CN108220403B

CN108220403B - 特定突变位点的检测方法、检测装置、存储介质及处理器

Info

Publication number: CN108220403B
Application number: CN201711435780.2A
Authority: CN
Inventors: 白灵; 谭泽民; 方楠; 刘珂弟; 刘倩; 唐宇
Original assignee: Beijing Usci Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Usci Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-12-26
Filing date: 2017-12-26
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2037-12-26
Also published as: CN108220403A

Abstract

本发明提供了一种特定突变位点的检测方法、检测装置、存储介质及处理器。该检测方法包括：根据人群中特定突变位点的特定单倍型，判断待测个体中特定突变位点的基因型。通过利用已有的或构建的针对特定突变位点对应的特定单倍型进行无创检测判断待测个体中特定突变位点的基因型，不仅该方法所需试剂价格便宜，可形成高通量的检测规模，而且不需要单独构建父母亲和先证者样本的单倍型，更贴近临床，并易于推广。

Description

特定突变位点的检测方法、检测装置、存储介质及处理器

技术领域

本发明涉及单基因突变的检测方法，具体而言，涉及一种特定突变位点的检测方法、检测装置、存储介质及处理器。

背景技术

产前检测是在孕早期或中期对胎儿进行检查，以便能够对发现的问题进行提前的干预或治疗。传统的产前检测主要是侵入性的手段：绒毛活检、羊膜穿刺和经腹脐静脉穿刺等。虽然检测的结果比较准确，但是风险较高，容易造成孕妇流产或宫内感染。

1997年，香港大学卢煜明团队首次发现孕妇外周血中含有胎儿游离核酸，基于此发现利用高通量测序平台结合低深度全基因组测序技术和Z值检验进行胎儿13/18/21号染色体非整倍体的无创产前检测技术不断成熟和发展并逐步应用于临床，目前部分公司在此基础上扩展到了染色体的微缺失和微重复检测。虽然目前已经能够在这些染色体水平对胎儿进行无创检测，减少染色体异常所带来的缺陷儿的出生，减少家庭负担并带来巨大的社会效益。

目前已有一些方法用于部分单基因病的无创检测，如利用数字PCR进行父源性或者新发的致病突变的检测；利用COLD(coamplification at lower denaturationtemperature)-PCR、Allele-specific real-time PCR进行父源性致病突变的无创单基因病检测；利用cSMART(ciruclating single-molecule amplification and resequencingtechnology)技术进行Wilson disease的无创检测；也有利用基于单倍型分析结合高通量测序技术来进行单基因病的无创检测。

血浆中胎儿等位基因的精确定量，比较等位基因处突变的相对含量问题，对于胎儿遗传的父源性突变或者denovo突变检测相对较易，这也是目前多数技术应用于单基因病的无创检测所解决的问题，而对于常染色体的隐性遗传检测，还比较困难。

目前已有基于单倍型分析的单基因病无创检测，但是需要收集父亲、母亲以及受该单基因病影响的先证者(指该家族第一个就诊或发现的患病成员)的基因组DNA样本，通过对三者的基因组DNA进行测序，根据SNP位点信息构建父母亲的单倍型，然后根据孕妇血浆游离DNA的测序数据，利用相对单倍型剂量(RHDO)分析计算胎儿遗传的单倍型的类型来判断胎儿在致病位点处的基因型，这一个过程往往比较复杂，费时费力，检测的价格比较昂贵，而且有时候并不能方便的收集到一级亲属的DNA样本，导致不能很好的应用于临床。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种特定突变位点的检测方法、检测装置、存储介质及处理器，以解决现有技术中在检测某些突变位点时存在检测过程复杂，不利于临床上的推广的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种特定突变位点的检测方法，该检测方法包括：根据人群中特定突变位点的特定单倍型，判断待测个体中特定突变位点的基因型。

进一步地，根据人群中特定突变位点的特定单倍型，判断待测个体中特定突变位点的基因型之前，检测方法还包括构建人群中特定突变位点的单倍型的步骤。

进一步地，构建人群中特定突变位点的特定单倍型的步骤包括：获取人群中来源于不同家系样本的包含特定突变位点的测序数据，其中，每个家系样本包括父本、母本及先证者；统计各测序数据中的SNP位点的基因型，得到每个样本的SNP位点信息；去除每个样本的SNP位点信息中的INDEL位点以及偏离孟德尔遗传定律的SNP位点，得到每个样本的有效SNP位点；对每个样本的有效SNP位点进行单倍体分型，得到每个样本的两条单倍型；以及比较所有家系中先证者的两条单倍型中在特定突变位点为突变型碱基时所对应的单倍型，找出所有与特定突变位点的突变型碱基连锁遗传的SNP位点，从而构成人群中特定突变位点的特定单倍型；

进一步地，获取人群中来源于不同家系样本的包含特定突变位点的测序数据的步骤包括：设计并合成包含特定突变位点的文库杂交探针；获取人群中来源于不同家系样本的基因组DNA文库；将基因组DNA文库与文库杂交探针进行杂交捕获反应，得到捕获文库；以及对捕获文库进行测序，得到人群中来源于不同家系样本的包含特定突变位点的测序数据。

进一步地，设计并合成包含特定突变位点的文库杂交探针的步骤包括：从HAPMAP数据库中选择特定突变位点所在基因上下游各1M区域的AF在0.05-0.95之间的SNP，且在基因的上下游的区域每间隔2000～4000bp挑选一个SNP，共计挑选900～1200个SNP位点，若挑选的SNP位点不足900～1200个SNP位点，则从1000genomes中CHB选择补足；从挑选的900～1200个SNP位点中过滤掉位于重复区域和CNV区域的位点，剩余的SNP位点作为用于单倍型分析的SNP位点；设计并合成包含用于单倍型分析的SNP位点的DNA探针，DNA探针的两端添加有通用接头序列；以及将DNA探针依次进行扩增和转录，得到带有生物素标记的RNA探针，带有生物素标记的RNA探针即为文库杂交探针。

进一步地，每个样本的SNP位点信息以vcf文件形式存在，去除每个样本的SNP位点信息中的INDEL位点以及偏离孟德尔遗传定律的SNP位点，得到每个样本的有效SNP位点的步骤包括：从vcf文件中去除每个样本的SNP位点信息中的INDEL位点；将所有样本的vcf文件进行合并，将合并后的vcf文件转化成plink格式的文件；以及将plink格式的文件转化为Beagle格式的文件，去除Beagle格式文件中偏离孟德尔遗传定律的SNP位点，得到每个样本的有效SNP位点。

进一步地，输入Beagle对每个样本的有效SNP位点进行单倍体分型，得到每个样本的两条单倍型。

进一步地，待测个体为胎儿，根据人群中特定突变位点的特定单倍型，判断待测个体中特定突变位点的基因型的步骤包括：获取父亲基因组DNA和母亲基因组DNA的特定单倍型中各SNP位点的基因型信息，并获取母亲血浆游离DNA的特定单倍型中各SNP位点的碱基类型的频率；挑选在母亲基因组DNA中的基因型为杂合而在父亲基因组DNA中的基因型为纯合的SNP位点，记为第一类SNP位点，并根据母亲血浆游离DNA中对应的第一类SNP位点的突变碱基的频率，判断胎儿遗传了来源于母亲野生型的单倍型还是突变型的单倍型；挑选在母亲基因组DNA中的基因型为纯合而在父亲基因组DNA的基因型为杂合的SNP位点，记为第二类SNP位点，并根据母亲血浆游离DNA中对应的第二类SNP位点的突变碱基的频率，判断胎儿遗传了来源于父亲野生型的单倍型还是突变型的单倍型；以及将胎儿的来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与人群中特定突变位点的特定单倍型进行比较，根据比较结果确定胎儿在突变位点的基因型。

进一步地，根据母亲血浆游离DNA中对应的第一类SNP位点的突变碱基的频率，判断胎儿遗传了来源于母亲野生型的单倍型还是突变型的单倍型的步骤包括：当突变碱基的频率小于50％时，则确定胎儿遗传了来源于母亲野生型的单倍型，当突变碱基的频率大于50％时，则确定胎儿遗传了来源于母亲突变型的单倍型。

进一步地，根据母亲血浆游离DNA中对应的第二类SNP位点的突变碱基的频率，判断胎儿遗传了来源于父亲野生型的单倍型还是突变型的单倍型的步骤包括：当母亲在第二类SNP位点的基因型为野生型纯合时，若检测到突变型频率，则确定胎儿遗传了来源于父亲的突变型的单倍型；当母亲在第二类SNP位点的基因型为突变型纯合时，若检测到野生型频率，则确定胎儿遗传了来源于父亲的野生型的单倍型。

进一步地，根据比较结果确定胎儿在突变位点的基因型的步骤包括：若来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与人群中特定突变位点的特定单倍型的比较结果均一致，则确定胎儿在特定突变位点的基因型为纯合突变；若来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与人群中特定突变位点的特定单倍型的比较结果之一为一致，则确定胎儿在特定突变位点的基因型为杂合突变；若来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与人群中特定突变位点的特定单倍型的比较结果均不一致，则确定胎儿在特定突变位点的基因型为野生型。

为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种特定突变位点的检测装置，该检测装置包括：判断单元，用于根据人群中特定突变位点的特定单倍型，判断待测个体中特定突变位点的基因型。

进一步地，判断单元在根据人群中特定突变位点的特定单倍型，判断待测个体中特定突变位点的基因型之前，检测装置还包括特定突变位点的单倍型构建单元，特定突变位点的单倍型构建单元用于构建人群中特定突变位点的单倍型。

进一步地，特定突变位点的单倍型构建单元包括：第一获取模块，用于获取人群中来源于不同家系样本的包含特定突变位点的测序数据，其中，每个家系样本包括父本、母本及先证者；统计模块，用于统计各测序数据中的SNP位点的基因型，得到每个样本的SNP位点信息；过滤模块，用于去除每个样本的SNP位点信息中的INDEL位点以及偏离孟德尔遗传定律的SNP位点，得到每个样本的有效SNP位点；单倍体分型模块，用于对每个样本的有效SNP位点进行单倍体分型，得到每个样本的两条单倍型；以及比较构建模块，用于比较所有家系中先证者的两条单倍型中在特定突变位点为突变型碱基时所对应的单倍型，找出所有与特定突变位点的突变型碱基连锁遗传的SNP位点，从而构成人群中特定突变位点的特定单倍型；

进一步地，第一获取模块包括：设计合成子模块，用于设计并合成包含特定突变位点的文库杂交探针；文库获取子模块，用于获取人群中来源于不同家系样本的基因组DNA文库；捕获子模块，用于将基因组DNA文库与文库杂交探针进行杂交捕获反应，得到捕获文库；以及测序子模块，用于对捕获文库进行测序，得到人群中来源于不同家系样本的包含特定突变位点的测序数据。

进一步地，设计合成子模块包括：SNP挑选元件，用于从HAPMAP数据库中选择特定突变位点所在基因上下游各1M区域的AF在0.05-0.95之间的SNP，且在基因上下游的区域每间隔2000～4000bp挑选一个SNP，共计挑选900～1200个SNP位点，若挑选的SNP位点不足900～1200个，则从1000genomes中CHB选择补足；过滤元件，用于从挑选的900～1200个SNP位点中过滤掉位于重复区域和CNV区域的位点，剩余的SNP位点作为用于单倍型分析的SNP位点；DNA探针元件，用于设计并合成包含用于单倍型分析的SNP位点的DNA探针，DNA探针的两端添加有通用接头序列；以及RNA探针元件，用于将DNA探针依次进行扩增和转录，得到带有生物素标记的RNA探针，带有生物素标记的RNA探针即为文库杂交探针。

进一步地，统计模块中每个样本的SNP位点信息以vcf文件形式存在，过滤模块包括：第一去除元件，用于从vcf文件中去除每个样本的SNP位点信息中的INDEL位点；格式转换元件，用于将所有样本的vcf文件进行合并，将合并后的vcf文件转化成plink格式的文件；第二去除元件，用于将plink格式的文件转化为Beagle格式的文件，去除Beagle格式文件中偏离孟德尔遗传定律的SNP位点，得到每个样本的有效SNP位点。

进一步地，单倍体分型模块为Beagle模块。

进一步地，待测个体为胎儿，判断单元包括：第二获取模块，用于获取父亲基因组DNA和母亲基因组DNA的特定单倍型中各SNP位点的基因型信息，并获取母亲血浆游离DNA的特定单倍型中各SNP位点的碱基类型的频率；第一筛选模块，用于挑选在母亲基因组DNA中的基因型为杂合而在父亲基因组DNA中的基因型为纯合的SNP位点，记为第一类SNP位点；来源于母亲的单倍型判断模块，用于根据母亲血浆游离DNA中对应的第一类SNP位点的突变碱基的频率，判断胎儿遗传了来源于母亲野生型的单倍型还是突变型的单倍型；第二筛选模块，用于挑选在母亲基因组DNA中的基因型为纯合而在父亲基因组DNA的基因型为杂合的SNP位点，记为第二类SNP位点；来源于父亲的单倍型判断模块，用于根据母亲血浆游离DNA中对应的第二类SNP位点的突变碱基的频率，判断胎儿遗传了来源于父亲野生型的单倍型还是突变型的单倍型；胎儿单倍型比对模块，用于将胎儿的来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与人群中特定突变位点的特定单倍型进行比较；以及胎儿基因型确定模块，用于根据比较结果确定胎儿在突变位点的基因型。

进一步地，来源于母亲的单倍型判断模块包括：第一单倍型子模块，用于当突变碱基的频率小于50％时，则确定胎儿遗传了来源于母亲野生型的单倍型；第二单倍型子模块，用于当突变碱基的频率大于50％时，则确定胎儿遗传了来源于母亲突变型的单倍型。

进一步地，来源于父亲的单倍型判断模块包括：第三单倍型子模块，用于当母亲在第二类SNP位点的基因型为野生型纯合时，若检测到突变型频率，则确定胎儿遗传了来源于父亲的突变型的单倍型；第四单倍型子模块，用于当母亲在第二类SNP位点的基因型为突变型纯合时，若果检测到野生型频率，则确定胎儿遗传了来源于父亲的野生型的单倍型。

进一步地，胎儿基因型确定模块包括：第一胎儿基因型确定子模块，用于当来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与人群中特定突变位点的特定单倍型的比较结果均一致时，确定胎儿在特定突变位点的基因型为纯合突变；第二胎儿基因型确定子模块，用于当来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与人群中特定突变位点的特定单倍型的比较结果之一为一致时，确定胎儿在特定突变位点的基因型为杂合突变；第三胎儿基因型确定子模块，用于当来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与人群中特定突变位点的特定单倍型的比较结果均不一致时，确定胎儿在特定突变位点的基因型为野生型。

根据本申请的第三个方面，提供了一种存储介质，该存储介质包括存储的程序，其中，在程序运行时控制存储介质所在的设备执行上述任一种检测方法。

根据本申请的第四个方面，提供了一种处理器，该处理器用于运行程序，其中，程序运行时执行上述任一种检测方法。

应用本发明的技术方案，本发明通过先构建出特定突变位点的特定单倍型，应用于无创检测分析时就不需要再单独构建父母亲的单倍型，因此具有较大的成本优势，检测相对简单，更易于用于临床的检测。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了根据本申请的一个具体实施例中通过对母亲羊水细胞基因组DNA进行测序的结果图，其验证了基于特定单倍型的无创检测结果的准确性。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

术语解释：

AF：等位基因频率。

CHB(Han Chinese in Bejing，北京汉族人)。

CNV：Copy Number Variation，拷贝数变异。

1000genomes：千人基因组。

如背景技术所提到的，针对具有特定单倍型遗传特点的单基因遗传病的无创检测，现有的基于单倍型分析的单基因病无创检测需要收集父亲母亲及受累的先证者样本，构建父母亲的单倍型，用于无创检测的分析，该检测过程复杂，检测费用昂贵，不利于临床上的推广。为了改善这一状况，在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种特定突变位点的检测方法，该检测方法包括：根据人群中特定突变位点的特定单倍型，判断待测个体中特定突变位点的基因型。

根据现有公开的众多数据库中的突变数据，针对某些特定突变位点已经能够构建特定单倍型。在此情况下，待测个体中特定突变位点的基因型可以根据人群中特定突变位点的特定单倍型来进行判断，而无需收集父亲、母亲及受累的先证者样本，构建父母亲的单倍型来进行判断，因而具有较大的成本优势，检测相对简单，更易于临床推广。

如果现有数据库中的突变数据不足以构建针对某特定突变位点的特定单倍型，为了提高该特定突变位点的基因型的检测成本及检测便利性，在本申请一种优选的实施例中，在根据人群中特定突变位点的特定单倍型，判断待测个体中特定突变位点的基因型之前，该检测方法还包括构建人群中特定突变位点的单倍型的步骤。具体构建人群中特定突变位点的单倍型的步骤，可以根据现有的单倍型的构建方法基础上进行适当优化调整得到。

在本申请一种优选的实施例中，上述构建人群中特定突变位点的特定单倍型的步骤包括：获取人群中来源于不同家系样本的包含特定突变位点的测序数据，其中，每个家系样本包括父本、母本及先证者；统计各测序数据中的SNP位点的基因型，得到每个样本的SNP位点信息；去除每个样本的SNP位点信息中的INDEL位点以及偏离孟德尔遗传定律的SNP位点，得到每个样本的有效SNP位点；对每个样本的有效SNP位点进行单倍体分型，得到每个样本的两条单倍型；比较所有家系中先证者的两条单倍型中在特定突变位点为突变型碱基时所对应的单倍型，找出所有与特定突变位点的突变型碱基连锁遗传的SNP位点，从而构成人群中特定突变位点的特定单倍型。

上述优选的实施例中，通过选定人群中含有特定突变位点的多个家系，并根据每个家系中的父亲、母亲及先证者的每个样本的测序数据中的SNP位点的基因型信息，去除无效或有干扰的SNP位点，获得各样本的有效SNP位点的基因型信息，从而获得每个样本的两条单倍型，进一步将所有先证者的两条单倍型中的含有该特定突变位点的突变型单倍型，找出所有先证者中与该特定突变位点一起连锁遗传的SNP位点，从而构成了人群中含有该特定突变位点的特定单倍型。构建好含有该特定突变位点的突变型单倍型时，在检测待测个体在该特定突变位点所对应的基因型时，无需再单独构建父母的单倍型，更贴近临床，并易于推广，因而检测流程简单，可形成高通量的检测规模。

上述优选的实施例中，获取人群中来源于不同家系样本的包含特定突变位点的测序数据的步骤与获取常规的测序数据的步骤类似，通过捕获目的片段即可获得相应的测序数据。在本申请一种优选的实施例中，获取人群中来源于不同家系样本的包含特定突变位点的测序数据的步骤包括：设计并合成包含特定突变位点的文库杂交探针；获取人群中来源于不同家系样本的基因组DNA文库；将基因组DNA文库与文库杂交探针进行杂交捕获反应，得到捕获文库；对捕获文库进行测序，得到人群中来源于不同家系样本的包含特定突变位点的测序数据。

上述设计并合成包含特定突变位点的文库杂交探针的步骤与常规的捕获文库中的捕获杂交探针的步骤类似。为了使所捕获到的目的片段中的SNP位点更具有代表性，在本申请一种优选的实施例中，设计并合成包含特定突变位点的文库杂交探针的步骤包括：从HAPMAP数据库中选择特定突变位点所在基因上下游各1M区域的AF在0.05-0.95之间的SNP，且在基因的上下游的区域每间隔2000～4000bp挑选一个SNP，共计挑选900～1200个SNP位点，若挑选的SNP位点不足900～1200个SNP位点，则从1000genomes中CHB选择补足；从挑选的900～1200个SNP位点中过滤掉位于重复区域和CNV区域的位点，剩余的SNP位点作为用于单倍型分析的SNP位点；设计并合成包含用于单倍型分析的SNP位点的DNA探针，DNA探针的两端添加有通用接头序列；将DNA探针依次进行扩增和转录，得到带有生物素标记的RNA探针，带有生物素标记的RNA探针即为文库杂交探针。

上述选取SNP所在区域的步骤中，在基因内部所有的SNP都保留，而在基因的上下游的区域按照每间隔2000～4000bp的挑选一个SNP，若在基因的上下游的区域按照每间隔2000～4000bp的挑选一个SNP的方式难以满足900～1200个SNP位点的要求，可以将2000～4000bp的间隔适当扩大，比如扩大到2500～5000bp或者3000～6000bp，具体间隔的扩大可以根据实际需要进行合理调整。

上述优选实施例中，采用RNA探针来进行文库的杂交捕获。需要说明的是，本申请中用于杂交反应捕获特定区域的探针并不局限于RNA探针，也可以是DNA探针。在实际应用中，可以根据需要进行合理设计或选择。

上述去除特殊位点以保留有效的SNP位点的方式可以采用现有已知的去除方式来进行去除。在本申请一种优选的实施例中，每个样本的SNP位点信息以vcf文件形式存在，去除每个样本的SNP位点信息中的INDEL位点以及偏离孟德尔遗传定律的SNP位点，得到每个样本的有效SNP位点的步骤包括：从vcf文件中去除每个样本的SNP位点信息中的INDEL位点；将所有样本的vcf文件进行合并，将合并后的vcf文件转化成plink格式的文件；将plink格式的文件转化为Beagle格式的文件，去除Beagle格式文件中偏离孟德尔遗传定律的SNP位点，得到每个样本的有效SNP位点。上述优选的实施例中，采用上述方式进行去除方便、快捷、准确。

对SNP位点进行分型的步骤中，可以采用现有的单倍型分型软件进行分型，也可以对现有软件进行适当改进后再进行分型。在本申请一种优选的实施例中，通过输入Beagle对每个样本的有效SNP位点进行单倍体分型，得到每个样本的两条单倍型。

在本申请一种优选的实施例中，待测个体为胎儿，根据人群中特定突变位点的特定单倍型，判断待测个体中特定突变位点的基因型的步骤包括：获取父亲基因组DNA和母亲基因组DNA的特定单倍型中各SNP位点的基因型信息，并获取母亲血浆游离DNA的特定单倍型中各SNP位点的碱基类型的频率；挑选在母亲基因组DNA中的基因型为杂合而在父亲基因组DNA中的基因型为纯合的SNP位点，记为第一类SNP位点，并根据母亲血浆游离DNA中对应的第一类SNP位点的突变碱基的频率，判断胎儿遗传了来源于母亲野生型的单倍型还是突变型的单倍型；挑选在母亲基因组DNA中的基因型为纯合而在父亲基因组DNA的基因型为杂合的SNP位点，记为第二类SNP位点，并根据母亲血浆游离DNA中对应的第二类SNP位点的突变碱基的频率，判断胎儿遗传了来源于父亲野生型的单倍型还是突变型的单倍型；将胎儿的来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与人群中特定突变位点的特定单倍型进行比较，根据比较结果确定胎儿在突变位点的基因型。

上述优选的实施例中，仅需要根据父母在某些特定SNP位点的基因型即可判定胎儿来源于母亲的单倍型和来源于父亲的单倍型，然后通过与人群中特定突变位点的特定单倍型进行比对，即可获得胎儿在该特定突变位点的基因型。该方法不仅在不方便收集一级亲属的DNA样本时能够实现对胎儿基因型的检测，而且一次构建好的人群中特定突变位点的特定单倍型，可以适用于后续对所有样本针对该特定突变位点的基因型的检测。因此，具有检测方便、成本低，便于临床推广的显著优势。

上述优选实施例中，具体判断胎儿遗传了来源于母亲或来源于父亲的哪条单倍型的判断方法可以根据现有方法进行判断。为了进一步提高判断的准确性，在本申请一种优选的实施例中，根据母亲血浆游离DNA中对应的第一类SNP位点的突变碱基的频率，判断胎儿遗传了来源于母亲野生型的单倍型还是突变型的单倍型的步骤包括：当突变碱基的频率小于50％时，则确定胎儿遗传了来源于母亲野生型的单倍型，当突变碱基的频率大于50％时，则确定胎儿遗传了来源于母亲突变型的单倍型。

在本申请一种优选的实施例中，根据母亲血浆游离DNA中对应的第二类SNP位点的突变碱基的频率，判断胎儿遗传了来源于父亲野生型的单倍型还是突变型的单倍型的步骤包括：当母亲在第二类SNP位点的基因型为野生型纯合时，若检测到突变型频率，则确定胎儿遗传了来源于父亲的突变型的单倍型；当母亲在第二类SNP位点的基因型为突变型纯合时，若检测到野生型频率，则确定胎儿遗传了来源于父亲的野生型的单倍型。

上述优选的实施例中的判断方法在此举例说明：

以中国人群耳聋基因(GJB2基因235位点del C)为例，当判断来源于母亲的哪一条单倍型时，由于第一类SNP位点为母亲杂合，父亲纯合，当母亲血浆游离DNA中对应的第一类SNP位点的突变碱基的频率小于50％时，表明野生型的碱基类型大于50％，而母亲血浆游离DNA中母亲为杂合体，母亲的野生型碱基类型和突变型碱基类型各占50％，因而大于50％的那部分的野生型的碱基类型即为胎儿的基因型。同样地，当母亲血浆游离DNA中对应的第一类SNP位点的突变碱基的频率大于50％时，大于50％的那部分的突变型的碱基类型即为胎儿的基因型。

具体地，在上述优选的实施例中，某SNP位点的突变型频率以在该位点处包含突变型的reads数与包含该位点的所有reads数的比值进行计算。且上述突变型频率小于50％或大于50％的判断标准，以具体SNP位点的突变型频率与50％的差值大于平均测序错误率的3倍偏差为准。

类似地，当判断来源于父亲的哪一条单倍型时，由于第二类SNP位点为母亲纯合，父亲杂合，根据母亲是野生型纯合还是突变型纯合，当母亲血浆游离DNA检测到与母亲的单倍型不一致的碱基类型时，则可以判断胎儿遗传了来自父亲的相应碱基类型。当从母亲血浆游离DNA中检测到的与母亲的纯合基因型不一致的碱基的频率大于平均测序错误率的2倍偏差时，认为“检测到与母亲的单倍型不一致的碱基类型”。

在本申请一种优选的实施例中，根据比较结果确定胎儿在突变位点的基因型的步骤包括：若来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与人群中特定突变位点的特定单倍型的比较结果均一致，则确定胎儿在特定突变位点的基因型为纯合突变；若来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与人群中特定突变位点的特定单倍型的比较结果之一为一致，则确定胎儿在特定突变位点的基因型为杂合突变；若来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与人群中特定突变位点的特定单倍型的比较结果均不一致，则确定胎儿在特定突变位点的基因型为野生型。

在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种特定突变位点的检测装置，该检测装置包括：判断单元，用于根据人群中特定突变位点的特定单倍型，判断待测个体中特定突变位点的基因型。

本申请的检测装置中的判断单元能够根据现有公开的众多数据库中的突变数据，针对某些特定突变位点已经能够构建特定单倍型，而且在此情况下，待测个体中特定突变位点的基因型可以根据人群中特定突变位点的特定单倍型来进行判断，而无需收集父亲、母亲及受累的先证者样本，构建父母亲的单倍型来进行判断，因而具有较大的成本优势，检测相对简单，更易于临床推广。

在本申请一种优选的实施例中，判断单元在根据人群中特定突变位点的特定单倍型，判断待测个体中特定突变位点的基因型之前，检测装置还包括特定突变位点的单倍型构建单元，特定突变位点的单倍型构建单元用于构建人群中特定突变位点的单倍型。上述特定突变位点的单倍型构建单元能够在现有数据库中的突变数据不足以构建针对某特定突变位点的特定单倍型的情况下构建出人群中的该特定突变位点的特定单倍型，进而提高该特定突变位点的基因型的检测成本及检测便利性。

在本申请一种优选的实施例中，特定突变位点的单倍型构建单元包括：第一获取模块，用于获取人群中来源于不同家系样本的包含特定突变位点的测序数据，其中，每个家系样本包括父本、母本及先证者；统计模块，用于统计各测序数据中的SNP位点的基因型，得到每个样本的SNP位点信息；过滤模块，用于去除每个样本的SNP位点信息中的INDEL位点以及偏离孟德尔遗传定律的SNP位点，得到每个样本的有效SNP位点；单倍体分型模块，用于对每个样本的有效SNP位点进行单倍体分型，得到每个样本的两条单倍型；以及比较分析模块，用于比较所有家系中先证者的两条单倍型中在特定突变位点为突变型碱基时所对应的单倍型，找出所有与特定突变位点的突变型碱基连锁遗传的SNP位点，从而构成人群中特定突变位点的特定单倍型。

上述优选实施例中的特定突变位点的单倍型构建单元，先通过执行第一获取模块选定人群中含有该特定突变位点的多个家系，然后依次执行统计模块、过滤模块以及单倍型分型模块，根据每个家系中的父亲、母亲及先证者的每个样本的测序数据中的SNP位点的基因型信息，去除无效或有干扰的SNP位点，获得各样本的有效SNP位点的基因型信息，从而获得每个样本的两条单倍型，进一步执行比较分析模块将所有先证者的两条单倍型中的含有该特定突变位点的突变型单倍型，找出所有先证者中与该特定突变位点一起连锁遗传的SNP位点，从而构成了人群中含有该特定突变位点的特定单倍型。该特定突变位点的单倍型构建单元所构建好的含有该特定突变位点的突变型单倍型，在检测待测个体在该特定突变位点所对应的基因型时，无需再单独构建父母的单倍型，更贴近临床，并易于推广，因而检测流程简单，可形成高通量的检测规模。

上述优选的实施例中，用于获取人群中来源于不同家系样本的包含特定突变位点的测序数据的第一获取模块与常规的测序数据的获取模块类似，通过利用捕获目的片段即可获得相应的测序数据。在本申请一种优选的实施例中，第一获取模块包括：设计合成子模块，用于设计并合成包含特定突变位点的文库杂交探针；文库获取子模块，用于获取人群中来源于不同家系样本的基因组DNA文库；捕获子模块，用于将基因组DNA文库与文库杂交探针进行杂交捕获反应，得到捕获文库；以及测序子模块，用于对捕获文库进行测序，得到人群中来源于不同家系样本的包含特定突变位点的测序数据。

上述捕获子模块中的文库杂交探针的设计并合成步骤与常规的捕获文库中的捕获杂交探针的设计合成步骤类似。为了使所捕获到的目的片段中的SNP位点更具有代表性，在本申请一种优选的实施例中，设计合成子模块包括：SNP挑选元件，用于从HAPMAP数据库中选择特定突变位点所在基因上下游各1M区域的AF在0.05-0.95之间的SNP，且在基因上下游的区域每间隔2000～4000bp挑选一个SNP，共计挑选900～1200个SNP位点，若挑选的SNP位点不足900～1200个，则从1000genomes中CHB选择补足；过滤元件，用于从挑选的900～1200个SNP位点中过滤掉位于重复区域和CNV区域的位点，剩余的SNP位点作为用于单倍型分析的SNP位点；DNA探针元件，用于设计并合成包含用于单倍型分析的SNP位点的DNA探针，DNA探针的两端添加有通用接头序列；RNA探针元件，用于将DNA探针依次进行扩增和转录，得到带有生物素标记的RNA探针，带有生物素标记的RNA探针即为文库杂交探针。

上述SNP挑选元件在选取SNP所在区域的步骤中，在基因内部所有的SNP都保留，而在基因的上下游的区域按照每间隔2000～4000bp的挑选一个SNP，若在基因的上下游的区域按照每间隔2000～4000bp的挑选一个SNP的方式难以满足900～1200个SNP位点的要求，可以将2000～4000bp的间隔适当扩大，比如扩大到2500～5000bp或者3000～6000bp，具体间隔的扩大可以根据实际需要进行合理调整。

上述优选实施例中，采用RNA探针元件来执行文库的杂交捕获。需要说明的是，本申请中用于杂交反应捕获特定区域的探针元件并不局限于RNA探针元件，也可以是DNA探针元件。在实际应用中，可以根据需要进行合理设计或选择。

上述去除特殊位点以保留有效的SNP位点的过滤模块可以采用现有已知的过滤模块来进行去除。在本申请一种优选的实施例中，统计模块中每个样本的SNP位点信息以vcf文件形式存在，过滤模块包括：第一去除元件，用于从vcf文件中去除每个样本的SNP位点信息中的INDEL位点；格式转换元件，用于将所有样本的vcf文件进行合并，将合并后的vcf文件转化成plink格式的文件；第二去除元件，用于将plink格式的文件转化为Beagle格式的文件，去除Beagle格式文件中偏离孟德尔遗传定律的SNP位点，得到每个样本的有效SNP位点。

对SNP位点进行分型的单倍体分型模块，可以采用现有的单倍型分型模块进行分型，也可以对现有模块进行适当改进后再进行分型。在本申请一种优选的实施例中，单倍体分型模块为Beagle模块。

在本申请一种优选的实施例中，待测个体为胎儿，判断单元包括：第二获取模块，用于获取父亲基因组DNA和母亲基因组DNA的特定单倍型中各SNP位点的基因型信息，并获取母亲血浆游离DNA的特定单倍型中各SNP位点的碱基类型的频率；第一筛选模块，用于挑选在母亲基因组DNA中的基因型为杂合而在父亲基因组DNA中的基因型为纯合的SNP位点，记为第一类SNP位点；来源于母亲的单倍型判断模块，用于根据母亲血浆游离DNA中对应的第一类SNP位点的突变碱基的频率，判断胎儿遗传了来源于母亲野生型的单倍型还是突变型的单倍型；第二筛选模块，用于挑选在母亲基因组DNA中的基因型为纯合而在父亲基因组DNA的基因型为杂合的SNP位点，记为第二类SNP位点；来源于父亲的单倍型判断模块，用于根据母亲血浆游离DNA中对应的第二类SNP位点的突变碱基的频率，判断胎儿遗传了来源于父亲野生型的单倍型还是突变型的单倍型；胎儿单倍型比对模块，用于将胎儿的来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与人群中特定突变位点的特定单倍型进行比较；胎儿基因型确定模块，用于根据比较结果确定胎儿在突变位点的基因型。

上述优选的实施例中的判断单元不仅能够在不方便收集一级亲属的DNA样本时能够实现对胎儿基因型的检测，而且一次构建好的人群中特定突变位点的特定单倍型，可以适用于后续对所有样本针对该特定突变位点的基因型的检测。因此，具有检测方便、成本低，便于临床推广的显著优势。

上述优选实施例中，具体判断胎儿遗传了来源于母亲或来源于父亲的哪条单倍型的来源于母亲的单倍型判断模块和来源于父亲的单倍型判断模块，可以根据现有判断模块进行判断。为了进一步提高判断的准确性，在本申请一种优选的实施例中，来源于母亲的单倍型判断模块包括：第一单倍型子模块，用于当突变碱基的频率小于50％时，则确定胎儿遗传了来源于母亲野生型的单倍型；第二单倍型子模块，用于当突变碱基的频率大于50％时，则确定胎儿遗传了来源于母亲突变型的单倍型。

在本申请一种优选的实施例中，来源于父亲的单倍型判断模块包括：第三单倍型子模块，用于当母亲在第二类SNP位点的基因型为野生型纯合时，若检测到突变型频率，则确定胎儿遗传了来源于父亲的突变型的单倍型；第四单倍型子模块，用于当母亲在第二类SNP位点的基因型为突变型纯合时，若检测到野生型频率，则确定胎儿遗传了来源于父亲的野生型的单倍型。

在本申请一种优选的实施例中，胎儿基因型确定模块包括：第一胎儿基因型确定子模块，用于当来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与人群中特定突变位点的特定单倍型的比较结果均一致时，确定胎儿在特定突变位点的基因型为纯合突变；第二胎儿基因型确定子模块，用于当来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与人群中特定突变位点的特定单倍型的比较结果之一为一致时，确定胎儿在特定突变位点的基因型为杂合突变；第三胎儿基因型确定子模块，用于当来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与人群中特定突变位点的特定单倍型的比较结果均不一致时，确定胎儿在特定突变位点的基因型为野生型。

在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种存储介质，该存储介质包括存储的程序，其中，在程序运行时控制存储介质所在的设备执行上述任一种检测方法。该设备在执行上述检测方法时不需要单独构建父母亲和先证者样本的单倍型，更贴近临床，并易于推广。

在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种处理器，该处理器用于运行程序，其中，程序运行时执行上述任一种检测方法。该程序运行时在执行上述检测方法时不需要单独构建父母亲和先证者样本的单倍型，更贴近临床，并易于推广。

下面将具体介绍本申请中的针对特定突变位点的特定单倍型的构建方法及其在无创检测中的应用。

一、特定突变位点对应的特定单倍型构建方法：

从HAPMAP数据库中选择基因上下游各1M(10⁶bp)区域的AF在0.05-0.95之间的SNP，每个基因挑选的SNP位点数量在900-1200左右，且在基因上下游每隔2000-4000bp挑选一个SNP，(如果按照2000-4000bp的间隔不能挑选到上述数量的SNP位点，可将2000～4000bp的间隔适当扩大)数量不足的从1000genomes中CHB(Han Chinese in Bejing，北京汉族人)选择补充，挑选的SNP位点会进一步过滤掉在重复区域和CNV(Copy NumberVariation，拷贝数变异)区域的位点，剩余的位点作为最终用于单倍型分析的位点。

挑选好SNP位点后，设计包含SNP位点的DNA探针，在两端添加通用的接头序列后进行合成，合成之后通过扩增和转录得到生物素标记的RNA探针。

将家系样本父亲母亲和小孩样本提取基因组DNA，并打断成150-200bp左右大小的片段，经过末端修复和接头连接及PCR扩增后，得到中间文库，接头一端包含有8个不同碱基组成的barcode，和文库另一端的Index一起共同用于区分不同的样本。

将不同Barcode和Index组合的中间文库混合在一起，与上述合成的带有生物素标记的RNA探针进行杂交反应，利用链霉亲和素标记的磁珠将与生物素标记RNA探针杂交结合的目标SNP位点捕获，洗脱去掉非特异性结合后，通过少量循环的PCR富集后得到最终的杂交文库。

杂交文库上机测序，上机后数据按照以下步骤构建特定单倍型：

1)下机数据经过过滤去除掉低质量的reads，统计所选SNP位点的基因型，得到每个样本SNP位点信息的vcf文件；

2)将vcf文件进行过滤，去除掉含indel的位点；

3)将所有样本的vcf文件进行合并；

4)将合并后的文件转化成plink格式的数据；

5)将plink格式的数据转化为Beagle格式的数据，作为Beagle的输入；

6)去除Beagle格式数据中偏离孟德尔遗传定律的点，然后用Beagle进行单倍体分型，得到每个样本的两条单倍型；

7)比较所有家系中先证者的两条单倍型中在特定突变位点为突变型碱基时所对应的单倍型，找出所有与特定突变位点的突变型碱基连锁遗传的SNP位点，从而构成人群中特定突变位点的特定单倍型。

二、特定突变位点对应的特定单倍型在无创检测中的应用

针对母亲和父亲基因组DNA，通过片段化、末端修复加A、接头连接及PCR富集后得到中间文库，针对包含胎儿遗传信息的母亲血浆游离DNA，通过末端修复加A、接头连接及PCR富集后得到中间文库；利用包含构建特定单倍型的SNP位点的探针与母亲基因组DNA中间文库及母亲血浆游离DNA中间文库杂交得到杂交捕获文库，将杂交捕获文库上机，得到在这些位点的基因型信息。

对母亲血浆游离DNA中胎儿遗传自母亲的单倍型的判断：挑选在母亲基因组DNA中特定单倍型位点所对应的位置的基因型为杂合而父亲在对应位置的基因型为纯合的位点，计算在该位点突变型的频率(在该位置处包含突变型的reads数与包含该位置的所有reads数的比值)，当突变型频率小于50％时(差异大于平均测序错误率的3倍偏差)，则胎儿在该位置遗传母亲的参考野生型，当突变频率大于50％时(差异大于平均测序错误率的3倍偏差)，则胎儿在该位置遗传母亲的突变型。

对母亲血浆游离DNA中胎儿遗传自父亲的单倍型的判断：挑选在母亲基因组DNA中特定单倍型位点所对应的位置的基因型为纯合而父亲在对应位置的基因型为杂合的位点，计算该位点突变型的频率，当母亲在该位点为参考野生型纯合时，如果检测到一定的突变型频率(大于平均测序错误率的2倍偏差)，则胎儿在该位置遗传父亲的突变型；当母亲在该位点为突变纯合型时，如果检测到一定的参考野生型频率(大于平均测序错误率的2倍偏差)，则胎儿在该位置遗传父亲的参考野生型。

将得到的胎儿的两条单倍型分别与构建好的特定单倍型比较，如果比较结果一致，则判定胎儿携带该特定突变位点，进而确定胎儿在特定位点的基因型。

下面将进一步结合具体的实施例来说明本申请的有益效果。

实施例1：特定突变位点对应的特定单倍型构建实例(中国人群GJB2基因235位点del C突变型)

挑选中国人群GJB2基因235位点(在hg19基因组13号染色体上的位置为20763488)为del C纯合突变型的个体10例外周血样本，同时收集其父亲和母亲的外周血样本，共10个家系。提取外周血样本基因组DNA。

一、用天根DNA片段化模块NG305对基因组DNA进行片段化：

1.将样本和试剂置于冰上融化，5×FragEnzymeMix融化后用手指后轻弹混匀，不要涡旋。其余试剂可短暂涡旋混匀。

2.取200ng-500ngDNA按照下表1配制反应体系于PCR小管中，冰上操作，各组分加入后，请轻柔吸打混匀，注意不要涡旋。(请确认DNA溶液中不含阳离子及螯合剂。如果DNA溶解于1×TE或不确定DNA溶液中的EDTA浓度，使用Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化)。

表1：

组分	体积(ul)
		10×Frag缓冲液	5
DNA样本	X
		无RNA酶ddH<sub>2</sub>O	35-X
总体积	40

3.向薄壁管中加入10μl 5×Frag Enzyme Mix，轻柔吹打6～8次，不要涡旋(此过程需一直处于冰浴中进行)。

4.将薄壁管短暂离心，收集溶液至管底后，立即转移至4℃预冷的PCR仪中(热盖温度设置为70℃)反应，反应程序见表2。

表2：

步骤	温度	时间
			1	4℃	1min
2	32℃	18min
			3	65℃	30min
4	4℃	保持

5.当反应程序结束，PCR仪温度降至4℃后，将薄壁管从PCR仪中取出并置冰上。立即进行下一步实验操作。

6.用1.8倍XP磁珠纯化打断产物，溶于44.5μl的无核酸酶的水中，吸取42μl纯化产物进行小片段文库的构建。

二、外周血DNA中间文库的构建

1.末端修复加A

1)按表3表所示配置末端修复与加A的反应体系：

表3：

试剂	体积
		片段化DNA	42μL
缓冲液1	6.8μL
		酶1	1.2μL
总计	50μL

2)轻柔混匀，瞬时离心，按表4所示程序在PCR仪上进行反应：

表4：

温度	时间
		37℃	30min
72℃	30min
		4℃	Hold

反应结束后立刻放置冰上，立即进入下一步接头连接反应。

2.接头连接

1)按表5所示配置接头连接反应体系：

表5：

试剂	体积
		End repair/dA-tail DNA	50uL
缓冲液2-1	8.4μL
		缓冲液2-2	15μL
增强子1	3.2μL
		接头	1μL
无RNA酶水	1.4μL
		T4连接酶	1μL
总计	80μL

2)20℃连接30min，注意控制盖温，由于反应体系较大，盖温过高会对体系上部的温度有影响。轻柔充分混匀，瞬时离心，按表6所示在PCR仪上进行反应：

表6：

温度	时间
		20℃	30min
4℃	Hold

3.磁珠纯化

1)涡旋混匀AMPureXP磁珠；并室温孵育30min备用。

2)按样品数准备好干净的1.5mL离心管，加入120μL(1.5X)重悬好的AMPureXP磁珠，并将对应的编号写好。将上一步的连接产物加入准备好的XP磁珠内，并用枪头混匀。室温孵育5min。

3)如管壁上有液体可瞬时离心，置于磁力架上，静置2min。

4)待溶液清亮后，弃上清。

5)加入200μL80％乙醇，盖上离心管盖，上下颠倒磁力架10次，充分漂洗DNA，于磁力架上静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠，尽量吸净管壁和管盖上残留的乙醇)。

6)重复步骤5一次。

7)瞬时离心，将所有残留乙醇收集到管底，使用10μL枪头吸净离心管底部残留的液体。

8)室温干燥5min，让乙醇尽量挥发干净(可明显看到磁珠干裂)。

9)加入24μL ddH₂O，轻轻弹匀，彻底重悬磁珠，室温放置5min。

10)瞬时离心，置于磁力架上，静置2min。

11)准备PCR管，并将编号写好。用枪头小心吸取23μL上清液到准备好的PCR管内。

4.PCR富集

1)按照表7所示配置PCR富集反应体系：

表7：

试剂	体积
		Adaptor Ligated DNA Fragments	23μL
KAPA HiFi Hot Start Ready Mix(2X)	25μL
		Universal Primer	1μL
Index Primer	1μL
		总计	50μL

2)瞬时离心，将所有液体收集到PCR管底。

3)按照表8所示，将上述PCR管放入PCR仪中运行扩增程序：

表8：

反应完成后，将PCR管拿出，瞬时离心，将所有液体收集到管底，用等体积的XP磁珠进行纯化。

5.磁珠纯化

1)涡旋混匀AMPureXP磁珠，室温孵育30min备用。

2)按样品数准备好干净的1.5mL离心管，加入50μL(1X)重悬好的AMPureXP磁珠，并将对应的编号写好。

3)将上一步PCR产物加入准备好的XP磁珠内，并用枪头混匀。室温孵育5min。

4)瞬时离心，将所有液体收集到管底。置于磁力架上，静置2-3min。

5)待溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。(可将上清作为中间产物保留，在实验结束后遗弃)

6)加入200μL80％乙醇，上下颠倒磁力架2-3次，彻底漂洗DNA，静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠，注意吸净管壁和管盖上残留的乙醇)。

7)重复步骤6一次。

8)瞬时离心，将所有残留乙醇收集到管底，用10μL枪头吸取离心管底部残留的液体。

9)敞开盖子5min，让乙醇尽量挥发干净，至磁珠干燥(可明显看到磁珠干裂)。

10)加入20μLddH2O，轻轻弹匀，彻底重悬磁珠，室温放置5min。

11)瞬时离心，置于磁力架上，静置2min。

12)待溶液清亮后，用10μL枪头小心吸取19μL上清至干净的离心管内，并将对应的编号写好。

13)取1μL进行Qubit定量，记下文库浓度，写上文库编号。

三、中间文库的杂交捕获

1.中间文库与探针的杂交

1)取1μg的DNA文库于一个新的PCR小管，真空浓缩(<45℃)至体积7.35μl。

2)按下表9配置文库封闭体系.

表9：

成分	体积(μl)
		中间文库	7.35μl
人Cot-1DNA(15279-101，Invitrogen)	2.5μl
		10mg/ml精子DNA(15632-011，Invitrogen)	2.5μl
XGen Universal Blocks–TS Mix(1075475，IDT)	0.65μl
		总体积	13μl

3)配置好封闭杂交体系后涡旋混匀，短暂离心，盖紧PCR管盖，放入PCR仪中按照如下表10的体系进行反应，设定PCR仪热盖温度105℃：

表10：

步骤	循环数	温度	时间	备注
					1	1	95℃	5min
2	1	65℃	1h(暂停)	加入杂交体系Mix
					3	1	65℃	>16h
4	1	65℃	Hold

4)在进行上述PCR过程中可以按下表11配置杂交体系Mix(常规杂交缓冲液先65℃孵育溶解混匀)：

表11：

成分	体积(μl)
		探针	2μl
RNA酶抑制剂SUPERase-In<sup>TM</sup>(AM2694，Invitrogen)	2μl
		常规杂交缓冲液(先65℃预热溶解)	13μl
总体积	17μl

5)当PCR中的反应程序进行到第二步(1hat 65℃)时，暂停反应程序，保持文库混合液在65℃条件下，将17μl的杂交体系Mix(放在65℃条件下先孵育2min)加入到文库混合液中，用枪上下吹吸混匀8-10次。

6)更换一个新的PCR管盖，再次确认所有的管盖已经盖紧，高速涡旋振荡5s，短暂离心，然后放回PCR仪中，开始程序。

2.杂交文库的捕获

1)在水浴锅或加热块上65℃预热洗脱缓冲液2；磁珠在保存的时候会沉降，涡旋剧烈震荡，让Dyna磁珠My One Strep tavidinT1重新悬浮，放置30min平衡至室温。

2)对每个杂交反应，取50μl Dyna磁珠My One Strep tavidinT1到1.5ml离心管中。

3)冲洗磁珠：

a)加入200μl结合缓冲液，吹吸8-10次混匀。

b)将管子放在磁力架上，至溶液变澄清后吸除上清。

c)重复步骤a-b两遍，总共冲洗3次。

4)用200μl结合缓冲液重新悬浮磁珠

5)保持杂交混合液65℃，将其用枪直接加到磁珠溶液里，颠倒混匀3-5次。

6)将混合液放在摇摆机(nutator)上，室温混匀30min。

7)简短离心。

8)把管子放在磁力架上，静置至溶液澄清，吸除上清。

9)加入200μl洗脱缓冲液1，用枪上下吹吸8-10次让磁珠重新悬浮，涡旋振荡8s，室温放置15min，其间用涡旋混匀3次，简短离心。

10)把管子放在磁力架上，静置至溶液澄清，吸除上清。

11)冲洗磁珠

a)加入200μl经过65℃预热的洗脱缓冲液2，用枪上下吹吸至少10次让磁珠重新悬浮。

b)在PCR仪或者金属浴上65℃温浴10min。

c)把管子放在磁力架上，静置至溶液澄清，吸除上清。

d)重复步骤a-c两遍，总共冲洗3次。

e)最后一遍冲洗完成后，短暂离心，再次置于磁力架上，确保所有的洗脱缓冲液2被吸除。

f)加入23μl无RNA酶的水，涡旋5s让磁珠重新悬浮。

3.PCR扩增

1)在冰上按照下表12体系配制PCR反应液。

表12：

试剂	体积
		Captured on-磁珠DNA	23μL
KAPA HiFi Hot Start Ready Mix(2X)	25μL
		P5/P7primer Mix	2μL
Total	50μL

2)确认将含有磁珠的反应液混匀后，将管子放入PCR仪中进行扩增，PCR仪参数设置如下表13：

4.磁珠纯化

1)充分混匀AMPureXP磁珠悬浮液，室温放置30min，混匀，在1.5mL新管中加入90μL混匀的磁珠悬浮液和PCR扩增后的DNA文库。涡旋混匀，室温放置5min。

2)短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约3min至溶液变澄清；在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠。

3)在磁力架上，在每个管中分加200μL80％乙醇。静置30s，吸除乙醇。

4)重复步骤3一次。

5)室温晾干，直至管中残留的乙醇完全挥发。

6)加入16μL无RNA酶的水水，在涡旋上混匀，室温放置5min。短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约2min至溶液变澄清；吸取大约15μL上清到一个新的1.5mL管中。取1μL样品进行Qubit2.0定量。

四、数据分析

文库经QPCR定量后得到摩尔浓度，根据上机数据量将文库混池上机测序，得到测序原始数据。

2)将vcf文件进行过滤，去除掉含indel的位点；

3)将所有样本的vcf文件进行合并；

4)将合并后的文件转化成plink格式的数据；

7)比较所有家系中先证者的两条单倍型中在特定突变位点为突变型碱基时所对应的单倍型，找出所有与特定突变位点的突变型碱基连锁遗传的SNP位点，从而构成人群中特定突变位点的特定单倍型，具体如表14所示。

表14：

五、中国人群GJB2基因235delC对应的特定单倍型在无创胎儿基因型分析中的应用：

一位孕周18周的孕妇，在基因组上GJB2基因235位点为del C杂合突变型，其丈夫也为GJB2基因235位点del C杂合突变型。收集到该孕妇和其丈夫的外周血样本；孕妇外周血分离血浆并提取cfDNA，分离血浆后下层的细胞用于提取基因组DNA，丈夫外周血样本直接提取基因组DNA。

基因组DNA建库流程同上述外周血DNA中间文库的构建方法。cfDNA建库流程除接头需要稀释10倍以及PCR富集循环数为12个外，其余与外周血DNA中间文库的构建方法相同。得到的中间文库分别进行杂交捕获(方法同上述中间文库的杂交捕获)。杂交文库经过文库检测后上机测序。下机数据经过过滤低质量的reads后，与参考基因组比对，得到对应于单倍型SNP位点位置处的基因型，可计算相应碱基的频率。血浆样本DNA测序平均错误率为0.58％。

其中，对母亲血浆游离DNA中胎儿遗传自母亲的单倍型的判断结果如下表15：

表15：

将此胎儿的单倍型与中国人群GJB2基因235del C对应的特定单倍型比较发现，在对应SNP位点上的基因型一致，因此确定胎儿遗传了来源于母亲的带有GJB2基因235del C突变的单倍型。

对母亲血浆游离DNA中胎儿遗传自父亲的单倍型的判断见下表16：

表16：

将此胎儿的单倍型与中国人群GJB2基因235del C对应的特定单倍型比较，在对应位置上的基因型不一致，因此确定胎儿遗传了来源于父亲的不携带GJB2基因235del C突变的单倍型。

根据上述可知，胎儿的两条单倍型在GJB2基因235位点的基因型一个是来自母亲的突变的碱基类型而另一个是来源于父亲的野生型碱基，因而胎儿GJB2基因235位点的基因型为del C杂合突变型。

进一步通过对母亲羊水细胞基因组DNA进行测序验证了上述判断结果。如图1所示，在胎儿对应GJB2基因235位点附近的一代测序结果(反向测序)中，箭头所指位点因一条链缺少一位G，使得该位点附近的GGG三位碱基中的第三位G呈现G和C的双峰，由此可知，胎儿在235位点为del C杂合型，验证了基于特定单倍型的无创检测结果的准确性。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本申请通过利用已有的或构建的针对特定突变位点对应的特定单倍型，将其用于无创检测方面，不仅该方法所需试剂价格便宜，可形成高通量的检测规模，而且不需要单独构建父母亲和先证者样本的单倍型，更贴近临床，并易于推广。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种非诊断目的的特定突变位点的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：

根据人群中特定突变位点的特定单倍型，判断待测个体中所述特定突变位点的基因型，

根据人群中特定突变位点的特定单倍型，判断待测个体中所述特定突变位点的基因型之前，所述检测方法还包括构建所述人群中特定突变位点的单倍型的步骤，构建所述人群中特定突变位点的特定单倍型的步骤包括：

获取人群中来源于不同家系样本的包含所述特定突变位点的测序数据，其中，每个家系样本包括父本、母本及先证者；

统计各所述测序数据中的SNP位点的基因型，得到每个样本的SNP位点信息；

去除每个所述样本的SNP位点信息中的INDEL位点以及偏离孟德尔遗传定律的SNP位点，得到每个所述样本的有效SNP位点；

对每个所述样本的有效SNP位点进行单倍体分型，得到每个所述样本的两条单倍型；

比较所有家系中所述先证者的两条单倍型中在所述特定突变位点为突变型碱基时所对应的单倍型，找出所有与所述特定突变位点的突变型碱基连锁遗传的SNP位点，从而构成所述人群中特定突变位点的特定单倍型；

所述待测个体为胎儿，根据人群中特定突变位点的特定单倍型，判断待测个体中所述特定突变位点的基因型的步骤包括：

获取父亲基因组DNA和母亲基因组DNA的所述特定单倍型中各SNP位点的基因型信息，并获取母亲血浆游离DNA的所述特定单倍型中各SNP位点的碱基类型的频率；

挑选在所述母亲基因组DNA中的基因型为杂合而在所述父亲基因组DNA中的基因型为纯合的SNP位点，记为第一类SNP位点，并根据所述母亲血浆游离DNA中对应的所述第一类SNP位点的突变碱基的频率，判断胎儿遗传了来源于母亲野生型的单倍型还是突变型的单倍型；

挑选在所述母亲基因组DNA中的基因型为纯合而在所述父亲基因组DNA的基因型为杂合的SNP位点，记为第二类SNP位点，并根据所述母亲血浆游离DNA中对应的所述第二类SNP位点的突变碱基的频率，判断胎儿遗传了来源于父亲野生型的单倍型还是突变型的单倍型；

将所述胎儿的来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与所述人群中特定突变位点的特定单倍型进行比较，根据比较结果确定所述胎儿在所述突变位点的基因型；

根据所述母亲血浆游离DNA中对应的所述第一类SNP位点的突变碱基的频率，判断胎儿遗传了来源于母亲野生型的单倍型还是突变型的单倍型的步骤包括：

当所述突变碱基的频率小于50%且父亲在所述第一类SNP位点的基因型为野生型纯合时，则确定所述胎儿遗传了来源于母亲野生型的单倍型，当所述突变碱基的频率大于50%且父亲在所述第一类SNP位点的基因型为突变型纯合时，则确定所述胎儿遗传了来源于母亲突变型的单倍型；

根据所述母亲血浆游离DNA中对应的所述第二类SNP位点的突变碱基的频率，判断胎儿遗传了来源于父亲野生型的单倍型还是突变型的单倍型的步骤包括：

当母亲在所述第二类SNP位点的基因型为野生型纯合时，若检测到突变型频率，则确定胎儿遗传了来源于父亲的突变型的单倍型；

当母亲在所述第二类SNP位点的基因型为突变型纯合时，若检测到野生型频率，则确定胎儿遗传了来源于父亲的野生型的单倍型。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述获取人群中来源于不同家系样本的包含所述特定突变位点的测序数据的步骤包括：

设计并合成包含所述特定突变位点的文库杂交探针；

获取所述人群中来源于不同家系样本的基因组DNA文库；

将所述基因组DNA文库与所述文库杂交探针进行杂交捕获反应，得到捕获文库；

对所述捕获文库进行测序，得到所述人群中来源于不同家系样本的包含所述特定突变位点的测序数据。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述设计并合成包含所述特定突变位点的文库杂交探针的步骤包括：

从HAPMAP数据库中选择所述特定突变位点所在基因上下游各1M区域的等位基因频率在0.05-0.95之间的SNP，且在所述基因的上下游的区域每间隔2000~4000bp挑选一个SNP，共计挑选900~1200个SNP位点，若挑选的SNP位点不足900~1200个SNP位点，则从千人基因组中CHB选择补足，其中所述CHB指北京汉族人；

从挑选的所述900~1200个SNP位点中过滤掉位于重复区域和CNV区域的位点，剩余的SNP位点作为用于单倍型分析的SNP位点；

设计并合成包含所述用于单倍型分析的SNP位点的DNA探针，所述DNA探针的两端添加有通用接头序列；

将所述DNA探针依次进行扩增和转录，得到带有生物素标记的RNA探针，所述带有生物素标记的RNA探针即为所述文库杂交探针。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述每个样本的SNP位点信息以vcf文件形式存在，去除每个所述样本的SNP位点信息中的INDEL位点以及偏离孟德尔遗传定律的SNP位点，得到每个所述样本的有效SNP位点的步骤包括：

从所述vcf文件中去除每个所述样本的SNP位点信息中的INDEL位点；

将所有样本的vcf文件进行合并，将合并后的vcf文件转化成plink格式的文件；

将所述plink格式的文件转化为Beagle格式的文件，去除Beagle格式文件中偏离孟德尔遗传定律的SNP位点，得到每个所述样本的有效SNP位点。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，输入Beagle对每个所述样本的有效SNP位点进行单倍体分型，得到每个所述样本的两条单倍型。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，根据比较结果确定所述胎儿在所述突变位点的基因型的步骤包括：

若来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与所述人群中特定突变位点的特定单倍型的比较结果均一致，则确定所述胎儿在所述特定突变位点的基因型为纯合突变；

若来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与所述人群中特定突变位点的特定单倍型的比较结果之一为一致，则确定所述胎儿在所述特定突变位点的基因型为杂合突变；

若来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与所述人群中特定突变位点的特定单倍型的比较结果均不一致，则确定所述胎儿在所述特定突变位点的基因型为野生型。

7.一种特定突变位点的检测装置，其特征在于，所述检测装置包括：

判断单元，用于根据人群中特定突变位点的特定单倍型，判断待测个体中所述特定突变位点的基因型；

所述判断单元在根据人群中特定突变位点的特定单倍型，判断待测个体中所述特定突变位点的基因型之前，所述检测装置还包括特定突变位点的单倍型构建单元，所述特定突变位点的单倍型构建单元用于构建所述人群中特定突变位点的单倍型；

所述特定突变位点的单倍型构建单元包括：

第一获取模块，用于获取人群中来源于不同家系样本的包含所述特定突变位点的测序数据，其中，每个家系样本包括父本、母本及先证者；

统计模块，用于统计各所述测序数据中的SNP位点的基因型，得到每个样本的SNP位点信息；

过滤模块，用于去除每个所述样本的SNP位点信息中的INDEL位点以及偏离孟德尔遗传定律的SNP位点，得到每个所述样本的有效SNP位点；

单倍体分型模块，用于对每个所述样本的有效SNP位点进行单倍体分型，得到每个所述样本的两条单倍型；以及

比较构建模块，用于比较所有家系中所述先证者的两条单倍型中在所述特定突变位点为突变型碱基时所对应的单倍型，找出所有与所述特定突变位点的突变型碱基连锁遗传的SNP位点，从而构成所述人群中特定突变位点的特定单倍型；

所述待测个体为胎儿，所述判断单元包括：

第二获取模块，用于获取父亲基因组DNA和母亲基因组DNA的所述特定单倍型中各SNP位点的基因型信息，并获取母亲血浆游离DNA的所述特定单倍型中各SNP位点的碱基类型的频率；

第一筛选模块，用于挑选在所述母亲基因组DNA中的基因型为杂合而在所述父亲基因组DNA中的基因型为纯合的SNP位点，记为第一类SNP位点；

来源于母亲的单倍型判断模块，用于根据所述母亲血浆游离DNA中对应的所述第一类SNP位点的突变碱基的频率，判断胎儿遗传了来源于母亲野生型的单倍型还是突变型的单倍型；

第二筛选模块，用于挑选在所述母亲基因组DNA中的基因型为纯合而在所述父亲基因组DNA的基因型为杂合的SNP位点，记为第二类SNP位点；

来源于父亲的单倍型判断模块，用于根据所述母亲血浆游离DNA中对应的所述第二类SNP位点的突变碱基的频率，判断胎儿遗传了来源于父亲野生型的单倍型还是突变型的单倍型；

胎儿单倍型比对模块，用于将所述胎儿的来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与所述人群中特定突变位点的特定单倍型进行比较；

胎儿基因型确定模块，用于根据比较结果确定所述胎儿在所述突变位点的基因型；

所述来源于母亲的单倍型判断模块包括：

第一单倍型子模块，用于当所述突变碱基的频率小于50%且父亲在所述第一类SNP位点的基因型为野生型纯合时，则确定所述胎儿遗传了来源于母亲野生型的单倍型；

第二单倍型子模块，用于当所述突变碱基的频率大于50%且父亲在所述第一类SNP位点的基因型为突变型纯合时，则确定所述胎儿遗传了来源于母亲突变型的单倍型；

所述来源于父亲的单倍型判断模块包括：

第三单倍型子模块，用于当母亲在所述第二类SNP位点的基因型为野生型纯合时，若检测到突变型频率，则确定胎儿遗传了来源于父亲的突变型的单倍型；

第四单倍型子模块，用于当母亲在所述第二类SNP位点的基因型为突变型纯合时，若果检测到野生型频率，则确定胎儿遗传了来源于父亲的野生型的单倍型。

8.根据权利要求7所述的检测装置，其特征在于，所述第一获取模块包括：

设计合成子模块，用于设计并合成包含所述特定突变位点的文库杂交探针；

文库获取子模块，用于获取所述人群中来源于不同家系样本的基因组DNA文库；

捕获子模块，用于将所述基因组DNA文库与所述文库杂交探针进行杂交捕获反应，得到捕获文库；以及

测序子模块，用于对所述捕获文库进行测序，得到所述人群中来源于不同家系样本的包含所述特定突变位点的测序数据。

9.根据权利要求8所述的检测装置，其特征在于，所述设计合成子模块包括：

SNP挑选元件，用于从HAPMAP数据库中选择所述特定突变位点所在基因上下游各1M区域的等位基因频率在0.05-0.95之间的SNP，且在所述基因上下游的区域每间隔2000~4000bp挑选一个SNP，共计挑选900~1200个SNP位点，若挑选的SNP位点不足900~1200个，则从千人基因组中CHB选择补足，其中所述CHB指北京汉族人；

过滤元件，用于从挑选的所述900~1200个SNP位点中过滤掉位于重复区域和CNV区域的位点，剩余的SNP位点作为用于单倍型分析的SNP位点；

DNA探针元件，用于设计并合成包含所述用于单倍型分析的SNP位点的DNA探针，所述DNA探针的两端添加有通用接头序列；

RNA探针元件，用于将所述DNA探针依次进行扩增和转录，得到带有生物素标记的RNA探针，所述带有生物素标记的RNA探针即为所述文库杂交探针。

10.根据权利要求7所述的检测装置，其特征在于，所述统计模块中所述每个样本的SNP位点信息以vcf文件形式存在，所述过滤模块包括：

第一去除元件，用于从所述vcf文件中去除每个所述样本的SNP位点信息中的INDEL位点；

格式转换元件，用于将所有样本的vcf文件进行合并，将合并后的vcf文件转化成plink格式的文件；

第二去除元件，用于将所述plink格式的文件转化为Beagle格式的文件，去除Beagle格式文件中偏离孟德尔遗传定律的SNP位点，得到每个所述样本的有效SNP位点。

11.根据权利要求10所述的检测装置，其特征在于，所述单倍体分型模块为Beagle模块。

12.根据权利要求7所述的检测装置，其特征在于，所述胎儿基因型确定模块包括：

第一胎儿基因型确定子模块，用于当来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与所述人群中特定突变位点的特定单倍型的比较结果均一致时，确定所述胎儿在所述特定突变位点的基因型为纯合突变；

第二胎儿基因型确定子模块，用于当来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与所述人群中特定突变位点的特定单倍型的比较结果之一为一致时，确定所述胎儿在所述特定突变位点的基因型为杂合突变；

第三胎儿基因型确定子模块，用于当来源于母亲的单倍型与来源于父亲的单倍型分别与所述人群中特定突变位点的特定单倍型的比较结果均不一致时，确定所述胎儿在所述特定突变位点的基因型为野生型。

13.一种存储介质，其特征在于，所述存储介质包括存储的程序，其中，在所述程序运行时控制所述存储介质所在的设备执行权利要求1至6中任意一项所述的检测方法。

14.一种处理器，其特征在于，所述处理器用于运行程序，其中，所述程序运行时执行权利要求1至6中任意一项所述的检测方法。