CN109750087A - 一种血液cfDNA提取试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种血液cfDNA提取试剂盒。包括样本DNA保存管、裂解液、结合液以及洗涤液，其特征在于所述的样本DNA保存管内装有血液cfDNA保存液，所述的保存液由包括如下组分制备得到：葡萄糖10‑50mg/ml、谷氨酰胺1‑5mg/ml、甘氨酸1‑5mg/ml、原钒酸钠200‑1000mg/ml、染料木黄酮1‑5mg/ml、抑肽酶1‑5mg/ml、氟化铝1‑5mg/ml、谷胱甘肽10‑40mg/ml、重氮烷基脲100‑500mg/ml、抗凝剂1‑3mg/ml、膜保护剂5‑20mg/ml。本发明一种血液cfDNA提取试剂盒，增加了对血液样本的保存管，该保存液使在保存血细胞不破碎的情况下，保证了血浆游离DNA的含量，并能在常温下保存样本21天时间仍有较高的细胞活性。

Description

一种血液cfDNA提取试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种血液cfDNA提取试剂盒。

背景技术

在现代疾病诊断当中，核酸占据着非常重要的地位，其中DNA的作用更显突出，而血液是容易获取的DNA重要来源。在PCR分子诊断过程中，获取的DNA的总拷贝数和质量是直接影响后续检验试验的结果，所以获得有效、可靠的DNA是PCR分子诊断的关键。但是血液样本不容易长期保存和运输，样本容易凝结、血细胞容易破裂、DNA容易被核酸降解酶降解破坏，从而导致检测结果的不确定性，给实际检测工作带来很大的局限性。

cfDNA（cell Free DNA）又称循环核酸，是指游离于细胞之外的DNA分子，这些DNA分子主要来源于正常细胞某些特定释放过程、细胞凋亡、细胞坏死、以及癌细胞生长浸润过程中的释放，其大小主要集中在几十到数百bp，半衰期在数小时左右。

血液中的cfDNA水平和种类与包括肿瘤在内的多种疾病相关，此外，在母体血液中也能找到胎儿的cfDNA。血液中的cfDNA检测已经被广泛用于各种癌症、某些自身免疫疾病如红斑狼疮的筛查，以及胎儿遗传疾病如唐氏综合征的无创检测。

目前的cfDNA检测实践中，血液样本的保存与cfDNA检测试剂盒是分离的，而血液样本的保存好坏是直接影响检测结果的重要因素。CfDNA降解破坏、血液中血细胞的破损导致基因组DNA对cfDNA的污染都会直接导致cfDNA提取失败和检测结果不准确。

发明内容

针对背景技术中存在的问题，本发明提供便于血液cfDNA提取试剂盒，能够保持血液样本较长时间不凝结、DNA不容易被降解确保DNA快速有效提取的血液cfDNA提取试剂盒。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种血液cfDNA提取试剂盒，包括样本DNA保存管、裂解液、结合液以及洗涤液，所述的样本DNA保存管内装有血液cfDNA保存液，所述的保存液由包括如下组分制备得到：葡萄糖10-50mg/ml、谷氨酰胺1-5mg/ml、甘氨酸 1-5mg/ml、原钒酸钠200-1000mg/ml、染料木黄酮1-5mg/ml、抑肽酶1-5mg/ml、氟化铝1-5mg/ml、谷胱甘肽10-40mg/ml、重氮烷基脲100-500mg/ml、抗凝剂1-3mg/ml、膜保护剂5-20mg/ml。

进一步的，所述的血液cfDNA保存液由包括如下组分制备得到：葡萄糖20-40mg/ml、谷氨酰胺2-4mg/ml、甘氨酸 2-4mg/ml、原钒酸钠400-800mg/ml、染料木黄酮2-4mg/ml、抑肽酶2-4mg/ml、氟化铝2-4mg/ml、谷胱甘肽15-35mg/ml、重氮烷基脲200-400mg/ml、抗凝剂1.5-2.5mg/ml、膜保护剂8-15mg/ml。

进一步的，所述的抗凝剂选择EDTA-3K和EDDHA盐中一种或多种，所述的膜保护剂选择山梨醇、鼠李糖、海藻糖中一种或多种。

进一步的，其中抗凝剂为EDTA-3K，膜保护剂为山梨醇和海藻糖。

所述的山梨醇和海藻糖的质量比为1:2~2:1。

所述的血液cfDNA保存液由包括如下组分制备得到：葡萄糖30mg/ml、谷氨酰胺3mg/ml、甘氨酸 3mg/ml、原钒酸钠600mg/ml、染料木黄酮3mg/ml、抑肽酶3mg/ml、氟化铝3mg/ml、谷胱甘肽25mg/ml、重氮烷基脲300mg/ml、EDTA-3K含量为2.0 mg/ml，山梨醇含量为6 mg/ml，山海藻糖含量为6 mg/ml。

其中抗凝剂为EDTA-3K和EDDHA–Na，膜保护剂为鼠李糖。

EDTA-3K和EDDHA–Na的质量比为1:1~4:1。

所述的血液cfDNA保存液由包括如下组分制备得到：葡萄糖40mg/ml、谷氨酰胺4mg/ml、甘氨酸 2mg/ml、原钒酸钠800mg/ml、染料木黄酮2mg/ml、抑肽酶2mg/ml、氟化铝2mg/ml、谷胱甘肽30mg/ml、重氮烷基脲250mg/ml、EEDTA-3K含量1.5 mg/ml，EDDHA–Na含量为0.8 mg/ml，鼠李糖含量为10mg/ml。

本发明一种血液cfDNA提取试剂盒，增加了对血液样本的保存管，能有效防止血液样本在存储和运输过程中血液样本变性凝结和样本中细胞破裂导致基因组DNA污染目标cfDNA。

本发明血液cfDNA提取试剂盒中的DNA保存液选择新种类抗凝剂和膜保护剂为重点进行研究，基于EDDHA中多种价键提供的独特螯合性能以及与血液/试剂中其他成分良好的兼容性申请人以部分EDDHA–Na替换常用抗凝剂EDTA-3K；基于鼠李糖、海藻糖对细胞低毒和高盐条件下良好的张力和表面活性剂性能，选用山梨醇、海藻糖、鼠李糖的膜保护剂。实验证明上述策略制成的新型游离核酸保存液能实现优异的保护效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步解释。

实施例1：

本实施例公开一种血液cfDNA提取试剂盒，包括样本DNA保存管、裂解液、结合液以及洗涤液，样本DNA保存管内装有血液cfDNA保存液。对于本发明血液cfDNA提取试剂盒中的血液cfDNA保存液，申请人以选择新种类抗凝剂和膜保护剂为重点研究进行研究。基于EDDHA中多种价键提供的独特螯合性能以及与血液/试剂中其他成分良好的兼容性申请人以部分EDDHA–Na替换常用抗凝剂EDTA-3K；基于鼠李糖、海藻糖对细胞低毒和高盐条件下良好的张力和表面活性剂性能，选用山梨醇、海藻糖、鼠李糖的膜保护剂。

按照采用的抗凝剂不同，将配方分为三组，为简化因素起见，以下实验配方中均采用葡萄糖30mg/ml、谷氨酰胺3mg/ml、甘氨酸 3mg/ml、原钒酸钠600mg/ml、染料木黄酮3mg/ml、抑肽酶3mg/ml、氟化铝3mg/ml、谷胱甘肽25mg/ml、重氮烷基脲300mg/ml。下表显示的也仅是最后总结验证时使用的有代表性的成分配比，前期部分方向不对或无代表性的配比种类也未显示。

配制中将所需量的各种试剂以无RNase酶活的纯净水溶解。

表1 基于EDTA-3K抗凝剂的配方

表2 基于EDDHA–Na抗凝剂的配方

表3 基于EDTA-3K和EDDHA–Na抗凝剂的配方

将上述DNA保存液按照每毫升采血量0.02ml灌装入血液样本DNA保存管。

实施例3：各配方性能比较

供试品：实施例2所得配方1-14血液样本DNA保存管；

对照品：康捷肝素锂采血管：江苏康捷生产；Streck无创真空采血管：Streck生产（抗凝剂，保护剂不明，推测为EDTA和糖类等）；空白玻璃采血管；

在研究阶段试剂多采用知名进口试剂，本领域技术人员可以理解，出于价格/获取便利性等原因这些试剂可以被近似/更高品质的国产/进口试剂替代，实现的效果相同或近似。

征集3名22-25岁的男性志愿者（经过体检：血常规指标正常，无体检肿瘤指症，无炎症指症），分别采血180ml（配方1-14采血管、康捷肝素锂采血管、Streck无创真空采血管、空白玻璃采血管）。静置于23摄氏度室温恒温箱中保存直至开始实验。

在第0（采血后2小时内）、2、5、10、14、21日对每份样本进行如下检测：

溶血情况，检测414nm OD值。计算三个样本平均值。

按照试剂盒的说明使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit cfDNA提取试剂盒提取样品中的cfDNA，使用qPCR方法检测样本中的cfDNA总浓度，检测对象为GAPDH，引物序列为：上游引物5’-GAAGGTCGGAGTCAACGG-3’，下游引物：5’-GGAAGATGGTGATGGGATTT-3’，以基因组DNA为标准品，从Ct值换算cfDNA总量。计算三个样本平均值。

结果如下：

表4 溶血情况

结果表明，除康捷肝素锂采血管和空白玻璃采血管外，其他DNA保存管溶血状况在21日，特别是15日内均较好，效果最好的是Streck无创真空采血管以及基于EDTA-3K和EDDHA–Na抗凝剂的配方9-14。

表5 cfDNA含量

结果表明，EDTA-3K配合糖类保存效果均较好，特别是EDTA-3K与海藻糖和山梨醇的组合。虽然EDDHA–Na的螯合效果适合血液保存，但其中的钠离子的渗透过程对细胞损害较大（推测），单纯使用EDDHA–Na，特别是较高浓度的EDDHA–Na效果不佳。以一定比例组合EDDHA–Na和EDTA-3K效果较好，两者比例0.8：1.5时达到最佳。上述配方中有多个在21日尺度上仍然能维持DNA数量增长不超过50%，理论上应仍然可以用于cfDNA相关诊断。相比之下，康捷肝素锂采血管和空白玻璃采血管在第2日上均已由于细胞破裂释放基因组DNA严重干扰了cfDNA数量，Streck无创真空采血管在15日内效果较好，但在第20日时DNA数量已经增长到初期的3倍。

实施例4：优选配方实际检测应用

将本申请的配方3、配方12的血液游离DNA保存管与Streck无创真空采血管一同用于肿瘤患者EGFR T790M实际检测（QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit 试剂盒提取cfDNA，cobas® EGFR Mutation Test试剂盒检测，操作按试剂盒标准流程），共涉及42名患者，每位患者使用三种采血管采样，采血后48小时内进行首次检测，常温保存14日和21日后再进行两次检测，比较检测结果。

表6 EGFR T790M检测结果

除配方3组中48小时内和14日三种保存方式的检测结果一致，在第21日Streck无创真空采血管出现了3例不一致（假阳性）的情况，而配方3和12检测结果仍然未改变。这初步证实了本申请配方3和12的cfDNA保存管完全可以在常温下稳定血液样本中的游离核酸长达3周，检测结果仍然可靠。

此外，进行10位患者样本的低温保存实验（48小时内、14日、21日、30日），结果表明，配方12的血液cfDNA保存管在4摄氏度保存30日后仍然能得到与48小时检测时相同的结果（突变：13例，无突变17例），而配方3与Streck无创真空采血管分别在30日和21日时出现了2例和2例假阳性情况。配方12的血液cfDNA保存管经过进一步优化和统计完全可以再次扩展使用时间范围。

Claims (9)

1.一种血液cfDNA提取试剂盒，包括样本DNA保存管、裂解液、结合液以及洗涤液，其特征在于所述的样本DNA保存管内装有血液cfDNA保存液，所述的保存液由包括如下组分制备得到：葡萄糖10-50mg/ml、谷氨酰胺1-5mg/ml、甘氨酸 1-5mg/ml、原钒酸钠200-1000mg/ml、染料木黄酮1-5mg/ml、抑肽酶1-5mg/ml、氟化铝1-5mg/ml、谷胱甘肽10-40mg/ml、重氮烷基脲100-500mg/ml、抗凝剂1-3mg/ml、膜保护剂5-20mg/ml。

2.如权利要求2所述的血液cfDNA提取试剂盒，其特征在于所述的血液cfDNA保存液由包括如下组分制备得到：葡萄糖20-40mg/ml、谷氨酰胺2-4mg/ml、甘氨酸 2-4mg/ml、原钒酸钠400-800mg/ml、染料木黄酮2-4mg/ml、抑肽酶2-4mg/ml、氟化铝2-4mg/ml、谷胱甘肽15-35mg/ml、重氮烷基脲200-400mg/ml、抗凝剂1.5-2.5mg/ml、膜保护剂8-15mg/ml。

3.如权利要求1所述的血液cfDNA提取试剂盒，其特征在于所述的抗凝剂选择EDTA-3K和EDDHA盐中一种或多种，所述的膜保护剂选择山梨醇、鼠李糖、海藻糖中一种或多种。

4.如权利要求3所述的血液cfDNA提取试剂盒，其特征在于其中抗凝剂为EDTA-3K，膜保护剂为山梨醇和海藻糖。

5.如权利要求4所述的血液cfDNA提取试剂盒，其特征在于所述的山梨醇和海藻糖的质量比为1:2~2:1。

6.如权利要求5所述的血液cfDNA提取试剂盒，其特征在于所述的血液cfDNA保存液由包括如下组分制备得到：葡萄糖30mg/ml、谷氨酰胺3mg/ml、甘氨酸 3mg/ml、原钒酸钠600mg/ml、染料木黄酮3mg/ml、抑肽酶3mg/ml、氟化铝3mg/ml、谷胱甘肽25mg/ml、重氮烷基脲300mg/ml、EDTA-3K含量为2.0 mg/ml，山梨醇含量为6 mg/ml，山海藻糖含量为6 mg/ml。

7.如权利要求4所述的血液cfDNA提取试剂盒，其特征在于其中抗凝剂为EDTA-3K和EDDHA–Na，膜保护剂为鼠李糖。

8.如权利要求7所述的血液cfDNA提取试剂盒，其特征在于EDTA-3K和EDDHA–Na的质量比为1:1~4:1。

9.如权利要求8所述的血液cfDNA提取试剂盒，其特征在于所述的血液cfDNA保存液由包括如下组分制备得到：葡萄糖40mg/ml、谷氨酰胺4mg/ml、甘氨酸 2mg/ml、原钒酸钠800mg/ml、染料木黄酮2mg/ml、抑肽酶2mg/ml、氟化铝2mg/ml、谷胱甘肽30mg/ml、重氮烷基脲250mg/ml、EEDTA-3K含量1.5 mg/ml，EDDHA–Na含量为0.8 mg/ml，鼠李糖含量为10mg/ml。