CN111500704B - 一种人胎儿染色体非整倍体检测试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人胎儿染色体非整倍体检测试剂盒及方法,所述试剂盒包括样本裂解液,所述样本裂解液包含以下浓度的组分:Tris‑HCl 10~100mM、盐酸胍10~80w/v%、曲拉通X‑100 0.1~20v/v%、亚精胺0.1~5w/v%、氯化钠0.01~10w/v%。上述试剂盒还包括DNA末端修复试剂、测序接头连接试剂、测序接头。所述试剂盒通过组分的优化,使得在文库构建中不需要进行PCR扩增,从而提高可用数据比率,降低数据碱基偏向性;所述试剂盒可用于产前诊断的全自动样本处理,能大大缩短样本处理及文库制备时间,极大提升产前诊断临床检测项目的时效性,能同时检测胎儿的21、18、13、X和Y染色体的异倍体,以及其他常见染色体变异,具有重复性好、准确率高、灵敏度高和检测限低等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种人胎儿染色体非整倍体检测试剂盒及方法。
背景技术
胎儿染色体的异常,尤其是异倍体(染色体数目异常),是一个复制失败、先天畸形和发育延缓和智力低下等病症的普遍诱因。发生异倍体的概率为300个新生儿中就有1个病患。传统的胎儿染色体异常诊断测试包括了羊水刺穿和绒毛取样等入侵性测试。这些测试方法被认为是当今异倍体最精确的探测方法。然而,因为这些诊断方法是侵入式的,会导致0.11%到0.22%的流产率。利用多重标记筛选方法同样是染色体异常检测的常用方法,且因为不是入侵式的,因此避免了流产,但诊断测试方法准确度并不高,受母亲的年龄和孕期不同的影响,对21三体的检出率在69-96%不等。更重要的是,此诊断方法的假阳性率接近5%。
无创产前检测(NIPT)指的是从孕期10周或更后的母亲血浆中获取cfDNA,通过全基因组测序方法进行测序,利用专门的软件算法,可以高精度地检测出13,18,21,X和Y染色体的胎儿异倍体情况。一份最近的临床研究分析表明,在单胎的18、21三体混合检测中,检出率和特异性如下:21三体分别为99.2%和99.91%,18三体分别为96.3%和99.87,13三体为100%和99.9%。
鉴于与多种传统标记筛查技术相比,NIPT具有明显降低假阳性概率的优势,很多专业的医学杂志发布了支持使用NIPT的观点。如国际产前诊断社团,研究母亲胎儿药物的美国产前和妇科医师大学社团,美国医学遗传学和基因组学大学和欧洲人类基因社团、美国人类基因社团等,支持提供NIPT技术给全部孕妈,并推荐预检测咨询、了解情况的咨询和确认阳性cfDNA筛查结果的诊断测试。
常规的NIPT检测包括:1.血浆分离;2.游离DNA提取;3.DNA末端修复;4.DNA末端加A;5.接头连接;6.连接产物的纯化;7.文库PCR扩增;8.文库纯化及定量;9.文库pool;10.文库测序;11.数据分析及出具报告。以上整个流程需要超过9个小时以上,因为流程繁多,人工操作过程易出错,效率低下。
为简化流程,提高效率,释放劳动力,一些生物公司推出了自动化平台,对核酸提取和文库制备实现了自动化操作。但这些工作站还有诸多限制,不能做到全流程自动化。如需要人工分离血浆后再将样本添加进工作站中;核酸提取结束后不能进行DNA质量检测,需要进行人工将DNA取出进行定量等质量控制;文库制备完成后也需要人工对文库定量及pool工作。这些限制都大大的限制了效率的进一步提高,不能做到无人值守,不能完全释放劳动力,节约劳力成本等,进而影响NIPT检测的时效性。且由于自动化平台机械臂移液精确度不如手工操作,各模块功能效率相比手工操作更低,使得现有适用于手工操作的试剂并不适用于仪器自动化操作平台。
发明内容
基于此,本发明提供一种人胎儿染色体非整倍体检测试剂盒及方法,所述试剂盒通过样本裂解液和DNA文库制备试剂的优化,使得在文库构建中不需要进行PCR扩增步骤,从而提高可用数据比率,降低数据碱基偏向性;所述试剂盒可用于产前诊断的全自动样本处理,能大大缩短样本处理及文库制备时间,极大提升产前诊断临床检测项目的时效性;具有重复性好、准确率高、灵敏度高和检测限低等优点。
具体技术方案为:
一种人胎儿染色体非整倍体检测试剂盒,包括样本裂解液,所述样本裂解液包含以下浓度的组分:Tris-HCl 10~100mM、盐酸胍10~80w/v%、曲拉通X-1000.1~20v/v%、亚精胺0.1~5w/v%、氯化钠0.01~10w/v%。
在其中一些实施例中,所述样本裂解液包含以下浓度的组分:Tris-HCl20~80mM、盐酸胍20~70w/v%、曲拉通X-100 1~15v/v%、亚精胺0.2~4w/v%、氯化钠0.09~8w/v%。
在其中一些实施例中,所述样本裂解液中盐酸胍的浓度为30~65w/v%。发明人经过研究发现,当所述样本裂解液中盐酸胍的浓度为30~65w/v%时,可使所述样本裂解液形成一个更好的裂解体系,从而提高DNA的得率。
在其中一些实施例中,所述样本裂解液还包含多肽,所述多肽的氨基酸数目为2~30,且氨基酸序列中含有Ala-Gln;所述多肽在样本裂解液中的浓度为0.01~5w/v%。发明人经过研究发现,当所述样本裂解液中包含所述多肽时,可进一步提高DNA得率。
在其中一些实施例中,所述样本裂解液还包含多肽,所述多肽的氨基酸数目为2~30,且氨基酸序列中含有Ala-Gln;所述多肽在样本裂解液中的浓度为0.05~1w/v%。
在其中一些实施例中,所述多肽为Ala-Gln二肽。
在其中一些实施例中,所述样本裂解液还包含蛋白酶K。在使用所述样本裂解液前,将蛋白酶K加入样本裂解液中。
在其中一些实施例中,所述蛋白酶K在所述样本裂解液中的浓度为0.3~2.3mg/mL。
在其中一些实施例中,优选所述蛋白酶K在所述样本裂解液中的浓度为0.4~1.0mg/mL。
在其中一些实施例中,所述样本裂解液的pH值为4~7,优选为4.5~6.0。
在其中一些实施例中,所述人胎儿染色体非整倍体检测试剂盒还包括DNA末端修复试剂,所述DNA末端修复试剂包括修复酶和修复缓冲液;所述修复缓冲液包含以下浓度的组分:Tris-HCl 10~100mM、MgCl2 1.5~10mM、NaCl2~15mM、dNTP 100~500nM、DTT 0.1~2.0mM、ATP 0.1~5.0mM、亚精胺0.1~10w/v%、曲拉通0.1~10v/v%。
在其中一些实施例中,所述修复缓冲液中亚精胺浓度为0.1~5w/v%,曲拉通浓度为0.1~5v/v%;更优选地,所述修复缓冲液中亚精胺浓度为0.1~2w/v%,曲拉通浓度为0.1~2v/v%。
在其中一些实施例中,所述修复酶包含以下浓度的组分:T4多核苷酸激酶0.1~10U/ul、T4 DNA聚合酶0.1~10U/ul、klenow片段0.1~10U/ul。
在其中一些实施例中,优选所述修复酶包含以下浓度的组分:T4多核苷酸激酶0.5~3U/ul、T4 DNA聚合酶0.5~3U/ul、klenow片段0.8~4U/ul。
在其中一些实施例中,所述人胎儿染色体非整倍体检测试剂盒还包括DNA3’末端加A试剂,所述DNA 3’末端加A试剂包含3’末端加A酶和酶反应缓冲液。
在其中一些实施例中,所述3’末端加A酶包含以下浓度的组分:Taq DNA聚合酶0.1~10U/ul、klenow片段0.1~10U/ul;所述酶反应缓冲液包含以下浓度的组分:Tris-HCl 10~100mM、MgCl2 1.0~5mM、dATP 100~500nM。
在其中一些实施例中,所述3’末端加A酶包含以下浓度的组分:Taq DNA聚合酶0.2~2U/ul、klenow片段0.5~5U/ul。
所述3’末端加A酶中增加了klenow片段,可充分提升加A成功率,进而增加下一步接头连接的效率。
在其中一些实施例中,所述人胎儿染色体非整倍体检测试剂盒还包括测序接头连接试剂,所述测序接头连接试剂包含连接酶和连接反应缓冲液;所述连接反应缓冲液包含以下浓度的组分:Tris-HCl 10~100mM、MgCl2 1.0~10.0mM、NaCl 5.0mM~20mM、DTT0.1~2.0mM、ATP 0.1~2.0mM、PEG400~8000 0.1~20w/v%、甜菜碱0.1~10M。
在其中一些实施例中,优选所述连接反应缓冲液中PEG400~8000的浓度为0.5~10w/v%,甜菜碱的浓度为0.5~5M;更优选地,所述连接反应缓冲液中PEG400~8000的浓度为1~5w/v%,甜菜碱的浓度为0.5~2M。
在其中一些实施例中,所述连接酶浓度为1~1000U/ul;优选地,所述连接酶浓度为10~500U/ul;更优选地,所述连接酶浓度为100~350U/ul。
在其中一些实施例中,所述PEG为分子量从400至8000中的一种或多种。
在其中一些实施例中,所述人胎儿染色体非整倍体检测试剂盒还包括测序接头,所述测序接头的3’端的最后一个T碱基进行了硫代修饰和/或锁核酸修饰。
在其中一些实施例中,所述测序接头为适用于Illumina测序平台的一段索引接头序列,其序列包含i5/i7、index1/2及read1/2三部分构成。
在其中一些实施例中,所述人胎儿染色体非整倍体检测试剂盒还包括DNA吸附滤膜、洗涤液I、洗涤液II、DNA洗脱液。
在其中一些实施例中,所述DNA吸附滤膜为硅基离子交换纤维膜。
在其中一些实施例中,所述洗涤液I包含以下浓度的组分:Tris-HCl10~100mM、盐酸胍10~70w/v%、曲拉通X-100 1~20v/v%、无水乙醇30~70v/v%;所述洗涤液II包含以下浓度的组分:Tris-HCl 10~100mM、无水乙醇70~85v/v%。
在其中一些实施例中,所述洗涤液I包含以下浓度的组分:Tris-HCl20~80mM、盐酸胍40~66w/v%、曲拉通X-100 5~10v/v%、无水乙醇45~60v/v%。
在其中一些实施例中,所述人胎儿染色体非整倍体检测试剂盒还包括DNA纯化试剂。
在其中一些实施例中,所述DNA纯化试剂为DNA纯化磁珠。
本发明还提供了一种人胎儿染色体非整倍体检测DNA文库构建方法。
具体技术方案为:
一种人胎儿染色体非整倍体检测DNA文库构建方法,包括以下步骤:
(1)采集孕妇外周血,分离血浆样本;
(2)向步骤(1)获得的血浆样本中加入上述试剂盒中的样本裂解液,于18~30℃条件下进行血浆样本裂解20~40min;将裂解后的血浆样本从上述试剂盒中的DNA吸附滤膜上滤过,分别用洗涤液I和洗涤液II进行洗涤,然后用DNA洗脱液进行洗脱,得到DNA溶液;
(3)利用上述试剂盒中的DNA末端修复试剂对步骤(2)获得的DNA进行末端修复;
(4)利用DNA 3’末端加A试剂对步骤(3)获得的DNA末端修复产物进行3’末端加A;
(5)利用上述试剂盒中的测序接头连接试剂对步骤(4)获得的DNA3’末端加A产物和上述试剂盒中的测序接头进行连接;
(6)步骤(5)所述测序接头连接完成后,即得到DNA文库,利用上述试剂盒中的DNA纯化试剂对DNA文库进行纯化。
在其中一些实施例中,所述步骤(1)具体为:用游离细胞采血管采集孕期超过10周的孕妇的外周血,然后于4±0.5℃,1600±10g/min的条件下离心10-20min,分离血浆样本。
在其中一些实施例中,步骤(3)所述修复条件为:20-25℃,10-20min;60-70℃,10-15min。
在其中一些实施例中,优选步骤(3)所述修复条件为:20℃,15min;65℃,10min。
在其中一些实施例中,步骤(4)所述3’末端加A条件为:60-70℃,10-15min。
在其中一些实施例中,优选步骤(4)所述3’末端加A条件为:65℃,10min。
在其中一些实施例中,步骤(5)所述连接条件为:25-35℃,15-25min;60-70℃,10-15min。
在其中一些实施例中,优选步骤(5)所述连接条件为:30℃,20min;65℃,10min。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明试剂盒通过组分的优化调整,提升了游离DNA的得率和测序接头连接效率,使提取得到的DNA高效地转化为DNA文库,无需PCR扩增就可以达到上机测序要求,从而提高可用数据比率,降低数据碱基偏向性,降低测序重复率:首先,本发明通过样本裂解液组分的优化,使组分之间相互配合形成一个很好的样本裂解体系,能更有效地将细胞囊泡膜破碎和将cfDNA与蛋白分离;同时优化后的样本裂解液可以提高核酸在溶液中的稳定性,且使核酸更容易沉淀,从而能够从样本中提取得到足够多的DNA,保证有足量的DNA用于后续测序文库的构建;
进一步地,通过使用合适的文库构建试剂,使提取得到的DNA能高效地转化为DNA文库,所述文库构建试剂主要包括:(1)优化后的修复缓冲液,其中添加了亚精胺及表面活性剂曲拉通,亚精胺和曲拉通与修复缓冲液中的其他组分复配,使所述修复缓冲液可稳定修复酶的结构,提高修复酶的活性,从而提高DNA末端修复效率;(2)通过在测序接头连接试剂中添加核酸杂交增强因子甜菜碱,提升接头与DNA杂交的效率与正确性,提高连接效率;(3)创新性的对测序接头3’末端的最后一个T碱基进行硫代修饰与锁核酸修饰,能显著提高测序接头的稳定性,以及测序接头与DNA杂交的牢固性与正确性,进一步增加接头连接效率。使用上述优化后的文库构建试剂,可高效地对DNA进行末端修复和测序接头连接,使DNA高效地转化为DNA测序文库。
本发明提供的试剂盒通过样本裂解液以及上述文库构建试剂的优化,克服了现有自动化平台机械臂移液精确度和各模块功能效率较手工操低的缺陷,使所述试剂盒不仅适用于手工操做,更适用于仪器自动操作,且能实现全自动样本处理及DNA文库构建,可大大缩短样本处理及DNA文库制备时间,最大限度地减少人工操作,极大地提升了产前诊断临床检测项目的时效性,能同时检测胎儿的21、18、13、X和Y染色体的异倍体,以及其他常见染色体变异,如微缺失与拷贝数变异等,具有重复性好、准确率高、灵敏度高和检测限低等优点。
附图说明
图1为利用实施例1所述试剂盒提取得到的cfDNA的检测结果图。
图2为利用实施例1所述试剂盒构建得到的DNA文库的检测结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述,以下给出了本发明的较佳实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解,下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂,均为市售产品。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
本实施例一种人胎儿染色体非整倍体检测试剂盒,所述试剂盒包含以下组分:样本裂解液、蛋白酶K、DNA吸附滤膜、洗涤液I、洗涤液II、DNA洗脱液、DNA末端修复试剂、DNA3’末端加A试剂、测序接头连接试剂、测序接头和DNA纯化试剂;
所述样本裂解液包含以下浓度的组分:Tris-HCl 20mM、盐酸胍50w/v%、曲拉通X-100 10v/v%、亚精胺2w/v%、氯化钠5.5w/v%、多肽1w/v%、蛋白酶K 0.4mg/mL;所述多肽为Ala-Gln二肽,购于楚肽生物;所述蛋白酶K在使用所述样本裂解液前加入样本裂解液中。
所述DNA吸附滤膜为硅基离子交换纤维膜;
所述洗涤液I包含以下浓度的组分:Tris-HCl 20mM、盐酸胍55w/v%、曲拉通X-1007.5v/v%、无水乙醇50v/v%;
所述洗涤液II包含以下浓度的组分:Tris-HCl 10mM、无水乙醇80v/v%;
所述DNA末端修复试剂包括修复酶和修复缓冲液;所述修复酶包含以下浓度的组分:T4多核苷酸激酶2U/ul、T4 DNA聚合酶2U/ul、klenow片段2U/ul;所述修复缓冲液包含以下浓度的组分:Tris-HCl 50mM、MgCl2 5mM、NaCl10mM、dNTP 200nM、DTT 0.5mM、ATP 2mM、亚精胺1.5w/v%、曲拉通1.5v/v%;
所述DNA 3’末端加A试剂包含3’末端加A酶和酶反应缓冲液;所述3’末端加A酶包含以下浓度的组分:Taq DNA聚合酶0.5U/ul、klenow片段3U/ul;所述酶反应缓冲液包含以下浓度的组分:Tris-HCl 50mM、MgCl2 2.5mM、dATP200nM;
所述测序接头连接试剂包含连接酶和连接反应缓冲液;所述连接酶浓度为300U/ul;所述连接反应缓冲液包含以下浓度的组分:Tris-HCl 50mM、MgCl25mM、NaCl 20mM、DTT0.2mM、ATP 2mM、PEG400~8000 5w/v%、甜菜碱1.5M;
所述测序接头为适用于Illumina测序平台的一段索引接头序列,其序列包含i5/i7、index1/2及read1/2三部分构成,所述测序接头的3’端的最后一个T碱基进行了硫代修饰和锁核酸修饰。
所述DNA纯化试剂为DNA纯化磁珠。
实施例2
本实施例一种人胎儿染色体非整倍体检测DNA文库构建方法,利用实施例1所述检测试剂盒在汉密尔顿自动化样本处理及文库制备平台上进行DNA文库构建,包括以下步骤:
(1)用游离细胞采血管采集孕期超过10周的孕妇的外周血,然后于4℃,1600g/min的条件下离心10min;将离心后的血浆放进汉密尔顿自动化平台上,自动化平台对样本信息自动读取并建立文档;仪器按照设定的程序运行,红外检测液面位置,仪器机械臂吸取1.0mL上层血浆至先前放置进仪器的96深孔板中,完成血浆样本的自动化分离;
(2)通过自动化平台机械臂向血浆样本中自动添加所述样本裂解液(血浆与样本裂解液的体积比为0.9:1~1.2,本实施例优选0.9:1),按照设置的条件进行血浆样本裂解:25℃裂解30min;上述的血浆样本裂解完成后,自动化仪器利用机械臂,自动将血浆-裂解消化混合液转移至所述DNA吸附滤膜上,用真空泵将混合液体从DNA吸附滤膜上通过,大部分杂质跟随液体通过,游离DNA已经少量的盐离子吸附在吸附膜上;自动化平台机械臂先吸取所述洗涤液I,真空抽滤洗涤残留在吸附膜上的蛋白质、有机物等杂质;接下来机械臂继续吸取所述洗涤液II进吸附膜上,真空抽滤,将吸附膜上的无机盐离子等杂质洗涤干净;经前面两次自动化洗涤步骤后,自动化平台利用机械臂吸取10~100ul的DNA洗脱液(Elutionbuffer),放置于吸附膜上,静置几分钟后,利用真空抽滤作用,将游离DNA洗脱下来;洗脱下来的游离DNA溶液,仪器机械臂将其转移至新的96孔板中,用于后续的DNA文库制备;
(3)自动化仪器平台移液装置自动吸取所述DNA末端修复试剂中的末端修复混合酶5μL及修复缓冲液10μL添加至游离DNA样本孔中,根据预设定末端修复程序进行游离DNA末端修复:20℃,15min;65℃,10min;
(4)DNA末端修复完成后,仪器自动进入DNA 3’端加‘A’部分,根据程序设定,机械臂吸取所述DNA 3’端加A试剂中的3’末端加A混合酶5μL及酶反应缓冲液10μL进入步骤(3)获得的末端修复反应孔中,操作完成即自动启动DNA加A程序完成加A反应:65℃,10min;
(5)DNA末端加A完成后,仪器自动进入DNA接头连接部分,根据程序设定,机械臂吸取所述测序接头连接试剂中的连接酶5μL、连接反应缓冲液25μL和测序接头5μL添加进步骤(4)末端获得的加A反应孔中,操作完成即自动启动DNA接头连接程序完成连接反应:30℃,20min;65℃,10min;所述的接头为适用于Illumina测序平台的一段索引接头序列,其序列为Illumina公司公开序列,包含i5/i7、index1/2及read1/2三部分构成;
(6)步骤(5)所述接头连接完成后,DNA文库即制备完成,自动化平台将DNA文库转移至适当的位置,开始全自动文库纯化程序(基于磁珠法纯化):①仪器机械臂吸取100μL纯化磁珠转移至DNA文库溶液中,通过上下吹打液体混合均匀,室温静置10min;②仪器机械臂将步骤①中已添加纯化磁珠的DNA文库96孔板转移至磁力板上,室温静置5min,吸附有DNA文库的磁珠被磁力板吸附至96孔板的底部管壁周围;③仪器机械臂将步骤②中的上清溶液吸取干净;④仪器机械臂将96孔板转移至步骤①开始时的位置,加入100μL80%的无水乙醇,上下吹打混匀磁珠,室温放置1min;⑤将第④步的96孔板用机械臂转移至磁力板上,静置3min,吸弃上清液;⑥重复步骤④和⑤一次,吸弃所有上清液体后,将96孔板转移至步骤①的位置,室温放置5min;⑦加入55μL无核酸酶水至96孔板的每个样本孔中,上下吹打10次混匀磁珠,室温放置10min;⑧将第⑦步的96孔板转移至磁力板上,静置5min,吸取50μL上清液至新的96孔板中,得到纯化好的DNA文库。
DNA文库纯化完成后,自动化仪器进入文库定量程序,进行DNA文库的定量,结果输出至计算机处理,然后计算机按照公式计算每个DNA文库pool的量,完成文库自动化文库pool,pool产物可直接进入上机测序环节。
实施例3
利用实施例1所述人胎儿染色体非整倍体检测试剂盒及实施例2所述人胎儿染色体非整倍体检测DNA文库构建方法对48例已知人胎儿染色体变异类型(T21、T18及T13)的孕妇外周血样本进行DNA文库制备,并利用Illumina测序平台对制备得到的DNA文库进行测序,结果如表1所示:
表1人胎儿染色体变异类型检测结果
上述结果显示,48个样本测序有效reads数全部大于8.0M(预期数据量),且每个样本数据量较均一,测序重复率非常低,均不超过2%,远小于经PCR进行DNA文库制备的测序平均重复率30%。
结果表明,本发明试剂盒可实现21、18、13染色体的异倍体的准确检测,结果与临床完全吻合,且测序重复率低,有效数据量大,能进一步保证测序准确率。整个检测过程为仪器全自动操作,大大缩短样本处理及文库制备时间,最大限度地减少人工操作,极大地提升了产前诊断临床检测项目的时效性。
本发明所述试剂盒通过样本裂解液的优化能有效提高DNA得率,进一步通过使用优化后的DNA末端修复试剂和测序接头连接试剂等文库建构试剂,有效提高DNA末端修复效率以及测序接头连接效率,保证提取得到的DNA能高效地转化为DNA文库,使得本发明试剂盒在构建DNA测序文库时不需要进行PCR扩增步骤,即可满足测序要求,且测序效果优于经PCR扩增制备得到的DNA文库。
对比例1
本对比例一种人胎儿染色体非整倍体检测试剂盒,所述试剂盒除了样本裂解液中不含亚精胺外,其他均与实施例1相同,具体如下:
所述样本裂解液包含以下浓度的组分:Tris-HCl 20mM、盐酸胍50w/v%、曲拉通X-100 10v/v%、氯化钠5.5w/v%、多肽1w/v%、蛋白酶K 0.4mg/mL;所述蛋白酶K在使用所述样本裂解液前加入样本裂解液中。
对比例2
本对比例一种人胎儿染色体非整倍体检测试剂盒,所述试剂盒除了样本裂解液中不含多肽外,其他均与实施例1相同,具体如下:
所述样本裂解液包含以下浓度的组分:Tris-HCl 20mM、盐酸胍50w/v%、曲拉通X-100 10v/v%、亚精胺2w/v%、氯化钠5.5w/v%、蛋白酶K 0.4mg/mL;所述蛋白酶K在使用所述样本裂解液前加入样本裂解液中。
对比例3
本对比例一种人胎儿染色体非整倍体检测试剂盒,所述试剂盒除了DNA末端修复缓冲液中不含亚精胺和曲拉通外,其他均与实施例1相同,具体如下:
所述修复缓冲液包含以下浓度的组分:Tris-HCl 50mM、MgCl2 5mM、NaCl10mM、dNTP 200nM、DTT 0.5mM、ATP 2mM。
对比例4
本对比例一种人胎儿染色体非整倍体检测试剂盒,所述试剂盒除了连接反应缓冲液中不含甜菜碱外,其他均与实施例1相同,具体如下:
所述连接反应缓冲液包含以下浓度的组分:Tris-HCl 50mM、MgCl2 5mM、NaCl20mM、DTT0.2mM、ATP 2mM、PEG400~8000 5w/v%。
分别利用实施例1和对比例1-2所述试剂盒对10例孕妇血浆样本进行游离DNA提取,方法与实施例2相同,检测提取得到的游离DNA溶液的浓度。
分别利用实施例1、对比例3和对比例4所述试剂盒对上述10例孕妇血浆样本进行游离DNA提取和DNA文库构建,测定DNA文库浓度,以此评价试剂盒的DNA末端修复效率和接头连接效率,方法与实施例2相同。
具体检测结果如表2所示:
表2 10例孕妇血浆样本检测结果
上述结果表明,本发明实施例1所述试剂盒通过样本裂解液、DNA末端修复试剂、测序接头连接试剂组分的优化,能有效提高DNA得率(图1),DNA末端修复效率以及接头连接效率,使得本发明试剂盒在构建DNA测序文库时不需要进行PCR扩增步骤,即可制备得到能满足测序要求的DNA文库(图2)。
与实施例1相比,对比例1-2中的样本裂解液分别缺少亚精胺和多肽,使得提取得到的DNA溶液浓度下降,降低DNA得率。本发明通过样本裂解液组分的优化,创新性地加入亚精胺和多肽,在所述样本裂解液其他组分的配合下,亚精胺可使核酸更容易被离液盐所沉淀,提高产量;同时多肽可提高核酸在溶液中的稳定性,提高核酸富集得率;从而使所述样本裂解液形成一个很好的裂解提取体系,能够提取得到足量的DNA用于后续建库。
与实施例1相比,对比例3中的修复缓冲液不含有亚精胺和曲拉通,其对DNA末端的修复效率下降。本发明修复缓冲液中创新性地添加了亚精胺及表面活性剂曲拉通,亚精胺和曲拉通与修复缓冲液中的其他组分复配,使得所述修复缓冲液可稳定修复酶的结构,提高修复酶的活性,从而提高DNA末端修复效率。
与实施例1相比,对比例4中的连接反应缓冲液不含甜菜碱,会导致接头连接效率下降。本发明通过在连接反应缓冲液中加入甜菜碱,能进一步提升接头与DNA杂交的效率与正确性,提高连接效率。
本发明试剂盒通过以上组分的优化调整,提升了DNA的得率和连接效率,使DNA高效转化为DNA文库,无需PCR扩增就可以达到上机测序要求。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.血浆样本裂解液在制备人胎儿染色体非整倍体检测DNA文库构建试剂盒中的应用,其特征在于,所述血浆样本裂解液包含以下浓度的组分:Tris-HCl 20mM、盐酸胍50w/v%、曲拉通X-100 10v/v%、亚精胺2w/v%、氯化钠 5.5w/v%、多肽1w/v%、蛋白酶K 0.4mg/mL,所述蛋白酶K在使用所述血浆样本裂解液前加入血浆样本裂解液中;
所述多肽为Ala-Gln二肽。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述试剂盒还包括DNA末端修复试剂,所述DNA末端修复试剂包括修复酶和修复缓冲液;所述修复缓冲液包含以下浓度的组分:Tris-HCl 50mM、MgCl2 5mM、NaCl 10mM、dNTP 200nM、DTT 0.5mM、ATP 2mM、亚精胺1.5w/v%、曲拉通1.5v/v%。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述修复酶包含以下浓度的组分:T4多核苷酸激酶2U/ul、T4 DNA聚合酶2U/ul、klenow片段2U/ul。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述试剂盒还包括测序接头连接试剂,所述测序接头连接试剂包含连接酶和连接反应缓冲液;所述连接反应缓冲液包含以下浓度的组分:Tris-HCl 50mM、MgCl2 5mM、NaCl 20mM、DTT 0.2mM、ATP 2mM、PEG400~8000 5w/v%、甜菜碱1.5M。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述试剂盒还包括测序接头,所述测序接头的3’端的最后一个T碱基进行了硫代修饰和/或锁核酸修饰。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述试剂盒还包括DNA吸附滤膜、洗涤液I、洗涤液II、DNA洗脱液;
所述洗涤液I包含以下浓度的组分:Tris-HCl 20mM、盐酸胍55w/v%、曲拉通X-1007.5v/v%、无水乙醇50v/v%;
所述洗涤液II包含以下浓度的组分:Tris-HCl 10mM、无水乙醇80 v/v %。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述试剂盒还包括DNA纯化试剂。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述DNA纯化试剂为DNA纯化磁珠。
9.一种非诊断目的人胎儿染色体非整倍体检测DNA文库构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)采集孕妇外周血,分离血浆样本;
(2)向步骤(1)获得的血浆样本中加入权利要求1中的所述血浆样本裂解液,于18~30℃条件下进行血浆样本裂解20~40min;将裂解后的血浆样本从权利要求6中的所述DNA吸附滤膜上滤过,分别用权利要求6中的所述洗涤液I和所述洗涤液II进行洗涤,然后用DNA洗脱液进行洗脱,得到DNA溶液;
(3)利用权利要求2中的所述DNA末端修复试剂对步骤(2)获得的DNA进行末端修复;
(4)利用DNA 3’末端加A试剂对步骤(3)获得的DNA末端修复产物进行3’末端加A;
(5)利用权利要求4中的所述测序接头连接试剂对步骤(4)获得的DNA 3’末端加A产物和权利要求5中的所述测序接头进行连接;
(6)步骤(5)所述测序接头连接完成后,即得到DNA文库,利用权利要求7中的所述DNA纯化试剂对DNA文库进行纯化。
10.根据权利要求9所述的非诊断目的人胎儿染色体非整倍体检测DNA文库构建方法,其特征在于,所述步骤(1)具体为:用游离细胞采血管采集孕期超过10周的孕妇的外周血,然后于4±0.5℃,1600±10g/min的条件下离心10-20min,分离血浆样本。
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