CN104694654A - 一种检测胎儿染色体数目变异的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测胎儿染色体数目的试剂盒及检测胎儿染色体数目的方法，属于染色体检测领域。该试剂盒包括了对DNA进行修饰处理的试剂Ⅰ；用于连接进行了修饰处理的DNA两端的磷酸化测序接头；将DNA磷酸化测序接头连接在一起的试剂Ⅱ；对连接产物不需要利用引物进行扩增处理，而直接进行纯化处理的装置；本发明提供的检测方法仅包括提取DNA、对DNA进行末端修饰处理、连接测序接头、纯化处理四个步骤，无需进行PCR扩增便可得到测序文库。本发明的试剂盒及制备的文库可以对胎儿的染色体数目的检测达到高效准确无创的效果。

Description

一种检测胎儿染色体数目变异的方法

技术领域

本发明涉及染色体检测领域，尤其涉及无创检测胎儿染色体数目变异的方法。

背景技术

染色体非整倍体疾病是先天性染色体数目异常引起的疾病，是引起新生儿出生缺陷的主要疾病之一。染色体发生数目异常，将会导致许多基因的增加或缺失，破环基因的平衡，妨碍人体相关器官的分化发育，临床表现为器官畸形、智力低下和生长发育迟缓等症状。染色体非整倍体疾病分为常染色体非整倍体疾病和性染色非整倍体疾病。21-三体(唐氏综合征)、18-三体(爱德华氏综合征)和13-三体(帕陶氏综合征)是三种最常见的常染色体非整倍体疾病，在新生儿中发病率分别为1/800、1/8000和1/6000。染色体非整倍疾病发生率与母亲怀孕年龄有相关性，如唐氏综合征的发生率随孕妇年龄变化，20岁孕妇的胎儿发病率为0.07％，40岁孕妇的胎儿发病率为1％。目前，对胎儿染色体疾病尚无有效治疗方法，对于该病的控制目前最可行的措施是采取有效的方法进行出生前筛查与诊断来避免患儿的出生。

目前，唐氏筛查是医院最常用的21三体筛查方法，是通过间接检测母体血清的生化标记物评估胎儿染色数目变异的风险，具有很高的假阳性率和漏检率。绒毛膜穿刺、羊膜腔穿刺及经脐静脉穿刺技术是诊断胎儿染色体非整倍体疾病的金标准，但是该类方法需要通过有创的方式获得胎儿细胞检测染色体核型，具有0.5-1％的胎儿流产率和宫内感染率。

1997年Lo等发现在孕妇血浆中存在游离的胎儿DNA，这为无创产前诊断技术的诞生提供了前提。孕妇外周血胎儿游离DNA具有其独特的特点：1)在于孕妇外周血中的胎儿DNA以小片段的形式存在，其长度较母源性分子短，绝大部分小于300bp，易于分离富集；2)孕妇血中胎儿游离DNA在妊娠4周左右即可出现在母血中，且半衰期短，在分娩后数小时内可从母体血中消失，不会导致先前妊娠对后续妊娠检测结果的干扰和误判；3)母血中胎儿游离的DNA占母体血中总DNA的10-20％左右，随着孕周的增长其数量也不断地增加。胎儿游离的DNA上述特点使其成为无创产前诊断的最佳材料。

高通量测序技术的飞速发展为无创产前诊断技术奠定了坚实的基础。基于高通量测序的无创DNA产前诊断技术，具有准确度高、通量高和成本低等优点。目前，illumina公司和life technologies公司的高通量测序平台已应用于无创DNA产前诊断。这两大平台最大的区别是测序原理不同，illumina公司测序原理是通过读取荧光信号来识别不同碱基；而Life technologies公司的半导体测序平台是根据DNA合成时释放的电流信号识别不同碱基。在上述高通量检测的整个流程中，高通量测序文库的制备是非常关键的一步，文库质量的好坏将直接影响测序数据的质量，并最终影响到检测结果的准确性。illumina公司和life technologies公司的高通量测序文库的制备都需要经过DNA片段化、末端修复、PCR扩增完成文库的制备。人类的基因组GC含量不均一，具有复杂二级结构等因素将会影响PCR扩增效率，使得PCR扩增会出现偏好，影响检测结构的准确性。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的问题，提供一种检测准确率高、成本低的试剂盒及其制备方法，用于Ion Proton测序仪检测胎儿染色体数目变异。

为了实现本发明的目的，本发明一方面提供一种用于检测胎儿染色体数目变异的试剂盒，其特征在于，包括：对采集的外周血中的DNA进行末端补平及添加A碱基的修饰处理的试剂Ⅰ，用于使所述DNA末端补平且具有粘性；用于连接进行了修饰处理的DNA两端的磷酸化测序接头；将进行了修饰处理的DNA两端与所述磷酸化测序接头连接在一起以便得到连接产物的试剂Ⅱ；对所述连接产物不需要利用引物进行扩增处理，而直接进行纯化处理得到测序文库的装置。

其中，所述磷酸化测序接头是其下游5′端缺少A碱基并经过磷酸化修饰的。

其中，所述磷酸化测序接头包括通用接头和Barcode接头。

其中，所述通用接头的正反向序列为：

5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT–3'

3'-T*T*GGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTp–5'。

其中，所述Barcode接头的正反向序列可以是：

5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGAT-3'

3'-T*T*GGTAGAGTAGGGACGCACAGAGGCTGAGTCGATTCCATTGCTp-5'；

也可以是：

5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAAGGAGAACGAT–3'

3'-T*T*GGTAGAGTAGGGACGCACAGAGGCTGAGTCATTCCTCTTGCTp-5'；

还可以是将life technologies公司的Barcode接头通过上述方法制得的其它磷酸化的Barcode接头。

其中，所述对采集的外周血中的DNA进行末端补平及添加A碱基的修饰处理的试剂Ⅰ包括：用于末端补平及添加A碱基的酶；用于实现并促进末端补平及添加A碱基的修饰反应的缓冲液I；其中，所述用于末端补平及添加A碱基的酶包括T4 DNA Polymerase、Taq和T4 Polynucleotide Kinase；其中，所述缓冲液I的pH值为8.0,溶剂为水，溶质为：100mMTris-HCl、500mM KCl、100mMMgCl2、10mM DDT和2.5mM dNTPs。

其中，所述将进行了修饰处理的DNA两端与所述磷酸化测序接头连接在一起以便得到连接产物的试剂Ⅱ包括：用于将所述进行了修饰处理的DNA与所述磷酸化接头连接在一起的酶；用于实现并促进所述连接的缓冲液II；其中，所述用于将所述进行了修饰处理的DNA与所述磷酸化接头连接在一起的酶是T4DNA Ligase；其中，所述用于实现并促进所述连接的缓冲液的pH值为7.3，溶剂为水，溶质为：180mM Tris-HCI、30mM MgCl2、3mM DTT、3mM ATP和1.3M甜菜碱。

其中，所述直接进行纯化处理得到测序文库的装置选自磁珠纯化、纯化柱纯化或2％的琼脂糖凝胶电泳纯化装置中的一种，优选为磁珠纯化，包括：用于盛装DNA溶液并进行纯化处理的EP管；向所述EP管中添加的使DNA发生吸附反应的XP beads溶液；用于放置所述EP管使所述发生吸附反应的DNA向有磁性的一端富集，实现DNA与杂质分离的磁力架；用于洗脱杂质的乙醇；用于洗脱经所述乙醇处理后的DNA使DNA解吸附于XP beads，得到纯化的DNA的洗脱液；

其中，所述XP beads的使用量为50μl。

其中，所述乙醇的浓度为80％，使用量为200μl。

其中，所述洗脱液的使用量为28μl。

为实现本发明的目的，本发明另一方面提供一种用于检测胎儿染色体数目方法，包括：采集外周血，并提取血浆中的DNA；对DNA进行末端补平及添加A碱基的修饰处理，得到补平且具有粘性末端的DNA；对所述修饰处理后的DNA与磷酸化测序接头进行连接，得到连接产物；对所述连接产物不需要利用引物进行扩增处理，而直接进行XP处理，得到测序文库；利用测序平台检测所述测序文库，得到胎儿染色体数目。

其中，所述磷酸化测序接头是经过末端修饰处理后得到的，包括：将两个测序接头进行合成时，改变两个测序接头反向的5′端，使两个测序接头下游的5′少合成一个A碱基，得到5′端缺少A碱基的测序接头；将所述5′端缺少A碱基的测序接头的末端进行磷酸化修饰，得到磷酸化测序接头；其中，所述测序接头为通用接头和Barcode接头。

其中，所述对DNA进行末端修饰处理包括：将血浆DNA、缓冲液Ⅰ、补平添加A碱基的酶Ⅰ进行混合得到补平加A反应体系混合液：将补平加A反应体系混合液进行离心处理后，在20℃的温度环境下反应30min、65℃温度环境下反应30min、在4℃的温度条件下停止反应，得到补平且具有粘性末端的DNA。

其中，所述血浆DNA、缓冲液Ⅰ、酶Ⅰ按以下体积份数进行混合：

血浆DNA           42μl

缓冲液Ⅰ          6μl

酶Ⅰ              2μl；

其中，所述补平加A缓冲液的pH值为8.0，以份数计，包括：

其中，所述补平加A的酶(Enzyme I)为T4 DNA Polymerase、Taq酶和T4Polynucleotide Kinase。

其中，将所述修饰后的DNA与磷酸化测序接头进行连接包括：将所述修饰后的DNA、连接缓冲液II、磷酸化通用接头、磷酸化Barcode接头、连接酶II进行混合，得到连接反应体系混合物；将所述连接反应体系混合物进行离心处理后，在置于20℃的温度环境下反应15min、4℃的温度条件下停止反应，得到连接产物。

其中，所述修饰后的DNA、连接缓冲液II、磷酸化通用接头、磷酸化Barcode接头、连接酶II按以下份数进行混合：

其中，所述连接缓冲液II的pH值为7.3，包括：

其中，所述连接酶(Enzyme II)为T4 DNA Ligase；

其中，所述连接缓冲液II的优选pH值为7.1～7.6，进一步优选为7.3。

优选地，所述外周血选自孕龄为8周以上孕妇的外周血。

优选的，所述纯化处理方法采用磁珠纯化的方法进行连接产物的纯化。

其中，所述纯化处理包括：向装有所述连接产物的EP管中加入XP beads，混匀后静置，使连接产物与XP beads充分接触，发生吸附反应，使连接产物被吸附在XP beads表面；将EP管放在磁力架上，使吸附有连接产物的DNA向磁力架一端积聚，并除去EP管中含有杂质分子的上清液；向除去上清液的EP管中加入80％乙醇溶液，颠倒磁力架后，吸出乙醇溶液。并重复上一步骤，得到除杂后的连接产物；再对除杂后的连接产物进行离心处理，最后置于磁力架上，用枪头吸尽残液，开盖晾干3min；向晾干后的EP管中加入洗脱液对晾干后的连接产物进行洗脱，以除去其中的磁珠，并在室温条件下放置5min后置于磁力架上静置2分钟，收集上层液体，得到测序文库。

其中，所述加入的XP beads与连接产物的比例为1：1。

其中，所述发生吸附反应的温度条件是18-25℃，静置时间为5min。

其中，所述加入乙醇溶液的质量浓度为80％，加入的量为200μl。

其中，所述颠倒磁力架的次数为5次。

其中，加入的洗脱液选自TE洗脱液。

其中，加入的洗脱液的量为28μl。

其中，所述测序文库浓度≥26pM。

为实现本发明的目的，本发明再一方面提供一种将上述试剂盒用于IonProton测序仪检测胎儿染色体数目变异的用途。

本发明的有益效果体现在：

1、本发明提供的试剂盒可以实现快速准确地检测染色体数目，由于本发明的试剂盒中没有进行PCR扩增的试剂和引物，因此避免了扩增过程中发生的变异而产生检测误差；本发明将DNA末端进行了补平并添加A碱基，将接头进行了磷酸化处理，使得DNA与测序接头可以高效准确连接，而且本发明提供了将甜菜碱代替PEG6000的连接反应的缓冲液，使得本发明的试剂盒可以促进DNA与测序接头的快速高效连接的同时，不影响连接产物进行纯化和产生自连接现象，从而简化了检测程序。

2、本发明提供的制备方法简单、成本低廉，省去了PCR扩增程序，减少的试剂和引物及时间的投入，仅需四个步骤即可完成试剂盒的制备，简化了文库构建过程。

3、本发明提供的试剂盒可以用于Ion Proton测序仪进行胎儿染色体数目变异的无创检测，极大的减少了检测过程中的时间成本及对人力和物力的投入。

附图说明

图1是本发明制备试剂盒的流程图；

图2是本发明连接酶反应缓冲液的PH值对连接效率的影响结果的电泳图。

图3是本发明使用甜菜碱作为连接酶反应缓冲液与使用PEG6000作为连接酶反应缓冲液对连接和回收效率的影响结果的电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 构建测序文库的方法

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种构建测序文库的方法，如图1所示，根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：

步骤S101，提取外周血，以获得血浆中的DNA。在本发明中所使用的术语“DNA”可以是任何包含任何脱氧核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA。本领域的技术人员可以理解的是，DNA的来源不受特别限制，可以从任何可能的途径获得，可以是通过市售直接获得，也可以是从其它实验室直接获取，还可以是直接从样本中提取。根据本发明的实施例，可以从样本中提取获得基因组DNA。根据本发明的一个实施例，构建测序文库的方法可进一步包括从样本中提取基因组DNA的步骤。根据本发明的一些具体实施例，样本可以来源于哺乳动物、植物和微生物的至少一种。根据本发明的一些实施例，哺乳动物可以为人和小鼠的至少一种。根据本发明的一个实施例，基因组DNA可以为人类全血基因组DNA，优选为外周血单核细胞基因组DNA。本发明人发现，当采用孕龄为8周以后的外周血，并使用TIANGEN公司生产的血浆游离DNA提取试剂盒或者Qiagen公司的QIAamp circulating nucleic acid kit提取血浆中的DNA构建测序文库时，获得的DNA质量好，尤其构建的样本的测序文库能够方便地应用于测序技术，从而基于对测序结果的数据分析可以方便有效地获得样本的染色体数目变异信息。

步骤S102，将基因组DNA进行末端修复及末端悬A修饰，以便获得补平且具有粘性末端的DNA，使连接感应有平末端连接改为悬A和悬T的粘性末端连接，以避免并省去平末端连接产生的缺刻而需进行的缺刻处理过程。根据本发明的实施例，将基因组DNA直接进行末端修复和添加碱基A是同时进行的，在PCR仪上进行，根据本发明的实施例，在添加碱基A可以利用T4 DNA聚合酶、具有加A能力的Taq酶和T4多核苷酸激酶进行，T4 DNA聚合酶同时具有5'→3'DNA聚合酶活性和3'→5'DNA外切酶活性，可以用于将5'端突出末端补平或3'端突出末端削平，同时T4 DNA聚合酶具有热不稳定性，这样就解决了补平之后升高温度失活T4 DNA聚合酶的活性，Taq酶末端加A不会被T4 DNA聚合酶切掉。

S103，将具有粘性末端的DNA与磷酸化测序接头连接，以便获得连接产物。本发明所使用的术语“磷酸化接头”是指这样一个接头，在其核苷酸序列中，所有的测序接头的5'端少一个碱基A后，均在T位点进行磷酸化修饰。根据本发明的一个实施例，在将具有粘性末端的基因组DNA与磷酸化的测序接头连接前，可以进一步包括对常规测序所用的接头进行磷酸化的步骤，这样可以在不改变测序文库的测序接头序列的同时，提高连接的高效性，修复了平连时产生的缺刻。

根据本发明的一个实施例，将具有粘性末端的基因组DNA与磷酸化的测序接头连接是利用加入了甜菜碱的缓冲液和T4 DNA连接酶，发明人发现将测序接头磷酸化并利用加入了甜菜碱的缓冲液可以促进连接，且解决使用PEG6000进行连接时存在的影响后续纯化效率和测序接头之间发生自连而产生的自连接产物，因此发明人使用磷酸化的测序接头并将甜菜碱代替PEG6000既可以提高快速连接效率，也不会发生测序接头自己连接而产生自连接产物的矛盾。据本发明的一个实施例，发明人惊奇的发现，利用加入了甜菜碱的缓冲液将具有粘性末端的基因组DNA与磷酸化的测序接头连接时，将缓冲液的pH调整为7.3，将进一步提高连接效率。

S104，对连接产物直接进行XP纯化回收处理，得到的纯化后的连接产物构成测序文库。根据本发明的实施例，纯化连接产物的方法不受特别的限制，根据本发明的具体实施例，可以通过磁珠纯化、纯化柱纯化和2％的琼脂糖凝胶电泳的至少一种进行，优选通过磁珠纯化。根据本发明的一些具体示例，本发明的测序文库浓度为26pM，可见该测序文库可用于Ion ProtonTM测序平台。

实施例2 试剂盒

根据本发明的另一个方面，本发明提供一种用于构建样本的基因组特定区域的测序文库试剂盒，根据本发明的实施例，该试剂盒可包含用于DNA末端修复加A碱基的酶及所需的包含Tris-HCl、KCl、MgCl2、DDT、dNTPs的缓冲液；用于连接修饰后DNA和测序接头的连接酶及所需的包含Tris-HCI、MgCl2、DTT、ATP、甜菜碱的缓冲液、接头。本领域的技术人员可以理解，试剂盒中还可以进一步包含构建样本测序文库的所需的任何其他组分。

本发明的构建测序文库的方法省去了PCR扩增的步骤，因此利用本发明的构建测序文库的方法减少PCR扩增产生的偏差，提高测序的准确性，由于本发明的构建测序文库的方法省去了PCR扩增的步骤，因此本发明构建的试剂盒中不包含对DNA进行PCR扩增所需的试剂和引物，从而降低了文库的构建成本，减少了测序步骤，简化了文库构建过程。

需要说明的是，根据本发明实施例构建的测序文库的方法和应用是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作完成的。

实施例3 构建测序文库的具体操作过程

1、血浆DNA的制备

抽取10名孕妇的外周血，编号为:14N0001、14N0002、14N0003、14N0004、14N0005、14N0006、14N0007、14N0008、14N0009和14N0010。血样经两步离心法得到除去了血细胞的血浆，并以经过灭菌的高纯水替代血浆设为阴性对照，以金标准羊水穿刺确诊样品为阳性对照，每个样本量为1ml。

使用TIANGEN公司生产的血清/血浆游离DNA提取试剂盒提取血浆中的DNA，(Qiagen公司的QIAamp circulating nucleic acid kit或其他公司的DNA提取试剂盒同样适用于本发明)，操作流程按说明书进行。

2.血浆DNA末端的修复和碱基A的添加

将提取获得的DNA在PCR仪上直接进行末端修复及修饰，以获得补平并具有粘性末端的DNA。

首先，将血浆DNA、补平加A缓冲液(Buffer I)、补平加A酶(Enzyme I)分别按照表1的混合比例在1.5ml的离心管中配制反应体系，其中，所述的补平加A缓冲液为：100mMTris-HCl、500mM KCl、100mM MgCl2、10mM DDT、2.5mM dNTPs和水的混合液，其pH值为8.0；所述补平加A的酶(Enzyme I)为外购于NEB公司的T4 DNA Polymerase(T4 DNA聚合酶)、Taq酶和T4Polynucleotide Kinase(T4 DNA多核苷酸激酶)。

表格1 末端补平加A的反应体系

其次，将末端修复加A反应体系中的血浆DNA、补平加A缓冲液(Buffer I)、补平加A酶(Enzyme I)按比例混合均匀后，置于离心管中进行短暂的离心处理，再将短暂离心后的混合液按表2所示的反应条件在PCR仪上反应，最终得到补平后具有粘性末端的DNA。

表格2 末端补平加A的反应条件

3.测序接头的修饰

在Life公司将通用接头和Barcode接头分别进行测序接头的悬A和磷酸化修饰，具体的包括：

将两个Barcode接头进行合成时，改变两个Barcode接头反向的5′端，使两个Barcode接头下游的5′少合成一个A碱基，得到5′端缺少A碱基的Barcode接头，再将5′端缺少A碱基的Barcode接头的末端进行磷酸化修饰，得到磷酸化Barcode接头。

同理，Life公司进行通用接头修饰时，改变两个通用接头反向的5′端，使两个通用接头下游的5′少合成一个A碱基，得到5′端缺少A碱基的通用接头，再将5′端缺少A碱基的通用接头的末端进行磷酸化修饰，得到磷酸化通用接头。

其中，所述通用接头的正反向序列为：

5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT–3'

3'-T*T*GGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTp–5'。

其中，所述Barcode接头的正反向序列可以是：

5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGAT-3'

3'-T*T*GGTAGAGTAGGGACGCACAGAGGCTGAGTCGATTCCATTGCTp-5'；

也可以是：

5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAAGGAGAACGAT–3'

3'-T*T*GGTAGAGTAGGGACGCACAGAGGCTGAGTCATTCCTCTTGCTp-5'；

还可以是将life technologies公司的Barcode接头通过上述方法制得的其它磷酸化的Barcode接头。

4.连接修饰后DNA和测序接头

将补平后具有粘性末端的DNA与测序接头直接连接，得到连接产物。

首先，将补平后具有粘性末端的DNA、连接缓冲液(Buffer II)、通用接头、Barcode接头、连接酶(Enzyme II)在1.5ml的离心管中按照表3所示的混合比例进行配制，其中，所述连接缓冲液(Buffer II)的pH值为7.3，为：180mMTris-HCI、30mM MgCl2、3mM DTT、3mM ATP、1.3M甜菜碱(Betaine)和水的混合液；所述连接酶(Enzyme II)为外购于NEB公司的T4 DNA Ligase。

其次，将补平后具有粘性末端的DNA、连接缓冲液(Buffer II)、通用接头、Barcode接头、连接酶(Enzyme II)按比例混合均匀后，置于离心管中进行短暂的离心处理，其处理时长为3-5s，再将短暂离心后的混合液按表4所示的反应条件在PCR仪上反应，得到补平后具有粘性末端的DNA与测序接头的连接产物。

表格3 连接反应体系的配制

表格4 连接反应的反应条件

其中，连接缓冲液(Buffer II)的pH值还可以是7.1、7.2、7.4、7.5、7.6。

4.纯化DNA连接产物

由于本申请在进行与测序接头连接时，使用了以甜菜碱成分的缓冲液和T4DNA连接酶，解决了使用PEG6000成分的缓冲液进行连接时存在的影响后续纯化效率和产生测序接头间的连接产物的问题，因此本申请的使用磁珠纯化的方法进行连接产物的纯化，具体的包括以下步骤：

4.1将得到的连接产物立即用Beckman公司生产的Agencourt AMPure XPMagnetic Beads进行回收，并将每个样品得到的连接产物逐一转移到EP管中，做好标记后再向每个EP管中加入66ul XP beads对连接进行纯化，混匀后在室温条件下静置5分钟，使连接产物与XP beads充分接触、发生吸附反应。

4.2将装有发生吸附反应后的连接产物的EP管放在磁力架上，在室温条件下静置5min，使吸附有连接产物的DNA向磁力架一端积聚，除去EP管中含有杂质分子的上清液。

4.3向除去上清液的EP管中加入200ul 80％的乙醇溶液，轻柔的上下颠倒磁力架5次，除去乙醇溶液；

4.4重复步骤4.3，得到除杂后的连接产物，再对连接产物进行离心处理，最后置于磁力架上反应，用枪头吸尽残液，开盖晾干3min。

4.5向晾干后的EP管中加入25ul EB洗脱液洗脱，以除去其中的磁珠，并在室温条件下放置5min后置于磁力架上静置2分钟，采集上层液体，得到纯化后的连接产物。

5.文库检测

用枪头吸出23ul的纯化后的连接产物，利用KAPA公司二代测序文库定量试剂盒检测纯化后的连接产物的浓度，经检测发现本发明的试剂组合溶液和文库构建方法所构建的文库浓度适当，高于Proton上机浓度(26pM)，该发明的试剂组合溶液和文库构建方法可适用于Ion Proton^TM测序平台。

6.文库测序

将经过上述步骤得到的文库在Ion Proton^TM测序平台测序，测序结果如表5所示。

表5：样品测序结果

样品	冗余度	GC比例	Unique比对数	Unique数	Chr13	Chr18	Chr21
								14N0001	2.154	41.031	59.578	5857098	-0.953	-2.073	0.361
14N0002	2.471	40.861	60.799	4646156	-0.204	-2.156	0.266
								14N0003	2.229	40.424	59.283	5189013	-0.2	-2.262	8.907
14N0004	2.101	40.456	59.404	4632242	2.599	-1.067	-0.038
								14N0005	2.293	40.814	57.766	6017941	0.993	-1.559	-0.363
14N0006	1.91	40.506	57.163	4935945	-0.408	-2.246	1.727
								14N0007	2.74	40.335	63.963	4992320	1.009	-0.959	0.974
14N0008	1.72	40.935	62.983	4923651	0.622	-1.673	0.751
								14N0009	1.615	40.972	64.456	4747390	1.159	-0.957	-0.221
14N0010	2.238	40.496	61.537	5177998	0.886	1.334	10.320

如表5所示的测序结果所示，通过本发明方法建立的测序文库的检测结果表明数据的冗余度很低，最低为1.615，最高仅为2.74；GC含量和正常人类的基因组CG含量接近在40.031～40.972范围内，Unique比对数最低为57.163，最高为64.456，且测序分析结果与医院核型结果完全一致。这说明该发明的试剂组合溶液和文库构建方法适用于Ion Proton^TM测序平台，尤其适用于在Ion Proton^TM测序平台上进行孕妇外周血胎儿染色体非整倍体检测。由此可见本申请不进行连接产物的PCR扩增获得的测序文库的质量好，并且简化了建库流程，显著优于现有技术的文库构建方法。

试验例1

将连接缓冲液(Buffer II)的pH值设置为7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6等6个处理组，对不同pH值缓冲液条件下反应得到的连接产物进行8个循环的PCR扩增，并用安捷伦2100电泳检测其连接效果，检测结果如图2所示。

由图2可知，当连接缓冲液的pH值为7.3时，其连接效果最好。

试验例2

用于纯化的Agencourt AMPure XP试剂是利用PEG6000的浓度来决定片断的抓取大小，所以如果连接反应中有PEG6000会影响XP的纯化回收。本发明以加入了甜菜碱的缓冲液进行连接反应为试验组、以加入了PEG6000的缓冲液进行连接反应为对照组，将获得的连接产物进行8个循环的PCR扩增和安捷伦2100电泳检测其连接效果测定结果如图3所示。

如图3所示的电泳图可知，PEG6000和甜菜碱对促进连接效果都很好，但是在加PEG6000时，高浓度的XP提高了DNA的回收效率，但没有去除接头自连的产物，因此本发明使用甜菜碱可以很好的避免使用PEG6000存在的问题。

尽管上述对本发明做了详细说明，但不限于此，本技术领域的技术人员可以根据本发明的原理进行修改，因此，凡按照本发明的原理进行的各种修改都应当理解为落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于检测胎儿染色体数目变异的试剂盒，其特征在于，包括：

对采集的外周血中的DNA进行末端补平及添加A碱基的修饰处理的试剂Ⅰ，用于使所述DNA末端补平且具有粘性；

用于连接进行了修饰处理的DNA两端的磷酸化测序接头；

将进行了修饰处理的DNA两端与所述磷酸化测序接头连接在一起以便得到连接产物的试剂Ⅱ；

对所述连接产物不需要利用引物进行扩增处理，而直接进行纯化处理得到测序文库的装置。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磷酸化测序接头是其下游5′端缺少A碱基并经过磷酸化修饰的。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述对采集的外周血中的DNA进行末端补平及添加A碱基的修饰处理的试剂Ⅰ包括：

用于末端补平及添加A碱基的酶；

用于实现并促进末端补平及添加A碱基的修饰反应的缓冲液I。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述将进行了修饰处理的DNA两端与所述磷酸化测序接头连接在一起以便得到连接产物的试剂Ⅱ包括：

用于将所述进行了修饰处理的DNA与所述磷酸化接头连接在一起的酶；

用于实现并促进所述连接的缓冲液II。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述直接进行纯化处理得到测序文库的装置选自磁珠纯化、纯化柱纯化或2％的琼脂糖凝胶电泳纯化装置中的一种，优选为磁珠纯化，包括：

用于盛装DNA溶液并进行纯化处理的EP管；

向所述EP管中添加的使DNA发生吸附反应的XP beads溶液；

用于放置所述EP管使所述发生吸附反应的DNA向有磁性的一端富集，实现DNA与杂质分离的磁力架；

用于洗脱杂质的乙醇；

用于洗脱经所述乙醇处理后的DNA使DNA解吸附于XP beads，得到纯化的DNA的洗脱液。

6.一种使用如权利要求1-5任意一项所述的试剂盒用于制备测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：

采集外周血，并提取血浆中的DNA；

对DNA进行末端补平及添加A碱基的修饰处理，得到补平且具有粘性末端的DNA；

对所述修饰处理后的DNA与磷酸化测序接头进行连接，得到连接产物；

对所述连接产物不需要利用引物进行扩增处理，而直接进行XP处理，得到测序文库；

利用测序平台检测所述测序文库，得到胎儿染色体数目。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述磷酸化测序接头是经过末端修饰处理后得到的，包括：

将两个测序接头进行合成时，改变两个测序接头反向的5′端，使两个测序接头下游的5′少合成一个A碱基，得到5′端缺少A碱基的测序接头；

将所述5′端缺少A碱基的测序接头的末端进行磷酸化修饰，得到磷酸化测序接头；

其中，所述测序接头为通用接头和Barcode接头。

8.如权利要求6所述的试剂盒的方法，其特征在于，所述对DNA进行末端修饰处理包括：

将血浆DNA、缓冲液Ⅰ、补平添加A碱基的酶Ⅰ进行混合得到补平加A反应体系混合液；

将补平加A反应体系混合液进行离心处理后，在20℃的温度环境下反应30min、65℃温度环境下反应30min、在4℃的温度条件下停止反应，得到补平且具有粘性末端的DNA。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述修饰后的DNA与磷酸化测序接头进行连接包括：

将所述修饰后的DNA、连接缓冲液II、磷酸化通用接头、磷酸化Barcode接头、连接酶II进行混合，得到连接反应体系混合物；

将所述连接反应体系混合物进行离心处理后，置于20℃的温度环境下反应15min、4℃的温度条件下停止反应，得到连接产物；

其中，所述连接缓冲液II的优选pH值为7.1～7.6，进一步优选为7.3。

10.一种将权利要求1所述的试剂盒用于Ion Proton测序仪检测胎儿染色体数目变异的用途。