CN103620055A - 在全基因组规模非侵入性确定亲本单倍型的胎儿遗传 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于单细胞单倍型分型的方法、装置和计算机程序，从而取自妊娠女性的样本，而不用直接对胎儿进行采样，提供非侵入性地确定胎儿基因组的能力。该方法可通过确定亲本的和遗传的单倍型而进行、或仅仅在母方遗传信息的基础上进行，优选获自血液或血清样本中。该新型装置允许对来自单细胞的单个染色体进行序列分析，优选通过将来自中期细胞的单个染色体分到长、窄的通道中，在通道中可以进行序列分析。

Description

在全基因组规模非侵入性确定亲本单倍型的胎儿遗传

政府资助的声明

本发明根据国立卫生研究院所颁发的协议CA143907和OD000251得到美国政府的资助。政府在本发明中享有一定的权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年12月7日提交的US临时申请系列号61/420,768的优先权，其整个并入此处作为参考。

参考序列表、计算机程序或光盘

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背景技术

技术领域

有核细胞从胎儿到母方循环的传递首先由Walknowska等人于1969年注意到，胎儿细胞用于产前检查的潜在应用和限制已经得到充分描述。虽然源自这些细胞的遗传物质理论上提供一种用于产前检查的非侵入性手段，循环胎儿细胞是稀少的，因此从母方血液样本中分离是昂贵且耗时的（Simpson和Elias,1994；Bianchi,1995；Steele等人，1996）。允许分离和富集有核胎儿细胞的通用细胞标记物还有待被发现，妨碍了这些方法来获得稳定、可重复结果的应用（Bischoff等人，2002）。

在1997年，发现了循环在母方血浆和血清中的片段的、无细胞胎儿DNA，为分离稀少的胎儿细胞用于非侵入性检测提供了一种潜在的替代（Lo等人，1997）。起源于衬在胎盘绒毛间隙的滋养层细胞，滋养层退化后胎儿DNA片段释放至母方循环；母方血液中循环的胎儿细胞凋亡可提供无细胞胎儿DNA的少数来源（Alberry等人，2007；Sekizawa等人，2003b；Wataganara等人，2005）。这一发现后不久，还观察到母方血液中存在胎盘来源的mRNA作为母方循环中胎儿遗传物质的第三来源（Poon等人，2000）。早在5周孕龄以及持续整个孕期，在母方循环中可检测到无细胞胎儿DNA（Birch等人，2005）。在整个孕期可以检测到无细胞胎儿DNA向母方血液的转移（Lo等人，2000）。由于其平均半衰期为16.3分钟，无细胞胎儿DNA在分娩后若干小时内从循环中被清除，因此之前的孕期不会混淆目前孕期的胎儿DNA鉴定和分析（Lo等人，1999C）。正如预期的那样，母方循环中的无细胞DNA可以是母方或胎儿来源，无细胞胎儿DNA相对于总DNA的浓度范围从3.4%至6.2%、或每毫升母方血液25.4至292.2基因组当量（Lo等人，1998）。可能是因为发育过程中的不稳定性或可变的转录，无细胞胎儿mRNA仅在22%的早期和中期妊娠孕期和63%的晚期妊娠孕期中得以鉴定（Poon等人，2000）。

尽管无细胞胎儿核酸，尤其是无细胞胎儿DNA的这些特性，将胎儿的遗传物质与母方遗传物质区分开的重大挑战阻碍了它们在非侵入性产前检查中的应用。即，由于胎儿其遗传信息的二分之一继承自母亲，胎儿来源的DNA或RNA片段的分离需要针对将它们和其母方对应部分区分开的这些核酸的信息或特征。

正在探索与性别测定、血型和人类白细胞抗原（HLA）分型、以及单基因疾病或其它多态性遗传的检测或排除有关的母方血液中胎儿特异性序列的用处，包括父方遗传的等位基因或全新（de novo）突变。为了检测非整倍体，可以利用杂合等位基因或特定染色体的特异性序列的浓度比例。专门源自胎盘的胎儿或mRNA种类的表观遗传标志（epigenetic signature），通过区分胎儿和母方的遗传物质，可以作为替代的诊断工具（Poon等人，2002；Lo等人，2007b）。

对于医学上指征用于产前性别测试的妊娠，目前推荐的侵入性诊断方法包括10至12孕周之间的绒毛膜绒毛取样、或15周至20周之间的羊膜穿刺术，其各自随后进行核型分析，获得基本上100%准确性的性别确定（Nicolaides等人，1994）。用于产前性别测试的医学指征包括性别连锁疾病的预防或管理（Hyett等人，2005）。如果他的母亲是一个受影响的等位基因携带者，那么男性继承隐性X-连锁疾病如血友病或杜氏肌营养不良症的风险为50%。目前，对这些疾病基因的妊娠携带者的建议包括侵入性测试X染色体上特异性遗传突变的存在（Sherman等人，2005）。通过使用无细胞核酸进行早期非侵入性的性别测定，怀有女性胎儿的女性可以免受进一步侵入性测试的风险，并在妊娠不久就可以得知结果（Wald等人，2003；Sherman等人，2005；Santacroce等人，2006）。

母方血浆中无细胞胎儿DNA的首次发现依赖于DSY14（位于Y染色体上的基因）的聚合酶链式反应（PCR）扩增和电泳（Lo等人，1997）。通过这种方法，胎儿DNA仅必然能在怀有男性胎儿的女性血液样本中检测到；然而，并不是所有这些女性具有可检测到的DSY14浓度，且在原始研究中的灵敏度在怀有男性的妊娠中仅限于80%的检测。最近，产前性别确定依赖于对SRY（在Y染色体上的性别决定区）的检测，其比DYS14提供更可靠的诊断能力（Honda等人，2002）。性别检测的实验室技术也得到了改善，从组合PCR电泳到定量实时PCR，增加了通量，并将妊娠头三个月的准确性提高至97%至100%（Lo等人，1998；Costa等人，2001；Hromanikova等人，2003；Sekizawa等人，2001）。

胎儿性别确定表明，在母方血液中循环的胎儿专属的无细胞DNA序列能够提供重要的产前诊断信息。这一发现的一年之内，可比较的技术被应用到RhD血型的基因分型中。胎儿和孕妇之间的RhD血型不兼容性可能会导致同种免疫、溶血性疾病和流产，但是通过现代围产期保健包括施用预防性抗RhD免疫球蛋白，负面结果可被有效预防。同胎儿性别检测相似，使用组合PCR-电泳操作或定量实时PCR技术，可以在RhD阴性孕妇的血液中检测到来自RhD阳性胎儿的无细胞RhD序列。（Faas等人，1998；Bischoff等人，1999）Meta-分析表明胎儿RhD血型测试提供95%的总体准确性，并可以早在8周孕龄就进行（Geifman-Holtzman等人，2006）。

也正在开发无细胞胎儿DNA测试来检测其它血型的母胎不兼容性，包括RhC、RhE和Kell（K）。和RhD测试相似，使用实时PCR或PCR-MS，尤其是当通过锁核酸增强测试时，实现了血型分型的高度准确（Li等人，2008；Finning等人，2007）。

使用与胎儿性别和血型检测相似的原则，母亲血液中存在不属于母方基因组一部分的序列可能表明，胎儿继承了完全来自父亲的等位基因或发生了全新的突变。检测到或缺乏这种等位基因突变可有助于诊断或排除单基因疾病和HLA单倍型的鉴定。

在2000年，科学家首次使用无细胞胎儿DNA，在处于强直性肌营养不良症风险的胎儿中检测显性单基因疾病的父方突变遗传（Amicucci等人，2000）。只要其不存在于母方DNA中，采用PCR然后通过电泳就可以成功鉴定这种已知突变。使用限制性片段长度多态性分析或降落式（touchdown）或巢式PCR的后续研究表明，已知突变的检测通过减少错配（mispriming）得以改善，比如用于软骨发育不全和血红蛋白病的那些（Li等人，2004；Fucharoen等人，2003；Saito等人，2000）。不久之后，等位基因特异性PCR随后进行电泳被应用到Hb Lepore病和亨廷顿病的诊断与排除；表明对亨廷顿病状态的鉴定早在10周孕龄时就已高度准确了，尽管CAG三核苷酸重复程度越大（这对应着更高的疾病外显率（penetrance）和更早的发作期）测试的灵敏降低（Amicucci等人，2000；Gonzalez-Gonzalez等人，2003a；Gonzalez-Gonzalez等人，2003b；Bustamante-Aragones等人，2008；Lazaros等人，2006）。同样，等位基因特异性实时PCR已证实被用于HLA分型，出于将造血干细胞移植到生病同胞中的目的，如果希望在胎儿中进行HLA匹配，则这可能是有用的（Reed等人，2002）。除了检测致病的突变，用于父方遗传的短串联重复序列的实时PCR也被应用于非侵入性的亲子鉴定（Wagner等人，2009）。

由于无法区分母方和胎儿的序列，以及因此而导致的母方等位基因的胎儿遗传不确定性，隐性疾病对使用无细胞胎儿核酸进行产前诊断构成更大的挑战。母方血液中不存在父方遗传的或全新突变允许明确排除隐性性状。同时，突变检测表明胎儿是杂合携带者或受影响的复合杂合子或纯合子，这取决于母方突变是否和父方突变相同。针对隐性疾病，如CAH和囊性纤维化，在11和17周孕龄之间，等位基因特异性PCR随后进行电泳允许检测或排除父方突变（Gonzalez-Gonzalez等人，2002；Chiu等人，2002a）。同样地，等位基因特异性实时PCR可以应用到囊性纤维化和β-地中海贫血突变中，具有100%的灵敏度和近乎完美的特异性（Chiu等人，2002b；Lun等人，2008）。

一个诊断隐性疾病的独特方法，在其中母亲和父亲携带相同突变的，需要检查来自母方血液的DNA中的相对突变剂量，或突变对野生型等位基因的比例（Lun等人，2008）。鉴于来自杂合子母亲的野生型和突变等位基因的平等贡献，胎儿遗传的状态将由母方血液中野生型等位基因（胎儿不受影响）或突变（胎儿受影响）的过度出现（overrepresentation）、或野生型和突变等位基因呈现平衡（胎儿是杂合携带者）所决定。同样，如果母亲携带显性突变，母方血液中的优势野生型等位基因将意味着疾病没有遗传，而平衡的野生型和突变等位基因将代表显性疾病的遗传。具体来说，数字实时PCR，由于反应的单个分隔，这比常规PCR更精确（precise），数字实时PCR已经以这种方式用于检测地中海贫血、血红蛋白病和血友病的母体突变的遗传（Lun等人，2008；Tsui等人，2011）。从理论上讲，只要父方基因型是已知的，以及在独特父方突变的情况下，也在母方血液中检测父方突变，这样的分析就可以应用到具有多种致病等位基因的隐性疾病诊断中（而不是仅仅排除）。

与SRY和RHD检测一样，PCR随后进行MS提供了已知的、隐性和显性父方突变检测中的更高特异性，包括β-地中海贫血和软骨发育不全的那些（Ding，2008；Ding等人，2004；Li等人，2009；Li等人，2007）。再次，为了临床实施单基因疾病的MS分析，有可能有显著的操作障碍，因为大多数实验室不具备昂贵的MS所需设备（Wright和Burton，2009）。

使单基因和其它类型非侵入性测试接近临床应用的一种机制是富集胎儿DNA或者RNA，尽管主要是母方的循环核酸。由于无细胞胎儿和母方DNA片段长度之间的差异（分别小于300bp和超过1000bp），尺寸分级为提高胎儿-母方DNA比例提供了一个途径（Li等人，2004）。使用电泳分离较短的片段以及因此胎儿DNA的浓缩，改善了父方遗传的单核苷酸多态性（SNP）、父方遗传的和全新的突变、和胎儿微卫星标记物的检测；使用数字PCR选择性扩增较短片段的方法也正在探索之中（Li等人，2004；Li等人，2007；Li等人，2009；Li等人，2005年；Chan等人，2004）。全基因组扩增可能是解决胎儿DNA水平低的次要方法（Jorgez和Bischoff，2009）。或者，无论是在胎儿或母方DNA中抑制野生型等位基因，从而改善突变等位基因的富集，可以通过使用肽核酸介导的PCR阻断野生型序列的扩增来实现（Li等人，2005；Galbiati等人，2006）。

产前非整倍体测试是应用无细胞胎儿DNA技术的另一个潜在领域。非整倍体，定义为任何染色体数目异常，影响到1/300的新生儿，是智力低下的最常见原因；非整倍体也和至少35%的流产有关（Hassold等人，1996）。在活产婴儿中最常见的非整倍体包括21三体（唐氏综合征）、13三体、18三体、和性染色体的单倍体或三体，包括特纳氏综合征和Klinefelter综合征。一些商业无细胞胎儿DNA和RNA技术正在开发中，以检测妊娠的非整倍体，大多专注于唐氏综合征测试。这些包括，将有问题染色体的总浓度与基于未受影响染色体的浓度所预期的浓度直接比较，或通过在受影响的染色体上确定母方遗传的等位基因和父方遗传的等位基因的比例。根据第一种方法，预期具有三体的胎儿具有3:2的受影响的染色体对未受影响的染色体的相对染色体剂量。根据第二种方法，三体胎儿将具有2:1的倾向于母方或父方遗传的等位基因的等位基因失衡。使用染色体剂量法相对于等位基因平衡法的优点是由于其多态性非依赖性的性质。使用后者，继承自父亲（而非母亲）的等位基因的存在对于确定等位基因平衡是必要的，反之亦然，而鉴定这样的等位基因并不总是可行或方便的（Wright，2009）。因此，这些确定等位基因比例的方法在胎儿纯合子的实例中是无效的。此外，由于胎儿DNA相对于母方DNA而言以降低的浓度存在，使用特异性等位基因的分析利用仅小部分的DNA；这个研究需要面对的一个重要问题是需要开发有效的分析方法，尽管胎儿DNA浓度低。

胎儿和母方DNA差异表观遗传标志的概念证据，在一些胎儿SNP的独特甲基化图式中得以证实，并导致了第一次使用等位基因比例用于非整倍体检测。具体来说，相对于密集甲基化的母方启动子而言，18号染色体上胎盘maspin（无对应中译文）基因启动子是低甲基化的（Poon等人，2002）。这些甲基化上的差异可以经探索被用来评估胎儿DNA浓度；这一发现后不久，研究人员表明使用甲基化特异性PCR通过maspin等位基因比例来诊断18三体的原则的证据（Chim等人，2005；tong等人，2006）。由于不同的等位基因对于确定等位基因比例是必要的，这种方法不能被应用在胎儿纯合子的情况。最近的研究继续基于表观遗传修饰搜索其它胎儿DNA标记物（Chan等人，2006；Old等人，2007；Nygren等人，2010）。

针对18号染色体基因，成功确定等位基因平衡的证据使得能够进行21号染色体SNP分析，包括对专门在胎盘中表达的PLAC4 mRNA的分析，来检测唐氏综合征（Lo等人，2007b；Oudejans等人，2003）。对于特异性的PLAC4 SNP杂合子胎儿，采用逆转录PCR和MS通过等位基因失衡进行21三体的鉴定，实现了90%的灵敏度和97%的特异性。类似的技术被应用到PLAC4上的一组5个SNP基因座，实现了92%的灵敏度和100%的特异性，且可能代表了更高的通量、更广泛的PLAC4 SNP分析的应用用途（Deng等人，2011）。在这两种情况下，排除了胎儿纯合性的非整倍体检测。然而，更一般的是，使用mRNA检测非整倍体的这种成功促进了研究胎盘来源mRNA的增长，以试图发现新的通用胎儿遗传标记物用于更广泛的产前诊断目的（Tsui等人，2004）。

后来使用数字PCR探索通过等位基因失衡的非整倍体检测，经选择来改善定量灵敏度，并根据使用羊水细胞样本的原则早期证据为基础（Zimmermann等人，2002；Lo等人，2007a）。使用PLAC4上的SNP来确定21号染色体的等位基因平衡，虽然使用小的样本量，非整倍体和整倍体胎儿的分类达到100%的准确性。这些样本之一需要在原始板之外进一步测试；由于实际样本中母方DNA占优势，计算表明约3%的情况将需要这种后续分析作出结论性诊断。

同一研究还表明了相对染色体剂量检测非整倍体的第一次使用（Zimmermann等人，2002；Lo等人，2007a）。通过检验1号和21号染色体上非多态性基因座的浓度比例，这种多态性非依赖性方法提供了100%的准确性。然而，各结论性诊断需要1至7个之间的板，从而使得这种形式的数字PCR成为劳动密集型。数字PCR在相对染色体剂量以及非整倍体检测上的精确性得以证实，考虑到胎儿DNA对母方DNA的比例较低，同时强调对广泛分析的需求（Fan和Quake,2007a）。

引入大规模平行基因组测序以解决以前对母方DNA比胎儿DNA占优势的关注，同时实现数字PCR所需的精确性（Chiu等人，2008；Fan等人，2008）。虽然PCR取决于选择仅出现在一些DNA片段上的基因座，可按照多态性非依赖性和基因座非依赖性的方式使用大规模平行测序，以利用样本中的所有DNA片段。通过同时测序所有或甚至靶向的片段，将序列和其各自的染色体进行比对，并定量各染色体剂量可以解决围绕母方DNA占优势的问题，即使用明显更少的样本量（Liao等人，2011）。原理研究的证据表明在13、18和21三体的情况中染色体过度出现的100%准确检测（Chiu等人，2008；Fan等人，2008）。后续研究表明对非整倍体或嵌合体的灵敏度只受测序深度的限制；即样本读取数目越大，检测越多的任何完整或部分染色体异常的过度出现或过低（Fan和Quake,2010b）。大规模平行基因组测序还可以为检测其它细胞遗传学异常引起的三体提供手段，如罗伯逊易位（Robertsonian translocation）（Lun等人，2011）。

非整倍体检测的替代策略使用串联SNP来绕过对母方DNA占优势的关注，同时避免和测序方法相关的成本过高（Ghanta等人，2010）。串联SNP是两个高度杂合的、邻近的多态性，其允许四种可能的单倍型排列。如果母方出现2种不同的单倍型以及父亲携带至少1种额外的不同单倍型，母方血浆中各单倍型的剂量为胎儿单倍型提供信息。在三体的情况下，胎儿将有3种单倍型或2种单倍型的失衡，这取决于不分离现象何时发生。除了100%的初步特异性和灵敏度，这种PCR技术或测序平台以及广泛染色体异常的适用性；然而，相当比例的情况对于给定串联SNP不会提供有用的信息（Ghanta等人，2010）。

直到最近，某些遗传疾病表现出难以适应现有分析方法的方法学复杂性（methodological complications）。由于无细胞胎儿DNA的片段化状态，使用这些方法没有检测到任何超过300个碱基对的致病序列（Chan等人，2004；Norbury和Norbury,2008）。此外，由于在胎儿DNA中区分相同的母方和父方遗传的等位基因是困难的，在单突变引起的隐性疾病（如镰刀状细胞贫血）的产前检测中所做的努力微乎其微。

此前报道的混合母方胎儿DNA的MS分析，尽管母方和父方的致病突变相同，表明了避免此限制的一种手段；通过分析母方和父方的单倍型，以及寻求有提示性的突变相关的父方SNP、胎儿遗传的父方SNP以及单倍型允许推断胎儿β-地中海贫血状态（Ding等人，2004）。

无细胞胎儿核酸还可以在围产期保健起到重要的作用，因为循环DNA的浓度有妊娠并发症的预测能力。最值得注意的是，蛋白尿和高血压的严重程度、先兆子痫的两个主要症状与无细胞胎儿DNA浓度的增加有关（Sekizawa等人，2004b；Lo等人，1999b）。无细胞胎儿DNA水平的这种提高一般先于先兆子痫的发作，提供潜在的高危妊娠鉴定（Zhong等人，2002；Farina等人，2004）。在患有侵入胎盘、妊娠剧吐和早产的孕妇中也注意到提高的无细胞胎儿DNA水平（Sekizawa等人，2002；Sekizawa等人，2001；Leung等人，1998）。通常通过确定怀男性胎儿的女性血液中循环的Y特异性序列的浓度除以总无细胞DNA的标记物（如β-珠蛋白或GAPDH）浓度，计算特异性源自胎儿的DNA的量，实现这种类型的定量分析（Zhong等人，2001a；Sekizawa等人，2003a）。替代方法包括测量其它胎儿遗传标记物如PLAC1、CRH及选择素-P mRNA的浓度，用于怀女性的妊娠（Maron等人，2007；Purwosunu等人，2007；Farina等人，2006；Ng等人，2003）。随着研究人员继续搜寻妊娠并发症的胎儿DNA或RNA指示物（indicator），有可能在母方血液中发现胎儿特异性遗传序列的新型通用标记物，这在非侵入性产前检查的其它应用中将是有价值的。

产前基因组图谱的临床实施障碍包括测序平台成本高和通量低、要求复杂的统计方法、和目前的单倍型信息知识有限。为了在高危人群中诊断疾病，通过有针对性的搜索已知的致病区域，来避免这些障碍。

发现在母方血流中循环的无细胞胎儿DNA和RNA为非侵入性全基因组产前检查打开了一扇大门，具有新的临床意义。此外，可以使用这种技术鉴定的胎儿遗传性状的范围，似乎仅受到基因组学知识的限制。随着无细胞胎儿DNA和RNA技术的科学研发推进，这种测试可能会逐渐取代或补充现有的筛查和诊断程序。由于其非侵入性、适应症广以及使用更及时，该技术已证实了显著改变产前遗传检测的潜力。

无细胞胎儿核酸检测的上述现有技术状态在Sayres和Cho，2011中有详尽的综述，其全部并入此处作为参考。

发明内容

以下简要概述不意图包括本发明的所有特征和方面，也没有暗示本发明必须包括概述中所讨论的所有特征和方面。

研究人类基因组的常规实验方法受限于无法单独研究染色体的每个同源拷贝。这些单倍型是基因组的重要特征，但一般不易确定。全基因组单倍型的确定将应用于个体基因组学、单细胞基因组学和统计遗传学。

在努力克服上述现有技术中非侵入性确定胎儿遗传亲本单倍型的方法，特别是在全基因组规模的不足时，本发明人惊奇地发现，通过将包含区域的多个同源拷贝的混合物稀释成单分子密度，并在单分子上进行遗传分析，可以测量单倍型。特别是，本发明人已开发整体扩增单细胞内的单个、完整染色体分子的方法，从而扩增材料的高通量遗传分析提供个体的全基因组单倍型。

本发明涉及非侵入性地确定胎儿所继承的亲本单倍型的装置和方法。由于胎儿遗传物质存在于母方血液中，来自怀有至少一个胎儿的妊娠女性的样本足以鉴定亲本单倍型以及胎儿的遗传信息，而不需要对胎儿侵入性采样，并因此避免在妊娠期间对胎儿可能存在的风险。

因此，在某些方面本发明包括非侵入性地确定胎儿所继承的亲本单倍型的方法，包括（a）从怀有至少一个胎儿的妊娠女性获得母方样本，其中所述的样本含有来自妊娠女性和胎儿的DNA；（b）通过下列步骤确定父方遗传的单倍型：（i）在胎儿父亲的DNA中确定一组单核苷酸多态性（SNP）；（ii）确定胎儿母亲DNA中的一组SNP；（iii）确定父亲中杂合的以及母亲中纯合的所有SNP，来鉴定父亲中存在而在母亲中缺失的各种基因座的等位基因，从而确定父亲的各单倍型；和（iv）计数各父方单倍型上的代表性等位基因，来确定两个单倍型的出现（representation）；（v）比较两个单倍型的出现来获得相对出现；（vi）确定两个单倍型之一的过度出现ε；和（vii）使过度出现ε与父方遗传的单倍型关联；以及（c）通过如下步骤确定母方遗传的单倍型：（i）确定胎儿母亲中所有杂合的SNP；（ii）在各SNP基因座上鉴定在母亲中存在但在父方遗传的单倍型中缺失的等位基因，以确定母亲的单倍型；（iii）计数各母方单倍型上的代表性等位基因进行，来确定两个单倍型的出现；（iv）比较两个单倍型的出现来获得相对出现；（v）确定两个单倍型之一的过度出现ε；和（vi）使过度出现ε与母方遗传的单倍型关联。

本发明还涉及非侵入性地确定由胎儿所继承的母方单倍型的方法，包括：（a）从怀有至少一个胎儿的妊娠女性获得母方样本，其中所述的样本含有来自妊娠女性和胎儿的DNA；（b）计数样本中定义两个母方单倍型中的每一个的标记物，以确定两个单倍型的出现；（c）比较两个单倍型的出现来获得相对出现；（d）确定两个单倍型之一的过度出现ε；和（e）使过度出现ε与遗传的（transmitted）母方单倍型关联。

本发明还包括确定一组适当标记物的方法，所述标记物定义母方单倍型，方法包括：确定在第一母方单倍型中的多态性基因座上存在，但在第二母方单倍型上的对应基因座却缺失的等位基因。

本发明的另一方面是提供确定数字取样的最小量来实现所需的关于哪种亲本单倍型过度出现的置信水平的方法，包括（a）估计样本中存在的胎儿DNA的分数；及（b）估计可用标记物的密度。

然而，本发明的另一个方面是提供估计母方样本中胎儿DNA分数的方法，包括，通过检验母方单倍型之一的过度出现或存在父方遗传的单倍型，来测量亲本单倍型的相对出现。

本发明的另一个方面是提供用于进行本发明方法的微流体装置，其中装置包括（a）染色体划分区；（b）扩增区；和（c）产物回收区，以及任选（d）细胞分选区；和（e）染色体释放区。

本发明还包括用于控制微流体装置和用于分析样本数据的计算机程序。

通过如下本发明优选实施方式的更具体描述，本发明的上述和其它目的、特征和优点将是显而易见的，正如附图所示的，其中相同参考符号表示所有不同视图中的相同部分。这些附图不一定按比例绘制，而是将重点放在说明本发明的原理上。

附图说明

申请文件含有至少一副以颜色表示的图。含有彩色图的来自本申请的任何专利或专利申请公布的拷贝，依据请求以及缴纳必要费用后由局提供。

图1.非侵入性确定胎儿基因组的策略的概要。当来自父母双方的血液或其它遗传物质可获得的情况下，获得亲本的全基因组、染色体长度单倍型，例如在这项研究中使用直接的确定性分相（phasing）。通过它们各自特异性的等位基因区分四种亲本单倍型。通过母方血浆的鸟枪测序实现亲本单倍型的分子计数。通过在每个母方单倍型上对等位基因进行计数并确定两个母方单倍型的相对出现来揭示母方单倍型的遗传。通过对特异于各父方单倍型的等位基因数目进行计数确定父方单倍型的遗传。当血液仅可从妊娠母方获得的情况时，以同样方式确定母方单倍型的遗传，但是基于母方血浆中检测到的父方特异性等位基因，通过归算（imputation）重建父方遗传的单倍型。

图2.微流体装置，其设计用于扩增来自单细胞的中期染色体，以实现直接的确定性分相（DDP）。显微镜下识别单个中期细胞并捕获于区域A中。引入蛋白酶（胃蛋白酶，低pH）以在区域B中产生染色体悬液。染色体悬液被划分为48个单元（区域C）。在每个分区中的内容物单独进行扩增（区域D）。具体而言，在低pH条件下的染色体首先进行中和，并用胰蛋白酶处理来消化染色体蛋白质。用碱使染色体变性，随后经中和用于进行多链置换扩增。随着试剂相继被引入到每一个充气室，装置材料的透气性使得能够将染色体推入一个室接着进入下一个，并最终到达扩增室。在收集口（区域E）回收经扩增的材料。在装置的概览图中，控制通道充满绿色染料。细胞分选区和扩增区中的流通道分别充满红色和蓝色染料。

图3.用于全基因组单倍型分型的微流体装置概述。

图4.在微流体装置中，使用46基因座PCR确定扩增产物的染色体来源身份。此表代表了使用P0培养的全血的单个中期细胞的实验结果。行代表微流体装置上室中内容物，列代表基因座，具有指定的染色体和坐标（NCBI Build36.1）。在两个室中发现各基因座，除17和20号染色体上的那些以外。SNP的两个等位基因以红色和绿色突出显示。杂合基因座用蓝色标记。室编号标记为黄色的汇集在一起，并在一个全基因组基因分型阵列上进行基因分型，而室编号标记为橙色的汇集在一起，并在另一个阵列上进行基因分型。从培养的全血中提取基因组DNA也用相同的46个基因座PCR进行测试。

图5.全基因组单倍型分型的统计。A.显示针对每个个体的各染色体分相的阵列上存在的SNP分数（fraction）的棒状图（GM12891、GM12892、GM12878和欧洲个体P0），显示为彩色条。B.棒状图针对每个个体显示每SNP分相的复制数。

图6.GM12878约160,000个杂合SNP（三人组（trio）的孩子）实验确定的分相和通过HapMap计划III期确定的那些进行比较。确定的SNP是指对于至少一个亲本是纯合的那些，并且使用HapMap中的家庭数据进行确定性分相。这一比较显示DDP的准确性。不确定的SNP是指对于三人组的所有成员都是杂合的那些，在HapMap中使用统计分相。这一比较表明，即便家庭数据可以获得，实验分相也是重要的。

图7.表显示父方（GM12891）和母方（GM12892）染色体中的交叉区域，产生CM12878的基因组。

图8A.在CEU家庭的三人组中，使用SNP阵列的数据进行杂合缺失的分相。在图8中，“同源物1”绘制在右边，而“同源物2”绘制在左边。携带区域拷贝的同源物粗体显示。B.在CEU家庭的三人组中，使用实时PCR进行杂合缺失的分相。携带区域拷贝的同源物粗体显示。^a经分型的标记物数目/区域内至少一个同源物中经分型的标记物数目；^b至少一个同源物不包含任何经分型的标记物；^c提供阳性PCR扩增的同源物数目/测试的同源物数目；^d两个同源物均提供阳性PCR扩增，尽管对于两个个体而言，这种CNV的拷贝数为1。

图9.家庭的三人组中，重组事件的直接观察以及杂合缺失的确定性分相。每个等位基因以彩色水平线表示，可获得孩子和亲本的DDP数据。从父方遗传给孩子的等位基因用蓝色标记。从母方遗传给孩子的等位基因用红色标记。未遗传的等位基因被标记为黑色。着丝粒和异染色质区域没有通过基因分型阵列进行分析，因此为白色。沿着各同源染色体，亲本中的杂合缺失表示为三角。实三角代表一个拷贝，而空三角表示一个无效（null）拷贝。针对各亲本独立确定缺失的分相。根据遗传状态用颜色对三角进行编码，其中遗传状态由相对于重组的位置通过缺失定位进行确定。独立于亲本，确定孩子中的缺失分相，并显示在亲本染色体的顶部。左边的整数是HapMap III期给出的各区ID。右边的数字是通过HapMap确定的孩子中的区域拷贝数。以相同的长度绘制染色体。

图10.分相SNP的分数作为所分析的同源染色体对数量的函数。这基于四次P0的单细胞实验的结果。每一个点代表常染色体的覆盖。误差棒代表平均值的标准误差。

图11.通过基因分型阵列较难获得区域中具有相对较高GC含量的SNP，可能是因为在较高GC含量的区域phi29的扩增效率降低。这里绘制的是，通过基因分型阵列分相的SNP分数（基于阵列划分扩增材料中等位基因类型的能力）作为SNP所处区域的GC含量的函数。这里显示的是，使用Illumina的OmnilS阵列进行的P0全基因组单倍型分型数据。测量每500kb的bin（无对应译文）内成功分相的SNP的分数，并对应着bin的GC含量进行绘制。22个常染色体分为3组，给予三色标记，这取决于所分析的同源拷贝对数量是多少（四个试验单细胞之中）。

图12.通过测序的分相与通过基因分型阵列的分相的一致性（concordance）作为测序覆盖率的函数。对P0的6号染色体上三个不同拷贝进行测序。只比较用基因分型阵列进行两次以上分相的SNP。

图13.表显示P0的6号染色体的两个同源拷贝的高通量测序的统计。将读取对应到NCBI Build36上。

图14.对于经测序的6号染色体的三个不同同源拷贝，32bp读取在整个6号染色体上的分布，标记为文库1、2和3，并以蓝色、红色和黑色的棒表示。顶部：相对于样本中位数，每500kb的读取数。每个图显示成对比较。着丝粒和多态性MHC区域内的序列无法正确比对。中部：同上，除冗余读取被删除以外，该冗余读取可能是由于对文库制备物测序过程中的PCR造成的。底部：每个bin的读取数累积分布，bin的大小范围从50kb到500kb。

图15.P0的实验确定的分相和通过PHASE确定的那些的比较。随机选择常染色体上七十六个区域并进行三次统计学分相。每个区域携带100个杂合SNP并横跨平均～2MB。切换误差率（Switch error rate）计算为不同分相的杂合SNP相对于紧挨着的上游SNP的比例。单位点误差率计算为错误分相的杂合SNP的比例。如果它有占主导的分相，则认为SNP被正确分相。对于每个区域，报道三次运行的平均值。通过DDP测量的确定性分相作为实际基础（ground truth）。

图16.P0的杂合缺失的分相。携带靶区域的同源物以粗体显示。^a和Pushkarev等人2009中的补充表4相同的标记；^b被选择用于定义PO的6号染色体的两个同源物拷贝的杂合SNP；^c每个同源物拷贝上所选SNP的等位基因；^d经分型的标记物数目/区域内至少一个同源物中经分型的标记物数目；^e阳性或阴性PCR信号；^f在获自3个单细胞的分离的染色体同源物的扩增材料上进行PCR实验（“C”是指来自3个单细胞中相同同源物的组合基因分型结果）；^g对于这种特定单细胞实验未分离同源拷贝。

图17.使用DDP确定的P0的HLA单倍型。在各6个经典HLA基因座上，将P0的实验分相的SNP单倍型和HapMap III期可获得的CEU三人组的176分相的SNP单倍型放置在邻接树上（neighbor-joining tree）。P0的两个单倍型以红色和蓝色标记。对于带有HLA分型数据的CEU组（panel）中的单倍型，四个数字等位基因出现在样本标记的旁边。树的大部分被压缩。如果HLA等位基因信息可获得的话，每个压缩的子树用和子树内的成员相关的HLA等位基因进行标记。单倍型1上HLA-B和HLA-C的等位基因身份不用DDP进行确定，因为具有和P0SNP单倍型相似的SNP单倍型的CEU个体在这些基因座上不具有HLA分型数据，但是可以从基因组DNA的直接HLA分型结果推导出来（表中的第一行）。HLA-DQAI不能直接分型。

图18.用于全基因组单倍型分型的46个基因分型分析的列表。

图19.用于家庭三人组中杂合缺失的分相的引物序列和Taqman探针。

图20.母方血浆中胎儿DNA分数和推导母方单倍型遗传所需的取样深度之间的关系。取样深度的测量是遗传的母方单倍型上出现标记物/bin的中位数。在不同的置信水平，给定胎儿DNA分数的预测取样需求绘制为实线。

图21.确定含有母方和孩子基因组DNA的混合物中亲本单倍型的孩子遗传。A.母方单倍型。每个黑圈对应着两个母方单倍型的相对出现，使用在圆圈中心10Mb区域内的标记物评估相对出现。每个黑圈随附有对应着针对各测量的95%置信区间的误差棒，通过模拟读取分布，假设各母方单倍型的计数是泊松随机变量的平均值，通过模拟读取的分布来评估。用100kb的滑动窗计算相对出现。如之前三人组的全基因组单倍型分型实验所确定的，母方单倍型的真实遗传作为背景显示（红色：从母亲遗传给女儿；灰色：未遗传；白色：异染色质/着丝粒）。所有染色体以相同的长度绘制。B.父方单倍型。白色交叉代表测序数据中观察到的两个父方单倍型中每一个上的父方等位基因。各黑圈对应着两个父方单倍型的相对出现，使用在圆圈中心10Mb区域内的标记物评估相对出现。用100kb的滑动窗计算相对出现。如之前三人组的全基因组单倍型分型实验所确定的，父方单倍型的真实遗传作为背景显示（蓝色：从父亲遗传给女儿；灰色：未遗传；白色：异染色质/着丝粒）。所有染色体以相同的长度绘制。C.测量交叉事件的分辨率。对于母方染色体上的交叉事件，绘制各测量的交叉和对应的真实交叉之间的距离。对父方染色体上的交叉事件，绘制各测量的交叉事件宽度。通过分辨率分选交叉事件。

图22.确定母方血浆DNA中胎儿的母方单倍型遗传。A.患者1，早期孕期（头三个月）的血浆。常染色体和X染色体bin的大小分别是15Mb和20Mb。B.患者1，中期孕期的血浆。常染色体和X染色体bin的大小分别是7.5Mb和10Mb。C.患者2。常染色体和X染色体bin的大小分别是3.5Mb和5Mb。22号染色体着丝粒附近的蓝色区域表示母方单倍型之一上和DiGeorge综合征相关的缺失区域。D.母方染色体上各测量的交叉和各自的真实交叉之间的距离。通过距离分选交叉事件。P1的早期孕期文库中丢失两个事件。

图23.基于母方血浆中检测到的父方特异性等位基因，重建父方遗传的染色体。A.在母亲是纯合的位置上每碱基覆盖的分布。蓝：父方特异性等位基因，红色：父方特异性等位基因+母方等位基因。B.在不同测序深度检测的父方特异性等位基因分数。

图24.母方基因组的直接确定性分相（DDP）。对于患者1（P1）和患者2（P2），分别使用3和4个单细胞实现全基因组单倍型分型。

具体实施方式

如背景技术部分中所讨论的，单倍型是难以测量的，因为它需要单独分析基因组中区域的两个同源拷贝的每一个。尽管将携带几乎相同的同源区的两条DNA链物理上分离是具有挑战性的，单分子分析非常适于本申请。通过将含有区域的多个同源拷贝的混合物稀释成单分子密度，并在单分子上进行遗传分析，可以测量单倍型。这是多个发表的分子单倍型技术背后的概念（Zhang等人，2006；Mitra等人，2003；Ding & Cantor,2003；Michalatos Beloin等人，1996；Ruano等人，1990；Xiao等人，2009），但是，由于分析是在DNA提取过程中被片段化的DNA上进行的，他们无法提供全基因组单倍型，和/或他们只能测量一个分子上的几个基因座。这里提出的策略，通过全面扩增来自单细胞的单个完整染色体分子，解决了这些问题，从而扩增材料的高通量遗传分析提供个体的全基因组单倍型。

非侵入性测量在胎儿中是杂合的在母方中是纯合的胎儿基因型并不重要，因为只需要检测到母方中不存在的等位基因的存在。非侵入性测量在母方中是杂合的胎儿基因型更具挑战性，但具有重要的应用，尤其是用于诊断常染色体隐性疾病。在父母双方都是疾病相关基因座携带者的这种情况下，确定胎儿是否遗传了隐性等位基因的两个拷贝是有趣的。像非整倍体的检测，在这种情况下确定胎儿的基因型历来是困难的，由于母方血浆中的母方背景DNA（Wheeler等人，2008；Bentley等人，2008；Ahn等人，2009；Kim等人，2009；Wang等人，2008；Pushkarev等人，2009；Schuster等人，2010）。

非侵入性检测胎儿非整倍体的单分子计数的相同方法可以用于开发用于检测胎儿中常染色体隐性疾病的分析。对兴趣双等位基因SNP中每个等位基因的数目进行简单计数，并确定两个等位基因的计数是否平衡。如果一个等位基因相对于另一个过度出现，那么对于过度出现的等位基因而言胎儿是纯合的。如果两个等位基因的计数是相似的，胎儿是杂合的。这种方法的一个缺点是每基因组当量只有一个拷贝的目标等位基因，可信的测量需要等位基因的大量计数，并且每体积血浆的DNA量有限。然而，由于各个体人类从他/她父母双方继承了大的单倍型块（block），各亲本单倍型定义为特异性等位基因的大的集合，本发明人认识到对单倍型特异性标记物进行数字计数使得能够确定在基因座上胎儿遗传了哪一个等位基因，而不会遇到样本限制的问题。

此处使用如下定义：

通过“等位基因”是指基因两个或两个以上的形式之一。二倍体生物体如人类包含每个染色体的两个拷贝，从而在每个上携带一个等位基因。

通过“纯合”是指生物体在某一特定基因座上包含两个相同的等位基因。

通过“杂合”是指生物体在某一特定基因座上包含两个不同的等位基因。

通过“单倍型”是指沿着单条染色体在多个基因座上等位基因的组合。单倍型可以基于单条染色体上的一组单核苷酸多态性（SNP）。

通过“单倍型块”是指被一起遗传的一组等位基因。

单倍型是指沿着单条染色体在多个基因座上等位基因的组合。它们之所以出现是因为我们基因组的二倍体性质。在个体化医学中知晓个体完整的单倍型是重要的，因为一些研究已经证实特定的单倍型与疾病抗性或易感性之间的关联。一个众所周知的例子是人类白细胞抗原（HLA）单倍型与自身免疫性疾病（de Bakker等人，2006；Stewart等人，2004）以及移植的临床结果（Petersdorf等人，2007）相关。载脂蛋白基因簇内的单倍型可能影响血浆甘油三酯浓度和动脉粥样硬化的风险（Groenendijk等人，2001）。一些研究表明，特定的3-珠蛋白基因座单倍型与较好的镰刀状细胞病预后有关（Nagel等人，1991），而其它研究已将基质金属蛋白酶基因簇的单倍型与癌症发展关联起来（Sun等人，2006）。单倍型在药物基因组学中也是重要的，一个实例是β-2肾上腺素受体与对哮喘的药物治疗的反应相关（Drysdale等人，2000）。确定性单倍型分型大大提高了全基因组关联研究在寻找与常见但复杂性状相关的候选基因中的能力。它还有助于了解人口遗传学和历史人类迁徙以及基因出现中顺式作用调节的研究。

通过“归算”是指，根据统计学上关联单倍型块中特定SNP的共同表型（appearance）的事实，明确鉴定染色体区域中所有多态性位点的能力。

除非另有指明，此处所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然任何和此处所述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明的实施或测试，对优选的方法和材料进行了描述。一般来说，与细胞和分子生物学和化学的技术有关的所用系统命名是众所周知的，并且在本领域中是常用的。没有特别指明，某些实验技术通常是根据本领域中公知的以及贯穿本说明书中引用和讨论的各种常规和更具体的参考文献中所描述的常规方法进行。为了清楚起见，如下术语定义如下。

本发明认识到只要对亲本（染色体同源拷贝的每个的序列）的二倍体基因组进行测序，通过确定遗传了哪个亲本单倍型就可以计算出胎儿基因组。来自亲本的单倍型信息的可用性大大降低了对输入血浆DNA的要求。不是计数特定SNP基因座上的等位基因，单倍型块内所有SNP的等位基因计数可有助于确定遗传了哪个亲本单倍型。由于减数分裂中交叉事件的数目是有限的，在原亲本染色体中的断裂数是小的，且对于每个亲本单倍型存在大量可以测量的有提示性的SNP。这种方法也提供了拷贝数变体遗传的有关信息。

简单地说，本发明涉及非侵入性确定胎儿所继承的亲本单倍型的方法和装置，并可能用来非侵入性确定胎儿基因组、或其部分。使用父方和母方的信息组合可进行该方法，或者可以仅利用母方的单倍型信息。为了进行该方法，获得含有母方和胎儿遗传物质的母方组织。优选地，母方组织是母方外周血或血浆。术语“血浆”可包括血浆或血清。为了区分来自胎儿结果的随机变化，运行大量的反应，并对结果应用统计方法。

离散样本在反应样本中，其中可以分析靶序列。反应样本可以是，例如，微量滴定板中的孔、乳液中的水相、阵列表面的区域、或微流体装置中的反应室。反应样本可用于离散样本的PCR分析。离散样本与多个PCR引物接触，包括至少一个（或一个正向和一个反向）特异于母方对照序列的引物，对照序列预计在母方和胎儿中是相同的。PCR引物也特异于胎儿序列，即母方和胎儿中可能都存在，但是在胎儿中扩增或改变。PCR扩增将允许检测这两个不同的序列。PCR方法可以是（但不一定是）定量的。可使用定量实时PCR，其包括用具有荧光标记的核酸与靶序列杂交。也可以使用与靶序列杂交的荧光探针。已知用于此目的的一些“数字PCR”规程，以及基于珠的或乳液PCR。尽管荧光探针易于获得并可用于提供灵敏的结果，如在FRET组合中，也可以使用其它标记技术。

根据所需的结果选择离散样本数目。在一个方面，优选得到高度的统计学显著性，并且可以使用数字计数的任何方法，包括但不限于PCR、测序和杂交。要获得的结果，对于所进行的分析的目的（例如初步筛选、初步诊断等），应当是统计学上显著的。当需要高度显著的结果时，统计学显著性的常用测量是p<0.01，即根据卡方或t检验99％置信区间。在一些实施方式中，可以使用其它统计方法。例如，可使用SPRT确定截止值。Fan和Quake（2010b）表明只通过计数统计，胎儿异常的检测灵敏度是有限的。

根据本发明的方法可检测任何通过遗传可传播的疾病，包括一个或多个基因中已知的改变：CFTR、VIII因子（F8基因）、β-珠蛋白、血色素沉着症、G6PD、神经纤维瘤、GAPDH、β淀粉样蛋白、和丙酮酸激酶。这些基因的序列和常见突变（如，单核苷酸多态性或SNP）是已知的。可检测其它遗传异常，如参与人染色体中缺失的、易位或倒位中移动的、或在染色体复制中复制的序列的那些，其中所述序列的特征在于在胎儿遗传物质中的已知遗传病不存在于母方遗传物质中。例如染色体三体可包括部分的、嵌合的、环的18、14、13、8、6、4等。已知异常的列表可见于OMIM Mobid图http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/getmorbid.cgi。

本发明包括一种用于分析母方样本，如来自外周血的方法。不像羊膜穿刺术或绒毛膜绒毛取样，其不侵入到胎儿空间。在优选方法中，使用母方血浆中存在的胎儿DNA。

在某些方面中，本发明可包括计算机，其经编程用来分析获自母方和胎儿染色体DNA混合物的序列数据。每个常染色体（染色体1-22）被计算机分割成连续的、非重叠窗口（也可使用滑动窗）。每个窗有足够的长度以包含定义各亲本单倍型的等位基因的大量计数（且计数依赖于测序深度和窗内的标记物数目），但每条染色体上不仍具有多个窗。通常情况下，窗在几百kb和几个Mb之间。

更详细地，通过如下代表了其优选实施方式的项目描述本发明。

1、一种非侵入性确定由胎儿所遗传的亲本单倍型的方法，包括：

a.从怀有至少一个胎儿的妊娠女性获得母方样本，其中所述样本含有来自妊娠女性和胎儿的DNA；

b.通过如下步骤确定父方遗传的单倍型：

i.在胎儿父亲的DNA中确定一组单核苷酸多态性（SNP）；

ii.确定胎儿母亲DNA中的一组SNP；

iii.确定父亲中杂合的以及母亲中纯合的所有SNP，来鉴定父亲中存在而在母亲中缺失的各种基因座等位基因，从而确定父亲的各单倍型；和

iv.在各父方单倍型上对代表性等位基因进行计数，来确定两个单倍型的出现；

v.比较两个单倍型的出现来获得相对出现；

vi.确定两个单倍型之一的过度出现ε；和

vii.关联所述过度出现ε与父方遗传的单倍型；以及

c.通过如下步骤确定母方遗传的单倍型：

i.确定胎儿母亲中所有杂合的SNP；和

ii.在各SNP基因座上鉴定在母亲中存在但在父方遗传的单倍型中缺失的等位基因，以确定母亲的单倍型；

iii.在各母方单倍型上对代表性等位基因进行计数，来确定两个单倍型的出现；

iv.比较两个单倍型的出现来获得相对出现；

v.确定两个单倍型之一的过度出现ε；和

vi.关联过度出现ε与母方遗传的单倍型；

2、根据项目1所述的方法，其中通过对标记物进行数字计数测量单倍型的相对出现，其中所述标记物是定义各亲本单倍型的等位基因。

3、根据项目1所述的方法，其中比较特异于每个固定距离上两个母方单倍型每一个的标记物计数总和，确定哪个母方单倍型过度出现。

4、根据项目1所述的方法，其中比较特异于每个固定距离上两个父方单倍型每一个的标记物计数总和，确定哪个父方单倍型过度出现。

5、根据项目2所述的方法，其中通过测量单个DNA分子计数的数量进行数字计数。

6、根据项目5所述的方法，其中通过测序、数字聚合酶链式反应（PCR）或杂交（或能够读取单个DNA分子上特定基因座上等位基因身份的任何方法）进行测量。

7、根据项目1所述的方法，其中确定胎儿基因组的一部分。

8、根据项目7所述的方法，其中确定整个胎儿基因组。

9、一种通过测量项目1的亲本单倍型的相对出现来估计胎儿DNA分数的方法。

10、一种非侵入性确定由胎儿所遗传的母方单倍型的方法，包括：

a.从怀有至少一个胎儿的妊娠女性获得母方样本，其中所述样本含有来自妊娠女性和胎儿的DNA；

b.计数所述样本中定义两个母方单倍型中每一个的标记物，以确定两个单倍型的出现；

c.比较两个单倍型的出现来获得相对出现；

d.确定两个单倍型之一的过度出现ε；和

e.关联所述过度出现ε与遗传的母方单倍型。

11、根据项目10所述的方法，其中通过对标记物进行数字计数测量单倍型的相对出现，其中所述标记物是定义各母方单倍型的等位基因。

12、根据项目11所述的方法，其中比较特异于每个固定距离上两个母方单倍型每一个的标记物计数总和，确定哪个母方单倍型过度出现。

13、根据项目11所述的方法，其中通过测量携带特异性标记物的单个DNA分子计数的数量进行数字计数。

14、根据项目13所述的方法，其中通过测序、数字聚合酶链式反应（PCR）或杂交（或能够读取单个DNA分子上特定基因座上等位基因身份的任何方法）进行测量。

15、根据项目10所述的方法，其中确定胎儿基因组的一部分。

16、根据项目15所述的方法，其中确定整个胎儿基因组。

17、根据项目10所述的方法，还包括非侵入性重建父方遗传的单倍型。

18、根据项目17所述的方法，其中使用样本中检测到的父方特异性等位基因，通过单倍型归算实现父方遗传的单倍型的重建。

19、一种确定一组适当标记物的方法，所述标记物定义母方单倍型，包括确定在第一母方单倍型中的多态性基因座上存在，但在第二母方单倍型上的对应基因座却缺失的等位基因。

20、根据项目19所述的方法，其中在第一母方单倍型中的多态性基因座上存在但在第二母方单倍型上的对应基因座却缺失的等位基因也不在两个父方单倍型的对应基因座上。

21、一种确定一组适当标记物的方法，所述标记物定义父方单倍型，包括确定在第一父方单倍型中的多态性基因座上存在，但在第二父方单倍型上的对应基因座却缺失的等位基因。

22、根据项目21所述的方法，其中在第一父方单倍型中的多态性基因座上存在但在第二父方单倍型上的对应基因座却缺失的等位基因也不在两个母方单倍型的对应基因座上。

23、根据项目21所述的方法，其中组中的标记物数目可以通过单倍型归算而增加。

24、根据项目18或23所述的方法，其中单倍型归算包括：

通过将待归算的单倍型上所观察到的等位基因与之前归档的单倍型数据库进行比较，在任何未测量的基因座上统计推导等位基因身份，其中之前归档的单倍型数据库的单倍型的等位基因身份在测量和未测量的基因座上均是已知的。

25、根据项目23所述的方法，其中所述数据库来自正常群体。

26、根据项目23所述的方法，其中所述数据库来自携带可通过遗传传播的特定疾病的群体。

27、一种确定数字取样的最小量来实现所需的关于哪种亲本单倍型过度出现的置信水平的方法，包括：

a.估计样本中存在的胎儿DNA的分数；和

b.估计可用标记物的密度。

28、一种估计胎儿DNA分数的方法，包括测量胎儿单倍型的相对出现。

29、根据项目19或21所述的方法，其中可以通过如下实现确定一组定义个体单倍型的标记物：

a.在相关家庭成员当中比较多态性基因座上的等位基因；或

b.分析单个DNA分子或单个染色体分子上多态性基因座上的等位基因。

30、一种用于进行项目27所述方法的微流体装置，包括：

a.染色体划分区；

b.扩增区；和

c.产物回收区。

31、根据项目30所述的微流体装置，还包括：

a.细胞分选区；

b.染色体释放区；

32、根据项目31所述的装置，其中在所述细胞分选区中，从细胞悬液中鉴定并捕获单个中期细胞，并进行裂解而形成染色体悬液。

33、根据项目31所述的装置，其中在所述染色体划分区中，染色体悬液被随机分到多个通道划分中。

34、根据项目30所述的装置，其中在所述扩增区中，分离的染色体通过多链置换扩增单独进行扩增。

35、一种用于控制项目30的微流体装置的计算机程序。

提供如下实施例以帮助理解本发明，真正的范围如所附权利要求书中所述。应当了解，在不脱离本发明精神的情况下，所述程序可以进行修改。

实施例：

结合如下实施例将更好的理解本发明的组合物和方法，其仅意图作为一个说明，而非限制本发明的范围。所公开的实施方式的各种变化和修改，对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且这种变化和修改包括但不限于，在不脱离本发明精神和所附权利要求书范围的情况下，做出涉及本发明的过程、制剂和/或方法的那些。

实施例1

为了解决现有技术中的缺点，本发明人已经开发出一种被称为“直接确定性分相”（DDP）的方法，其中来自单细胞的完整染色体在微流体装置上被分散和扩增（图2、3）。图2和图3代表用于分离和扩增单细胞内染色体的微流体装置的概况。三个罩以40,000dpi分辨率被印在透明胶片上（Fineline Imaging），一个带有5m流层的图式，一个带有40pm流层的图式，以及一个带有25pm控制层的图式。两个带有流层的罩规模扩大1.5％以适应当它从模具中剥离时厚PDMS层的收缩。用正性光刻胶（photoresist）产生流模具，而用负性光刻胶产生控制模具。本节中的操作由斯坦福微流体铸造厂（Stanford Microfluidics Foundry）提供。

微流体装置具有5个区域（图2）。其由如下组成：细胞分选区，其中显微镜下鉴定并从细胞悬液中捕获单个中期细胞；染色体释放区，其中通过细胞质蛋白酶消化释放中期染色体；染色体划分区，其中染色体悬液随机分到48个狭长通道的分区；扩增区，其中分离的染色体通过多链置换扩增单独进行扩增；以及产物回收区，其中单独收集扩增的产物。

微流体装置由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成，并采用多层软光刻技术铸造（Unger等人，2000；Thorsen等人，2002；Melin & Quake,20070。两层装置在底部具有矩形25pm高控制通道（tall control channel），并在顶部环绕流通道。装置连接包被有薄PDMS层的玻片。在装置的细胞分选区，流通道为40μm高且200μm宽。在装置的扩增区中，流通道为5μm和100μm宽，且反应室为40μm高。在控制通道和流通道交叉的位置形成“上推”（push-up）膜阀，且当控制通道加压至20-25psi时膜阀被启动，并向上推挤流通道。对于40μm的流通道而言，每个阀的面积为200μm×200μm，对于5μm流通道为100μm×100μm。通过外部气动电磁阀控制膜阀，气动电磁阀由连接至计算机USB口的自定义电子设备驱动。编写Matlab程序与阀交接（interface）。由芯片上的一组蠕动泵控制细胞分选区内的流体流。在扩增区中，由于PDMS的透气性，有可能通过终端（dead-end）填充依次引入试剂。根据每个反应室的体积确定引入试剂的量。该装置制造的详细操作如下。

装置的制备

流模具包含两个高度的圆形特征（feature）。用SPR220-7光刻胶制造具有5μm特征的第一层。用AZ50光刻胶制造具有40μm特征的第二层：

1.用HDMS（六甲基二硅氮烷）处理晶片（wafer）5分钟。

2.旋涂5PR220-7：500rpm持续5s，3200rpm持续30s。

3.软烤：115℃持续90s。

4.暴露于UV持续65s。

5.通过在MF-319中浸泡3-5分钟形成罩（develop mask）。用水冲洗。

6.硬烤：以每小时10℃的升温速率，经15小时使温度从25℃提高到190℃。

7.用HDMS处理晶片5分钟。

8.旋涂AZ50：500rpm持续10s，1100rpm持续30s。

9.115℃软烤4分钟，65℃持续1分钟。热板设置到自动关闭并冷却至室温。

10.在2个30s周期中将晶片暴露于UV。

11.在AZ形成剂中形成罩。用水冲洗。

12.硬烤：以每小时10℃的升温速率，经15小时使温度从25℃提高到190℃。

控制模具包含25μm的矩形特征，用SU2025光刻胶进行制造：

1.旋涂SU2025光刻胶：500rpm持续5s，2700rpm持续60s。

2.软烤：65℃持续2分钟，95℃持续5分钟，65℃持续2分钟。

3.暴露于UV持续20s。

4.后烘：65℃持续2分钟，95℃持续5分钟，65℃持续2分钟。

5.在SU8形成剂中形成罩1-2分钟，用异丙醇冲洗。

6.硬烤：以120℃的升温速率，使温度从65℃提高到150℃。烤2小时。

用PDMS（聚二甲基硅氧烷）制造微流体装置：

1.厚层：通过将A部分和B部分以5：1的比例在一个混合搅拌机（hybridmixer）中混合1分钟随后脱气2分钟，来制备50g RTV PDMS。将混合物倒入流模具，并在真空室中脱气30分钟，或直至气泡消失。在80℃烘烤1小时。

2.薄层：通过将A部分和B部分以20：1的比例在一个混合搅拌机中混合1分钟随后脱气2分钟，来制备21g RTV PDMS。以1500rpm的转速旋转60s，具有15s的升高时间（ramp time），将混合物旋涂在控制模具上。在80℃烘烤40分钟。

3.从流模具上切割并剥离厚层。在厚层上打孔并对齐到涂有PDMS的控制模具。一起烘烤1.5h。

4.通过以2000rpm将RTV PDMS（20：1的A部分：B部分）直接旋涂在玻片上并在80℃烘烤40分钟，来涂覆空白玻片。

5.从控制模具上剥离厚层和薄层。打孔并置于玻片上。80℃烘烤过夜。

细胞培养

在装置上对两个类型的细胞进行了测试：国际HapMap计划中所用的类淋巴母细胞系（lymphoblastoid）以及来自捐赠者全血细胞的淋巴细胞。

EBV-转化的类淋巴母细胞系（Coriell细胞存储库）培养于补充有15%胎牛血清的RPMI1640。为了富集有丝分裂细胞群，各培养物用2mM胸苷（Sigma）在37℃处理24小时。随后是在PBS中多次洗涤，细胞在正常培养基中培养3小时，用200ng/ml诺考达唑（Sigma）在37℃处理2小时使细胞停滞在中期。

从指尖采集的全血（～250微升）用肝素钠处理，并在PB-Max介质（Invitrogen）中培养4天。培养物用50ng/ml秋水仙酰胺（Invitrogen）处理6小时。将培养物成层状置于Accuspin系统-Histopaque-1077（Sigma）上，以2500rpm离心8分钟。除去界面上的有核细胞，用Hank氏缓冲盐溶液（HBSS）洗涤一次。

停滞在中期的细胞与75mM KCl在室温下孵育10-15分钟。以2%的最终浓度在细胞悬液中加入乙酸，以固定细胞。在冰上固定30分钟后，用PBS-1%BSA-1mM EDTA将细胞洗涤两次，并用PBS-1%BSA-1mM EDTA-1%Triton洗涤一次，最后悬浮在75mM KCl-1mM EDTA-1%Triton X-100中。加载至微流体装置前，用0.2mg/mlRNaseA（Qiagen）处理细胞。

从无细胞血浆的DNA提取规程

血液处理

1.在EDTA真空采血管中收集20ml外周血。

2.以1600g管在4℃离心10分钟。

3.血浆的850ul分装至1.5ml聚丙烯管中，注意不要扰乱血沉棕黄色层。

4.以16000g将管在4℃离心10分钟以去除残留的细胞。

5.小心取出上清液（～800μl）并置于新1.5ml聚丙烯管中。

6.采集血液尽快进行离心。无细胞血浆的等份可以保存于-80℃，直到进一步的处理。

7.在这项研究中，使用两种商品化试剂盒，根据制造商的规程稍作修改后，从血浆中提取DNA。

使用QIAamp DNA微试剂盒（Qiagen）提取无细胞DNA

以下规程包含对制造商手册中“小体积血液规程”的修改。

1.将加热块的温度设置为56℃。

2.平衡样本、AE缓冲液或水至室温。

3.向缓冲液AL中加入适量的载体RNA（carrier RNA）（10μg载体RNA每ml缓冲液AL）。例如，7ml缓冲液AL需要700载体RNA。

4.吸取40μl蛋白酶K加入1.5ml微量离心管底部。

5.400μl血浆加入至微量离心管（2个独立的管共800μl血浆）。

6.向样本添加400μl缓冲液AL。通过脉冲旋涡振荡混合15s。

7.在56℃孵育l0分钟。

8.1.5ml离心管短暂离心除去盖子内部的液滴。

9.向样本添加200μl乙醇（96-100%）。通过旋涡振荡混合15s。在室温下孵育3分钟。短暂离心。

10.将样本施加到2ml收集管中的MinElute离心柱上。以6000g离心1分钟（取决于柱体积，它可能需要将样本反复施加到柱上）。将离心柱置于干净的2ml收集管中。

11.向柱添加500μl缓冲液AW1。以6000g离心1分钟。将离心柱置于干净的2ml收集管中。

12.添加500μl缓冲液AW2。以6000g离心1分钟。

13.将离心柱置于新的2ml收集管中，以20000g离心3分钟（缓冲液AW2可能会影响下游应用）。

14.20000g翻转旋转3分钟。

15.在56℃预热缓冲液AE。

16.将离心柱置于干净的1.5ml微量离心管中。添加500μl缓冲液AE。

17.在室温下孵育5分钟。以6000g离心1分钟。

A.3使用Nucleospin血浆F试剂盒（Macherey-Nagel）提取无细胞DNA

和制造商说明书的唯一差异是省略最后的开盖干燥步骤。

细胞分选、染色体释放和多链置换扩增

加载细胞悬液之前，用Pluronic F127（PBS中0.2%）处理装置的细胞分选通道。使用芯片上的蠕动泵和芯片外的压力源将细胞悬液导入装置。显微镜下通过形态差异区分中期细胞和间期细胞。一旦在捕获室识别单个中期细胞，启动周围的阀将其从其余细胞悬液中分离。引入胃蛋白酶溶液（在75mMKCl、1%TritonX-100、2%乙酸中0.01%）消化细胞质并释放染色体。通过启动一系列沿着通道的阀，将染色体悬液推入狭长通道，并划分至48个180皮升的分区中。引入150mMTris-HCl（pH8.0）（1.2纳升）中的胰蛋白酶（0.25%）来中和溶液，并消化染色体蛋白质。十分钟后，引入变性缓冲液（补充有0.8%Tween-20的Qiagen Repli-GMidi试剂盒的缓冲液DLB）（1.4纳升）。装置放置在平顶热循环仪上，设定在40℃持续10分钟。随后是引入中和溶液（Repli-G试剂盒的终止溶液）（1.4纳升）并在室温下孵育10分钟。送入反应缓冲液（Qiagen Repli-G Midi试剂盒）、phi29聚合酶（Qiagen Repli-G Midi试剂盒）、1×混合蛋白酶抑制剂（Roche）和0.5%Tween-20（16纳升）的混合物。每反应的总体积是20纳升，装置置于平顶热循环仪上，设定在32℃持续约16小时。从其相应的出口，通过用补充有0.2%Tween-20的TE缓冲液（pH8.0）冲洗室，收集来自各室的扩增产物。从各室收集约5μl产物。在65℃孵育产物3分钟使phi29酶失活。

用46-基因座Taqman PCR进行初始基因分型

对于各单细胞实验，通过46-基因座Taqman基因分型PCR在48.48动态阵列（Fluidigm）（一种允许同时在48个样本上进行48个检测的微流体装置）上建立各微流体室中内容物的染色体来源。图18中列出了所用的检测。根据制造商的规程，在动态阵列上分析之前，在来自各室中的1.25μl回收产物上进行预扩增。

由于细胞停滞于中期的早期阶段，染色体被复制，但是姐妹染色单体仍在着丝粒处结合在一起。因此，各中期细胞有46个分开的染色体，不超过两个室应容纳用于给定PCR基因分型分析的模板。正如预期的那样，对于两个室中产生的PCR信号的分析，如果个体对于受试基因座是纯合的，那么两个室的等位基因与基因组DNA的等位基因相匹配，如果个体对于受试基因座是杂合的，那么两个室的等位基因是不同的（图4）。

由于染色体随机分散到室中，将有机会使染色体的两个同源拷贝共同定位在相同的室中（例如，图4中的17和20号染色体）。通过增加室的数量，可以将这种概率变得任意小，在实践中进行三到四个单细胞实验以确保各染色体的同源拷贝被分离到至少一个单细胞实验中。

使用基因分型阵列的全基因组分相

在10μl体积中，使用Repli-G Midi试剂盒用于扩增纯化基因组DNA的规程，对从微流体装置回收的DNA产物进行第二次扩增。来自多个室的产物合并到两个混合物中，从而各混合物含有各染色体的同源拷贝之一。各混合物，含有大约一个细胞的单倍体基因组，在Illumina的HumanOmnil-Quad BeadChip阵列或HumanOmnilS BeadChip阵列上进行基因分型。在相同类型的阵列上对基因组DNA也进行基因分型。

对于各染色体同源物，根据生物复制之间的一致性确定SNP等位基因身份。如果在位点处观察到两等位基因的相等数目，则没有达成一致。通过计算分型一次以上的位点处不一致等位基因调取的数目来估计单个基因分型测量的误差。对于其中仅观察到等位基因之一的SNP，使用基因组DNA的基因型确定其它等位基因的身份。各SNP位点处，来自两同源物的一致等位基因的组合，原则上应和基因组DNA对照的基因型调取一致。没有遵循此规则的SNP（～0.3%至0.4%）从下游分析中淘汰。

CEU家庭三人组中成员的全基因组单倍型分型

三个CEU个体的全基因组单倍型

在代表了CEU（犹他州欧洲后裔的高加索人）1463个家庭中父-母-女儿三人组的三个类淋巴母细胞系GM12891、GM12892和GM12878上进行初始实验。这些细胞系在HapMap计划中已被广泛基因分型。在来自每个个体的三至四个单个中期细胞上进行实验。各同源染色体具有平均～2至3个生物复制，各SNP平均分相2-3次（图5A）。对于GM12878、GM12891和GM12892，分别建立了在阵列上出现的～970,000个refSNP的～87.9%、～89.9%、～433.8%分相（图5B）。通过计数各染色体同源物的生物复制之间不一致的等位基因调取的数目，将源自单分相测量的扩增和基因分型的误差估计为0.2%至0.4%。每SNP的实际分相误差要小得多，因为大多数SNP的最后分相是通过复制间的一致性确定的，并且可以通过增加复制的数目得到所需的尽可能小的误差。

比较直接确定性分相和单倍型统计推导

在HapMap计划中，通过研究家庭三人组的基因型获得CEU群体中的单倍型。孩子约80%的杂合SNP可以被明确分相，只要一个亲本对于SNP而言是纯合的。孩子中剩余～20%的杂合SNP是不确定的，且要求统计分相，因为亲本双方都是杂合的。比较由DDP所确定的孩子（GM12878）分相与使用从HapMap计划III期可获得的程序Impute++的计算机分相数据，排除具有A/T和G/C等位基因的SNP。在确定的SNP上进行的DDP和HapMap数据的比较给出DDP的准确性的估计。两个数据集之间的一致率是99.8%。从DDP基因分型中的误差或HapMap数据中基因分型的误差产生少量不一致（图6）。当仅考虑不确定的SNP时，两组数据集之间的不一致率是5.7%。这些不一致的大部分（96.0%）来自HapMap计划中不正确的统计分相，因为可以通过两个亲本实验确定的分相证实孩子中这些不确定的SNP分相（图6）。这些数据符合之前CEU三人组中统计分相的准确性评估（国际HapMap协作组，2005；Marchini等人，2006），即使当家庭数据可获得时仍强调对直接实验分相的需求。

家庭三人组中重组的直接观察

亲本单倍型的可获得性允许我们直接测量产生个体独特基因组的重组事件的产物，以前这只能使用三代家庭（Broman等人，1998）或具有紧密亲缘关系的两代家庭（Kong等人，2002）进行推导。孩子的各同源染色体与亲本染色体对进行比对，其中所述染色体遗传自亲本。图9表明父方和母方减数分裂产生的交叉事件。在男性减数分裂和女性减数分裂中分别检测到共26和38个事件，中位数分辨率为～43-44kb（图7）。这种分辨率仅仅受到标记物密度的限制。检测到的重组事件数目匹配之前报道中的那些，并支持这样一种看法即女性中重组事件数目普遍高于男性中的（Broman等人，1998；Frazer等人，2007）。除了作为重组结果的同源染色体的大块切换（switch-over）之外，观察到单个位点处的切换，这构成各亲子比较中SNP总数的～0.4%；据推测，这些是基因转换或细胞培养诱导的突变以及DDP误差的结果。

杂合缺失的分相

尽管可以使用类似于SNP统计分相的方法对CNV进行统计分相（Su等人，2010；McCarroll等人，2008；Conrad等人，2010），结构变化的直接实验分相，比如较长范围的拷贝数多态性，在很大程度上还未被开发（Su等人，2010）。作为原理的证明，由HapMap计划III期确定的且通过基因分型阵列可获得的家庭三人组中三个个体的杂合缺失，是通过实验进行分相的。选择这种类型的变化，是因为它们代表了，继纯合缺失后，最简单形式的拷贝数变体。假设是，染色体同源物之一不应给出杂合缺失区域内的SNP标记物的调取或PCR扩增。利用此规则，使用基因分型阵列数据（图8A）和实时PCR（图8B），分别对家庭三人组内出现的12和6杂合缺失进行分相。PCR分析的细节见于（图19）中。三人组内所有被分相的杂合缺失符合遗传图式（图9）。

欧洲个体的全基因组单倍型分型

使用基因分型阵列进行全基因组单倍型分型

在充分确定的HapMap样本上验证了DDP方法，其用于确定个体的单倍型，标记为P0，其基因组已被测序（Pushkarev等人，2009）并被临床注释（Ashley等人，2010）。因为DDP只需要少数细胞，从指尖收集的血液样本足以满足实验。而一些用于家庭三人组实验的早期微流体装置含有导致不能从一些室中回收产物的缺点，装置制造上的精细改进产生了功能齐全的装置，从而改善了P0每单细胞实验的分相SNP数目。P0每单细胞分离的常染色体对的平均数为17.5。

源自四个单细胞中每一个的单倍体DNA池在HumanOmnil-Quad阵列和HumanOmnilS阵列上进行分析。两个不同的阵列彼此互补。使用四个单细胞覆盖了HumanOmnilS阵列上出现的～120万SNP中的约96.1%（图5B）。使用来自3个单细胞的材料和HumanOmnil-Quad阵列对额外的～861,000SNP进行分相（阵列上出现的常染色体refSNP的约89.0%）。对于在所有四个单细胞复制中分离的同源染色体（即各同源拷贝的4个生物复制），对染色体上分析的所有SNP中高达99.2%进行了分相（图10）。我们注意到未分相的SNP往往集中在一起，并进一步检查发现它们通常位于GC含量较高的区域（图11）。在GC含量较高的区域DNA链之间更强的分子结合可能导致更难扩增，与phi29有关的这种现象先前已有报道（Bredel等人，2005）。

使用高通量测序对6号染色体分相

通过直接测序实现SNP分相。来自P06号染色体的三个单拷贝的扩增材料得以轻松测序。从P0的四个单细胞实验中，选择三个含有来自染色体单拷贝的扩增材料的室用于在Illumina的Genome Analyzer II上进行配对末端测序。两个室仅含有来自6号染色体的材料，而第三个室含有来自6、16和18号染色体同源物的材料。在20μl的反应中，用4/11dsDNA片段化酶（Fragmentase）（NEB）对来自这些室的第二轮扩增材料进行30分钟37℃孵育将其片段化。对片段化的DNA末端配对，尾随一个A碱基并连接有接头。进行12个循环的PCR，使用凝胶提取选择大小在300-500bp的PCR产物。用数字PCR定量测序文库（Hillier等人，2008）。在流动池（cell）上的两条道上测序各文库。在每一端测序三十六个碱基对。

使用Illumina的GA Pipeline1.5.1版本进行图像分析、碱基调取和比对。每次读取的前32个碱基和人类基因组（hg18）比对。使用Illumina的CASAVA1.6.0版本进行SNP调取。根据“分选.计数（sort.count）”中间文件，覆盖至少三次的位置用于下游分析。杂合SNP的列表获自P0测序的基因组。如果只检测到等位基因的话，根据不同同源物中两等位基因的直接观察、或通过推导未观察到的等位基因身份确定杂合SNP的分相。

通过以前基因组测序所确定的6号染色体上约46,000杂合SNP进行分相，包括基因组临床注释所鉴定的一些医学有关的罕见变异（Ashley等人，2010）。通过三倍或更多倍的覆盖所调取的等位基因，通过测序的分相和通过基因分型阵列的分相的一致率为99.8%（图12）。这表明，用相对较低的覆盖可以准确实现单倍体材料的等位基因调取，这优于通过测序进行的传统基因分型，传统基因分型需要更高倍数的覆盖以保证杂合SNP的准确性。

使用聚合酶phi29对微量材料的扩增已知导致扩增偏倚和非特异性产物的形成，这会破坏测序性能。本发明人以前表明，使用类似于本研究中的微流体装置通过减少～1000倍的扩增体积，改善单细菌全基因组扩增的性能（Marcy等人，2007a；Marcy等人，2007b）。本测序实验表明非特异性产物构成非常小的量。对于仅含有6号染色体材料的两个文库，大部分读取（～78%）比对至6号染色体，只有～6%的读取相对于人类基因组没有给出任何命中（图13）。这些实验还为人染色体大小的单分子模板提供了扩增偏倚的表征（图13，14）。很大比例的测序读取出现不止一次，且一些读取丰度很高。这是文库制备和簇生成期间PCR的可能结果，且不来自phi29扩增，因为长的phi29扩增产物在文库制备之前被酶随机片段化。此外，中位数插入尺寸小于100bp，而文库的电泳分析表明大部分样本长于200bp，这表明作为文库制备期间PCR结果的冗余的较短插入，在簇生成期间被严重富集。即使去除冗余读取，读取沿染色体的分布是非均匀的，然而在所有经测序的拷贝中大部分（～80-90%）染色体上的读取分布在1.5至2个数量级内（图14）。

实验分相和统计分相的比较

由于很难实验上获得单倍型，统计推导单倍型已被广泛使用，尤其是在涉及无关个体全基因组关联的研究中。然而由于缺乏实验数据，仅进行了数量非常有限的研究来评估这些计算方法的准确性。

实验获得的P0单倍型提供一个数据源以评价计算分相的性能。为了比较缺失家庭信息情况下的统计分相方法和直接物理单倍型分型，使用程序PHASE（2.1版）（Stephens等人，2001；Stephens等人，2003；Stephens等人，2005）来推导P0中的单倍型，该程序被认为相较于其它推导软件具有较高的准确性（Stephens等人，2005；International HapMap Consortium，2005）。随机选择各常染色体（除4、20、21号染色体）上的四个区域，区域各具有在PO中是杂合的100个双-等位基因SNP。只选择两等位基因经过直接单倍型分型的、并且和全基因组测序确定的基因型具有完美一致性的SNP。各区域覆盖～0.7至～3.3Mb的范围（平均2Mb），SNP至SNP平均距离为～20kb。HapMap计划III期中176个经分相的CEU单倍型用作推导的已知单倍型。对于各区，用相同的默认设置，但不同的随机种子运行三次重建。

统计确定的单倍型与DDP确定的单倍型的比对，每区域平均6.3个块切换，计算为每区域具有不同分相的杂合SNP相对于紧挨着的上游SNP的比例。平均块尺寸为～260kb。如果考虑具有占优势分相的SNP被正确分相，那么平均30.2%的杂合SNP被错误分相（图15）。这些结果符合之前的两项研究，其中比较了统计单倍型推导与获自体细胞杂种和完整hydatidform moles（无对应译文）的真正分相，并说明直接实验分相尤其对于跨较长范围且不可获得家庭数据时的重要性（Kukita等人，2005；Andres等人，2007）。

杂合缺失的分相

使用来自基因分型阵列和实时PCR的数据，对通过P0基因组测序检测到的、和以前通过数字PCR验证过（Pushkarev等人，2009）的所有8个杂合缺失进行了分相（图9）。对于实时PCR，分析和Pushkarev等人，2009的研究中所用的相同。所有三个单细胞间来自所有三个平台的结果是一致的。

HLA单倍型的直接确定

DDP的一个重要应用是确定个体中的HLA单倍型。HLA基因座具有高度多态性，并在6号染色体上分布4Mb。对区域内HLA基因进行单倍型分型的能力在临床上是重要的，因为区域与自身免疫和感染性疾病有关（Shiina等人，2009）且供体和受体之间HLA单倍型的兼容性可以影响移植的临床结果（Petersdorf等人，2007）。然而，测量个体HLA单倍型的分子技术仍然是有限的（Guo等人，2006）。

要确定HLA单倍型，先确定各基因座上的HLA等位基因。这通常通过昂贵的直接测序而实现。在这里，使用更简单的方法，利用P0实验确定的SNP单倍型和SNP单倍型的可获得性（来自HapMap计划III期）以及CEU个体小组（panel）的HLA分型数据（来自de Bakker等人(de Bakker等人，2006)在http://www.inflammgen.org的研究）来确定各HLA基因座上的等位基因。具体而言，总共176个分相的CEU单倍型连同PO实验分相的单倍型，被用来构建6号染色体上六个经典HLA基因座每一个的邻接树。坐标界限显示于图17中，其中经单倍型分型的SNP用于各基因座。用于HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB-、HLA-DQA和HLA-DQB的SNP数目分别为420、139、89、59、14和34。针对各单倍型的对，将等位基因共享距离计算为

其中n是基因座的数目，在第i个SNP基因座上对于匹配的等位基因d_i等于0，对于未匹配的等位基因等于1。使用MEGA4.1构建树（Tamura等人，2007）。由于相似的HLA等位基因携带在树上聚集在一起的相似SNP单倍型，在各HLA基因座上PO各同源染色体的等位基因身份可以由树中其最近邻的等位基因身份得以确定（图17）。

通过系统发育分析所确定的各HLA基因座上的等位基因组合，与基因组DNA的直接HLA分型一致。结果的组合形成产生P0的两HLA单倍型的所有基因座（图17）。HLA单倍型之一是8.1祖先单倍型，这是高加索人中最常观察到的单倍型之一，且和免疫病理疾病的风险升高相关。

DDP方法的一些技术改进有利于高通量实验。

首先，悬液中单个有丝分裂细胞的鉴定和捕获目前是手工操作，其需要熟练的操作员。这一步可能通过用荧光标记的有丝分裂特异性抗体（如抗磷酸化组蛋白H3）标记细胞或通过联合计算机观察进行自动化。

其次，细胞质的酶消化后，中期染色体往往粘在一起并形成团块，导致室中存在多个染色体。尽管在当前设定中细胞中大部分染色体的同源拷贝通常是分离的，理想的情况是分离细胞中单独的和每一个染色体，这将有利于鉴定染色体重排和拷贝数变异的分相以及可潜在出现于不同非一致染色体上的重复。在当前规程中，用RNases去除可能导致染色体的粘稠的过量的细胞质RNA，但是染色体分离化学中额外的改善将是所需的。

第三，已知使用聚合酶phi29扩增微量材料导致非特异性产物和扩增偏倚的形成（Lasken2007）。当SNP阵列用于分相确定时，非特异性产物的存在是不相关的，但是当材料将被测序时，这是不希望的，其导致有用信息的输出量的减少。通过将扩增体积从台式反应的50微升减少到微流体室的20纳升，扩增材料中检测到非常少的非特异性产物，正如6号染色体的测序结果所揭示的（图13）。另一方面，扩增偏倚仍然存在（图14），并增加所需的测序深度以获得整个染色体的覆盖。由于扩增偏倚似乎主要是随机的（图14），潜在的解决方案是将来自多个单细胞实验的相同染色体同源物的多个拷贝的扩增产物进行合并。

最后，来自各微流体室的扩增材料可被潜在地条形码化。分子条形码是短的DNA标签，并常用于高通量多重测序。对来自各室的扩增材料进行条形码化可以将收集出口的数目从目前设计的每室一个出口降低至每装置一个出口。由于收集出口是微特征（macro feature），出口数目的减少使得能够将更多的微特征纳入每芯片面积。因此，可能在装置上处理更多的单细胞，并因此改善通量。

单细胞非整倍体检测

微流体装置也能够确定单细胞的核型和检测单个细胞内的染色体重排，是因为染色体在分离过程中保持完整，以及可以从含有源自各特定染色体的扩增材料的室的计数来数字读取各染色体的数目。在上述实验中，在大多数情况下，两个室对于各常染色体特异性标记物显示阳性信号，以及一个室对于男性中各性染色体显示信号。本方法在研究单细胞基因组是有益的领域中具有重要应用。实例包括植入前遗传学诊断、涉及母方血液中罕见的循环胎儿细胞的非侵入性产前诊断、以及有关肿瘤和罕见循环肿瘤细胞中异质细胞群的癌症研究。

对于完整的个体基因组测序

为了正确地研究人类基因组，测序作为混合物的二倍体基因组的传统方法应得以补充或被可单独检查各单倍体的技术所取代。对于短-读取测序技术，这尤其重要，因为组装短的读取是计算机挑战性的。目前为止，所有描述使用这些技术进行个体基因组测序的研究严重依赖参考人类基因组用于测绘（map）短的读取，并主要集中在新SNP的鉴定和拷贝数变体上（Wheeler等人，2008；Bentley等人，2008；Ahn等人，2009；Kim等人，2009；Wang等人，2008；Pushkarev等人，2009；Schuster等人，2010）。那些个体基因组不仅苦于例如空位、误调取的碱基、和难以确定大规模的结构变异的不完善性，它们也未能解决同源染色体的独特单倍体结构。只有少数研究在他们的分析中包括根据短读取测序数据进行统计单倍型构建（Wang等人，2008）。

尽管此处描述的大部分实验集中在可用基因分型阵列进行处理的1百万变体的直接确定性分相上，DDP可以被利用对基因组中的所有变体进行分相。对基因分型阵列上存在的tagSNP进行直接确定性分相，为与tagSNP有强连锁不平衡的常见变体固有地提供了分相信息。对于罕见的变体，最直接的方法是测序来自分离的染色体的扩增材料。这可以得到所有基因组变体的分相信息，包括罕见的和个人的那些，这在标准的基因分型阵列上是缺失的。该方法应使得能够进行正常或患病基因组中每个个体染色体的完整测序和组装，包括各种所有种类拷贝数变体的直接分相（除上述实验中所示的杂合缺失之外）以及染色体重排和结构变体的检测。

本单倍型分型技术并不限定于人类基因组。所有其它生物的基因组研究也应得益于本方法。

结论

研究人类基因组的常规实验方法受限于无法单独研究染色体的各同源拷贝。这些单倍型是基因组的重要特征，但一般不易确定。上述是开发能够分离并扩增单个人类中期细胞内各染色体的同源拷贝的微流体装置。源自单个细胞内染色体的单个拷贝的扩增材料的SNP阵列分析和直接测序使得能够进行完整的确定性全基因组个体单倍型分型。已经表明了这种方法的几个实际应用，包括家庭三人组中重组事件的直接观察、个体结构变异的确定性分相以及个体HLA单倍型的直接测量。

本工作在传统细胞遗传学和现代分子技术之间架起了一座桥梁。前者允许显微镜下目视检查单细胞中的个体染色体，但分辨率有限，而后者使我们能够检查单个DNA碱基，但不能有效地允许研究个体细胞和染色体。它允许个体的两个单倍体基因组的完整测序，这在个性化基因组学和医学的时代中将变得必不可少。它还回答了生物学中的重要问题，如基因调控和个体间变异。在微流体装置上物理分离染色体的技术可以扩展到个体内同源染色体之间表观遗传差异的研究。

实施例2

本发明人此处表明能够从母方血液中非侵入性确定胎儿基因组的实践技术。策略依赖于对使用最近报道的微流体装置获得的亲本全基因组染色体长度单倍型的了解，并利用高通量测序作为分子计算工具，来确定哪些亲本单倍型由于胎儿基因组的贡献而在母方血浆DNA中过度出现。除了发生亲本染色体重组的区域，当亲本双方单倍型信息已知时，可以利用浅测序（shallow sequencing）明确地从母方血浆破译胎儿基因组，当仅可获得母方信息时，额外的测序努力允许基本上确定胎儿基因组。从母方血浆中确定胎儿基因组的能力有利于所有遗传的遗传疾病的诊断。

介绍

几十年以来已知胎儿遗传物质存在于母方血液中。这些材料的存在，无论是完整胎儿细胞还是无细胞胎儿DNA的形式，使得能够开发一些非侵入性的产前诊断技术。然而，使用来自母方血液中的胎儿材料来诊断胎儿遗传疾病并非平常，因为胎儿材料相对于母方对应部分只构成小量。

本发明人已经证明，通过母方血浆中无细胞DNA的鸟枪测序可以非侵入性测量胎儿的非整倍体。该技术基于对源自母方血浆中各染色体的序列标签数目进行计数，以确定是否存在作为妊娠母方怀有非整倍体胎儿的结果的染色体被过高或过低出现。这种技术已被多个小组且以各种规模得到证实。

近期，本发明人提出利用分子计数来非侵入性分析来自母方血浆的整个胎儿基因组。而非整倍性检测依赖23（女）或24（男）条染色体中每一个的相对出现的计数，提出的胎儿基因组的确定依赖于计数亲本染色体的相对出现（即相同染色体的四种不同亲本单倍型）。在这项工作中，使用最近开发的微流体装置（微流体装置使得能够确定全基因组亲本单倍型）结合上母方血浆DNA的鸟枪测序，首次显示可以从母方血浆实际破译胎儿基因组。即使父方信息不可获得时，本发明人基本上能够确定胎儿基因组。从母方血浆确定胎儿基因组的能力随后将有利于所有遗传的遗传性疾病的诊断。

方法

从HapMap二人组测序含有DNA的混合物

从细胞系GM12892（母方）和GM12878（女儿）提取的基因组DNA按7:3的质量比混合（即，女儿对混合物的贡献（ε）为30%）。通过超声将混合物片段化为大小范围<300bp。DNA片段进行末端补平，以A结尾，并连接有用于Illumina测序的全长接头。省略文库制备工作流程中的最后PCR步骤（Kozarewa等人，2009）。加载到流动池前，通过数字PCR对文库定量（White等人，2009）。在GAII上在流动池的一条道上对文库进行鸟枪测序。使用Illumina数据分析通道（pipeline）1.6进行图像分析和碱基调取。用Illumina数据分析通道中的算法ELAND，将读取比对至人类基因组（hgl8）上。在沿着各染色体的各碱基位置上，使用Illumina的CASAVA软件（版本1.6）获得等位基因调取的列表。仅使用调取的质量评分>30的等位基因。

患者受试者的全基因组单倍型分型

研究招募的受试者得到斯坦福大学内部评审委员会（Internal Review Board ofStanford University）的批准。产后母方全血收集到钠肝素包被的真空采血管中。这项研究使用产后血液，是因为妊娠期间收集的血样没有进行培养所需的低温保存（cyropreserved）。用PB Max核型分析介质对1毫升全血培养4天。在3至4个单细胞上进行直接确定性分相（DDP）。

研究受试者及其婴儿的全基因组基因分型

用QIAamp Blood迷你试剂盒（Qiagen）从200μl产后母方血液和200μl脐带血液中提取基因组DNA，并在Illumina Omnil-Quad基因分型阵列上进行全基因组基因分型。

母方血浆的全基因组鸟枪测序

在EDTA包被的真空采血管中收集母方血液。血液在4℃下于1600g离心10分钟，在4℃下于16000g再次离心血浆10分钟以除去残留的细胞。用QIAampBlood迷你试剂盒（Qiagen）从血浆中提取无细胞DNA。从1到2ml血浆中提取DNA，并随后转换成Illumina测序文库。在GAII和HiSeq仪器上进行测序（表3）。使用CASVA版本1.7.0将序列比对至人类基因组（hgl9）上。仅使用调取的质量评分>30的等位基因。此外，只有与dbSNP数据库中先前报道的变体相匹配的等位基因用于分析。

母方基因组未经分型的基因座的归算

用单倍体选项，用Impute v1（Marchini,J.2006）进行归算。对于模拟样本，使用CEU群体的1000基因组计划中试行（pilot）分相数据，基于根据DDP分相的～800,000标记物，对母方和父方未经分型的基因座进行归算。对于临床样本，使用来自CEU群体的1000基因组计划2010年8月的数据进行归算。对于母方基因组，归算基于根据DDP分相的～100万个标记物。对于父方单倍型，归算基于鸟枪测序数据中观察到的非母方等位基因。沿着每条染色体在5Mb的节段中进行归算。

DiGeorge相关缺失的胎儿遗传的数字PCR确认

通过在脐带血液基因组DNA上独立进行数字PCR非依赖地证实患者2的胎儿遗传了22q11.1染色体上携带缺失的母方单倍型。缺失区域内扩增子的单分子扩增数目和1号染色体上扩增子的单分子扩增数目进行比较。～0.5的比表明母方缺失被遗传。

确定重组位置

在胎儿是纯合而母方是杂合的位置上，通过比较胎儿基因型和两个母方单倍型的每一个上的等位基因，确定母方遗传的染色体组上真实的重组事件。在母方血浆中，如果在血浆DNA中，如果满足两个原则，则导致胎儿遗传母方染色体的两母方单倍型之间的交叉事件被调取：1.与单倍型2相比单倍型1的相对出现持续增加或减少（即在正文中解释表达式N_p1/n_p1-N_p2/n_p2和变量），伴有符号变化，正如按照2号染色体p臂至q臂的方向所扫描的。2.基于这样一个事实即交叉很少彼此接近（正干扰），对于滑动bin5Mb下游的大部分而言表达式中的符号仍然相同。

根据母方血浆测序评估胎儿DNA分数

按两种方式评估胎儿DNA分数：1.根据母方单倍型之一的过度出现。2.根据父方遗传的单倍型的存在。准确地说，将胎儿DNA分数（ε）估计为2x/(2-x)，其中，对于在母方单倍型或父方单倍型上评价的所有bin而言，x是表达式(N_p1/n_p1-N_p2/n_p2)的中位数绝对值，除以两母方单倍型的平均标记物密度。

结果与讨论

来自母方血浆的胎儿基因组非侵入性确定原理

在母方血浆中，母方基因组和胎儿基因组以短的无细胞DNA的形式混合在一起。由于胎儿基因组是四种亲本染色体或单倍型的组合，作为减数分裂过程中随机分类和重组的结果，对每个基因组区域，母方血浆中存在3种单倍型：遗传给胎儿的母方单倍型，未遗传的母方单倍型和遗传的父方单倍型。如果未遗传的母方单倍型的相对拷贝数为1-ε，遗传的母方单倍型的相对拷贝数是1，且遗传的父方单倍型的相对拷贝数是ε，其中ε是胎儿DNA分数（图1）。因此，遗传的亲本单倍型，相较于未遗传的，过度出现。通过测量亲本单倍型的相对量，可以推导胎儿基因组。

通过其所特异的等位基因，称为“标记物”，来区分四种亲本单倍型，通过计数这些标记物的数目确定母方血浆中这些亲本单倍型的出现。

定义各父方单倍型的标记物是在一个父方单倍型上存在、而在另一个父方单倍型上不存在、在两个母方单倍型上也不存在的等位基因。通过计数特异于各父方单倍型的标记物确定父方单倍型的遗传；只有在遗传的父方单倍型上的等位基因将出现在母方血浆中（图1）。

本发明人开发了一种微流体装置，其能够分离和扩增单个人中期细胞内每个染色体的同源拷贝。获自单细胞的扩增材料的SNP阵列分析，使其能够以～99.8%的准确性、高达所有分析的SNP的～96%、实现四个个体的完全确定性全基因组个体单倍型，包括CEU三人组成员和一个无关欧洲个体。严格地说，定义各母方单倍型的标记物是出现在一个母方单倍型上、但不出现在另一个母方单倍型上、也不出现在两个父方单倍型上的标记物。然而，由于极少见到两个不相关的人共享相同长度范围的单倍型，即相较于群体中观察到的单倍型块的通常长度（～100kb）更长的单倍型，只要认为单倍型足够长，那么在这些基因座上由遗传的父方单倍型所贡献的等位基因的存在不干扰母方单倍型出现的测量，从而本发明人选择使用所有母方杂合基因座来定义两个母方单倍型（图1）。这种选择显著提高可用的母方标记物的数目，因此鉴于取样DNA的基因组当量，将可获得的信息进行最大化。

通过对定义各母方单倍型的标记物进行计数以及通过比较两单倍型的出现，确定母方单倍型的遗传；以ε的量表示遗传的母方单倍型过度出现。这种过度出现，无论多小，只要计数深度足够，就能得以揭示。设定泊松随机变量的两种分布，一种为N的平均值，另一种为N（1-ε）的平均值，其中N是遗传的母方单倍型上所有可用标记物的标记物计数的累计总和，根据下面的表达，使用针对大量N的泊松分布的正态近似，估计区分两种分布的取样要求N：

$\frac{N-N(1-\mathrm{\&epsiv;})}{\sqrt{N-(1-\mathrm{\&epsiv;})+N}}-\frac{\mathrm{N\&epsiv;}}{\sqrt{N(1-\mathrm{\&epsiv;})+N}}\&GreaterEqual;z_a$

其中Z_α是α置信水平相关的z-评分。因此，

$N\&GreaterEqual;\frac{{z_a}^2(2-\mathrm{\&epsiv;})}{{\mathrm{\&epsiv;}}^2}$

表2代表针对不同数值的胎儿DNA分数（ε）和置信水平（α）的估计的要求N。对于使用鸟枪测序的分子计数，所需基因组覆盖与N和各单倍型内可用标记物数目（n）之比成正比。鉴于减数分裂过程中交叉事件的数目是有限的且原亲本染色体的断裂数目小，如果每个亲本染色体被充分分相，那么每单倍型可获得大量可用标记物，从而浅测序将足以从母方血浆确定胎儿基因组。

表2.对于非侵入性确定母方单倍型遗传所估计的取样要求（N）。N是指遗传的母方单倍型上所有可用标记物的等位基因计数的累计总和。

原理实验证据：HapMap二人组的混合物（母方和孩子）

本发明人通过从细胞系GM12892（母方）和GM12878（女儿）提取的基因组DNA按7:3的质量比制备混合物（即，女儿对混合物的贡献（ε）为30%），首先模拟了母方血浆DNA。在Illumina平台上测序该混合物，并产生0.25×单倍体基因组的覆盖。使用这两种细胞系，因为这种家庭三人组中三个成员的染色体通过最近开发的全基因组单倍型分型方法（称为“直接确定性分相（DDP）”）被完全分相（Fan等人，2011），该方法涉及在微流体装置上对来自单细胞的分散中期染色体进行扩增。

由于单倍型是从具有高基因座密度的染色体一端进行分相的，使用来自1000基因组计划的数据，基于这些基因座，发明人可以确信地归算各亲本染色体上很多未经分型的基因座。基于归算程序内部进行的留一验证，归算的准确性高（>98%）。归算将可用于单倍型计数的基因座数目提高了数倍，因此降低了用于计数的测序要求。

通过一个母方单倍型相对于另一个的过度出现确定孩子的母方单倍型遗传。每个染色体分为10Mb的bin，滑动步幅为100kb。选择bin的大小使得bin内标记物的计数总数至少是克服计数噪声所需的（表2，图20）。由于经单倍体分型的X染色体的标记物密度（即Illumina阵列上出现的）只有常染色体上的一半，bin的大小相应增加（表3）。对于每个bin，使用表达式(N_p1/n_p1-N_p2/n_p2)计算相对单倍型出现，其中N_p1是bin内出现定义“母方单倍型1”的标记物的数目，其通过测序进行计数，n_p1是bin内定义“母方单倍型1”的可用标记物的总数，N_p2是bin内出现定义“母方单倍型2”的标记物的数目，其通过测序进行计数，n_p2是bin内定义“母方单倍型2”的可用标记物的总数。可以根据遗传的母方单倍型相对于两母方单倍型平均出现的过度出现的量估计孩子的DNA分数（ε），估计为～0.29，这在整个基因组是一致的，且符合混合物中两个体基因组DNA的质量比。可以明确地确定过度出现的母方单倍型（图21a，黑线），并与真实遗传一致（图21a，阴影背景）。对母方染色体上的所有交叉事件，除了一个，进行了鉴定。丢失的交叉事件位于非常接近母方13号染色体q臂上异染色质区域的地方，由此产生的单倍型块的可测量大小只有几兆碱基的长度。各鉴定的交叉与真实交叉之间的中位数距离为～770kb（图21c）。

表3.样本和实验统计细节

通过测量一个父方单倍型的标记物的存在和另一个父方单倍型的标记物的缺失确定父方单倍型的遗传。有机会在短距离内来自亲本双方单倍型的标记物都存在，可能是由于测序误差或归算误差。为了消除这种噪音，父方染色体分为10Mb的bin，步长100kb。计算每个bin中一个父方单倍型超过另一个父方单倍型的出现，定义为N_p1/n_p1-N_p2/n_p2，其中N_p1是bin内出现定义“父方单倍型1”的标记物的数目，其通过测序进行计数，n_p1是bin内定义“父方单倍型1”的可用标记物的数目，N_p2是bin内出现定义“父方单倍型2”的标记物的数目，其通过测序进行计数，n_p2是bin内定义“父方单倍型2”的可用标记物的数目。明确地鉴定所遗传的父方单倍型（图21b，黑线），并与真实遗传一致（图21b，阴影背景）。交叉事件的分辨率取决于测序检测到的标记物的密度，中位数分辨率为～400kb（图21c）。

总体而言，孩子基因组的～99.6%的父方遗传和～98.2%的母方遗传可以在混合物中正确被推导。

临床样本中的应用

本发明人通过把它应用到收集自两位孕妇的样本中验证该技术。母方被称为“患者1（P1）”和“患者2（P2）”。P1怀有正常核型的女性胎儿，而P2是患有DiGeorge综合征的个体，且产后观察女婴发现DiGeroge综合征典型相关的心脏缺陷。在通过培养母方全血获得的3或4个母方中期细胞上进行直接确定性分相（DDP）（表3）。对Omnil Quad BeadChip阵列（Illumina）上存在的约92%至96%的～100万SNP进行分相（图24）。此外，分娩时采集的脐带血基因组DNA也在相同阵列上进行基因分型以作为胎儿基因型的真实参考。

从来自P1早期孕期（妊娠第9周）和中期孕期（妊娠第23周）、以及P2晚期孕期期间收集的血浆提取无细胞DNA。无细胞DNA样本最初在Illumina平台上进行鸟枪测序，对于P1早期孕期、P1中期孕期和P2的文库，分别得到总共～33.1Gb（相当于单倍体人基因组的可获得分数的～11.6倍覆盖）、～11.5Gb（～4.0倍覆盖）和～3.7Gb（～1.3倍覆）。

为了确定母方单倍型的胎儿遗传，本发明人基于Illumina阵列分相的～100万标记物，比较了15Mb（患者1，早期孕期）、7.5Mb（患者1，中期孕期）或3.5Mb（患者2）bin中，滑动步幅为100kb，母方染色体两个拷贝的出现。bin大小的选择由表1中预测的最小取样要求决定，给定胎儿DNA分数（图20，表3）。对于所有3个血浆样本，可以明确鉴定过度出现的母方单倍型（图22，黑线）。

通过将脐带血基因分型得到的胎儿纯合SNP与经分相的母方杂合SNP所定义的两母方单倍型进行比对，确定母方单倍型的真实遗传（图22，阴影背景，粉红色：遗传的，灰色：未遗传的）。遗传给胎儿的P1和P2母方遗传的染色体内分别有42和37个真实交叉事件。在P1中期孕期和P2样本中鉴定所有交叉，而在P1早期孕期样本中丢失2个交叉。这2个事件均靠近异染色质（染色体l3和染色体21），导致几乎不包含计数可用标记物的小块切换。对于P1早期孕期、P1中期孕期和P2样本，鉴定的交叉事件分别在真实交叉的～1.8Mb、～630kb和～470kb（中位数）内（图22d）。交叉事件的鉴定分辨率依赖于bin大小的选择，其最终取决于胎儿DNA分数和测序深度。考虑到不确定的交叉周边区域以及丢失的交叉，P1早期孕期、P1中期孕期和P2样本中，可以分别正确推导约97.4%、98.9%和99.4%的所有母方遗传。

患者2是患有DiGeorge综合征的个体。全基因组单倍型分型鉴定了22q11.1上～2.85Mb的缺失，所述缺失和染色体之一上的综合征有关（注释为“母方单倍型2”，图22c中），独立地通过PCR验证。母方血浆中单倍型计数指示着紧邻着缺失的区域的“母方单倍型2”的过度出现，这表明DiGeorge综合征相关缺失的胎儿遗传（图22c，缺失显示为蓝色）。通过脐带血DNA的数字PCR证实这种结果。

在足以确定母方单倍型遗传的初始测序深度，每～4-8kb中的一个鉴定为非母方等位基因（即，在母方基因型是纯合的位置上不同于母方等位基因的碱基）。如果对于这些妊娠的情况已知父方单倍型，按照模拟样本所示的相同方法，用这些非母方等位基因作为两父方单倍型的标记物，可以确定遗传的父方单倍型，从而非侵入性揭示整个胎儿基因组。通过单倍型归算，基于母方血浆中检测到的父方特异性等位基因，可重建父方遗传的染色体上的其余基因座。这就产生了胎儿基因组的父方遗传的一半信息，即使事先不知道父方。通过标记物的密度部分确定归算的准确性，鉴定的非母方等位基因的数目依赖于测序深度和胎儿DNA分数。据估计，如果母方血浆中正确鉴定所有父方特异性等位基因（每～lkbp一个这种等位基因），归算将沿整个父方遗传的染色体在～70%的基因座上，以至少>99%的准确性确定等位基因身份（图23A）。为了证明该原理，发明人进行额外的血浆DNA文库测序至预计覆盖至少一次所有父方特异性等位基因的深度（即对于P1早期和中期孕期样本、和P2样本分别为～52.7×、～20.8×、～10.7×单倍体基因组覆盖），母方血浆中父方等位基因的百分比与胎儿DNA分数所估计的大致一致（表2）（图23B和C）。在这样的测序深度，本发明人能够检测所有父方特异性等位基因的～66-70%。使用这些标记物，本发明人以～94-97%的准确性归算父方遗传的单倍型的～70%（图23A）。低于理想的准确性是因为这样一种事实，一些父方遗传的等位基因未被检测到，作为测序和/或扩增误差结果的父方等位基因的错误检测，-约5%的非母方等位基因不是真正的父方等位基因。

讨论

正如通过这些采用母方和孩子DNA的混合物、以及3个临床样本的实验所说明的，与母方血浆无细胞DNA的鸟枪测序关联的两亲本染色体长度的单倍型的知识，可以较明确地非侵入性揭示整个胎儿基因组。本方法利用了发明人近期开发的微流体技术，该技术仅从若干单个血液细胞就能够获得全基因组、染色体长度的单倍型。因此，可确定亲本单倍型，而无需来自其它家庭成员的信息，这对于以前没有怀过孕的夫妇的胎儿诊断而言特别重要。因为确定母方血浆中亲本单倍型相对出现所需的测序量，随着特异于各单倍型的可用标记物的数目增加而降低，只要来自亲本双方的信息可用，知晓亲本染色体长度的单倍型使我们能够使用浅的测序深度而毫无疑义地确定整个基因组中（除了交叉和端粒附近的区域）亲本单倍型的胎儿遗传，即使是胎儿DNA百分比低得多时（对于～5%胎儿DNA，～11×）。

本发明人表明，甚至没有父方信息，可以用浅测序明确确定母方单倍型的遗传。仅知晓母方单倍型的胎儿遗传对于诊断各种类型遗传病已经是有价值的，即涉及母方遗传的那些。这些包括所有X-连锁疾病，包括脆性X综合征，其中携带缺陷基因座的母方X染色体拷贝以及母方缺失所造成的疾病遗传到男性胎儿，如上述DiGeorge综合征的具体实例。此外，可以排除一半情况的常染色体隐性疾病。当常染色体隐性疾病不可排除的情况下，即正如由母方血浆中单倍型计数所确定的，母方疾病相关的单倍型被遗传，使用本研究中所表明的额外血浆DNA测序或更多靶向方法例如PCR和/或外显子组测序，通过鉴定任何父方特异性等位基因实现最后诊断，其中父方特异性等位基因与疾病相关的等位基因或可替代的正常等位基因相关。尽管目前的研究利用正常人群的单倍型数据库来归算父方遗传的单倍型上的连锁基因座，这种技术用于诊断罕见遗传疾病的应用需要知晓与这些疾病相关的较长范围单倍型，建立疾病相关的单倍型数据库是极有价值的。

此处所述方法提供了全面非侵入性产前诊断遗传性疾病的途径。随着基因组技术的进步，非侵入性确定整个胎儿基因组没有实际的障碍，这有利于产前诊断。

此处提及的专利和科学文献建立了本领域技术人员可获得的知识。此处引用的所有美国专利和出版或未公布的美国专利申请并入此处作为参考。此处引用的所有公布的外国专利和专利申请并入此处作为参考。此处引用的所有其它出版的参考文献、文件、手稿和科学文献并入此处作为参考。尽管参考其优选的实施方式具体显示并描述了本发明，本领域技术人员应当理解，可以在其中进行形式和细节上的各种改变，而不脱离所附权利要求所涵盖的本发明范围。

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U.S.专利No.6,440,705

U.S.专利No.7,888,017

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U.S.专利申请No.2007/0202525

U.S.专利申请No.2009/0029377

U.S.专利申请No.2009/0053719

U.S.专利申请No.2009/0087847

U.S.专利申请No.2010/0112575。

Claims (35)

1.一种非侵入性确定由胎儿所遗传的亲本单倍型的方法，包括：

a.从怀有至少一个胎儿的妊娠女性获得母方样本，其中所述样本含有来自妊娠女性和胎儿的DNA；

b.通过如下步骤确定父方遗传的单倍型：

i.在胎儿父亲的DNA中确定一组单核苷酸多态性（SNP）；

ii.确定胎儿母亲DNA中的一组SNP；

iii.确定父亲中杂合的以及母亲中纯合的所有SNP，来鉴定父亲中存在而在母亲中缺失的各种基因座等位基因，从而确定父亲的各单倍型；和

iv.在各父方单倍型上对代表性等位基因进行计数，来确定两个单倍型的出现；

v.比较两个单倍型的出现来获得相对出现；

vi.确定两个单倍型之一的过度出现ε；和

vii.关联所述过度出现ε与父方遗传的单倍型；以及

c.通过如下步骤确定母方遗传的单倍型：

i.确定胎儿母亲中所有杂合的SNP；和

ii.在各SNP基因座上鉴定在母亲中存在但在父方遗传的单倍型中缺失的等位基因，以确定母亲的单倍型；

iii.在各母方单倍型上对代表性等位基因进行计数，来确定两个单倍型的出现；

iv.比较两个单倍型的出现来获得相对出现；

v.确定两个单倍型之一的过度出现ε；和

vi.关联过度出现ε与母方遗传的单倍型。

2.根据权利要求1所述的方法，其中通过对标记物进行数字计数测量单倍型的相对出现，其中所述标记物是定义各亲本单倍型的等位基因。

3.根据权利要求1所述的方法，其中比较特异于每个固定距离上两个母方单倍型每一个的标记物计数总和，确定哪个母方单倍型过度出现。

4.根据权利要求1所述的方法，其中比较特异于每个固定距离上两个父方单倍型每一个的标记物计数总和，确定哪个父方单倍型过度出现。

5.根据权利要求2所述的方法，其中通过测量单个DNA分子计数的数量进行数字计数。

6.根据权利要求5所述的方法，其中通过测序、数字聚合酶链式反应（PCR）或杂交进行测量。

7.根据权利要求1所述的方法，其中确定胎儿基因组的一部分。

8.根据权利要求7所述的方法，其中确定整个胎儿基因组。

9.一种通过测量权利要求1的亲本单倍型的相对出现来估计胎儿DNA分数的方法。

10.一种非侵入性确定由胎儿所遗传的母方单倍型的方法，包括：

a.从怀有至少一个胎儿的妊娠女性获得母方样本，其中所述样本含有来自妊娠女性和胎儿的DNA；

b.计数所述样本中定义两个母方单倍型中每一个的标记物，以确定两个单倍型的出现；

c.比较两个单倍型的出现来获得相对出现；

d.确定两个单倍型之一的过度出现ε；和

e.关联所述过度出现ε与遗传的母方单倍型。

11.根据权利要求10所述的方法，其中通过对标记物进行数字计数测量单倍型的相对出现，其中所述标记物是定义各母方单倍型的等位基因。

12.根据权利要求11所述的方法，其中比较特异于每个固定距离上两个母方单倍型每一个的标记物计数总和，确定哪个母方单倍型过度出现。

13.根据权利要求11所述的方法，其中通过测量携带特异性标记物的单个DNA分子计数的数量进行数字计数。

14.根据权利要求13所述的方法，其中通过测序、数字聚合酶链式反应（PCR）或杂交进行测量。

15.根据权利要求10所述的方法，其中确定胎儿基因组的一部分。

16.根据权利要求15所述的方法，其中确定整个胎儿基因组。

17.根据权利要求10所述的方法，还包括非侵入性重建父方遗传的单倍型。

18.根据权利要求17所述的方法，其中使用样本中检测到的父方特异性等位基因，通过单倍型归算实现父方遗传的单倍型的重建。

19.一种确定一组适当标记物的方法，所述标记物定义母方单倍型，包括确定在第一母方单倍型中的多态性基因座上存在，但在第二母方单倍型上的对应基因座上却缺失的等位基因。

20.根据权利要求19所述的方法，其中在第一母方单倍型中的多态性基因座上存在但在第二母方单倍型上的对应基因座上却缺失的等位基因也不在两个父方单倍型的对应基因座上。

21.一种确定一组适当标记物的方法，所述标记物定义父方单倍型，包括确定在第一父方单倍型中的多态性基因座上存在，但在第二父方单倍型上的对应基因座上却缺失的等位基因。

22.根据权利要求21所述的方法，其中在第一父方单倍型中的多态性基因座上存在但在第二父方单倍型上的对应基因座上却缺失的等位基因也不在两个母方单倍型的对应基因座上。

23.根据权利要求21所述的方法，其中组中的标记物数目可以通过单倍型归算而增加。

24.根据权利要求18或23所述的方法，其中单倍型归算包括：

通过将待归算的单倍型上所观察到的等位基因与之前归档的单倍型数据库进行比较，在任何未测量的基因座上统计推导等位基因身份，其中之前归档的单倍型数据库的单倍型的等位基因身份在测量和未测量的基因座上均是已知的。

25.根据权利要求23所述的方法，其中所述数据库来自正常群体。

26.根据权利要求23所述的方法，其中所述数据库来自携带可通过遗传传播的特定疾病的群体。

27.一种确定数字取样的最小量来实现所需的关于哪种亲本单倍型过度出现的置信水平的方法，包括：

a.估计样本中存在的胎儿DNA的分数；和

b.估计可用标记物的密度。

28.一种估计胎儿DNA分数的方法，包括通过检验母方单倍型之一的过度出现或通过存在父方遗传的单倍型来测量亲本单倍型的相对出现。

29.根据权利要求19或21所述的方法，其中可以通过如下实现确定一组定义个体单倍型的标记物：

a.在相关家庭成员当中比较多态性基因座上的等位基因；或

b.分析单个DNA分子或单个染色体分子上多态性基因座上的等位基因。

30.一种用于进行权利要求27所述方法的微流体装置，包括：

a.染色体划分区；

b.扩增区；和

c.产物回收区。

31.根据权利要求30所述的微流体装置，还包括：

a.细胞分选区；

b.染色体释放区。

32.根据权利要求31所述的装置，其中在所述细胞分选区中，从细胞悬液中鉴定并捕获单个中期细胞，并进行裂解而形成染色体悬液。

33.根据权利要求31所述的装置，其中在所述染色体划分区中，染色体悬液被随机分到多个通道划分中。

34.根据权利要求30所述的装置，其中在所述扩增区中，分离的染色体通过多链置换扩增单独进行扩增。

35.一种用于控制权利要求30的微流体装置的计算机程序。

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