TWI694150B - 網膜組織的製造方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種網膜細胞或網膜組織的製造方法，其係包含下述步驟(1)~(3)；(1)在餵養細胞不存在下，將人類多功能性幹細胞培養在包含維持未分化因子之培養基的第一步驟，(2)將於第一步驟所得到的多功能性幹細胞，在音蝟因子信號傳導途徑作用物質存在下進行懸浮培養，使之形成細胞凝集體的第二步驟，(3)將在第二步驟所得到的凝集體，在BMP信號傳導途徑作用物質存在下進行懸浮培養，而得到包含網膜細胞或網膜組織之凝集體的第三步驟。

Description

網膜組織的製造方法
本發明與從多功能性幹細胞製造網膜細胞或網膜組織的方法有關。
作為從多功能性幹細胞製造網膜組織等神經組織(neural tissue)的方法，有一種被揭示的神經組織製造方法為，經由在無血清培養基中形成均一的多功能性幹細胞凝集體，將之懸浮培養後，於分化誘導用的培養液中，在適當分化誘導因子等的存在下進行懸浮培養，而從多功能性幹細胞分化誘導目的之神經系細胞(neural cells)(專利文獻1及非專利文獻1)。例如已知有，從多功能性幹細胞得到多層網膜組織的方法(非專利文獻2及專利文獻2)，在包含Wnt信號傳導途徑抑制劑的無血清培養基中形成均一的多功能性幹細胞凝集體，將之在基底膜製劑存在下進行懸浮培養後，再經由以血清培養基進行懸浮培養，而得到多層網膜組織的方法(非專利文獻3及專利文獻3)。此外，也有關於從多功能性幹細胞往下視丘組織分化誘導的方法(專利文獻4及非專利文獻4)，以及 從多功能性幹細胞往神經前驅細胞分化誘導的方法(非專利文獻5及6)的報告。
身為這些製造方法的起始材料的多功能性幹細胞，尤其是在靈長類多功能性幹細胞，以往是在餵養細胞存在下‧添加維持未分化因子的條件下被維持未分化培養。近年來，維持未分化培養不斷改良，有將靈長類多功能性幹細胞在餵養細胞不存在下(feeder free)‧添加維持未分化因子的條件下之培養手法的報告(非專利文獻7、非專利文獻8及非專利文獻9)。迫切期望一種將以該手法feeder free培養出來的多功能性幹細胞為起始材料，安定地製造網膜細胞或網膜組織的方法。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2009/148170號
[專利文獻2]國際公開第2011/055855號
[專利文獻3]國際公開第2013/077425號
[專利文獻4]國際公開第2013/065763號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Cell Stem Cell, 3, 519-32 (2008)
[非專利文獻2]Nature, 472, 51-56 (2011)
[非專利文獻3]Cell Stem Cell, 10 (6), 771-775 (2012)
[非專利文獻4]Nature, 480, 57-62 (2011)
[非專利文獻5]Nature Biotechnology, 27 (3), 275-80 (2009)
[非專利文獻6]Proc Natl Acad Sci USA, 110 (50), 20284-9 (2013)
[非專利文獻7]Nature Methods, 8, 424-429 (2011)
[非專利文獻8]Scientific Reports, 4, 3594 (2014)
[非專利文獻9]In Vitro Cell Dev Biol Anim., 46, 247-58 (2010)
本發明所欲解決之課題為，提供一種在餵養細胞不存在下調配或從被維持未分化培養的多功能性幹細胞製造網膜細胞或網膜組織的方法。
本發明群為了解决上述課題反覆進行研究後發現，經由將多功能性幹細胞(尤其是人類iPS細胞)在餵養細胞不存下在進行維持未分化培養，將所得到的多功能性幹細胞在含有音蝟因子信號傳導途徑作用物質的培養基中懸浮培養使之形成細胞凝集體，能夠以高效率形成圓形、表面光滑、凝集體內部致密且維持未分化性的細胞凝集體。並發現使用此高品質細胞凝集體，能夠以高效率誘導網膜細胞和網膜組織，而完成本發明。
即，本發明與以下有關。
[1]一種網膜細胞或網膜組織的製造方法，其係包含 下述步驟(1)~(3)；(1)在餵養細胞不存在下，將人類多功能性幹細胞培養在包含維持未分化因子之培養基的第一步驟，(2)將於第一步驟所得到的多功能性幹細胞，在音蝟因子(Sonic hedgehog)信號傳導途徑作用物質存在下進行懸浮培養，使之形成細胞凝集體的第二步驟，以及(3)將在第二步驟所得到的凝集體，在BMP信號傳導途徑作用物質存在下進行懸浮培養，而得到包含網膜細胞或網膜組織之凝集體的第三步驟。
[2]如[1]之製造方法，其中於第二步驟，將於第一步驟所得到的細胞分散，並將該分散了的細胞進行懸浮培養。
[3]如[1]或[2]之製造方法，其中維持未分化因子為FGF信號傳導途徑作用物質。
[4]如[3]之製造方法，其中FGF信號傳導途徑作用物質為bFGF。
[5]如[1]~[4]中任一項之製造方法，其中第二步驟之培養基中的音蝟因子信號傳導途徑作用物質的濃度為，相當於SAG 10nM~700nM之音蝟因子信號傳導作用之濃度。
[6]如[1]~[5]中任一項之製造方法，其中音蝟因子信號傳導途徑作用物質為SAG，Purmorphamine或Shh。
[7]如[1]~[6]中任一項之製造方法，其中BMP信號傳導途徑作用物質為1種以上選自BMP2、BMP4、BMP7 及GDF7所成群之蛋白質。
[8]如[6]之製造方法，其中BMP信號傳導途徑作用物質為BMP4。
[9]如請求項1~8中任一項之製造方法，其中於第三步驟，BMP信號傳導途徑作用物質在第二步驟開始後的第2天至第9天之間被添加於培養基。
[10]如[1]~[9]中任一項之製造方法，其中於第3步驟，以音蝟因子信號傳導途徑作用物質的濃度為相當於SAG 700nM之音蝟因子信號傳導作用之濃度以下的培養基培養凝集體。
[11]如[1]~[10]中任一項之製造方法，其中第一步驟為貼附培養法。
[12]如[1]~[11]中任一項之製造方法，其中多功能性幹細胞為人工多功能性幹細胞。
[13]如[1]~[12]中任一項之製造方法，其中於第二步驟，形成均一的凝集體。
[14]如[1]~[13]中任一項之製造方法，其中於第三步驟所得到的凝集體為包含1或複數種，選自網膜前驅細胞、神經網膜前驅細胞、視細胞前驅細胞、視細胞、視桿細胞、視錐細胞、水平細胞、無軸突細胞、聯絡神經元、神經節細胞、網膜色素上皮細胞、以及睫狀體邊緣區細胞所成群之細胞的凝集體。
[15]如[1]~[14]中任一項之製造方法，其中懸浮培養為在基底膜製劑不存在下進行。
[16]一種被檢物質毒性‧藥效評價用試劑，其特徵係含有經由如[1]~[15]中任一項之方法製造之網膜細胞或網膜組織。
[17]一種被檢物質毒性‧藥效評價方法，其特徵係包含使被檢物質接觸經由如[1]~[15]中任一項之方法製造之網膜細胞或網膜組織，並鑑定該物質對該細胞或該組織的影響。
[18]一種因網膜組織異常引起之疾病的治療藥，其特徵係含有經由如[1]~[15]中任一項之方法製造之網膜細胞或網膜組織。
[19]如[18]之治療藥，其中網膜細胞為網膜前驅細胞及/或網膜層特異性神經細胞。
[20]一種因網膜組織異常引起之疾病的治療方法，其特徵係包含將經由如[1]~[15]中任一項之方法製造之網膜細胞或網膜組織的有效量移植至需要移植的對象。
[21]一種經由[1]~[15]中任一項之方法製造的網膜細胞或網膜組織，其特徵係為了用於因網膜組織異常而引起之疾病的治療。
[22]一種醫藥組成物，其特徵係含有經由[1]~[15]中任一項之方法製造的網膜細胞或網膜組織作為有效成分。
藉由本發明，可以從在餵養細胞不存在下所培養的多功能性幹細胞，以高效率製造高品質的細胞凝集體，與網 膜細胞和網膜組織。
[圖1]圖示比較例1及實施例1的培養條件，以及凝集體的明視野像(A-D)。
[圖2]圖示實施例1的培養條件，以及凝集體的網膜組織標記(Chx10,Rx)的免疫組織染色像(A-D)。
[圖3]圖示實施例2的培養條件，以及凝集體的明視野像(A-D)。
[圖4]圖示實施例2(無BMP4處理)的培養條件，以及將凝集體形態的程度定量化的圖表。
[圖5]圖示實施例3的培養條件，以及凝集體的網膜組織標記(Chx10,Rx)的免疫組織染色像(A-D)。
[圖6]圖示以實施例4的培養條件製造的網膜組織之，經網膜組織標記進行的免疫染色像。
[圖7]圖示以實施例5的培養條件製造的網膜組織之，經網膜組織標記進行的免疫染色像。
[圖8]圖示以實施例6的培養條件製造的凝集體的明視野像(A-C)，以及經網膜組織標記(Chx10)進行的免疫染色像(D-F)。
[圖9]圖示以實施例7的培養條件製造的凝集體的明視野像(A-D)，以及經網膜組織標記(Chx10)進行的免疫染色像(E)。
[圖10]圖示以實施例8的培養條件製造的凝集體的 明視野像(A,B)，以及經網膜組織標記(Chx10,Rx)進行的免疫染色像(C,D)。
1. 定義
本發明中所謂的「幹細胞」，意指具有分化能力維持分化能力的增殖能力(尤其是自我複製能力)的未分化細胞。按照分化能力，幹細胞中包含多功能性幹細胞(pluripotent stem cell)、複功能性幹細胞(multipotent stem cell)、單功能性幹細胞(unipotent stem cell)等亞群。所謂多功能性幹細胞是指可以在體外(in vitro)培養，而且具有可分化為三胚層(外胚層、中胚層、內胚層)及/或所有屬於源自胚外膜組織之組織的細胞譜系的能力的幹細胞。所謂的複功能性幹細胞，意指雖然不是所有種類，但具有可分化為複數種組織或細胞的能力的幹細胞。所謂的單功能性幹細胞，意指指具有分化為特定組織或細胞的能力的幹細胞。
多功能性幹細胞可從受精卵、克隆胚胎、生殖幹細胞、組織內幹細胞、體細胞等誘導。作為多功能性幹細胞，可列舉出胚胎幹細胞(ES細胞：Embryonic stem cell)、EG細胞(Embryonic germ cell)、人工多功能性幹細胞(iPS細胞：iduced pluripotent stem cell)等。從間質幹細胞(mesenchymal stem cell；MSC)得到的Muse細胞(Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell)、和從生殖細胞(例如睪丸)所製造的GS細胞也被包含在多功能性幹細胞之內。胚胎幹細胞在1981年間被建立，1989年之後也被應用於製造基因剔除小鼠(knockout mouse)。人類胚胎幹細胞在1998年間被建立，也不斷被利用於再生醫學。ES細胞可經由，在餵養細胞上或含LIF培養基中培養內部細胞塊(inner cell mass)來製造。ES細胞的製造方法被揭示於WO96/22362、WO02/101057、US5,843,780、US6,200,806、US6,280,718等。胚胎幹細胞可自特定機關取得，而且也可購得市售產品。例如，人類胚胎幹細胞KhES-1、KhES-2及KhES-3可自京都大學再生醫科學研究所取得。EB5細胞可自國立研究開發法人理化學研究所、D3細胞株可自ATCC取得，兩者皆為小鼠胚胎幹細胞。
ES細胞之一的核移植ES細胞(ntES細胞)，可從將體細胞的細胞核移植到除去細胞株的卵子而做成的克隆胚胎來建立。
EG細胞，可經由在含mSCF、LIF及bFGF的培養基中培養原始生殖細胞(primordial germ cell)來製造(Cell,70：841-847,1992)。
本發明中所謂的「人工多功能性幹細胞」，是經由將體細胞依照眾所周知的方法等重新編程(reprogramming)而誘導多功能性的細胞。具體來說可列舉出，因選自包含Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc(c-Myc、N-Myc、L-Myc)、Glisl、Nanog、Sall4、lin28、 Esrrb等重新編程基因群的複數個基因的組合的任何表現，而將纖維芽細胞和周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell)等已分化之體細胞重新編程並誘導多分化能力的細胞。作為理想的重新編程因子的組合，可舉出(1)Oct3/4、Sox2、Klf4、及Myc(c-Myc或L-Myc)、(2)Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28及L-Myc(Stem Cells,2013；31：458-466)。
人工多功能性幹細胞在2006年由山中等人以小鼠細胞建立(Cell,2006,126(4),pp.663-676)。人工多功能性幹細胞亦在2007年間以人類纖維芽細胞被建立，並且有和胚胎幹細胞同等的多功能性與自我複製能力(Cell,2007,131(5),pp.861-872；Science,2007,318(5858),pp.1917-1920；Nat.Biotechnol.,2008,26(1),pp.101-106)。作為人工多功能性幹細胞，除了以基因表現的直接重新編程來製造的方法之外，還可以經由化合物的添加等從體細胞誘導人工多功能性幹細胞(Science,2013,341,pp.651-654)。
此外，也可取得細胞株化的人工多功能性幹細胞，例如，在京都大學被建立的201B7細胞、201B7-Ff細胞、253G1細胞、253G4細胞、1201C1細胞、1205D1細胞、1210B2細胞、或1231A3細胞等人類人工多功能性細胞株，可自京都大學及iPS Academia Japan,Inc.取得。作為細胞株化的人工多功能性幹細胞，例如，在京都大學被建立的Fg-I01細胞及Ff-I14細胞，可自京都大學取得。
作為製造人工多功能性幹細胞時所使用的體細胞，並無特殊限制，但可舉出，源自組織的纖維芽細胞、血球系細胞(例如，周邊血液單核細胞和T細胞)、肝細胞、胰臟細胞、腸上皮細胞、平滑肌細胞等。
製造人工多功能性幹細胞時，若是以數種基因表現來重新編程，則為了使基因表現的手段並無特殊限制。作為前述手段，可舉出利用病毒載體(例如，反轉錄病毒載體、慢病毒載體、仙台病毒載體、腺病毒載體、腺關連性病毒載體)的感染法、利用質體載體(例如，質體載體、附加型質體載體)的基因轉移法(例如，磷酸鈣法、脂轉染法、RetroNectin法、電穿孔法)、利用RNA載體的基因移轉法(例如，磷酸鈣法、脂轉染法、電穿孔法)、蛋白質直接注入法等。
人工多功能性幹細胞可在餵養細胞存在下或餵養細胞不存在下(feeder free)製造。在餵養細胞存在下製造時，可依照眾所周知的方法，在維持未分化因子存在下製造人工多功能性幹細胞。作為在餵養細胞不存在下製造人工多功能性幹細胞時所使用的培養基，並無特殊限制，可使用眾所周知的胚胎幹細胞及/或人工多功能性幹細胞的維持培養基，和用於在feeder free下建立人工多功能性幹細胞的培養基。作為用於在feeder free下建立人工多功能性幹細胞的培養基，例如可舉出Essential 8培養基、TeSR培養基、mTeSR培養基、mTeSR-E8培養基，StemFit培養基等feeder free培養基。例如，在餵養細胞 不存在下，藉由使用仙台病毒載體將Oct3/4、Sox2、Klf4、及Myc這4個因子基因轉移至體細胞，可製作人工多功能性幹細胞。
本發明所使用的多功能性幹細胞，以ES細胞或人工多功能性幹細胞為佳，並以人工多功能性幹細胞為更佳。
作為複功能性幹細胞，可舉出造血幹細胞、神經幹細胞、網膜幹細胞、間質幹細胞等組織幹細胞(亦稱為組織性幹細胞、組織特異性幹細胞或體幹細胞)。
基因被改變的多功能性幹細胞，例如，可經由利用同源重組(homologous recombination)技術製作。作為被改變的染色體上的基因，例如可舉出細胞標記基因、組織適合性抗原的基因、因神經系細胞異常而引起之疾病的相關基因等。染色體上的標的基因的改變可利用揭示於Manipulating the Mouse Embryo,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)；Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993)；Bio manual series 8,Gene targeting，利用ES細胞製作突變小鼠，羊土社(1995)等的方法進行。
具體來說，例如，分離包含要改變之標的基因(例如細胞標記基因、組織適合性抗原的基因和疾病相關基因等)的染色體DNA，利用分離出來的染色體DNA製作用於對標的基因進行同源重組的標靶載體。將製作完成的標靶載體導入幹細胞，經由篩選出在標的基因與標靶載體間 發生同源重組的細胞，可製作染色體上基因被改變的幹細胞。
作為分離包含標的基因之染色體DNA的方法，例如可舉出被揭示於Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)和Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987-1997)等的眾所周知的方法。也可以經由利用染色體DNA基因庫篩選系統(Genome System製)和Universal GenomeWalker Kits(CLONTECH製)等，將包含標的基因的色體DNA分離出來。也可用包覆標的蛋白質的多核苷酸取代染色體DNA來使用。該多核苷酸可經由以PCR法擴增該多核苷酸來取得。
用於對標的基因進行同源重組之標靶載體的製作，以及同源重組體的有效篩選，可依循揭示於Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993)；Bio manual series 8,Gene targeting，利用ES細胞製作突變小鼠，羊土社(1995)；等的方法進行。標靶載體可使用置換型或插入型的任何一種。作為挑選方法，可使用陽性篩選、啟動子篩選、陰性篩選、或poly A篩選等方法。
作為從挑選出來的細胞株中篩選目標同源重組體的方法，可舉出針對染色體DNA的南方雜交法和PCR法等。
本發明的「哺乳動物」中，包含囓齒類、有蹄類、食肉目、靈長類等。嚙齒類中包含小鼠、大鼠、倉鼠、天竺 鼠等。有蹄類中包含豬、牛、山羊、馬、綿羊等。食肉目中包含狗、貓等。本發明中所謂的「靈長類」，是指屬於靈長目的哺乳類動物，作為靈長類，可舉出狐猴和懶猴、樹鼩等原猴亞目、與猴、類人猿、人類等類人猿亞目。
本發明中所使用的多功能性幹細胞為人類多功能性幹細胞，以人類人工多功能性幹細胞(iPS細胞)或人類胚胎幹細胞(ES細胞)為更佳。
本發明中所謂的「懸浮培養」或「懸浮培養法」，是指持續維持細胞或細胞凝集體在培養液中懸浮存在的狀態進行培養，以及進行該培養的方法。也就是說，懸浮培養是在不使細胞或細胞凝集體貼附於培養器材等的條件下進行，在貼附於培養器材等的條件下所進行的培養(貼附培養，或，貼附培養法)不屬於懸浮培養的範疇。在這個情況，細胞貼附是指，細胞或細胞凝集體與培養器材之間就會出現強力的細胞-基質間連接(cell-substratum junction)。更詳細地來說，所謂懸浮培養是指在不讓細胞或細胞凝集體與培養器材等之間出現強力的細胞-基質間連接的條件下的培養，而貼附培養是指在讓細胞或細胞凝集體與培養器材等之間出現強力的細胞-基質間連接的條件下的培養。
在懸浮培養的細胞凝集體中，細胞與細胞是平面貼附。在懸浮培養中的細胞凝集體與培養器材等之間幾乎沒有形成細胞-基質間連接，或者就算有，其影響也很小。其中一部分的情況是，在懸浮培養中的細胞凝集體的凝集 塊內部雖然存在內在的細胞-基質間連接，但是細胞-基質間連接幾乎沒有在凝集體與培養器材等之間形成，或者就算有，其影響也很小。
所謂細胞與細胞平面貼附(plane attachment)，是指細胞與細胞是以平面來貼附。更詳細地來說，所謂細胞與細胞平面貼附，是指某細胞的表面積中與另一個細胞的表面貼附的比例為，例如，1%以上，以3%以上為佳，5%以上為更佳。細胞的表面可經由膜染色試劑(例如DiI)的染色、細胞貼附因子(例如，E-cadherin或N-cadherin)的免疫染色來觀察。
進行懸浮培養時所使用的培養器，只要是可以「進行懸浮培養」者即無特殊限制，只要是本領域技術人員即可做適當決定。作為這樣的培養器，例如可舉出燒瓶、組織培養用燒瓶、培養皿(dish)、有蓋培養皿(petri dish)、組織培養用培養皿、多孔培養皿、微孔板、微孔板(MicroWell plate)、微孔、多孔板(multi plate)、多孔板(multiwell plate)、細胞培養玻片(chamber slide)、培養皿(schale)、管(tube)、盤(tray)、培養袋、三角燒瓶、攪拌式培養瓶(spinner flask)或滾瓶(roller bottle)。為了可以進行懸浮培養，這些培養器以細胞非貼附性者為佳。作為細胞非貼附性培養器，可使用培養器表面未經以提升與細胞的貼附性為目的之人工處理(例如，基底膜製劑、層黏蛋白、巢蛋白(entactin)、膠原蛋白、明膠等細胞外基質等，或是聚離胺酸、聚鳥胺 酸等高分子等的塗覆處理，或正電荷處理等的表面加工)者。作為細胞非貼附性培養器，可使用經過以降低與細胞的貼附性為目的之人工處理者(例如，MPC聚合物等的超親水性處理、蛋白質低貼附處理等)者。也可使用攪拌式培養瓶(spinner flask)或滾瓶(roller bottle)等進行旋轉培養。培養器的培養面可以是平整的，也可以凹凸不平。
進行貼附培養時所使用的培養器，只要是可以「進行貼附培養」者即無特殊限制，只要是本領域技術人員即可按照培養的規模、培養條件及培養期間做適當選擇。作為這樣的培養器，例如可舉出燒瓶、組織培養用燒瓶、培養皿(dish)、組織培養用培養皿、多孔培養皿、微孔板、微孔板(MicroWell plate)、多孔板(multi plate)、多孔板(multiwell plate)、細胞培養玻片(chamber slide)、培養皿(schale)、管(tube)、盤(tray)、培養袋、微載體、珠(beads)、堆疊板(stack plate)、攪拌式培養瓶(spinner flask)或滾瓶(roller bottle)。為了可以進行貼附培養，這些培養器以細胞貼附性者為佳。作為細胞貼附性培養器，可舉出培養器表面經過以提升與細胞的貼附性為目的之人工處理的培養器，具體來說為經過表面加工的培養器，或是內部經過塗覆劑塗覆之培養器。作為塗覆劑，例如，可舉出層黏蛋白[包含層黏蛋白α5β1γ1(以下簡稱層黏蛋白511)、層黏蛋白α1β1γ1(以下簡稱層黏蛋白111)等及層黏蛋白片段(層黏蛋白 511E8等)]、巢蛋白、膠原蛋白、明膠、玻璃黏附蛋白(Vitronectin)、Synthemax(Corning Inc.)、Matrigel等細胞外基質等，或是聚離胺酸、聚鳥胺酸等的高分子等。作為經過表面加工的培養器，可舉出經過正電荷處理等表面加工的培養容器。
本發明中用於細胞培養的培養基，可以將通常用於動物細胞培養的培養基調配成基礎培養基。作為基礎培養基，例如可舉出BME培養基、BGJb培養基、CMRL 1066培養基、Glasgow MEM(GMEM)培養基、Improved MEM Zinc Option培養基、IMDM培養基、Medium 199培養基、Eagle MEM培養基、αMEM培養基、DMEM培養基、F-12培養基、DMEM/F12培養基、IMDM/F12培養基、Ham培養基、RPMI 1640培養基、Fischer’s培養基、或此等之混合培養基等，可以用於動物細胞培養的培養基。
本發明中所謂的「無血清培養基」，意指不含無調整或未經精製之血清的培養基。於本發明，混入源自精製過之血液的成分和源自動物組織的成分(例如，增殖因子)的培養基，只要不含無調整或未經精製之血清，也被包含在無血清培養基之內。
無血清培養基也可含有血清替代物。作為血清替代物，例如可舉出白蛋白、轉鐵蛋白、脂肪酸、膠原前驅物、微量元素、2-巰基乙醇或3’-巰基甘油、或適當地含有此等之等效物者。該血清替代物，例如，可依照 WO98/30679所揭示的方法調配。也可使用市售產品作為血清替代物。作為該市售血清替代物，例如可舉出KnockoutTM Serum Replacement(Life Technologies公司製；現為ThermoFisher：以下有時也會記為KSR)、Chemically-defined Lipid concentrated(Life Technologies公司製)、GlutamaxTM(Life Technologies公司製)、B27(Life Technologies公司製)、N2補充劑(Life Technologies公司製)。
懸浮培養時使用的無血清培養基，也可適當地含有脂肪酸或脂質、胺基酸(例如，非必需胺基酸)、維生素、增殖因子、細胞因子、抗氧化劑、2-巰基乙醇、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類等。
為了避免調配時的麻煩，也可使用適量(例如，從約0.5%至約30%，以從約1%至約20%為佳)添加了市售KSR(Life Technologies公司製)的無血清培養基(例如，在F-12培養基與IMDM培養基的1：1混合液中添加10% KSR，1 x Chemically Defined Lipid Concentrate(CDLC)及450μM 1-硫代甘油的培養基)作為該無血清培養基。此外，舉出日本特表2001-508302中所揭示的培養基作為KSR的等同品。
本發明中所謂的「血清培養基」，意指含無調整或未經精製之血清的培養基。該培養基也可含有脂肪酸或脂質、胺基酸(例如，非必需胺基酸)、維生素、增殖因子、細胞因子、抗氧化劑、2-巰基乙醇、1-硫代甘油、丙 酮酸、緩衝劑、無機鹽類等。例如，在維持經由本發明製造的神經組織(例如，網膜組織)的步驟(也稱為成熟培養)中，可使用血清培養基。
本發明中的培養，以在無異種成分條件下進行為佳。所謂的「無異種成分」，意指源自與培養對象細胞的生物種不同之生物種的成分被排除之條件。
本發明中所謂的「含物質X培養基」「在物質X存在下」，意指添加了外因性(exogenous)物質X的培養基或含外因性物質X的培養基，或在外因性物質X存在下。也就是，當存在於該培養基中的細胞或組織會內因性(endogenous)地表現、分泌或產生該物質X時，內因性物質X和外因性物質X不同，就算不含外因性物質X的培養基含內因性物質X，還是認定其不在「含物質X培養基」的範疇內。
例如，所謂的「含音蝟因子信號傳導途徑作用物質的培養基」，是被添加了外因性音蝟因子信號傳導途徑作用物質的培養基或含外因性音蝟因子信號傳導途徑作用物質的培養基。
本發明中所謂的餵養細胞，是培養幹細胞時與該幹細胞共存之幹細胞以外的細胞。作為被用於多功能性幹細胞之維持未分化培養的餵養細胞，例如可舉出小鼠纖維芽細胞(MEF等)、人類纖維芽細胞、SNL細胞等。作為餵養細胞，以已經過增殖抑制處理的餵養細胞為佳。作為增殖抑制處理，可舉出增殖抑制劑(例如，絲裂黴素C)處 理、或伽馬射線照射或UV照射等。用於多功能性幹細胞之維持未分化培養的餵養細胞，透過分泌體液因子(以維持未分化因子為佳)，與製作細胞貼附用的基礎(細胞外基質)，對維持多功能性幹細胞的未分化進行貢獻。
本發明中所謂的餵養細胞不存在下(feeder free)，是指在餵養細胞不存在下進行培養。所謂餵養細胞不存在下，例如可舉出不添加餵養細胞之條件、或實質上不含餵養細胞(例如，餵養細胞數相對於全細胞數的比例為3%以下)之條件。
本發明中所謂的細胞的「凝集體」(Aggregate)，是指原本分散在培養基中的細胞集合形成的團塊，而且是細胞彼此之間貼附在一起的團塊。細胞塊、類胚體(Embryoid body)、細胞球(sphere)、細胞球體(Spheroid)也被包含在細胞凝集體之內。細胞凝集體中，以細胞彼此之間平面貼附為佳。在其中一部分的情況，一部分或全部的凝集體中，細胞彼此之間可能會形成細胞-細胞間連接(cell-cell junction)及/或細胞貼附(cell adhesion)，例如貼附連接(adherence junction)。作為本發明中的「凝集體」，具體來說可舉出在上述本發明[1]的第二步驟中生成，原本在懸浮培養開始時分散的細胞所形成的凝集體，與在上述本發明[1]的第三步驟生成，包含從多功能性幹細胞被分化誘導的網膜細胞之凝集體，但「凝集體」中也包含在上述本發明[1]的第二步驟開始時(即懸浮培養開始時)就已形成的 凝集體。在第二步驟生成的細胞凝集體包含類胚體(Embryoid body；EB)。
本發明中所謂「均一的凝集體」，意指培養複數個凝集體時各凝集體的大小固定，當凝集體大小是以最大直徑長度來評價時，所謂均一的凝集體意指最大直徑長度的分散度小。更具體地來說，意指凝集體之全體集團中75%以上的凝集體，在該凝集塊集團中最大直徑的平均值±100%的範圍內，以在平均值±50%的範圍內為佳，以在平均值±20%的範圍內為更佳。
本發明中所謂的「形成均一的凝集體」，是指將細胞集合起來使之形成凝集體並進行懸浮培養時，透過「迅速凝集一定數量的分散細胞」形成大小均一的細胞凝集體。
所謂分散，是指將細胞或組織經過酵素處理或物理處理等的分散處理，使之分離成小細胞片(2細胞以上100細胞以下，以50細胞以下為佳)或分離至單一細胞。所謂一定數量的分散細胞是指，收集一定數量的細胞片或單一細胞。
作為使多功能性幹細胞分散的方法，例如可舉出，機械性的分散處理、細胞分散液處理、細胞保護劑添加處理。也可將這些處理組合後進行。以進行細胞分散液處理後，接著進行機械性分散處理為佳。
作為機械性分散處理的方法，可舉出吸量管處理(pipetting)或刮刀刮取操作。
作為用於細胞分散液處理的細胞分散液，例如可舉出 含胰蛋白酶(trypsin)、膠原蛋白酶、玻尿酸酶(hyaluronidase)、彈性蛋白酶(elastase)、鏈黴蛋白酶(pronase)、DNase或木瓜酶等酵素類，和乙二胺四乙酸等螫合劑之中任何一者的溶液。也可使用市售的細胞分散液，例如TrypLE Select(Life Technologies公司製)或TrypLE Express(Life Technologies公司製)。
分散多功能性幹細胞時，也可經由細胞保護劑的處理來抑制多功能性幹細胞的細胞死亡。作為用於細胞保護劑處理的細胞保護劑，可舉出FGF信號傳導途徑作用物質、肝素、IGF信號傳導途徑作用物質、血清、或血清替代物。此外還可為了抑制因分散而引發的細胞死亡(尤其是人類多功能性幹細胞的細胞死亡)，而在分散的時候添加Rho-associated coiled-coil激酶(ROCK)的抑制劑或Myosin的抑制劑。作為ROCK抑制劑，可舉出Y-27632、Fasudil(HA1077)、H-1152等。作為Myosin抑制劑，可舉出Blebbistatin。作為理想的細胞保護劑，可舉出ROCK抑制劑。
例如，作為使多功能性幹細胞的分散的方法，可舉出在ROCK抑制劑作為細胞保護劑的存在下，將多功能性幹細胞的菌落經過細胞分散液(TrypLE Select)處理，再進一步經由吸量管處理來使之分散的方法。
本發明的製造方法中，以將多功能性幹細胞迅速集合起來使之形成多功能性幹細胞凝集體為佳。一旦形成這樣的多功能性幹細胞凝集體，上皮樣結構即可以良好的重現 性被形成在從所形成的凝集體分化誘導的細胞中。作為使凝集體形成的實驗性操作，例如可舉出，利用孔穴小的培養板(例如，孔穴底面積換算成平底為0.1~2.0cm2左右的培養板)或微孔等將細胞關閉在小空間內的方法、用小離心管經由短時間內的離心使細胞凝集的方法。作為孔穴小的培養板，例如可舉出24孔培養板(面積換算成平底為1.88cm2左右)、48孔培養板(面積換算成平底為1.0cm2左右)、96孔培養板(面積換算成平底為0.35cm2左右，內徑6~8mm左右)、384孔培養板。可舉出96孔培養板為佳。作為孔穴小的培養板的形狀，作為從孔穴上方所見的底面形狀，例如可舉出多角形、長方形、橢圓、圓形，可舉出圓形為佳。作為孔穴小的培養板的形狀，作為從孔穴側面所見的底面形狀，無論是平底結構還是外圍高內凹部低陷的結構皆可。作為底面的形狀，例如可舉出U底、V底、M底，可舉出U底或V底為佳、V底為更佳。作為孔穴小的培養板的形狀，也可使用細胞培養皿(例如，60mm~150mm培養皿、培養瓶)的底面具凹凸或凹陷者。作為孔穴小的培養板的底面，以使用細胞非貼附性底面為佳，以使用前述經過細胞非貼附性塗覆處理的底面為佳。
多功能性幹細胞的凝集體，或含多功能性幹細胞之細胞集團的凝集體的形成、及其均一性，可根據凝集體的大小及細胞數、巨觀形態、經組織染色解析之微觀形態及其均一性等來判斷。而且凝集體中上皮樣結構的形成及其均 一性，可根據凝集體的巨觀形態、經組織染色解析之微觀形態及其均一性、分化及未分化標記的表現及其均一性、分化標記表現的控制及其同步性、凝集體間的分化效率重現性等來判斷。
本發明中所謂的「組織」是指，形態和性質均一的單一種類細胞，或者雖為形態和性質相異的複數種類細胞，但是具有以特定模式立體配置而成的結構之細胞集團的結構體。
本發明中所謂的「神經組織」，意指新生期(nascent)或成年期(adulthood)的大腦、中腦、小腦、脊髓、網膜、末梢神經、前腦、後腦、端腦(endbrain,telencephalon)、間腦(diencephalon)等由神經系細胞所構成的組織。神經組織可能形成具有層狀結構的上皮結構(神經上皮)，可經由以光學顯微鏡進行的明視野觀察來評估細胞凝集體中的神經上皮的存在量。
本發明中所謂的「神經系細胞(Neural cell)」代表源自外胚層的組織中的表皮系細胞以外的細胞。也就是說，包含神經系前驅細胞、神經元(neuron)(神經細胞)、神經膠(glia)、神經幹細胞、神經元前驅細胞及神經膠前驅細胞等的細胞。神經系細胞中，也包含後述構成網膜組織的細胞(網膜細胞)、網膜前驅細胞、網膜層特異性神經細胞、神經網膜細胞、網膜色素上皮細胞。神經系細胞，可用Nestin、TuJ1、PSA-NCAM、N-cadherin等為標記來鑑定。
神經細胞(Neuron‧Neuronal cell)為構成神經迴路並對資訊傳導有貢獻的機能性細胞，可用TuJ1、Dcx、HuC/D等新生神經細胞標記，及/或Map2、NeuN等成熟神經細胞標記的表現為指標來鑑定。
作為神經膠細胞(glia)，可舉出星狀神經膠細胞、寡突細胞、繆樂神經膠細胞(Müller glia)等。可舉出GFAP為星狀神經膠細胞的標記、O4為寡突細胞的標記、CRALBP等為繆樂神經膠細胞的標記。
所謂神經幹細胞，是具有維持往神經細胞及神經膠細胞的分化能力(多分化能力)，與維持多分化能力的增殖能力(有時也稱為自我複製能力)的細胞。作為神經幹細胞的標記，可舉出Nestin、Sox2、Musashi、Hes家族、CD133等，但這些標記是前驅細胞整體的標記而不被認為是神性幹細胞特異性的標記。神經幹細胞的數量，可用神經球分析(neurosphere assay)和克隆分析(clonal assay)等來評估。
所謂神經元前驅細胞，是具有增殖能力，產生神經細胞，不產生神經膠細胞的細胞。作為神經元前驅細胞，可舉出Tbr2、Tα1等。或是，也可將新生神經細胞標記(TuJ1、Dcx、HuC/D)陽性且增殖標記(Ki67、pH3、MCM)陽性的細胞鑑定為神經元前驅細胞。
所謂神經膠前驅細胞，是具有增殖能力，產生神經膠細胞，不產生神經細胞的細胞。
神經系前驅細胞(Neural Precursor cell)為包含神經 幹細胞、神經元前驅細胞及神經膠前驅細胞之前驅細胞集合體，具有增殖能力與產生神經元及神經膠的能力。神經系前驅細胞可用Nestin、GLAST、Sox2、Sox1、Musashi、Pax6等為標記來鑑定。或是，也可將神經系細胞標記陽性且增殖標記(Ki67、pH3、MCM)陽性的細胞鑑定為神經系前驅細胞。
本發明中所謂的「網膜組織」，意指單一種類或至少複數種類的在生物體網膜中構成各網膜層的視細胞、視細胞前驅細胞、視桿細胞、視錐細胞、聯絡神經元、水平細胞、雙極細胞、無軸突細胞、網膜神經節細胞(神經節細胞)、網膜色素上皮細胞(RPE)、睫狀體邊緣區細胞、此等之前驅細胞、或網膜前驅細胞等的細胞，以層狀立體配置而成的組織。每種細胞各分別構成哪種網膜層，可透過眾所周知的方法，例如有無細胞標記的表現或其表現的程度等來確認。
本發明中所謂的「網膜層」，意指構成網膜的各層，具體來說可舉出網膜色素上皮層、視細胞層、外界限膜、外核層、外網狀層、內核層、內網狀層，神經節細胞層、神經纖維層及內界限膜。
本發明中所謂的「網膜前驅細胞」，是指有可能往視細胞、水平細胞、雙極細胞、無軸突細胞、網膜神經節細胞、網膜色素上皮細胞等之中任何成熟網膜細胞分化的前驅細胞。
本發明中所謂的「神經網膜前驅細胞」，是指有可能 往視細胞、水平細胞、雙極細胞、無軸突細胞、網膜神經節細胞等之中任何1種或複數種成熟網膜細胞分化的前驅細胞。一般來說，神經網膜前驅細胞不會往網膜色素上皮細胞分化。
所謂視細胞前驅細胞、水平細胞前驅細胞、雙極細胞前驅細胞、無軸突細胞前驅細胞、網膜神經節細胞前驅細胞、網膜色素上皮細胞前驅細胞，各是指確定會往視細胞、水平細胞、雙極細胞、無軸突細胞、網膜神經節細胞、網膜色素上皮細胞分化之前驅細胞。
本發明中所謂的「網膜層特異性神經細胞」，意指構成網膜層的細胞且為網膜層特異性之神經細胞(神經元)。作為網膜層特異性神經細胞，可舉出雙極細胞、網膜神經節細胞、無軸突細胞、水平細胞、視細胞、網膜色素上皮細胞、桿體細胞及錐體細胞。
本發明中「網膜細胞」包含上述的網膜前驅細胞及網膜層特異性神經細胞。
作為網膜細胞標記，可舉出在網膜前驅細胞中表現的Rx(也稱為Rax)、PAX6及Chx10，在下視丘神經元的前驅細胞中表現而不在網膜前驅細胞中表現的Nkx2.1、在下視丘神經上皮中表現而不在網膜中表現的Sox1、在視細胞的前驅細胞中表現的Crx、Blimp1等。作為網膜層特異性神經細胞的標記，可舉出在雙極細胞中表現的Chx10、PKCα及L7、在網膜神經節細胞中表現的TuJ1及Brn3、在無軸突細胞中表現的Calretinin、在水平細胞中 表現的Calbindin、在成熟視細胞中表現的Rhodopsin及Recoverin、在桿體細胞中表現的Nrl及Rhodopsin、在錐體細胞中表現的Rxr-gamma及S-Opsin、在網膜色素上皮細胞中表現的RPE65及Mitf、在睫狀體邊緣區中表現的Rdh10及SSEA1等。
2. 網膜細胞或網膜組織的製造方法
本發明之製造方法，包含下述步驟(1)~(3)，為網膜細胞和網膜組織的製造方法：
(1)在餵養細胞不存在下，將人類多功能性幹細胞培養在包含維持未分化因子之培養基的第一步驟，
(2)將於第一步驟所得到的多功能性幹細胞，在音蝟因子信號傳導途徑作用物質存在下進行懸浮培養，使之形成細胞凝集體的第二步驟，以及，
(3)將在第二步驟所得到的凝集體，在分化誘導因子存在下或不存在下進行懸浮培養，而得到包含網膜細胞或網膜組織之凝集體的第三步驟。
於步驟(1)，在餵養細胞不存在下，將人類多功能性幹細胞培養於包含維持未分化因子的培養基中。
作為步驟(1)的人類多功能性幹細胞，可舉出以人類人工多功能性幹細胞或人類胚胎幹細胞(ES細胞)為佳。
在這裡，人工多功能性幹細胞的製造方法並無特殊限制，可以如上述那樣以本領域技術人員眾所周知的方法製 造，但是人工多功能性幹細胞的製作步驟(即，將體細胞重新編程並建立多功能性幹細胞的步驟)最好也能在feeder free下進行。
在這裡，胚胎幹細胞(ES細胞)的製造方法並無特殊限制，可以如上述那樣以本領域技術人員眾所周知的方法製造，但是胚胎幹細胞(ES細胞)的製作步驟最好也能在feeder free下進行。
以得到用於步驟(1)的多功能性幹細胞為目的的維持培養‧擴增培養，可以如上述那樣以本領域技術人員眾所周知的方法實施。前述之多功能性幹細胞的維持培養‧擴增培養，無論貼附培養還是懸浮培養皆可實施，但以實施貼附培養為佳。前述之多功能性幹細胞的維持培養‧擴增培養步驟，可在餵養細胞存在下實施也可在feeder free下實施，以在feeder free下實施為佳。
步驟(1)中所謂餵養的細胞不存在下(feeder free)，意指實質上不含餵養細胞(例如，餵養細胞數相對於全細胞數的比例為3%以下)之條件。以在不含餵養細胞的條件下實施步驟(1)為佳。
步驟(1)中所使用的培養基，只要是在feeder free的條件下，可實現多功能性幹細胞的維持未分化培養的培養基(feeder free培養基)，即無特殊限制，但為了實現維持未分化培養，以包含維持未分化因子為宜。例如可舉出包含維持未分化因子，不含TGFβ家族信號傳導途徑抑制劑及音蝟信號傳導途徑作用物質的培養基。
維持未分化因子，只要是具有抑制多功能性幹細胞分化的作用的物質即無特殊限制。作為本領域技術人員廣泛使用的維持未分化因子，在起始態多功能性幹細胞(Primed pluripotent stem cells)(例如，人類ES細胞、人類iPs細胞)的情況，可舉出FGF信號傳導途徑作用物質、TGFβ家族信號傳導途徑作用物質、insulin等。作為FGF信號傳導途徑作用物質，具體來說可舉出纖維芽細胞增殖因子(例如，bFGF、FGF4和FGF8)。此外，作為TGFβ家族信號傳導途徑作用物質，具體來說可舉出TGFβ信號傳導途徑作用物質、Nodal/Activin信號傳導途徑作用物質。作為TGFβ信號傳導途徑作用物質，例如可舉出TGFβ1、TGFβ2。作為Nodal/Activin信號傳導途徑作用物質，例如可舉出Nodal、ActivinA、ActivinB。在培養人類多功能性幹細胞(人類ES細胞、人類iPS細胞)的情況，步驟(1)的培養基中，以包含bFGF作為維持未分化因子為佳。
本發明中使用的維持未分化因子，為普通哺乳動物的維持未分化因子。作為哺乳動物，可舉出上述之動物。維持未分化因子在哺乳動物的物種之間可能有交叉反應性，因此，雖然只要能維持培養對象多功能性幹細胞的未分化狀態，無論使用哪種哺乳動物的維持未分化因子皆可，但是以使用和培養細胞同一種哺乳動物的維持未分化因子為佳。例如，在人類多功能性幹細胞的培養中所使用的是人類維持未分化因子(例如，bFGF、FGF4、FGF8、EGF、 Nodal、ActivinA、ActivinB、TGFβ1、TGFβ2等)。這裡所謂的「人類蛋白質X」，意指蛋白質X具有在人類生物體內自然表現的蛋白質X的胺基酸序列。
本發明中所使用的維持未分化因子，以分離的為佳。所謂「分離」，意指進行去除目的成分或細胞以外的因子，脫離自然的存在狀態。因此，「被分離的蛋白質X」中，不包含從培養對象細胞或組織產生的細胞或組織以及培養基中所包含的本身的蛋白質X。「被分離的蛋白質X」的純度(蛋白質X佔總蛋白質重量的重量百分比)，通常為70%，以80%以上為佳，以90%以上為更佳，以99%以上為進一步更佳，以100%為進一步更佳。因此，在某種情況中，本發明包含提供被分離的維持未分化因子的步驟。此外，在某種情況中，包含外來地(或外因性地)將被分離的維持未分化因子添加到步驟(1)中使用的培養基中的步驟。或者，維持未分化因子也可預先被添加到步驟(1)中使用的培養基中。
步驟(1)中所使用的培養基中的維持未分化因子濃度，為可實現維持所培養的多功能性幹細胞的未分化狀態的濃度，只要是本領域技術人員即可做適當設定。例如，在餵養細胞不存在下使用bFGF作為維持未分化因子的情況，其濃度通常為4ng~500ng/mL左右、以10ng~200ng/mL為佳、以30ng/150ng/mL左右為更佳。
作為feeder free培養基，有許多被開發出來的‧市售的合成培養基，例如可舉出Essential 8培養基。Essential 8培養基，是在DEME/F12培養基中包含L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium(64mg/l)、sodium selenium(14μg/l)、insulin(19.4mg/l)、NaHCO3(543mg/l)、transferrin(10.7mg/l)、bFGF(100ng/mL)、以及TGFβ家族信號傳導途徑作用物質(TGFβ1(2ng/mL)或Nodal(100ng/mL))(Nature Methods,8,424-429(2011))作為添加劑。作為市售的feeder free培養基，例如可舉出Essential 8(Life Technologies公司製)、S-medium(DS Pharma Biomedical)、StemPro(Life Technologies公司製)、hESF9(Pro Natl Acad Sci U S A.2008 Sep 9；105(36)：13409-14)、mTeSR1(STEMCELL Technologies公司製)、mTeSR2(STEMCELL Technologies公司製)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies公司製)。而且除此之外，作為feeder free培養基，還可舉出StemFit(味之素公司製)。透過在上述步驟(1)中使用這些培養基，可以簡便地實行本發明。
進行貼附培養時所使用的培養器，只要是能「進行貼附培養」者即無特殊限制，但以細胞貼附性的培養器為佳。作為細胞貼附性的培養器，可舉出培養器表面經過以提升與細胞的貼附性為目的之人工處理的培養器，具體來說可舉出前述以塗覆劑塗覆內部的培養器。作為塗覆劑，例如可舉出層黏蛋白[包含層黏蛋白α5β1γ1(以下簡稱層黏蛋白511)、層黏蛋白α1β1γ1(以下簡稱層黏蛋白111)等及層黏蛋白片段(層黏蛋白511E8等)]、巢蛋 白、膠原蛋白、明膠、玻璃黏附蛋白(Vitronectin)、Synthemax(Corning Inc.)、Matrigel等細胞外基質等，或是聚離胺酸、聚鳥胺酸等的高分子等。而且，也可使用經過正電荷處理等表面加工的培養容器。可舉出以層黏蛋白為佳、層黏蛋白511E-8為更佳。層黏蛋白511E-8，可購得市售產品(例如：iMatrix-511,Nippi)。
步驟(1)中所使用的培養基，無論是血清培養基還是無血清培養基皆可，但是從避免化學上不確定成分混入的觀點來看，以無血清培養基為佳。
步驟(1)中所使用的培養基，從避免化學上不確定成分混入的觀點來看，也可以是含有成分為在化學上已被確定的培養基。
步驟(1)中多功能性幹細胞的培養，可以在懸浮培養及貼附培養中任何一種條件下進行，但以經由貼附培養來進行為佳。
步驟(1)中在feeder free條件下的多功能性幹細胞的培養中，可使用前述feeder free培養基作為培養基。
步驟(1)中在feeder free條件下的多功能性幹細胞的培養中，為了代替餵養細胞提供基礎給多功能性幹細胞，也可使用適合的基質作為基礎。經由作為基礎的基質，在表面塗覆的細胞容器中貼附培養多功能性幹細胞。
作為可當做基礎使用的基質，可舉出層黏蛋白(Nat Biotechonol 28,611-615(2010))、層黏蛋白片段(Nat Commun 3,1236(2012))、基底膜製劑(Nat Biotechnol 19,971-974(2001))、明膠、膠原蛋白、硫酸乙醯肝素蛋白多糖、巢蛋白、玻璃黏附蛋白(Vitronectin)等。
所謂「層黏蛋白」，為由α、β、γ鏈所形成的異三聚體分子，且為存在次單位鏈不同之同功異構型的細胞外基質蛋白質。具體來說，層黏蛋白因5種α鏈、4種β鏈及3種γ鏈的異三聚體組合而有約15種的同功異構型。層黏蛋白的名稱是以α鏈(α1~α5)、β鏈(β1~β4)及γ鏈(γ1~γ4)的各個數字的組合決定。例如α5鏈、β1鏈、γ1鏈組合的層黏蛋白稱為層黏蛋白511。本發明中，以使用層黏蛋白511為佳(Nat Biotechnol 28,611-615(2010))。
本發明中使用的層黏蛋白，為普通哺乳動物的層黏蛋白。作為哺乳動物，可舉出上述之動物。從達成無異種成分條件的觀點來看，以使用和培養細胞同一種哺乳動物的層黏蛋白為佳。例如，在人類多功能性幹細胞的培養中所使用的是人類層黏蛋白(以人類層黏蛋白511為佳)。
本發明中使用的層黏蛋白片段，只要是具有多功能性幹細胞貼附性，能實現在feeder free條件下的多功能性幹細胞維持培養者，即無特殊限制，但以E8片段為佳。層黏蛋白E8片段為，以彈性蛋白酶消化層黏蛋白511而得到的片段之中，被鑑定為具有強細胞貼附活性的片段(EMBO J.,3：1463-1468,1984,J.Cell Biol.,105：589-598,1987)。本發明中以使用層黏蛋白511的E8片段為佳(Nat Commun 3,1236(2012),Scientific Reports 4,3549 (2014))。本發明中所使用的層黏蛋白E8片段，不需要是層黏蛋白的彈性蛋白酶消化產物，也可以是重組蛋白。從避免不確定成分混入的觀點來看，本發明中以使用重組蛋白的層黏蛋白片段為佳。層黏蛋白511的E8片段有在市面上銷售，例如可自Nippi股份有限公司等購得。
本發明中所使用的層黏蛋白或層黏蛋白片段，以分離的為佳。
本發明中所謂的「基底膜製劑」，是指包含將具有基底膜形成能力之期望的細胞播種於其上進行培養時，具有類上皮細胞控制細胞形態、分化、增殖、運動、功能表現等功能之基底膜構成成分者。例如，將經由本發明所製造的神經系細胞‧神經組織分散，更進一步進行貼附培養時，可以在基底膜製劑存在下進行培養。這裡所謂的「基底膜構成成分」，是只在動物的組織中，存在於上皮細胞層和介質細胞層等之間的薄膜狀細胞外基質分子。基底膜製劑，例如可將透過基底膜貼附在支持體上的具有基底膜形成能力的細胞，用具有該細胞脂質溶解能力的溶液或鹼性溶液等將其從支持體上去除來製作。作為基底膜製劑，可舉出包含作為基底膜調配品的市售產品(例如，MatrigelTM(Corning Inc.製：以下有時也會記為Matrigel))和GeltrexTM(Life Technologies公司製)、作為基底膜成分而眾所周知的細胞外基質分子(例如，層黏蛋白、IV型膠原蛋白、硫酸乙醯肝素蛋白多糖、巢蛋白等)者。
MatrigelTM為從Engelbreth Holm Swarn(EHS)小鼠肉瘤中萃取出來的基底膜調配品。MatrigelTM的主要成分為IV型膠原蛋白、層黏蛋白、硫酸乙醯肝素蛋白多糖及巢蛋白，除此之外還包含TGFβ、FGF、組織纖維蛋白溶酶原活化因子及EHS腫瘤自然產生的增殖因子。MatrigelTM的「growth factor reduced產品」為，增殖因子的濃度比普通的MatrigelTM低，其標準濃度為EGF<0.5ng/ml、NGF<0.2ng/ml、PDGF<5pg/ml、IGF1 5ng/ml、TGFβ 1.7ng/ml。
從避免不確定成分混入的觀點來看，本發明中以使用分離的層黏蛋白或層黏蛋白片段為佳。
步驟(1)中在feeder free條件下的多功能性幹細胞的培養中，以在表面用分離的層黏蛋白511或層黏蛋白511的E8片段(以層黏蛋白511的E8片段為更佳)塗覆過的細胞容器中，進行人類多功能性幹細胞貼附培養為佳。
步驟(1)中多功能性幹細胞的培養時間，只要是在能達到提升步驟(2)中凝集體品質的效果的範圍內即無特殊限制，但是通常是0.5~144小時、以2~96小時為佳、6~48小時為更佳、12~48小時為進一步更佳、18~28小時為更進一步更佳(例如，24小時)。也就是說，在步驟(2)開始的0.5~144小時(以18~28小時為佳)前開始第一步驟，步驟(1)結束後接著進行步驟(2)。
步驟(1)中可適當地更換培養基，其中一部分的情 況是，具體來說可舉出每1~2天進行培養基更換的方法。在這裡，例如，也可進行更換培養基為不含後述之ROCK抑制劑等細胞保護劑或細胞死亡抑制劑的培養基。
步驟(1)中的培養溫度、CO2濃度等培養條件可以適當地設定。培養溫度為，舉例來說從約30℃至約40℃，以約37℃為佳。而CO2濃度為，舉例來說從約1%至約10%，以約5%為佳。
在其中一個理想的情況中，將人類多功能性幹細胞(例如，人類iPS細胞)在餵養細胞不存在下，於含有bFGF的無血清培養基中進行貼附培養。該貼附培養，以在表面塗覆了層黏蛋白511、層黏蛋白511的E8片段或玻璃黏附蛋白的細胞容器內實施為佳。該貼附培養，以使用Essential 8、TeSR培養基、mTeSR培養基、mTeSR-E8培養基、或StemFit培養基為feeder free培養基來實施為佳，以使用Essential 8或StemFit培養基為feeder free培養基來實施為更佳。
在其中一個理想的情況中，將人類多功能性幹細胞(例如，人類iPS細胞)在餵養細胞不存在下，於含有bFGF的無血清培養基中進行懸浮培養。於該懸浮培養，人類多功能性幹細胞也可以形成人類多功能性幹細胞的凝集體。
針對將於步驟(1)所得到的多功能性幹細胞，在音蝟因子信號傳導途徑作用物質存在下進行懸浮培養，使之形成多功能性幹細胞的凝集體的步驟(2)進行說明。
步驟(2)中所使用的培養基，只要是如上述定義項所揭示者即無特殊限制。步驟(2)中所使用的培養基，可以是含血清培養基或無血清培養基。從避免化學上不確定成分混入的觀點來看，本發明中適合使用無血清培養基。例如可使用沒有添加Wnt信號傳導途徑抑制劑的無血清培養基。為了避免調配時的麻煩，例如，以使用適量添加市售KSR等血清替代物的無血清培養基(例如，在IMDM與F-12的1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-硫代甘油及1 x Chemically Defined Lipid Concentrate的培養基、或是在GMEM中添加5%~20% KSR、NEAA、丙酮酸、2-巰基乙醇的培養基)為佳。作為KSR在無血清培養基中的添加量，例如在人類ES細胞的情況，通常為從約1%至約30%，以從約2%至約20%為佳。
有關凝集體的形成，首先進行步驟(1)中所得到的多功能性幹細胞的分散操作。經分散操作而得的「被分散了的細胞」，例如可舉出7成以上是單一細胞且存在3成以下2~50個細胞的團塊的狀態。作為被分散了的細胞，可舉出以8成以上是單一細胞，且存在2成以下2~50個細胞的團塊的狀態為佳。所謂被分散了的細胞，可舉出是指細胞彼此之間的貼附(例如平面貼附)幾乎消失的狀態。在其中一部分的情況，所謂被分散了的細胞，可舉出是指細胞-細胞間連接(例如，貼附連接)幾乎消失的狀態。
步驟(1)中所得到的多功能性幹細胞的分散操作， 可包含前述之機械性的分散處理、細胞分散液處理、細胞保護劑添加處理。也可將這些處理組合後進行。以在添加細胞保護劑處理的同時進行細胞分散液處理，接著進行機械性分散處理為佳。
作為用於細胞保護劑添加處理的細胞保護劑，可舉出FGF信號傳導途徑作用物質、肝素、IGF信號傳導途徑作用物質、血清、或血清替代物。此外，還可為了抑制因分散而引發的多功能性幹細胞(尤其是人類多功能性幹細胞)的細胞死亡，並保護細胞，而添加Rho-associated coiled-coil激酶(ROCK)的抑制劑或Myosin的抑制劑。為了抑制因分散而引發的多功能性幹細胞(尤其是人類多功能性幹細胞)的細胞死亡，也可以從第二步驟開始的時候添加Rho-associated coiled-coil激酶(ROCK)的抑制劑或Myosin的抑制劑。作為ROCK抑制劑，可舉出Y-27632、Fasudil(HA1077)、H-1152等。作為Myosin抑制劑，可舉出Blebbistatin。
作為用於細胞分散液處理的細胞分散液，例如可舉出含胰蛋白酶(trypsin)、膠原蛋白酶、玻尿酸酶(hyaluronidase)、彈性蛋白酶(elastase)、鏈黴蛋白酶(pronase)、DNase或木瓜酶等酵素類，和乙二胺四乙酸等螫合劑之中任何一者的溶液。也可使用市售的細胞分散液，例如TrypLE Select(Life Technologies公司製)或TrypLE Express(Life Technologies公司製)。
作為機械性分散處理的方法，可舉出吸量管處理或刮 刀刮取操作。
被分散了的細胞在上述培養基中懸浮。
然後，將被分散了的多功能性幹細胞的懸浮液播種在上述培養器中，經由將被分散了的多功能性幹細胞在對培養器非貼附性的條件下培養，而集合複數個細胞並形成凝集體。
此時，可以經由將分散了的多功能性幹細胞播種在如10cm培養皿般的較大培養器中，使複數個細胞凝集體在1個培養器中同時形成，但是一但這樣做各個凝集塊的大小就會不一致。因此，例如，在如96孔微孔板般的多孔板(U底、V底)的各個孔中放入固定數量的分散了的多功能性幹細胞，將之靜置培養，即會因細胞迅速凝集，而在各個孔中形成1個凝集體。經由從複數個孔中回收此凝集體，可得到均一凝集體的集團。
步驟(2)中多功能性幹細胞的濃度，為了更均一、更有效率地形成細胞凝集體，可以做適當設定。例如在使用96孔微孔板懸浮培養人類細胞(例如，從步驟(1)所得到的人類iPS細胞)的情況，添加使每1孔達到從約1×103個至約1×105個細胞，以約3×103個至約5×104個細胞為佳，以約4×103個至約2×104個細胞更佳，以約4×103個至約1.6×104個細胞為進一步更佳，以約8×103個至約1.2×104個細胞為更進一步更佳，那樣的調配液至孔中，靜置微孔板使之形成凝集體。
步驟(2)中的培養溫度、CO2濃度等培養條件可以 適當地設定。培養溫度為，舉例來說從約30℃至約40℃，以約37℃為佳。而CO2濃度為，舉例來說從約1%至約10%，以約5%為佳。
要在步驟(2)中，進行培養基更換操作時，例如可舉出不捨棄原有培養基並添加新培養基的操作(培養基添加操作)、捨棄約一半(原有培養基的體積量的30~90%左右，例如40~60%左右)原有培養基並添加約一半(原有培養基的體積量的30~90%左右，例如40~60%左右)新培養基的操作(半量培養基更換操作)、捨棄約全量(原有培養基的體積量的90%以上)原有培養基並添加約全量(原有培養基的體積量的90%以上)新培養基的操作(全量培養基更換操作)。
要在某個時期添加特定成分(例如，分化誘導因子)的時候，例如，也可在計算最終濃度後，進行捨棄約一半的原有培養基，加入約一半新培養基的操作(半量培養基更換操作)，其中新培養基中包含比最終濃度更高濃度(具體來說為最終濃度的1.5~3.0倍，例如最終濃度的約2倍濃度)的特定成分。
要在某個時期維持原有培養基中特定成分之濃度時，例如，也可進行捨棄約一半的原有培養基，加入約一半以與原有培養基所含濃度相同濃度之特定成分的新培養基的操作。
要在某個時期稀釋原有培養基中所含成分降低濃度時，例如，也可在1天內進行複數次培養基更換操作，以 在1小時內進行複數次(例如2~3次)為佳。此外，要在某個時期稀釋原有培養基中所含成分降低濃度時，也可將細胞或凝集體移到其他培養容器中。
培養基更換操作中使用的道具並無特殊限制，但可舉出吸量管管理器、微量吸量管(PIPETMAN)、多管微量吸量管(multichannel PIPETMAN)、連續型分注器等。例如，在以96孔微孔板為培養容器的情況，也可使用多管微量吸量管(multichannel PIPETMAN)。
使細胞凝集體形成所需要的懸浮培養時間，為了使細胞均一地凝集，可以依照使用的多功能性幹細胞適當地決定，但為了形成均一的細胞凝集體最好是盡可能短的時間。被分散了的細胞形成細胞凝集體為止的步驟，分為細胞集合的步驟，以及集合的細胞形成細胞凝集體的步驟。從播種被分散了的細胞的時期(即懸浮培養開始時)開始到細胞集合為止，例如，在人類多功能性幹細胞(例如，人類iPS細胞)的情況中，以在約24小時以內形成集合細胞為佳，以在約12小時以內形成集合細胞為更佳。從播種被分散了的細胞的時期(即懸浮培養開始時)開始到形成細胞凝集體為止的步驟，例如，在人類多功能性幹細胞(例如，人類iPS細胞)的情況中，以在約72小時以內形成凝集體為佳，以在約48小時以內形成凝集體為更佳。凝集體形成為止的時間，可經由調整使細胞凝集的用具，和離心條件等做適當的調節。
細胞凝集體的形成、及其均一性，可根據凝集體的大 小及細胞數、巨觀形態、經組織染色解析之微觀形態及其均一性、分化及未分化標記的表現及其均一性、分化標記表現的控制及其同步性、凝集體間的分化效率重現性等來判斷。
凝集體形成後，也可維持原狀繼續培養凝集體。步驟(2)中懸浮培養的時間，通常為12小時~6天左右，以12小時~48小時為佳。
用於步驟(2)的培養基，包含音蝟因子信號傳導途徑作用物質。步驟(1)中，在feeder free的條件下維持培養多功能性幹細胞，在第二步驟中，將在第一步驟中所得到的多功能性幹細胞懸浮培養於包含音蝟因子信號傳導途徑作用物質的培養基(以無血清培養基為佳)中並使凝集體形成，藉此凝集體的品質提升，並且能夠以高效率形成圓形、表面光滑、形體完整，凝集體內部緻密且維持未分化性的細胞凝集體。
所謂音蝟因子(以下有時也會記為Shh。)信號傳導途徑作用物質，是能夠增強由Shh媒介之信號傳導的物質。作為Shh信號傳導途徑作用物質，例如可舉出屬於Hedgehog家族的蛋白質(例如，Shh和Ihh)、Shh受體、Shh受體作用物質、Purmorphamine(PMA；9-環己基-N-[4-(4-嗎啉基)苯基]-2-(1-萘氧基)-9H-嘌呤-6-胺)、或SAG(Smoothened Agonist；N-甲基-N’-(3-吡啶基苯甲基)-N’-(3-氯苯[b]噻吩-2-羰基)-1,4-環己二胺等。作為Shh信號傳導途徑作用物質，例如可舉出SAG、 Purmorphamine(PMA)及Shh蛋白質(Genbank登錄號碼：NM_000193及NP_000184)為佳、可舉出SAG為更佳。培養基中的Shh信號傳導途徑作用物質的濃度，可以在能達成上述效果的範圍內適當地設定。SAG被使用時的濃度通常為1~2000nM、以10nM~1000nM為佳、以10nM~700nM、30nM~700nM、50nM~700nM為佳、以100nM~600nM為更佳、以100nM~500nM為進一步更佳。此外，要使用SAG以外的Shh信號傳導途徑作用物質時，被使用時的濃度最好是表現出與前述濃度之SAG相同的Shh信號傳導促進活性的濃度。例如，在PMA的情況，通常是0.002~20μM、以0.02~2μM為佳、以相當於約0.2μM為更佳，在Shh蛋白質的情況、通常是約10~1000ng/ml、以相當於約10~300ng/ml的濃度為佳。
也可在步驟(2)的期間，使培養基中的音蝟因子信號傳導途徑作用物質的濃度改變。例如，也可以在步驟(2)開始時，將音蝟因子信號傳導途徑作用物質設在上述範圍內，以每2~4天，減少40~60%的比例，慢慢地或階段性地使該濃度下降。
將音蝟因子信號傳導途徑作用物質添加於培養基的時間點，雖然只要是在能達成上述效果的範圍內即無特殊限制，但是越早添加效果越好。音蝟因子信號傳導途徑作用物質，是在步驟(2)開始起，通常3天以內，以2天以內為佳，以1天以內為更佳，以在步驟(2)開始時為進一步更佳，被添加至培養基。
在理想的情況中，於步驟(2)，將於步驟(1)所得到的人類多功能性幹細胞(例如，人類iPS細胞)，在含音蝟因子信號傳導途徑作用物質(例如，SAG、Shh蛋白質、PMA)的無血清培養基中進行懸浮培養，並形成凝集體。音蝟因子信號傳導途徑作用物質，以從開始懸浮培養起就被包含於培養基中為佳。培養基中也可添加ROCK抑制劑(例如，Y-27632)。培養時間為12小時~6天，以12小時~48小時為佳。所形成的凝集體，以均一的凝集體為佳。
例如，回收於步驟(1)所得到的人類多功能性幹細胞(例如，人類iPS細胞)，將之分散成單一細胞或接近單一細胞的狀態，懸浮於含音蝟因子信號傳導途徑作用物質(例如，SAG、Shh蛋白質、PMA)的無血清培養基中，進行懸浮培養。該無血清培養基，也可包含ROCK抑制劑(例如，Y-27632)。將人類多功能性幹細胞(例如，iPS細胞)的懸浮液播種在上述培養器中，經由將被分散了的多功能性幹細胞在對培養器非貼附性的條件下培養，而集合複數個多功能性幹細胞並形成凝集體。培養時間為12小時~6天，以12小時~48小時為佳。所形成的凝集體，以均一的凝集體為佳。
經由像這樣實施步驟(2)，即形成於步驟(1)所得到的多功能性幹細胞，或源於此多功能性幹細胞的細胞的凝集體。本發明也提供像這樣的凝集體的製造方法。於步驟(2)所得到的凝集體，於步驟(2)中，與不經過音蝟 因子信號傳導途徑作用物質處理時相比，有更好的品質。具體來說，可得到圓形、表面光滑、凝集體內部緻密、形體完整的凝集體占大部分的凝集體集團。在某種情況中，在從第二步驟開始起第6天隨意地選出凝集體(例如，100個以上)時，形體完整凝集體的比例及/或沒有囊腫化的凝集體比例的和，例如為30%以上，以50%以上為佳。
於步驟(2)所得到的凝集體，具有往各種分化細胞和分化組織分化的能力。在某種情況中，於步驟(2)所得到的凝集體，具有往神經系細胞(例如，網膜細胞)和神經組織(例如，網膜組織)分化的能力。在某種情況中，經由將於步驟(1)所得到的至少具有往神經系細胞和神經組織(以網膜組織、網膜前驅細胞、或網膜層特異性神經細胞為佳)分化的能力的幹細胞(以至少具有往神經細細胞和神經組織(以網膜組織、網膜前驅細胞、或網膜層特異性神經細胞為佳)分化的能力的Oct3/4陽性的幹細胞為佳)用在步驟(2)，就能夠得到包含至少具有往神經系細胞和神經組織(以網膜組織、網膜前驅細胞、或網膜層特異性神經細胞為佳)分化的能力的幹細胞(例如，Oct3/4陽性幹細胞)的凝集體。於步驟(2)所得到的凝集體，經由在適當的分化條件下培養該凝集體，能夠以高效率誘導各種分化細胞和分化組織(例如，網膜細胞等的神經系細胞、網膜組織等神經組織)。
在某種情況中，於步驟(2)所得到的凝集體中，包含介於於步驟(1)所得到的多功能性幹細胞，與神經系 細胞和神經組織(以網膜細胞或網膜組織為佳)之間的，相當於中間階段細胞的細胞。該細胞會表現多功能性性質標記Oct3/4、外胚層標記(Sox1,Sox2,N-cadherin,TP63)、神經外胚層標記(Sox1,Sox2,Nestin,N-cadherin,Otx2)、前述神經系細胞標記中的任何一種。也就是說，在某種情況中，於步驟(2)所得到的凝集體中，包含表現多功能性性質標記Oct3/4、外胚層標記(Sox1,Sox2,N-cadherin,TP63)、神經外胚層標記(Sox1,Sox2,Nestin,N-cadherin,Otx2)、前述神經系細胞標記中任何一種的細胞的混合物。也就是說，於步驟(2)所得到的凝集體中，包含至少具有往神經系細胞或神經組織(以網膜細胞或網膜組織為佳)分化的能力的幹細胞，及/或神經系細胞或神經組織(以網膜細胞或網膜組織為佳)的前驅細胞。此外，若是以眾所周知的適當培養條件進行培養，該前驅細胞的特徵是具有表現前述神經系細胞標記(以網膜標記為佳)的能力(competence)。因此，在某種情況中，於步驟(2)所得到的凝集體包含Oct3/4陽性的，至少具有往神經系細胞或神經組織(以網膜細胞或網膜組織為佳)分化的能力的幹細胞，及/或神經系細胞或神經組織(以網膜細胞或網膜組織為佳)的前驅細胞。被包含於於步驟(2)所得到凝集體中的細胞之中的一部分，也可表現上述神經組織標記。在某種情況中，於步驟(2)所得到的凝集體，全體細胞中Oct3/4陽性的比例為50%以上，例如也可以包含70%以上。
要在步驟(2)中，進行培養基更換操作時，例如可舉出不捨棄原有培養基並添加新培養基的操作(培養基添加操作)、捨棄約一半(原有培養基的體積量的30~90%左右，例如40~60%左右)原有培養基並添加約一半(原有培養基的體積量的30~90%左右，例如40~60%左右)新培養基的操作(半量培養基更換操作)、捨棄約全量(原有培養基的體積量的90%以上)原有培養基並添加約全量(原有培養基的體積量的90%以上)新培養基的操作(全量培養基更換操作)。
要在某個時期添加特定成分(例如，分化誘導因子)的時候，例如，也可在計算最終濃度後，進行捨棄約一半的原有培養基，加入約一半新培養基的操作(半量培養基更換操作)，其中新培養基中包含比最終濃度更高濃度(具體來說為最終濃度的1.5~3.0倍，例如最終濃度的約2倍濃度)的特定成分。
要在某個時期維持原有培養基中特定成分之濃度時，例如，也可進行捨棄約一半的原有培養基，加入約一半以與原有培養基所含濃度相同濃度之特定成分的新培養基的操作。
要在某個時期稀釋原有培養基中所含成分降低濃度時，例如，也可在1天內進行複數次培養基更換操作，以在1小時內進行複數次(例如2~3次)為佳。此外，要在某個時期稀釋原有培養基中所含成分降低濃度時，也可將細胞或凝集體移到其他培養容器中。
培養基更換操作中使用的道具並無特殊限制，但可舉出吸量管管理器、微量吸量管(PIPETMAN)、多管微量吸量管(multichannel PIPETMAN)、連續型分注器等。例如，在以96孔微孔板為培養容器的情況，也可使用多管微量吸量管(multichannel PIPETMAN)。
針對從於步驟(2)所得到的凝集體誘導包含網膜細胞或網膜組織的凝集體的步驟(3)進行說明。
將於步驟(2)所得到的凝集體，在適當的分化誘導因子的存在下或不存在下(以存在下為佳)進行懸浮培養，可得到包含網膜細胞或網膜組織的凝集體。
作為經由懸浮培養細胞凝集體來誘導網膜細胞或網膜組織的方法，有許多的方法被報告出來。已知有例如被揭示於Nature,472,51-56(2011)、Cell Stem Cell,10(6),771-775(2012)等的方法，但並不限於此等。
作為在分化誘導因子不存在下製造網膜細胞或網膜組織的方法，例如可舉出，將於步驟(2)所得到的凝集體，在血清培養基或無血清培養基中，誘導自發性地往包含網膜細胞的神經系細胞分化的方法。作為前述血清培養基或無血清培養基，可舉出不含維持未分化因子的血清培養基或無血清培養基。也可篩選‧分離在往神經系細胞分化的過程中生成的網膜細胞。篩選‧分離可採用FACS或MAGS。此外，作為步驟(1)的起始原料，也可使用容易製造網膜的多功能性幹細胞。
以將於步驟(2)所得到的凝集體，在適當的分化誘 導因子的存在下進行懸浮培養，得到包含網膜細胞或網膜組織的凝集體為佳。
在這裡被使用的分化誘導因子，只要是具有誘導網膜細胞或網膜組織分化的活性的因子即無特殊限制，但例如可舉出BMP信號傳導途徑作用物質、基底膜製劑、Wnt信號傳導途徑抑制劑、TGFβ家族信號傳導途徑抑制劑等。依照細胞種類和分化狀態(competence或potential)不同，對分化誘導因子的反應也不同，分化誘導的過程中也一樣依照分化誘導因子的濃度和添加時期的不同分化誘導因子的效果有時也會不同。此外，已知達到相同效果的分化誘導因子最適濃度會因動物種類而不同，例如已知一般來說小鼠細胞和人類細胞中，人類細胞的最適濃度較高(尤其是在外胚層、內胚層)。從多功能性幹細胞往特定細胞或組織分化誘導的方法有許多被報告出來，可選擇適合目的細胞或組織之分化誘導因子或分化誘導方法。
以使用BMP信號傳導途徑作用物質作為分化誘導因子為佳。也就是說，將於步驟(2)所得到的凝集體，在BMP信號傳導途徑作用物質存在下進行懸浮培養，得到包含網膜細胞或網膜組織的凝集體。
所謂BMP信號傳導途徑作用物質，是能夠增強由BMP媒介之信號傳導途徑的物質。作為BMP信號傳導途徑作用物質，例如可舉出BMP2、BMP4或BMP7等的BMP蛋白、GDF7等的GDF蛋白、抗BMP受體抗體、或BMP部分肽等。BMP2蛋白、BMP4蛋白及BMP7蛋白例 如可自R&D Systems取得，GDF7蛋白例如可自Wako Pure Chemical Industries,Ltd.(和光純藥)取得。BMP信號傳導途徑作用物質，以BMP4為佳。
本發明中使用的分化誘導因子(例如，BMP4)，為普通哺乳動物的分化誘導因子。作為哺乳動物，可舉出上述之動物。分化誘導因子在哺乳動物的物種之間可能有交叉反應性，因此，雖然只要能實現培養對象的多功能性幹細胞的分化誘導，無論使用哪種哺乳動物的未分化誘導因子皆可，但是以使用和培養細胞同一種哺乳動物的分化誘導因子為佳。例如，要誘導人類多功能性幹細胞往網膜組織或網膜細胞的分化時，適合使用人類的分化誘導因子(例如，BMP4)。
本發明中使用的分化誘導因子(例如，BMP4)，以分離的為佳。因此，在某種情況中，本發明包含提供被分離的分化誘導因子(例如，BMP4)的步驟。此外，在某種情況中，包含外因性地將被分離的分化誘導因子(例如，BMP4)添加到步驟(3)中使用的培養基中的步驟。
在某種情況中，用於步驟(3)中的培養基為添加了分化誘導因子(例如，BMP4)的無血清培養基或血清培養基(以無血清培養基為佳)。該培養基中可添加、也可不添加基底膜製劑。作為基底膜製劑，可使用上述之基底膜製劑。添加基底膜製劑時的濃度，例如，在使用Matrigel的情況，以體積濃度計算為0.1~10%，以0.5%至2%為更佳。從避免化學上不確定成分混入的觀點來看， 不添加基底膜製劑。
用於該培養基的無血清培養基或血清培養基，只要是如上述那樣者即無特殊限制。為了避免調配時的麻煩，例如，以使用適量添加市售KSR等血清替代物的無血清培養基(例如，在IMDM與F-12的1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-硫代甘油及1 x Chemically Defined Lipid Concentrate的培養基、或是在GMEM中添加5%~20% KSR、NEAA、丙酮酸、2-巰基乙醇的培養基)為佳。作為KSR在無血清培養基中的添加量，例如在人類ES細胞的情況，通常為從約1%至約20%，以從約2%至約20%為佳。
用於步驟(3)的培養基(以無血清培養基為佳)，可直接使用在步驟(2)使用的培養基(以無血清培養基為佳)，也可替換成新的培養基(以無血清培養基為佳)。要將步驟(2)中使用的，不含分化誘導因子(例如，BMP4)的無血清培養基直接用在步驟(3)時，在培養基中添加分化誘導因子(例如，BMP4)即可。
在某種情況中，若是在步驟(2)添加Shh信號傳導途徑作用物質至培養基中的濃度為相對低濃度(例如，SAG為700nM以下，其他的Shh信號傳導途徑作用物質為表現出與前述濃度之SAG同等以下的Shh信號傳導途徑作用活性的濃度)時，沒有進行培養基更換的必要，在步驟(2)中使用的培養基中添加分化誘導因子(例如，BMP4)即可。另一方面，若是Shh信號傳導途徑作用物 質的濃度為相對高濃度(例如，SAG為超過700nM，或是1000nM以上，其他的Shh信號傳導途徑作用物質為表現出與前述濃度之SAG同等的Shh信號傳導途徑作用活性的濃度)時，添加分化誘導因子時為了抑制殘存的Shh信號傳導途徑作用物質的影響，最好更換成包含分化誘導因子(例如，BMP4)的新鮮培養基。
在理想的情況中，步驟(3)中所使用的培養基中的Shh信號傳導途徑作用物質濃度以SAG的Shh信號傳導途徑作用活性換算，為700nM以下、以300nM以下為佳、以10nM以下為更佳，以0.1nM以下為進一步更佳，以不含Shh信號傳導途徑作用物質為進一步更佳。在「不含Shh信號傳導途徑作用物質」的培養基中，也包含實質上不含Shh信號傳導途徑作用物質的培養基，例如也包括不含其濃度為會造成對往網膜細胞及網膜組織的選擇性分化有不利影響的程度之Shh信號傳導途徑作用物質的培養基。在「沒有被添加Shh信號傳導途徑作用物質」的培養基中，也包含實質上沒有被添加Shh信號傳導途徑作用物質的培養基，例如也包括沒有被添加其濃度為會造成對往網膜細胞及網膜組織的選擇性分化有不利影響的程度之Shh信號傳導途徑作用物質的培養基。
培養基中的分化誘導因子(例如，BMP信號傳導途徑作用物質)的濃度為，只要是能誘導多功能性幹細胞或源於多功能性幹細胞的細胞凝集體往網膜細胞分化的濃度即可。例如在人類BMP4的情況為從約0.01nM至約 1μM、以從約0.1nM至約100nM為佳、以從約1nM至約10nM為更佳、以濃度達到約1.5nM(55ng/mL)那樣地添加至培養基中為進一步更佳。要使用BMP4以外的BMP信號傳導途徑作用物質時，被使用時的濃度最好是表現出與上述BMP4之濃度同等的BMP信號傳導途徑作用活性的濃度。
也可在步驟(3)的期間，使培養基中的分化誘導因子(例如，BMP4)的濃度改變。例如，也可以在步驟(3)開始時，將分化誘導因子(例如，BMP4)的濃度設在上述範圍內，以每2~4天，減少40~60%的比例，慢慢地或階段性地使該濃度下降。
分化誘導因子(例如，BMP4)，在步驟(2)的懸浮培養開始起約24小時以後被添加即可，也可以在懸浮培養開始後幾天之內(例如，15天以內)添加於培養基中。以從懸浮培養開始後第1天開始至第15天為止的期間內將分化誘導因子(例如，BMP4)添加於培養基中為佳，以第1天開始至第9天為止的期間內為更佳，以第3天開始至第8天為止的期間內為進一步更佳，以第3天開始至第6天為止的期間內為更進一步更佳。
在分化誘導因子(例如，BMP4)被添加於培養基中，且凝集體往網膜細胞的分化誘導開始後，就沒有將分化誘導因子(例如，BMP4)添加於培養基中的必要，可以使用不含分化誘導因子(例如，BMP4)之無血清培養基或血清培養基之進行培養基更換。在其中一個情況中， 在凝集體往神經系細胞的分化誘導開始後，以不含分化誘導因子(例如，BMP4)的無血清培養基或血清培養基進行培養基更換，藉此可以將培養基中的分化誘導因子(例如，BMP4)的濃度，以每2~4天，減少40~60%的比例，慢慢地或階段性地降低。藉此，可階段性的稀釋分化誘導因子(例如，BMP4)的濃度，而且可以限定分化誘導因子的效果‧作用時間。
作為具體的情況，可在懸浮培養開始用(也就是前述步驟(2)開始後)第1~9天、以第2~8天為佳、以第3或4天為更佳，將一部分或全部的培養基更換成包含BMP4的培養基，將BMP4的最終濃度調配至約1~10nM，並且在BMP4存在下培養1~12天、以培養2~9天為佳、以培養2~5天為更佳。在這裡，應該將BMP4的濃度維持在同一濃度，可將一部分或全部的培養基更換成包含BMP4的培養基1或2次左右。而且也可如前述那樣，階段性地減低BMP4的濃度。
開始往網膜細胞的分化誘導的細胞，例如，可經由檢測該細胞中網膜前驅細胞標記基因(例如，Rx基因(別名Rax)、Pax6基因、Chx10基因)的表現來確認。還可以在往網膜細胞分化誘導所需濃度之分化誘導因子(例如，BMP4)存在下，懸浮培養GFP等螢光報告蛋白質基因插入(knock-in)Rx基因座(locus)之多功能性幹細胞經由步驟(2)所形成的凝集體，並且經由檢測表現出來的螢光報告蛋白質所發出的螢光，來確認往網膜細胞的 分化誘導開始的時期。作為步驟(3)的一個實施情況，可舉出在表現網膜前驅細胞標記基因(例如，Rx基因、Pax6基因、Chx10基因)的細胞開始出現為止的期間內，將於步驟(2)所形成的凝集體懸浮培養在包含往網膜細胞分化誘導所需濃度之分化誘導因子(例如，BMP4)之無血清培養基或血清培養基中，得到包含網膜前驅細胞之凝集體的步驟。
步驟(3)中，要進行培養基更換操作時，例如可舉出前述之培養基添加操作、半量培養基更換操作、全量培養基更換操作。
要在某個時期添加特定成分(例如，分化誘導因子)的時候，例如，也可在計算最終濃度後，進行捨棄約一半的原有培養基，加入約一半新培養基的操作(半量培養基更換操作)，其中新培養基中包含比最終濃度更高濃度(具體來說為最終濃度的1.5~3.0倍，例如最終濃度的約2倍濃度)的特定成分。
要在某個時期維持原有培養基中特定成分之濃度時，例如，也可進行捨棄約一半的原有培養基，加入約一半與原有培養基所含濃度相同濃度之特定成分的新培養基的操作。
要在某個時期稀釋原有培養基中所含成分降低濃度時，例如，也可在1天內進行複數次培養基更換操作，以在1小時內進行複數次(例如2~3次)為佳。此外，要在某個時期稀釋原有培養基中所含成分降低濃度時，也可將 細胞或凝集體移到其他培養容器中。
培養基更換操作中使用的道具並無特殊限制，但可舉出吸量管管理器、微量吸量管(PIPETMAN)、多管微量吸量管(multichannel PIPETMAN)、連續型分注器等。例如，在以96孔微孔板為培養容器的情況，也可使用多管微量吸量管(multichannel PIPETMAN)。
步驟(3)中的培養溫度、CO2濃度等培養條件可以適當地設定。培養溫度為，舉例來說從約30℃至約40℃，以37℃為佳。而CO2濃度為，舉例來說從約1%至約10%，以約5%為佳。
經由該培養，形成步驟(2)所得到的凝集體的細胞往網膜前驅細胞的分化被誘導，可以得到包含網膜前驅細胞的凝集體。本發明也提供像這樣的包含網膜前驅細胞之凝集體的製造方法。包含網膜前驅細胞之凝集體的獲得，例如可經由檢測凝集體內包含表現網膜前驅細胞標記基因Rx、PAX6或Chx10的細胞來確認。作為步驟(3)的一個實施情況，可舉出在表現Rx基因的細胞開始出現為止的期間內，將於步驟(2)所形成的凝集體培養在包含往網膜細胞分化誘導所需濃度之BMP信號傳導途徑作用物質(例如，BMP4)之無血清培養基或血清培養基中，得到包含網膜前驅細胞之凝集體的步驟。在某種情況中，實施步驟(3)的培養，直到凝集體中所含細胞的20%以上(以30%以上、40%以上、50%以上、60%以上為佳)處於表現Rx的狀態為止。
所得到的包含網膜前驅細胞之凝集體，可以直接當作毒性‧藥效評價用試劑使用。將包含網膜前驅細胞之凝集體進行分散處理(例如，胰蛋白酶/EDTA處理或木瓜酶處理)，將所得到的細胞以FACS或MACS篩選，藉此可得到高純度的網膜前驅細胞。
更進一步，經由將包含網膜組織的凝集體繼續培養在無血清培養基或血清培養基中，可更進一步使被包含在網膜組織中的網膜細胞(例如，網膜前驅細胞)分化，並製造神經上皮細胞結構樣的網膜組織。
用於該培養基的無血清培養基或血清培養基，只要是如上述那樣者即無特殊限制。例如可舉出在DMEM-F12培養基中添加10%牛胎兒血清、N2補充劑、100μM牛磺酸、500nM視黃酸的血清培養基，或是適量添加市售KSR等血清替代物的無血清培養基(例如，在IMDM與F-12的1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-硫代甘油及1 x Chemically Defined Lipid Concentrate的培養基)等。
從網膜前驅細胞誘導網膜組織時的培養時間，雖然依照做為目的的網膜層特異性神經細胞而有所不同，但例如是從約7天至約200天。
網膜組織是像覆蓋凝集體表面那樣存在。懸浮培養結束後，用聚甲醛溶液等固定液固定，製作冷凍切片後，以免疫染色法等確認形成具有層狀結構的網膜組織即可。因構成網膜組織各層的細胞(視細胞、水平細胞、雙極細胞、無軸突細胞、網膜神經節細胞)各不相同，可以使用 針對在這些細胞中表現之上述標記的抗體，透過免疫染色法，確認層狀結構正在形成。在某種情況中，網膜組織為Rx或Chx10陽性的神經上皮結構。
也可用鑷子等，將存在於凝集體表面的網膜組織物理性地從凝集體分割出來。這個時候，因為各凝集體的表面也會有形成網膜組織以外的神經組織的情況，所以可以經由切取一部分從凝集體被分割出來的神經組織，將此用來以後述的免疫染色法等確認，藉此確認該組織為網膜組織。
在某種情況中，步驟(3)所得到的凝集體包含網膜組織而實質上不包含頭部非神經外胚層。在實質上不包含頭部非神經外胚層的凝集體中，例如，在上述之凝集體冷凍切片的免疫染色像中，Rx陽性的組織會被觀察到，在其外側的Rx陰性的組織不會被觀察到。
作為步驟(3)的一個實施情況，可舉出在表現Rx基因的細胞開始出現為止的期間內，將於步驟(2)所形成的凝集體培養在包含往網膜細胞分化誘導所需濃度之BMP信號傳導途徑作用物質之無血清培養基或血清培養基中，得到包含網膜前驅細胞之凝集體，並且繼續在無血清培養基或血清培養基中懸浮培養該包含網膜前驅細胞之凝集體直到網膜組織形成為止，得到包含網膜組織之凝集體的步驟。繼續在無血清培養基或血清培養基中懸浮培養包含網膜前驅細胞之凝集體直到網膜組織形成為止時，可經由以不含BMP信號傳導途徑作用物質之無血清培養基 或血清培養基的培養基更換，將為了誘導網膜前驅細胞而被包含在培養基中的BMP信號傳導途徑作用物質濃度，以每2~4天，減少40~60%的比例，慢慢地或階段性降低。在某種情況中，實施包含網膜前驅細胞之凝集體的懸浮培養，直到凝集體中所含細胞的20%以上(以30%以上、40%以上、50%以上、60%以上為佳)處於表現Chx10的狀態為止。
此外，作為步驟(3)的一個實施情況，也可以將在步驟(2)所得到的凝集體，或是將在步驟(2)所得到的凝集體依照上述方法懸浮培養的凝集體，進行貼附培養，使之形成貼附凝集體。在表現Rx基因的細胞開始出現為止的期間內，將該貼附凝集體貼附培養在包含往網膜細胞分化誘導所需濃度之分化誘導因子(例如，BMP4)之無血清培養基或血清培養基中，得到包含網膜前驅細胞之貼附凝集體。繼續在無血清培養基或血清培養基中貼附培養該包含網膜前驅細胞之凝集體直到網膜組織形成為止，並得到包含網膜組織之貼附凝集體。在某種情況中，實施包含網膜前驅細胞之貼附凝集體的貼附培養，直到凝集體中所含細胞的10%以上(以20%以上、30%以上、40%以上、50%以上為佳)處於表現Chx10的狀態為止。
經由本發明之方法，能夠以高效率從多功能性幹細胞得到網膜細胞及網膜組織。因為以本發明之方法所得到的網膜組織中，包含網膜層各種特異性神經元(神經細胞)，所以可得到視細胞、水平細胞、雙極細胞、無軸突 細胞、網膜神經節細胞、或此等的前驅細胞等構成網膜組織之各種細胞。從所得到的網膜組織得到的細胞是哪種細胞，可以用本身已知的方法，例如透過細胞標記的表現來確認。
所得到的包含網膜組織之凝集體，可以直接當作毒性‧藥效評價用試劑使用。將包含網膜組織之凝集體進行分散處理(例如，胰蛋白酶/EDTA處理)，將所得到的細胞以FACS或MACS篩選，藉此可得到高純度的網膜組織構成細胞，例如高純度的視細胞。
經由下述步驟(A)及步驟(B)，可從以本發明之製造方法所得到的包含網膜組織之細胞凝集體，製造睫狀體邊緣區樣結構體。
所謂的「睫狀體邊緣區樣結構體」，是指類似睫狀體邊緣區的結構體。作為「睫狀體邊緣區(ciliary marginal zone；CMZ)」，例如可舉出，生物體網膜中存在於網膜組織(具體來說，神經網膜)與網膜色素上皮的邊界區域內的組織，而且是包含網膜的組織幹細胞(網膜幹細胞)的區域。睫狀體邊緣區也稱為，睫緣(ciliary margin)或網膜緣(retinal margin)，睫狀體邊緣區、睫緣及網膜緣是同等的組織。已知睫狀體邊緣區在對網膜組織供給網膜前驅細胞和分化細胞還有網膜組織結構的維持等發揮重要的作用。作為睫狀體邊緣區的標記基因，例如可舉出Rdh10基因(陽性)及Otx1基因(陽性)及Zix1基因(陽性)。
首先，作為步驟(A)，將以本發明之製造方法所得到的包含網膜組織之細胞凝集體，且前述網膜組織中Chx10陽性細胞的存在比例為20%以上100%以下之細胞凝集體，僅在直到表現RPE65基因的細胞出現為止的期間內，在包含Wnt信號傳導途徑作用物質及/或FGF信號傳導途徑抑制劑的無血清培養基或血清培養基中培養。
在這裡，作為步驟(A)的理想培養方式，可舉出懸浮培養。
作為步驟(A)中使用的無血清培養基，可舉出在基礎培養基中添加N2或KSR的無血清培養基，更具體地來說，可舉出在DMEM/F12培養基中添加N2 supplement(N2,Life Technologies公司製)的無血清培養基。作為血清培養基，例如可舉出在基礎培養基中添加牛胎兒血清的血清培養基。
步驟(A)中的培養溫度、CO2濃度等培養條件可以適當地設定。作為培養溫度，例如可舉出從約30℃至約40℃的範圍。例如可舉出，以約37℃左右為佳。而作為CO2濃度，例如可舉出從約1%至約10%的範圍。例如可舉出，以約5%左右為佳。
步驟(A)中，將上述「包含網膜組織之細胞凝集體」培養在無血清培養基或血清培養基中時，作為被包含在該培養基中的Wnt信號傳導途徑作用物質，只要是能夠增強由Wnt媒介之信號傳導者即無特殊限制。作為具體的Wnt信號傳導途徑作用物質，例如可舉出屬於Wnt家族的 蛋白質(例如，Wnt1、Wnt3a、Wnt7a)、Wnt受體、Wnt受體作用物質、GSK3抑制劑(例如，6-Bromoindirubin-3’-oxime(BIO)、CHIR99021、Kenpaullone)等。
作為步驟(A)的無血清培養基或血清培養基所含的Wnt信號傳導途徑作用物質的濃度，在CHIR99021等普通的Wnt信號傳導途徑作用物質的情況中，例如可舉出從約0.1μM至約100μM的範圍。例如可舉出，以從約1μM至約30μM的範圍為佳。例如可舉出，以3μM左右的濃度為更佳。
步驟(A)的將上述「包含網膜組織之細胞凝集體」培養在無血清培養基或血清培養基中時，作為被包含在該培養基中的FGF信號傳導途徑抑制劑，只要是能夠抑制由FGF媒介之信號傳導者即無特殊限制。作為FGF信號傳導途徑抑制劑，例如可舉出FGF受體、FGF受體抑制劑(例如，SU-5402、AZD4547、BGJ398)、MAP激酶級聯反應抑制物質(例如，MEK抑制劑、MAPK抑制劑、ERK抑制劑)、PI3激酶抑制劑、Akt抑制劑等。
步驟(A)的無血清培養基或血清培養基所含的FGF信號傳導途徑抑制劑的濃度，只要是能誘導凝集體往睫狀體邊緣區樣結構體分化的濃度即可。例如在SU-5402的情況，以從約0.1μM至約100μM的濃度添加，以從約1μM至約30μM的濃度添加為佳，以約5μM的濃度添加為更佳。
步驟(A)中所謂進行「僅在直到表現RPE65基因的 細胞出現為止的期間內，培養」，意指僅在直到表現RPE65基因的細胞出現為止的整個或其中一部分期間內進行培養。也就是說，僅在存在於培養系統中的前述「包含網膜組織之細胞凝集體」是由實質上不表現RPE65基因的細胞所構成的整個或其中一部分期間(任意期間)內培養即可，經由採行這樣的培養，可以得到不出現表現RPE65基因之細胞的細胞凝集體。
為了設定這樣的特定期間，以前述「包含網膜組織之細胞凝集體」為試劑，用普通基因工程的手法或生化學的手法來測定該試劑中所包含之RPE65基因表現的有無或其程度即可。具體來說，例如可以使用針對RPE65蛋白質的抗體，將前述「包含網膜組織之細胞凝集體」的冷凍切片透過免疫染色法調查RPE65基因表現的有無或其程度。
作為步驟(A)的「直到表現RPE65基因的細胞出現為止的期間」，例如可舉出，前述網膜組織中Chx陽性細胞的存在比例，和前述細胞凝集體在包含Wnt信號傳導途徑作用物質及/或FGF信號傳導途徑抑制劑之無血清培養基或血清培養基中的培養開始時相比減少，變成處於從30%至0%的範圍內為止的期間。作為「不出現表現RPE65基因之細胞的細胞凝集體」，可舉出前述網膜組織中Chx陽性細胞的存在比例為從30%至0%的範圍內的細胞凝集體。
步驟(A)的「直到表現RPE65基因的細胞出現為止 的期間」的天數會按照Wnt信號傳導途徑作用物質及/或FGF信號傳導途徑抑制劑的種類、無血清培養基或血清培養基的種類、其他培養條件等而變化，但例如可舉出14天以內。更具體地來說，在使用無血清培養基(例如，在基礎培養基中添加N2的無血清培養基)的情況，作為前述期間，例如可舉出以10天以內為佳，例如可舉出以從3天至6天為更佳。在使用血清培養基(例如，在基礎培養基中添加牛胎兒血清的血清培養基)的情況，作為前述期間，例如可舉出以12天以內為佳，例如可舉出以從6天至9天為更佳。
接下來，作為步驟(B)，要將如上述那樣培養所得到的「不出現表現RPE65基因之細胞的細胞凝集體」，培養在不含Wnt信號傳導途徑作用物質的無血清培養基中或血清培養基。
作為步驟(B)的理想培養方式，例如可舉出懸浮培養。
作為步驟(B)的無血清培養基，可舉出在基礎培養基中添加N2或KSR的培養基。作為血清培養基，例如可舉出在基礎培養基中添加牛胎兒血清的培養基，更具體地來說，可舉出在DMEM/F12培養基中添加牛胎兒血清的血清培養基。
也可在步驟(B)的前述無血清培養基或血清培養基中，添加已知的增殖因子、促進增殖的添加劑或化學物質等。作為已知的增殖因子，可舉出EGF、FGF、IGF、 insulin等。作為促進增殖的添加劑，可舉出N2 supplement(Life Technologies公司製)、B27 supplement(Life Technologies公司製)、KSR等。作為促進增殖的化學物質，可舉出類視色素類(例如，視黃酸)、牛磺酸。
作為步驟(B)的理想培養時間，例如可舉出，前述網膜組織中Chx10陽性細胞的存在比例，和前述細胞凝集體在不含Wnt信號傳導途徑作用物質之無血清培養基或血清培養基中的培養開始時相比增加，變成30%以上內為止的培養時間。
步驟(B)中的培養溫度、CO2濃度等培養條件可以適當地設定。作為培養溫度，例如可舉出從約30℃至約40℃的範圍。可舉例以約37℃左右為佳。而CO2濃度為，例如可舉出從約1%至約10%的範圍，例如可舉出以約5%左右為佳。
步驟(B)直到能夠取得「包含睫狀體邊緣區樣結構體之細胞凝集體」為止的上述培養天數會按照無血清培養基或血清培養基的種類、其他培養條件等而變化，但例如可舉出100天以內。作為前述培養天數，例如可舉出以從20天至70天為佳，例如可舉出以從30天至60天為更佳。
經由上述步驟(A)、(B)所調配的「包含睫狀體邊緣區樣結構體之細胞凝集體」中，分別與睫狀體邊緣區樣結構毗連的網膜色素上皮與網膜組織(具體來說，神經 網膜)存在於同一個細胞凝集體內。有關該結構可用顯微鏡觀察等來確認。具體來說，例如可透過顯微鏡觀察，從透明度高的網膜組織，確認在與可看到色素沉澱的網膜色素上皮之間所形成的，作為網膜側厚而網膜色素上皮側薄之上皮結構的睫狀體邊緣區樣結構體的存在。此外，藉由凝集體的冷凍切片的免疫染色，作為Rdh10陽性、Otx1陽性、或Zic1陽性，可確認睫狀體邊緣區樣結構體的存在。
可從以本發明之製造方法等所得到的包含網膜組織之細胞凝集體，經由下述步驟(C)來製造網膜色素上皮細胞。可以從下述步驟(C)所得到的網膜色素上皮細胞，經由下述步驟(D)來製造網膜色素上皮薄片。
本發明中所謂的「網膜色素上皮細胞」意指存在於生物體網膜中神經網膜組織外側的上皮細胞。只要是本領域技術人員，即可經由例如細胞標記(RPE65(成熟網膜色素上皮細胞)、Mitf(新生或成熟的網膜色素上皮細胞)等)的表現、黑色素顆粒的存在、多角形的特殊細胞形態等來確認是否為網膜色素上皮細胞。
首先，作為步驟(C)，將在本發明之製造方法(2)所得到的包含網膜組織之細胞凝集體，在不含BMP信號傳導途徑作用物質且包含Wnt信號傳導途徑作用物質之無血清培養基或血清培養基中進行懸浮培養，得到包含網膜色素上皮細胞的凝集體。
作為步驟(C)中使用的無血清培養基，可舉出在基 礎培養基中添加N2或KSR的無血清培養基，更具體地來說，可舉出在DMEM/F12培養基中添加N2 supplement(Life Technologies公司)的無血清培養基。作為血清培養基，可舉出在基礎培養基中添加牛胎兒血清的血清培養基。
在步驟(C)中使用的無血清培養基中，除了前述之Wnt信號傳導途徑作用物質，還可包含前述之Nodal/Activin信號傳導途徑作用物質，及/或，前述之FGF信號傳導途徑抑制劑。
在這裡，作為步驟(C)的理想培養方式，可舉出懸浮培養。
接下來，針對將於步驟(C)所得到的凝集體分散，將所得到的細胞進行貼附培養的步驟(D)進行說明。
步驟(D)在步驟(C)的實施開始起60天以內實施，以在30天以內實施為佳，以在3天後實施為更佳。
作為用於步驟(D)中貼附培養的無血清培養基或血清培養基，可舉出如上述那樣的培養基。為了避免調配時的麻煩，以使用適量添加市售KSR等血清替代物的無血清培養基(例如，在DMEM/F-12與Neurobasal的1：1混合液中添加1/2×N2補充劑、1/2×B27補充劑及100μM 2-巰基乙醇的培養基)為佳。作為KSR在無血清培養基中的添加量，例如在源自人類iPS細胞的細胞的情況，通常為從約1%至約20%，以從約2%至約20%為佳。
步驟(D)中，以在包含前述之ROCK抑制劑的無血 清培養基或血清培養基中培養細胞為佳。
步驟(D)中，以在更進一步包含1種以上選自Wnt信號傳導途徑作用物質、FGF信號傳導途徑抑制劑、Activin信號傳導途徑作用物質及BMP信號傳導途徑作用物質所成群之物質的無血清培養基或血清培養基中培養細胞為更佳。
所謂Activin信號傳導途徑作用物質，是能夠增強由Activin媒介之信號的物質。作為Activin信號傳導途徑作用物質，例如可舉出屬於Activin家族的蛋白質(例如，Activin A、Activin B、Activin C、Activin AB等)、Activin受體、Activin受體作用物質等。
用於步驟(D)之Activin信號傳導途徑作用物質的濃度，只要是能有效地形成網膜色素上皮細胞的均一薄片的濃度即可。例如在Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A(R&D system公司#338-AC)的情況，以從約1ng/ml至約10μg/ml的濃度添加，以從約10ng/ml至約1μg/ml的濃度添加為佳，以達到約100ng/ml的濃度添加為更佳。
Activin信號傳導途徑作用物質，在步驟(D)開始起例如18天以內添加，以在第6天添加為佳，
步驟(D)中，以在已經經過培養基質的表面處理的培養器材上進行貼附培養為佳。作為步驟(D)中用於培養器材的處理的培養基質，可舉出能實現源於凝集體之細胞的貼附培養與網膜色素上皮薄片的形成的細胞培養基 質。
3. 毒性‧藥效評價方法
經由本發明之製造方法所製造的網膜組織或網膜細胞(例如，視細胞、網膜前驅細胞、網膜層特異性神經細胞)，作為因網膜組織或網膜細胞的異常引起之疾病的治療藥的篩選和毒性評價的疾病研究材料、藥物開發材料是有用的，所以可以當成被檢物質的毒性‧藥效評價用試劑。例如，從因網膜組織的異常引起之疾病，尤其是因遺傳性的異常引起的疾病的人類患者，製作iPS細胞，使用此iPS細胞以本發明之方法製造網膜組織或網膜細胞(例如，視細胞、網膜前驅細胞、網膜層特異性神經細胞)。網膜組織或網膜細胞有可能在體外重現成為該患者所罹患之疾病原因的網膜組織異常。因此，本發明提供包含使被檢物質接觸經由本發明之製造方法所製造的網膜組織或網膜細胞(例如，視細胞、網膜前驅細胞、網膜層特異性神經細胞)，鑑定該物質對該細胞或該組織之影響的該物質的毒性‧藥效評價方法。
例如，將經由本發明之製造方法所製造的，具有特定異常(例如，遺傳性的異常)的網膜組織或網膜細胞(例如，視細胞、網膜前驅細胞、網膜層特異性神經細胞)，在被檢物質的存在下或不存在下(陰性對照)進行培養。然後，將經過被檢物質處理的網膜組織或網膜細胞的該異常程度和陰性對照相比。其結果，可選擇減輕異常程度的 被檢物質為因該異常而引起之疾病的治療藥的候選物質。例如，可探索使得經由本發明之製造方法所製造的網膜細胞的生理活性(例如，促進生存或成熟化)進一步提升的被檢物質，作為藥品的候選物質。或者，可以從具有呈現伴隨網膜異常之疾病等特定異常之基因變異的體細胞調配人工多功能性幹細胞，將被檢物質添加在將該細胞以本發明之製造方法分化誘導而製造的網膜細胞中，以是否呈現出前述異常為指標，探索作為該異常的治療藥‧預防藥的有效被檢物質之候選物質。
在毒性評價中，將經由本發明之製造方法所製造的網膜組織或網膜細胞(例如，視細胞、網膜前驅細胞、網膜層特異性神經細胞)，在被檢物質的存在下或不存在下(陰性對照)進行培養。然後，將經過被檢物質處理的網膜組織或網膜細胞中的毒性程度和陰性對照相比。其結果，可以將和陰性對照相比顯示出毒性的被檢物質，判定為對網膜組織或網膜細胞(例如，視細胞、網膜前驅細胞、網膜層特異性神經細胞)而言是具有毒性的物質。
也就是說，本發明包含包含以下的步驟之毒性評價方法。
(步驟1)將經由本發明之製造方法所製造的網膜組織或網膜細胞，在可生存的培養條件下，在一定時間內、被檢物質存在下進行培養之後，測定細胞傷害程度的步驟，(步驟2)將經由本發明之製造方法所製造的網膜組 織或網膜細胞，在可生存的培養條件下，在一定時間內、被檢物質不存在下或陽性對照存在下進行培養之後，測定細胞傷害程度的步驟，以及(步驟3)根據(步驟1)及(步驟2)中測定結果的差異，評價步驟1中被檢物質所具有的毒性的步驟。
在這裡，所謂的「被檢物質不存在下」，包含以培養液取代被檢物質，僅添加將被檢物質溶解的溶劑。此外，所謂「陽性對照」，意指具有毒性的已知化合物。
作為測定細胞的傷害程度的方法，可舉出測量生存細胞數的方法，例如測定細胞內ATP量的方法，或以細胞染色(例如細胞核染色)與形態觀察測量活細胞數的方法等。
步驟3中，作為評價被檢物質所具有的毒性的方法，例如，比較步驟1的測定值與步驟2中陰性對照的測定值，當步驟1的細胞的傷害程度較大時可以判斷該被檢物質具有毒性。此外，比較步驟1的測定值與步驟2中陽性對照的測定值，當步驟1的細胞的傷害程度為同等以上時可以判斷該被檢物質具有毒性。
4. 醫藥組成物
本發明提供包含有效量的經由本發明之製造方法所製造的網膜組織或網膜細胞(例如，視細胞、網膜前驅細胞、網膜層特異性神經細胞)之醫藥組成物。
該醫藥組成物包含有效量的經由本發明之製造方法所 製造的網膜組織或網膜細胞(例如，視細胞、網膜前驅細胞、網膜層特異性神經細胞)、及被容許作為藥物的載體。
作為被容許作為藥物的載體，可使用生理性水性溶劑(生理食鹽水、緩衝液、無血清培養基等)。也可視需要，在移植醫療中，在包含移植組織或細胞的藥物中，搭配常用的保存劑、穩定劑、還原劑、等滲壓劑等。
本發明之醫藥組成物，可藉由以適當的生理性水性溶劑懸浮經由製造方法1及2所製造的網膜組織或網膜細胞，製造成懸浮液。若有需要，也可添加冷凍保存劑，進行冷凍保存，使用時解凍，以緩衝液清洗並用於移植醫療。
本發明之製造方法所得到的網膜組織，也可用鑷子等細切成適當大小，製成片劑。
而且，本發明之製造方法所得到的細胞，還能在進行分化誘導的步驟(3)中進行貼附培養，藉此成形為薄片狀的細胞，製成片劑。
本發明之醫藥組成物，作為因神經組織或神經系細胞(例如，網膜組織、網膜前驅細胞、網膜層特異性神經細胞)的異常而引起的疾病的治療藥是有用的。
5. 治療藥
經由本發明之製造方法所製造的網膜組織或網膜細胞(例如，視細胞、網膜前驅細胞、網膜層特異性神經細 胞)，對因該網膜組織或網膜細胞的異常而引起的疾病的移植醫療是有用的。因此，本發明提供包含經由本發明之製造方法所製造的網膜組織或網膜細胞(例如，視細胞、網膜前驅細胞、網膜層特異性神經細胞)之，因該網膜組織或網膜細胞的異常而引起的疾病的治療藥。作為因該網膜組織或網膜細胞的異常而引起的疾病的治療藥，或者，在該網膜組織處於損傷狀態時，可以為了補充該損傷部位而使用經由本發明之製造方法所製造的網膜組織或網膜細胞(包含網膜前驅細胞、網膜層特異性神經細胞)。將經由本發明之製造方法所製造的網膜組織或網膜細胞移植到有需要移植的，因網膜組織或網膜細胞的異常而引起的疾病，或是處於網膜組織損傷狀態的患者，藉由補充該網膜細胞或發生異常的網膜組織本身，可以治療因網膜組織或網膜細胞的異常而引起的疾病或網膜組織的損傷狀態。作為因網膜組織或網膜細胞的異常而引起的疾病，例如可舉出網膜變性症、網膜色素變性症、老年黃斑變性症、有機水銀中毒、氯喹網膜症、青光眼、糖尿病性網膜症、新生兒網膜症等。
在移植醫療中，因組織相容性抗原的不同而引發的排斥常常成為問題，但是藉由使用從移植接受者的體細胞建立的多功能性幹細胞(例如，人工多功能性幹細胞)可以克服該問題。也就說，在理想的情況中，在本發明的方法中，藉由使用從接受者的體細胞建立的多功能性幹細胞(例如，人工多功能性幹細胞)作為多功能性幹細胞，針 對該接受者製造在免疫學上自身的神經組織或神經系細胞，而這才是要是被移植到該接受者的。
而且，也可以從與接受者免疫相容(例如，HLA型和MHC型相容)的他人的體細胞建立的多功能性幹細胞(例如，人工多功能性幹細胞)，製造同種異體移植物(allografts)之神經組織或神經系細胞，移植到該接受者。
[實施例]
以下舉出實施例將本發明做更詳細的說明，但本發明並不受限於此等。
比較例1：於步驟2不使用Shh傳導途徑作用物質，從人類iPS細胞的分化例
依照Scientific Reports,4,3594(2014)中所揭示的方法在feeder free的條件下培養人類iPS細胞(1231A3細胞株，自京都大學取得)。使用StemFit培養基(AK03，味之素公司製)作為feeder free培養基，使用Laminin 511-E8(Nippi公司製)作為feeder free支持體。
作為具體的維持培養操作，首先用PBS洗淨接近匯合狀態的人類iPS細胞(1231A3細胞株)後，用TrypLE Select(Life Technologies公司製)分散成單一細胞。其後，將前述被分散成單一細胞的人類iPS細胞播種於以 Laminin 511-E8塗覆過的塑膠培養皿，在Y27632(ROCK抑制劑，10μM)存在下，以StemFit培養基進行feeder free培養。作為前述塑膠培養皿，在使用6孔培養板(IWAKI公司製，細胞培養用，培養面積9.4cm2)的情況，前述分散成單一細胞的人類iPS細胞的播種細胞數設為6×103。播種1天後，進行全量培養基更換為不含Y27632的StemFit培養基。之後，每1~2天以不含Y27632的StemFit培養基進行一次全量培養基更換。其後，在播種6天後，培養成接近匯合狀態(培養面積的6成左右被細胞覆蓋)為止。
將前述接近匯合狀態的人類iPS細胞，利用TrypLE Select(Life Technologies)進行細胞分散液處理，更進一步經由吸量管操作分散成單一細胞。其後，將前述被分散成單一細胞的人類iPS細胞，在非細胞貼附性的96孔培養板(PrimeSurface 96V底培養板，Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.)以每1孔達1.2×104個細胞的方式懸浮於100μl的無血清培養基中，在37℃、5% CO2下進行懸浮培養。當時的無血清培養基(gfCDM+KSR)，使用F-12培養基與IMDM培養基的1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-硫代甘油、1 x Chemically defined lipid concentrate的無血清培養基。在懸浮培養開始時(懸浮培養開始後第0天，步驟2開始)，在前述無血清培養基中添加Y27632(最終濃度20μM)。懸浮培養開始後第2天為止，細胞凝集體形成(步驟2結束，步驟3開始)。在懸浮培養開 始後第3天，加入50μl不含Y27632的無血清培養基。
在懸浮培養開始後第6天，以不含Y27632、包含或不包含人類重組BMP4(R&D公司製)的培養基，以成為外因性人類重組BMP4的最終濃度達到1.5nM(55ng/ml，圖1B)的培養基或成為不含外因性人類重組BMP4的培養基(圖1A)那樣進行半量培養基交換。作為半量培養基交換操作，捨棄培養器中培養基體積的一半分量，即75μl，加入75μl新的前述無血清培養基，使培養基量為合計150μl。其後，每2~4天以不含Y27632及不含人類重組BMP4的前述無血清培養基進行一次半量培養基更換。在懸浮培養開始後第19天，利用倒立顯微鏡(Keyence公司製，BIOREVO)，將像這樣調配而成的細胞凝集體進行明視野觀察(圖1A,B)。其結果為，無論是在添加人類重組BMP4條件下(圖1B)，還是不添加人類重組BMP4條件下(圖1A)，都有90%以上的細胞凝集體崩壞，神經組織的形成效率差。
實施例1：從於步驟1利用StemFit作為feeder free培養基所培養的人類iPS細胞，於步驟2利用Shh傳導途徑作用物質調配之細胞凝集體、神經組織及網膜組織的形成例
依照Scientific Reports,4,3594(2014)中所揭示的方法在feeder free的條件下培養人類iPS細胞(1231A3細胞株，自京都大學取得)。使用StemFit培養基(AK03，味之素公司製)作為feeder free培養基，使用 Laminin 511-E8(Nippi公司製)作為feeder free支持體。維持培養操作以揭示於比較例1的方法進行。
將像這樣調配而成的接近匯合狀態的人類iPS細胞，利用TrypLE Select(Life Technologies)進行細胞分散液處理，更進一步經由吸量管操作分散成單一細胞。其後，將前述被分散成單一細胞的人類iPS細胞，在非細胞貼附性的96孔培養板(PrimeSurface 96V底培養板，Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.)以每1孔達1.2×104個細胞的方式懸浮於100μl的無血清培養基中，在37℃、5% CO2下進行懸浮培養。當時的無血清培養基(gfCDM+KSR)，使用F-12培養基與IMDM培養基的1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-硫代甘油、1 x Chemically defined lipid concentrate的無血清培養基。在懸浮培養開始時(懸浮培養開始後第0天，步驟2開始)，在前述無血清培養基中添加Y27632(最終濃度20μM)及添加SAG(300nM)作為Shh信號傳導途徑作用物質。懸浮培養開始後第2天為止，細胞凝集體形成(步驟2結束，步驟3開始)。在懸浮培養開始後第3天，加入50μl不含Y27632與SAG的無血清培養基。在懸浮培養開始後第6天，以不含Y27632、包含或不包含人類重組BMP4(R&D公司製)的培養基，以成為外因性人類重組BMP4的最終濃度達到1.5nM(55ng/ml，圖1D)的培養基或成為不含外因性人類重組BMP4的培養基(圖1C)那樣進行半量培養基交換。作為半量培養基交換操 作，捨棄培養器中培養基體積的一半分量，即75μl，加入75μl新的前述無血清培養基，使培養基量為合計150μl。其後，每2~4天以不含Y27632與SAG及不含人類重組BMP4的前述無血清培養基進行一次半量培養基更換。在懸浮培養開始後第19天，利用倒立顯微鏡(Keyence公司製，BIOREVO)，將像這樣調配而成的細胞凝集體進行明視野觀察(圖1C,D)。其結果為，無論是在添加人類重組BMP4條件下(圖1D)，還是不添加人類重組BMP4條件下(圖1C)，細胞凝集體都受到維持，且觀察到神經上皮構造。也就是說，發現藉由添加Shh信號傳導途徑作用物質，凝集體的形狀變好，神經組織的形成效率提高(圖1A-D)。從這個結果發現，藉由在步驟2的懸浮培養開始時添加Shh信號傳導途徑作用物質，可以從feeder free培養的人類iPS細胞，以高效率製造神經組織。
將前述懸浮培養開始後第19天的細胞凝集體，各以4%聚甲醛固定，製作冷凍切片。將這些冷凍切片進行網膜組織標記之1的Chx10(抗Chx10抗體，Exalpha公司製，綿羊)，或者，網膜組織標記之1的Rx(抗Rx抗體，TAKARA公司製，天竺鼠)的免疫染色。在免疫染色分析中判斷前述標記是否為陽性時，與背景值相比亮度值超過2倍以上為陽性。其結果為，發現在懸浮培養第0天添加Shh信號傳導途徑作用物質，懸浮培養第6天不添加BMP信號傳導途徑作用物質的條件下，全體細胞中Rx陽 性細胞的比例不滿3%，Chx10陽性細胞的比例也不滿3%(圖2A,C)。另一方面，發現在懸浮培養第0天添加Shh信號傳導途徑作用物質，懸浮培養第6天添加BMP信號傳導途徑作用物質的條件下，全體細胞中Rx陽性細胞的比例為60%以上，全細胞中的Chx10陽性細胞的比例也為60%以上(圖2B,D)。更進一步，從連續切片的分析發現，在Chx10陽性細胞的比例高(95%以上)的神經組織中，Rx也為強陽性(圖2B,D)。從這個結果發現，藉由在步驟2的懸浮培養開始時添加Shh信號傳導途徑作用物質，並且在步驟3的懸浮培養中添加BMP信號傳導途徑作用物質作為分化誘導物質，可以從feeder free培養的人類iPS細胞(以下有時也稱為feeder free人類iPS細胞)，以高效率製造網膜組織。
實施例2：於懸浮培養開始時利用Shh傳導途徑作用物質，從於步驟1中利用Essential 8作為feeder free培養基的人類iPS細胞製造神經組織之例
依照「Scientific Reports,4,3594(2014)」中所揭示的方法在feeder free的條件下培養人類iPS細胞(1231A3細胞株，自京都大學取得)。使用Essential 8培養基(Life Technologies公司製)作為feeder free培養基，使用Laminin 511-E8(Nippi公司製)作為feeder free支持體。
作為具體的維持培養操作，首先用PBS洗淨接近匯 合狀態的人類iPS細胞(1231A3細胞株)後，用TrypLE Select(Life Technologies公司製)分散成單一細胞。其後，將前述被分散成單一細胞的人類iPS細胞播種於以Laminin 511-E8塗覆過的塑膠培養皿，在Y27632(ROCK抑制劑，10μM)存在下，以Essentail 8培養基進行feeder free培養。作為前述塑膠培養皿，在使用6孔培養板(IWAKI公司製，細胞培養用，培養面積9.4cm2)的情況，前述分散成單一細胞的人類iPS細胞的播種細胞數設為6×103。播種1天後，進行全量培養基更換為不含Y27632的Essentail 8培養基。之後，每1~2天以不含Y27632的Essentail 8培養基進行一次全量培養基更換。其後，在播種6天後，培養成接近匯合狀態(培養面積的6成左右被細胞覆蓋)為止。
將像這樣調配而成的接近匯合狀態的人類iPS細胞，利用TrypLE Select(Life Technologies公司製)進行細胞分散液處理，更進一步經由吸量管操作分散成單一細胞。其後，將前述被分散成單一細胞的人類iPS細胞，在非細胞貼附性的96孔培養板(PrimeSurface 96V底培養板，Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.)以每1孔達1.2×104個細胞的方式懸浮於100μl的無血清培養基中，在37℃、5% CO2下進行懸浮培養。當時的無血清培養基(gfCDM+KSR)，使用F-12培養基與IMDM培養基的1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-硫代甘油、1 x Chemically defined lipid concentrate的無血清培養基。在 懸浮培養開始時(懸浮培養開始後第0天，步驟2開始)，使用在前述無血清培養基中添加Y27632(最終濃度20μM)之無血清培養基(圖3A-D)。在其中一部分的條件下，使用在無血清培養基中添加Y27632(最終濃度20μM)及添加SAG(300nM)作為Shh信號傳導途徑作用物質之無血清培養基(圖3C,D)。在懸浮培養開始後第2天，無論是在添加SAG的條件下，還是在沒有添加的條件下，都有形成細胞凝集體(步驟2結束，步驟3開始)。在懸浮培養開始後第3天，加入50μl不含Y27632與SAG的無血清培養基。在懸浮培養開始後第6天，以不含Y27632與SAG、包含或不包含人類重組BMP4(R&D公司製)的培養基，以成為外因性人類重組BMP4的濃度達到1.5nM(圖3B,D)的培養基或成為不含外因性人類重組BMP4的培養基(圖3A,C)那樣進行半量培養基交換。其後，每2~4天以不含Y27632與SAG及不含人類重組BMP4的前述無血清培養基進行一次半量培養基更換。在懸浮培養開始後第18天，利用倒立顯微鏡(Keyence公司製，BIOREVO)，將像這樣調配而成的細胞凝集體進行明視野觀察(圖3A-D)。其結果為，無論是在懸浮培養開始時不添加SAG且懸浮培養中不添加BMP4的條件下(條件1，圖3A)，還是在懸浮培養開始時不添加SAG且懸浮培養中添加BMP4的條件下(條件2，圖3B)，都有80%以上的細胞凝集體崩壞，神經組織的形成效率差。另一方面，在懸浮培養開始時添加SAG 且懸浮培養中不添加BMP4的條件下(條件3，圖3C)，以及，在懸浮培養開始時添加SAG且懸浮培養中添加BMP4的條件下(條件4，圖3D)，細胞凝集體都受到維持，並且以良好效率形成神經上皮結構。
更進一步，多次觀察懸浮培養開始後第18天的凝集體的形態，區分並定量成形態良好(圖4黑柱，凝集體良好，而且包含許多神經上皮)、形態中等程度(圖4灰柱，凝集體良好，但神經上皮的比例低)、形態差(圖4白柱，凝集體崩壞，不含神經上皮)。其結果為，條件1(圖3A)中形態良好的比例為不滿3%，形態差的比例為71%(圖4,Control)。與之相比，條件3(圖3C)中形態良好的比例為93%，形態差的比例為6%(圖4,SAG)。
從這些結果發現，藉由在懸浮培養開始時添加Shh信號傳導途徑作用物質，利用Essential 8培養基feeder free培養的人類iPS細胞的神經組織形成效率變好。
實施例3：於懸浮培養開始時利用Shh傳導途徑作用物質，從於步驟1中利用Essential 8作為feeder free培養基的人類iPS細胞製造網膜組織之例
依照Scientific Reports,4,3594(2014)中所揭示的方法feeder free培養人類iPS細胞(201B7細胞株，自京都大學取得)。使用Essential 8培養基(Life Technologies公司製)作為feeder free培養基，使用 Laminin 511-E8(Nippi公司製)作為feeder free支持體。
作為具體的維持培養操作，首先用PBS洗淨接近匯合狀態的人類iPS細胞(201B7細胞株)後，用TrypLE Select(Life Technologies公司製)分散成單一細胞。其後，將前述被分散成單一細胞的人類iPS細胞播種於以Laminin 511-E8塗覆過的塑膠培養皿，在Y27632(Rock抑制劑，10μM)存在下，以Essentail 8培養基進行feeder free培養。作為前述塑膠培養皿，在使用6孔培養板(IWAKI公司製，細胞培養用，培養面積9.4cm2)的情況，前述分散成單一細胞的人類iPS細胞的播種細胞數設為6×103。播種1天後，進行全量培養基更換為不含Y27632的Essentail 8培養基。之後，每1~2天以不含Y27632的Essentail 8培養基進行一次全量培養基更換。其後，在播種6天後，培養成接近匯合狀態(培養面積的6成左右被細胞覆蓋)為止。
將像這樣調配而成的接近匯合狀態的人類iPS細胞，利用TrypLE Select(Life Technologies公司製)進行細胞分散液處理，更進一步經由吸量管操作分散成單一細胞。其後，將前述被分散成單一細胞的人類iPS細胞，在非細胞貼附性的96孔培養板(PrimeSurface 96V底培養板，Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.)以每1孔達1.2×104個細胞的方式懸浮於100μl的無血清培養基中，在37℃、5% CO2下進行懸浮培養。當時的無血清培養基 (gfCDM+KSR)，使用F-12培養基與IMDM培養基的1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-硫代甘油、1 x Chemically defined lipid concentrate的無血清培養基。在懸浮培養開始時(懸浮培養開始後第0天，步驟2開始)，使用在前述無血清培養基中添加SAG(最終濃度300nM)作為Shh信號傳導途徑作用物質，以及，Y27632(20μM)之無血清培養基(圖5A-D)。在懸浮培養開始後第2天，細胞凝集體形成。在懸浮培養開始後第3天，加入50μl不含Y27632與SAG的無血清培養基。在懸浮培養開始後第6天，以不含Y27632與SAG、包含或不包含人類重組BMP4(R&D公司製)的培養基，以成為外因性人類重組BMP4的最終濃度達到1.5nM(55ng/ml)的培養基之方式進行半量培養基交換。其後，每2~4天以不含Y27632、SAG、以及不含人類重組BMP4的前述無血清培養基進行一次半量培養基更換。在懸浮培養開始後第18天，當利用倒立顯微鏡(Keyence公司製，BIOREVO)，將像這樣調配而成的細胞凝集體進行明視野觀察時，發現神經上皮細胞正在形成。
將該懸浮培養開始後第18天的細胞凝集體，以4%聚甲醛固定，製作冷凍切片。將這些冷凍切片進行網膜組織標記之1的Chx10(抗Chx10抗體，Exalpha公司製，綿羊)，或者，網膜組織標記之1的Rx(抗Rx抗體，TAKARA公司製，天竺鼠)的免疫染色。其結果為，發現在懸浮培養第0天添加Shh信號傳導途徑作用物質，懸浮 培養第6天不添加BMP信號傳導途徑作用物質的條件下，全體細胞中Rx陽性細胞的比例在3%以下，全體細胞中Chx10陽性細胞的比例也在3%以下(圖5A,C)。另一方面，發現在懸浮培養第0天添加Shh信號傳導途徑作用物質，懸浮培養第6天添加BMP信號傳導途徑作用物質的條件下，全體細胞中Rx陽性細胞的比例為40%以上，全體細胞中Chx10陽性細胞的比例也為40%以上(圖5B,D)。更進一步，從連續切片的分析發現，在Chx10陽性細胞的比例高(95%以上)的神經組織中，Rx也為強陽性(圖5B,D)。從這個結果發現，藉由在步驟2的懸浮培養開始時添加Shh信號傳導途徑作用物質，並且在步驟3的懸浮培養中添加BMP信號傳導途徑作用物質作為分化誘導物質，可以從feeder free人類iPS細胞，以良好效率製造網膜組織。
實施例4：於步驟2利用Shh傳導途徑作用物質，於步驟3利用BMP4，從人類iPS細胞製造網膜組織之例
依照Scientific Reports,4,3594(2014)中所揭示的方法feeder free培養人類iPS細胞(1231A3細胞株，自京都大學取得)。使用StemFit培養基(AK03，味之素公司製)作為feeder free培養基，使用Laminin 511-E8(Nippi公司製)作為feeder free支持體。
作為具體的維持培養操作，首先用PBS洗淨接近匯合狀態的人類iPS細胞(1231A3細胞株)後，用TrypLE Select(Life Technologies公司製)分散成單一細胞。其後，將前述被分散成單一細胞的人類iPS細胞播種於以Laminin 511-E8塗覆過的塑膠培養皿，在Y27632(ROCK途徑抑制劑，10μM)存在下，以StemFit培養基進行feeder free培養。作為前述塑膠培養皿，在使用6孔培養板(IWAKI公司製，細胞培養用，培養面積9.4cm2)的情況，前述分散成單一細胞的人類iPS細胞的播種細胞數設為6×103。播種1天後，進行更換為不含Y27632的StemFit培養基。之後，每1~2天以不含Y27632的StemFit培養基進行一次培養基更換。其後，在播種6天後，培養成接近匯合狀態(培養面積的6成左右被細胞覆蓋)為止。
將前述接近匯合狀態的人類iPS細胞，利用TrypLE Select(Life Technologies公司製)分散成單一細胞後，將前述被分散成單一細胞的人類iPS細胞，在非細胞貼附性的96孔培養板(PrimeSurface 96V底培養板，Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.)以每1孔達1.2×104個細胞的方式懸浮於100μl的無血清培養基中，在37℃、5% CO2下進行懸浮培養。當時的無血清培養基(gfCDM+KSR)，使用F-12培養基與IMDM培養基的1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-硫代甘油、1 x Chemically defined lipid concentrate的無血清培養基。在懸浮培養開始時(懸浮培養開始後第0天，步驟2開始)，在前述無血清培養基中添加Y27632(最終濃度20 μM)及SAG(最終濃度300nM)。懸浮培養開始後第2天為止，細胞凝集體形成(步驟2結束，步驟3開始)。
在此，作為步驟3，以以下條件1、2進行培養。
作為條件1(+BMP，d3)，在懸浮培養開始後第3天，以外因性人類重組BMP4的最終濃度達到1.5nM那樣，加入50μl不含Y27632及SAG、含人類重組BMP4(R&D公司製)的培養基(培養基量合計150μl)。在懸浮培養開始後第6天，以不含Y27632、SAG及人類重組BMP4的培養基，進行半量培養基更換。
作為條件2(+BMP，d6)，在懸浮培養開始後第3天，加入50μl不含Y27632、SAG及人類重組BMP4的無血清培養基。在懸浮培養開始後第6天，以不含Y27632及SAG、含人類重組BMP4(R&D公司製)的培養基，以外因性人類重組BMP4的最終濃度達到1.5nM那樣，進行半量培養基更換。
將條件1及條件2的細胞，在懸浮培養開始後第6天之後，每2~4天以不含Y27632、SAG、以及、人類重組BMP4的前述無血清培養基進行一次半量培養基更換。在懸浮培養開始後第18天，利用倒立顯微鏡觀察形態時，發現無論是在條件1還是在條件2，細胞凝集體都受到維持，而且神經組織正在形成。
將像這樣調配而成的，以feeder free iPS細胞為起始原料，而且在步驟2添加SAG製作而成的懸浮培養開始後第18天的細胞凝集體，以4%聚甲醛固定，製作冷凍 切片。將這些冷凍切片進行網膜組織標記之1的Chx10(抗Chx10抗體，Exalpha公司製，綿羊)，或者，網膜組織標記之1的Rx(抗Rx抗體，Takara公司製，天竺鼠)的免疫染色。用倒立型螢光顯微鏡觀察這些免疫染色切片。其結果為，發現無論是條件1的細胞，還是條件2的細胞，全體細胞中Rx強陽性細胞的比例皆為40%左右，全體細胞中Chx10陽性細胞的比例也為40%左右(圖6)。更進一步，從連續切片的分析發現，在Chx10陽性細胞的比例高(95%左右)的神經組織中，Rx也為強陽性。從這個結果發現，藉由在步驟2添加SAG，並且在步驟3的懸浮培養開始後第3天或第6天添加BMP信號傳導途徑作用物質作為分化誘導物質，可以從feeder free人類iPS細胞，以良好效率製造網膜組織。
實施例5：於步驟2利用600nM Shh傳導途徑作用物質，於步驟3利用BMP4，從人類iPS細胞製造網膜組織之例
將依照實施例4揭示的方法調配而成的人類iPS細胞(1231A3細胞株)，利用TrypLE Select(Life Technologies公司製)分散成單一細胞後，將前述被分散成單一細胞的人類iPS細胞在非細胞貼附性的96孔培養板(PrimeSurface 96V底培養板，Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.)以每1孔達1.2×104個細胞的方式懸浮於100μl的無血清培養基中，在37℃、5% CO2下進行懸浮培養。當時的無血清培養基(gfCDM+KSR)，使用F-12與IMDM 的1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-硫代甘油、1 x Chemically defined lipid concentrate的無血清培養基。在懸浮培養開始時(懸浮培養開始後第0天，步驟2開始)，在前述無血清培養基中添加Y27632(最終濃度20μM)及SAG(最終濃度600nM)。懸浮培養開始後第2天為止，細胞凝集體形成(步驟2結束，步驟3開始)。
在此，作為步驟3，以以下條件1、2進行培養。
作為條件1(+BMP，d3)，在懸浮培養開始後第3天，以外因性人類重組BMP4的最終濃度達到1.5nM那樣，加入50μl不含Y27632及SAG、含人類重組BMP4(R&D公司製)的培養基(培養基量合計150μl)。在懸浮培養開始後第6天，以不含Y27632、SAG及人類重組BMP4的培養基，進行半量培養基更換。
作為條件2(+BMP，d6)，在懸浮培養開始後第3天，加入50μl不含Y27632、SAG及人類重組BMP4的無血清培養基。在懸浮培養開始後第6天，以外因性人類重組BMP4的最終濃度達到1.5nM那樣，以不含Y27632、含人類重組BMP4(R&D公司製)的培養基，進行半量培養基更換。
將條件1及條件2的細胞，在懸浮培養開始後第6天之後，每2~4天以不含Y27632、SAG、以及、人類重組BMP4的前述無血清培養基進行一次半量培養基更換。在懸浮培養開始後第18天，利用倒立顯微鏡觀察形態時，發現無論是在條件1還是在條件2，細胞凝集體都受到維 持，而且神經組織正在形成。
將像這樣調配而成的，以feeder free iPS細胞為起始原料，而且在步驟2添加SAG製作而成的懸浮培養開始後第18天的細胞凝集體，以4%聚甲醛固定，製作冷凍切片。將這些冷凍切片進行網膜組織標記之1的Chx10(抗Chx10抗體，Exalpha公司製，綿羊)，或者，網膜組織標記之1的Rx(抗Rx抗體，Takara公司製，天竺鼠)的免疫染色。用倒立型螢光顯微鏡觀察這些免疫染色切片。其結果為，發現無論是條件1的細胞，還是條件2的細胞，全體細胞中Rx強陽性細胞的比例為40%左右，全體細胞中Chx10陽性細胞的比例也為40%左右(圖7)。更進一步，從連續切片的分析發現，在Chx10陽性細胞的比例高(95%左右)的神經組織中，Rx也為強陽性。從這個結果發現，藉由在步驟2添加600nM的SAG，並且在步驟3的懸浮培養開始後第3天或第6天添加BMP信號傳導途徑作用物質作為分化誘導物質，可以從feeder free人類iPS細胞，以良好效率製造網膜組織。
實施例6：於步驟2利用SAG、Purmorphamine、重組Shh蛋白質作為音蝟因子信號傳導途徑作用物質，從人類iPS細胞製造網膜組織之例
依照Scientific Reports,4,3594(2014)中所揭示的方法feeder free培養人類iPS細胞(201B7細胞株，自京都大學取得)。使用Stem Fit培養基(AK-03；味之素公 司製)作為feeder free培養基，使用Laminin 511-E8(Nippi公司製)作為feeder free支持體。
作為具體的維持培養操作，首先用PBS洗淨接近匯合狀態的人類iPS細胞(201B7細胞株)後，用TrypLE Select(Life Technologies公司製)分散成單一細胞。其後，將前述被分散成單一細胞的人類iPS細胞播種於以Laminin 511-E8塗覆過的塑膠培養皿，在Y27632(ROCK途徑抑制劑，10μM)存在下，以Stem Fit培養基進行feeder free培養。作為前述塑膠培養皿，在使用6孔培養板(IWAKI公司製，細胞培養用，培養面積9.4cm2)的情況，前述分散成單一細胞的人類iPS細胞的播種細胞數設為1.3×104。播種1天後，進行全量培養基更換為不含Y27632的Stem Fit培養基。之後，每1~2天以不含Y27632的Stem Fit培養基進行一次全量培養基更換。其後，在播種6天後，培養成接近匯合狀態(培養面積的6成左右被細胞覆蓋)為止。
將像這樣調配而成的接近匯合狀態的人類iPS細胞，利用TrypLE Select(Life Technologies公司製)進行細胞分散液處理，更進一步經由吸量管操作分散成單一細胞。其後，將前述被分散成單一細胞的人類iPS細胞，在非細胞貼附性的96孔培養板(Sumilon Spheloid V底培養板PrimeSurface 96V底培養板，Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.)以每1孔達1.0×104個細胞的方式懸浮於100μl的無血清培養基中，在37℃、5% CO2下進行懸浮培養。當 時的無血清培養基(gfCDM+KSR)，使用F-12與IMDM的1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-硫代甘油、1 x Chemically defined lipid concentrate的無血清培養基。在懸浮培養開始時(懸浮培養開始後第0天，步驟2開始)，使用在前述無血清培養基中添加Y27632(20μM)，並進一步添加SAG(最終濃度30nM)、Purmorphamine(Wako公司製，最終濃度0.2μM)、或者、人類重組Shh(R&D公司製，Recombinant N-Terminus，最終濃度50ng/ml)作為Shh信號傳導途徑作用物質之無血清培養基(圖8)。在懸浮培養開始後第2天，細胞凝集體形成。在懸浮培養開始後第3天，以外因性人類重組BMP4的最終濃度達到1.5nM(55ng/ml)那樣，加入50μl不含Y27632、SAG、Purmorphamine、以及、重組Shh、包含人類重組BMP4(R&D公司製)的培養基。在懸浮培養開始後第6天，以不含Y27632、SAG、Purmorphamine、Shh蛋白質、以及、人類重組BMP4的無血清培養基進行半量培養基更換。其後，每2~4天以不含Y27632、SAG、Purmorphamine、Shh蛋白質、以及、不含人類重組BMP4的前述無血清培養基進行一次半量培養基更換。在懸浮培養開始後第18天，當利用倒立顯微鏡(Keyence公司製，BIOREVO)，將像這樣調配而成的細胞凝集體進行明視野觀察時，發現神經上皮細胞正在形成。
將該懸浮培養開始後第18天的細胞凝集體，以4%聚 甲醛固定，製作冷凍切片。將這些冷凍切片進行網膜組織標記之1的Chx10(抗Chx10抗體，Exalpha公司製，綿羊)的免疫染色。其結果為，在懸浮培養第0天添加SAG、PMA、或者、Shh作為Shh信號傳導途徑作用物質，在懸浮培養第3天添加BMP4的條件下，全體細胞中Chx10陽性細胞的比例為30%以上(圖8,D~F)。從這些結果發現，藉由在步驟2的懸浮培養開始時添加SAG、Purmorphamine、重組Shh之中的任何一者作為Shh信號傳導途徑作用物質，在步驟3的懸浮培養中添加BMP信號傳導途徑作用物質作為分化誘導物質，可以從feeder free培養的人類iPS細胞，以良好效率製造網膜組織。
實施例7：於步驟2利用SAG、Purmorphamine、重組Shh蛋白質作為音蝟因子信號傳導途徑作用物質，於步驟3利用BMP4，從人類iPS細胞製造網膜組織之例
依照Scientific Reports,4,3594(2014)中所揭示的方法feeder free培養人類iPS細胞(1231A3細胞株，自京都大學取得)。使用StemFit培養基(AK-03；味之素公司製)作為feeder free培養基，使用Laminin 511-E8(Nippi公司製)作為feeder free支持體。
將依照實施例6揭示的方法調配而成的接近匯合狀態的人類iPS細胞，利用TrypLE Select(Life Technologies公司製)進行細胞分散液處理，更進一步經由吸量管操作分散成單一細胞。其後，將前述被分散成單一細胞的人類 iPS細胞在非細胞貼附性的96孔培養板(Sumilon Spheloid V底培養板PrimeSurface 96V底培養板，Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.)以每1孔達1.0×104個細胞的方式懸浮於100μl的無血清培養基中，在37℃、5% CO2下進行懸浮培養。當時的無血清培養基(gfCDM+KSR)，使用F-12與IMDM的1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-硫代甘油、1 x Chemically defined lipid concentrate的無血清培養基。在懸浮培養開始時(懸浮培養開始後第0天，步驟2開始)，使用在前述無血清培養基中添加Y27632(最終濃度20μM)，並進一步添加SAG(最終濃度30nM)、Purmorphamine(PMA，Wako公司製，最終濃度0.2μM)、或者、人類重組Shh(R&D公司製，Recombinant N-Terminus，最終濃度300ng/ml)作為Shh信號傳導途徑作用物質之無血清培養基，或者，使用不添加外因性Shh信號傳導途徑作用物質之無血清培養基(圖9)。在懸浮培養開始後第2天，細胞凝集體形成。在懸浮培養開始後第3天，以外因性人類重組BMP4的最終濃度達到1.5nM(55ng/ml)那樣，加入50μl不含Y27632、SAG、Purmorphamine、以及、重組Shh、包含人類重組BMP4(R&D公司製)的培養基。在懸浮培養開始後第6天，以不含Y27632、SAG、Purmorphamine、Shh蛋白質、以及、不含人類重組BMP4的無血清培養基進行半量培養基更換。其後，每2~4天以不含Y27632、SAG、Purmorphamine、Shh蛋白 質、以及、不含人類重組BMP4的前述無血清培養基進行一次半量培養基更換。在懸浮培養開始後第18天，當利用倒立顯微鏡(Keyence公司製，BIOREVO)，將像這樣調配而成的細胞凝集體進行明視野觀察時，發現相較於在步驟2中不添加外因性Shh信號傳導途徑作用物質的條件下細胞凝集體沒有成長，神經上皮沒有形成(圖9：Control)，在步驟2中添加SAG、PMA、或者、重組Shh蛋白質的條件下細胞凝集體成長，神經上皮正在形成(圖9：SAG、PMA、Shh)。
將該懸浮培養開始後第18天的細胞凝集體，以4%聚甲醛固定，製作冷凍切片。將這些冷凍切片進行網膜組織標記之1的Chx10(抗Chx10抗體，Exalpha公司製，綿羊)的免疫染色。其結果為，在懸浮培養第0天添加PMA，在懸浮培養第3天添加BMP4的條件下，全體細胞中Chx10陽性細胞的比例為60%以上(圖9下段PMA)。而且，發現在懸浮培養地0天添加SAG或Shh的條件下，細胞凝集體中也會包含Chx10陽性細胞。從這些結果發現，藉由在步驟2的懸浮培養開始時添加SAG、Purmorphamine、重組Shh之中的任何一者作為Shh信號傳導途徑作用物質，在步驟3的懸浮培養中添加BMP信號傳導途徑作用物質作為分化誘導物質，可以從feeder free人類iPS細胞製造網膜組織。
實施例8：於懸浮培養開始時利用Shh信號傳導途徑作用 物質，於步驟3利用BMP4，feeder free培養利用仙台病毒建立的人類iPS細胞製造網膜組織之例
人類iPS細胞(DSPC-3細胞株，Sumitomo Dainippon Pharma(大日本住友製藥)建立)為，利用市售仙台病毒載體(Oct3/4、Sox2、KLF4、c-Myc的4個基因，DNAVEC(現為ID Pharma)公司製CytoTune套組)，以Life Technologies公司的公開流程(iPS 2.0 Sendai Reporgramming Kit，Publication Number MAN0009378，Revision 1.0)，以及，京都大學的公開流程(feeder free下的人類iPS細胞的建立‧維持培養，CiRA_Ff-iPSC_protocol_JP_v140310,http：//www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/protocol.html)所揭示的方法為基礎，利用StemFit培養基(AK03；味之素公司製)，Laminin 511-E8(Nippi公司製)建立。
依照Scientific Reports,4,3594(2014)中所揭示的方法feeder free培養該人類iPS細胞(DSPC-3細胞株)。使用StemFit培養基(味之素公司製)作為feeder free培養基，使用Laminin 511-E8(Nippi公司製)作為feeder free支持體。
作為具體的維持培養操作，首先用PBS洗淨接近匯合狀態的人類iPS細胞後，用TrypLE Select(Life Technologies公司製)分散成單一細胞。其後，將前述被分散成單一細胞的人類iPS細胞播種於以Laminin 511-E8塗覆過的塑膠培養皿，在Y27632(ROCK途徑抑制劑， 10μM)存在下，以Stem Fit培養基進行feeder free培養。作為前述塑膠培養皿，在使用6孔培養板(IWAKI公司製，細胞培養用，培養面積9.4cm2)的情況，前述分散成單一細胞的人類iPS細胞的播種細胞數設為1.3×104。播種1天後，進行全量培養基更換為不含Y27632的Stem Fit培養基。之後，每1~2天以不含Y27632的Stem Fit培養基進行一次全量培養基更換。其後，在播種6天後，培養成接近匯合狀態(培養面積的6成左右被細胞覆蓋)為止。
將像這樣調配而成的接近匯合狀態的人類iPS細胞，利用TrypLE Select(Life Technologies公司製)進行細胞分散液處理，更進一步經由吸量管操作分散成單一細胞。其後，將前述被分散成單一細胞的人類iPS細胞，在非細胞貼附性的96孔培養板(Sumilon Spheloid V底培養板PrimeSurface 96V底培養板，Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.)以每1孔達1.2×104個細胞的方式懸浮於100μl的無血清培養基中，在37℃、5% CO2下進行懸浮培養。當時的無血清培養基(gfCDM+KSR)，使用F-12培養基與IMDM培養基的1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-硫代甘油、1 x Chemically defined lipid concentrate的無血清培養基。在懸浮培養開始時(懸浮培養開始後第0天，步驟2開始)，使用在前述無血清培養基中添加Y27632(20μM)，並進一步添加SAG(最終濃度300nM)作為外因性Shh信號傳導途徑作用物質的條件 下，或在不添加SAG的條件下(最終濃度0nM)，之無血清培養基(圖10)。在懸浮培養開始後第2天，細胞凝集體形成。在懸浮培養開始後第3天，以外因性人類重組BMP4的最終濃度達到1.5nM(55ng/ml)或0nM那樣，加入50μl不含Y27632與SAG、包含或不包含人類重組BMP4(R&D公司製)的培養基。在懸浮培養開始後第6天，以不含Y27632、SAG、以及、不含BMP4的無血清培養基進行半量培養基交換。其後，每2~4天以不含Y27632、SAG、以及、不含BMP4的前述無血清培養基進行一次半量培養基更換。在懸浮培養開始後第22天，當利用倒立顯微鏡(Keyence公司製，BIOREVO)，將像這樣調配而成的細胞凝集體進行明視野觀察時，發現在不添加Shh信號傳導途徑作用物質的條件下，細胞凝集體的形成效率差(圖10，Control)。另一方面，在懸浮培養開始時添加SAG的條件下，細胞凝集體受到維持，而且神經上皮正在形成(圖10，SAG 300nM)。
將該懸浮培養開始後第22天的細胞凝集體，以4%聚甲醛固定，製作冷凍切片。將這些冷凍切片進行網膜組織標記之1的Chx10(抗Chx10抗體，Exalpha公司製，綿羊)，或者，網膜組織標記之1的Rx(抗Rx抗體，TAKARA公司製，天竺鼠)的免疫染色。其結果為，在懸浮培養第0天添加SAG，並且在懸浮培養第3天添加BMP4的條件下，全體細胞中Rx陽性細胞的比例為10%左右，全體細胞中Chx10陽性細胞的比例也為10%左右 (圖10)。更進一步，從連續切片的分析發現，在Chx10陽性細胞的神經組織中，Rx也為強陽性(圖10)。從這個結果確認了，藉由在步驟2的懸浮培養開始時添加Shh信號傳導途徑作用物質，在步驟3的懸浮培養中添加BMP信號傳導途徑作用物質作為分化誘導物質，也可以從利用仙台病毒建立的feeder free人類iPS細胞製造網膜組織。
[產業上可利用性]
藉由本發明之製造方法，能夠實現在餵養細胞不存在下，進行從多功能性幹細胞往網膜細胞的分化誘導，並製造網膜組織。本發明之製造方法，在可以製造出成為以下應用所需的試驗與治療用材料之網膜組織的方面是有用的：使用網膜組織進行藥品候選化合物、其他化學物質的毒性‧藥效評價、與網膜組織移植治療用的移植材料。
這裡所敘述的包含專利、專利申請說明書及科學文獻在內所有發行刊物中所揭示的內容，經由被引述於此，相當於全部內容都已經清楚地併入本說明書中。
本申請以在日本申請的特願2014-217868(申請日：2014年10月24日)為基礎，其內容被全部包含於本說明書中。

Claims (17)

  1. 一種網膜細胞或網膜組織的製造方法，其係包含下述步驟(1)~(3)；(1)在餵養細胞不存在下，將人類多功能性幹細胞培養在包含維持未分化因子之培養基的第一步驟，(2)將於第一步驟所得到的多功能幹細胞，在音蝟因子(Sonic hedgehog)信號傳導途徑作用物質存在下進行懸浮培養，使之形成細胞凝集體的第二步驟，以及(3)將在第二步驟所得到的凝集體，在BMP信號傳導途徑作用物質存在下進行懸浮培養，而得到包含網膜細胞或網膜組織之凝集體的第三步驟。
  2. 如請求項1之製造方法，其中於第二步驟，將於第一步驟所得到的細胞分散，並將該分散了的細胞進行懸浮培養。
  3. 如請求項1或2之製造方法，其中維持未分化因子為FGF信號傳導途徑作用物質。
  4. 如請求項3之製造方法，其中FGF信號傳導途徑作用物質為bFGF。
  5. 如請求項1或2之製造方法，其中第二步驟之培養基中的音蝟因子信號傳導途徑作用物質的濃度為，相當於SAG 10nM~700nM之音蝟因子信號傳導作用之濃度。
  6. 如請求項1或2之製造方法，其中音蝟因子信號傳導途徑作用物質為SAG，Purmorphamine或Shh。
  7. 如請求項1或2之製造方法，其中BMP信號傳導 途徑作用物質為1種以上選自BMP2、BMP4、BMP7及GDF7所成群之蛋白質。
  8. 如請求項6之製造方法，其中BMP信號傳導途徑作用物質為BMP4。
  9. 如請求項1或2之製造方法，其中於第三步驟，BMP信號傳導途徑作用物質在第二步驟開始後的第2天至第9天之間被添加於培養基。
  10. 如請求項1或2之製造方法，其中於第3步驟，以音蝟因子信號傳導途徑作用物質的濃度為相當於SAG 700nM音蝟因子信號傳導作用之濃度以下的培養基培養凝集體。
  11. 如請求項1或2之製造方法，其中第一步驟為貼附培養法。
  12. 如請求項1或2之製造方法，其中多功能性幹細胞為人工多功能性幹細胞。
  13. 如請求項1或2之製造方法，其中於第二步驟，形成均一的凝集體。
  14. 如請求項1或2之製造方法，其中於第三步驟所得到的凝集體為包含1或複數種之選自網膜前驅細胞、神經網膜前驅細胞、視細胞前驅細胞、視細胞、視桿細胞、視錐細胞、水平細胞、無軸突細胞、聯絡神經元、神經節細胞、網膜色素上皮細胞、以及睫狀體邊緣區細胞所成群之細胞的凝集體。
  15. 如請求項1或2之製造方法，其中懸浮培養為在 基底膜製劑不存在下進行。
  16. 如請求項1或2之製造方法，其中第三步驟中，至表現Rx基因及/或Chx10的細胞開始出現為止的期間內，在BMP信號傳導途徑作用物質的存在下進行懸浮培養。
  17. 一種網膜組織的製造方法，其包含下述步驟：藉由如請求項1或2之製造方法製造包含網膜組織之凝集體的步驟，及由該凝集體切出網膜組織的步驟。
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