CN113564123A - 神经组织的制备方法 - Google Patents

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RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
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Abstract

本发明提供神经细胞或神经组织的制备方法，所述方法包括下述步骤(1)‑(3)：(1)第一步，用于在不存在饲养细胞的条件下在包括下述各项的培养基中培养多能干细胞：1)TGFβ家族信号转导途径抑制剂和/或Sonic hedgehog信号转导途径激活剂，和2)未分化维持因子；(2)第二步，用于悬浮培养第一步中得到的细胞，从而形成细胞聚集体，和(3)第三步，用于在存在或不存在分化诱导因子的条件下悬浮培养第二步中得到的细胞聚集体，从而得到包括神经细胞或神经组织的聚集体。

Description

神经组织的制备方法
本申请是国际申请号PCT/JP2015/080016，国际申请日2015年10月23日，中国申请号201580071124.1，发明名称为“神经组织的制备方法”的专利申请的分案申请。
[技术领域]
本发明涉及用于由多能干细胞制备诸如视网膜组织等的神经组织的方法。
[背景技术]
作为由多能干细胞制备诸如视网膜组织等的神经组织的方法，已经报道了用于制备神经组织的方法，所述方法包括在无血清培养基中形成均匀的多能干细胞聚集体，悬浮培养所述聚集体，酌情在存在分化诱导因子等的条件下在用于分化诱导的培养基中悬浮培养所述聚集体，从而诱导多能干细胞向目的神经细胞的分化(专利文献1和非专利文献1)。例如，已知用于由多能干细胞得到多层视网膜组织的方法(非专利文献2和专利文献2)，和用于获得多层视网膜组织的方法，所述方法包括在含有Wnt信号转导途径抑制物质的无血清培养基中形成均匀的多能干细胞聚集体，将其在存在基膜制剂的条件下悬浮培养，并且将其在含血清培养基中悬浮培养(非专利文献3和专利文献3)。另外，还已经报道了用于诱导多能干细胞向下丘脑组织分化的方法(专利文献4和非专利文献4)和诱导多能干细胞向神经前体细胞分化的方法(非专利文献5和6)。
在存在饲养细胞的条件下并且加入用于维持未分化状态的因子，培养作为这些制备方法的起始材料的多能干细胞，特别是在灵长类多能干细胞的情形中，从而维持未分化状态。近年来，在维持未分化状态的培养中已经取得了一些改进，并且已经报道了在不存在饲养细胞(无饲养细胞)的条件下加入用于维持未分化状态的因子培养灵长类多能干细胞的方法(非专利文献7、8和9)。需要使用通过该方法进行无饲养细胞培养的多能干细胞作为起始材料的制备神经细胞或神经组织的稳定方法。
[文献列表]
[专利文献]
[专利文献1]WO 2009/148170
[专利文献2]WO 2011/055855
[专利文献3]WO 2013/077425
[专利文献4]WO 2013/065763
[非专利文献]
[非专利文献1]Cell Stem Cell，3，519-32(2008)
[非专利文献2]Nature，472，51-56(2011)
[非专利文献3]Cell Stem Cell，10(6)，771-775(2012)
[非专利文献4]Nature，480，57-62(2011)
[非专利文献5]Nature Biotechnology，27(3)，275-80(2009)
[非专利文献6]Proc Natl Acad Sci USA，110(50)，20284-9(2013)
[非专利文献7]Nature Methods，8，424-429(2011)
[非专利文献8]Scientific Reports，4，3594(2014)
[非专利文献9]In Vitro Cell Dev Biol Anim.，46，247-58(2010)
[发明概述]
[发明要解决的问题]
本发明要解决的问题是提供一种用于由在不存在饲养细胞的条件下制备或培养以保持未分化状态的多能干细胞制备诸如视网膜组织等的神经组织和神经细胞的方法。
[解决问题的方式]
本发明人已经进行了深入的研究，尝试解决前述问题，并且发现通过在不存在饲养细胞的条件下(在无饲养细胞条件下)在包含TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径激活物质的培养基中培养多能干细胞，然后将所述细胞进行悬浮培养，可以高效地形成具有光滑表面和致密内部并且维持未分化状态的球形细胞聚集体。另外，本发明人已经发现，通过使用这种高质量的细胞聚集体，可以高效地诱导诸如视网膜组织等的神经组织和神经细胞，这导致了本发明的完成。
即，本发明涉及下述各项：
[1]用于制备神经细胞或神经组织的方法，所述方法包括下述步骤(1)-(3)：
(1)第一步，在不存在饲养细胞的条件下在含有1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径激活物质和2)用于维持未分化状态的因子的培养基中培养多能干细胞，
(2)第二步，悬浮培养第一步中得到的细胞，从而形成细胞聚集体，和
(3)第三步，在存在或不存在分化诱导因子的条件下悬浮培养第二步中得到的聚集体，从而得到包括神经细胞或神经组织的聚集体。
[2][1]的制备方法，其中，在第二步中，将在第一步中得到的细胞分散，并且将分散的细胞进行悬浮培养。
[3][1]或[2]的制备方法，其中所述用于维持未分化状态的因子是FGF信号转导途径激活物质。
[4][3]的制备方法，其中所述FGF信号转导途径激活物质是bFGF。
[5][1]-[4]中任一项的制备方法，其中，在第二步中，将细胞在包含Sonichedgehog信号转导途径激活物质的无血清培养基中悬浮培养。
[6][1]-[5]中任一项的制备方法，其中，在第三步中，将所述聚集体在存在分化诱导因子的条件下悬浮培养。
[7][1]-[6]中任一项的制备方法，其中所述TGFβ家族信号转导途径抑制物质是Nodal/激活蛋白(Activin)信号转导途径抑制物质、TGFβ信号转导途径抑制物质或BMP信号转导途径抑制物质。
[8][1]-[7]中任一项的制备方法，其中所述TGFβ家族信号转导途径抑制物质是Lefty、SB431542、A-83-01或LDN193189。
[9][1]-[8]中任一项的制备方法，其中所述Sonic hedgehog信号转导途径激活物质是Shh、SAG或Purmorphamine。
[10][1]-[9]中任一项的制备方法，其中第三步中的所述分化诱导因子是BMP信号转导途径激活物质。
[11][10]的制备方法，其中所述BMP信号转导途径激活物质是选自由BMP2、BMP4、BMP7和GDF7组成的组的一种或多种蛋白。
[12][10]的制备方法，其中所述BMP信号转导途径激活物质是BMP4。
[13][1]-[12]中任一项的制备方法，其中在第三步中得到的聚集体包含视网膜组织。
[14][1]-[13]中任一项的制备方法，其中在第三步中得到的聚集体包含选自由下述各项组成的组的一种或多种细胞：视网膜祖先细胞，神经视网膜祖先细胞，感光前体细胞，感光细胞，视杆感光细胞，视锥感光细胞，水平细胞，无长突细胞，中间神经元，神经节细胞，视网膜色素上皮细胞，和睫状边缘区细胞。
[15][13]或[14]的制备方法，其中在第三步中的所述分化诱导因子是BMP信号转导途径激活物质，并且第二步中的所述培养基包含Sonic hedgehog信号转导途径激活物质。
[16][15]的制备方法，其中所述多能干细胞是人多能干细胞，在第二步中的培养基中的所述Sonic hedgehog信号转导途径激活物质具有与10nM-700nM的SAG的Sonichedgehog信号转导活性相对应的浓度，并且所述视网膜组织是人视网膜组织。
[17][15]或[16]的制备方法，其中，在第三步中，在第二步开始后第1天与第9天之间向所述培养基中添加所述BMP信号转导途径激活物质。
[18][13]或[14]的制备方法，其中，在第三步中，在包含浓度不超过与700nM的SAG的Sonic hedgehog信号转导活性相对应的浓度的Sonic hedgehog信号转导途径激活物质的培养基中培养所述聚集体。
[19][1]-[9]的制备方法，其中第三步中的所述分化诱导因子是TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Wnt信号转导途径抑制物质。
[20][19]的制备方法，其中所述TGFβ家族信号转导途径抑制物质是Lefty、SB431542、A-83-01或LDN193189。
[21][19]或[20]的制备方法，其中所述Wnt信号转导途径抑制物质是IWR-1-endo。
[22][1]-[9]或[19]-[21]中任一项的制备方法，其中在第三步中得到的所述聚集体包含大脑组织。
[23][1]-[22]中任一项的制备方法，其中第一步的培养时间期是0.5小时-144小时。
[24][1]-[23]中任一项的制备方法，其中第一步通过贴壁培养方法进行。
[25][1]-[24]中任一项的制备方法，其中，在第三步中，在第二步开始后第3天与第6天之间向所述培养基中添加分化诱导因子。
[26][1]-[15]和[17]-[25]中任一项的制备方法，其中所述多能干细胞是灵长类多能干细胞。
[27][1]-[26]中任一项的制备方法，其中所述多能干细胞是人多能干细胞。
[28][1]-[27]中任一项的制备方法，其中所述多能干细胞是诱导的多能干细胞。
[29][1]-[28]中任一项的制备方法，其中在第二步中形成均匀的聚集体。
[30][1]-[29]中任一项的制备方法，其中所述悬浮培养在不存在基膜制剂的条件下进行。
[31]用于评价测试物质的毒性或功效的试剂，其包含通过[1]-[30]中任一项的方法制备的神经细胞或神经组织。
[32]用于评价测试物质的毒性或功效的方法，所述方法包括使所述物质与通过[1]-[30]中任一项的方法制备的神经细胞或神经组织接触，并且检测所述物质对所述细胞或组织的影响。
[33]用于治疗由于神经细胞或神经组织的紊乱导致的疾病的药物，其包含通过[1]-[30]中任一项的方法制备的神经细胞或神经组织。
[34][33]的药物，其中所述神经细胞或神经组织是视网膜祖先细胞、视网膜层专有的神经元、视网膜组织、大脑神经前体细胞、大脑层专有的神经元或大脑组织。
[35]一种治疗由于神经细胞或神经组织的紊乱导致的疾病的方法，所述方法包括向需要移植的受试者移植有效量的通过[1]-[30]中任一项的方法制备的神经细胞或神经组织。
[36]通过[1]-[30]中任一项的方法制备的神经细胞或神经组织，其用于治疗由于神经细胞或神经组织的紊乱导致的疾病。
[37]一种药物组合物，其包含通过[1]-[30]中任一项的方法制备的神经细胞或神经组织作为活性成分。
[发明效果]
按照本发明，可以由在不存在饲养细胞的条件下培养的多能干细胞高效地产生高质量的细胞聚集体，以及诸如视网膜细胞等的神经组织和神经细胞。
[附图简述]
图1显示实施例1的培养条件以及培养后人iPS细胞的形态。
图2显示实施例2的培养条件，培养后细胞的亮视野图像和针对Oct3/4的免疫组织化学染色图像。
图3显示聚集体的亮视野图像(A和B)，和定量聚集体的形态水平的图表(C)。
图4显示聚集体的亮视野图像。
图5显示聚集体的亮视野图像(A和B)，和聚集体针对神经组织标记(巢蛋白，TuJ1，PSA-NCAM)的免疫组织化学染色图像(C-E)。
图6显示实施例7的培养条件，和聚集体针对视网膜组织标记(Chx10，Rx)的免疫组织化学染色图像(A-D)。
图7显示实施例8的培养条件，培养后聚集体的亮视野图像(A-H)，和定量聚集体的形态水平的图表(I)。
图8显示聚集体针对神经组织标记(巢蛋白，TuJ1，PSA-NCAM)的免疫组织化学染色图像。
图9显示实施例9的培养条件，聚集体针对视网膜组织标记(Chx10，Rx)的免疫组织化学染色图像(A-H)。
图10显示在不同条件下形成的聚集体的亮视野图像。
图11显示实施例11的培养条件，和聚集体针对神经组织标记(巢蛋白，TuJ1，PSA-NCAM)的免疫组织化学染色图像(A-F)。
图12显示实施例12的培养条件，和聚集体针对视网膜组织标记(Chx10，Rx)的免疫组织化学染色图像(A-D)。
图13显示实施例13的培养条件，和聚集体与Chx10相关的免疫组织化学染色图像(A-D)。
图14显示实施例14的培养条件，聚集体的亮视野图像，和聚集体针对视网膜组织标记(Chx10，Rx)的免疫组织化学染色图像。
图15显示实施例15的培养条件，和培养后细胞的亮视野图像(A-D)。
图16显示实施例16的培养条件，培养后细胞的亮视野图像(A，B)和聚集体针对Chx10的免疫组织化学染色图像(C)。
图17显示实施例17的培养条件，和培养后细胞的亮视野图像(A-F)。
图18显示实施例18的培养条件，培养后细胞的亮视野图像(A-E)，和聚集体针对Chx10的免疫组织化学染色图像(F-I)。
图19显示实施例19的培养条件，培养后细胞的亮视野图像(A-D)，和聚集体针对Chx10的免疫组织化学染色图像(E-H)。
图20显示实施例20的培养条件，和培养后细胞的亮视野图像(A-J)。
图21显示实施例21的培养条件，和培养后细胞的亮视野图像(A-L)。
图22显示实施例22的培养条件，培养后细胞的亮视野图像(A-C)，和聚集体针对Chx10的免疫组织化学染色图像(D-F)。
图23显示实施例23的培养条件，培养后细胞的亮视野图像(A，B)和聚集体针对Chx10的免疫组织化学染色图像(C，D)。
图24显示实施例24的培养条件，和培养后细胞的亮视野图像(A-D)。
图25显示实施例25的培养条件，培养后细胞的亮视野图像(A-D)。
图26显示实施例26的培养条件，培养后细胞的亮视野图像(A-E)，和聚集体针对Chx10的免疫组织化学染色图像(F-I)。
图27显示实施例27的培养条件，人ES细胞的培养图像(A)，培养后细胞的亮视野图像(B-D)，和针对Rx：：GFP的荧光图像(E，F)。
图28显示聚集体针对视网膜组织标记(Rx，Chx10，Crx，Blimp1，Brn3b)和Ki67的免疫组织化学染色图像(A-F)。
图29显示聚集体针对视网膜组织标记(钙视网膜蛋白，S-视蛋白，Rx，Pax6，恢复蛋白，视紫质，NRL，钙结合蛋白)的免疫组织化学染色图像(A-H)。
图30显示培养后细胞的亮视野图像(A，B)，和聚集体针对视网膜组织标记(SSEA1，Mitf，Aqp1)的免疫组织化学染色图像(C-E)。
图31显示实施例31的培养条件，和培养后细胞的亮视野图像(A-C)。
图32显示聚集体针对大脑组织标记(Sox2，FoxG1，Pax6，Tbr1，Ctip2)的免疫组织化学染色图像(A-F)。
图33显示在不同条件下培养的细胞的亮视野图像(A-J)。
图34显示实施例33的培养条件，培养后细胞的亮视野图像(A，B)，和聚集体针对Chx10的免疫组织化学染色图像(C，D)。
图35显示实施例34的培养条件，培养后细胞的亮视野图像(A-D)，和聚集体针对Chx10的免疫组织化学染色图像(E-H)。
图36显示实施例35的培养条件，培养后细胞的亮视野图像(A-E)，和聚集体针对Chx10的免疫组织化学染色图像(F-I)。
[实施方案描述]
1.定义
在本发明中，“干细胞”意指具有分化潜能和保持分化潜能的增殖能力(特别是自我更新的能力)的未分化的细胞。干细胞依据分化潜能包括多种亚群，诸如多能干细胞(pluripotent stem cell)，专能干细胞(multipotent stem cell)，单能干细胞等。多能干细胞是指能够在体外培养并且具有分化成属于三个胚层(外胚层、中胚层、内胚层)和/或胚外组织的任意细胞谱系的潜能(多能性)的干细胞。专能干细胞意指具有分化成多种类型的组织或细胞但不是所有种类的组织或细胞的潜能的干细胞。单能干细胞意指具有分化成特定的组织或细胞的潜能的干细胞。
多能干细胞可以由受精卵、克隆胚胎、生殖干细胞、组织中的干细胞、体细胞等诱导。多能干细胞的实例包括胚胎干细胞(ES细胞)，EG细胞(胚胎生殖细胞)，诱导的多能干细胞(iPS细胞)等。由间质干细胞(MSC)得到的Muse细胞(多系分化应激持久细胞(Multi-lineage differentiating stress enduring cell))和由生殖细胞(例如，睾丸)产生的GS细胞也包括在多能干细胞中。胚胎干细胞最先在1981年建立，并且自1989年起还已经用于产生敲除小鼠。在1998年，建立了人胚胎干细胞，其也用于再生药物。可以通过在饲养细胞上或在含有LIF的培养基中培养内细胞团而产生ES细胞。ES细胞的制备方法记载在，例如，WO 96/22362，WO 02/101057，US 5,843,780，US 6,200,806，US 6,280,718等中。胚胎干细胞可从给定的机构得到，或可以购买商购产品。例如，人胚胎干细胞，KhES-1，KhES-2和KhES-3，可从京都大学前沿医学科学研究院(Kyoto University’s Institute forFrontier Medical Sciences)得到。作为人胚胎干细胞的Rx：：GFP细胞系(来源于KhES-1)可从RIKEN得到。作为小鼠胚胎干细胞的EB5可从Incorporated Administrative AgencyRIKEN得到，并且作为小鼠胚胎干细胞的D3细胞系可从ATCC得到。
作为ES细胞中的一种的核转移ES细胞(ntES细胞)可以由通过将体细胞的细胞核移植到无核卵中产生的克隆胚胎建立。
EG细胞可以通过在含有mSCF、LIF和bFGF的培养基中培养原生殖细胞而产生(Cell，70：841-847，1992)。
本发明中的“诱导的多能干细胞”是通过已知的方法等使体细胞重新编程而被诱导具有多能性的细胞。具体地，可以提及通过表达多种基因的组合使分化的体细胞(诸如成纤维细胞、外周血单核细胞等)重新编程而被诱导具有多能性的细胞，所述多种基因选自由包括下述各项的重新编程基因组成的组：Oct3/4，Sox2，Klf4，Myc(c-Myc，N-Myc，L-Myc)，Glis1，Nanog，Sall4，lin28，Esrrb等。优选的重新编程因子的组合的实例包括：(1)Oct3/4，Sox2，Klf4，和Myc(c-Myc或L-Myc)，和(2)Oct3/4，Sox2，Klf4，Lin28和L-Myc(Stem Cells，2013；31：458-466)。
诱导的多能干细胞由Yamanaka等人在2006年在小鼠细胞中建立(Cell，2006，126(4)，pp.663-676)。在2007年，还由人成纤维细胞建立了诱导的多能干细胞，并且具有与胚胎干细胞相似的多能性和自我更新能力(Cell，2007，131(5)，pp.861-872；Science，2007，318(5858)，pp.1917-1920；Nat.Biotechnol.，2008，26(1)，pp.101-106)。
除了基于通过基因表达的直接重新编程的制备方法之外，还可以通过添加化合物等由体细胞得到诱导的多能干细胞(Science，2013，341，pp.651-654)。
还可以获得建立的诱导的多能干细胞，并且，例如，由京都大学建立的人诱导的多能细胞系，诸如201B7细胞，201B7-Ff细胞，253G1细胞，253G4细胞，1201C1细胞，1205D1细胞，1210B2细胞或1231A3细胞等可从京都大学和iPS Academia Japan，Inc.获得。作为建立的诱导的多能干细胞，例如，由京都大学建立的Ff-I01细胞和Ff-I14细胞可从京都大学获得。
尽管用于获得诱导的多能干细胞的体细胞没有特别限制，但是可以提及组织来源的成纤维细胞、血液谱系细胞(例如，外周血单核细胞、T细胞)、肝细胞、胰腺细胞、肠上皮细胞、平滑肌细胞等。
当通过表达一些种类的基因进行重新编程产生诱导的多能干细胞时，对基因表达的方式没有特别限制。前述方式的实例包括使用病毒载体(例如，反转录病毒载体，慢病毒载体，仙台病毒(Sendaivirus)载体，腺病毒载体，腺伴随病毒载体)的感染法，使用质粒载体(例如，质粒载体，附加型载体)的基因转移法(例如，磷酸钙法，脂转染法，RetroNectin法，电穿孔法)，使用RNA载体的基因转移法(例如，磷酸钙法，脂转染法，电穿孔法)，直接注射蛋白的方法等。
当制备诱导的多能干细胞时，其能够在存在饲养细胞的条件下或在不存在饲养细胞(无饲养细胞)的条件下产生。当在存在饲养细胞的条件下产生诱导的多能干细胞时，所述诱导的多能干细胞可以在存在用于维持未分化状态的因子的条件下通过已知的方法产生。尽管用于在不存在饲养细胞的条件下产生诱导的多能干细胞的培养基没有特别限制，但是可以使用已知的用于胚胎干细胞和/或诱导的多能干细胞的维持培养基和用于在无饲养细胞的条件下建立诱导的多能干细胞的培养基。用于在无饲养细胞的条件下建立诱导的多能干细胞的用于无饲养细胞建立的培养基的实例包括无饲养细胞培养基，诸如Essential 8培养基，TeSR培养基，mTeSR培养基，mTeSR-E8培养基，StemFit培养基等。当制备诱导的多能干细胞时，例如，其可以在不存在饲养细胞的条件下，用仙台病毒(Sendaivirus)载体向体细胞中基因转移Oct3/4、Sox2、Klf4和Myc 4个因子而产生。
用于本发明的多能干细胞优选是ES细胞或诱导的多能干细胞，更优选是诱导的多能干细胞。
作为专能干细胞，可以提及组织干细胞(还称为组织中的干细胞、组织特异性干细胞或体干细胞)，诸如造血干细胞、神经干细胞、视网膜干细胞、间充质干细胞等。
可以例如，通过使用同源重组技术产生遗传上修饰的多能干细胞。染色体上要被修饰的基因的实例包括细胞标记基因、组织相容性抗原基因、与神经细胞紊乱导致的疾病相关的基因等。染色体上的靶基因可以使用以下各项中记载的方法进行修饰：Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual(操作小鼠胚胎，实验室手册)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)；Gene Targeting，A PracticalApproach(基因靶向，实践方法)，IRL Press at Oxford University Press(1993)；Biomanual Series 8，Gene Targeting，Making of Mutant Mouse using ES cell(基因靶向，使用ES细胞产生突变体小鼠)，YODOSHA CO.，LTD.(1995)；等等。
具体而言，例如，分离包含要被修饰的靶基因(例如，细胞标记基因、组织相容性抗原基因、疾病相关的基因等)的基因组DNA，并且使用该分离的基因组DNA产生用于该靶基因同源重组的靶向载体。将所产生的靶向载体引入到干细胞中，并且选择表现出在所述靶基因与所述靶向载体之间的同源重组的细胞，由此可以产生在染色体中具有所述修饰的基因的干细胞。
用于分离包含靶基因的基因组DNA的方法的实例包括以下各项中记载的已知方法：Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆，实验室手册)，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学流程)，John Wiley&Sons(1987-1997)等。包含靶基因的基因组基因也可以使用基因组DNA文库筛选系统(由Genome Systems制造)、通用基因组步量试剂盒(Universal GenomeWalker Kits)(由CLONTECH制造)等分离。也可以使用编码靶蛋白的多核苷酸替代基因组DNA。所述多核苷酸可以通过用PCR法扩增相对应的多核苷酸而得到。
用于靶基因同源重组的靶向载体的产生和同源重组子的有效选择可以按照以下各项中记载的方法进行：Gene Targeting，A Practical Approach(基因靶向，实践方法)，IRL Press at Oxford University Press(1993)；Biomanual Series 8，Gene Targeting，Making of Mutant Mouse using ES cell(基因靶向，使用ES细胞产生突变体小鼠)，YODOSHA CO.，LTD.(1995)；等等。作为所述靶向载体，可以使用替换类型或插入类型中的任一种。作为所述选择方法，可以使用诸如阳性选择、启动子选择、阴性选择、聚腺苷酸(polyA)选择等的方法。
用于从所选的细胞系中选择需要的同源重组子的方法的实例包括用于基因组DNA的DNA杂交法(Southern hybridization method)、PCR法等。
本发明中的“哺乳动物”包括啮齿类、有蹄类、食肉类、灵长类动物等。啮齿类包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等。有蹄类包括猪、牛、山羊、马、绵羊等、食肉类包括狗、猫等。本发明中的“灵长类”是指属于灵长类的哺乳动物，并且灵长类包括原猴业目(prosimian)，如狐猴(lemur)，懒猴(loris)，tupai等，和类人猿亚目(anthropoidea)，如猴，类人猿(ape)，人等。
用于本发明的多能干细胞是哺乳动物的多能干细胞，优选啮齿动物(例如，小鼠、大鼠)或灵长类动物(例如，人、猴)的多能干细胞，更优选人多能干细胞，更优选是人诱导的多能干细胞(iPS细胞)。
本发明中的“悬浮培养”或“悬浮培养法”是指在维持细胞或细胞聚集体悬浮在培养基中的状态的同时进行培养和进行所述培养的方法。即，悬浮培养在细胞或细胞聚集体不粘附在培养容器等上的条件下进行，并且在允许粘附到培养容器等上的条件下进行的培养(贴壁培养或贴壁培养法)不包括在悬浮培养的范畴内。在这一情形中，细胞粘附意指在细胞或细胞聚集体与培养容器之间形成强的细胞-基底接合(cell-substratumjunction)。更具体地，悬浮培养是指在细胞或细胞聚集体与培养容器之间不形成强的细胞-基底接合的条件下的培养，并且贴壁培养是指在细胞或细胞聚集体与培养容器等之间形成强的细胞-基底接合的条件下的培养。
在悬浮培养的细胞聚集体中，形成平面的细胞-细胞粘附。在悬浮培养的细胞聚集体中，几乎不形成与培养容器等的细胞-基底接合，并且即使形成与培养容器等的细胞-基底接合，其贡献也是小的。在一些实施方案中，在聚集体内部存在内源性细胞-基底接合，但是几乎不形成与培养容器等的细胞-基底接合，即使形成与培养容器等的细胞-基底接合，其贡献也是小的。
平面细胞-细胞粘附(平面附着)意指一个细胞经由平面与另一个细胞连接。更具体地，平面细胞-细胞粘附意指，例如，一个细胞不少于1％，优选不少于3％，更优选不少于5％的表面积粘附到另一个细胞的表面上。细胞的表面可以通过用对膜染色的试剂(例如，DiI)染色、细胞粘附分子(例如，E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白)的免疫染色而观察到。
进行悬浮培养时使用的细胞培养容器没有特别限制，只要其能够允许“悬浮培养”即可，并且本领域普通技术人员能够适当地确定此类细胞培养容器。此类细胞培养容器的实例包括烧瓶、组织培养瓶、培养平皿(平皿)、培养皿、组织培养皿、多联培养皿、微量平板、微孔平板、微孔、多联平板、多孔平板、室载玻片、碗(schale)、管、托盘、培养袋、旋转烧瓶、锥形瓶(Erlenmeyer flask)、摇瓶等。为了能够允许悬浮培养，这些培养容器优选是非细胞粘附性的。可用的非细胞粘附性的培养容器包括表面没有进行改善细胞粘附性的人工处理(例如，使用诸如基膜制剂、层粘连蛋白、触觉蛋白(entactin)、胶原蛋白、明胶等的细胞外基质等进行的表面处理或用诸如聚赖氨酸、聚鸟氨酸等的聚合物进行的包被处理或正电荷处理等)以及类似处理的培养皿。作为非细胞粘附性培养容器，可以使用表面已被人工处理以减小对细胞的粘附性(例如，使用MPC聚合物等的超亲水处理、蛋白低吸附性处理等)以及类似处理的培养容器。可以使用旋转烧瓶、摇瓶等进行转管(roller)培养。培养容器的培养表面可以是平底的或可以具有凹陷和凸出。
用于贴壁培养的培养容器没有特别限制，只要可以进行“贴壁培养”即可，并且本领域普通技术人员能够依据培养规模、培养条件和培养时间适当地选择合适的培养容器。此类培养容器的实例包括烧瓶、组织培养瓶、培养平皿(平皿)、组织培养皿、多联培养皿、微量平板、微孔平板、多联平板、多孔平板、室载玻片、碗(schale)、管、托盘、培养袋、微载体、珠子、叠板、旋转烧瓶和摇瓶。为了能够允许贴壁培养，这些培养容器优选是细胞粘附性的。细胞粘附性的培养容器包括对表面进行人工处理以改善细胞粘附性的培养容器，并且具体是表面处理的培养容器，或可以提及内部用涂层剂涂覆的培养容器。涂层剂的实例包括细胞外基质，如层粘连蛋白[包括层粘连蛋白α5β1γ1(以下为层粘连蛋白511)，层粘连蛋白α1β1γ1(以下为层粘连蛋白111)等和层粘连蛋白片段(层粘连蛋白511E8等)]，触觉蛋白，胶原蛋白，明胶，玻连蛋白，Synthemax(Corning Incorporated)，基质胶(Matrigel)等，或聚合物，诸如聚赖氨酸，聚鸟氨酸等。所述表面处理的培养容器的实例包括通过正电荷处理等进行表面处理的培养容器。
在本发明中用于培养细胞的培养基可以由通常用于培养动物细胞的培养基作为基础培养基而制备。所述基础培养基的实例包括可以用于培养动物细胞的培养基，诸如BME培养基，BGJb培养基，CMRL1066培养基，Glasgow MEM(GMEM)培养基，改良的MEM锌选择培养基，IMDM培养基，Medium199培养基，Eagle MEM培养基，αMEM培养基，DMEM培养基，F-12培养基，DMEM/F-12培养基，IMDM/F12培养基，Ham培养基，RPMI1640培养基，费希尔培养基(Fischer’s medium)，以及它们的混合培养基等。
本发明中的“无血清培养基”表示不含未调节的或未纯化的血清的培养基。在本发明中，含有纯化的血液来源的组分和动物组织来源的组分(例如，生长因子)的培养基也包括在无血清培养基中，除非其中含有未调节的或未纯化的血清。
无血清培养基可以含有血清代替物。血清代替物的实例包括适当地含有以下物质的那些：白蛋白，转铁蛋白，脂肪酸，胶原蛋白前体，痕量元素，2-巯基乙醇或3’硫醇甘油，或它们的等效物等。此种血清代替物可以通过例如WO98/30679中所述的方法制备。此外，血清代替物可以是市售的产品。此种市售血清代替物的实例包括KnockoutTM血清替代品(KnockoutTM Serum Replacement，Life Technologies，现为ThermoFisher：下文中有时也被称为KSR)，化学成分确定的脂质浓缩物(由Life Technologies生产)，和GlutamaxTM(由Life Technologies生产)，B27(由Life Technologies生产)，N2补充剂(由LifeTechnologies生产)。
用于悬浮培养的无血清培养基可以适当地含有脂肪酸或脂质，氨基酸(例如，非必需氨基酸)，维生素，生长因子，细胞因子，抗氧化剂，2-巯基乙醇，丙酮酸，缓冲剂，无机盐等。
为避免复杂的制备，补充有适当量(例如，约0.5％-约30％，优选约1％-约20％)的市售的KSR(由Life Technologies生产)的无血清培养基可以用作所述无血清培养基(例如，补充了10％KSR、化学成分确定的脂质浓缩物和450μM 1-一硫代甘油的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物的培养基)。关于与KSR相当的产品，可以提及JP-A-2001-508302中公开的培养基。
本发明中的“含血清培养基”表示含有未调节的或未纯化的血清的培养基。所述培养基可以含有脂肪酸、脂质，氨基酸(例如，非必需氨基酸)，维生素，生长因子，细胞因子，抗氧化剂，2-巯基乙醇，1-一硫代甘油，丙酮酸，缓冲剂，无机盐等。例如，当通过使用基膜制剂(如基质胶等)诱导多能干细胞向视网膜组织等分化时，可以使用血清培养基(Cell StemCell，10(6)，771-775(2012))。另外，血清培养基可以用在维持由本发明产生的神经组织(例如，视网膜组织、大脑组织)的步骤中(也被称为成熟培养)。
在本发明中，培养优选地在无外源物质(xeno-free)的条件下进行。“无外源物质”意指消除源自与要培养的细胞不同的物种的成分的条件。
在本发明中，“含有物质X的培养基”和“在存在物质X的条件下”表示补充有外源物质X的培养基或含有外源物质X的培养基，或在存在外源物质X的条件下。即，当培养基中存在的细胞或组织内源性表达、分泌或产生物质X时，内源性物质X与外源性物质X区分，并且，理解无内源性物质X的培养基落在“含有物质X的培养基”的范畴之外(甚至当其包含内源性物质X时)。
例如，“含有TGFβ family信号转导途径抑制物质的培养基”是补充有外源性TGFβ家族信号转导途径抑制物质的培养基或包含外源性TGFβ家族信号转导途径抑制物质的培养基。
在本发明中，饲养细胞是指在培养干细胞时共存的除干细胞之外的细胞。用于培养多能干细胞同时保持未分化状态的饲养细胞的实例包括小鼠成纤维细胞(MEF等)、人成纤维细胞、SNL细胞等。关于饲养细胞，优选经历生长抑制处理的饲养细胞。生长抑制处理的实例包括用生长抑制剂(例如，丝裂霉素C)、γ辐射、UV辐照等处理。用于培养多能干细胞同时保持未分化状态的饲养细胞通过分泌激素因子(优选用于维持未分化状态的因子)或产生用于细胞粘附的构架(细胞外基底)而有助于维持多能干细胞的未分化。
在本发明中，不存在饲养细胞(无饲养细胞)意指在不存在饲养细胞的条件下培养。不存在饲养细胞意指，例如，无饲养细胞添加的条件，或基本上无饲养细胞的条件(例如，饲养细胞数目相对于细胞总数的比例不大于3％)。
在本发明中，细胞的“聚集体”是指由分散在培养基中的细胞组装体形成的团块，其中细胞彼此粘附。细胞团块、胚状体、球体、球状体也包含在所述细胞聚集体中。优选地，在细胞的聚集体中形成平面细胞-细胞粘附。在一些实施方案中，在一些或全部的聚集体中，细胞有时形成细胞-细胞接合和/或细胞粘附，例如，粘附接合。本发明中的“聚集体”特别包括：在上文提及的本发明[1]的第二步中产生的聚集体，其由在开始悬浮培养时分散的细胞形成，和在上文提及的本发明[1]的第三步中产生的聚集体，其包含由多能干细胞分化的诱导的神经细胞，并且所述“聚集体”还包括在上文提及的本发明[1]的第二步开始时(即，在悬浮培养开始时)已经形成的聚集体。在第二步中形成的细胞聚集体包含“胚状体(EB)”。
在本发明中，“均匀的聚集体”意指在培养多个聚集体时，每个聚集体的尺寸一致，并且在通过最大直径的长度评价所述聚集体的尺寸时，最大直径的长度变化小。更具体地，这意味着全部聚集体群体中不少于75％的聚集体在所述聚集体群体中最大直径的平均值±100％、优选平均值±50％、更优选平均值±20％内。
在本发明中，“形成均匀的细胞聚集体”意指，当汇聚细胞形成细胞聚集体并且悬浮培养所述细胞聚集体时，“迅速聚集给定数量的分散的细胞”从而形成尺寸均匀的细胞聚集体。
分散是指通过诸如酶处理、物理处理等的分散处理将细胞或组织分成小细胞块(不少于2个细胞，并且不多于100个细胞，优选不多于50个细胞)或单个细胞。给定数量的分散的细胞是特定数量的细胞块或单个细胞的集合。
分散多能干细胞的方法的实例包括机械分散处理、细胞分散液处理和细胞保护剂添加处理。这些处理可以联合进行。优选地，进行细胞分散处理，然后进行机械分散处理。
关于机械分散处理的方法，可以提及吹吸处理或通过刮刀刮片操作。
关于用于细胞分散液处理的细胞分散液，可以提及包含诸如胰蛋白酶、胶原蛋白酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、链霉蛋白酶、DNA酶、木瓜蛋白酶等中的任一种酶和诸如乙二胺四乙酸等的螯合剂的溶液。还可以使用商购的细胞分散液，诸如TrypLE Select(由LifeTechnologies生产)和TrypLE Express(由Life Technologies生产)。
当分散多能干细胞时，可以通过用细胞保护剂处理而抑制多能干细胞的细胞死亡。关于用于细胞保护剂处理的细胞保护剂，可以提及FGF信号转导途径激活物质、肝素、IGF信号转导途径激活物质、血清和血清代替物。为了抑制由分散引起的细胞死亡(特别是人多能干细胞的细胞死亡)，可以在分散时添加Rho相关卷曲螺旋激酶(ROCK)抑制物质或肌球蛋白抑制物质。关于ROCK抑制物质，可以提及Y-27632、法舒地尔(Fasudil)(HA1077)、H-1152等。关于肌球蛋白抑制物质。可以提及Blebbistatin。关于优选的细胞保护剂，可以提及ROCK抑制物质。
例如，用于分散多能干细胞的方法包括，例如，包括在存在ROCK抑制物质作为细胞保护剂的条件下，用细胞分散液(TrypLE Select)处理多能干细胞的集落，并且通过吹吸进一步将其分散的方法。
在本发明的制备方法中，优选地通过迅速汇集多能干细胞而形成多能干细胞聚集体。当以这样的方式形成多能干细胞聚集体时，可以以良好的重现性在由所形成的聚集体诱导和分化的细胞中形成上皮样结构。形成聚集体的实验操作的实例包括涉及使用具有小孔的平板(例如，当以平底方式计算时，具有基底面积为约0.1-2.0cm2的孔的平板)、微孔等将细胞保持在小空间内的方法，涉及通过用小离心管短时间离心而使细胞聚集的方法。关于具有小孔的平板，例如，可以提及24孔平板(当以平底方式计算时，面积约为1.88cm2)、48孔平板(当以平底方式计算时，面积约为1.0cm2)、96孔平板(当以平底方式计算时，面积约为0.35cm2，内径约为6-8mm)和384孔平板。优选96孔平板。关于具有小孔的平板的形状，例如，从上方看孔时底表面的形状为多边形、长方形、椭圆形、真正的圆形，优选是真正的圆形。关于从侧孔观察孔时具有小孔的平板的形状，底表面的形状可以是平底结构或具有高外部周长和低内部凹陷的结构。底表面的形状包括，例如，U型底、V型底、M型底，优选U型底或V型底，更优选V型底。关于具有小孔的平板，也可以使用在底表面上具有凹凸或齿状(dent)的细胞培养平皿(例如，60mm-150mm的平皿，培养瓶)。具有小孔的平板的底表面优选是非细胞粘附性底表面，优选前述非细胞粘附性涂覆的底表面。
包含多能干细胞的聚集体或包含多能干细胞的细胞群的形成以及它们的均匀性可以基于聚集体块的尺寸和其中的细胞数目、宏观形态、通过组织染色分析的微观形态和它们的同质性等来确定。另外，可以基于聚集体的宏观形态、通过组织染色分析的微观形态及其均匀性、分化和未分化标记的表达及其均匀性、分化标记表达的控制及其同步性、聚集体之间的分化效率的重现性等确定聚集体中上皮样结构的形成及其均匀性。
在本发明中，“组织”是指细胞群结构，其具有这样的构造，其中具有均匀的形态或性质的一种细胞，或具有不同形态和性质的多种类型的细胞在空间上以给定模式排列。
在本发明中，“神经组织”是指由神经细胞组成的组织，包括处在发育阶段或成人阶段的大脑、中脑、小脑、脊髓、视网膜、周围神经、前脑、后脑、端脑、间脑等。神经组织有时形成具有层结构的上皮结构(神经上皮)，并且细胞聚集体中神经上皮的量可以通过使用光学显微镜的亮视野观察进行评价。
在本发明中，“神经细胞”是指来源于外胚层的组织中除表皮谱系细胞之外的细胞。即，其包括诸如神经前体细胞、神经元(神经元细胞)、神经胶质、神经干细胞、神经元前体细胞、神经胶质前体细胞等的细胞。神经细胞还包括组成下文提及的视网膜组织(视网膜细胞)、视网膜祖先细胞、视网膜层专有的神经元、神经视网膜细胞和视网膜色素上皮细胞的细胞。神经细胞可以通过使用巢蛋白、TuJ1、PSA-NCAM、N-钙粘蛋白等作为标记进行鉴定。
神经元(或神经元细胞)是形成神经回路并且对信号转导有贡献的功能细胞，并且可以通过使用不成熟神经元标记(诸如TuJ1，Dcx，HuC/D等)和/或成熟神经元细胞标记(诸如Map2，NeuN等)的表达作为指标进行鉴定。
关于神经胶质，可以提及星形胶质细胞、少突胶质细胞、Müller胶质等。关于星形胶质细胞标记，可以提及GFAP；关于少突胶质细胞标记，可以提及O4，并且关于Müller胶质标记，可以提及CRALBP等。
神经干细胞是具有向神经元和胶质细胞的分化潜能(多能性)和维持多能性的增殖能力(有时称为自我更新能力)的细胞。关于神经干细胞标记，可以提及巢蛋白、Sox2、Musashi、Hes家族、CD133等；然而，这些标记通常是关于祖先细胞/前体细胞的标记，并且不被认为是神经干细胞-特异性的标记。神经干细胞的数量可以通过神经球测定、克隆测定等评估。
神经元前体细胞是具有增殖能力的细胞，其产生神经元，并且不产生胶质细胞。关于神经元前体细胞标记，可以提及Tbr2、Tα1等。备选地，不成熟的神经元标记(TuJ1，Dcx，HuC/D)-阳性的和生长标记(Ki67，pH3，MCM)-阳性的细胞也可以被鉴定为神经元前体细胞。
神经胶质前体细胞是具有增殖能力的细胞，其产生神经胶质细胞，并且不产生神经元。
神经前体细胞是前体细胞的集合，包括神经干细胞、神经元前体细胞和神经胶质前体细胞，并且具有增殖能力和神经元-与神经胶质-产生能力。神经前体细胞可以用巢蛋白、GLAST、Sox2、Sox1、Musashi、Pax6等作为标记鉴定。备选地，神经细胞标记-阳性的和生长标记(Ki67，pH3，MCM)-阳性的细胞也可以被鉴定为神经前体细胞。
在本发明中，“视网膜组织”意指这样的组织，其中在体内组成各个视网膜层的一种类型的或至少两种或更多种类型的细胞在空间上按层排列，所述细胞诸如感光细胞、感光前体细胞、视杆感光细胞、视锥感光细胞、中间神经元、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞(神经节细胞)、视网膜色素上皮细胞(RPE)、睫状边缘区细胞、它们的祖先/前体细胞以及视网膜祖先细胞等。由每个细胞组成的视网膜层可以通过已知的方法，例如，通过细胞标记表达的存在或不存在或其水平等验证。
本发明中的“视网膜层”表示构成视网膜的每个层。其具体实例包括视网膜色素上皮层，光感受器层，外界膜，外核层，外网织层，内核层，内网织层，神经节细胞层，神经纤维层和内界膜。
本发明中的“视网膜祖先细胞”是指能够分化成任何成熟的视网膜细胞(包括感光细胞，水平细胞，双极细胞，无长突细胞，视网膜神经节细胞和视网膜色素上皮细胞等)的祖先细胞。
在本发明中，“神经视网膜祖先细胞”是指能够分化成多种成熟的视网膜细胞(包括感光细胞，水平细胞，双极细胞，无长突细胞，视网膜神经节细胞等)中的任一种的祖先细胞。通常，神经视网膜祖先细胞不分化成视网膜色素上皮细胞。
感光前体细胞、水平细胞前体细胞、双极细胞前体细胞、无长突细胞前体细胞、视网膜神经节细胞前体细胞和视网膜色素上皮前体细胞分别是指确定分化成感光细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞和视网膜色素上皮细胞的前体细胞。
在本发明中，“视网膜层专有的神经元”是构成视网膜层的细胞并且为视网膜层所专有的神经元。视网膜层专有的神经元的实例包括双极细胞，视网膜神经节细胞，无长突细胞，水平细胞，感光细胞，视网膜色素上皮细胞，视杆细胞和视锥细胞。
视网膜细胞标记的实例包括在视网膜祖先细胞中表达的Rx(还称作Rax)、PAX6和Chx10，在下丘脑神经元的前体细胞中表达而在视网膜祖先细胞中不表达的Nkx2.1，在下丘脑神经上皮中表达而在视网膜中不表达的Sox1，在感光细胞的前体细胞中表达的Crx、Blimp1等，以及类似的标记。视网膜层专有的神经元的标记的实例包括在双极细胞中表达的Chx10、PKCα和L7，在视网膜神经节细胞表达中的TUJI和Brn3，在无长突细胞表达中的钙视网膜蛋白，在水平细胞表达中的钙结合蛋白，在成熟的感光细胞中表达的视紫质(Rhodopsin)和恢复蛋白，在视杆细胞中表达的Nrl和视紫质，在视锥细胞中表达的Rxr-γ和S-视蛋白，在视网膜色素上皮细胞中表达的RPE65和Miff，在睫状边缘区中表达的Rdh10和SSEA1等。
在本发明中，“大脑组织”是其中在胎儿阶段或成人中组成大脑的一种类型或至少多种类型的细胞(例如，皮质神经前体细胞，背侧大脑神经前体细胞，腹侧大脑神经前体细胞，大脑层结构专有的神经元，第1层神经元，第2层神经元，第3层神经元，第4层神经元，第5层神经元，第6层神经元，神经胶质细胞(星形胶质细胞和少突胶质细胞)，这些前体细胞等)在空间上按层排列的组织。胎儿阶段的大脑还称为前脑或端脑。每个细胞的存在可以通过已知的方法验证，例如，通过存在或不存在细胞标记的表达或其水平等验证。
在本发明中，“大脑层”意指组成成人大脑或胎儿阶段大脑的每个层，并且特别包括分子层、外部颗粒层、外部锥体层、内部颗粒层、神经节层(内锥体层)、多形层、第1层、第2层、第3层、第4层、第5层、第6层、皮质带、中间带、脑室下带和脑室带(ventricular zone)。
本发明中“大脑神经前体细胞”的实例包括神经元前体细胞、第1层神经元前体细胞、第2层神经元前体细胞、第3层神经元前体细胞、第4层神经元前体细胞、第5层神经元前体细胞、第6层神经元前体细胞、星形胶质细胞前体细胞、少突胶质细胞前体细胞等。它们是分别确定分化为第1层神经元、第2层神经元、第3层神经元、第4层神经节、第5层神经元、第6层神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的前体细胞。
在本发明中，“大脑神经前体细胞”包括具有向来自第1层神经元、第2层神经元、第3层神经元、第4层神经元、第5层神经元、第6层神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的至少多个分化谱系的分化潜能(多能性)的多能干细胞(多能神经干细胞)。
在本发明中，“大脑层专有的神经元”是组成大脑层并且是大脑层专有的神经元的细胞。关于大脑层专有的神经元，可以提及第1层神经元、第2层神经元、第3层神经元、第4层神经节、第5层神经元、第6层神经元、大脑兴奋性神经元、大脑抑制性神经元等。
大脑细胞标记的实例包括在大脑细胞中表达的FoxG1(别名为Bf1)，在大脑神经前体细胞中表达的Sox2和巢蛋白，在背侧大脑神经前体细胞中表达的Pax6和Emx2，在腹侧大脑神经前体细胞中表达的Dlx1、Dlx2和Nkx2.1，在神经元前体细胞中表达的Tbr2、Nex、Svet1，在第6层神经元中表达的Tbr1，在第5层神经元中表达的Ctip2，在第4层神经元中表达的RORβ，在第3层神经元或第2层神经元中表达的Cux1或Brn2，在第1层神经元中表达的Reelen等。
2.制备神经细胞或神经组织的方法
本发明的制备方法1是用于制备神经细胞或神经组织的方法，所述方法包括下述步骤(1)-(3)：
(1)第一步，在不存在饲养细胞的条件下在含有1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径激活物质和2)用于维持未分化状态的因子的培养基中培养多能干细胞，
(2)第二步，悬浮培养第一步中得到的细胞，从而形成细胞聚集体，和
(3)第三步，在存在或不存在分化诱导因子的条件下悬浮培养第二步中得到的聚集体，从而得到包含神经细胞或神经组织的聚集体。
在步骤(1)中，在不存在饲养细胞的条件下在含有1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径激活物质和2)用于维持未分化状态的因子的培养基中培养多能干细胞。
关于步骤(1)中的优选的多能干细胞，可以提及诱导的多能干细胞或胚胎干细胞(ES细胞)，更优选人诱导的多能干细胞。
诱导的多能干细胞的制备方法没有特别限制，并且其可以通过本领域普通技术人员公知的方法产生，如上文提及的。在无饲养细胞的条件下进行制备诱导的多能干细胞的步骤(即，使体细胞重新编程建立多能干细胞的步骤)也是合乎需要的。
尽管胚胎干细胞(ES细胞)的制备方法没有特别限制，并且可以通过本领域普通技术人员公知的方法制备，如上文提及的，但是在无饲养细胞的条件下进行制备胚胎干细胞(ES细胞)的步骤也是合乎需要的。
用于步骤(1)中所用的多能干细胞的维持培养或扩增培养可以通过本领域普通技术人员公知的方法进行，如上文提及的。尽管多能干细胞的维持培养和扩增培养可以通过贴壁培养或悬浮培养进行，但是其优选地通过贴壁培养进行。尽管多能干细胞的维持培养和扩增培养可以在存在饲养细胞的条件下或在无饲养细胞的条件下进行，但是其优选在无饲养细胞的条件下进行。在多能干细胞的维持培养和扩增培养中不存在饲养细胞(无饲养细胞)意指基本上不含饲养细胞的条件(例如，饲养细胞的数目相对于细胞总数的比例不大于3％)。优选地，多能干细胞的维持培养和扩增培养在无饲养细胞的条件下进行。
在步骤(1)中不存在饲养细胞(无饲养细胞)意指基本上没有饲养细胞的条件(例如，饲养细胞数目相对于细胞总数的比例不大于3％)。优选地，步骤(1)在无饲养细胞的条件下进行。用于步骤(1)的培养基没有特别限制，只要其是能够允许在无饲养细胞条件下维持未分化状态的多能干细胞培养的培养基(无饲养细胞培养基)即可。优选地，为了允许维持未分化状态的培养，其包含用于维持未分化状态的因子。
用于维持未分化状态的因子没有特别限制，只要其是具有抑制多能干细胞分化的作用的物质即可。在致敏的(primed)多能干细胞(例如，人ES细胞，人iPS细胞)的情形中，本领域普通技术人员广泛应用的用于维持未分化状态的因子的实例包括FGF信号转导途径激活物质、TGFβ家族信号转导途径激活物质、胰岛素等。关于FGF信号转导途径激活物质，可以特别提及成纤维细胞生长因子(例如，bFGF，FGF4，FGF8)。关于TGFβ家族信号转导途径激活物质，可以提及TGFβ信号转导途径激活物质，Nodal/激活蛋白信号转导途径激活物质。关于TGFβ信号转导途径激活物质，可以提及TGFβ1、TGFβ2。关于Nodal/激活蛋白信号转导途径激活物质，可以提及Nodal、激活蛋白A、激活蛋白B。当培养人多能干细胞(人ES细胞，人iPS细胞)时，步骤(1)的培养基优选包含bFGF作为用于维持未分化状态的因子。
用于本发明的维持未分化状态的因子通常是用于维持哺乳动物未分化状态的因子。所述哺乳动物例如上文提及的那些。由于用于维持未分化状态的因子可以在哺乳动物物种之间具有交叉反应性，因此也可以使用用于维持任何哺乳动物未分化状态的因子，只要能够维持要培养的多能干细胞的未分化状态即可。优选地，使用用于维持与要培养的细胞是同一物种的哺乳动物的未分化状态的因子。例如，对于人多能干细胞的培养，使用用于维持未分化状态的人因子(例如，bFGF，FGF4，FGF8，EGF，Nodal，激活蛋白A，激活蛋白B，TGFβ1，TGFβ 2等)。此处，“人蛋白X”意指蛋白X具有在人体内天然表达的蛋白X的氨基酸序列。
用于本发明的维持未分化状态的因子优选是分离的。“分离的”意指已经进行了去除除想要的成分或细胞之外的因子的操作，并且所述成分或细胞不再以天然存在的状态存在。因此，“分离的蛋白X”不包括由培养的细胞或组织产生的和包含在细胞或组织中或在培养基中的内源性蛋白X。“分离的蛋白X”的纯度(蛋白X重量占总蛋白重量的百分数)通常不小于70％，优选不小于80％，更优选不小于90％，还优选不小于99％，进一步优选为100％。因此，在一个实施方案中，本发明包括提供分离的用于维持未分化状态的因子的步骤。在一个实施方案中，其包括向步骤(1)中使用的培养基中外源添加分离的用于维持未分化状态的因子的步骤。备选地，可以在步骤(1)中使用的培养基中预先添加用于维持未分化状态的因子。
在步骤(1)中使用的培养基中用于维持未分化状态的因子的浓度是能够维持要培养的多能干细胞的未分化状态的浓度，并且可以由本领域普通技术人员适当地确定。例如，具体地，当在不存在饲养细胞的条件下使用bFGF作为用于维持未分化状态的因子时，其浓度通常为约4ng-500ng/mL，优选约10ng-200ng/mL，更优选约30ng-150ng/mL。
关于无饲养细胞的培养基，已经开发了多种合成的培养基，并且是可商购获得的，例如，可以提及Essential 8培养基。Essential 8培养基是包含下述各项作为添加剂的DMEM/F12培养基：L-抗坏血酸-2-磷酸镁(64mg/l)，硒酸钠(sodium selenium)(14μg/l)，胰岛素(19.4mg/l)，NaHCO3(543mg/l)，转铁蛋白(10.7mg/l)，bFGF(100ng/mL)，和TGFβ家族信号转导途径激活物质(TGFβ 1(2ng/mL)或Nodal(100ng/mL))(Nature Methods，8，424-429(2011))。可商购的无饲养细胞培养基的实例包括Essential 8(由Life Technologies制造)，S-培养基(由DS Pharma Biomedical制造)，StemPro(由Life Technologies制造)，hESF9(Proc Natl Acad Sci U S A.2008年9月9日；105(36)：13409-14)，mTeSR1(由STEMCELL Technologies制造)，mTeSR2(由STEMCELL Technologies制造)，和TeSR-E8(由STEMCELL Technologies制造)。除了这些之外，可以提及StemFit(由Ajinomoto Co.，Inc.制造)作为无饲养细胞的培养基。本发明可以通过在上文提及的步骤(1)中使用这些而便利地进行。
在步骤(1)中，所述多能干细胞可以在悬浮培养和贴壁培养的任何条件下培养，优选进行贴壁培养。
尽管用于贴壁培养的培养容器没有特别限制，只要能够进行“贴壁培养”即可，但是优选细胞粘附性培养容器。细胞粘附性培养容器包括表面已经经过人工处理以提高细胞粘附性的培养容器，并且具体地，可以提及上文提及的表面处理的培养容器，内部用涂层剂涂覆的培养容器。涂层剂的实例包括细胞外基质，如层粘连蛋白[包括层粘连蛋白α5β1γ1(以下为层粘连蛋白511)，层粘连蛋白α1β1γ1(以下为层粘连蛋白111)等和层粘连蛋白片段(层粘连蛋白511E8等)]，触觉蛋白，胶原蛋白，明胶，玻连蛋白，Synthemax(CorningIncorporated)，基质胶(Matrigel)等，或聚合物，诸如聚赖氨酸，聚鸟氨酸等，以及类似的物质。还可以使用表面经过正电荷处理等处理的培养容器。优选的是层粘连蛋白，更优选的是层粘连蛋白511E-8。层粘连蛋白511E-8可以是商购产品(例如，iMatrix-511，Nippi)。
用于步骤(1)的培养基包含TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonichedgehog信号转导途径激活物质。在第一步中，将多能干细胞用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径激活物质处理，并且在第二步中进行悬浮培养，其结果是所述多能干细胞的状态改变，聚集体的质量提高，并且能够以高效率产生具有平滑的表面和致密的内部并且维持未分化状态的球形细胞聚集体。
TGFβ家族信号转导途径(即，TGFβ超家族信号转导途径)是由以TGFβ、Nodal/激活蛋白或BMP作为配体的Smad家族在细胞内传递的信号转导途径。
所述TGFβ家族信号转导途径抑制物质是指抑制TGFβ家族信号转导途径(即，由Smad家族传递的信号转导途径)的物质，并且具体的实例包括TGFβ信号转导途径抑制物质、Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质和BMP信号转导途径抑制物质。
TGFβ信号转导途径抑制物质没有特别限制，只要其抑制由TGFβ引起的信号转导途径即可，并且可以是核酸、蛋白、和低分子量有机化合物中的任一种。所述物质的实例包括直接作用于TGFβ的物质(例如，蛋白、抗体、适体等)，抑制编码TGFβ的基因的表达的物质(例如，反义寡核苷酸、siRNA等)，抑制TGFβ受体与TGFβ的结合的物质，和抑制由TGFβ受体的信号转导引起的生理活性的物质(例如，TGFβ受体抑制剂、Smad抑制剂等)。已知作为TGFβ信号转导途径抑制物质的蛋白，可以提及Lefty等。关于TGFβ信号转导途径抑制物质，可以使用本领域普通技术人员公知的化合物，并且具体地，可以提及SB431542、LY-364947、SB-505124、A-83-01等。此处，SB431542(4-(5-苯[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-4-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基)-苯甲酰胺)和A-83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-羰基硫代酰胺(carbothioamide))是已知作为TGFβ受体(ALK5)和激活蛋白受体(ALK4/7)的抑制剂(即，TGFβR抑制剂)的化合物。所述TGFβ信号转导途径抑制物质优选是SB431542或A-83-01。
所述Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质没有特别限制，只要其抑制由Nodal或激活蛋白引起的信号转导途径即可，并且可以是核酸、蛋白和低分子量有机化合物中的任一种。该物质的实例包括直接作用于Nodal或激活蛋白的物质(例如，抗体、适体等)、抑制编码Nodal或激活蛋白的基因的表达的物质(例如，反义寡核苷酸、siRNA等)、抑制Nodal/激活蛋白受体与Nodal/激活蛋白的结合的物质和抑制由Nodal/激活蛋白受体的信号转导引起的生理活性的物质。关于Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质，可以使用本领域普通技术人员公知的化合物，并且具体地，可以提及SB431542、A-83-01等。此外，可以使用已知作为Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质的蛋白(Lefty，Cerberus等)。Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质优选为SB431542、A-83-01或Lefty。
所述BMP信号转导途径抑制物质没有特别限制，只要其抑制由BMP引起的信号转导途径即可，并且可以是核酸、蛋白、和低分子量有机化合物中的任一种。此处，关于BMP，可以提及BMP2，BMP4，BMP7和GDF7。该物质的实例包括直接作用于BMP的物质(例如，抗体、适体等)、抑制编码BMP的基因的表达的物质(例如，反义寡核苷酸、siRNA等)、抑制BMP受体(BMPR)与BMP的结合的物质和抑制由BMP受体的信号转导引起的生理活性的物质。关于BMPR，可以提及ALK2和ALK3。关于BMP信号转导途径抑制物质，可以使用本领域普通技术人员公知的化合物，并且具体地，可以提及LDN193189、Dorsomorphin等。此处，LDN193189(4-[6-(4-哌嗪-1-基苯基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基]喹啉)是已知的BMPR(ALK2/3)抑制剂(以下为BMPR抑制剂)，并且通常以盐酸盐的形式商购得到。此外，可以使用已知作为BMP信号转导途径抑制物质的蛋白(Chordin，Noggin等)。BMP信号转导途径抑制物质优选是LDN193189。
TGFβ家族信号转导途径抑制物质优选是Lefty、SB431542、A-83-01或LDN193189。
多种具有不同作用位点的TGFβ家族信号转导途径抑制物质可以组合使用。通过将它们组合，预计提高聚集体质量改善效果。例如，可以提及TGFβ信号转导途径抑制物质与BMP信号转导途径抑制物质的组合，TGFβ信号转导途径抑制物质与Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质的组合，BMP信号转导途径抑制物质与Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质的组合。优选地，TGFβ信号转导途径抑制物质与BMP信号转导途径抑制物质组合使用。例如，特别优选的组合是SB431542与LDN193189的组合。
Sonic hedgehog(以下有时表示为Shh)信号转导途径激活物质是能够提高由Shh介导的信号转导的物质。Shh信号转导途径激活物质的实例包括属于Hedgehog家族的蛋白(例如，Shh和Ihh)，Shh受体，Shh受体激动剂，PMA(Purmorphamine；9-环己基-N-[4-(4-吗啉基)苯基]-2-(1-萘基氧基)-9H-嘌呤-6-胺)，SAG(平滑的激动剂；N-甲基-N’-(3-吡啶基苄基)-N’-(3-氯代苯并[b]噻吩-2-羰基)-1，4-二氨基环己烷)等。所述Shh信号转导途径激活物质优选是Shh蛋白(Genbank登记号：NM_000193，NP_000184)，SAG或PMA。
TGFβ家族信号转导途径抑制物质与Shh信号转导途径激活物质可以组合使用。通过将它们组合，预计提高聚集体质量改善作用。关于特定的组合，可以提及选自由Lefty、SB431542、A-83-01和LDN193189组成的组的任一种TGFβ家族信号转导途径抑制物质与选自由Shh蛋白、SAG和PMA组成的组的Shh信号转导途径激活物质的组合。当组合使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质与Shh信号转导途径激活物质时，可以将细胞在包含TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径激活物质二者的培养基中培养，或者可以将细胞用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径激活物质中的任一种处理，并且继续用它们中的任一种或两种处理。
可以适当地确定TGFβ家族信号转导途径抑制物质与Sonic hedgehog信号转导途径激活物质的浓度落入能够提供前述作用的范围内。例如，SB431542通常以0.1-200μM、优选2-50μμM的浓度使用。A-83-01通常以0.05-50μM、优选0.5-5μM的浓度使用。LDN193189通常以1-2000nM、优选10-300nM的浓度使用。Lefty通常以5-200ng/ml、优选10-50ng/ml的浓度使用。Shh蛋白通常以20-1000ng/ml、优选50-300ng/ml的浓度使用。SAG通常以1-2000nM、优选10-700nM、更优选30-600nM的浓度使用。PMA通常以0.002-20μM、优选0.02-2μM的浓度使用。在一个实施方案中，TGFβ家族信号转导途径抑制物质可以适当地以赋予与前述浓度的SB43154相当的TGFβ家族信号转导途径抑制活性的量使用。在一个实施方案中，Sonichedgehog信号转导途径激活物质可以适当地以赋予与前述浓度的SAG相当的Shh信号转导促进活性的量使用。
SB431542、LDN193189等的TGFβ家族信号转导途径抑制活性可以通过本领域普通技术人员公知的方法确定，例如，通过经由蛋白质印迹法检测Smad的磷酸化(Mol CancerTher.(2004)3，737-45)确定。SAG等的Sonic hedgehog信号转导促进活性可以通过本领域普通技术人员公知的方法确定，例如，通过聚焦Gli1基因表达的报道基因测定(Oncogene(2007)26，5163-5168)确定。
尽管用于步骤(1)的培养基可以是含血清培养基或无血清培养基，但是优选是无血清培养基，以避免化学上不确定的成分的污染。
为了避免化学上不确定的成分的污染，用于步骤(1)的培养基可以是成分为化学上确定的培养基。
在步骤(1)中，多能干细胞可以在悬浮培养和贴壁培养的任一条件下培养，优选进行贴壁培养。
对于步骤(1)中在无饲养细胞的条件下培养多能干细胞，可以使用前文提及的无饲养细胞培养基作为培养基。关于无饲养细胞培养基，可以提及Essential 8，S-培养基，StemPro，hESF9，mTeSR1，mTeSR2，TeSR-E8，或StemFit等，并且优选使用Essential 8或StemFit。
对于步骤(1)中在无饲养细胞的条件下培养多能干细胞，可以使用适当的基质作为构架，用于给多能干细胞提供替代饲养细胞的构架。多能干细胞在表面用作为构架的基质涂覆的细胞容器中进行贴壁培养。
关于可以用作构架的基质，可以提及层粘连蛋白(Nat Biotechnol 28，611-615(2010))，层粘连蛋白片段(Nat Commun 3，1236(2012))，基膜制剂(Nat Biotechnol 19，971-974(2001))，明胶，胶原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，触觉蛋白，玻连蛋白等。
“层粘连蛋白”是由α、β、γ链组成的异三聚体分子，并且是包含具有不同亚基链组成的异构体的细胞外基质蛋白。具体地，基于具有5种α链、4种β链和3种γ链的异三聚体组合，层粘连蛋白具有约15种异构体。层粘连蛋白的名称通过组合α链(α1-α5)、β链(β1-β4)和γ链(γ1-γ3)各自的数目而确定。例如，具有α5链、β1链、γ1链的组合的层粘连蛋白称为层粘连蛋白511。在本发明中，优选使用层粘连蛋白511(Nat Biotechnol 28，611-615(2010))。
用于本发明的层粘连蛋白通常是哺乳动物层粘连蛋白。关于哺乳动物，可以提及上文提及的那些。为了获得无外源物质(xeno-free)的条件，优选使用与要培养的细胞是相同物种的哺乳动物的层粘连蛋白。例如，使用人层粘连蛋白(优选地，人层粘连蛋白511)培养人多能干细胞。
本发明中使用的层粘连蛋白片段没有特别限制，只要其具有与多能干细胞的粘附性并且允许在无饲养细胞的条件下维持培养多能干细胞即可，并且其优选是E8片段。在通过用弹性蛋白酶消化层粘连蛋白511得到的多个片段中，层粘连蛋白E8片段被鉴定为具有强细胞粘附活性的片段(EMBO J.，3：1463-1468，1984，J.Cell Biol.，105：589-598，1987)。在本发明中，优选使用层粘连蛋白511的E8片段(Nat Commun 3，1236(2012)，ScientificReports 4，3549(2014))。用于本发明的层粘连蛋白E8片段不需要是层粘连蛋白的弹性蛋白酶消化产物，并且可以是重组的。为了避免不确定成分的污染，在本发明中优选使用重组的层粘连蛋白片段。层粘连蛋白511的E8片段可商购获得，并且，例如，可以从Nippi，Inc.等购买。
用于本发明的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段优选是分离的。
本发明中的“基膜制剂”是指这样的制剂，即，当将能够形成基膜的目的细胞涂布在其上并培养时，包含具有与上皮细胞的那些功能类似的控制细胞形态、分化、生长、移动性、功能表达等的功能的基膜组成成分的制剂。例如，当进行进一步的贴壁培养时，通过本发明制备的神经细胞和神经组织可以分散并在存在基膜制剂的条件下培养。此处，“基膜组成成分”是指在动物组织中的上皮细胞层与间质细胞层等之间存在的薄膜形式的胞外基质分子。例如，基膜制剂可以通过用能够溶解细胞的脂质的溶液、碱溶液等从支持物上去除能够形成基膜的细胞而产生，所述细胞通过基膜粘附在所述支持物上。基膜制剂的实例包括可作为基膜制剂商购获得的产品(例如，MatrigelTM(由Corning Incorporated制造：以下有时称为基质胶(Matrigel)))，GeltrexTM(由Life Technologies制造)，和已知为基膜成分的细胞外基质(例如，层粘连蛋白，IV型胶原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，触觉蛋白等)。
MatrigelTM是从Engelbreth Holm Swarn(EHS)小鼠肉瘤提取的基膜制剂。MatrigelTM的主要成分是IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和触觉蛋白。除了这些之外，包含TGF-β、FGF、组织纤溶酶原激活物和由EHS肿瘤天然产生的生长因子。MatrigelTM的“生长因子减少的产品”具有比常规MatrigelTM低的生长因子浓度，并且其标准浓度为：＜0.5ng/ml的EGF，＜0.2ng/ml的NGF，＜5pg/ml的PDGF，5ng/ml的IGF1，和1.7ng/ml的TGFβ。
为了避免不确定的成分的污染，在本发明中优选使用分离的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段。
优选地，在步骤(1)中在无饲养细胞的条件下培养多能干细胞时，将多能干细胞在表面用分离的层粘连蛋白511或层粘连蛋白511的E8片段(更优选地，层粘连蛋白511的E8片段)涂覆的细胞容器中以粘附状态培养。
尽管步骤(1)中培养多能干细胞的时间期没有特别限制，只要可以实现提高步骤(2)中形成的聚集体的质量的效果即可，其通常为0.5-144小时。步骤(1)中培养多能干细胞的时间期优选不少于1小时，不少于2小时，不少于6小时，不少于12小时，不少于18小时，或不少于24小时。步骤(1)中培养多能干细胞的时间期在96小时或72小时之内。在一个实施方案中，步骤(1)中培养多能干细胞的时间期优选为2-96小时，更优选6-48小时，进一步优选12-48小时，进一步更优选18-28小时(例如，24小时)。即，第一步在步骤(2)开始前0.5-144小时(优选18-28小时)开始，并且步骤(2)在步骤(1)结束时继续进行。在另一个实施方案中，步骤(1)中培养多能干细胞的时间期优选为18-144小时，24-144小时，24-96小时，或24-72小时。当将细胞用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径激活物质中的任一种处理，并且用另一种继续处理时，可以设置每一种的处理时间落入前述提及的培养时间期范围内。
可以适当地确定步骤(1)中的培养条件，如培养温度和CO2浓度。例如，尽管培养温度为约30℃-约40℃，但是优选约37℃。例如，CO2浓度为约1％-约10％，优选约5％。
在一个优选的实施方案中，在不存在饲养细胞的条件下，和在包含bFGF的无血清培养基中，以粘附状态培养人多能干细胞(例如，人iPS细胞)。优选地，在表面用层粘连蛋白511、层粘连蛋白511的E8片段或玻连蛋白涂覆的细胞容器中进行贴壁培养。贴壁培养优选地使用Essential 8、TeSR培养基、mTeSR培养基、mTeSR-E8培养基或StemFit培养基、更优选Essential 8或StemFit培养基作为无饲养细胞的培养基进行。
在一个优选的实施方案中，在不存在饲养细胞的条件下，和在包含bFGF的无血清培养基中，悬浮培养人多能干细胞(例如，人iPS细胞)。在悬浮培养中，人多能干细胞可以形成人多能干细胞聚集体。
在优选的实施方案中，步骤(1)中得到的细胞维持多能样状态，并且在整个步骤(1)过程中，该多能样状态得以维持。多能样状态意指维持多能干细胞特有的和多能干细胞共有的至少一部分特征(包括多能性)的状态。多能样状态不必须是严格的多能性。具体地，在“多能样状态”中包括表达作为多能状态的指标的全部或部分标记的状态。关于多能样状态的标记，可以提及Oct3/4阳性的、碱性磷酸酶阳性的等。在一个实施方案中，维持多能样状态的细胞是Oct3/4阳性的。甚至在与ES细胞或iPS细胞相比Nanog的表达水平低时，其包括在“显示多能样状态的细胞”中。
在一个实施方案中，步骤(1)中得到的细胞是具有分化成至少神经细胞或神经组织(优选地，视网膜组织，视网膜细胞，视网膜祖先细胞，或视网膜层专有的神经元)的潜能的干细胞。在一个实施方案中，步骤(1)中得到的细胞是具有分化成至少神经细胞或神经组织(优选地，视网膜组织，视网膜细胞，视网膜祖先细胞，或视网膜层专有的神经元)的潜能的Oct3/4阳性的干细胞。
在优选的实施方案中，在不存在饲养细胞的条件下在含有TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径激活物质和bFGF的无血清培养基中，以粘附状态培养人多能干细胞(例如，iPS细胞)。
前述贴壁培养优选在表面用层粘连蛋白511或层粘连蛋白511的E8片段涂覆的细胞容器内进行。所述TGFβ家族信号转导途径抑制物质优选为TGFβ信号转导途径抑制物质(例如，SB431542，A-83-01，Lefty)、Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01)、BMP信号转导途径抑制物质(例如，LDN193189，Chordin，Noggin)或它们的组合(例如，SB431542与LDN193189)。TGFβ家族信号转导途径抑制物质更优选是Lefty，SB431542，A-83-01，或LDN193189，或它们的组合(例如，SB431542与LDN193189)。Sonichedgehog信号转导途径激活物质优选是Shh蛋白，SAG或Purmorphamine(PMA)，更优选是SAG。TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01，LDN193189)和Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，Shh蛋白，SAG，PMA)可以组合使用。用于培养的时间期是0.5-144小时(优选地，18-144小时，24-144小时，24-96小时，或24-72小时(例如，18-28小时))。
例如，步骤(1)这样进行：预先在不存在饲养细胞的条件下在含有用于维持未分化状态的因子的培养基中培养多能干细胞以维持未分化状态，向培养物中添加TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径激活物质，并且继续所述培养。
例如，在不存在饲养细胞的条件下和在包含bFGF的无血清培养基中培养人多能干细胞(例如，人iPS细胞)，以维持未分化状态。维持培养优选地通过贴壁培养进行。贴壁培养优选地在表面用玻连蛋白、层粘连蛋白511或层粘连蛋白511的E8片段涂覆的细胞容器内进行。然后，向培养物中添加TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径激活物质，并且继续所述培养。所述TGFβ家族信号转导途径抑制物质优选是TGFβ信号转导途径抑制物质(例如，SB431542，A-83-01，Lefty)，Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质(例如，SB431542，A-83-01，Lefty)，BMP信号转导途径抑制物质(例如，LDN193189)，或它们的组合(例如，SB431542与LDN193189)。TGFβ家族信号转导途径抑制物质更优选是Lefty，SB431542，A-83-01，或LDN193189，或它们的组合(例如，SB431542与LDN193189)。Sonic hedgehog信号转导途径激活物质优选是Shh蛋白，SAG或PMA。TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01，LDN193189)和Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，Shh蛋白，SAG，PMA)可以组合使用。在添加之后，培养继续进行0.5-144小时(优选地，18-144小时，24-144小时，24-96小时，或24-72小时(例如，18-28小时))。
解释步骤(2)，其中步骤(1)得到的细胞在培养基中悬浮培养，从而形成细胞聚集体。
用于步骤(2)的培养基没有特别限制，只要其在上文提及的定义部分有记载即可。用于步骤(2)的培养基可以是含血清培养基或无血清培养基。为了避免化学上不确定成分的污染，在本发明中优选使用无血清培养基。例如，可以使用无BMP信号转导途径激活物质和Wnt信号转导途径抑制物质二者的无血清培养基。例如，为了避免复杂的制备，优选使用补充了适量的商购血清代替物(如KSR等)的无血清培养基(例如，补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油和1x化学成分确定的脂质浓缩物的IMDM与F-12的1∶1混合物的培养基，或补充了5％-20％KSR、NEAA、丙酮酸、2-巯基乙醇的GMEM培养基)。在人多能干细胞的情形中，要添加到无血清培养基中的KSR的量通常为约1％至约30％，优选约2％至约20％。
关于聚集体的形成，首先通过对步骤(1)得到的细胞的分散操作而制备分散的细胞。通过分散操作得到的“分散的细胞”是指其中例如不少于70％的细胞是单细胞并且不多于30％的细胞是2-50个细胞的团块的状态。优选地，关于分散的细胞，可以提及其中不少于80％的细胞是单细胞并且不多于20％的细胞是2-50个细胞的团块的状态。分散的细胞是指几乎没有细胞的相互粘附(例如，平面附着)的状态。在该实施方案的一部分中，分散的细胞是指几乎不含细胞-细胞接合(例如，粘附连接)的状态。
步骤(1)得到的细胞的分散操作可以包含上文提及的机械分散处理、细胞分散液处理和细胞保护剂处理。这些处理可以联合进行。优选地，细胞分散液处理与细胞保护剂处理同时进行，然后进行机械分散处理。
关于用于细胞保护剂处理的细胞保护剂，可以提及FGF信号转导途径激活物质，肝素，IGF信号转导途径激活物质，血清，和血清代替物。关于用于抑制由分散引起的多能干细胞的细胞死亡(特别地，人多能干细胞的细胞死亡)的细胞保护剂，可以添加Rho相关卷曲螺旋激酶(ROCK)抑制剂或肌球蛋白抑制剂。为了抑制由分散引起的多能干细胞(特别是人多能干细胞)的细胞死亡，并保护细胞，可以在第二步培养开始时添加Rho相关卷曲螺旋激酶(ROCK)抑制剂或肌球蛋白抑制剂。关于ROCK抑制剂，可以提及Y-27632、Fasudil(HA1077)、H-1152等。关于肌球蛋白抑制剂，可以提及Blebbistatin。
关于用于细胞分散处理的细胞分散液，可以提及包含诸如胰蛋白酶、胶原蛋白酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、链霉蛋白酶、DNA酶、木瓜蛋白酶等中的任一种酶和诸如乙二胺四乙酸等的螯合剂的溶液。也可以使用商购的细胞分散液，诸如TrypLE Select(由LifeTechnologies生产)和TrypLE Express(由Life Technologies生产)。
关于机械分散处理方法，可以提及吹吸处理或刮刀的刮擦。
将分散的细胞悬浮在上文提及的培养基中。
然后，将分散的细胞的混悬液接种在上文提及的培养容器中，将分散的细胞在不与所述培养容器粘附的条件下培养，由此多个细胞聚集在一起形成聚集体。
在这种情形中，可以通过将分散的细胞接种在比较大的培养容器中，如10cm平皿中，在一个培养容器中同时形成多个细胞聚集体。然而，在这种情形中，聚集体的尺寸不同。因此，例如，将给定量的分散的干细胞放置在多孔平板(U型底、V型底)(如96孔微量平板)的每个孔中，并且进行静置培养，由此在每个孔中细胞快速凝聚形成一个聚集体。从多个孔中回收聚集体，由此可以得到均匀的聚集体群。
步骤(2)中细胞的浓度可以适当地设置，从而更均匀有效地形成细胞聚集体。例如，当使用96孔微孔平板悬浮培养人细胞(例如，步骤(1)中由人iPS细胞得到的细胞)时，向孔中添加制备得到每孔约1x103至约1x105个细胞、优选约3x103至约5x104个细胞、更优选约4x103至约2x104个细胞、进一步优选约4x103至约1.6x104个细胞、进一步更优选约8x103至约1.2x104个细胞的液体，并且将平板静置以形成聚集体。
可以适当地确定步骤(2)的培养条件，诸如培养温度、CO2浓度等。例如，培养温度为约30℃至约40℃，优选约37℃。例如，CO2浓度为约1％至约10％，优选约5％。
在步骤(2)中，当进行培养基更换操作时，例如，可以提及不丢弃已有的培养基添加新鲜培养基的操作(培养基添加操作)，弃掉约一半量的已有的培养基(已有的培养基体积的约30-90％，例如，40-60％)并且添加约一半量的新鲜培养基(已有的培养基体积的约30-90％，例如，40-60％)的操作(一半培养基更换操作)，和弃掉约全部量的已有的培养基(不少于已有的培养基的量的90％)并且添加约全部量的新鲜培养基(不少于已有的培养基的量的90％)的操作(完全培养基更换操作)。
当在特定时间点添加特定成分(例如，分化诱导因子)时，例如，可以进行这样的操作：计算终浓度，弃掉约一半量的已有的培养基，并且添加约一半量的新鲜培养基(一半培养基更换操作，一半培养基更换)，所述新鲜培养基包含浓度高于所述终浓度(具体地，所述终浓度的1.5倍-3倍，例如，约为终浓度的2倍)的特定成分。
当在特定时间点保持已有的培养基中包含的特定成分的浓度时，例如，可以进行这样的操作：弃掉约一半量的已有的培养基，并且添加约一半量的新鲜培养基，所述新鲜培养基包含浓度与已有的培养基中相同的特定成分。
当通过在特定时间点稀释而降低已有的培养基中包含的成分的浓度时，例如，可以每天多次进行培养基更换操作，优选在1小时内进行多次(例如，2-3次)。此外，当通过在特定时间点的稀释降低已有的培养基中包含的成分的浓度时，可以将细胞或聚集体转移到另一个培养容器中。
尽管用于培养基更换操作的工具没有特别限制，例如，可以提及移液管、微量移液管、多通道微量移液管、连续的分配器等。例如，当使用96孔平板作为培养容器时，可以使用多通道微量移液管。
形成细胞聚集体所需要的悬浮培养的时间期可以依据要用的细胞适当地确定，以使细胞可以均匀地聚集。为了形成均匀的细胞聚集体，理想地是尽可能短。用于分散的细胞形成细胞聚集体的步骤可以分成聚集细胞的步骤和由所聚集的细胞形成细胞聚集体的步骤。例如，在人细胞(例如，在步骤(1)中由人iPS细胞得到的干细胞)的情形中，在接种分散的细胞(即，在悬浮培养开始时)以使细胞聚集的步骤中，优选地在约24小时内，更优选在约12小时内，形成聚集的细胞。在人多能干细胞(例如，人iPS细胞)的情形中，从接种分散的细胞的时间点(即，在悬浮培养开始的时间)到形成聚集体的时间期，例如，优选在约72小时内，更优选在约48小时内。细胞聚集体形成的时间期可以通过控制使细胞聚集的工具、离心条件等而适当地调节。
可以基于聚集体的尺寸和细胞数目、宏观形态、组织染色分析的微观形态和其均匀性、分化-和未分化-标记的表达及其均匀性、分化标记表达的控制及其同步性、聚集体之间的分化效率的重现性等，确定细胞聚集体的形成及其均匀性。
在聚集体形成后，聚集体可以按原样继续培养。步骤(2)中悬浮培养的时间期通常为约12小时-6天，优选约12小时-48小时。
在一个实施方案中，用于步骤(2)的培养基包含Sonic hedgehog信号转导途径激活物质。在步骤(1)中，将多能干细胞用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonichedgehog信号转导途径激活物质处理；并且在第二步中，将在第一步中得到的细胞在包含Sonic hedgehog信号转导途径激活物质的培养基(优选是无血清培养基)中悬浮培养，从而进一步提高聚集体的质量，并且能够以高效率形成球形的、表面平滑的、未塌陷的、内部致密的维持未分化特性的细胞聚集体。
关于Sonic hedgehog信号转导途径激活物质，可以使用上文提及的那些。优选地，所述Sonic hedgehog信号转导途径激活物质是SAG，Purmorphamine(PMA)或Shh蛋白。可以适当地确定Sonic hedgehog信号转导途径激活物质在培养基中的浓度，以落在能够实现前述效果的范围内。SAG通常以1-2000nM、优选10nM-1000nM、更优选10nM-700nM、进一步优选50nM-700nM、进一步优选100nM-600nM、进一步优选100nM-500nM的浓度使用。PMA通常以0.002-20μM、优选0.02-2μμM的浓度使用。Shh蛋白通常以20-1000ng/ml、优选50-300ng/ml的浓度使用。当使用除SAG、PMA和Shh蛋白之外的Sonic hedgehog信号转导途径激活物质时，其理想地以赋予与上文提及的浓度的SAG的活性相当的Sonic hedgehog信号转导促进活性的浓度使用。
向培养基中添加Sonic hedgehog信号转导途径激活物质的时间安排没有特别限制，只要能够提供上文提及的效果即可，但是越早添加能够获得更高的效果。Sonichedgehog信号转导途径激活物质通常在自步骤(2)开始时6天内、优选在3天内、更优选在1天内、并且进一步优选地在步骤(2)开始时添加到培养基中。
在优选的实施方案中，在步骤(2)中，将在步骤(1)中得到的人细胞(例如，在步骤(1)中由人iPS细胞得到的细胞)在包含Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，SAG，PMA，Shh蛋白)的无血清培养基中进行悬浮培养，从而形成聚集体。Sonic hedgehog信号转导途径激活物质优选在悬浮培养开始时就包含在培养基中。还可以向培养基中添加ROCK抑制剂(例如，Y-27632)。培养的时间期是12小时-6天，优选12小时-48小时。形成的聚集体优选是均匀的聚集体。
例如，将在步骤(1)中得到的人细胞(例如，在步骤(1)中由人iPS细胞得到的细胞)回收，在包含Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，SAG，PMA，Shh蛋白)的无血清培养基中分散成单细胞或接近单细胞的状态，并且进行悬浮培养。所述无血清培养基可以包含ROCK抑制剂(例如，Y-27632)。将人多能干细胞(例如，人iPS细胞)的混悬液接种在上文提及的培养容器中，并且在多能干细胞不与培养容器粘附的条件下培养分散的多能干细胞，由此组装多个多能干细胞形成聚集体。培养的时间期是12小时-6天，优选12小时-48小时。形成的聚集体优选是均匀的聚集体。
在一个优选的实施方案中，在步骤(1)中，将多能干细胞用TGFβ信号转导途径抑制物质处理，并且在步骤(2)中，将步骤(1)中得到的细胞在包含Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，SAG，PMA，Shh蛋白)的培养基中进行悬浮培养。优选地，此处可以使用SB431542或A-83-01作为TGFβ信号转导途径抑制物质。
在一个优选的实施方案中，在步骤(1)中，将多能干细胞用BMP信号转导途径抑制物质处理，并且在步骤(2)中，将步骤(1)中得到的细胞在不含Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，SAG，PMA，Shh蛋白)的培养基中进行悬浮培养。优选地，此处可以使用LDN193189作为BMP信号转导途径抑制物质。
在一个优选的实施方案中，在步骤(1)中，将多能干细胞(例如，人多能干细胞)用下述各项处理：TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如，TGFβ信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01)，Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01)，BMP信号转导途径抑制物质(例如，LDN193189)，或它们的组合(例如，SB431542与LDN193189)等)；Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，Shh蛋白，SAG，PMA)；或TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01，LDN193189)与Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，Shh蛋白，SAG，PMA)的组合，并且在步骤(2)中，在包含Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，SAG，PMA，Shh蛋白)的培养基中进行步骤(1)中得到的细胞的悬浮培养。
在另一个实施方案中，在步骤(1)中，将多能干细胞(例如，人多能干细胞)用下述各项处理：TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如，TGFβ信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01)，Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01)，BMP信号转导途径抑制物质(例如，LDN193189)，或它们的组合(例如，SB431542与LDN193189)等)；Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，Shh蛋白，SAG，PMA)；或TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01，LDN193189)与Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，Shh蛋白，SAG，PMA)的组合，并且在步骤(2)中，在不含Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，SAG，PMA，Shh蛋白)的培养基中进行步骤(1)中得到的细胞的悬浮培养。
在任意实施方案中，步骤(2)中的培养基优选包含ROCK抑制剂(例如，Y-27632)。
通过以这种方式进行步骤(2)，形成步骤(1)中得到的细胞或由其衍生的细胞的聚集体。本发明还提供制备所述聚集体的方法。与通过在步骤(1)不进行TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径激活物质处理形成的聚集体相比，步骤(2)中得到的聚集体具有更高的质量。具体而言，可以得到具有高比例的球形细胞聚集体的聚集体群，所述球形细胞聚集体具有光滑的表面、致密的内部、和未塌陷的形状。在一个实施方案中，在自第二步开始起第6天随机选择聚集体(例如，不少于100个聚集体)时，例如，未塌陷的聚集体和/或非囊性聚集体的比例总数不小于70％，优选不小于80％。
步骤(2)中得到的聚集体具有向多种分化细胞和分化组织分化的潜能。在一个实施方案中，步骤(2)中得到的聚集体具有向神经细胞或神经组织(优选地，视网膜组织，视网膜细胞，视网膜祖先细胞，或视网膜层专有的神经元)分化的潜能。
在一个实施方案中，通过使用步骤(1)中得到的并且在步骤(2)中具有向至少神经细胞或神经组织(优选地，视网膜组织，视网膜细胞，视网膜祖先细胞，或视网膜层专有的神经元)分化的潜能的干细胞(优选地，具有向至少神经细胞或神经组织(优选地，视网膜组织，视网膜细胞，视网膜祖先细胞，或视网膜层专有的神经元)分化的潜能的Oct3/4阳性的干细胞)，可以得到包含具有向至少神经细胞或神经组织(优选地，视网膜组织，视网膜细胞，视网膜祖先细胞，或视网膜层专有的神经元)分化的潜能的干细胞(优选地，Oct3/4阳性的干细胞)的聚集体。通过在适当的分化条件下培养步骤(2)中得到的聚集体，可以高效地诱导多种分化的细胞和分化的组织。
在一个实施方案中，在步骤(2)中得到的聚集体包含与在步骤(1)结束时得到的维持多能样状态(具体地，表达Oct3/4)的细胞与神经细胞或神经组织之间的中间阶段的细胞相对应的细胞。这些细胞表达多能性状态标记Oct3/4、外胚层标记(Sox1，Sox2，N-钙粘蛋白，TP63)、神经外胚层标记(Sox1，Sox2，巢蛋白，N-钙粘蛋白，Otx2)和前文提及的神经细胞标记中的任一种。即，在一个实施方案中，在步骤(2)中得到的聚集体包含表达多能性状态标记Oct3/4、外胚层标记(Sox1，Sox2，N-钙粘蛋白，TP63)、神经外胚层标记(Sox1，Sox2，巢蛋白，N-钙粘蛋白，Otx2)和前文提及的神经细胞标记中的任一种的细胞的混合物。即，在步骤(2)中得到的聚集体包含具有向至少神经细胞或神经组织分化的潜能的干细胞，和/或神经细胞或神经组织的祖先/前体细胞。所述祖先/前体细胞特征在于，当将它们在已知的适当培养条件下培养时，它们表现出表达前文提及的神经细胞标记的能力(活性)。因此，在一个实施方案中，在步骤(2)中得到的聚集体包含具有向至少神经细胞或神经组织分化的潜能的Oct3/4阳性干细胞，和/或神经细胞或神经组织的祖先/前体细胞。在步骤(2)中得到的聚集体中包含的一部分细胞可以表达前文提及的神经组织标记。在一个实施方案中，在步骤(2)中得到的聚集体可以包含不少于总细胞的50％(例如，不少于70％)的比例的Oct3/4阳性细胞。
在步骤(2)中，当进行培养基更换操作时，例如，可以提及不丢弃已有的培养基而添加新鲜培养基的操作(培养基添加操作)，弃掉约一半量的已有的培养基(已有的培养基体积的约30-90％，例如，约40-60％)并且添加约一半量的新鲜培养基(已有的培养基体积的约30-90％，例如，约40-60％)的操作(一半培养基更换操作)，和弃掉约全部量的已有的培养基(不少于已有的培养基的量的90％)并且添加约全部量的新鲜培养基(不少于已有的培养基的量的90％)的操作(完全培养基更换操作)。
当在特定时间点添加特定成分(例如，分化诱导因子)时，例如，可以进行这样的操作：计算终浓度，弃掉约一半量的已有的培养基，并且添加约一半量的新鲜培养基(一半培养基更换操作，一半培养基更换)，所述新鲜培养基包含浓度高于所述终浓度(具体地，所述终浓度的1.5倍-3.0倍，例如，约为终浓度的2倍)的特定成分。
当在特定时间点保持已有的培养基中包含的特定成分的浓度时，例如，可以进行这样的操作：弃掉约一半量的已有的培养基，并且添加约一半量的新鲜培养基，所述新鲜培养基包含浓度与已有的培养基中相同的特定成分。
当通过在特定时间点稀释而降低已有的培养基中包含的成分的浓度时，例如，可以每天多次进行培养基更换操作，优选在1小时内进行多次(例如，2-3次)。此外，当通过在特定时间点稀释降低已有的培养基中包含的成分的浓度时，可以将细胞或聚集体转移到另一个培养容器中。
尽管用于培养基更换操作的工具没有特别限制，例如，可以提及移液管、微量移液管、多通道微量移液管、连续的分配器等。例如，当使用96孔平板作为培养容器时，可以使用多通道微量移液管。
解释步骤(3)，其中由步骤(2)中得到的聚集体诱导包含神经细胞或神经组织的聚集体。
关于通过悬浮培养诱导多能干细胞的聚集体成为神经细胞或神经组织的方法，已经报道了多种方法。例如，已知下列各项中记述的方法：WO 2005/123902，WO 2009/148170，WO 2008/035110，WO 2011/055855，Cell Stem Cell，3，519-32(2008)，Nature，472，51-56(2011)，Cell Stem Cell，10(6)，771-775(2012)，Nature Biotechnology，27(3)，275-80(2009)，Proc Natl Acad Sci USA，110(50)，20284-9(2013)等，但是方法不限于这些。通过对步骤(2)中得到的聚集体应用此类不同的神经细胞或神经组织诱导方法并且在适当的神经元分化诱导条件下培养步骤(2)中得到的聚集体，可以产生包含神经细胞或神经组织的聚集体。
例如，将步骤(2)中得到的聚集体在存在或不存在(优选在存在)分化诱导因子的条件下悬浮培养，产生包含神经细胞或神经组织的聚集体。
所述分化诱导因子是具有诱导向细胞或组织分化的活性的因子，例如，其是具有使干细胞或祖先/前体细胞分化成特定的分化谱系(或决定干细胞或祖先/前体细胞的命运)的活性的因子。分化诱导因子的实例包括，但不特别限于下述各项：体内基因产物，如生长因子等，在体内调节基因产物作用的低分子量化合物，激素，生理活性物质，如维生素等，以及类似的。本领域普通技术人员广泛使用的分化诱导因子的实例包括BMP信号转导激活物质，BMP信号转导途径抑制物质，Shh信号转导途径激活物质，Shh信号转导途径抑制物质，FGF信号转导途径激活物质，FGF信号转导途径抑制物质，Wnt信号转导途径激活物质，和Wnt信号转导途径抑制物质。对分化诱导因子的响应随细胞的种类和分化状态(分化能力，潜能)而不同，并且分化诱导因子的作用甚至在分化诱导过程中可能是不同的，这取决于分化诱导因子的浓度和加入的时机。此外，已知分化诱导因子表现出相似效果的最佳浓度随动物物种而不同，并且，例如，已知在小鼠细胞与人细胞之间，人细胞的最佳浓度通常较高(特别是在外胚层、内胚层中)。关于多能干细胞向特定细胞或组织的分化诱导的方法存在多个报道，并且可以选择适于目的细胞或组织的分化诱导因子或分化诱导方法。
用于本发明的分化诱导因子通常是哺乳动物分化诱导因子。哺乳动物的实例包括上文提及的那些。由于分化诱导因子可能在哺乳动物物种之间具有交叉反应性，也可以使用任意哺乳动物的分化诱导因子，只要可以实现培养的多能干细胞的分化诱导即可。优选地，使用与培养的细胞相同物种的哺乳动物分化诱导因子。
用于本发明的分化诱导因子优选是分离的。因此，在一个实施方案中，本发明包括提供分离的分化诱导因子的步骤。并且，在一个实施方案中，本发明包括向用于步骤(3)的培养基中外源添加分离的分化诱导因子的步骤。
在一个实施方案中，使用神经元分化诱导因子作为本发明方法中的分化诱导因子，由此可以产生包含神经细胞或神经组织的聚集体。
在一个实施方案中，例如，用于步骤(3)的培养基是补充了分化诱导因子的无血清培养基或含血清培养基(优选无血清培养基)。所述培养基可以包含或可以不包含基膜制剂。关于基膜制剂，可以使用上文提及的那些。当添加基膜制剂时，其浓度例如为使用基质胶时的体积浓度的0.1-10％，更优选为0.5％-2％。为避免化学上不确定物质的污染，不添加基膜制剂。
用于所述培养基的无血清培养基或含血清培养基没有特别限制，只要其是上文提及的即可。为了避免复杂的制备，例如，优选使用补充了适量的商购血清代替物(如KSR等)的无血清培养基等(例如，补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油和1x化学成分确定的脂质浓缩物的IMDM与F-12的1∶1混合物的培养基或补充了5％-20％KSR、NEAA、丙酮酸、2-巯基乙醇的GMEM培养基)。在人ES细胞的情形中，要添加到无血清培养基中的KSR的量通常为约1％至约20％，优选约2％至约20％。
关于要用于步骤(3)的培养基(优选是无血清培养基)，可以直接使用步骤(2)所用的培养基(优选是无血清培养基)或可以用新鲜培养基(优选是无血清培养基)替换。当步骤(2)中所用的不含分化诱导因子的无血清培养基直接用于步骤(3)时，可以向所述培养基中添加分化诱导因子。
在步骤(3)中，当进行培养基更换操作时，例如，可以提及不丢弃已有的培养基而添加新鲜培养基的操作(培养基添加操作)，弃掉约一半量的已有的培养基(已有的培养基体积的约40-80％)并且添加约一半量的新鲜培养基(已有的培养基体积的约40-80％)的操作(一半培养基更换操作)，和弃掉约全部量的已有的培养基(不少于已有的培养基的量的90％)并且添加约全部量的新鲜培养基(不少于已有的培养基的量的90％)的操作(完全培养基更换操作)。
当在特定时间点添加特定成分(例如，分化诱导因子)时，例如，可以进行这样的操作：计算终浓度，弃掉约一半量的已有的培养基，并且添加约一半量的新鲜培养基(一半培养基更换操作，一半培养基更换)，所述新鲜培养基包含浓度高于所述终浓度(具体地，所述终浓度的1.5倍-3.0倍，例如，约为终浓度的2倍)的特定成分。
当在特定时间点保持已有的培养基中包含的特定成分的浓度时，例如，可以进行这样的操作：弃掉约一半量的已有的培养基，并且添加约一半量的新鲜培养基，所述新鲜培养基包含浓度与已有的培养基中相同的特定成分。
当通过在特定时间点稀释而降低已有的培养基中包含的成分的浓度时，例如，可以每天多次进行培养基更换操作，优选在1小时内进行多次(例如，2-3次)。此外，当通过在特定时间点稀释降低已有的培养基中包含的成分的浓度时，可以将细胞或聚集体转移到另一个培养容器中。
尽管用于培养基更换操作的工具没有特别限制，例如，可以提及移液管、微量移液管、多通道微量移液管、连续的分配器等。例如，当使用96孔平板作为培养容器时，可以使用多通道微量移液管。
分化诱导因子可以在自步骤(2)的悬浮培养起始时约24小时后或以后加入，并且也可以在自悬浮培养起始时数天内(例如，15天或18天内)加入到培养基中。优选地，分化诱导因子在自悬浮培养起始第1天至第18天内、或第1天至第15天内、更优选地第1天至第9天内、进一步优选第3天至第8天或第2天至第9天内、仍然更优选地第3天至第6天内加入到培养基中。
在另一实施方案中，分化诱导因子(例如，Wnt信号转导途径抑制物质，TGFβ家族信号转导途径抑制物质等)可以在步骤(2)的悬浮培养起始起同时添加或在步骤(2)的悬浮培养起始后约24小时内添加。
向培养基中加入分化诱导因子并且开始聚集体向神经细胞的诱导分化后，向所述培养基中加入分化诱导因子不是必需的，并且培养基可以更换为分别不含分化诱导因子的无血清培养基或含血清培养基。在一个实施方案中，在聚集体开始向神经细胞的分化诱导后，通过将培养基更换为分别不含分化诱导因子的无血清培养基或含血清培养基，培养基中分化诱导因子的浓度以每2-4天40-60％的比例逐渐或逐步降低。
在具体的实施方案中，在开始悬浮培养后(即，在前述步骤(2)开始后)第0-18天、优选第1-9天、更优选第2-8天、进一步优选第3天或第4天，培养基可以被部分或完全更换为包含分化诱导因子的培养基，并且可以将细胞在存在分化诱导因子的条件下培养约1-100天。为了将分化诱导因子的浓度保持在相同水平，可以将培养基部分或完全更换为包含分化诱导因子的培养基。备选地，如上文提及的，分化诱导因子的浓度也可以逐步减小。
已经开始向神经细胞的分化诱导的细胞可以通过例如检测所述细胞中的神经标记基因的表达而验证。关于步骤(3)的一个实施方案，可以提及这样的步骤：在包含神经元分化诱导所需要浓度的分化诱导因子的无血清培养基或血清培养基中悬浮培养步骤(2)中形成的聚集体，直到出现表达神经标记基因的细胞，由此得到包含神经细胞的聚集体。
在一个实施方案中，使用BMP信号转导途径激活物质作为分化诱导因子。即，将在第二步中得到的聚集体在存在BMP信号转导途径激活物质的条件下悬浮培养，从而产生包含神经细胞或神经组织的聚集体。
所述BMP信号转导途径激活物质是能够增强由BMP介导的信号转导的物质。BMP信号转导途径激活物质的实例包括BMP蛋白如BMP2，BMP4或BMP7等，GDF蛋白如GDF7等，抗-BMP受体抗体，BMP部分肽等。BMP2蛋白，BMP4蛋白和BMP7蛋白可获自，例如，R&D Systems，而GDF7蛋白可获自，例如，Wako Pure Chemical Industries，Ltd。
BMP信号转导途径激活物质的浓度可以是能够诱导多能干细胞的聚集体或由其衍生的干细胞向神经细胞的分化的浓度。例如，在BMP4的情形中，其以约0.01nM-约1μM、优选约0.1nM-约100nM、更优选约1nM-约10nM、进一步优选地约1.5nM(55ng/mL)的浓度添加到培养基中。
在一个实施方案中，向神经细胞或神经组织的分化(自发分化)也可以通过在分别不含前述分化诱导因子的无血清培养基或含血清培养基(优选无血清培养基)以及在分别不含前述用于维持未分化状态的因子的无血清培养基或含血清培养基(优选无血清培养基)中进行步骤(3)而诱导。例如，还可以通过在基本上不含(即，完全不含或包含浓度不大于表达生理活性的浓度)BMP信号转导途径激活物质(例如，BMP4)和Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，SAG，PMA)的无血清培养基或含血清培养基(优选无血清培养基)中悬浮培养步骤(2)中得到的聚集体而得到包含神经细胞或神经组织的聚集体。
所述培养基没有特别限制，只要其是上文提及的即可。为了避免复杂的制备，例如，优选使用补充了适量的商购血清代替物(如KSR等)的无血清培养基(例如，补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油和1x化学成分确定的脂质浓缩物的IMDM与F-12的1∶1混合物的培养基)。例如，在人ES细胞的情形中，要添加到无血清培养基中的KSR的量通常为约1％至约20％，优选约2％至约20％。
关于要用于步骤(3)的培养基(优选是无血清培养基)，也可以按原样使用步骤(2)中所用的培养基(优选是无血清培养基)，或者可以将培养基更换为新鲜培养基(优选是无血清培养基)。
可以适当设定步骤(3)的其他培养条件，如培养温度、CO2浓度等。例如，培养温度为约30-40℃，优选约37℃。例如，CO2浓度为约1-10％，优选约5％。
例如，得到包含神经细胞的聚集体的事实可以通过检测所述聚集体中表达神经细胞标记的细胞的存在而验证。神经细胞标记的实例包括，但不限于，巢蛋白，TuJ1，PSA-NCAM等。在一个实施方案中，进行步骤(3)的培养，直到聚集体中包含的不少于20％(优选地，不少于30％，不少于40％，不少于50％，不少于60％)的细胞表达选自由巢蛋白、TuJ1和PSA-NCAM组成的组的任意神经细胞标记。
得到的包含神经细胞的聚集体可以按原样用作评价毒性或药物功效的试剂。包含神经细胞的聚集体可以进行分散处理(例如，胰蛋白酶/EDTA处理或木瓜蛋白酶处理)，并且使用FACS或MACS对得到的细胞进行选择，由此也可以得到高纯度的神经细胞。
在个实施方案中，在步骤(3)中得到的包含神经细胞的聚集体包含神经上皮结构，并且在上皮结构中包含神经组织和/或神经细胞。尽管神经上皮结构覆盖着所述聚集体的表面而存在，但是其部分也在所述聚集体内部形成。使用步骤(2)中得到的聚集体，可以以高效率诱导包含神经上皮结构的聚集体。所述神经上皮结构可以被鉴定为神经标记基因(例如，巢蛋白，TuJ1，PSA-NCAM)-阳性的上皮结构。所述神经上皮结构可以作为神经组织获得。在一个实施方案中，进行步骤(3)的培养，直到在所述聚集体中形成神经上皮结构。关于步骤(3)的一个实施方案，可以提及这样的步骤：在神经元分化诱导条件下(例如，在包含神经元分化诱导所需浓度的分化诱导因子的无血清培养基或含血清培养基中)悬浮培养步骤(2)中形成的聚集体，直到出现神经上皮结构，由此得到包含神经上皮结构的聚集体。
在一个实施方案中，可以将步骤(2)或步骤(3)中得到的聚集体分散并接种在细胞培养皿中，并且以粘附状态培养，从而产生神经细胞或神经组织。备选地，在一个实施方案中，可以将步骤(2)或步骤(3)中得到的聚集体分散，将得到的分散的细胞接种在细胞培养皿中，并且以粘附状态培养，以产生神经细胞或神经组织。关于培养基，可以使用前文提及的培养基，并且可以向培养基中添加分化诱导因子。关于细胞培养皿，可以使用前文提及的用于贴壁培养的平皿。细胞培养皿可以用细胞粘附分子等(例如，层粘连蛋白涂层)涂覆。神经细胞或神经组织的产生可以通过对神经细胞或神经组织标记免疫染色证实。
在一个实施方案中，可以将在步骤(2)或步骤(3)的悬浮培养过程中得到的不含神经细胞的聚集体接种在用于贴壁培养的平皿中，并且以粘附状态培养，直到分化为神经细胞。尽管用于贴壁培养的培养基没有特别限制，但是也可以使用前文提及的步骤(3)中所用的培养基。
在一个实施方案中，在步骤(2)或步骤(3)的贴壁培养过程中得到的不含神经细胞的细胞可以从用于贴壁培养的平皿上剥离，接种在用于悬浮培养的平皿中，并且进行悬浮培养，直到分化为神经细胞。尽管用于悬浮培养的培养基没有特别限制，但是也可以使用步骤(3)中所用的培养基。
存在于聚集体表面上的神经上皮结构可以在显微镜下使用镊子等从所述聚集体上物理切下。
通过本发明的制备方法，能够以高效率由多能干细胞得到神经组织，如神经上皮结构等。由于通过本发明的制备方法得到的神经上皮结构包含多种神经细胞，通过使用针对多种神经细胞的标记的抗体，经由FACS等，也可以多种神经元及其祖先/前体细胞。
得到的包含诸如神经上皮结构等的神经组织的聚集体可以按原样用作评价毒性或药物功效的试剂。通过使包含诸如神经上皮结构等的神经组织的聚集体进行分散处理(例如，胰蛋白酶/EDTA处理或木瓜蛋白酶处理)，也可以得到高纯度的神经细胞，并且使得到的细胞进行经由FACS或MACS的选择。
3.制备视网膜组织的方法
本发明的制备方法2是用于制备视网膜组织的方法，所述方法包括下述步骤(1)-(3)：
(1)第一步，在不存在饲养细胞的条件下在含有1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径激活物质，和2)用于维持未分化状态的因子的培养基中培养多能干细胞，
(2)第二步，悬浮培养第一步中得到的细胞，从而形成细胞聚集体，和
(3)第三步，在存在BMP信号转导途径激活物质的条件下悬浮培养第二步中得到的聚集体，从而得到包含视网膜组织的聚集体。
本发明的制备方法2的步骤(1)可以以与本发明的制备方法1的步骤(1)相同的方式进行。
优选地，步骤(1)中得到的细胞包含具有向至少视网膜组织、视网膜细胞、视网膜祖先细胞或视网膜层专有的神经元分化的潜能的干细胞。在一个实施方案中，步骤(1)中得到的细胞包括具有向至少视网膜组织、视网膜细胞、视网膜祖先细胞或视网膜层专有的神经元分化的潜能的Oct3/4阳性干细胞。在一个实施方案中，步骤(1)中得到的细胞包含不少于60％，例如，不少于90％的比例的Oct3/4阳性干细胞。
本发明的制备方法2的步骤(2)也可以与本发明的制备方法1的步骤(2)相同的方式进行。
用于制备方法2的步骤(2)的培养基优选地包含Sonic hedgehog信号转导途径激活物质。在步骤(1)中，将多能干细胞用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonichedgehog信号转导途径激活物质处理；并且在步骤(2)中，将步骤(1)中得到的细胞在包含Sonic hedgehog信号转导途径激活物质的培养基(优选是无血清培养基)中悬浮培养，从而形成聚集体，由此所述聚集体的质量被进一步提高并且向视网膜组织的分化潜能被提高。使用高质量的聚集体，能够以高效率诱导包含视网膜组织的聚集体。
关于所述Sonic hedgehog信号转导途径激活物质，可以使用上文提及的那些。优选地，所述Sonic hedgehog信号转导途径激活物质是Shh蛋白，SAG或PMA。可以适当地确定所述Sonic hedgehog信号转导途径激活物质在培养基中的浓度，以落入能够实现前文提及的作用的范围内。SAG通常以1-2000nM、优选10-700nM、更优选30-600nM的浓度使用。PMA通常以0.002-20μM、优选0.02-2μM的浓度使用。Shh蛋白通常以20-1000ng/ml、优选50-300ng/ml的浓度使用。当使用除Shh蛋白、SAG或PMA之外的Sonic hedgehog信号转导途径激活物质时，其理想地以赋予与前述浓度的SAG相当的Sonic hedgehog信号转导促进活性的量使用。
在步骤(2)期间，培养基中Sonic hedgehog信号转导途径激活物质的浓度可能变化。例如，提供Sonic hedgehog信号转导途径激活物质以落在前文提及的在步骤(2)开始时的范围内，并且浓度可以以每2-4天40-60％的比例逐渐或逐步地减少。
向培养基中添加Sonic hedgehog信号转导途径激活物质的时机没有特别限制，只要能够提供上文提及的作用即可，但是越早添加能够获得更高的效果。Sonic hedgehog信号转导途径激活物质通常在自步骤(2)开始时6天内、优选在3天内、更优选在1天内、并且进一步优选地在步骤(2)开始时添加到培养基中。
在优选的实施方案中，将在步骤(1)中得到的人细胞(例如，在步骤(1)中由人iPS细胞得到的细胞)在包含Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，SAG，PMA，Shh蛋白)的无血清培养基中进行悬浮培养，从而形成聚集体。Sonic hedgehog信号转导途径激活物质优选在悬浮培养开始时就包含在培养基中。还可以向培养基中添加ROCK抑制物质(例如，Y-27632)。培养的时间期是12小时-6天，优选12小时-48小时。形成的聚集体优选是均匀的聚集体。
例如，将在步骤(1)中得到的人细胞(例如，在步骤(1)中由人iPS细胞得到的细胞)回收，分散成单细胞或接近单细胞的状态，并且在包含Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，SAG，PMA)的无血清培养基中进行悬浮培养。所述无血清培养基可以包含ROCK抑制剂(例如，Y-27632)。将人干细胞(例如，由人iPS细胞衍生的干细胞)的混悬液接种在上文提及的培养容器中，并且在不与培养容器粘附的条件下培养分散的细胞，由此组装多个多能干细胞形成聚集体。培养的时间期是12小时-6天(优选12小时-48小时)。形成的聚集体优选是均匀的聚集体。
通过以这种方式进行步骤(2)，可以形成步骤(1)中得到的细胞或由其衍生的细胞的聚集体。本发明还提供所述聚集体的制备方法。与在步骤(1)中不进行使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径激活物质处理所形成的聚集体相比，在步骤(2)中得到的聚集体具有更高的质量。具体而言，可以得到具有平滑的表面和致密的内部并且具有高比例的未塌陷的聚集体的球形细胞聚集体群。在一个实施方案中，在自第二步开始起第6天随机选择聚集体(例如，不少于100个聚集体)时，例如，非囊性聚集体的比例不小于70％，优选不小于80％。
步骤(2)中得到的聚集体具有向视网膜组织分化的潜能。通过将步骤(2)中得到的聚集体在下述步骤(3)的条件下培养，可以以高效率产生包含视网膜组织的聚集体。
在一个实施方案中，通过在步骤(2)中使用步骤(1)中得到的具有向至少视网膜组织、视网膜细胞、视网膜祖先细胞或视网膜层专有的神经元分化的潜能的干细胞(优选地，具有向至少视网膜组织、视网膜细胞、视网膜祖先细胞或视网膜层专有的神经元分化的潜能的Oct3/4阳性干细胞)，可以得到包含具有向至少视网膜组织、视网膜细胞、视网膜祖先细胞或视网膜层专有的神经元分化的潜能的干细胞(例如，Oct3/4阳性干细胞)的聚集体。
解释步骤(3)，其中将在步骤(2)中得到的聚集体在存在BMP信号转导途径激活物质的条件下悬浮培养，从而得到包含视网膜组织的聚集体。
例如，用于步骤(3)的培养基是补充了BMP信号转导途径激活物质的无血清培养基或含血清培养基(优选是无血清培养基)。
用于所述培养基的无血清培养基或含血清培养基没有特别限制，只要其是上文提及的即可。为了避免复杂的制备，例如，可以优选地使用补充了适量的商购血清代替物(如KSR等)的无血清培养基(例如，补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油和1x化学成分确定的脂质浓缩物的IMDM与F-12的1∶1混合物的培养基)。在人多能干细胞(例如，iPS细胞)的情形中，要添加到无血清培养基中的KSR的量通常为约1％至约20％，优选约2％至约20％。
用于步骤(3)的培养基(优选地，无血清培养基)也可以是用于步骤(2)的培养基(优选地，无血清培养基)，或可以用新鲜培养基(优选是无血清培养基)替换。当步骤(2)中所用的不含BMP信号转导途径物质的无血清培养基直接用于步骤(3)时，可以向所述培养基中添加BMP信号转导途径激活物质。
用于步骤(3)的BMP信号转导途径激活物质的实例包括BMP蛋白，诸如BMP2、BMP4、BMP7等，GDF蛋白，诸如GDF7等，抗-BMP受体抗体，BMP部分肽等。BMP2蛋白、BMP4蛋白和BMP7蛋白可从例如R&D Systems获得，并且GDF7蛋白可从例如Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.获得。关于优选的BMP信号转导途径激活物质，可以提及BMP4。
BMP信号转导途径激活物质的浓度可以是能够将形成多能干细胞聚集体的细胞诱导向视网膜细胞分化的浓度。例如，在人BMP4的情形中，将其以约0.01nM至约1μM，优选约0.1nM至约100nM，更优选约1nM至约10nM，进一步优选约1.5nM(55ng/mL)的浓度添加到培养基中。当使用不同于BMP4的BMP信号转导途径激活物质时，其理想地以显示与上文提及的浓度的BMP4相当的BMP信号转导促进活性的浓度使用。
培养基中BMP信号转导途径激活物质的浓度在步骤(3)期间可以变化。例如，提供BMP信号转导途径激活物质落在上文提及的在步骤(3)开始时的范围内，并且浓度可以以每2-4天40-60％的比例逐渐或逐步地降低。
BMP信号转导途径激活物质可以在自步骤(2)的悬浮培养起始时约24小时后或以后加入，并且也可以在自悬浮培养起始的数天内(例如，15天内)加入到培养基中。优选地，BMP信号转导途径激活物质在自悬浮培养起始第1天至第15天内、更优选地第1天至第9天内、进一步优选地第3天至第8天或第2天至第9天内、仍然更优选地第3天至第6天内加入到培养基中。
在具体的实施方案中，在开始悬浮培养后(即，在前述步骤(2)开始后)第1-9天、优选第2-8天、进一步优选第3天或第4天，培养基可以被部分或完全更换为包含BMP4的培养基，以调节BMP4的终浓度至约1-10nM，并且可以将细胞在存在BMP4的条件下培养约1-12天，优选2-9天，更优选2-5天。为了将BMP4的浓度保持在相同水平，可以将培养基用包含BMP4的培养基部分或完全更换一次或两次。备选地，如上文提及的，BMP4的浓度也可以逐步减小。
向培养基中加入BMP信号转导途径激活物质并且形成聚集体的细胞开始向视网膜细胞诱导分化后，向所述培养基中加入BMP信号转导途径激活物质不是必需的，并且培养基可以更换为分别不含BMP信号转导途径激活物质的无血清培养基或含血清培养基。在一个实施方案中，在开始向视网膜细胞分化诱导后，通过将培养基更换为分别不含BMP信号转导途径激活物质的无血清培养基或含血清培养基，培养基中BMP信号转导途径激活物质的浓度以每2-4天40-60％的比例逐渐或逐步降低。例如，开始向视网膜细胞分化诱导的细胞可以通过检测在所述细胞中视网膜祖先细胞标记基因(例如，Rx基因(别名Rax)，Pax6基因，Chx10基因)的表达而证实。将通过使用在Rax基因座中敲入了荧光报告蛋白基因(如GFP等)的多能干细胞在步骤(2)中形成的聚集体在存在向视网膜细胞分化诱导需要的浓度的BMP信号转导途径激活物质的条件下悬浮培养，并且检测由所表达的荧光报告蛋白发射的荧光，由此可以证实向视网膜细胞分化诱导开始的时间期。步骤(3)的一个实施方案是这样的步骤：在包含向视网膜细胞分化诱导需要的浓度的BMP信号转导途径激活物质的无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养步骤(2)中形成的聚集体，直到开始出现表达视网膜祖先细胞标记基因(例如，Rx基因，Pax6基因，Chx10基因)的细胞，由此得到包含视网膜祖先细胞的细胞聚集体。
在步骤(3)中，当进行培养基更换操作时，例如，可以提及不丢弃已有的培养基而添加新鲜培养基的操作(培养基添加操作)，弃掉约一半量的已有的培养基(已有的培养基体积的约40-80％)并且添加约一半量的新鲜培养基(已有的培养基体积的约40-80％)的操作(一半培养基更换操作)，和弃掉约全部量的已有的培养基(不少于已有的培养基的量的90％)并且添加约全部量的新鲜培养基(不少于已有的培养基的量的90％)的操作(完全培养基更换操作)。
当在特定时间点添加特定成分(例如，BMP4)时，例如，可以进行这样的操作：计算终浓度，弃掉约一半量的已有的培养基，并且添加约一半量的新鲜培养基(一半培养基更换操作，一半培养基更换)，所述新鲜培养基包含浓度高于所述终浓度(具体地，所述终浓度的1.5-3.0倍，例如，约为终浓度的2倍)的特定成分。
当在特定时间点保持已有的培养基中包含的特定成分的浓度时，例如，可以进行这样的操作：弃掉约一半量的已有的培养基，并且添加约一半量的新鲜培养基，所述新鲜培养基包含浓度与已有的培养基中相同的特定成分。
当通过在特定时间点稀释而降低已有的培养基中包含的成分的浓度时，例如，可以每天多次进行培养基更换操作，优选在1小时内进行多次(例如，2-3次)。此外，当通过在特定时间点稀释降低已有的培养基中包含的成分的浓度时，可以将细胞或聚集体转移到另一个培养容器中。
尽管用于培养基更换操作的工具没有特别限制，例如，可以提及移液管、微量移液管、多通道微量移液管、连续的分配器等。例如，当使用96孔平板作为培养容器时，可以使用多通道微量移液管。
在一个实施方案中，当添加到步骤(2)的培养基中的Shh信号转导途径激活物质的浓度比较低(例如，对于SAG，不大于700nM，并且对于其他Shh信号转导途径激活物质，以赋予与上文提及的浓度的SAG相当或更低的Shh信号转导促进活性的浓度)时，培养基更换不是必要的，并且可以向步骤(2)中所用的培养基中添加分化诱导因子(例如，BMP4)。另一方面，当Shh信号转导途径激活物质的浓度比较高(例如，对于SAG，超过700nM或不小于1000nM，并且对于其他Shh信号转导途径激活物质，以赋予与上文提及的浓度的SAG相当的Shh信号转导促进活性的浓度)时，需要将培养基更换为含有分化诱导因子(例如，BMP4)的新鲜培养基，以抑制在加入分化诱导因子时残留的Shh信号转导途径激活物质的影响。
在优选的实施方案中，当就SAG的Shh信号转导促进活性而言计算时，在用于步骤(3)的培养基中的Shh信号转导途径激活物质的浓度不大于700nM，优选不大于300nM，更优选不大于10nM，进一步优选不大于0.1nM，进一步优选不含Shh信号转导途径激活物质。“不含Shh信号转导途径激活物质”的培养基还包括基本上不含Shh信号转导途径激活物质的培养基，例如，不含处在对向视网膜祖先细胞或视网膜组织的选择性分化施加不利影响的浓度的Shh信号转导途径激活物质的培养基。“不含Shh信号转导途径激活物质”的培养基还包括基本上没有补充Shh信号转导途径激活物质的培养基，例如，没有补充处在对向视网膜祖先细胞或视网膜组织的选择性分化施加不利影响的浓度的Shh信号转导途径激活物质的培养基。
可以适当地确定步骤(3)中的培养条件，如培养温度和CO2浓度等。例如，培养温度为约30℃-约40℃，优选约37℃。例如，CO2浓度为约1％-约10％，优选约5％。
通过这样的培养，将形成步骤(2)中得到的聚集体的细胞诱导向视网膜祖先细胞分化，由此可以得到包含视网膜祖先细胞的聚集体。本发明还提供制备此类包含视网膜祖先细胞的聚集体的方法。得到包含视网膜祖先细胞的聚集体可以通过例如检测所述聚集体中表达Rax、PAX6或Chx10(它们是视网膜祖先细胞标记)的细胞的存在而证实。步骤(3)的一个实施方案是在包含向视网膜细胞分化诱导所需要的浓度的BMP信号转导途径激活物质的无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养步骤(2)中形成的聚集体的步骤，直到开始出现表达Rx基因的细胞，由此得到包含视网膜祖先细胞的聚集体。在一个实施方案中，进行步骤(3)的培养直到聚集体中包含的不少于20％(优选地，不少于30％，不少于40％，不少于50％，不少于60％)的细胞表达Rx。
在制备视网膜细胞和/或视网膜组织的优选的实施方案中，在步骤(1)中，将人多能干细胞(例如，人iPS细胞)在不存在饲养细胞的条件下在包含TGFβ信号转导途径抑制物质(例如，SB431542，A-83-01)和bFGF的无血清培养基以粘附状态培养；在步骤(2)中，将细胞在包含Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，SAG，PMA，Shh蛋白)的无血清培养基中悬浮培养；并且在步骤(3)中，将聚集体在包含BMP信号转导途径激活物质(例如，BMP4)的无血清培养基中悬浮培养。
另外，在制备视网膜细胞和/或视网膜组织的优选的实施方案中，在步骤(1)中，将人多能干细胞(例如，人iPS细胞)在不存在饲养细胞的条件下在包含BMP信号转导途径抑制物质(例如，LDN193189)和bFGF的无血清培养基中以粘附状态培养；在步骤(2)中，将细胞在不含或包含Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，SAG，PMA)的无血清培养基中悬浮培养；并且在步骤(3)中，将聚集体在包含BMP信号转导途径激活物质(例如，BMP4)的无血清培养基中悬浮培养。
在制备视网膜细胞和/或视网膜组织的优选实施方案中，在步骤(1)中，将人多能干细胞(例如，人iPS细胞)在不存在饲养细胞的条件下在包含Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，SAG，PMA)和bFGF的无血清培养基中以粘附状态培养优选不少于1天并且不多于6天，进一步优选地培养2-4天，在步骤(2)中，将细胞在包含Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，SAG，PMA)的无血清培养基中悬浮培养，并且在步骤(3)中，将聚集体在包含BMP信号转导途径激活物质(例如，BMP4)的无血清培养基中悬浮培养。
在制备视网膜细胞和/或视网膜组织的优选实施方案中，在步骤(1)中，将人多能干细胞(例如，人iPS细胞)在不存在饲养细胞的条件下在包含下述各项的无血清培养基中以粘附状态培养：TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如，TGFβ信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01)，Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01)，BMP信号转导途径抑制物质(例如，LDN193189)，或它们的组合(例如，SB431542与LDN193189)等)；Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，Shh蛋白，SAG，PMA)；或TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01，LDN193189)与Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，Shh蛋白，SAG，PMA)的组合；bFGF；在步骤(2)中，将步骤(1)中得到的细胞在包含Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，SAG，PMA，Shh蛋白)的无血清培养基中悬浮培养，以形成细胞聚集体，并且在步骤(3)中，将聚集体在包含BMP信号转导途径激活物质(例如，BMP4)的无血清培养基中悬浮培养，以产生包含视网膜祖先细胞、视网膜细胞或视网膜组织的聚集体。
步骤(2)中的培养基优选地包含ROCK抑制物质(例如，Y-27632)。
得到的包含视网膜祖先细胞的聚集体可以按其原样作为用于评价毒性或药物功效的试剂使用。将包含视网膜祖先细胞的聚集体进行分散处理(例如，胰蛋白酶/EDTA处理或木瓜蛋白酶处理)，并且使用FACS或MACS对得到的细胞进行选择，由此也可以得到高纯度的视网膜祖先细胞。
此外，可以将包含视网膜组织的聚集体继续在无血清培养基或含血清培养基中培养，以使视网膜祖先细胞进一步分化，由此可以产生神经上皮结构样视网膜组织。
用于所述培养基的无血清培养基或含血清培养基没有特别限制，只要其是上文提及的即可。例如，可以提及作为补充了10％胎牛血清、N2补充物、100μM牛磺酸和500nM视黄酸的DMEM-F12培养基的含血清培养基或补充了适量的商购得到的血清代替物(如KSR等)的无血清培养基(例如，补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油和1x化学上明确的脂质浓缩物的IMDM和F-12的1∶1混合物的培养基)等。
尽管从视网膜祖先细胞诱导视网膜组织的培养时间期随目的视网膜层专有的神经元而不同，但是，例如，该时间期为约7天至约200天。
视网膜组织覆盖着聚集体的表面存在。在悬浮培养结束后，可以将聚集体用固定剂(如多聚甲醛溶液等)固定，并且制备冷冻切片，然后可以通过免疫染色等证实具有层结构的视网膜组织的形成。由于视网膜组织的各个层由不同的视网膜祖先细胞(感光细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞)构成，层结构的形成可以使用针对在这些细胞中表达的前述标记的抗体通过免疫染色证实。在一个实施方案中，视网膜组织是Rx-或Chx10-阳性神经上皮结构。
存在于聚集体表面上的视网膜组织可以使用镊子等从所述聚集体上物理切下。在这一情形中，由于可以在每个聚集体表面上形成除视网膜组织之外的神经组织，从所述聚集体上切下的一部分神经组织可以进行下文提及的免疫染色等的验证，由此可以证实所述组织是视网膜组织。
在一个实施方案中，步骤(3)中得到的聚集体包含视网膜组织，并且基本上不含非神经头部外胚层。在包含视网膜组织且基本上不含非神经头部外胚层的聚集体中，例如，在前述聚集体冷冻切片的免疫染色图像中，观察到Rx-阳性组织，在其外侧没有观察到Rx-阴性组织。
步骤(3)的一个实施方案是在包含向视网膜细胞分化诱导需要的浓度的BMP信号转导途径激活物质的无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养步骤(2)中形成的聚集体的步骤，直到开始出现表达Rx基因和/或Chx10基因的细胞，从而产生包含视网膜祖先细胞的聚集体，并且随后在无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养包含所述视网膜祖先细胞的聚集体，直到形成视网膜组织，由此得到包含视网膜组织的聚集体。当随后在无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养包含所述视网膜祖先细胞的聚集体直到形成视网膜组织时，通过将所述培养基更换为分别不含BMP信号转导途径激活物质的无血清培养基或含血清培养基，培养基中为了诱导视网膜祖先细胞的BMP信号转导途径激活物质的浓度可以以每2-4天40-60％的比例逐渐或逐步降低。在一个实施方案中，进行包含视网膜祖先细胞的聚集体的悬浮培养，直到所述聚集体中所包含的不少于20％(优选地，不少于30％，不少于40％，不少于50％，不少于60％)的细胞表达Chx10。
在步骤(3)的一个实施方案中，步骤(2)中得到的聚集体或通过上文提及的方法悬浮培养步骤(2)中得到的聚集体而得到的聚集体可以进行贴壁培养以形成粘附的聚集体。在包含向视网膜细胞分化诱导所需要的浓度的BMP信号转导途径激活物质的无血清培养基或含血清培养基中以粘附状态培养粘附的聚集体，直到开始出现表达Rx基因和/或Chx10基因的细胞，从而产生包含视网膜祖先细胞的聚集体。将包含所述视网膜祖先细胞的聚集体在无血清培养基或含血清培养基中以粘附状态培养，直到形成视网膜组织，由此得到包含视网膜组织的聚集体。在个实施方案中，进行包含视网膜祖先细胞的聚集体的贴壁培养，直到不少于10％(优选地，不少于20％，不少于30％，不少于40％，不少于50％)的所述细胞表达Chx10。
通过本发明的制备方法2，可以高效地从多能干细胞得到视网膜组织。通过本发明的制备方法2得到的视网膜组织包含每个视网膜层专有的神经元，其也可能得到组成视网膜组织的细胞，诸如感光细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞或它们的祖先/前体细胞等。由获得的视网膜组织可以获得什么细胞可以通过本身已知的方法(例如，细胞标记物的表达)来确认。
含有获得的视网膜组织的聚集体也可以直接用作用于评估毒性或药物功效的试剂。将包含视网膜组织的聚集体进行分散处理(例如，胰蛋白酶/EDTA处理)，并且使用FACS或MACS，对得到的细胞进行选择，由此也可以获得高纯度的构成视网膜组织的细胞，例如，高纯度的感光细胞。
可以通过下述步骤(A)和步骤(B)由通过本发明的制备方法2等得到的包含视网膜组织的细胞聚集体产生睫状边缘区样结构。
本发明中的睫状边缘区样结构是指与睫状边缘区相似的结构。“睫状边缘区(CMZ)”的实例包括在体内在视网膜中的视网膜组织(具体地，神经视网膜)和视网膜色素上皮的边缘区中存在的组织，其是包含视网膜组织干细胞(视网膜干细胞)的区域。睫状边缘区还称为睫状边缘或视网膜边缘，并且睫状边缘区、睫状边缘和视网膜边缘是同等的组织。已知睫状边缘区在向视网膜组织供应视网膜祖先细胞或分化细胞、维持视网膜组织结构等中起重要作用。睫状边缘区的标记基因的实例包括Rdh10基因(阳性)、Otxl基因(阳性)、Zicl基因(阳性)等。
步骤(A)包括在分别包含Wnt信号途径激活物质和/或FGF信号途径抑制物质的无血清培养基或含血清培养基中培养通过本发明的制备方法2得到的包含视网膜组织的细胞聚集体持续仅在表达RPE65基因的细胞出现之前的时间期，在所述细胞聚集体中Chx10阳性细胞以占所述视网膜组织20％以上且100％以下的比例存在。
此处关于步骤(A)优选的培养，可以提及悬浮培养。
关于用于步骤(A)的无血清培养基，可以提及作为补充了N2或KSR的基础培养基的无血清培养基。更具体地，可以提及作为补充了N2补充剂(Life Technologies)的DMEM/F-12培养基的无血清培养基。关于含血清的培养基，可以提及作为补充了胎牛血清的基础培养基的含血清培养基。
可以适当设置步骤(A)的培养条件，诸如培养温度、CO2浓度。例如，培养温度在约30℃至约40℃的范围内，优选地，例如，大致约37℃。例如，CO2浓度在约1％至约10％的范围内，优选地，例如，大致约5％。
在步骤(A)中，当在培养基中培养上文提及的“包含视网膜组织的细胞聚集体”时，要包含在无血清培养基或含血清培养基中的Wnt信号转导途径激活物质没有特别限制，只要其能够增强由Wnt介导的信号转导即可。Wnt信号转导途径激活物质的具体实例包括属于Wnt家族的蛋白(例如，Wnt1，Wnt3a，Wnt7a)，Wnt受体，Wnt受体激动剂，GSK3β抑制剂(例如，6-溴靛玉红-3’-肟(6-Bromoindirubin-3’-oxime，BIO)，CHIR99021，Kenpaullone)等。
在常见的Wnt信号转导途径激活物质诸如CHIR99021的情形中，例如，步骤(A)中包含在无血清培养基或含血清培养基中的Wnt信号转导途径激活物质的浓度在约0.1μM至约100μM的范围内，优选地，例如，在约1μM至约30μM的范围内，更优选地，例如，为约3μM。
当在培养基中培养上文提及的“包含视网膜组织的细胞聚集体”时，步骤(A)中包含在无血清培养基或含血清培养基中的FGF信号转导途径抑制物质没有特别限制，只要其能够抑制由FGF介导的信号转导即可。FGF信号转导途径抑制物质的实例包括FGF受体，FGF受体抑制剂(例如，SU-5402，AZD4547，BGJ398)，MAP激酶级联抑制物质(例如，MEK抑制剂，MAPK抑制剂，ERK抑制剂)，PI3激酶抑制剂，Akt抑制剂等。
步骤(A)中包含在无血清培养基或含血清培养基中的FGF信号转导途径抑制物质的浓度仅需要是可以诱导聚集体向睫状边缘区样结构分化的浓度。例如，在SU-5402的情形中，将其添加到培养基中至约0.1μM至约100μM、优选地约1μM至约30μM、更优选地约5μM的浓度。
步骤(A)中“培养持续仅在表达RPE65基因的细胞出现之前的时间期”意指在表达RPE65基因的细胞出现之前的全部时间期内或部分时间期内培养。即，在所述时间期(任意时间期)的全部或部分内的培养是足够的，在所述时间期内，培养系统中的前述“包含视网膜组织的细胞聚集体”由基本上不表达RPE65基因的细胞组成。通过使用这样的培养，可以得到其中没有出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体。
为了确定所述特定的时间期，使用前述“包含视网膜组织的细胞聚集体”作为样品，并且可以通过一般的遗传改造方法或生物化学方法测量样品中包含的RPE65基因表达的存在或不存在或其水平。具体地，例如，可以通过使用针对RPE65蛋白的抗体使前述“包含视网膜组织的细胞聚集体”的冷冻切片进行免疫染色法检验RPE65基因表达的存在或不存在或其水平。
关于步骤(A)中“在表达RPE65基因的细胞出现之前的时间期”，例如，可以提及这样的时间期，在所述时间期内，与在分别包含Wnt信号转导途径激活物质和/或FGF信号转导途径抑制物质的无血清培养基或含血清培养基中开始培养前述细胞聚集体的时刻相比，在上述视网膜组织中存在的Chx10阳性细胞的比例降低，并且落入30％至0％的范围内。关于“其中没有出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”，可以提及这样的细胞聚集体，其中在前述视网膜组织中存在占所述组织的30％至0％比例内的Chx10阳性细胞。
尽管步骤(A)中“在表达RPE65基因的细胞出现之前的时间期”的天数随Wnt信号转导途径激活物质和/或FGF信号转导途径抑制物质的种类、无血清培养基或含血清培养基的种类、其他培养条件等而变化，但是，例如，其在14天内。更具体地，当使用无血清培养基(例如，作为补充了N2的基础培养基的无血清培养基)时，例如，上述时间期优选地在10天内，更优选地，例如，3天至6天。当使用含血清培养基(例如，作为补充了胎牛血清的基础培养基的含血清培养基)时，例如，前述时间期优选地在12天内，更优选地，例如，6天至9天。
然后，关于步骤(B)，将通过上述培养得到的“其中没有出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”在分别不含Wnt信号转导途径激活物质的无血清培养基或含血清培养基中培养。
关于步骤(B)中优选的培养，可以提及悬浮培养。
步骤(B)的无血清培养基优选地不含FGF信号转导途径抑制物质。
关于步骤(B)中的无血清培养基，可以提及作为补充了N2或KSR的基础培养基的培养基。关于含血清培养基，可以提及作为补充了胎牛血清的基础培养基的培养基。更具体地，可以提及作为补充了胎牛血清的DMEM/F-12培养基的含血清培养基。
步骤(B)中前述无血清培养基或含血清培养基可以包含已知的生长因子、添加剂和促进生长的化学物质等。已知的生长因子的实例包括EGF，FGF，IGF，胰岛素等。促进生长的添加剂的实例包括N2补充剂(Life Technologies)，B27补充剂(Life Technologies)，KSR(Life Technologies)等。促进生长的化学物质的实例包括类视黄醇(例如，视黄酸)和牛磺酸。
例如，步骤(B)中的培养的优选的时间期是这样的培养时间期，在所述时间期内，与在分别不含Wnt信号转导途径激活物质的无血清培养基或含血清培养基中开始培养前述细胞聚集体的时刻相比，在上述视网膜组织中存在的Chx10阳性细胞的比例增加，并且达到30％以上。
可以适当地设定步骤(B)中的培养条件，诸如培养温度、CO2浓度等。例如，培养温度在约30℃至约40℃的范围内，优选地，例如，大致约37℃。例如，CO2浓度在约1％至约10％的范围内，优选地，例如，大致约5％。
尽管步骤(B)中直到得到“包含睫状边缘区样结构的细胞聚集体”的上述培养天数随无血清培养基或含血清培养基的种类、其他培养条件等而变化，但是，例如，其在100天之内。例如，前述培养天数优选地为20天至70天，更优选地，例如，30天至60天。
在通过前述步骤(A)、(B)制备的“包含睫状边缘区样结构的细胞聚集体”中，在同一细胞聚集体中，邻近所述睫状边缘区样结构存在视网膜色素上皮和视网膜组织(具体地，神经视网膜)。所述结构可以通过显微镜观察等证实。具体地，例如，可以通过显微镜观察证实睫状边缘区样结构的存在，其作为具有厚视网膜侧和薄视网膜色素上皮侧的上皮结构存在，其在具有高透明度的视网膜组织与表现出色素沉着的视网膜色素上皮之间形成。另外，可以通过利用聚集体冷冻切片的免疫染色鉴定Rdh10阳性、Otx1阳性或Zic1阳性细胞而证实睫状边缘区样结构的存在。
在另一个实施方案中，通过前述步骤(A)、(B)，所述聚集体中包含的视网膜组织(神经上皮)的分化继续进行，并且可以产生成熟的视网膜组织和包含至少一种、优选多种、更优选选自由下述各项组成的组的细胞的全部细胞：感光前体细胞，感光细胞，视锥感光细胞，视杆感光细胞，水平细胞，和中间神经元(无长突细胞，神经节细胞等)。
可以通过下述步骤(C)由通过本发明的制备方法2和类似方法得到的包含视网膜组织的细胞聚集体产生视网膜色素上皮细胞。视网膜色素上皮片层(sheet)可以通过下述步骤(D)由通过下述步骤(C)得到的视网膜色素上皮细胞产生。
本发明中的“视网膜色素上皮细胞”意指在体内在视网膜中神经视网膜组织外部存在的上皮细胞。是否是视网膜色素上皮细胞可以由本领域普通技术人员基于例如细胞标记(RPE65(成熟的视网膜色素上皮细胞)，Miff(幼态的或成熟的视网膜色素上皮细胞)等)的表达、黑素颗粒的存在、多边形特征性细胞形态等而验证。
首先，在步骤(C)中，将通过本发明的制备方法2得到的包含视网膜组织的细胞聚集体在不含BMP信号转导途径激活物质但是包含Wnt信号转导途径激活物质的无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养，从而产生包含视网膜色素上皮细胞的聚集体。
关于用于步骤(C)的无血清培养基，可以提及作为补充了N2或KSR的基础培养基的无血清培养基。更具体地，可以提及作为补充了N2补充剂(Life Technologies)的DMEM/F-12培养基的无血清培养基。关于含血清培养基，可以提及作为补充了胎牛血清的基础培养基的含血清培养基。
除了前述Wnt信号转导途径激活物质之外，用于步骤(C)的无血清培养基还可以包含前述Nodal/激活蛋白信号转导途径激活物质和/或前述FGF信号转导途径抑制物质。
例如，步骤(C)中优选的培养是悬浮培养。
解释步骤(D)，其中将在本发明步骤(C)中得到的聚集体分散并且将得到的细胞以粘附状态培养。
在步骤(C)开始后60天内，优选地在30天内，更优选地3天内，进行步骤(D)。
关于步骤(D)中用于贴壁培养的无血清培养基或含血清培养基，可以提及前述培养基。为了避免复杂的制备，优选使用补充了适量商购血清代替物(如KSR等)的无血清培养基(例如，补充了1/2x N2补充剂、1/2x B27补充剂和100μM 2-巯基乙醇的DMEM/F-12和Neurobasal的1∶1混合物的培养基)。在来源于人iPS细胞的细胞的情形中，例如，要添加到无血清培养基中的KSR的量通常为约1％至约20％，优选约2％至约20％。
在步骤(D)中，优选地在包含ROCK抑制物质的前述无血清培养基或含血清培养基中培养细胞。
在步骤(D)中，更优选地在进一步包含选自由下述各项组成的组的一种或多种物质的无血清培养基或含血清培养基中培养细胞：Wnt信号转导途径激活物质，FGF信号转导途径抑制物质，激活蛋白信号转导途径激活物质和BMP信号转导途径激活物质。
激活蛋白信号转导途径激活物质是能够增强由激活蛋白介导的信号的物质。激活蛋白信号转导途径激活物质的实例包括属于激活蛋白家族的蛋白(例如，激活蛋白A，激活蛋白B，激活蛋白C，激活蛋白AB等)，激活蛋白受体，和激活蛋白受体激动剂。
用于步骤(D)的激活蛋白信号转导途径激活物质的浓度可以是任意浓度，只要可以有效地形成均匀的视网膜色素上皮细胞片层即可。例如，加入重组的人/小鼠/大鼠激活蛋白A(R&D systems，#338-AC)至约1ng/ml至约10μg/ml、优选地约10ng/ml至约1μg/ml、更优选地约100ng/ml的浓度。
例如，在步骤(D)开始起18天内，优选地在第6天，添加激活蛋白信号转导途径激活物质。
在步骤(D)中，优选地在表面用培养基底处理的培养容器上进行贴壁培养。关于步骤(D)中用于处理培养容器的培养基底，可以提及能够允许聚集体来源的细胞的贴壁培养和视网膜色素上皮片层形成的细胞培养基底。
4.制备大脑组织的方法
本发明的制备方法3是用于制备大脑组织的方法，所述方法包括下述步骤(1)-(3)：
(1)第一步，在不存在饲养细胞的条件下在含有1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径激活物质，和2)用于维持未分化状态的因子的培养基中培养多能干细胞，
(2)第二步，悬浮培养第一步中得到的细胞，从而形成细胞聚集体，和
(3)第三步，在存在TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Wnt信号转导途径抑制物质的条件下悬浮培养第二步中得到的聚集体，从而得到包含大脑组织的聚集体。
本发明的制备方法3的步骤(1)可以以与本发明的制备方法1的步骤(1)相同的方式进行。
本发明的制备方法3的步骤(2)也可以以与本发明的制备方法1的步骤(2)相同的方式进行。
用于制备方法3的步骤(2)的培养基可以包含或可以不包含Sonic hedgehog信号转导途径激活物质。
用于步骤(2)的培养基可以包含TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Wnt信号转导途径抑制物质。在步骤(2)中，可以向培养基中单独添加TGFβ家族信号转导途径抑制物质或Wnt信号转导途径抑制物质，并且优选组合添加二者。
在步骤(3)中，关于分化诱导因子，可以向培养基中单独添加TGFβ家族信号转导途径抑制物质或Wnt信号转导途径抑制物质，并且优选组合添加二者。
例如，用于步骤(3)的培养基是补充了TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Wnt信号转导途径抑制物质的无血清培养基或含血清培养基(优选是无血清培养基)。
用于所述培养基的无血清培养基或含血清培养基没有特别限制，只要其是上文提及的即可。为了避免复杂的制备，例如，优选地使用补充了适量的商购血清代替物(如KSR等)的无血清培养基(例如，补充了20％KSR、0.1mM 2-巯基乙醇、非必需氨基酸、1mM丙酮酸的GMEM培养基)。在人多能干细胞(例如，iPS细胞)的情形中，要添加到无血清培养基中的KSR的量通常为约1％至约30％，优选约2％至约20％。
用于步骤(3)的培养基(优选地，无血清培养基)也可以是用于步骤(2)的培养基(优选地，无血清培养基)，或可以用新鲜培养基(优选是无血清培养基)替换。当步骤(2)中所用的不含TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Wnt信号转导途径抑制物质的培养基直接用于步骤(3)时，可以向所述培养基中添加TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Wnt信号转导途径抑制物质。当步骤(2)中使用的包含TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Wnt信号转导途径抑制物质的培养基直接用于步骤(3)时，可以将一半量的所述培养基用相同的培养基更换。
要用在步骤(2)和(3)中的TGFβ家族信号转导途径抑制物质的实例包括TGFβ信号转导途径抑制物质、Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质和BMP信号转导途径抑制物质。
所述TGFβ信号转导途径抑制物质没有特别限制，只要其抑制由TGFβ引起的信号转导途径即可，并且可以是核酸、蛋白、和低分子量有机化合物中的任一种。所述物质的实例包括直接作用于TGFβ的物质(例如，蛋白、抗体、适体等)，抑制编码TGFβ的基因的表达的物质(例如，反义寡核苷酸、siRNA等)，抑制TGFβ受体与TGFβ的结合的物质，和抑制由TGFβ受体的信号转导引起的生理活性的物质(例如，TGFβ受体抑制剂、Smad抑制剂等)。已知作为TGFβ信号转导途径抑制物质的蛋白，可以提及Lefty等。关于TGFβ信号转导途径抑制物质，可以使用本领域普通技术人员公知的化合物，并且具体地，可以提及SB431542，LY-364947，SB-505，A-83-01等。此处，SB431542(4-(5-苯[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-4-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基)-苯甲酰胺)和A-83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-羰基硫代酰胺(carbothioamide))是已知作为TGFβ受体(ALK5)和激活蛋白受体(ALK4/7)的抑制剂(即，TGFβR抑制剂)的化合物。所述TGFβ信号转导途径抑制物质优选是SB431542或A-83-01。
所述Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质没有特别限制，只要其抑制由Nodal或激活蛋白引起的信号转导途径即可，并且可以是核酸、蛋白和低分子量有机化合物中的任一种。该物质的实例包括直接作用于Nodal或激活蛋白的物质(例如，抗体、适体等)、抑制编码Nodal或激活蛋白的基因的表达的物质(例如，反义寡核苷酸、siRNA等)、抑制Nodal/激活蛋白受体与Nodal/激活蛋白的结合的物质，和抑制由Nodal/激活蛋白受体的信号转导引起的生理活性的物质。关于Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质，可以使用本领域普通技术人员公知的化合物，并且具体地，可以提及SB431542、A-83-01等。此外，可以使用已知作为Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质的蛋白(Lefty，Cerberus等)。
所述BMP信号转导途径抑制物质没有特别限制，只要其抑制由BMP引起的信号转导途径即可，并且可以是核酸、蛋白、和低分子量有机化合物中的任一种。此处，关于BMP，可以提及BMP2，BMP4，BMP7和GDF7。该物质的实例包括直接作用于BMP的物质(例如，抗体、适体等)、抑制编码BMP的基因的表达的物质(例如，反义寡核苷酸、siRNA等)、抑制BMP受体(BMPR)与BMP的结合的物质和抑制由BMP受体的信号转导引起的生理活性的物质。关于BMPR，可以提及ALK2和ALK3。关于BMP信号转导途径抑制物质，可以使用本领域普通技术人员公知的化合物，并且具体地，可以提及LDN193189，Dorsomorphin等。此处，LDN193189(4-[6-(4-哌嗪-1-基苯基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基]喹啉)是已知的BMPR(ALK2/3)抑制剂，并且通常以盐酸盐的形式商购得到。此外，可以使用已知作为BMP信号转导途径抑制物质的蛋白(Chordin，Noggin等)。BMP信号转导途径抑制物质优选是LDN193189。
TGFβ家族信号转导途径抑制物质优选是SB431542，A-83-01或LDN193189。
用于步骤(2)和(3)的Wnt信号转导途径抑制物质没有特别限制，只要其可以抑制由Wnt介导的信号转导即可，并且可以是蛋白、核酸、和低分子量化合物等中的任一种。由Wnt介导的信号经由作为Frizzled(Fz)与LRP5/6(低密度脂蛋白受体相关的蛋白5/6)的异二聚体存在的Wnt受体传递。所述Wnt信号转导途径抑制物质的实例包括，但不限于，直接作用于Wnt或Wnt受体的物质(抗-Wnt抗体，抗-Wnt受体抗体等)，抑制编码Wnt或Wnt受体的基因的表达的物质(例如，反义寡核苷酸、siRNA等)，抑制Wnt受体与Wnt的结合的物质(可溶性Wnt受体、占优势的阴性Wnt受体等、Wnt激活物质、Dkk1、Cerberus蛋白等)，抑制由Wnt受体的信号转导引起的生理活性的物质[低分子量化合物，如CKI-7(N-(2-氨基乙基)-5-氯代异喹啉-8-磺酰胺)，D4476(4-[4-(2，3-二氢-1，4-苯并二
Figure BDA0003177256520000661
英-6-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)，IWR-1-endo(IWRle)(4-[(3aR，4S，7R，7aS)-1，3，3a，4，7，7a-六氢-1，3-二氧代-4，7-桥亚甲基-2H-异吲哚-2-基]-N-8-喹啉基-苯甲酰胺)，IWP-2(N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[(3，4，6，7-四氢-4-氧代-3-苯基噻吩并[3，2-d]嘧啶-2-基)硫代]乙酰胺)和类似的，等等]等。CKI-7，D4476，IWR-1-endo(IWR1e)，IWP-2等是已知的Wnt信号转导途径抑制物质，并且适当地可以得到商购的产品等。例如，优选的Wnt信号转导途径抑制物质是IWR1e。
Wnt信号转导途径抑制物质的浓度仅需要是可以将形成多能干细胞聚集体的细胞诱导向大脑细胞分化的浓度。例如，在IWR-1-endo的情形中，其以约0.1μM-约100μM、优选地约0.3μM-约30μM、更优选地约1μM-约10μM、进一步优选地约3μM的浓度添加到培养基中。当使用除IWR-1-endo以外的Wnt信号转导途径激活物质时，其理想地以赋予与上文提及的浓度的IWRle相当的信号转导途径抑制活性的浓度使用。
TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Wnt信号转导途径抑制物质可以在步骤(2)悬浮培养开始时同时、或在步骤(2)悬浮培养开始后经过特定的时间后(例如，在约24小时后或之后)添加到培养基中。
在步骤(3)中，当进行培养基更换操作时，例如，可以通过下述进行：不丢弃已有的培养基添加新鲜培养基的操作(培养基添加操作)，弃掉约一半量的已有的培养基(已有的培养基体积的约40-80％)并且添加约一半量的新鲜培养基(已有的培养基体积的约40-80％)的操作(一半培养基更换操作)，和弃掉约全部量的已有的培养基(不少于已有的培养基的量的90％)并且添加约全部量的新鲜培养基(不少于已有的培养基的量的90％)的操作(完全培养基更换操作)等。
当在特定时间点添加特定成分(例如，IWR-1-endo)时，例如，可以进行这样的操作：计算终浓度，弃掉约一半量的已有的培养基，并且添加约一半量的新鲜培养基(一半培养基更换操作，一半培养基更换)，所述新鲜培养基包含浓度高于所述终浓度(具体地，所述终浓度的1.5倍-3.0倍，例如，约为终浓度的2倍)的特定成分。
当在特定时间点保持已有的培养基中包含的特定成分的浓度时，例如，可以进行这样的操作：弃掉约一半量的已有的培养基，并且添加约一半量的新鲜培养基，所述新鲜培养基包含浓度与已有的培养基中相同的特定成分。
当通过在特定时间点稀释而降低已有的培养基中包含的成分的浓度时，例如，可以每天多次进行培养基更换操作，优选在1小时内进行多次(例如，2-3次)。此外，当通过在特定时间点稀释降低已有的培养基中包含的成分的浓度时，可以将细胞或聚集体转移到另一个培养容器中。
尽管用于培养基更换操作的工具没有特别限制，例如，可以提及移液管、微量移液管、多通道微量移液管、连续的分配器等。例如，当使用96孔平板作为培养容器时，可以使用多通道微量移液管。
可以适当地确定步骤(3)的培养条件，诸如培养温度、CO2浓度等。例如，培养温度为约30℃-约40℃，优选地约为37℃。例如，CO2浓度为约1％-约10％，优选地约为5％。
通过这样的培养，诱导步骤(2)中得到的形成聚集体的细胞向大脑神经前体细胞分化，由此能够得到包含大脑神经前体细胞的聚集体。本发明还提供制备此类包含大脑神经前体细胞的聚集体的方法。包含大脑神经前体细胞的聚集体的获得可以通过例如检测所述聚集体中表达FoxG1、Lhx2、PAX6、Emx2等(其为大脑神经前体细胞标记)的细胞的存在而证实。步骤(3)的一个实施方案是包括下述的步骤：在无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养步骤(2)中形成的聚集体，直到开始出现表达FoxG1的细胞。在一个实施方案中，进行步骤(3)的培养，直到所述聚集体中包含的不少于20％(优选地，不少于30％，不少于40％，不少于50％，不少于60％)的细胞表达FoxG1。
在制备大脑细胞和/或大脑组织的优选实施方案中，在步骤(1)中，将人多能干细胞(例如，人iPS细胞)在不存在饲养细胞的条件下在包含TGFβ信号转导途径抑制物质(例如，SB431542)和bFGF的无血清培养基中以粘附状态培养；在步骤(2)中，将步骤(1)中得到的细胞在无血清培养基中悬浮培养；并且在步骤(3)中，将步骤(2)中得到的聚集体在包含Wnt信号转导途径抑制物质(IWR-1-endo)和TGFβ信号转导途径抑制物质(例如，SB431542)的无血清培养基中悬浮培养。
另外，在制备大脑细胞和/或大脑组织的优选实施方案中，在步骤(1)中，将人多能干细胞(例如，人iPS细胞)在不存在饲养细胞的条件下在包含BMP信号转导途径抑制物质(例如，LDN193189)和bFGF的无血清培养基中以粘附状态培养；在步骤(2)中，将步骤(1)中得到的细胞在无血清培养基中悬浮培养；并且在步骤(3)中，将步骤(2)中得到的聚集体在包含Wnt信号转导途径抑制物质(IWR--1-endo)和TGFβ信号转导途径抑制物质(例如，SB431542)的无血清培养基中悬浮培养。
在制备大脑细胞和/或大脑组织的优选实施方案中，在步骤(1)中，将人多能干细胞(例如，人iPS细胞)在不存在饲养细胞的条件下在包含下述各项的无血清培养基中以粘附状态培养：TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如，TGFβ信号转导途径抑制物质(例如，SB431542，A-83-01)，Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质(例如，Lefty)，BMP信号转导途径抑制物质(例如，LDN193189)，或它们的组合(例如，SB431542和LDN193189)等)；Sonichedgehog信号转导途径激活物质(例如，Shh蛋白，SAG，PMA)；或TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01，LDN193189)与Sonic hedgehog信号转导途径激活物质(例如，Shh蛋白，SAG，PMA)的组合；和bFGF，在步骤(2)中，将步骤(1)得到的细胞在包含下述各项的无血清培养基中悬浮培养：TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如，TGFβ信号转导途径抑制物质(例如，SB431542，A-83-01)，Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质(例如，Lefty)，BMP信号转导途径抑制物质(例如LDN193189)，或它们的组合(例如，SB431542与LDN193189)等)；以及Wnt信号转导途径抑制物质(IWR--1-endo)，以形成细胞聚集体，并且在步骤(3)中，将步骤(2)中得到的聚集体在包含下述各项的无血清培养基中悬浮培养：TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如，TGFβ信号转导途径抑制物质(例如，SB431542，A-83-01)，Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质(例如，Lefiy)，BMP信号转导途径抑制物质(例如，LDN193189)，或它们的组合(例如，SB431542与LDN193189)等)；以及Wnt信号转导途径抑制物质(IWR-1-endo)，从而产生包含大脑神经前体细胞、大脑细胞或大脑组织的聚集体。
步骤(2)的培养基优选地包含ROCK抑制物质(例如，Y-27632)。
更优选地，在步骤(2)中，将步骤(1)中得到的细胞在包含下述各项的无血清培养基中悬浮培养：TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如，TGFβ信号转导途径抑制物质(例如，SB431542，A-83-01)，Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质(例如，Lefty)；Wnt信号转导途径抑制物质(IWR--1-endo)；和ROCK抑制物质(例如，Y-27632)，从而形成细胞聚集体，并且在步骤(3)中，将步骤(2)中得到的聚集体在包含下述各项的无血清培养基中悬浮培养：TGFβ信号转导途径抑制物质(例如，SB431542，A-83-01)，或Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质(例如，Lefty)；和Wnt信号转导途径抑制物质(IWR--1-endo)，从而产生包含大脑神经前体细胞、大脑细胞或大脑组织的聚集体。
得到的包含大脑神经前体细胞的聚集体可以按原样用作评价毒性或药物功效的试剂。包含大脑神经前体细胞的聚集体可以进行分散处理(例如，胰蛋白酶/EDTA处理或木瓜蛋白酶处理)，并且使用FACS或MACS对得到的细胞进行选择，由此也可以得到高纯度的大脑神经前体细胞。
此外，将包含大脑神经前体细胞的聚集体在无血清培养基或含血清培养基中继续培养，以使所述大脑神经前体细胞或大脑细胞进一步分化，由此可以产生具有层结构的大脑组织。
用于所述培养基的无血清培养基或含血清培养基没有特别限制，只要其是上文提及的即可。例如，可以提及作为补充了10％胎牛血清、N2补充物和视黄酸的DMEM-F12培养基的含血清培养基，或补充了适量的商购血清代替物(如N2补充物等)的无血清培养基(例如，诸如补充了N2补充物的DMEM-F12培养基的培养基)等。
尽管从大脑神经前体细胞诱导大脑组织的培养时间期随目的大脑层专有的神经元而不同，但是，例如，该时间期为约7天至约200天。
大脑组织存在，在聚集体中形成神经上皮结构。在悬浮培养结束后，可以将聚集体用固定剂(如多聚甲醛溶液等)固定，并且制备冷冻切片，然后可以通过免疫染色等证实具有层结构的大脑组织的形成。由于大脑组织的各个层由不同的大脑神经前体细胞、脑室区前体细胞、和大脑层结构专有的神经元构成，层结构的形成可以使用针对在这些细胞中表达的前述标记的抗体通过免疫染色证实。在一个实施方案中，所述大脑组织是FoxG1-阳性的神经上皮结构。
存在于聚集体表面上的大脑组织可以使用镊子等从所述聚集体上物理切下。在这一情形中，由于可以在每个聚集体表面上形成除大脑组织之外的神经组织，从所述聚集体上切下的一部分神经组织可以进行下文提及的免疫染色等的验证，由此可以证实所述组织是大脑组织。
步骤(3)的一个实施方案是在包含向大脑细胞分化诱导需要的浓度的TGFβ信号转导途径抑制物质和/或Wnt信号转导途径抑制物质的无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养步骤(2)中形成的聚集体的步骤，直到开始出现表达FoxG1基因的细胞，从而产生包含大脑神经前体细胞的聚集体，并且在无血清培养基或含血清培养基中继续悬浮培养包含所述大脑神经前体细胞的聚集体，直到形成大脑组织，由此得到包含大脑组织的聚集体。在一个实施方案中，进行包含大脑神经前体细胞的聚集体的悬浮培养，直到所述聚集体中所包含的不少于20％(优选地，不少于30％，不少于40％，不少于50％，不少于60％)的细胞表达FoxG1。
在步骤(3)的一个实施方案中，步骤(2)中得到的聚集体或通过上文提及的方法悬浮培养步骤(2)中得到的聚集体而得到的聚集体可以进行贴壁培养以形成粘附的聚集体。在包含向大脑细胞分化诱导所需要的浓度的TGFβ信号转导途径抑制物质和/或Wnt信号转导途径抑制物质的无血清培养基或含血清培养基中以粘附状态培养粘附的聚集体，直到开始出现表达FoxG1基因的细胞，从而产生包含大脑神经前体细胞的聚集体。将包含所述大脑神经前体细胞的聚集体在无血清培养基或含血清培养基中继续悬浮培养，直到形成大脑组织，由此得到包含大脑组织的聚集体。在一个实施方案中，进行包含大脑神经前体细胞的聚集体的贴壁培养，直到不少于10％(优选地，不少于20％，不少于30％，不少于40％，不少于50％)的所述细胞表达FoxG1。
通过本发明的制备方法3，可以高效地从多能干细胞得到大脑组织。因为通过本发明的制备方法3得到的视网膜组织包含每个大脑层专有的神经元，其也可能得到组成大脑组织的细胞，诸如层结构专有的神经元或其前体细胞等。由获得的大脑组织可以获得什么细胞可以通过本身已知的方法(例如，细胞标记物的表达)来验证。
获得的含有大脑组织的聚集体也可以直接用作用于评估毒性或药物功效的试剂。将包含大脑组织的聚集体进行分散处理(例如，胰蛋白酶/EDTA处理)，并且使用FACS或MACS，对得到的细胞进行选择，由此也可以获得高纯度的组成大脑组织的细胞，例如，高纯度的大脑层结构专有的神经元。
4.评价毒性或功效的方法
由于通过本发明的制备方法1、2或3产生的神经组织或神经细胞(例如，视网膜组织，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元，脑组织，大脑神经前体细胞，大脑层专有的神经元)可作为用于疾病研究或药物发现的材料用于筛选治疗由于神经组织或神经细胞的紊乱导致的疾病的药物，或用于毒性评价，其可以用作评价测试物质的毒性或功效的试剂。例如，由患有由于神经组织(例如，视网膜组织，大脑组织)紊乱导致的疾病、特别是遗传病的人患者产生iPS细胞，并且使用该iPS细胞，通过本发明的方法产生神经组织或神经细胞(例如，视网膜组织，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元，大脑组织，大脑神经前体细胞，大脑层专有的神经元)。所述神经组织或神经细胞可以在体外重现引起患者的疾病的神经组织紊乱。因此，本发明提供用于评价测试物质的毒性或功效的方法，所述方法包括使所述测试物质与通过本发明的制备方法1、2或3产生的神经组织或神经细胞(例如，视网膜组织，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元，大脑组织，大脑神经前体细胞，大脑层专有的神经元)接触，并且检测所述物质对所述细胞或组织的影响。
例如，在存在或不存在(阴性对照)测试物质的条件下，培养通过本发明的制备方法1、2或3产生的具有特定紊乱(例如，遗传性紊乱)的神经组织或神经细胞(例如，视网膜组织，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元，大脑组织，大脑神经前体细胞，大脑层专有的神经元)。然后，将用测试物质处理的所述神经组织或神经细胞的紊乱的严重性与阴性对照的严重性进行比较。结果，可以选择减轻紊乱的严重性的测试物质作为用于治疗由所述紊乱导致的疾病的药物的候选物质。例如，可以寻找改善通过本发明的制备方法产生的神经细胞的生理活性(例如，存活促进或成熟)的测试物质作为药物产品的候选物质。备选地，按照本发明的制备方法，通过诱导由体细胞制备的诱导的多能干细胞的分化制备神经细胞，所述体细胞具有引起特定紊乱诸如神经学疾病等的基因突变。
可以基于添加了测试物质的神经细胞是否表现出前述紊乱作为指标，寻找有效作为所述紊乱的治疗药或预防药的测试物质的候选物。
对于毒性评价，将通过本发明的制备方法1、2或3产生的神经组织或神经细胞(例如，视网膜组织，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元，大脑组织，大脑神经前体细胞，大脑层专有的神经元)在存在或不存在(阴性对照)测试物质的条件下培养。然后，将对用所述测试物质处理的神经组织或神经细胞的毒性的严重性与阴性对照比较。结果，与阴性对照相比，可以判断表现出毒性的测试物质是对神经组织或神经细胞(例如，视网膜组织，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元)具有毒性的物质。
即，本发明包括评价毒性的方法，所述方法包括下述步骤：
(步骤1)在测试物质的存在下，在存活培养条件下，培养通过本发明的制备方法1、2或3产生的神经组织或神经细胞持续给定的时间，并且测量细胞损伤的严重性的步骤，
(步骤2)在不存在测试物质或存在阳性对照时，在存活培养条件下，培养通过本发明的制备方法1、2或3产生的神经组织或神经细胞持续给定的时间，并且测量细胞损伤的严重性的步骤，
(步骤3)基于(步骤1)和(步骤2)中测量的结果的差异，评价步骤1中测试物质的毒性的步骤。
用于本文时，“在不存在测试物质时”包括仅添加培养基或用于溶解所述测试物质的溶剂，而不添加测试物质。另外，“阳性对照”意指已知具有毒性的化合物。测量细胞损伤严重性的方法的实例包括测量存活细胞数量的方法，例如，测量细胞内ATP的量的方法，通过细胞染色(例如，核染色)和形态观察测量存活细胞数量的方法等。
在步骤3中，关于评价测试物质的毒性的方法，比较步骤1中的测量值和步骤2中阴性对照的测量值，并且当步骤1中细胞损伤的严重性高时，可以判断所述测试物质具有毒性。另外，比较步骤1中的测量值与步骤2中阳性对照的测量值，并且当步骤1中细胞损伤的严重性相同或更高时，可以判断所述测试物质具有毒性。
5.药物组合物
本发明提供包含有效量的通过本发明的制备方法1、2或3产生的神经组织或神经细胞(例如，视网膜组织，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元，大脑组织，大脑神经前体细胞，大脑层专有的神经元)的药物组合物。
所述药物组合物包含有效量的通过本发明的制备方法1、2或3产生的神经组织或神经细胞(例如，视网膜组织，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元，大脑组织，大脑神经前体细胞，大脑层专有的神经元)和药用载体。
关于药用载体，可以使用生理水性溶剂(盐水，缓冲液，无血清培养基等)。必要时，在移植治疗中，包含要移植的组织或细胞的药物可以包含方便使用的防腐剂、稳定剂、还原剂、等渗剂等。
本发明的药物组合物可以通过将由本发明的制备方法1、2或3产生的神经组织或神经细胞悬浮在适当的生理水性溶剂中制成混悬剂。必要时，所述组合物可以添加防冻剂，冷冻保藏，使用时解冻，用缓冲液洗涤，并且用于移植治疗。
通过本发明的制备方法得到的神经组织也可以用镊子等切成适当的尺寸，以产生片层制剂。
通过本发明的制备方法得到的细胞也可以在步骤(3)中进行贴壁培养用于分化诱导，从而形成片层样细胞，产生片层制剂。
本发明的药物组合物可以用作治疗由于神经组织或神经细胞(例如，视网膜组织，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元，大脑组织，大脑神经前体细胞，大脑层专有的神经元)的紊乱导致的疾病的药物。
6.治疗药
通过本发明的制备方法1、2或3产生的神经组织或神经细胞(例如，视网膜组织，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元，大脑组织，大脑神经前体细胞，大脑层专有的神经元)可用于由于神经组织或神经细胞的紊乱导致的疾病的移植治疗。因此，本发明提供用于治疗由于神经组织或神经细胞的紊乱导致的疾病的药物，其包含通过本发明的制备方法1、2或3产生的神经组织或神经细胞(例如，视网膜组织，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元，大脑组织，大脑神经前体细胞，大脑层专有的神经元)。通过本发明的制备方法1、2或3产生的神经组织或神经细胞(例如，视网膜组织，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元，大脑组织，大脑神经前体细胞，大脑层专有的神经元)可以用作治疗由于神经组织或神经细胞的紊乱导致的疾病的药物或用于补充损伤状态的神经组织中相对应的损伤位点。由于神经组织或神经细胞的紊乱导致的疾病和损伤状态的神经组织可以通过向具有由于神经组织或神经细胞的紊乱导致的疾病或损伤状态的神经组织的患者(其需要移植)移植通过本发明的制备方法1、2或3产生的神经组织或神经细胞进行治疗，从而补充神经细胞或紊乱的神经组织本身。由于神经组织或神经相关的细胞的紊乱导致的疾病的实例包括神经变性疾病(neurodegenerative diseases)(例如，大脑局部缺血病症(cerebral ischemicdisorder)，脑梗死(cerebral infarction)，帕金森病(Parkinson’s disease)，脊髓损伤(spinal cord injury)，脑血管病症(cerebrovascular disorders)或脑/脊髓创伤病症(brain/spinal cord traumatic disorders)(例如，脑梗死，头部外伤性脑损伤(headtraumatic brain injury，TBI)或脊髓损伤多系统萎缩(spinal cord injury multiplesystem atrophy))，局部神经变性疾病(typical neurodegenerative disease)(肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)，帕金森病(PD)，帕金森综合征(Parkinsonsyndrome)，阿尔茨海默型痴呆(dementia of Alzheimer type)，进行性核上性麻痹(progressive supranuclear paralysis，PSP)，亨廷顿病(Huntington’s disease)，多系统萎缩(multiple system atrophy，MSA)，脊髓小脑变性(spinal cord cerebellardegeneration，SCD))，脱髓鞘脑病(demyelination disease)或神经肌肉病(neuromuscular disease)(多发性硬化(multiple sclerosis，MS)，急性播散性脑脊髓炎(acute disseminated encephalomyelitis，ADEM)，炎性弥漫性硬化症(inflammatorypervasive sclerosis)(希尔德病(Schilder disease))，亚急性硬化性全脑炎(subacutesclerosing panencephalitis)，进行性多病灶脑白质病(progressive multifocalleukoencephalopathy)，脑缺氧(cerebral hypoxia)，脑桥中央髓鞘溶解(centralpontine myelinolysis)，宾斯旺格病(Binswanger disease)，吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome)，菲希尔综合征(Fisher syndrome)，慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)，脊髓空洞症(syringomyelia)，脊髓小脑变性(spinocerebella degeneration)，纹状体黑质变性(striatonigral denaturation，SND)，橄榄体脑桥小脑萎缩(olivopontoserebellaratrophy，OPCA)，夏伊-德雷格综合征(Shy-Drager syndrome))，眼科病(ophthalmologicdisease)(黄斑变性(macular degeneration)，年龄相关黄斑变性(age-related maculardegeneration)，视网膜色素变性(retinal pigment denaturation)，白内障(cataract)，青光眼(glaucoma)，角膜病(cornea disease)，视网膜病变(retinopathy))，难治性癫痫(refractory epilepsy)，进行性核上性麻痹(progressive supranuclear paralysis)，脊髓空洞症，脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy，SMA)，脊髓延髓肌萎缩(spinobulbarmuscular atrophy，SBMA)，原发性侧索硬化症(primary lateral sclerosis，PLS)，进行性核上性麻痹(progressive supranuclear paralysis，PSP)，皮质基底节变性(corticobasal degeneration，CBD)，亨廷顿病(Huntington’s disease，HD)，舞蹈病棘红细胞增多症(choreoacanthocytosis)，脊髓空洞症，额颞叶退化(Frontotemporal lobardegeneration)，夏-马-图三氏病(Charcot-Marie-Tooth disease)，张力失常(dystonia)，泛素激酶相关的神经变性(Pantothenate kinase-associated neurodegeneration)，家族性痴呆症(familial dementia)，帕金森综合征(Parkinson’s syndrome)，老年性痴呆(senile dementia)，痉挛性截瘫(spastic paraplegia)，雷维小体痴呆症(Lewy bodydementia)等。由于大脑组织或大脑相关的细胞的紊乱导致的疾病的实例包括神经变性疾病(例如，大脑局部缺血损伤(cerebral ischemic injury)，脑梗死，运动神经元病(motorneuron disease)，ALS，阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)，聚谷氨酰胺病(polyglutamine disease)，皮质基底变性(cotricobasal degeneration))。由于视网膜组织或视网膜相关的细胞的紊乱导致的疾病的实例包括视网膜变性(retinaldenauration)、视网膜色素性变性(pigmentary degeneration of the retina)、年龄相关黄斑变性(age-related macular degeneration)、有机汞中毒(organic mercurypoisoning)、氯喹视网膜病变(chloroquine retinopathy)、青光眼(glaucoma)、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy)、新生儿视网膜病变(retinopathy of newbornbabies)等。神经组织的损伤状态的实例包括神经组织分离后的患者、神经组织中肿瘤辐照和创伤后的患者。
在移植治疗中，由于组织相容性抗原的差异导致的排异通常构成问题。然而，该问题可以通过使用由移植接受体的体细胞建立的多能干细胞(例如，诱导的多能干细胞)而解决。即，在优选的实施方案中，由接受体的体细胞建立的多能干细胞(例如，诱导的多能干细胞)用作本发明的方法中的多能干细胞，并且产生对于所述接受体在免疫上是自身的神经组织或神经细胞并移植到所述接受体中。
另外，可以从由与接受体免疫相容的(例如，在HLA型和MHC型方面相容)其他人的体细胞建立多能干细胞(例如，诱导的多能干细胞)产生同种异体神经组织或神经细胞，并且移植到所述接受体中。
[实施例]
在下文通过参考实施例详细解释本发明，所述实施例不应该解释为限制性的。
实施例1：在步骤1中使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质预先处理人iPS细胞的 实施例
按照“Scientific Reports，4，3594(2014)”中所述的方法，使人iPS细胞(1231A3株，获自京都大学(Kyoto University))进行无饲养细胞的培养。关于无饲养细胞的培养基，使用StemFit培养基(AK03，由Ajinomoto Co.，Inc.制造)，并且关于无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511-E8(由Nippi，Inc.制造)。
关于具体的维持培养操作，首先将亚汇合的人iPS细胞(1231A3株)用PBS洗涤，并且使用TrypLE Select(由Life Technologies制造)分散成单个细胞。然后，将上述分散成单个细胞的人iPS细胞接种在用层粘连蛋白511-E8包被的塑料培养皿中，并且在存在Y27632(ROCK抑制物质，10μM)的条件下，在StemFit培养基中进行无饲养细胞的培养。当使用6孔平板(由Iwaki制造，对于细胞培养，培养面积为9.4cm2)作为前述塑料培养皿时，将关于上述分散成单个细胞的人iPS细胞的铺板细胞数目调整为6x103。接种后一天，将培养基更换为不含Y27632的StemFit培养基。然后，1-2天一次，将培养基更换为不含Y27632的StemFit培养基。之后，接种后6天，培养细胞至亚汇合(60％的培养面积被细胞覆盖)。
作为本发明的制备方法的步骤1中预先处理的具体实施例，进行下述操作。首先，将上述亚汇合的人iPS细胞(1231A3株)用PBS洗涤，并且通过使用TrypLE Select(由LifeTechnologies制造)分散成单个细胞。然后，将上述分散成单个细胞的人iPS细胞接种在用层粘连蛋白511-E8包被的塑料培养皿(由Iwaki制造)中，并且在存在Y27632(ROCK抑制物质，10μM)的条件下，在StemFit培养基中进行无饲养细胞的培养。当使用6孔平板(由Iwaki制造，培养面积为9.4cm2)作为上述塑料培养皿时，将关于上述分散成单个细胞的人iPS细胞的铺板细胞数目调整为6x103。当使用60mm平皿(由Iwaki制造，培养面积为21cm2)作为上述塑料培养皿时，将关于上述分散成单个细胞的人iPS细胞的铺板细胞数目调整为13x103。接种后一天，将培养基更换为不含Y27632的StemFit培养基。然后，1-2天一次，将培养基更换为不含Y27632的StemFit培养基。之后，培养细胞直到接种后5天，即，亚汇合之前一天(50％的培养面积被细胞覆盖)。甚至在在接种后培养6天时，也显示相似的结果。使在上述无饲养细胞培养中亚汇合前一天的人iPS细胞在存在SB431542(TGFβR抑制剂(TGFβRi)，5μM)的条件下(步骤1：预先处理的处理，图1“预先处理TGFβRi 24hr”)或在不存在其的条件下(步骤1：无预先处理的处理，图1“对照”)进行无饲养细胞培养持续1天。在倒置显微镜(KEYENCE)下进行培养细胞的亮视野观察。结果，发现在无饲养细胞培养过程中，人iPS细胞的形态没有很大程度受到TGFβR抑制剂(SB431542)处理影响(图1)。
实施例2：在步骤1中使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质或Shh激活物质预先处 理人iPS细胞的实施例-2
按照实施例1所述的方法，使人iPS细胞(1231A3株)在StemFit培养基中进行无饲养细胞培养直到亚汇合前一天。使亚汇合前一天的人iPS细胞在存在SB431542(TGFβR抑制剂，5μM)，LDN193189(BMPR抑制剂，100nM)，SAG(Shh激活物质，300nM)，或TGFβR抑制剂和BMPR抑制剂(SB431542 5μM，与LDN193189 100nM)的条件下(步骤1：预先处理的处理)，或在不存在它们的条件下(步骤1：不进行预先处理)进行无饲养细胞的培养持续1天。将得到的细胞分别用4％多聚甲醛固定，并且进行针对Oct3/4(其是多能干细胞标记中的一种)的染色，并将免疫染色的细胞在倒置荧光显微镜(BIOREVO，KEYENCE)下进行亮视野观察和荧光图像观察。在免疫染色分析中判断上述标记是否是阳性的时，将比背景高不小于2倍的强度值确定为阳性的。结果，发现用任意化合物进行预先处理的处理的细胞都是Oct3/4-阳性的，这与未经预先处理的细胞相似(图2)。即，发现在这些条件下预先处理的细胞具有维持的多能样状态。
实施例3：在步骤1中通过使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质由人iPS细胞形成 细胞聚集体的实施例
按照实施例1所述的方法，使人iPS细胞(1231A3株)在StemFit培养基中进行无饲养细胞培养直到亚汇合前一天。使亚汇合前一天的人iPS细胞在存在SB431542(TGFβR抑制剂，5μM)的条件下(步骤1：预先处理：TGFβRi处理)或在不存在其的条件下(步骤1：无预先处理)进行无饲养细胞培养持续1天。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)，将上述人iPS细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.2×104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)中的100μl无血清培养基中，并且在37℃，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油和1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中加入Y27632(终浓度为20μM)。到悬浮培养开始后第2天，在预先处理条件下和未经预先处理的条件下都形成细胞聚集体(步骤2结束，并且步骤3开始)。在悬浮培养开始后第3天，加入不含Y27632的无血清培养基(50μl)。
将在悬浮培养开始后第6天的这样制备的细胞在倒置显微镜(KEYENCE)下进行亮视野观察(图3)。结果，发现在存在TGFβR抑制剂(SB431542)的条件下进行预先处理的处理的细胞的细胞聚集体(图3B)具有比未经预先处理的处理的细胞的聚集体(图3A)更好的形状。
此外，在倒置显微镜下进行在悬浮培养开始后第6天的细胞聚集体的形状的亮视野观察，并且将形状分类为良好的形状(图3C，黑色条，球状、平滑表面和致密的内部)、中等水平的形状(图3，灰色条，球状，形成囊)和差的形状(图3C，白色条，不是球状的，塌陷的)并定量。结果，发现在未经预先处理的条件下，约90％的细胞聚集体具有差的形状，约10％的细胞聚集体具有中等形状，并且约0％的细胞聚集体具有良好的形状(图3C“对照”，从左数第一条状图)。相反，发现，在预先处理的处理条件下，约0％的细胞聚集体具有差的形状，约0％的细胞聚集体具有中等形状，并且约100％的细胞聚集体具有良好的形状(图3C“预先处理(TGFβRi)”，从左数第三条状图)。即，发现在步骤1中用TGFβR抑制剂(SB431542，5μM)预先处理的处理导致步骤2和3中的良好形状的细胞聚集体。
实施例4：在步骤1或步骤2中通过使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质由人iPS细 胞形成细胞聚集体的实施例
按照实施例1所述的方法，使人iPS细胞(1231A3株)在StemFit培养基中进行无饲养细胞培养直到亚汇合前一天。使亚汇合前一天的人iPS细胞在存在SB431542(TGFβR抑制剂，5μM)的条件下(步骤1，预先处理：TGFβRi处理)或在不存在其的条件下(步骤1：未经预先处理)进行无饲养细胞培养持续1天。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)，将上述人iPS细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.2×104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)中的100μl无血清培养基中，并且在37℃，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中加入Y27632(终浓度为20μM)和TGFβR抑制剂(SB431542，5μM)。到悬浮培养开始后第2天，在预先处理条件下和未经预先处理的条件下都形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。在悬浮培养开始后第3天，加入不含Y27632并且补充了TGFβR抑制剂(SB431542，5μM)的无血清培养基(50μl)。
按照实施例3所述的方法观察在悬浮培养开始后第6天的这样制备的细胞聚集体的形状。结果，在步骤1中未经预先处理的处理并且在步骤2中补充了TGFβR抑制剂(SB431542)的条件下，发现约30％的细胞聚集体具有差的形状，约60％的细胞聚集体具有中等形状，并且约10％的细胞聚集体具有良好的形状(图3C，‘对照+SB’，从左数第二条状图)。相反，发现在步骤1中进行预先处理的处理并且在步骤2中添加TGFβR抑制剂(SB431542)的条件下，约0％的细胞聚集体具有差的形状，约0％的细胞聚集体具有中等形状，并且约100％的细胞聚集体具有良好的形状(图3C，‘预先处理(TGFβRi)+SB’，从左数第四条状图)。即，发现，与在步骤1中不进行预先处理的处理相比，在步骤1中用TGFβR抑制剂(SB431542，5μM)进行预先处理的处理甚至在步骤2和步骤3中添加TGFβR抑制剂(SB431542)的条件下都导致良好形状的细胞聚集体。
此外，实施例3和实施例4的比较揭示，与在步骤1中未经预先处理的处理并且在步骤2和步骤3中添加TGFβR抑制剂(SB431542)的条件(图3C“对照+SB”，从左数第二条状图)相比，在步骤1中使用TGFβR抑制剂(SB431542)进行预先处理的处理并且在步骤2和步骤3中不添加TGFβR抑制剂(SB431542)的条件(图3℃“预先处理(TGFβRi)”，从左数第三条状图)产生更高比例的具有良好形状的细胞聚集体。即，发现添加TGFβR抑制剂(SB431542)的优选的时机是在步骤1中(预先处理)。
实施例5：在步骤1中通过使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质由人iPS细胞形成 细胞聚集体的实施例
按照实施例1所述的方法，使人iPS细胞(1231A3株)在StemFit培养基中进行无饲养细胞培养直到亚汇合前一天。使亚汇合前一天的人iPS细胞在存在SB431542(TGFβR抑制剂，5μM)或LDN193189(BMPR抑制剂，100nM)的条件下(步骤1：预先处理的处理)或在不存在其的条件下(步骤1：未经预先处理)进行无饲养细胞培养持续1天。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)，将上述人iPS细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.2×104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)中的100μl无血清培养基中，并且在37℃，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油和1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中加入Y27632(终浓度为20μM)。到悬浮培养开始后第2天，在预先处理条件下和未经预先处理的条件下都形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。在悬浮培养开始后第3天，加入不含Y27632的无血清培养基(50μl)。在悬浮培养开始后第6天或以后，将50-70％体积的培养基更换为上述不含Y27632的无血清培养基，每2-4天更换一次。
将在悬浮培养开始后第9天的这样制备的细胞聚集体在倒置显微镜(KEYENCE)下进行亮视野观察(图4)。结果，发现，与实施例3类似，与未处理组(图4A)相比，在步骤1中存在TGFβR抑制剂(SB431542)的条件下进行预先处理的处理的细胞在步骤3中显示出良好形状的细胞聚集体(图4B)。此外，发现与未处理组(图4A)相比，甚至在步骤1中存在BMPR抑制剂(SB431542)的条件下进行预先处理的处理的细胞也在步骤3中表现出良好形状的细胞聚集体(图4C)。即，发现使用TGFβR抑制剂(SB431542)和BMPR抑制剂(LDN193189)(它们是TGFβ家族信号转导途径抑制物质)中的任一种用于预先处理的处理(步骤1)提供得到良好形状的细胞聚集体的作用。
实施例6：在步骤1中通过使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质预先处理的人iPS 细胞形成神经组织的实施例
按照实施例1所述的方法，使人iPS细胞(1231A3株)在StemFit培养基中进行无饲养细胞培养直到亚汇合前一天。使亚汇合前一天的人iPS细胞在存在LDN193189(BMPR抑制剂，100nM)的条件下(步骤1：预先处理)或在不存在其的条件下(步骤1：未经预先处理)进行无饲养细胞培养持续1天。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)，将上述人iPS细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.2×104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)中的100μl无血清培养基中，并且在37℃，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中加入Y27632(终浓度为20μM)。到悬浮培养开始后第2天，在预先处理条件下和未经预先处理的条件下都形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。在悬浮培养开始后第3天，加入不含Y27632的无血清培养基(50μl)。在悬浮培养开始后第6天或以后，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632的无血清培养基，每2-4天更换一次。在一半培养基更换操作中，弃掉培养容器中一半体积的培养基，即75μl，加入上述新鲜的无血清培养基(75μl)，使得总培养基量为150μl。
使在悬浮培养开始后第23天的这样制备的细胞在倒置显微镜(KEYENCE)下进行亮视野观察悬浮培养(图5A，B)。结果，发现，在步骤1中不经过预先处理的处理条件下，在步骤3中细胞聚集体塌陷并且完全不形成神经组织(图5A)。另一方面，发现在步骤1中在存在BMPR抑制剂(LDN193189)的条件下进行预先处理的处理的细胞在步骤3中形成良好形状的细胞聚集体，并且形成具有神经上皮结构的神经组织(图5B)。此外，使在悬浮培养开始后第23天的细胞在倒置显微镜(KEYENCE)下进行亮视野观察，并且分别定量“其中神经组织部超过3％的塌陷的细胞聚集体(具有差的形状的细胞聚集体)”，“其中神经组织不超过10％的维持的细胞聚集体(具有中等水平形状的细胞聚集体)”和“其中神经组织不少于10％的维持的细胞聚集体(包含神经组织的细胞聚集体)”。结果，发现在步骤1中未经预先处理的条件下，约100％是具有差的形状的细胞聚集体，约0％是具有中等水平形状的细胞聚集体，并且约0％是包含神经组织的细胞聚集体。相反，发现在步骤1中进行预先处理的条件下，约0％是具有差的形状的细胞聚集体，约0％是具有中等水平形状的细胞聚集体，并且约100％是包含神经组织的细胞聚集体。
此外，将在悬浮培养开始后第23天的由上述进行预先处理的处理的iPS细胞作为起始材料(图5B的条件)产生的细胞聚集体用4％多聚甲醛固定，以制备冷冻切片。将这些冷冻切片针对巢蛋白(抗-巢蛋白抗体，Millipore K.K.，小鼠)(其是一种神经组织标记(神经前体细胞))、TuJ1(抗-βIII-微管蛋白抗体，Promega K.K.，小鼠)(其是一种神经组织标记(神经元))或PSA-NCAM(抗-PSA-NCAM抗体，Millipore K.K.，小鼠IgM)(其是一种神经组织标记)免疫染色。在倒置荧光显微镜下观察这些免疫染色的切片。结果，发现在用BMPR抑制剂(LDN193189)进行预先处理的条件下制备的细胞聚集体中，总细胞中巢蛋白-阳性细胞的比例为约20％，总细胞中TuJ1-阳性细胞的比例为约70％，并且总细胞中PSA-NCAM-阳性细胞的比例为约70％(图5C-E)。此外，从连续切片的分析可以证实，在倒置显微镜下亮视野中通过形态观察可能确定为神经组织的区域是巢蛋白-阳性的、TuJ1-阳性的和PSA-NCAM-阳性的(图5C-E)。从这些结果，发现通过在步骤1中使用进行无饲养细胞培养的人iPS细胞作为起始材料并且用TGFβ家族信号转导途径抑制物质预先处理，在步骤3中能够有效地产生神经组织。
实施例7：由人iPS细胞形成视网膜组织的实施例，包括在步骤1中用TGFβ家族信号 转导途径抑制物质预先处理和在步骤3中使用BMP信号转导途径激活物质作为分化诱导因 子
按照实施例1所述的方法，使人iPS细胞(1231A3株)在StemFit培养基中进行无饲养细胞培养直到亚汇合前一天。使亚汇合前一天的人iPS细胞在存在LDN193189(BMPR抑制剂，100nM)的条件下(步骤1：预先处理)进行无饲养细胞培养持续1天。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)，将上述人iPS细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.2×104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)中的100μl无血清培养基中，并且在37℃，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中加入Y27632(终浓度为20μM)。到悬浮培养开始后第2天，在预先处理条件下形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。在悬浮培养开始后第3天，加入不含Y27632的无血清培养基(50μl)。
此处，作为步骤3，培养在下述条件1和条件2下进行：在条件1(+BMP)下，在悬浮培养开始后第6天，将培养基更换为不含Y27632但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基，以使外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/ml)(图6B，D)。在条件2(-BMP)下，在悬浮培养开始后第6天，将一半量的培养基更换为不含Y27632且不含BMP信号转导途径激活物质的培养基，不添加外源性人重组BMP4(图6A，C)。
在悬浮培养开始后第6天或以后，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632和人重组BMP4的无血清培养基，每2-4天更换一次。在悬浮培养开始后第23天，通过倒置显微镜观察形态。结果，发现在该实施例中，使用预先处理的iPS细胞作为起始材料，细胞聚集体得以维持并且形成了神经组织。
将在悬浮培养开始后第23天的由上述在步骤1中进行预先处理的处理的iPS细胞作为起始材料产生的细胞聚集体用4％多聚甲醛固定，以制备冷冻切片。将这些冷冻切片针对Chx10(抗-Chx10抗体，Exalpha，绵羊)(其是一种视网膜组织标记)或Rx(抗-Rx抗体，Takara，豚鼠)(其是一种视网膜组织标记)免疫染色。在倒置荧光显微镜下观察这些免疫染色的切片。结果，发现，在步骤1中用BMPR抑制剂(LDN193189)进行预先处理并且在步骤3中不添加BMP4的条件下制备的细胞聚集体中，总细胞中Rx-阳性细胞的比例低于10％(Rx-强阳性(对应视网膜)低于3％，Rx-弱阳性(对应视网膜之外的神经组织)低于7％)，并且Chx10-阳性细胞的比例也低于3％(图6A，C)。另一方面，发现，在步骤1中用BMPR抑制剂(LDN193189)进行预先处理并且在步骤3中添加BMP4的条件下制备的细胞聚集体中，总细胞中Rx-阳性细胞的比例为约60％，并且总细胞中Chx10-阳性细胞的比例也为约60％(图6B，D)。此外，从连续切片分析可知，提示在具有高比例(约95％)的Chx10-阳性细胞的神经组织中，Rx也是强阳性的(图6B，D)。从这些结果，发现在涉及步骤1中的预先处理的条件下形成神经组织，并且进一步地，通过在步骤3的悬浮培养中添加BMP信号转导途径激活物质作为悬浮培养过程中的分化诱导因子，能够由无饲养细胞培养的人iPS细胞(以下有时称为无饲养细胞的人iPS细胞)有效地产生视网膜组织。
实施例8：在步骤1中使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质或Shh信号转导途径激 活物质和在步骤2中使用Shh信号转导途径激活物质，由无饲养细胞的人iPS细胞形成神经 组织的实施例
按照实施例1所述的方法，使人iPS细胞(1231A3株)在StemFit培养基中进行无饲养细胞培养直到亚汇合前一天。使亚汇合前一天的人iPS细胞在存在SB431542(TGFβR抑制剂，5μM)、LDN193189(BMPR抑制剂，100nM)或SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)的条件下或在不存在其的条件下(步骤1：无预先处理)进行无饲养细胞培养持续1天。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)，将上述人iPS细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.2×104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)中的100μl无血清培养基中，并且在37℃，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。
在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，将细胞在下述条件1和条件2下培养。在条件1(+SAG)下，在悬浮培养开始时向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度为20μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)(图7B-D，F-H，‘+SAG’)。在条件2(-SAG)下，在悬浮培养开始时向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度为20μM)但是不添加SAG(图7A，E，‘-’)。到悬浮培养开始后第2天，在两种条件下都形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。在悬浮培养开始后第3天，加入不含Y27632和SAG的无血清培养基(50μl)。
在悬浮培养开始后第6天，将培养基更换为不含Y27632和SAG且包含或不包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基，以提供包含终浓度为1.5nM的外源性人重组BMP4的培养基(图7E-H)，或不含BMP信号转导途径激活物质的培养基(图7A-D)。在悬浮培养开始后第6天或以后，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基，每2-4天更换一次。
在悬浮培养开始后第23天，将这样制备的细胞在倒置显微镜(KEYENCE)下进行亮视野观察(图7)。此外，在悬浮培养开始后第23天，按照实施例6所述的方法，定量细胞聚集体的形状(图7I)。结果，发现，在步骤1中未经过预先处理并且在步骤2不添加SAG的条件下，细胞聚集体塌陷，并且没有形成神经组织(图7A，E)。另一方面，发现，在步骤1中涉及用TGFβR抑制剂(SB431542)、BMPR抑制剂(LDN193189)或Shh信号转导途径激活物质预先处理并且在步骤2中添加Shh信号转导途径激活物质的条件下，形成细胞聚集体，并且能够有效地形成神经组织(图7B-D，F-I)。
此外，在悬浮培养开始后第23天的由上述经历用TGFβR抑制剂(SB431542)或BMPR抑制剂(LDN193189)进行预先处理的处理的iPS细胞作为起始材料产生的上述细胞聚集体用4％多聚甲醛规定，以制备冷冻切片。将这些冷冻切片针对巢蛋白(抗-巢蛋白抗体，NihonMillipore K.K.，小鼠)(其是一种神经组织标记(神经前体细胞))、TuJ1(抗-βIII-微管蛋白抗体，Promega KK，小鼠)(其是一种神经组织标记(神经元))或PSA-NCAM(抗-PSA-NCAM抗体，Millipore K.K.，小鼠IgM)(其是一种神经组织标记)免疫染色。在倒置荧光显微镜下观察这些免疫染色的切片。结果，发现，在用TGFβR抑制剂(SB431542)或BMPR抑制剂(LDN193189)预先处理的条件下制备的细胞聚集体中，总细胞中巢蛋白-阳性细胞的比例为约20％，总细胞中TuJ1-阳性细胞的比例为约70％，并且PSA-NCAM-阳性细胞的比例为约70％(图8A-F)。此外，由连续切片的分析能够证实在亮视野图像中通过形态观察可能鉴定为神经组织的区域是巢蛋白-阳性的、TuJ1-阳性的和PSA-NCAM-阳性的(图8A-F)。
从这些结果，发现在涉及在步骤1中使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质或Shh信号转导途径激活物质预先处理，并且进一步涉及在步骤2中添加Shh信号转导途径激活物质的条件下，甚至在步骤3中添加或不添加BMP信号转导途径激活物质时，能够由无饲养细胞的人iPS细胞有效地产生神经组织。
实施例9：在步骤1中使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质，在步骤2中使用Shh信 号转导途径激活物质和在步骤3中使用BMP信号转导途径激活物质作为分化诱导因子，由无 饲养细胞的人iPS细胞形成视网膜组织的实施例
在将使用StemFit培养基作为无饲养细胞培养基的人iPS细胞用作起始材料、在步骤1中使用TGFβR抑制物质(SB431542)或BMPR抑制物质(LDN193189)、在步骤2中使用Shh信号转导途径激活物质和在步骤3中添加或不添加BMP信号转导途径激活物质的条件下，按照实施例8所述的方法制备细胞聚集体。在开始悬浮培养后第23天，在全部的在所有这些条件下形成的聚集体中都形成了神经组织。将上述细胞聚集体用4％多聚甲醛固定，以制备冷冻切片。将这些冷冻的切片针对Chx10(抗-Chx10抗体，Exalpha，绵羊)(其是一种视网膜组织标记)或Rx(抗-Rx抗体，Takara，豚鼠)(其是一种视网膜组织标记)免疫染色。在荧光显微镜下观察这些免疫染色的切片。结果，发现，在涉及在步骤1中用TGFβR抑制剂(SB431542)或BMPR抑制剂(LDN193189)预先处理、在步骤2中添加Shh信号转导途径激活物质和在步骤3中不添加BMP4的条件下产生的细胞聚集体中，总细胞中Rx-阳性细胞的比例低于10％(Rx-强阳性(对应视网膜)低于3％，Rx-弱阳性(对应除视网膜之外的神经组织)低于7％)，并且Chx10-阳性细胞的比例也低于3％(图9A，C，E，G)。另一方面，发现，在涉及在步骤1中用TGFβR抑制剂(SB431542)预先处理、在步骤2中添加Shh信号转导途径激活物质和在步骤3中添加BMP4的条件下产生的细胞聚集体中，总细胞中Rx-阳性细胞的比例为80％以上，并且总细胞中Chx10-阳性细胞的比例也为70％以上(图9B，F)。此外，发现，在涉及在步骤1中用BMPR抑制剂(LDN193189)预先处理、在步骤2中添加Shh信号转导途径激活物质和在步骤3中添加BMP4的条件下产生的细胞聚集体中，总细胞中Rx-阳性细胞的比例为50％以上，总细胞中Chx10-阳性细胞的比例也为40％以上(图9D，H)。此外，从连续切片分析发现在具有高比例(不低于95％)的Chx10-阳性细胞的神经组织中，Rx也是强阳性的(图9B，D，F，H)。
从这些结果，发现通过在步骤1中用TGFβ家族信号转导途径抑制物质预先处理、在步骤2中添加Shh信号转导途径激活物质和在步骤3的悬浮培养中添加BMP信号转导途径激活物质作为分化诱导物质，能够由无饲养细胞的人iPS细胞有效地产生视网膜组织。
实施例10：在步骤1中使用在作为无饲养细胞培养基的Essential 8培养基中的人 iPS细胞作为起始材料和使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质，形成细胞聚集体的实施例
按照“Scientific Reports，4，3594(2014)”所述的方法，使人iPS细胞(1231A3株，获自京都大学(Kyoto University))进行无饲养细胞的培养。关于无饲养细胞的培养基，使用Essential 8培养基(由Life Technologies生产，Nature Methods，8，424-429(2011))，并且关于无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511-E8(由Nippi，Inc.制造)。
关于具体的维持培养操作，首先将亚汇合的(约60％的培养面积被细胞覆盖)人iPS细胞(1231A3株)用PBS洗涤，并且使用TrypLE Select(由Life Technologies制造)分散成单个细胞。然后，将上述分散成单个细胞的人iPS细胞接种在用层粘连蛋白511-E8包被的塑料培养皿(由Iwaki制造)中，并且在存在Y27632(10μM，ROCK抑制物质)的条件下，在Essential 8培养基中进行无饲养细胞的培养。当使用6孔平板(由Iwaki制造，培养面积为9.4cm2)作为前述塑料培养皿时，将关于上述分散成单个细胞的人iPS细胞的铺板细胞数目调整为6x103。接种后一天，将培养基更换为不含Y27632的Essential 8培养基。然后，培养细胞直到接种后6天，即，亚汇合(60％的培养面积被细胞覆盖)。
关于预先处理操作，首先将亚汇合的人iPS细胞(1231A3株)用PBS洗涤，并且通过使用TrypLE Select(由Life Technologies制造)分散成单个细胞。然后，将上述分散成单个细胞的人iPS细胞接种在用层粘连蛋白511-E8包被的塑料培养皿(由Iwaki制造)中，并且在存在Y27632(10μM，ROCK途径抑制物质)的条件下在Essential 8培养基中进行无饲养细胞的培养。当使用6-孔平板(由Iwaki制造，对于细胞培养，培养面积为9.4cm2)作为上述塑料培养皿时，将上述分散为单个细胞的人iPS细胞的铺板细胞数目设置为6x103。接种后一天，将培养基更换为不含Y27632的Essential 8培养基。然后，培养细胞直到接种后5天，即，亚汇合前一天(50％的培养面积被细胞覆盖)。使上述在亚汇合前一天的无饲养细胞培养的人iPS细胞在存在SB431542(TGFβR抑制剂，5μM)、LDN193189(BMPR抑制剂，100nM)或TGFβR与BMPR双重抑制剂(5μM SB431542，和100nM LDN193189)(步骤1：预先处理)的条件下，或在不存在其的条件下(步骤1：无预先处理，对照)进行无饲养细胞的培养持续1天。在倒置显微镜(KEYENCE)下进行培养的细胞的亮视野观察。结果，发现在无饲养细胞培养过程中用TGFβ家族信号转导途径抑制剂处理没有在很大程度上影响人iPS细胞的形态。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)，将上述人iPS细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.2×104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)中的100μl无血清培养基中，并且在37℃，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。
在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，将细胞在下述包括条件1和条件2的2种条件下培养。在条件1(+SAG)下，在悬浮培养开始时向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度20μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)(图10C，F，H，J，L，N“+SAG”)。在条件2(-SAG)下，在悬浮培养开始时向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度20μM)，并且不添加SAG(图10A，B，D，E，G，I，K，M“-”)。到悬浮培养开始后第2天，在两种条件下都形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。在悬浮培养开始后第3天，加入不含Y27632和SAG的无血清培养基(50μl)。
在悬浮培养开始后第6天，将培养基更换为不含Y27632和SAG但是包含或不包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基，以使培养基包含终浓度为1.5nM的外源性人重组BMP4(图10D-F)，或培养基不包含BMP信号转导途径激活物质(图10K-N)。在悬浮培养开始后第6天或以后，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基，每2-4天更换一次。
在开始悬浮培养后第7天，将这样制备的细胞在倒置显微镜(KEYENCE)下进行亮视野观察(图10)。结果，发现，在步骤1中未经预先处理并且在步骤2中不添加SAG的条件下，细胞聚集体塌陷，并且没有形成神经组织(图10A)。发现在步骤1中进行预先处理的条件下，甚至当在步骤2中不添加Shh信号转导途径激活物质或在步骤2中添加Shh信号转导途径激活物质时，能够形成细胞聚集体(图10)。即，发现通过在步骤1中用TGFβ家族信号转导途径抑制物质进行预先处理的处理，甚至在使用Essential 8培养基作为无饲养细胞的培养基时，由人iPS细胞形成的细胞聚集体的形状变得良好。
实施例11：使用在作为无饲养细胞的培养基的Essential 8培养基中的人iPS细胞 作为起始材料、在步骤1中使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和在步骤2中使用Shh信号 转导途径激活物质形成神经组织的实施例
通过使用Essential 8培养基作为无饲养细胞培养的人iPS细胞作为起始材料、在步骤1中使用TGFβR抑制物质(SB431542)并且在步骤2中使用Shh信号转导途径激活物质，按照实施例10所述方法制备细胞聚集体。将在开始悬浮培养后第18天的细胞聚集体用4％多聚甲醛固定，以制备冷冻切片。将这些冷冻切片针对巢蛋白(抗-巢蛋白抗体，NihonMillipore K.K.，小鼠)(其是一种神经组织标记(神经前体细胞))、TuJl(抗-βIII-微管蛋白抗体，Promega KK，小鼠)(其是一种神经组织标记(神经元))或PSA-NCAM(抗-PSA-NCAM抗体，Millipore K.K.，小鼠IgM)(其是一种神经组织标记)免疫染色，并且在荧光显微镜下观察。结果，发现在上述细胞聚集体中，总细胞中巢蛋白-阳性细胞的比例为约30％，总细胞中TuJ1-阳性细胞的比例为约70％，并且PSA-NCAM-阳性细胞的比例为约70％(图11)。此外，由连续切片分析能够证实，在亮视野图像中通过形态观察能够鉴定为神经组织的区域是巢蛋白-阳性的、TuJ1-阳性的且PSA-NCAM-阳性的(图11)。即，发现在涉及在步骤1中用TGFβR抑制物质预先处理并且在步骤2中添加SAG的条件下产生的细胞聚集体中，能够有效地形成神经组织。
实施例12：使用在作为无饲养细胞培养的Essential 8培养基中的人iPS细胞作为 起始材料、在步骤1中使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质、在步骤2中使用Shh信号转导途 径激活物质并且在步骤3中使用BMP信号转导途径激活物质，形成视网膜组织的实施例
通过使用Essential 8培养基作为无饲养细胞培养的人iPS细胞作为起始材料，在步骤1中使用TGFβR抑制物质(SB431542)、在步骤2在使用Shh信号转导途径激活物质并且在步骤3中添加或不添加BMP信号转导途径激活物质的条件下，按照实施例10所述的方法，制备细胞聚集体。将在开始悬浮培养后第18天的细胞聚集体分别用4％多聚甲醛固定，以制备冷冻切片。将这些冷冻切片针对Chx10(抗-Chx10抗体，Exalpha，绵羊)(其是一种视网膜组织标记)或Rx(抗-Rx抗体，Takara，豚鼠)(其是一种视网膜组织标记)免疫染色，并且在荧光显微镜下观察。结果，发现在步骤1中用TGFβR抑制剂(SB431542)预先处理、在步骤2中添加Shh信号转导途径激活物质并且在步骤3中不添加BMP4的条件下制备的细胞聚集体中，总细胞中Rx-阳性细胞的比例低于10％(Rx-强阳性(对应视网膜)低于3％，Rx-弱阳性(对应视网膜之外的神经组织)低于7％)，并且Chx10-阳性细胞的比例也低于3％(图12)。另一方面，发现，在步骤1中用TGFβR抑制剂(SB431542)预先处理、在步骤2中添加Shh信号转导途径激活物质并且在步骤3中添加BMP4的条件下制备的细胞聚集体中，总细胞中Rx-强阳性细胞的比例为约30％以上，并且总细胞中Chx10-阳性细胞的比例也为约20％以上(图12)。此外，从连续切片分析发现，在具有高比例(不低于95％)的Chx10-阳性细胞的神经组织中，Rx也是强阳性的。从这些结果，发现在使用Essential 8培养基无饲养细胞培养的人iPS细胞作为起始材料、在步骤1中使用TGFβR抑制物质、在步骤2中使用Shh信号转导途径激活物质和在步骤3中使用BMP信号转导途径激活物质的条件下，能够产生视网膜组织。
实施例13：使用在作为无饲养细胞的培养基的StemFit中的人iPS细胞作为起始材 料，在步骤1中使用TGFβ信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径激活物质并且在步骤3 中使用BMP信号转导途径激活物质，形成视网膜组织的实施例
按照实施例1所述的方法，使人iPS细胞(1231A3株)在StemFit培养基中进行无饲养细胞培养直到亚汇合前一天。使亚汇合前一天的人iPS细胞在存在SB431542(TGFβR抑制剂，5μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)的条件下进行无饲养细胞的培养持续一天(步骤1，预先处理：TGFβRi+SAG处理)。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)，将上述人iPS细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.2×104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)中的100μl无血清培养基中，并且在37℃，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基，使用作为补充了10％KSR和450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中加入Y27632(终浓度为20μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)。在开始悬浮培养后一天至第2天形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)，之后在步骤3中进行在下述条件1-3下的培养。
条件1：在开始悬浮培养后第3天，添加不含Y27632、SAG和BMP信号转导途径激活物质的无血清培养基(50μl)。在开始悬浮培养后第6天或以后，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、SAG和BMP信号转导途径激活物质的无血清培养基(弃掉一半体积的培养基，即75μl，并且添加75μl上述不含Y27632、SAG和BMP激活物质的无血清培养基)，每3天更换一次。
条件2：在开始悬浮培养后第3天，添加不含Y27632和SAG但是包含终浓度为1.5nM的人重组BMP4的无血清培养基。在开始悬浮培养后第6天或以后，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、SAG和BMP激活物质的无血清培养基(弃掉一半体积的培养基，即75μl，并且添加75μl上述不含Y27632、SAG和BMP激活物质的无血清培养基)，每3天更换一次。
条件3：在开始悬浮培养后第3天，添加不含Y27632、SAG和BMP信号转导途径激活物质的无血清培养基(50μl)。在开始悬浮培养后第6天，添加不含Y27632和SAG但是包含终浓度为1.5nM的人重组BMP4的无血清培养基。在开始悬浮培养后第6天或以后，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、SAG和BMP激活物质的无血清培养基(弃掉一半体积的培养基，即75μl，并且添加75μl上述不含Y27632、SAG和BMP激活物质的无血清培养基)。
当在上述条件1-3下培养时，在每一种条件下，在开始悬浮培养后第26天形成细胞聚集体，并且形成神经组织。将在开始悬浮培养后第26天的上述细胞聚集体分别用4％多聚-甲醛固定，以制备冷冻切片。将这些冷冻切片针对Chx10(抗-Chx10抗体，Exalpha，绵羊)(其是一种视网膜组织标记)免疫染色。结果，发现在条件1的细胞聚集体中，总细胞中Chx10-阳性细胞的比例低于3％(图13，左图)。另一方面，在条件2和条件3的细胞聚集体中，总细胞中Chx10-阳性细胞的比例不低于60％(图13，中图，右图)。从这些结果，发现在步骤1中使用TGFβR抑制物质(SB431542)和Shh信号转导途径激活物质、在步骤2中使用Shh信号转导途径激活物质并且在步骤3使用BMP信号转导途径激活物质的条件下，能够产生视网膜组织。
实施例14：在步骤2中铺板细胞数目的考虑(在作为无饲养细胞的培养基的 StemFit中的人iPS细胞用作起始材料，在步骤1中使用TGFβ信号转导途径抑制物质和Shh信 号转导途径激活物质)
按照实施例1所述的方法，使人iPS细胞(1231A3株)在StemFit培养基中进行无饲养细胞培养直到亚汇合前一天。将在亚汇合前一天的人iPS细胞在存在SB431542(TGFβR抑制剂，5μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)的条件下进行无饲养细胞的培养持续一天(步骤1，预先处理：TGFβRi+SAG处理)。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)，将上述人iPS细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以下述4种条件：即0.4x104，0.8x104，1.2x104，或1.6x104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)中的100μl无血清培养基中，并且在37如，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度20μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)。在开始悬浮培养后一天至第2天形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。然后，在步骤3中，在开始悬浮培养后第3天，添加不含Y27632和SAG但是包含终浓度为1.5nM的人重组BMP4的无血清培养基。在开始悬浮培养后第6天或以后，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、SAG和BMP激活物质的无血清培养基，每2-4天一次。
在每种条件下在开始悬浮培养后第18天形成细胞聚集体，并且形成神经组织(图14，上图)。将在开始悬浮培养后第18天形成的上述细胞聚集体分别用4％多聚甲醛固定，以制备冷冻切片。将这些冷冻切片针对Chx10(抗-Chx10抗体，Exalpha，绵羊)(其是一种视网膜组织标记)或Rx(抗-Rx抗体，Takara，豚鼠)(其是一种视网膜组织标记)免疫染色，并且在荧光显微镜下观察。结果，发现以任意铺板细胞数目(0.4x104，0.8x104，1.2x104，或1.6x104个细胞)，总细胞中Chx10-阳性细胞的比例不低于20％(图14，中图，右图)。特别地，以0.8x104或1.2x104个细胞的铺板细胞数目的条件表现出特别高比例的Chx10-阳性细胞。Rx-阳性细胞的比例的结果与Chx10的结果相同。从这些结果，发现在步骤2中在0.4x104-1.6x104个细胞的铺板细胞数目条件下能够产生视网膜组织。
实施例15：通过在步骤1中使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质Lefty和在步骤2 中使用Shh信号转导途径激活物质SAG由无饲养细胞的人iPS细胞形成神经组织的实施例
按照“Scientific Reports，4，3594(2014)”中所述的方法，使人iPS细胞(1231A3株，获自京都大学(Kyoto University))进行无饲养细胞的培养。作为无饲养细胞的培养基，使用StemFit培养基(AK03，由Ajinomoto Co.，Inc.制造)，并且作为无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511-E8(由Nippi，Inc.制造)。
按照实施例1所述的方法，使人iPS细胞(1231A3株)在StemFit培养基中进行无饲养细胞的培养直至亚汇合前一天。然后，使细胞在下述3种条件下进行无饲养细胞的培养持续一天。
·条件1：人重组Lefty-A(Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质，由R&D制造，Lefty-A C-端，20μg/m1)
·条件2：人重组Lefty-A(Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质，由R&D制造，Lefty-A C-端，20μg/ml)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)
·条件3：不含外源性TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径激活物质(未经预先处理)
通过使用TrypLE Select(由Life Technologies生产)，将在上述条件1-3下这样制备的人iPS细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.2x104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)中的100μl无血清培养基中，并且在37℃，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。
在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，将细胞在包括条件1和条件2的下述2种条件下培养。作为条件1(+SAG)，在开始悬浮培养时，向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度20μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)。作为条件2(-SAG)，在开始悬浮培养时，向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度20μM)并且不添加SAG。到开始悬浮培养后第2天，在两种条件下都形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。在开始悬浮培养后第3天，添加不含Y27632、SAG但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基(50μl)，以使外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/ml)。在开始悬浮培养后第6天，将一半量的培养基更换为不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基。然后，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基，每2-4天更换一次。
在开始悬浮培养后第18天，将这样制备的细胞在倒置显微镜(KEYENCE)下进行亮视野观察(图15)。结果，发现在步骤1中未经预先处理并且在步骤2中不添加SAG的条件下，细胞聚集体塌陷，并且没有形成神经组织(图15，A)。另一方面，发现在涉及在步骤1中用Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质或Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径激活物质预先处理并且在步骤2中添加或不添加Shh信号转导途径激活物质的条件下，形成细胞聚集体，并且能够有效地形成神经组织(图15，B，C，D)。
从这些结果，发现甚至在涉及用作为TGFβ家族信号转导途径抑制物质的Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质Lefty预先处理的条件下，由无饲养细胞的人iPS细胞形成高质量的聚集体，并且神经上皮的生成效率提高。
实施例16：通过在步骤1中使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质A83-01并且在步 骤2中使用Shh信号转导途径激活物质SAG，由无饲养细胞的人iPS细胞形成神经组织和视网 膜组织的实施例
按照“Scientific Reports，4，3594(2014)”所述的方法，使人iPS细胞(1231A3株，获自京都大学(Kyoto University))进行无饲养细胞的培养。作为无饲养细胞的培养基，使用StemFit培养基(AK03，由Ajinomoto Co.，Inc.制造)，作为无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511-E8(由Nippi，Inc.制造)。
使按照实施例15所述的方法制备的在亚汇合前一天的人iPS细胞在存在A83-01(由Wako制造，TGFβR抑制剂，0.5μM)的条件下(预先处理的处理)或不存在其的条件下(步骤1：未经预先处理)进行无饲养细胞的培养持续一天。
通过使用TrypLE Select(由Life Technologies制造)，将上述人iPS细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.0x104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)中的100μl无血清培养基中，并且在37如，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。
在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，将细胞在包括条件1和条件2的下述2种条件下培养。作为条件1(+SAG)，在悬浮培养开始时，向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度为20μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，终浓度为30nM)。作为条件2(-SAG)，在悬浮培养开始时，向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度为20μM)并且不添加SAG。到开始悬浮培养后第2天，在两种条件下都形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。在开始悬浮培养后第3天，添加不含Y27632和SAG但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基(50μl)，以使外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/ml)。在开始悬浮培养后第6天，将一半量的培养基更换为不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基。然后，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基，每2-4天更换一次。
在开始悬浮培养后第20天，将这样制备的细胞在倒置显微镜(KEYENCE)下进行亮视野观察(图16，A-B)。结果，发现在步骤1中未经预先处理并且在步骤2中不添加SAG的条件下，细胞聚集体塌陷，并且没有形成神经组织(图16，A)。另一方面，发现在涉及在步骤1中用A83-01预先处理和在步骤2中添加SAG的条件下，形成细胞聚集体，并且能够有效地形成神经组织(图16，B)。
将在开始悬浮培养后第20天的上述细胞聚集体用4％多聚甲醛固定，以制备冷冻切片。将这些冷冻切片针对Chx10(抗-Chx10抗体，Exalpha，绵羊)(其是一种视网膜组织标记)免疫染色，并且在荧光显微镜下观察。结果，发现当步骤1涉及用A83-01预先处理并且步骤2涉及添加SAG时，总细胞中Chx10-阳性细胞的比例为约20％(图16，C)。
从这些结果，发现在涉及在步骤1中用作为TGFβ家族信号转导途径抑制物质的TGFβR抑制剂A83-01预先处理并且在步骤2中添加Shh信号转导途径激活物质的条件下，能够产生视网膜组织。
实施例17：通过在步骤1中使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质A83-01或TGFβ家 族信号转导途径抑制物质(A83-01)与Shh信号转导途径激活物质(SAG，Purmorphamine，或 人重组Shh)的组合，并且在步骤2中使用Shh信号转导途径激活物质，由无饲养细胞的人iPS 细胞形成神经组织的实施例
按照“Scientific Reports，4，3594(2014)”所述的方法，使人iPS细胞(1231A3株，获自京都大学(Kyoto University))进行无饲养细胞的培养。作为无饲养细胞的培养基，使用StemFit培养基(AK03，由Ajinomoto Co.，Inc.制造)，并且作为无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511-E8(由Nippi，Inc.制造)。
将按照实施例15所述的方法制备的在亚汇合前一天的人iPS细胞在下述6种条件下进行无饲养细胞的培养，持续一天。
·条件1：A83-01(由Wako制造，TGFβR抑制剂，0.5μM)
·条件2：A83-01(由Wako制造，TGFβR抑制剂，0.5μM)和fAG(由Enzo制造，Shh信号转导途径激活物质，300nM)
·条件3：A83-01(由Wako制造，TGFβR抑制剂，0.5μM)和Purmorphamine(由Wako制造，Shh信号转导途径激活物质，0.2μM)
·条件4：A83-01(由Wako制造，TGFβR抑制剂，0.5μM)和人重组Shh(由R&D制造，Shh信号转导途径激活物质，50ng/ml)
·条件5：A83-01(由Wako制造，TGFβR抑制剂0.5μM)和人重组Shh(由R&D制造，Shh信号转导途径激活物质，300ng/ml)
·条件6：不含外源性TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径激活物质(未经预先处理)
通过使用TrypLE Select(由Life Technologies制造)，将上述人iPS细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.0x104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)中的100μl无血清培养基中，并且在37如，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。
在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，将细胞在包括条件(A)和条件(B)的下述两种条件下培养。作为条件(A)(+SAG)，在悬浮培养开始时，向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度为20μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，30nM)。作为条件(B)(-SAG)，在悬浮培养开始时，向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度为20μM)，并且不添加SAG。
到开始悬浮培养后第2天，在两种条件下都形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。在开始悬浮培养后第3天，添加不含Y27632、SAG、Purmorphamine和人重组Shh但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基(50μl)，以使外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/ml)。在开始悬浮培养后第6天，将一半量的培养基更换为不含Y27632、SAG、Purmorphamine、人重组Shh和人重组BMP4的无血清培养基。然后，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、SAG、Purmorphamine、人重组Shh和人重组BMP4的无血清培养基，每2-4天更换一次。
在开始悬浮培养后第20天，将这样制备的细胞在倒置显微镜(KEYENCE)下进行亮视野观察(图17)。结果，发现在上述条件6下，即在步骤1中未经预先处理并且在步骤2中不添加SAG的条件，细胞聚集体塌陷，并且没有形成神经组织(图17，A)。另一方面，发现在上述条件1-5下，即涉及在步骤1中添加A83-01和Shh信号转导途径激活物质(SAG，PMA，人重组Shh 50ng/ml，人重组Shh 300ng/ml)并且在步骤2中添加SAG(条件(A)(+SAG))的条件，形成细胞聚集体，并且能够有效地形成神经组织(图17，B-F)。
从这些结果，发现在涉及在步骤1中用TGFβ家族信号转导途径抑制物质(A83-01)或TGFβ家族信号转导途径抑制物质(A83-01)与Shh信号转导途径激活物质(SAG、PMA、人重组Shh中任一种)预先处理的条件下，能够有效地由无饲养细胞培养的人iPS细胞产生神经组织。
实施例18：通过在步骤1中使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途 径激活物质并且在步骤2中使用Shh信号转导途径激活物质(SAG、Purmorphamine、或人重组 Shh中任一种)由无饲养细胞的人iPS细胞形成视网膜组织的实施例
按照“Scientific Reports，4，3594(2014)”所述的方法，使人iPS细胞(1231A3株，获自京都大学(Kyoto University))进行无饲养细胞的培养。作为无饲养细胞的培养基，使用StemFit培养基(AK03，由Ajinomoto Co.，Inc.制造)，并且作为无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511-E8(由Nippi，Inc.制造)。
将按照实施例15所述的方法制备的在业汇合前一天的人iPS细胞在存在A83-01(由Wako制造，TGFβR抑制剂0.5μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)的条件下(预先处理的处理)或在不存在其的条件下(步骤1：无预先处理)进行无饲养细胞的培养，持续一天。
通过使用TrypLE Select(由Life Technologies制造)，将上述人iPS细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.0x104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)中的100μl无血清培养基中，并且在37℃，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。
使用步骤1中得到的细胞，在下述条件下如在步骤2中起始悬浮培养。在任意条件下，使用上述补充了Y27632(终浓度为20μM)的无血清培养基。
·条件1：添加SAG(由Enzo制造，Shh信号转导途径激活物质，30nM)。
·条件2：添加Purmorphamine(由Wako制造，Shh信号转导途径激活物质，0.2μM)。
·条件3：添加人重组Shh(由R&D制造，Shh信号转导途径激活物质，300ng/ml)。
·条件4：在开始悬浮培养时不添加外源性Shh信号转导途径激活物质。
到开始悬浮培养后第2天，在任一条件下都形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。在开始悬浮培养后第3天，添加不含Y27632、SAG、Purmorphamine和人重组Shh但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基(50μl)，以使外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/ml)。在开始悬浮培养后第6天，将一半量的培养基更换为不含Y27632、SAG、Purmorphamine、人重组Shh和人重组BMP4的无血清培养基。然后，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基，每2-4天更换一次。
在开始悬浮培养后第20天，将这样制备的细胞在倒置显微镜(KEYENCE)下进行亮视野观察(图18，A-E)。结果，发现在步骤1中未经预先处理并且在步骤2中不添加Shh信号转导途径激活物质的条件下(上述条件4)，细胞聚集体塌陷，并且没有形成神经组织(图18，A)。另一方面，发现在涉及在步骤1中用A83-01和SAG预先处理并且在步骤2中不添加外源性Shh信号转导途径激活物质或添加SAG、Purmorphamine(PMA)或人重组Shh中任一种作为Shh信号转导途径激活物质的条件下，形成细胞聚集体，并且有效地形成神经组织(图18，B-E)。
从这些结果，发现在涉及在步骤1中用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径激活物质预先处理并且在开始悬浮培养时添加SAG、Purmorphamine或人重组Shh中任一种作为Shh信号转导途径激活物质的条件下，能够有效地从无饲养细胞的人iPS细胞产生神经组织。
将在开始悬浮培养后第20天的细胞聚集体用4％多聚甲醛固定以制备冷冻切片。将这些冷冻的切片针对Chx10(抗-Chx10抗体，Exalpha，绵羊)(其是一种视网膜组织标记)免疫染色，并且在荧光显微镜下观察。结果，发现当步骤1涉及用A83-01和SAG预先处理并且步骤2涉及不添加外源性Shh信号转导途径激活物质时，总细胞中Chx10-阳性细胞的比例为约40％(图18，F)。另一方面，发现在涉及在步骤1用A83-01和SAG预先处理并且在开始悬浮培养时添加SAG、Purmorphamine或人重组Shh中任一种作为Shh信号转导途径激活物质的条件下，总细胞中Chx10-阳性细胞的比例为约90％(图18，G-I)。
从这些结果，发现在涉及在步骤1中用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径激活物质预先处理并且在步骤2中添加SAG、Purmorphamine或人重组Shh中的任一种作为Shh信号转导途径激活物质的条件下，能够有效地由无饲养细胞的人iPS细胞产生视网膜组织。
实施例19：通过在步骤1中使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质SB431542和Shh信 号转导途径激活物质Purmorphamine并且在步骤2中使用Shh信号转导途径激活物质 Purmorphamine，由无饲养细胞的人iPS细胞形成视网膜组织的实施例
按照“Scientific Reports，4，3594(2014)”所述的方法，使人iPS细胞(1231A3株，获自京都大学(Kyoto University))进行无饲养细胞的培养。作为无饲养细胞的培养基，使用StemFit培养基(AK03，由Ajinomoto Co.，Inc.制造)，并且作为无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511-E8(由Nippi，Inc.制造)。
将按照实施例15所述的方法制备的在亚汇合前一天的人iPS细胞在存在SB431542(TGFβR抑制剂，5μM)和Purmorphamine(PMA；Shh信号转导途径激活物质，0.02μM或0.2μM)的条件下进行无饲养细胞的培养，持续一天。
通过使用TrypLE Select(由Life Technologies制造)，将上述人iPS细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.0x104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)中的100μl无血清培养基中，并且在37℃，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。
在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中添加Y27632(20μM)和Purmorphamine(由Wako制造，Shh信号转导途径激活物质，0.2μM或2μM)(图19)。到开始悬浮培养后第2天，形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。在开始悬浮培养后第3天，添加不含Y27632和Purmorphamine但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基(50μl)，以使外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/ml)。在悬浮培养开始后第6天，将一半量的培养基更换为不含Y27632、Purmorphamine和人重组BMP4的无血清培养基。然后，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、Purmorphamine和人重组BMP4的无血清培养基，每2-4天更换一次。
在开始悬浮培养后第17天，将这样制备的细胞在倒置显微镜(KEYENCE)下进行亮视野观察(图19，A-D)。结果，发现在涉及在步骤1中用SB431542和Purmorphamine(0.02μM或0.2μM)预先处理并且在步骤2中添加Purmorphamine(0.2μM或2μM)的条件下，在任意Purmorphamine浓度都形成细胞聚集体，并且能够有效地形成神经组织(图19，A-D)。
将在开始悬浮培养后第17天的细胞聚集体用4％多聚甲醛固定，从而制备冷冻切片。将这些冷冻切片针对Chx10(抗-Chx10抗体，Exalpha，绵羊)(其是一种视网膜组织标记)免疫染色。在倒置荧光显微镜下观察这些冷冻切片。结果，发现在涉及在步骤1中用SB431542和Purmorphamine(0.02μM或0.2μM)预先处理并且在步骤2中添加Purmorphamine(0.2μM或2μM)的条件下，在任意Purmorphamine浓度，总细胞中Chx10-阳性细胞的比例都为约60％(图19，E-H)。
从这些结果，发现在涉及在步骤1中用TGFβ家族信号转导途径抑制物质SB431542和Shh信号转导途径激活物质Purmorphamine预先处理并且在开始悬浮培养时添加Shh信号转导途径激活物质(Purmorphamine)的条件下，能够有效地由无饲养细胞的人iPS细胞产生视网膜组织。
实施例20：通过在步骤1中用Shh信号转导途径激活物质或用TGFβ家族信号转导途 径抑制物质与Shh信号转导途径激活物质的组合预先处理1、2或3天，由无饲养细胞的人iPS 细胞形成神经组织的实施例
按照“Scientific Reports，4，3594(2014)”所述的方法，使人iPS细胞(1231A3株，获自京都大学(Kyoto University))进行无饲养细胞的培养。作为无饲养细胞的培养基，使用StemFit培养基(AK03，由Ajinomoto Co.，Inc.制造)，并且作为无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511-E8(由Nippi，Inc.制造)。
将上述人iPS细胞在下述6种条件下进行无饲养细胞的培养。
·条件1：SAG(由Enzo制造，Shh信号转导途径激活物质，300nM)持续48小时
·条件2：SAG(由Enzo制造，Shh信号转导途径激活物质，300nM)持续72小时
·条件3：A83-01(由Wako制造，TGFβR抑制剂，0.5μM)和SAG(由Enzo制造，Shh信号转导途径激活物质，300nM)持续24小时
·条件4：A83-01(由Wako制造，TGFβR 抑制剂，0.5μM)和SAG(由Enzo制造，Shh信号转导途径激活物质，300nM)持续48小时
·条件5：A83-01(由Wako制造，TGFβR抑制剂，0.5μM)和SAG(由Enzo制造，Shh信号转导途径激活物质，300nM)持续72小时
·条件6：不含外源性TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径激活物质(无预先处理)
通过使用TrypLE Select(由Life Technologies制造)，将上述人iPS细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.0x104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)中的100μl无血清培养基中，并且在37℃，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。
在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，将细胞在包括条件(A)和条件(B)的下述两个条件下培养。作为条件(A)，在悬浮培养开始时，向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度为20μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，30nM)。作为条件(B)，在悬浮培养开始时，向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度为20μM)，并且不添加SAG。到开始悬浮培养后第2天，在两种条件下都形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。在开始悬浮培养后第3天，添加不含Y27632和SAG但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基(50μl)，以使外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/m1)。在悬浮培养开始后第6天，将一半量的培养基更换为不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基。然后，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基，每2-4天更换一次。
在开始悬浮培养后第17天，将这样制备的细胞在倒置显微镜(KEYENCE)下进行亮视野观察(图20，A-J)。结果，发现在步骤1中未经预先处理并且在步骤2中不添加SAG的条件下，细胞聚集体塌陷，并且没有形成神经组织(图20，A)。另一方面，发现当在步骤1用SAG进行预先处理48或72小时并且在步骤2添加SAG(条件(A))或不添加SAG(条件(B))时，形成细胞聚集体，并且能够有效地形成神经组织(图20，B-D)。另外，发现当在步骤1用A83-01和SAG进行预先处理24、48或72小时并且在步骤2中添加SAG(条件(A))或不添加SAG(条件(B))时，形成细胞聚集体。并且能够有效地形成神经组织(图20，E-J)。
从这些结果，发现在涉及在步骤1中用Shh信号转导途径激活物质预先处理48或72小时的条件下和在涉及在步骤1中用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径激活物质预先处理24、48或72小时的条件下，能够有效地由无饲养细胞的人iPS细胞产生神经组织。
实施例21：通过在步骤1中用Shh信号转导途径激活物质预先处理24、48、72、96、 120或144小时并且在最后24小时内共同存在TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转 导途径激活物质的条件下，由无饲养细胞的人iPS细胞形成神经组织的实施例
按照“Scientific Reports，4，3594(2014)”所述的方法，使人iPS细胞(1231A3株，获自京都大学(Kyoto University))进行无饲养细胞的培养。作为无饲养细胞的培养基，使用StemFit培养基(AK03，由Ajinomoto Co.，Inc.制造)，并且作为无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511-E8(由Nippi，Inc.制造)。
在存在SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)的条件下(预先处理的处理)开始人iPS细胞的无饲养细胞培养。在SAG存在下的培养持续24，48，72，96，120或144小时，并且对于最后24小时，培养在A83-01(由Wako制造，TGFβR抑制剂，0.5μM)和SAG的共同存在下进行。
通过使用TrypLE Select(由Life Technologies制造)，将上述人iPS细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.0x104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)中的100μl无血清培养基中，并且在37如，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。
在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，将细胞在包括条件(A)和条件(B)的下述两种条件下培养。作为条件(A)，在悬浮培养开始时，向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度为20μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，30nM)。作为条件(B)，在悬浮培养开始时，向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度20μM)，并且不添加SAG。到开始悬浮培养后第2天，在两种条件下都形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。在开始悬浮培养后第3天，添加不含Y27632和SAG的无血清培养基(50μl)。
在悬浮培养开始后第6天或以后，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基，每2-4天更换一次。
在开始悬浮培养后第16天，将这样制备的细胞在倒置显微镜(KEYENCE)下进行亮视野观察。结果，发现在涉及在步骤1中用SAG预先处理24-144小时并且在最后24小时A83-01和SAG共同存在的任意条件下，细胞聚集体生长，并且能够有效地形成神经组织(图21，A-L)。
从这些结果，发现在涉及在步骤1中用Shh信号转导途径激活物质预先处理24-144小时的时间期的任意条件下，能够有效地由无饲养细胞的人iPS细胞产生神经组织。
实施例22：通过在步骤1中用Shh信号转导途径激活物质预先处理2天，在步骤2中 使用Shh信号转导途径激活物质，并且在步骤3中一次或多肽添加BMP激活物质，由无饲养细 胞的人iPS细胞形成视网膜组织的实施例
按照“Scientific Reports，4，3594(2014)”所述的方法，使人iPS细胞(Ff-I01株，获自京都大学(Kyoto University))进行无饲养细胞的培养。作为无饲养细胞的培养基，使用StemFit培养基(AK03，由Ajinomoto Co.，Inc.制造)，并且作为无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511-E8(由Nippi，Inc.制造)。
使在业汇合前2天的人iPS细胞在存在SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)的条件下进行无饲养细胞的培养，持续2天(预先处理的处理)。
通过使用TrypLE Select(由Life Technologies制造)，将上述人iPS细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.0x104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)中的100μl无血清培养基中，并且在37如，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。
在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度20μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)(图22)。到开始悬浮培养后第2天，在任一种条件下都形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。在开始悬浮培养后第3天或以后，在包括下述条件1-3的3种条件下添加BMP4。
·条件1：(+BMP4添加一次)在悬浮培养第3天，添加不含Y27632和SAG但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基(50μl)，以使外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/ml)。在悬浮培养开始后第6天或以后，将一半量的培养基更换为不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基。
·条件2：(+BMP4添加两次)在悬浮培养第3天，添加不含Y27632、SAG但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基(50μl)，以使外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/ml)。在开始悬浮培养的第6天，弃掉50μl培养基，并且添加50μl不含Y27632和SAG但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基，以维持外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/ml)。在开始悬浮培养的第9天或以后，将一半量的培养基更换为不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基。
·条件3：(+BMP4添加三次)在悬浮培养第3天，添加不含Y27632、SAG但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基(50μl)，以使外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/ml)。在开始悬浮培养的第6天和第9天，弃掉50μl培养基，并且添加50μl不含Y27632和SAG但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基，以维持外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/ml)。在开始悬浮培养的第12天或以后，将一半量的培养基更换为不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基。
然后，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基，每2-4天更换一次。
在开始悬浮培养后第16天，将这样制备的细胞在倒置显微镜(KEYENCE)下进行亮视野观察(图22，A-C)。结果，发现在涉及添加BMP41次、2次或3次的各个条件下，细胞聚集体生长，并且能够有效地形成神经组织(图22，A-C)。
从这些结果，发现在涉及在步骤1中用Shh信号转导途径激活物质(SAG)预先处理2天并且在步骤3中添加BMP信号转导途径激活物质1次、2次或3次的条件下，能够有效地由无饲养细胞的人iPS细胞产生神经组织。
将在悬浮培养开始后第16天的细胞聚集体用4％多聚甲醛固定，以制备冷冻切片。将这些冷冻切片针对Chx10(抗-Chx10抗体，Exalpha，绵羊)(其是一种视网膜组织标记)免疫染色。将这些免疫染色的切片在荧光显微镜下观察。结果，发现在添加BMP4一次的条件下，总细胞中Chx10-阳性细胞的比例为约60％，并且在添加其2次或3次的条件下为约80％(图22，D-F)。
从这些结果，发现在涉及在步骤1中用Shh信号转导途径激活物质(SAG)预先处理2天并且在步骤3中添加BMP信号转导途径激活物质1次、2次或3次(即，维持BMP信号转导途径激活物质浓度(1.5nM)持续3天、6天、9天的条件)的条件下，能够有效地由无饲养细胞的人iPS细胞产生视网膜组织。
实施例23：通过在步骤1中用Shh信号转导途径激活物质预先处理2天，在步骤2中 使用Shh信号转导途径激活物质并且在步骤3中添加BMP4(1.5nM或5nM)，由无饲养细胞的人 iPS细胞形成视网膜组织的实施例
按照“Scientific Reports，4，3594(2014)”所述的方法，使人iPS细胞(Ff-I01株，获自京都大学(Kyoto University))进行无饲养细胞的培养。作为无饲养细胞的培养基，使用StemFit培养基(AK03，由Ajinomoto Co.，Inc.制造)，并且作为无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511-E8(由Nippi，Inc.制造)。
将在亚汇合前2天的人iPS细胞在存在SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)的条件下进行无饲养细胞的培养，持续2天(预先处理的处理)。
通过使用TrypLE Select(由Life Technologies制造)，将上述人iPS细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.0x104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)中的100μl无血清培养基中，并且在37如，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。
在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度为20μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，1000nM)。到开始悬浮培养后第2天，在任一种条件下都形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。
在开始悬浮培养后第3天，添加不含Y27632和SAG但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基(50μl)，以使外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/ml)或5nM(183ng/ml)。在开始悬浮培养后第6天，弃掉50μl培养基，并且添加50μl不含Y27632和SAG但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基，以维持外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/ml)或5nM(183ng/ml)。然后，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基，每2-4天更换一次。
在开始悬浮培养后第16天，将这样制备的细胞在倒置显微镜(KEYENCE)下进行亮视野观察。结果，发现在涉及以1.5nM和5nM添加BMP4的各个条件下，形成细胞聚集体，并且能够有效地形成神经组织(图23，A，B)。
将在开始悬浮培养后第16天的细胞聚集体用4％多聚甲醛固定以制备冷冻切片。将这些冷冻的切片针对Chx10(抗-Chx10抗体，Exalpha，绵羊)(其是一种视网膜组织标记)免疫染色，并且在荧光显微镜下观察。结果，发现在添加BMP4两次以维持终浓度为1.5nM的条件下，总细胞中Chx10-阳性细胞的比例为约70％(图23，C)。另外，在添加BMP4两次以维持终浓度为5nM的条件下，总细胞中Chx10-阳性细胞的比例为约80％(图23，D)。
从这些结果，发现在涉及在步骤1中用Shh信号转导途径激活物质预先处理2天、在步骤2中添加Shh信号转导途径激活物质并且在步骤3中以1.5nM或5nM添加BMP4两次(即，维持BMP信号转导途径激活物质浓度(1.5nM或5nM)6天的条件)的条件下，能够有效地产生视网膜组织。
实施例24：通过在步骤1中用TGFβ家族信号转导途径抑制物质(A83-01)和Shh信号 转导途径激活物质(SAG，30nM，300nM，500nM，或1000nM)预先处理一天并且在步骤2中使用 Shh信号转导途径激活物质(SAG)，由无饲养细胞的人iPS细胞形成神经组织的实施例
按照“Scientific Reports，4，3594(2014)”所述的方法，使人iPS细胞(Ff-I01株，获自京都大学(Kyoto University))进行无饲养细胞的培养。作为无饲养细胞的培养基，使用StemFit培养基(AK03，由Ajinomoto Co.，Inc.制造)，并且作为无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511-E8(由Nippi，Inc.制造)。
将在亚汇合前一天的人iPS细胞在存在A83-01(由Wako脂质，TGFβR抑制剂0.5μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，30nM，300nM，500nM，或1000nM)的条件下进行无饲养细胞的培养，持续一天(预先处理的处理)。
通过使用TrypLE Select(由Life Technologies制造)，将上述人iPS细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.0x104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)中的100μl无血清培养基中，并且在37℃，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。
在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度为20μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)。到开始悬浮培养后第2天，在任一种条件下都形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。在开始悬浮培养后第3天，添加不含Y27632和SAG但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基(50μl)，以使外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/ml)。在悬浮培养开始后第6天，弃掉50μl培养基，并且添加50μl不含Y27632和SAG但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基，以维持外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/ml)。然后，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基，每2-4天更换一次。
在开始悬浮培养后第17天，将这样制备的细胞在倒置显微镜(KEYENCE)下进行亮视野观察(图24)。结果，发现在涉及在步骤1中用A83-01和SAG(浓度范围在30-1000nM)预先处理并且在步骤2中添加SAG的条件下，形成细胞聚集体，并且能够有效地形成神经组织(图24，A-D)。
从这些结果，发现在涉及在步骤1中用TGFβ家族信号转导途径抑制物质(A83-01)和Shh信号转导途径激活物质(SAG，浓度范围为30nM-1000nM)预先处理的条件下，能够有效地由无饲养细胞的人iPS细胞产生神经组织。
实施例25：通过在步骤1中用TGFββ家族信号转导途径抑制物质(A83-01)和Shh信 号转导途径激活物质(SAG)预先处理一天，并且在步骤2中使用浓度为30nM，300nM，500nM或 1000nM的Shh信号转导途径激活物质(SAG)，由无饲养细胞的人iPS细胞形成神经组织的实 施例
按照“Scientific Reports，4，3594(2014)”所述的方法，使人iPS细胞(Ff-I01株，获自京都大学(Kyoto University))进行无饲养细胞的培养。作为无饲养细胞的培养基，使用StemFit培养基(AK03，由Ajinomoto Co.，Inc.制造)，并且作为无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511-E8(由Nippi，Inc.制造)。
将在亚汇合前一天的人iPS细胞在存在A83-01(由Wako制造，TGFβR抑制剂0.5μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，1000nM)(预先处理的处理)的条件下进行无饲养细胞的培养，持续一天。
通过使用TrypLE Select(由Life Technologies制造)，将上述人iPS细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.0x104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)中的100μl无血清培养基中，并且在37如，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。
在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度为20μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，30nM，300nM，500nM，1000nM)(图25)。到开始悬浮培养后第2天，在任一种条件下都形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。
在开始悬浮培养后第3天，添加不含Y27632和SAG但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基(50μl)，以使外源性人重组BMP4(由R&D制造)的终浓度为1.5nM(55ng/ml)。
在悬浮培养开始后第6天，将一半量的培养基更换为不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基。然后，每2-4天一次，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基。
在开始悬浮培养后第17天，将这样制备的细胞在倒置显微镜(KEYENCE)下进行亮视野观察。结果，发现在涉及在步骤1中用A83-01和SAG预先处理并且在步骤2中以30nM，300nM，500nM，或1000nM的浓度添加SAG的条件下，形成细胞聚集体，并且能够有效地形成神经组织(图25，A-D)。
从这些结果，发现在涉及在步骤1中用TGFβ家族信号转导途径抑制物质(A83-01)和Shh信号转导途径激活物质(SAG)预先处理并且在分化诱导开始时以30-1000nM的浓度范围添加SAG的条件下，能够有效地由无饲养细胞的人iPS细胞产生神经组织。
实施例26：通过使用用仙台病毒建立并且进行无饲养细胞的培养的人iPS细胞作 为起始材料、在步骤1中使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质并且在步骤3中使用BMP信号 转导途径激活物质，由人iPS细胞制备视网膜组织的实施例
使用商购的仙台病毒载体(4种因子，包括Oct3/4，Sox2，KLF4和c-Myc，由DNAVEC(现在的ID Pharma)制造的CytoTune试剂盒)和StemFit培养基(AK03；由Ajinomoto Co.，Inc.制造)、层粘连蛋白511-E8(由Nippi，Inc.制造)，并且按照Life Technologies的公布流程(iPS 2.0仙台重新编程试剂盒(Sendai Reprogramming Kit)，公布号MAN0009378，Revision 1.0)和京都大学(Kyoto University)的公布的流程(人iPS细胞的建立·维持培养，CiRA_Ff-iPSC_protocol_JP_v140310，http：//www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/protoc0l.html)中所述的方法，建立人iPS细胞(DSPC-3株，由Sumitomo Dainippon PharmaCo.，Ltd.建立)。
按照Scientific Reports，4，3594(2014)中所述的方法，将人iPS细胞(DSPC-3株)进行无饲养细胞的培养。作为无饲养细胞的培养基，使用StemFit培养基(AK03，由Ajinomoto Co.，Inc.制造)，并且作为无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511-E8(由Nippi，Inc.制造)。
按照实施例1所述的方法，通过使用StemFit培养基，将人iPS细胞(DSPC-3株)进行无饲养细胞的培养，直到亚汇合前一天。将亚汇合前一天的人iPS细胞在下述3种条件下进行无饲养细胞的培养。
·条件1：SB431542(TGFβR抑制剂，5μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)(图26，B，C，F，G)
·条件2：LDN193189(BMP信号转导途径抑制物质，100nM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)(图26，D，E，H，I)
·条件3：不含外源性TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径激活物质(图26，A)
使用TrypLE Select(由Life Technologies制造)，将条件1-3这样制备的人iPS细胞用细胞分散液处理，并且通过吹吸操作进一步分散成单个细胞。然后，将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.2x104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(SUMILONSpheroid V型底平板，PrimeSurface 96V型底平板，SUMITOMO BAKELITE)中的100μl无血清培养基中，并且在37℃，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中添加Y27632(20μM)，并且在再一次添加SAG(外源性Shh信号转导途径激活物质)(终浓度为30nM)的条件下，或在没有再一次添加SAG的条件下使用所述培养基。在开始悬浮培养后第2天，形成细胞聚集体。在开始悬浮培养后第3天，添加不含Y27632和SAG但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基(50μl)，以使外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/ml)。在悬浮培养开始后第6天，将一半量的培养基更换为不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基。然后，每2-4天一次，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基。
在悬浮培养开始后第22天，将这样制备的细胞聚集体在倒置显微镜(BIOREVO，由KEYENCE制造)下进行亮视野观察(图26，A-E)。结果，发现，未经预先处理(条件3)，细胞聚集体不生长，并且没有形成神经上皮(图26，A)。另一方面，发现在涉及在步骤1中用SB431542与SAG或LDN193189与SAG(条件1，2)预先处理的条件下，细胞聚集体生长，并且形成神经上皮(图26，B-E)。
在开始悬浮培养后第22天，将这种制备的细胞聚集体用4％多聚甲醛固定，以制备冷冻切片。将这些冷冻切片针对Chx10(抗-Chx10抗体，Exalpha，绵羊)(其是一种视网膜组织标记)免疫染色，并且在荧光显微镜(BIOREVO，由KEYENCE制造)下观察。
结果，发现，在涉及在步骤1中用SB431542与SAG预先处理、在步骤2中不添加SAG并且在步骤3中添加BMP4的条件下产生的细胞聚集体中，总细胞中Chx10-阳性细胞的比例为约90％(图26，F)。另外，在涉及在步骤1中用SB431542与SAG预先处理、在步骤2中添加SAG并且在步骤3中添加BMP4的条件下产生的细胞聚集体中，总细胞中Chx10-阳性细胞的比例为约70％(图26，G)。即，发现在涉及在步骤1中用TGFβR抑制剂(SB431542)和Shh信号转导途径激活物质预先处理并且在步骤3中添加BMP信号转导途径激活物质的条件下，甚至当在步骤2中添加或不添加Shh信号转导途径激活物质时，都能够产生视网膜组织。
此外，发现，在涉及在步骤1中用LDN193189与SAG预先处理、在步骤2中不添加SAG并且在步骤3中添加BMP4的条件下产生的细胞聚集体中，总细胞中Chx10-阳性细胞的比例为约90％(图26，I)。另外，在涉及在步骤1中用LDN193189与SAG预先处理、在步骤2中添加SAG并且在步骤3中添加BMP4的条件下产生的细胞聚集体中，总细胞中Chx10-阳性细胞的比例为约60％(图26，H)。即，发现在涉及在步骤1中用BMPR抑制剂(LDN193189)与Shh信号转导途径激活物质预先处理并且在步骤3中添加BMP信号转导途径激活物质的条件下，甚至当在步骤2中添加或不添加Shh信号转导途径激活物质时，都能够产生视网膜组织。
从这些结果，发现通过在步骤1中添加TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径激活物质并且在步骤3中添加BMP信号转导途径激活物质，能够由作为起始材料的经由仙台病毒产生的和进行无饲养细胞的培养的人iPS细胞产生视网膜组织。
实施例27：通过使用进行无饲养细胞培养的人ES细胞作为起始材料、在步骤1中使 用TGFβ家族信号转导途径抑制物质、在步骤2中使用Shh信号转导途径激活物质和在步骤3 中使用BMP信号转导途径激活物质，由人iPS细胞制备视网膜组织的实施例
按照Scientific Reports，4，3594(2014)中所述的方法，将Rx：：GFP敲入的人ES细胞(来源于KhES-1株；Cell Stem Cell，2012，10(6)771-785)进行无饲养细胞的培养(图27，A)。作为无饲养细胞的培养基，使用StemFit培养基(AK03，由Ajinomoto Co.，Inc.制造)，并且作为无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511-E8(由Nippi，Inc.制造)。
通过使用StemFit培养基并且按照实施例1所述的方法，将人ES细胞(Rx：：GFP株)进行无饲养细胞的培养直到亚汇合前一天。将亚汇合前一天的人iPS细胞在下述3种条件下进行无饲养细胞的培养，持续一天。
·条件1：SB431542(TGFβR抑制剂，5μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，30nM)(图27，C，E)
·条件2：LDN193189(BMPR抑制剂，100nM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，30nM)(图27，D，F)
·条件3：不含外源性TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径激活物质(图27，B)
使用TrypLE Select(由Life Technologies制造)，将条件1-3下这样制备的人ES细胞用细胞分散液处理，并且通过吹吸操作进一步分散成单个细胞。然后，将上述分散成单个细胞的人ES细胞以1.2x104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(SUMILONSpheroid V型底平板，PrimeSurface 96V型底平板，SUMITOMO BAKELITE)中的100μl无血清培养基中，并且在37如，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。
在未经预先处理的条件3下，在悬浮培养开始时(悬浮培养开始后第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中添加Y27632(20μM)，并且使用没有进一步添加外源性Shh信号转导途径激活物质的条件下的无血清培养基。
在条件1和2下，在悬浮培养开始时(悬浮培养开始后第0天，步骤2开始时)，向上述无血清培养基中添加Y27632(20μM)，并且在进一步添加SAG、外源性Shh信号转导途径激活物质(终浓度为30nM)的条件下使用所述培养基(图27)。在条件1-3中任一条件下，在开始悬浮培养后第2天，形成细胞聚集体。在开始悬浮培养后第3天，添加不含Y27632和SAG但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基(50μl)，以使外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/ml)。在悬浮培养开始后第6天，将一半量的培养基更换为不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基。然后，每3天一次，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基。
在悬浮培养开始后第18天，将这样制备的细胞聚集体在倒置显微镜(BIOREVO，由KEYENCE制造)下进行亮视野观察。结果，发现未经预先处理(条件3)，在细胞聚集体中神经上皮形成的效率差(图27，B)。另一方面，发现在涉及在步骤1中用SB431542与SAG或LDN193189与SAG预先处理的条件下(条件1，2)，细胞聚集体生长，并且形成神经上皮(图27，C，D)。即，发现在步骤1中预先处理操作提高神经上皮产生的效率。
在荧光显微镜(BIOREVO，由KEYENCE制造)下观察在这样制备的细胞聚集体(人ES细胞Rx：：GFP-来源的株)中在Rx基因启动子调节下的GFP表达。结果，发现在涉及在步骤1中用SB431542与SAG的组合或LDN193189与SAG的组合预先处理、在步骤2中添加SAG并且在步骤3中添加BMP4的条件下，总细胞中大约90％是GFP-强阳性的(图27，E，F)。
从这些结果，发现通过在步骤1中添加TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径激活物质并且在步骤3中添加BMP信号转导途径激活物质，能够由作为起始材料的进行无饲养细胞培养的人ES细胞产生视网膜组织。
实施例28：通过使用进行无饲养细胞培养的人iPS细胞作为起始材料、在步骤1中 使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质、在步骤2中使用Shh信号转导途径激活物质并且在步 骤3中使用BMP信号转导途径激活物质，由人iPS细胞制备视网膜组织的实施例
按照实施例1所述的方法，使用StemFit培养基，将人iPS细胞(1231A3株)进行无饲养细胞的培养直到亚汇合前一天。将亚汇合前一天的人iPS细胞用TGFβR抑制剂(SB431542，5μM)和Shh信号转导途径激活物质(SAG，300nM)进行无饲养细胞的培养持续一天(预先处理)。
使用TrypLE Select(由Life Technologies制造)，将上述人iPS细胞用细胞分散液处理，并且通过吹吸操作进一步分散成单个细胞。然后，将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.2x104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板中的100μl无血清培养基中，并且在37℃，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，在悬浮培养开始时，向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度为20μM)和Shh信号作用物质(SAG，30nM)。到开始悬浮培养后第2天，形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。
在开始悬浮培养后第3天，将培养基更换为上述不含Y27632和SAG但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的无血清培养基，以将外源性人重组BMP4的终浓度设置为1.5nM。在开始悬浮培养后第3天或以后，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基，每2-4天更换一次。在开始悬浮培养后第17天，细胞聚集体生长，并且形成了神经上皮。
将在开始悬浮培养后第17天的细胞聚集体转移到90mm低粘附性培养皿(由SUMITOMO BAKELITE制造)中，并且在包含Wnt信号转导途径激活物质(CHIR99021，3μM)和FGF信号转导途径抑制物质(SU5402，5μM)的无血清培养基(补充了1％N2补充剂的DMEM/F12培养基)中在37如，5％CO2培养3天，即，直到悬浮培养开始后第20天。在该时间期内，在每一个90mm低粘附性培养皿中，使约50个聚集体在10ml上述包含CHIR99021和SU5402的无血清培养基中进行悬浮培养。在开始悬浮培养后第20天，形成薄的神经上皮，并且形成视网膜色素上皮(RPE)-样组织。
此外，将在开始悬浮培养后第20天的细胞聚集体在90mm低粘附性培养皿(由SUMITOMO BAKELITE制造)中在不含Wnt信号转导途径激活物质和FGF信号转导途径抑制物质的含血清培养基(补充了10％胎牛血清，1％N2补充剂，0.5μM视黄酸和100μM牛磺酸的DMEM/F12培养基)中在37℃，5％CO2，大气氧浓度(约20％)进行悬浮培养持续81天，即直到开始悬浮培养后第101天。从开始悬浮培养后的第20天至第101天，将一半量的培养基更换为上述含血清培养基，每2-4天更换一次。在该时间期内，在每个90mm低粘附性培养皿中，将约30个聚集体在15ml上述无血清培养基中进行悬浮培养。在开始悬浮培养后第30天或以后，存在神经视网膜样组织。
将在开始悬浮培养后第101天的这样制备的细胞聚集体用4％多聚甲醛固定，以产生冷冻切片。将这些冷冻切片针对Rx(抗-Rax/Rx抗体，由Takara制造，豚鼠)(其是一种视网膜组织标记)、Ki67(抗-Ki67抗体，由Leica制造，兔)(其是一种增殖细胞标记)、Chx10(抗-Chx10抗体，Exalpha，绵羊)(其是一种神经视网膜祖先细胞标记)、Crx(抗-Crx抗体，由Takara制造，兔)(其是一种感光前体细胞标记)、Blimp1(抗-Blimp1抗体，由Santa Cruz制造，大鼠)(其是一种感光前体细胞标记)和Bm3b(抗-Brn3b抗体，由Santa Cruz制造，山羊)(其是一种神经节细胞标记)免疫染色，并且在荧光显微镜(BIOREVO，由KEYENCE制造)下观察。
结果，发现在这样制备的细胞聚集体中，总细胞中Rx-阳性细胞的比例为约90％(图28，A)。从连续切片的分析，发现Ki67-阳性和Chx10-阳性神经视网膜祖先细胞包含在Rx-强阳性细胞中(图28，B，C)。此外，发现所述细胞聚集体包含Crx-强阳性感光前体细胞(图28，D)。从连续切片的分析，发现一部分Crx-强阳性细胞是Blimp1-阳性感光前体细胞(图28，E)。此外，发现所述细胞聚集体包含Brn3b-阳性神经节细胞(图28，F)。
从这些结果，发现通过本发明的制备方法产生的视网膜组织通过继续所述培养分化并且成熟为包含神经视网膜祖先细胞、感光前体细胞和神经节细胞的视网膜组织。
实施例29：通过使用进行无饲养细胞培养的人iPS细胞作为起始材料、在步骤1中 使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质、在步骤2中使用Shh信号转导途径激活物质并且在步 骤3中使用BMP信号转导途径激活物质，由人iPS细胞制备视网膜组织的实施例
按照实施例28所述的方法，在涉及在步骤1中用TGFβR抑制剂(SB431542，5μM)和Shh信号转导途径激活物质(SAG，300nM)预先处理一天、在步骤2中使用Shh信号转导途径激活物质(SAG，30nM)并且在步骤3中添加BMP信号转导途径激活物质(BMP4，终浓度为1.5nM)的条件下，由作为起始材料的在StemFit培养基(作为无饲养细胞的培养基)中的人iPS细胞(1231A3株)制备细胞聚集体。在悬浮培养开始后第18天，形成神经上皮。
将在悬浮培养开始后第18天的细胞聚集体转移到90mm低粘附性培养皿(由SUMITOMO BAKELITE制造)中，并且在包含Wnt信号转导途径激活物质(CHIR99021，3μM)和FGF信号转导途径抑制物质(SU5402，5μM)的无血清培养基(补充了1％N2补充剂的DMEM/F12培养基)中在37如，5％CO2培养5天，即，直到悬浮培养开始后第23天。在该时间期内，在每一个90mm低粘附性培养皿中，将约50个聚集体在10ml上述包含CHIR99021和SU5402的无血清培养基中进行悬浮培养。在悬浮培养开始后第23天，形成薄的神经上皮，并且形成视网膜色素上皮(RPE)-样组织。
此外，将在悬浮培养开始后第23的细胞聚集体在90mm低粘附性培养皿(由SUMITOMO BAKELITE制造)中在不含Wnt信号转导途径激活物质和FGF信号转导途径抑制物质的含血清培养基(补充了10％胎牛血清，1％N2补充剂，0.5μM视黄酸和100μM牛磺酸的DMEM/F12培养基)中在37如，5％CO2，大气氧浓度(约20％)进行悬浮培养直至悬浮培养开始后第130天(持续107天)，直至第137天(持续114天)或直至第178天(持续155天)。在悬浮培养开始后第23天到悬浮培养结束过程中，将一半量的培养基更换为上述含血清培养基，每2-4天更换一次。在该时间期内，在每个90mm低粘附性培养皿中，将约30个聚集体在15ml上述含血清培养基中进行悬浮培养。在悬浮培养开始后第35天或以后，存在神经视网膜样组织。
将在悬浮培养开始后第130天、第137天和第178天的这样制备的细胞聚集体分别用4％多聚甲醛固定，以产生冷冻切片。将这些冷冻切片针对下述各项免疫染色：钙视网膜蛋白(抗-钙视网膜蛋白抗体，由Millipore制造，兔)(其是一种中间神经元标记(神经节细胞和无长突细胞))，S-视蛋白(抗-S-视蛋白抗体，由Millipore制造，兔)(其是一种视锥感光细胞标记)，Rx(抗-Rax/Rx抗体，由Takara制造，豚鼠)(其是一种视网膜组织标记)，Pax6(抗-Pax6抗体，由BD制造，小鼠)(其是一种中间神经元标记(神经节细胞和无长突细胞))，恢复蛋白(抗-恢复蛋白抗体，由Millipore制造，兔)(其是一种感光细胞标记)，视紫质(抗-视紫质抗体Ret-P1，由Sigma制造，小鼠)(其是一种视杆感光细胞标记)，NRL(抗-NRL抗体，由R&D制造，ω羊)(其是一种视杆感光前体细胞标记)，和钙结合蛋白(抗-钙结合蛋白抗体，由Millipore制造，兔)(其是一种中间神经元标记(水平细胞))，并且在共聚焦激光显微镜(LSM780，由Zeiss制造)下观察。
从在悬浮培养开始后第130天的细胞聚集体的分析，发现总细胞中Rx-阳性细胞的比例为约90％。另外，发现Rx-强阳性视网膜组织在内部包含钙视网膜蛋白-阳性中间神经元(图29，A)。
从在悬浮培养开始后第137天的细胞聚集体的分析，发现总细胞中Rx-阳性细胞的比例为约90％。另外，发现Rx-强阳性视网膜组织包含Crx-阳性感光前体细胞和恢复蛋白-阳性感光细胞。此外，发现Rx-强阳性视网膜组织包含S-视蛋白-阳性视锥感光细胞(图29，B)。
从在悬浮培养开始后第178天的细胞聚集体的分析，发现总细胞中Rx-阳性细胞的比例为约90％(图29，C)。从连续切片的分析，发现Rx-强阳性视网膜组织在内部包含Pax6-阳性中间神经元(无长突细胞和神经节细胞)(图29，D)。发现Rx-强阳性视网膜组织在外侧包含恢复蛋白-阳性感光细胞、视紫质-阳性视杆感光细胞、NRL-阳性视杆感光前体细胞和钙结合蛋白-阳性水平细胞(图29，E-H)。
从这些结果，发现通过继续所述培养，经由本发明的制备方法产生的视网膜组织分化并成熟为包含感光前体细胞、感光细胞、视锥感光细胞、视杆感光细胞、水平细胞和其他中间神经元的视网膜组织。
实施例30：通过使用进行无饲养细胞培养的人iPS细胞作为起始材料、在步骤1使 用TGFβ家族信号转导途径抑制物质、在步骤2中使用Shh信号转导途径激活物质并且在步骤 3中使用BMP信号转导途径激活物质，由人iPS细胞制备视网膜组织的实施例
按照实施例29所述的方法，在涉及在步骤1中用TGFβR抑制剂(SB431542，5μM)和Shh信号转导途径激活物质(SAG，300nM)预先处理一天、在步骤2中使用Shh信号转导途径激活物质(SAG，30nM)并且在步骤3中添加BMP信号转导途径激活物质(BMP4，终浓度为1.5nM)的条件下，由作为起始材料的在StemFit培养基(作为无饲养细胞的培养基)中的人iPS细胞(1231A3株)制备细胞聚集体。在悬浮培养开始后第18天，形成神经上皮。
将在悬浮培养开始后第18天的细胞聚集体转移到90mm低粘附性培养皿(由SUMITOMO BAKELITE制造)中，并且在包含Wnt信号转导途径激活物质(CHIR99021，3μM)和FGF信号转导途径抑制物质(SU5402，5μM)的无血清培养基(补充了1％N2补充剂的DMEM/F12培养基)中在37如，5％CO2培养5天，即，直至悬浮培养开始后第23天。在该时间期内，在每个90mm低粘附性培养皿中，将约50个聚集体在10ml上述包含CHIR99021和SU5402的无血清培养基中进行悬浮培养。在悬浮培养开始后第23天，形成薄的神经上皮，并且形成了视网膜色素上皮(RPE)-样组织。
此外，将在悬浮培养开始后第23天的细胞聚集体在90mm低粘附性培养皿(由SUMITOMO BAKELITE制造)中在不含Wnt信号转导途径激活物质和FGF信号转导途径抑制物质的含血清培养基(补充了10％胎牛血清，1％N2补充剂，0.5μM视黄酸和100μM牛磺酸的DMEM/F12培养基)中在37如，5％CO2，大气氧浓度(约20％)下进行悬浮培养，直至悬浮培养开始后第63天(持续41天)。从悬浮培养开始后第23天到悬浮培养结束，将一半量的培养基更换为上述含血清培养基，每2-4天更换一次。在该时间期内，在每一个90mm低粘附性培养皿中，将约30个聚集体在15ml上述含血清培养基中进行悬浮培养。在悬浮培养开始后第35天或以后，存在神经视网膜样组织。
在倒置显微镜(由Nicon制造)下对在悬浮培养开始后第63天的这样制备的细胞聚集体的亮视野观察揭示了神经视网膜组织和色素RPE-样组织的存在。当对得到的100个细胞聚集体详细分析时，在40个细胞聚集体中不少于90％的总细胞组成神经视网膜，在40个细胞聚集体中发现同时包含神经视网膜和视网膜色素上皮(RPE，可通过色素沉着区分)的复合视网膜组织(图30，A)，并且在20个细胞聚集体中不少于90％的总细胞组成视网膜色素上皮(RPE，可通过色素沉着区分)(图30，B)。
此外，将上述在悬浮培养开始后第63天的细胞聚集体在不含Wnt信号转导途径激活物质和FGF信号转导途径抑制物质的含血清培养基(补充了10％胎牛血清，1％N2补充剂，0.5μM视黄酸和100μM牛磺酸的DMEM/F12培养基)中进行悬浮培养直至开始悬浮培养后第130天(持续107天)。将这些细胞聚集体用4％多聚甲醛固定，以产生冷冻切片。将这些冷冻的切片针对下述各项免疫染色：SSEA1(抗-SSEA1抗体，由Millipore制造，小鼠)(其是一种睫状边缘区(CMZ)标记)，Miff(抗-Miff抗体，Exalpha，小鼠)(其是一种RPE标记)，和Aqp1(抗-Aqp1抗体，由Millipore制造，兔)(其是一种RPE和睫状体标记)，并且在共聚焦激光显微镜(LSM780，由Zeiss制造)下观察。
其中在悬浮培养开始后第130天整个聚集体悬浮培养表现出色素沉着的RPE-样组织的分析揭示总细胞中约80％是Rx-弱阳性的。另外，连续切片分析揭示Rx-弱阳性细胞是Mitf-阳性的RPE(图30，D)。此外，发现上述RPE-样组织是Aqp1-阳性的(图30，E)。从这些结果，发现通过本发明的制备方法产生的视网膜组织能够分化并成熟为RPE。
通过对在悬浮培养开始后第130天的包含神经视网膜和RPE-样组织二者的复合视网膜组织的分析，发现总细胞中Rx-阳性细胞的比例为约90％，并且包含Rx-强阳性神经视网膜和Rx-弱阳性RPE-样组织。另外，发现在神经视网膜(图30，C，右图)与RPE(图30，C)之间的边界中形成SSEA1-阳性睫状边缘区。从这些结果，发现通过本发明的制备方法产生的视网膜组织能够分化并成熟为睫状边缘区。
实施例31：通过使用进行无饲养细胞培养的人iPS细胞作为起始材料、在步骤1中 使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质，由人iPS细胞制备大脑组织的实施例
按照Scientific Reports，4，3594(2014)所述的方法，按照实施例1所述的方法，使人iPS细胞(1231A3株)进行无饲养细胞的培养。作为无饲养细胞的培养基，使用StemFit培养基(AK03，由Ajinomoto Co.，Inc.制造)，并且作为无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511-E8(由Nippi，Inc.制造)。
按照实施例1所述的方法，通过使用StemFit培养基，将人iPS细胞(1231A3株)进行无饲养细胞的培养直至亚汇合前一天。将亚汇合前一天的人iPS细胞在下述3种条件下进行无饲养细胞的培养持续一天。
·条件1：SB431542(TGFβR抑制剂，5μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)
·条件2：LDN193189(BMPR抑制剂，100nM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)
·条件3：不含外源性TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径激活物质(未经预先处理)
使用TrypLE Select(由Life Technologies制造)，将上述条件1-3下这样制备的人iPS细胞用细胞分散液处理，并且通过吹吸操作进一步分散成单个细胞。然后，将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以0.9x104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(SUMILON Spheroid V型底平板，PrimeSurface 96V型底平板，SUMITOMO BAKELITE)中的100μl无血清培养基中，并且在37℃，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(GMEM+KSR)，使用作为补充了20％KSR(由Life Technologies生产)，0.1mM2-巯基乙醇，1x非必需氨基酸(由Life Technologies生产)和1mM丙酮酸(由Life Technologies生产)的GMEM培养基(由Life Technologies生产)的无血清培养基。
在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中添加Wnt信号转导途径抑制物质(IWR-1-endo，3μM)、TGFβR抑制剂(SB431542，5μM)和Y27632(20μM)，并且将细胞在包含SAG(Shh信号作用物质，100nM)的条件(A)和不包含SAG的条件(B)下培养。在悬浮培养开始后第2天，在任一种条件下都形成细胞聚集体。
在开始悬浮培养后第3天，将一半量的培养基更换为不含Y27632和SAG但是包含Wnt信号转导途径抑制物质(IWR-1-endo，3μM)和TGFβR抑制剂(SB431542，5μM)的无血清培养基。然后，直到悬浮培养开始后第25天或第27天，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632和SAG但是包含Wnt信号转导途径抑制物质(IWR-1-endo，3μM)和TGFβR抑制剂(SB431542，5μM)的无血清培养基，每2-4天更换一次。
将在悬浮培养开始后第25天的细胞聚集体在倒置显微镜(BIOREVO，由KEYENCE制造)下进行亮视野观察。结果，未经预先处理(条件3)时，细胞聚集体不生长，并且几乎不形成神经上皮(图31，A)。另一方面，在步骤1中用SB431542与SAG或LDN193189与SAG预先处理的条件下(条件1，2)，甚至在步骤2中不添加SAG的条件(B)下，细胞聚集体生长，并且形成神经上皮(图31，B，C)。类似地，在步骤1中用SB431542与SAG或LDN193189与SAG预先处理的条件(条件1和2)下和在步骤2中添加SAG的条件(A)下，细胞聚集体生长，并且形成了神经上皮。即，发现只要在步骤1中添加TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Shh信号作用物质，不管在步骤2中是添加还是不添加Shh信号作用物质，神经上皮的产生效率都得到提高。
将在悬浮培养开始后第27天的这样制备的细胞聚集体分别用4％多聚甲醛固定，以产生冷冻切片。将这些冷冻切片针对下述各项免疫染色：Sox2(抗-Sox2抗体，由SantaCruz制造，山羊)(其是一种神经前体细胞标记)，和FoxG1(抗-FoxG1抗体，由RIKEN制造，As3514，兔)(其是一种大脑标记)，并且在聚焦激光显微镜(由Olympus制造)下观察。
结果，发现在步骤1中以条件1下培养的在悬浮培养开始后第27天的细胞聚集体中，在所述细胞聚集体的表面上存在Sox2-阳性神经前体细胞(图32，A)。此外，共染色分析揭示Sox2-阳性神经前体细胞中约98％是Sox2-阳性且FoxG1-阳性的大脑神经前体细胞(图32，B)。另外，发现在步骤1中以条件2培养的在悬浮培养开始后第27天的细胞聚集体也在所述细胞聚集体表面上具有Sox2-阳性神经前体细胞，如同条件1，并且Sox2-阳性神经前体细胞中约98％是Sox2-阳性且FoxG1-阳性的大脑神经前体细胞。
从这些结果，发现通过在步骤1中添加TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Shh信号转导途径激活物质并且在步骤3中添加TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Wnt信号转导途径抑制物质，能够由作为起始材料的进行无饲养细胞培养的人iPS细胞产生大脑组织。
实施例32：通过使用进行无饲养细胞培养的人iPS细胞作为起始材料并在步骤1中 使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质，由人iPS细胞制备大脑组织的实施例
将按照实施例31所述的方法制备的在悬浮培养开始后第27天的细胞聚集体转移到90mm低粘附性培养皿(由SUMITOMO BAKELITE制造)中，并且在无血清培养基(补充了1％N2补充剂(由Life Technologies生产)的DMEM/F12培养基(由Life Technologies生产))中在37如，5％CO2进行悬浮培养。在该时间期内，在每个90mm低粘附性培养皿中，将约30个聚集体在10ml无血清培养基中进行悬浮培养。然后，直至悬浮培养开始后第40天，将一半量的培养基更换为无血清培养基(补充了1％N2补充剂(由Life Technologies生产)的DMEM/F12培养基(由Life Technologies生产))，每2-4天更换一次。
将在悬浮培养开始后第40天得到的的细胞聚集体在90mm低粘附性培养皿(由SUMITOMO BAKELITE制造)中在作为补充了10％胎牛血清、1％N2补充剂和0.5μM视黄酸的DMEM/F12培养基(由Life Technologies生产)的含血清培养基中在37如，5％CO2进行悬浮培养。在该时间期内，在每个90mm低粘附性培养皿中，将约30个聚集体在10ml无血清培养基中进行悬浮培养。然后，直到悬浮培养开始后第60天，将一半量的培养基更换为上述含血清培养基，每2-4天更换一次。
将在悬浮培养开始后第60天的这样制备的细胞聚集体分别用4％多聚甲醛固定，以产生冷冻切片。将这些冷冻切片针对下述各项免疫染色：FoxG1(抗-FoxG1抗体，由RIKEN制备，As3514，兔)(其是一种大脑标记)，Pax6(抗-Pax6抗体，由BD制造，小鼠)(其是一种背侧大脑神经前体细胞标记)，Tbr1(抗-Tbr1抗体，由Abcam制造，兔)(其是一种大脑第6层神经元标记)，和Ctip2(抗-Ctip2抗体，由Abcam制造，大鼠)(其是一种大脑第5层神经元标记)，并且在聚焦激光显微镜(由Olympus制造)下观察。
结果，在步骤1中用SB431542和SAG预先处理的条件(条件1)下培养的在悬浮培养开始后第60天的细胞聚集体中，所述细胞聚集体中总细胞的约40％是FoxG1-阳性大脑细胞(图32，C)。连续切片分析揭示包含FoxG1-阳性细胞的细胞聚集体以总细胞的约30％包含Pax6-阳性的背侧大脑神经前体细胞(图32，D)，以总细胞的约5％包含Tbr1-阳性的第6层神经元，和以约15％包含Ctip2-阳性的第5层神经元。
另外，发现在涉及在步骤1中用LDN193189和SAG预先处理的条件(条件2)下培养的在悬浮培养开始后第60天的细胞聚集体也包含FoxG1-阳性大脑细胞，如同条件1。连续切片分析揭示包含FoxG1-阳性细胞的细胞聚集体以总细胞的约30％包含Pax6-阳性的背侧大脑神经前体细胞，以总细胞的约5％包含Tbr1-阳性的第6层神经元，和以约15％包含Ctip2-阳性的第5层神经元。
此外，发现在四种条件(在步骤1中以条件1或条件2，在步骤2中添加SAG的条件(条件(A))或不添加SAG的条件(条件(B)))中的任一种下培养的在悬浮培养开始后第60天的细胞聚集体包含FoxG1-阳性大脑细胞。
从这些结果，发现通过在步骤1中添加TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Shh信号转导途径激活物质并且在步骤3中添加TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Wnt信号转导途径抑制物质，能够由作为起始材料的进行无饲养细胞培养的人iPS细胞产生大脑组织、大脑神经前体细胞和大脑层专有的神经元(例如，第6层神经元，第5层神经元)。
实施例33：通过使用进行无饲养细胞培养的人iPS细胞作为起始材料并且在步骤1 中使用TGFβ家族信号转导途径抑制物质，制备神经组织的实施例
按照实施例8所述的方法，将已经进行无饲养细胞培养的在亚汇合前一天的人iPS细胞(1231A3株)在下述2种条件下进行无饲养细胞的培养，持续一天。
·条件1：SB431542(TGFβR抑制剂，5μM)
·条件2：LDN193189(BMPR抑制剂，100nM)
·条件3：不含外源性TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径激活物质(未经预先处理)
通过使用TrypLE Select(由Life Technologies制造)，将在条件1-3下这样制备的人iPS细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞。并且，作为用于此的无血清培养基，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1的混合物的无血清培养基。
然后，将细胞接种在下述两种培养皿中。
·条件(A)。将上述分散为单个细胞的人iPS细胞以1.2x104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(SUMILON Spheroid U型底平板，PrimeSurface96U-型底平板，SUMITOMO BAKELITE)中的100μl上述无血清培养基中，并且在37℃，5％CO2进行悬浮培养。
·条件(B)。将上述分散为单个细胞的人iPS细胞以2.4x105个细胞/1个培养皿悬浮在非细胞粘附性的60mm F型底细胞培养皿(用于悬浮培养的皮式(petri)培养皿，SUMITOMO BAKELITE)中的4ml上述无血清培养基中，并且在37如，5％CO2进行悬浮培养。
在未经预先处理的条件3下，在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中添加Y27632(20μM)，并且使用在没有添加外源性Shh信号转导途径激活物质的条件下的无血清培养基。
在条件1和2下，在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中添加Y27632(20μM)，并且使用在进一步添加外源性Shh信号转导途径激活物质SAG(终浓度300nM)的条件下的无血清培养基(图33)。在条件1-3中任一种条件下，在开始悬浮培养后第2天，形成细胞聚集体。在开始悬浮培养后第4天，添加上述不含Y27632和SAG的无血清培养基。然后，每2-4天一次，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632和SAG的无血清培养基。
在悬浮培养开始后第19天，将这样制备的细胞聚集体在倒置显微镜(BIOREVO，由KEYENCE制造)下进行亮视野观察。结果，发现，未经预先处理(条件3)时，细胞聚集体不生长，并且在U型底平板(条件A)和F型底培养皿(条件B)中几乎都不形成神经上皮(图33，A，F)。另一方面，在步骤1中用TGFβR抑制剂(SB431542)或BMPR抑制剂(LDN193189)预先处理的条件(条件1和2)下，在U型底平板(条件A)和F型底培养皿(条件B)中，细胞聚集体都生长，并且都形成神经上皮(图33，B-E，G-J)。即，发现通过步骤1中的预先处理操作，在U型底平板(条件A)和F型底培养皿(条件B)中，神经上皮的生成效率都提高。
实施例34：通过在步骤1中用Shh信号转导途径激活物质对使用无饲养细胞培养基 StemFit(AK03N)培养的人iPS细胞进行预先处理操作，在步骤2中添加Shh信号转导途径激 活物质并且在步骤3中添加BMP4，形成视网膜组织的实施例
按照“Scientific Reports，4，3594(2014)”中所述的方法，将人iPS细胞(Ff-I01株，获自京都大学(Kyoto University))进行无饲养细胞的培养。作为无饲养细胞的培养基，使用StemFit培养基(AK03N，由Ajinomoto Co.，Inc.制造)，并且作为无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511-E8(由Nippi，Inc.制造)。
按照实施例8所述的方法，将亚汇合前2天无饲养细胞培养的人iPS细胞在存在SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)(步骤1，预先处理的处理)的条件下进行无饲养细胞的培养，持续2天。
通过使用TrypLE Select(由Life Technologies制造)，将上述人iPS细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，之后将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.0x104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)的100μl无血清培养基中，并且在37如，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。
在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度为20μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，500nM)。到开始悬浮培养后第2天，形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。
在开始悬浮培养后第3天或以后，添加不含Y27632和SAG但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基(50μl)，以使外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/ml)或5nM(183ng/ml)。在悬浮培养开始后第6天，弃掉50μl培养基并且添加50μl不含Y27632和SAG但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基，以维持外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/ml)或5nM(183ng/ml)。然后，每2-4天一次，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基。
在悬浮培养开始后第19天，将这样制备的细胞在倒置显微镜(KEYENCE)下进行亮视野观察。结果，发现在涉及以1.5nM或5nM添加BMP4的条件下，细胞聚集体生长，并且能够有效地形成神经组织(图34，A-B)。
从这些结果，发现在涉及在步骤1中用Shh信号转导途径激活物质(SAG)预先处理2天、在步骤2中添加Shh信号转导途径激活物质并且在步骤3中以1.5nM或5nM添加BMP4的条件下，能够有效地由无饲养细胞培养的人iPS细胞产生神经组织。
将在悬浮培养开始后第19天的细胞聚集体用4％多聚甲醛固定，以制备冷冻切片。将这些冷冻切片针对Chx10(抗-Chx10抗体，Exalpha，绵羊)(其是一种视网膜组织标记)免疫染色。将这些免疫染色的切片在倒置荧光显微镜下观察。结果，在添加BMP4两次保持终浓度为1.5nM的条件下，总细胞中Chx10-阳性细胞的比例为约70％(图34C)。另外，在添加BMP4两次保持终浓度为5nM的条件下，总细胞中Chx10-阳性细胞的比例为约90％(图34，D)。
从这些结果，发现在涉及在步骤1中用Shh信号转导途径激活物质(SAG)对在无饲养细胞的培养基StemFit(AK03N)中培养的人iPS细胞预先处理2天、在步骤2中添加Shh信号转导途径激活物质并且在步骤3中以5nM添加BMP信号转导途径激活物质2次(即，持续6天维持BMP信号转导途径激活物质的浓度处在5nM的条件)的条件下，能够有效地产生视网膜组织。
实施例35：通过在步骤1中用Shh信号激活物质预先处理1-4天、在步骤2中使用Shh 信号激活物质并且在步骤3中添加BMP信号激活物质，由无饲养细胞的人iPS细胞形成视网 膜组织的实施例
按照“Scientific Reports，4，3594(2014)”所述的方法，将人iPS细胞(Ff-I01株，获自京都大学(Kyoto University))进行无饲养细胞的培养。作为无饲养细胞的培养基，使用StemFit培养基(AK03N，由Ajinomoto Co.，Inc.制造)，并且作为无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511-E8(由Nippi，Inc.制造)。
在下述4种条件下进行预先处理的处理。
·条件1：将在亚汇合前24小时的人iPS细胞在补充了SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)的Stem Fit培养基(AK03N)中进行无饲养细胞的培养，持续24小时。
·条件2：将在亚汇合前48小时的人iPS细胞在补充了SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)的Stem Fit培养基(AK03N)中进行无饲养细胞的培养，持续48小时。
·条件3：将在亚汇合前72小时的人iPS细胞在补充了SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)的Stem Fit培养基(AK03N)中进行无饲养细胞的培养，持续72小时。
·条件4：将在亚汇合前96小时的人iPS细胞在补充了SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)的Stem Fit培养基(AK03N)中进行无饲养细胞的培养，持续96小时。
通过使用TrypLE Select(由Life Technologies制造)，将在上述条件4下培养的人iPS细胞分别用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，之后将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.0x104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)中的100μl无血清培养基中，并且在37℃，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基，使用作为补充了10％KSR、450μM 1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1：1混合物的无血清培养基。
在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度为20μM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，500nM)(图35)。到开始悬浮培养后第2天，在任一种条件下都形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。
在开始悬浮培养后第3天，添加不含Y27632和SAG但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基(50μl)，以使外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/ml)。在开始悬浮培养后第6天，弃掉50μl培养基，并且添加50μl不含Y27632和SAG但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基，以维持外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/ml)。然后，每2-4天一次，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基。
在开始悬浮培养后第19天，将这样制备的细胞聚集体在倒置显微镜(KEYENCE)下进行亮视野观察。结果，发现在涉及上述条件1-4中任一种的预先处理的条件下，细胞聚集体生长，并且能够有效地形成神经上皮(图35，A-D)。
从这些结果，发现在涉及在步骤1中用Shh信号转导途径激活物质预先处理1-4天、在步骤2中添加Shh信号转导途径激活物质并且在步骤3中添加BMP信号转导途径激活物质的条件下，能够有效地由无饲养细胞培养的人iPS细胞产生神经组织。
将在开始悬浮培养后第19天的这样制备的细胞聚集体用4％多聚甲醛固定，以制备冷冻切片。将这些冷冻切片针对Chx10(抗-Chx10抗体，Exalpha，绵羊)(其是一种视网膜组织标记)免疫染色，并且在荧光显微镜下观察。结果，发现通过涉及用SAG预先处理24小时(条件1)的条件，总细胞中Chx10-阳性细胞的比例为约10％(图35，E)。另一方面，发现通过涉及用SAG预先处理48、72或96小时(条件2，3，4)的条件，总细胞中Chx10-阳性细胞的比例为约80％(图35，F-H)。
从这些结果，发现在涉及在步骤1中用Shh信号转导途径激活物质(SAG)预先处理1-4天、在步骤2中添加Shh信号转导途径激活物质并且添加BMP信号转导途径激活物质的任一种条件下，能够有效地产生视网膜组织。
实施例36：通过在步骤1中用Shh信号转导途径激活物质和BMP信号转导途径抑制 物质预先处理30分钟-2天，并且在步骤3中添加BMP信号转导途径激活物质，由无饲养细胞 的人iPS细胞形成视网膜组织的实施例
按照“Scientific Reports，4，3594(2014)”所述的方法，将人iPS细胞(1231A3株，获自京都大学(Kyoto University))进行无饲养细胞的培养。作为无饲养细胞的培养基，使用StemFit培养基(AK03，由Ajinomoto Co.，Inc.制造)，并且作为无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511-E8(由Nippi，Inc.制造)。
预先处理的处理在下述5种条件下进行。
·条件1：将刚好在亚汇合前的人iPS细胞在补充了LDN193189(BMPR抑制剂，100nM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)的Stem Fit培养基(AK03)中进行无饲养细胞的培养，持续30分钟。
·条件2：将刚好在亚汇合前的人iPS细胞在补充了LDN193189(BMPR抑制剂，100nM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)的Stem Fit培养基(AK03)中进行无饲养细胞的培养，持续6小时。
·条件3：将在亚汇合前一天的人iPS细胞在补充了LDN193189(BMPR抑制剂，100nM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)的Stem Fit培养基(AK03)中进行无饲养细胞的培养，持续24小时。
·条件4：将在亚汇合前两天的人iPS细胞在补充了LDN193189(BMPR抑制剂，100nM)和SAG(Shh信号转导途径激活物质，300nM)的Stem Fit培养基(AK03)中进行无饲养细胞的培养，持续48小时。
·条件5：将亚汇合的人iPS细胞在不添加TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Shh信号转导途径激活物质的条件下进行无饲养细胞的培养。
通过使用TrypLE Select(由Life Technologies制造)，将在上述5种条件下培养的人iPS细胞分别用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，之后将上述分散成单个细胞的人iPS细胞以1.2x104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V型底平板，由SUMITOMO BAKELITE制造)中的100μl无血清培养基中，并且在37如，5％CO2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基，使用作为补充了10％KSR、450μM1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的F-12培养基与IMDM培养基的1∶1混合物的无血清培养基。
在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度20μM)。到开始悬浮培养后第2天，在任一种条件下都形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。
在开始悬浮培养后第3天，添加不含Y27632和SAG但是包含人重组BMP4(由R&D制造)的培养基(50μl)，以使外源性人重组BMP4的终浓度为1.5nM(55ng/m1)。然后，每2-4天一次，将一半量的培养基更换为上述不含Y27632、SAG和人重组BMP4的无血清培养基。
将在开始悬浮培养后第19天的这样制备的细胞聚集体在倒置显微镜(由KEYENCE制造)下进行亮视野观察。结果，在未经预先处理操作(条件5)的条件下，聚集体塌陷，并且几乎没有形成神经上皮(图36，A)。另一方面，发现在涉及用LDN193189和SAG预先处理30分钟、6小时、24小时和48小时的任一时间期(条件1-4)的条件下，聚集体生长，并且能够有效地形成神经上皮(图36，B-E)。
从这些结果，发现在涉及在步骤1中用Shh信号激活物质预先处理30分钟-2天并且在步骤3中添加BMP信号激活物质的条件下，能够有效地由无饲养细胞培养的人iPS细胞产生神经组织。
将在开始悬浮培养后第22天的这样制备的细胞聚集体用4％多聚甲醛固定，以制备冷冻切片。将这些冷冻切片针对Chx10(抗-Chx10抗体，Exalpha，绵羊)(其是一种视网膜组织标记)免疫染色。在倒置荧光显微镜下观察这些免疫染色的切片。结果，发现通过涉及用LDN193189和SAG预先处理30分钟、6小时、24小时和48小时中的任一时间期(条件1-4)的条件，总细胞中Chx10-阳性细胞的比例为约80％(图36，F-I)。
从这些结果，发现在涉及在步骤1中用Shh信号转导途径激活物质和BMP信号转导途径抑制物质预先处理30分钟-2天并且在步骤3中添加BMP信号转导途径激活物质的条件下，能够有效地由无饲养细胞的人iPS细胞产生视网膜组织。
[工业实用性]
根据本发明的制备方法，可以在不存在饲养细胞的条件下进行多能干细胞向神经细胞的分化诱导，并且产生神经组织。本发明的制备方法是有用的，原因在于其能够产生用作药物产品候选化合物和其他化学物质的毒性和功效评价的材料、用于神经组织移植治疗的移植材料的应用测试或治疗的神经组织。
本文引用的任何公布中公开的内容，包括专利、专利申请的说明书和科学文献，通过引用以它们在本文中公开的程度完全结合在本文中。
本申请基于在日本提交的专利申请号2014-217867(申请日期：2014年10月24日)，其内容完全结合在本文中。

Claims (19)

1.用于制备视网膜组织的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)第一步，在不存在饲养细胞的条件下在含有(a)和(b)的培养基中培养多能干细胞，由此获得维持多能样状态的细胞：其中，(a)为TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonichedgehog信号转导途径激活物质，(b)为用于维持未分化状态的因子，
(2)第二步，分散第一步中得到的细胞和悬浮培养所述分散的细胞，从而形成细胞聚集体，
(3)第三步，在存在BMP信号转导途径激活物质的条件下悬浮培养第二步中得到的聚集体，直到出现表达Rx基因，Pax6基因和/或Chx10基因的细胞，从而得到包括视网膜祖先细胞的聚集体，
(4)第四步，在基本上不补充任何BMP信号转导途径激活物质的培养基中悬浮培养第三步中得到的聚集体7天至200天，从而得到包括视网膜组织的聚集体，
其中所述多能干细胞是人工多能干细胞，非人胚胎干细胞，或可商购的人胚胎干细胞。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述用于维持未分化状态的因子是选自由bFGF，FGF4，FGF8，EGF，Nodal，激活蛋白A，激活蛋白B，TGFβ1，和TGFβ2组成的组的一种或多种蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述TGFβ家族信号转导途径抑制物质是Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质、TGFβ信号转导途径抑制物质或BMP信号转导途径抑制物质。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述TGFβ家族信号转导途径抑制物质是Lefty、SB431542、A-83-01或LDN193189。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述Sonic hedgehog信号转导途径激活物质是Shh、SAG或Purmorphamine。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述BMP信号转导途径激活物质是选自由BMP2、BMP4、BMP7和GDF7组成的组的一种或多种蛋白。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中所述BMP信号转导途径激活物质是BMP4。
8.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，在第三步中，在第二步开始后第1天与第9天之间向所述培养基中添加所述BMP信号转导途径激活物质。
9.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，在第三步中培养基中的所述BMP信号转导途径激活物质的浓度是与1nM-10nM的BMP4的信号转导活性相对应的浓度，其中，所述相对应的浓度是指赋予与上述浓度的BMP4相当的BMP信号转导促进活性的浓度。
10.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，在第一步中培养基中的所述TGFβ家族信号转导途径抑制物质的浓度是与2μM-50μM的SB431542的TGFβ家族信号转导途径抑制活性相对应的浓度，其中，所述相对应的浓度是指赋予与上述浓度的SB431542相当的TGFβ家族信号转导途径抑制活性的浓度。
11.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中在第四步中得到的聚集体包含选自由下述各项组成的组的一种或多种细胞：视网膜祖先细胞，神经视网膜祖先细胞，感光前体细胞，感光细胞，视杆感光细胞，视锥感光细胞，水平细胞，无长突细胞，中间神经元，神经节细胞，视网膜色素上皮细胞，和睫状边缘区细胞。
12.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，在第二步中，将细胞在包含Sonichedgehog信号转导途径激活物质的无血清培养基中悬浮培养。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其中在第一步和第二步中的培养基中的所述Sonic hedgehog信号转导途径激活物质具有与10nM-700nM的SAG的Sonic hedgehog信号转导活性相对应的浓度，其中，所述相对应的浓度是指赋予与上述浓度的SAG相当的Shh信号转导促进活性的浓度。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其中，在第三步中，在包含浓度不超过与700nM的SAG的Sonic hedgehog信号转导活性相对应的浓度的Sonic hedgehog信号转导途径激活物质的培养基中培养所述聚集体，其中，所述相对应的浓度是指赋予与上述浓度的SAG相当的Shh信号转导促进活性的浓度。
15.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中第一步通过贴壁培养方法进行。
16.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述多能干细胞是人多能干细胞。
17.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述悬浮培养在不存在基膜制剂的条件下进行。
18.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中将培养基逐步替换为基本上不补充任何BMP信号转导途径激活物质的培养基。
19.一种制备神经视网膜的方法，包括：
通过权利要求1或2所述的制备方法制备包含视网膜组织的细胞聚集体，和
从所述细胞聚集体上切下所述视网膜组织。
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