CN112400861B - 一种用于快速细胞免疫组化的细胞保存液及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于快速细胞免疫组化的细胞保存液及其制备方法和应用。本发明提供的细胞保存液主要由缓冲液、红细胞裂解试剂、渗透压维持剂、细胞形态维持试剂、固定剂、防腐剂、粘液处理试剂、抗聚集试剂以及用于细胞免疫组化细胞抗原处理的试剂组成；其中，所述用于细胞免疫组化细胞抗原处理的试剂包括福尔马林和水杨酸锌，此二者协同能够有效催化免疫组化反应，使得细胞抗原无需进行修复处理，缩短细胞免疫组化检测的反应时间，提高检测效率，增强病理诊断的时效性。本发明提供的细胞保存液能够应用于保存或收集宫颈脱落细胞，胸腹水，肺泡灌洗液，脑脊液，痰液及尿液等多种细胞样本。同时，本发明提供了上述保存液的制备方法。

Description

一种用于快速细胞免疫组化的细胞保存液及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于细胞病理检测领域，具体涉及一种用于快速细胞免疫组化的细胞保存液及其制备方法和应用。
背景技术
病理诊断中活体组织免疫组化技术已经相当完善，但是细胞免疫组化技术还不是特别成熟。主要存在两方面的问题:一是如何恰当地固定，尽可能保持细胞的形态结构完整，防止脱片。二是如何充分暴露细胞抗原决定簇，提高细胞膜的通透性，使抗体大分子物质易于进入细胞，以便于抗体与抗原更好的结合。所以，如何保存细胞样本以及如何处理细胞，使抗原决定簇充分暴露是细胞免疫组化技术成功的关键。
目前，细胞保存液是保存细胞的最好的方法和手段。由于细胞样本种类繁多，有如宫颈脱落细胞，胸腹水，肺泡灌洗液，脑脊液，也有像痰液，尿液等样本，所以，与之匹配的细胞保存液同样是琳琅满目。市售的细胞保存液以宫颈细胞保存液较为常见，其样本经液基薄层细胞制片技术(TCT)制片，用于宫颈脱落细胞分类诊断。但是，现用的样本保存液常用高浓度的醇类、醛类、生理盐水对细胞标本进行保存，这会导致细胞成团，蛋白质粘液结块沉积，样本转移和观察效果差，同时容易导致细胞表面变形，难以准确观察到目标细胞的形态，影响细胞染色结果判读。除此之外，目前所见的细胞保存液多数仅用于TCT检测使用，少部分产品可以用于细胞免疫组化检测，但仍需要细胞修复操作；这无形减弱了病理检测结果的时效性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于快速细胞免疫组化的细胞保存液，该保存液能够应用于保存或收集细胞样本。用该保存液保存或收集细胞样本不仅可以对细胞形态起到良好保存效果，还能够用于细胞免疫组化检测，且检测过程中无需对细胞抗原进行修复，能够在2-3个小时内获得检测结果，从而缩短检测时间，增强了病理诊断的时效性。
本发明的另一目的在于，提供上述用于快速细胞免疫组化的细胞保存液的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种用于快速细胞免疫组化的细胞保存液，主要由缓冲液、红细胞裂解试剂、渗透压维持剂、细胞形态维持试剂、固定剂、防腐剂、粘液处理试剂、抗聚集试剂以及用于细胞免疫组化细胞抗原处理的试剂组成；其中，所述用于细胞免疫组化细胞抗原处理的试剂包括福尔马林和水杨酸锌。
优选的，所述缓冲液的含量为50％-70％(v/v)；所述红细胞裂解试剂的含量为0.1％-1.0％(v/v)或0.5％-1.0％(w/v)；所述渗透压维持剂的含量为0.01％-1.14％(w/v)；所述细胞形态维持试剂的含量为0.5％-1.0％(v/v)；所述固定剂的含量为15％-25％(v/v)；所述防腐剂的含量为0.05％-0.1％(v/v)；所述粘液处理试剂的含量为0.5％-1.5％(w/v)、所述抗聚集试剂的含量为0.05％-0.1％(w/v)；所述福尔马林的含量为5.0％-7.0％(v/v)，所述水杨酸锌的含量为1.0％-3.0％(w/v)。
优选的，所述缓冲液为Tris缓冲液或者磷酸盐缓冲液。
优选的，所述红细胞裂解试剂为TritonX-100或NH4Cl；当红细胞裂解试剂为TritonX-100时，其含量为0.1％-1％(v/v)；当红细胞裂解试剂为NH4Cl时，其含量为0.5％-1％(w/v)。
优选的，所述渗透压维持剂为NaCl、KCl、MgCl2中的一种或几种。
优选的，所述细胞形态维持试剂为PEG4000，其含量为0.5％-1％(v/v)。PEG4000可维持细胞骨架的完整性，防止细胞水肿，保持细胞原始形态。
优选的，所述固定剂为醇类，所述的醇类为甲醇、乙醇、乙二醇、丙醇、异丙醇中的一种或几种，所述固定剂的含量为15％-25％(v/v)。
优选的，所述防腐剂为proclin300或proclin950，其含量为0.05％-0.1％(v/v)。
优选的，所述粘液处理试剂为TCEP或巯乙磺酸钠，其含量为0.5％-1.5％(w/v)。
优选的，所述抗聚集试剂为EDTA-2Na或柠檬酸钠，其含量为0.05％-0.1％(w/v)；
本发明中，所述“w/v”或“v/v”，分母中的“v”指的是配好的细胞保存液的总体积；分子中的“w”或“v”指的是相应组分的质量或体积。
上述细胞保存液能够应用于保存或收集细胞样本。所述细胞样本包括宫颈脱落细胞，胸腹水，肺泡灌洗液，脑脊液，痰液及尿液样本。
宫颈脱落细胞样本取自女性宫颈部位，获取的样本通常含有大量的粘液或者血液成分；本发明采用的TCEP/巯乙磺酸钠能够很好的还原蛋白间的二硫键，从而释放被粘液包裹的细胞；另外，TritonX-100可以有效有效改善红细胞细胞膜的通透性，协助裂解红细胞，达到去除红细胞的目的；同时PEG4000是一种非渗透性大分子物质，能够保持细胞骨架的完整性，防止细胞水肿；所以该配方可以有效的维持细胞的原始形态；另外，本发明中使用的福尔马林和水杨酸锌试剂组合可以有效的固定细胞中的抗原，水杨酸锌中锌离子是多种金属酶的组成成分，可以催化诸多的酶促反应，进而增强细胞免疫组化染色效果。
本发明还提供了用于快速细胞免疫组化的细胞保存液的制备方法，包括如下步骤：
1)在双蒸水中加入缓冲液、渗透压维持剂、细胞形态维持试剂、红细胞裂解试剂、抗聚集试剂及粘液处理试剂，混匀后得到溶液A；
2)在溶液A中加入固定剂醇类，混匀后得到溶液B；
3)配制福尔马林水杨酸锌混合液，得到溶液C；
4)将溶液C加入溶液B中，混匀，得到溶液D；
5)在溶液D中加入防腐剂，使用双蒸水补充至1L，稀盐酸调整pH至6.8，得到细胞保存液。
本发明取得的有益效果：
1)细胞免疫组化检测是基于细胞涂片的免疫组化检测手段，本发明提供的保存液包括福尔马林和水杨酸锌，通过优化福尔马林含量，可有效固定细胞内抗原，同时锌离子是多种酶的组成成分，此二者协同不仅可以有效的保护细胞核和细胞质原始形态，同时能够有效催化免疫组化反应，使得细胞抗原无需进行修复处理，缩短细胞免疫组化检测的反应时间，提高检测效率，增强病理诊断的时效性。
2)本发明提供的保存液不仅可以对细胞形态起到良好保存效果能够应用于TCT检测巴氏染色，还可以对细胞抗原起到良好保存效果，能够应用于细胞免疫组化检测，且检测过程中无需抗原修复。一次取样即可满足TCT与细胞免疫组化两项检测样本需求，减少患者痛苦，提高诊疗效率。
3)本发明提供的保存液采用TCEP/巯乙磺酸钠作为粘液分解剂，能够有效分离被粘液包裹的细胞；采用TritonX-100作为红细胞裂解试剂，能够有效协助裂解样本中的红细胞，避免红细胞造成的背景干扰结果判读；
4)本发明提供的保存液，所用试剂均为实验室常用的生化试剂，成本低减轻病患负担。
附图说明
图1是对比例1中细胞保存液保存的宫颈细胞样本巴氏染色结果图；
图2是实施例1中细胞保存液1保存的宫颈细胞样本巴氏染色结果图；
图3是实施例2中细胞保存液2保存的宫颈细胞样本巴氏染色结果图；
图4是实施例3中细胞保存液3保存的宫颈细胞样本巴氏染色结果图；
图5是对比例1中细胞保存液保存的宫颈细胞样本p16/Ki67细胞免疫组化双染结果图；
图6是实施例1中细胞保存液1保存的宫颈细胞样本p16/Ki67细胞免疫组化双染结果图；
图7是实施例2中细胞保存液2保存的宫颈细胞样本p16/Ki67细胞免疫组化双染结果图；
图8是实施例3中细胞保存液3保存的宫颈细胞样本p16/Ki67细胞免疫组化双染结果图；
图9是对比例2中细胞保存液保存的肺泡灌洗液淋巴细胞样本Ki67免疫组化染色结果图；
图10是实施例1中细胞保存液1保存的肺泡灌洗液淋巴细胞样本Ki67免疫组化染色结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；若未特别指明，实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。
试剂名称 厂家 批号/货号
Tris 美国陶氏 D609J7S011
KCl 国药集团化学试剂有限公司 20190527
NaCl 国药集团化学试剂有限公司 20200105
磷酸二氢钾 索莱宝 YZ-100745
磷酸氢二钠 索莱宝 D9790
TritonX-100 麦克林 C10048897
MgCl<sub>2</sub> 国药集团化学试剂有限公司 20141126
EDTA.2NA 天津永大化学试剂有限公司 20130710
乙二醇 国药集团化学试剂有限公司 20191126
甲醇 天津永大化学试剂有限公司 20180901
乙醇 天津永大化学试剂有限公司 20200102
异丙醇 国药集团化学试剂有限公司 20190920
PEG4000 索莱宝 521E0318
TCEP 懋康生物 2704s20348
巯乙磺酸钠 梯希爱(上海)化成工业发展有限公司 M0913
Proclin950 Sigma MKCK3840
NH<sub>4</sub>CL 国药集团化学试剂有限公司 20200225
福尔马林 索莱宝 G2161
水杨酸锌 斯百全化学(上海)有限公司 16283-36-6
实施例1用于快速免疫组化的细胞保存液1的制备
本实施例提供的用于快速免疫组化的细胞保存液1，按照下表进行各组分的称量或量取：
表1细胞保存液1的配方
Figure BDA0002796600080000041
Figure BDA0002796600080000051
上述配方中，“w/v”或“v/v”，分母中的“v”指的是配好的细胞保存液的总体积；分子中的“w”或“v”指的是相应组分的质量或体积。
本实施例提供的用于快速免疫组化的细胞保存液1，制备方法如下：
1)按照表1所示配方，在双蒸水中加入Tris缓冲液及NaCl、KCl、MgCl2、PEG4000、TritonX-100、EDTA.2NA、TCEP，混匀后得到溶液A；
2)在溶液A中加入固定剂乙二醇、甲醇，混匀后得到溶液B；
3)配制福尔马林水杨酸锌混合液，得到溶液C；
4)将溶液C加入溶液B中，混匀，得到溶液D；
5)在溶液D中加入防腐剂(Proclin950)，使用双蒸水补充至1L，稀盐酸调整pH至6.8，得到细胞保存液1。
其中，Tris缓冲液的配制方法如下：
将1.21g的Tris盐溶于适量纯化水，0.1M盐酸调pH至7.2；纯化水定容至1L。
实施例2用于快速免疫组化的细胞保存液2的制备
本实施例提供的用于快速免疫组化的细胞保存液2，按照下表进行各组分的称量或量取：
表2细胞保存液2的配方
Figure BDA0002796600080000052
Figure BDA0002796600080000061
上述配方中，“w/v”或“v/v”，分母中的“v”指的是配好的细胞保存液的总体积；分子中的“w”或“v”指的是相应组分的质量或体积。
本实施例提供的用于快速免疫组化的细胞保存液1，制备方法如下：
1)按照表1所示配方，在双蒸水中加入磷酸盐缓冲液及NaCl、KCl、PEG4000、EDTA.2NA及TCEP，混匀后得到溶液A；
2)在溶液A中加入固定剂乙二醇、乙醇，混匀后得到溶液B；
3)配制福尔马林水杨酸锌混合液，得到溶液C；
4)将溶液C加入溶液B中，混匀，得到溶液D；
5)在溶液D中加入防腐剂(Proclin950)，使用双蒸水补充至1L，稀盐酸调整pH至6.8，得到细胞保存液2。
其中，磷酸钠盐缓冲液的配制方法如下：
将10.64g的无水磷酸氢二钠和8.99g的无水磷酸二氢钠溶于1L纯化水，混匀即可。
实施例3用于快速免疫组化的细胞保存液3的制备
本实施例提供的用于快速免疫组化的细胞保存液2，按照下表进行各组分的称量或量取：
表3细胞保存液3的配方
Figure BDA0002796600080000062
Figure BDA0002796600080000071
上述配方中，“w/v”或“v/v”，分母中的“v”指的是配好的细胞保存液的总体积；分子中的“w”或“v”指的是相应组分的质量或体积。
本实施例提供的用于快速免疫组化的细胞保存液1，制备方法如下：
1)按照表3所示配方，在双蒸水中加入磷酸钾盐缓冲液及NaCl、KCl、PEG4000、NH4CL、柠檬酸钠、巯乙磺酸钠，混匀后得到溶液A；
2)在溶液A中加入固定剂异丙醇、乙醇，混匀后得到溶液B；
3)配制福尔马林水杨酸锌混合液，得到溶液C；
4)将溶液C加入溶液B中，混匀，得到溶液D；
5)在溶液D中加入防腐剂(Proclin300)，使用双蒸水补充至1L，稀盐酸调整pH至6.8，得到细胞保存液3。
其中，磷酸钾盐缓冲液的配制方法如下：
将10.64g的无水磷酸氢二钠和8.99g的无水磷酸二氢钾溶于1L纯化水，混匀即可。
另外，在其他实施例中，细胞保存液配方采用的渗透压维持剂也可以是NaCl、KCl、MgCl2中的任意一种或两种。
对比例1
该对比例按照中国专利申请CN……(CN101664028B)制备细胞保存液：按体积比醇类10-30％，以双蒸水补足100％；以质量/体积百分浓度计：含磷酸盐0.1％-3.0％、苯酚0.1％-2.0％、N-甲基-N-环己基-2-氨基-3，5-二溴苯甲胺盐酸盐0.1％-2.0％。
对比例2
本对比例提供的细胞保存液配方如下表，其中不含福尔马林及水杨酸锌，其余组分与实施例1相同。
表4对比例2细胞保存液的配方
Figure BDA0002796600080000072
Figure BDA0002796600080000081
配制方法参考实施例1，省略与添加福尔马林及水杨酸锌相关的步骤3)、4)。
试验例1巴氏染色试验
该试验例对上述实施例中制备的细胞保存液1-3和对比例1对宫颈脱落细胞样本细胞形态的保存进行观察。
将分别采用细胞保存液1-3与对比例1的细胞保存液保存的同一样本同时进行巴氏染色，具体操作如下：细胞样本TCT制片，冲洗液(1min)，缓冲液(1min)，缓冲液(1min)，苏木素(1min)，缓冲液(1min)，缓冲液(1min)，缓冲液(1min)，冲洗液(1min)，冲洗液(1min)，EA/OG染色液(1min)，冲洗液(1min)，冲洗液(1min)，冲洗液(1min)，异丙醇(1min)，二甲苯(1min)，封片；
结果如图1-图4所示：对比例1中的细胞保存液染色整体效果良好(图1)，但采用本发明提供的细胞保存液1-3保存的样本，其巴士染色细胞形态更加完整，且染色效果对比更加鲜明(图2-4)。
试验例2宫颈脱落细胞样本的快速细胞免疫组化试验
该试验例对上述实施例中制备的细胞保存液1-3和对比例1对宫颈脱落细胞样本进行免疫组化试验。
将本发明保存液1-3与对比例1保存液保存的同一样本同时进行p16/Ki67双染细胞免疫组化染色，具体操作如下：
1)细胞样本TCT制片；
2)组合一抗室温孵育30min；TBS清洗液清洗3次，每次3min；
3)组合二抗室温孵育20min；TBS清洗液清洗3次，每次3min；
4)快红显色8min；纯化水清洗3次，每次3min；TBS清洗液清洗1次，每次3min；
5)DAB显色2min；纯化水清洗3次，每次3min；TBS清洗液清洗1次，每次3min；
6)苏木素复染1min；纯化水清洗3次，每次3min；
7)水性封片剂封片，显微镜下观察；
上述步骤中省略了常规免疫组化抗原修复的步骤。
结果如图5-图8所示：对比例细胞保存液宫颈脱落细胞染色阴性(图5)，说明对抗原保存不当，致使在省略抗原修复步骤的快速细胞免疫组化中无法有效检测标本p16/Ki67表达情况；图6-图8为本发明细胞保存液宫颈脱落细胞双染结果显示，p16抗体细胞质为棕黄色，细胞核KI67染色为红色，染色结果符合p16/Ki67双染阳性判读标准；
试验例3肺泡灌洗液细胞样本的快速细胞免疫组化试验
该试验例对上述实施例1和对比例2中制备的细胞保存液对肺泡灌洗液细胞样本样本进行免疫组化试验。
本发明保存液1与对比例2保存液保存的同一样本同时进行细胞免疫组化试验；具体操作如下：
1)细胞样本TCT制片；
2)Ki67一抗室温孵育30min；TBS清洗液清洗3次，每次3min；
3)一抗后室温孵育20min；TBS清洗液清洗3次，每次3min；
4)组合二抗室温孵育20min；PBS清洗液清洗3次，每次3min；
5)DAB显色5min；纯化水清洗3次，每次3min；TBS清洗液清洗1次，每次3min；
6)苏木素复染2min；纯化水清洗3次，每次3min；
7)脱水透明封片，显微镜下观察；
结果如图9-图10所示：常规免疫组化Ki67项目染色结果表明，采用对比例2未添加福尔马林水杨酸锌的细胞保存液保存的肺泡灌洗液细胞样本染色为阴性(图9)，而使用实施例1中的细胞保存液Ki67项目细胞核染色为阳性(图10)；说明福尔马林水杨酸锌二者的协同对抗原的固定及细胞免疫组化试验起到了积极的效果。
最后说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制。上文中已经用具体实施方案描述了本发明的基本原理和主要特征，在本发明的基础上，可以对之进行一些修改或替换，但这些修改或者替换并不使相应技术方案的本质脱离本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种用于快速细胞免疫组化的细胞保存液，其特征在于，主要由缓冲液、红细胞裂解试剂、渗透压维持剂、细胞形态维持试剂、固定剂、防腐剂、粘液处理试剂、抗聚集试剂以及用于细胞免疫组化细胞抗原处理的试剂组成；其中，所述用于细胞免疫组化细胞抗原处理的试剂包括福尔马林和水杨酸锌；所述缓冲液的含量为50%-70%（v/v）；所述红细胞裂解试剂的含量为0.1%-1.0%（v/v）或0.5%-1.0%（w/v）；所述渗透压维持剂的含量为0.01%-1.14%（w/v）；所述细胞形态维持试剂的含量为0.5%-1.0%（v/v）；所述固定剂的含量为15%-25%（v/v）；所述防腐剂的含量为0.05%-0.1%（v/v）；所述粘液处理试剂的含量为0.5%-1.5%（w/v）、所述抗聚集试剂的含量为0.05%-0.1%（w/v）；所述福尔马林的含量为5.0%-7.0%（v/v），所述水杨酸锌的含量为1.0%-3.0%（w/v）；所述红细胞裂解试剂为TritonX-100或NH4Cl；当红细胞裂解试剂为TritonX-100时，其含量为0.1%-1%（v/v）；当红细胞裂解试剂为NH4Cl时，其含量为0.5%-1%（w/v）。
2.根据权利要求1所述的用于快速细胞免疫组化的细胞保存液，其特征在于，所述缓冲液为Tris缓冲液或者磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的用于快速细胞免疫组化的细胞保存液，其特征在于，所述渗透压维持剂为NaCl、KCl、MgCl2中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的用于快速细胞免疫组化的细胞保存液，其特征在于，所述细胞形态维持试剂为PEG4000，其含量为0.5%-1%（v/v）。
5.根据权利要求1所述的用于快速细胞免疫组化的细胞保存液，其特征在于，所述固定剂为醇类，所述的醇类为甲醇、乙醇、乙二醇、丙醇、异丙醇中的一种或几种，所述固定剂的含量为15％-25％（v/v）。
6.根据权利要求1所述的用于快速细胞免疫组化的细胞保存液，其特征在于，所述防腐剂为proclin300或proclin950，其含量为0.05%-0.1%（v/v）。
7.根据权利要求1所述的用于快速细胞免疫组化的细胞保存液，其特征在于，所述粘液处理试剂为TCEP或巯乙磺酸钠，其含量为0.5%-1.5%（w/v）。
8.根据权利要求1所述的用于快速细胞免疫组化的细胞保存液，其特征在于，所述抗聚集试剂为EDTA- 2Na或柠檬酸钠，其含量为0.05%-0.1%（w/v）。
9.权利要求1-8中任一项所述的用于快速细胞免疫组化的细胞保存液的制备方法，包括如下步骤：
在双蒸水中加入缓冲液、渗透压维持剂、细胞形态维持试剂、红细胞裂解试剂、抗聚集试剂及粘液处理试剂，混匀后得到溶液A；
在溶液A中加入固定剂醇类，混匀后得到溶液B；
配制福尔马林水杨酸锌混合液，得到溶液C；
将溶液C加入溶液B中，混匀，得到溶液D；
在溶液D中加入防腐剂，使用双蒸水补充至1L，稀盐酸调整pH至6.8，得到细胞保存液。
10.权利要求1-8中任一项所述的用于快速细胞免疫组化的细胞保存液在保存或收集细胞样本中的应用。
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