CN107326009B - 使血液单个核细胞逆向分化产生人血源性自体视网膜干细胞的方法、试剂盒及用途 - Google Patents

使血液单个核细胞逆向分化产生人血源性自体视网膜干细胞的方法、试剂盒及用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及生物医学技术领域，更具体涉及一种使人的体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞的细胞培养方法、试剂盒和应用。所述的制备方法通过将自体细胞作为原料细胞依次经细胞培养液A1、细胞培养液A2和细胞培养液A3培养后得到血源性自体视网膜干细胞。本发明应用人自体血液细胞作为原料细胞，使之逆向分化生产人血源性自体视网膜干细胞。本发明应用小分子物质组成的细胞培养液配方，在不改变人的体细胞染色体DNA序列，不插入任何外来基因或DNA片段的情况下，快速使人的自体血液细胞逆向分化产生血源性自体视网膜干细胞。本发明在生产速度、产量、纯度方面均明显优于现有技术。

Description

使血液单个核细胞逆向分化产生人血源性自体视网膜干细胞 的方法、试剂盒及用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及生物医学技术领域，更具体涉及一种使人的体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞的细胞培养方法、试剂盒和应用。
背景技术
视网膜是位于眼底的中枢神经系统特化的一部分,起源于神经外胚层，是一层对光敏感的、精细的膜样结构，是形成各种视功能的基础。由胚胎时期神经外胚叶形成的视杯发育而来，视杯外层形成单一的视网膜色素上皮层，视杯内层则分化为视网膜神经感觉层。视网膜神经感觉层由外向内分别是:视锥、视杆层，外界膜，外核层，外丛状层，内核层，内丛状层，神经节细胞层，神经纤维层，内界膜(属Müller细胞的基底膜)。
眼底疾病多数会导致严重的致盲眼病，视网膜神经元的不可逆性的丢失是许多眼底疾病的最终结局，主要有各种视网膜疾病和年龄相关性黄斑变性。目前尚无有效的治疗方法。如何地治疗和预防眼底性疾病，再生和修复视网膜病变和黄斑病变，恢复眼底疾病患者的视功能，是当今神经科学领域面临的挑战。近10年来，国内外医学界利用视网膜干细胞修复各种视网膜变性和损伤，给各种视网膜疾病、黄斑变性等致盲性眼底疾病的治疗和预防带来了曙光。
目前，应用型的视网膜干细胞多来源于：1、胚胎干细胞(ESCs)诱导的异体视网膜干细胞；2、睫状上皮来源的干细胞或祖细胞，在体外进行培养；3、脐带血干细胞/间充质干细胞来源的视网膜细胞；4、诱导的多能干细胞(IPS)来源的视网膜干细胞。
中国专利申请201480066229公开了一种提供用于产生分离的哺乳动物原始视网膜干细胞(pRSC)的体外方法，其包括：(a)在不含饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的细胞培养基中培养来自哺乳动物的分离的胚胎干细胞(ESC)以产生并生长所述分离的ESC的培养物；和(b)使这样生长的所述分离的ESC的所述培养物与Wnt或TGF-β/BMP信号传导抑制剂中的一种或多种接触以使(a)的所述分离的ESC分化成原始视网膜干细胞，由此产生分离的哺乳动物pRSC。然而通过ESC诱导制备视网膜干细胞的方法通常耗时较长，诱导产生时间需要8-15周，此外其制备的视网膜干细胞在应用时也会出现异体免疫排斥反应。
睫状上皮来源的干细胞或祖细胞，在体外进行培养也有可能分化形成视网膜干细胞，然而研究已经证明睫状体细胞并不是真正意义上的视网膜干细胞，因此不适合应用于视网膜再生的治疗。
中国专利申请201510636044公开了一种治疗视网膜变性的干细胞制剂及其使用方法。通过将骨髓间充质干细胞优化培养和诱导分化，提高了其分化为视网膜神经前体样细胞效率，其移植效果与视网膜前体细胞具有相似的功效，使移植区视网膜功能有效改善，为干细胞移植治疗视网膜变性疾病提供了一种理想的细胞来源。然而脐带血干细胞/间充质干细胞来源的视网膜细胞的方法，存在体外培养时间长达数周，稳定性差，污染率高，获得的视网膜细胞数量少，产量极少，生物特性不稳定等问题。
中国专利申请201210301765公开了一种诱导人多能干细胞分化为视网膜前体细胞的方法。该方法，将人胚胎干细胞或人诱导的多能干细胞在含有N2的培养基中诱导后，转入含有神经基础培养基、敲除的血清替代物和烟酰胺的视网膜诱导培养基，获得视网膜前体细胞。诱导的多能干细胞(IPS)是一种转基因式的自体多能干细胞，然而其致癌风险高，生产工艺复杂，时间长，应用安全性引起严重关注。
在本发明中，应用多种小分子物质组成的细胞培养液，使血液单个核细胞等人的体细胞逆向分化，在2周之内即可产生数亿数量级别的人血源性自体视网膜干细胞。这种人血源性自体视网膜干细胞是在不改变人的体细胞染色体DNA序列，不插入任何外来基因或DNA片段的情况下产生的，不仅为多种致盲性眼底疾病的治疗和预防提供了一种新的选择，而且对自体视网膜组织器官工程和自体视网膜干细胞生产的产业化发展提供了一种潜在的应用基础。
发明内容
基于上述技术问题或技术缺陷，本发明的目的是：提供一组使人的体细胞逆向分化产生人血源性自体视网膜干细胞的细胞培养液配方；提供一种采用该细胞培养液配方使人的体细胞产生血源性自体视网膜细胞的技术方法；提供一种制备自体视网膜干细胞的试剂盒。以解决目前视网膜干细胞制备方法中的耗时长、存在免疫排斥反应、不适用于视网膜再生治疗、稳定性差、污染率高、产量低、致癌风险高以及工艺复杂的诸多问题。
一个方面，本发明提供了使人的体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞的一组培养液，所述的一组培养液包括细胞培养液A1、细胞培养液A2和细胞培养液A3；
其中，所述的细胞培养液A1为含有以下成分的DMEM培养液：
1-100μM的RHO激酶抑制剂Y-27632(C14H21N3O·2HCl)、1-100ng/mL的干细胞因子(SCF)、1-100ng/mL的白细胞介素3(IL3)、1-100ng/mL的白细胞介素6(IL6)、1-100ng/mL的白细胞介素11(IL11)、1-100ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、1-100ng/mL的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、1-100μg/mL的岩藻多糖、1-100μg/mL的葡聚糖硫酸酯、1-100nM的AMD 3100(1,1'-[1,4-亚苯基双(亚甲基)]双[1,4,8,11-四氮杂环十四烷])、1-100μM的M-阿仑膦酸钠(M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE)、1-100μM的氨羟二磷酸二钠、5-30ng/mL的神经生长因子和5-30μM的二甲亚砜(DMSO)；
其中，所述的细胞培养液A2为含有以下成分的DMEM培养液：
1-100ng/mL的Dkk1蛋白、1-100ng/mL的Noggin蛋白、1-100ng/mL的γ-分泌酶抑制剂DAPT、1-100ng/mL的Sonic hedgehog蛋白(Shh蛋白)、1-100ng/mL的胰岛素样生长因子(IGF)、1-100ng/mL的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子7(CKI-7)、1-100ng/mL的SMAD3抑制剂SB431542、1-100ng/mL的Lefly蛋白、100-1000nmol/L的视黄酸(Retinoic acid)、10-500nmol/L的激活素A(Activin A)、1-100ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、1-100μM的RHO激酶抑制剂Y-27632、5-30ng/mL的白细胞介素3(IL3)、5-30ng/mlL的白细胞介素6(IL6)、5-30ng/mL的神经生长因子(NGF)、1-100ng/mL的干细胞因子(SCF)；
其中，所述的细胞培养液A3为含有以下成分的DMEM培养液：
1-100ng/mL的Dkk1蛋白、1-100ng/mL的Noggin蛋白、1-100ng/mL的γ-分泌酶抑制剂DAPT、1-100ng/mL的Sonic hedgehog蛋白(Shh蛋白)、1-100ng/mL的胰岛素样生长因子(IGF)、1-100ng/mL的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子7(CKI-7)、1-100ng/mL的SMAD3抑制剂SB431542、1-100ng/mL的Lefly蛋白、100-1000nmol/L的视黄酸(Retinoic acid)、10-500nmol/L的激活素A(Activin A)、1-100ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、5-30μM的RHO激酶抑制剂Y-27632、5-30ng/mL的白细胞介素3(IL3)、5-30ng/mlL的白细胞介素6(IL6)、1-100ng/mL的干细胞因子(SCF)、1-100ng/mL的成纤维细胞生长因子2(FGF2)、1-100ng/mL的成纤维细胞生长因子8(FGF8)、1-100ng/mL的表皮生长因子(EGF)、1-100ng/mL的GSK-3α/β抑制剂CHIR、1-100ng/mL的TGFβR-1/ALK5抑制剂RepSox(616452)、1-100ng/mL的FGFR1特异性拮抗剂SU5402、1-100ng/mL的脑源性神经营养因子(BDNF)、1-100ng/mL的神经生长因子(NGF)、1-100ng/mL的神经营养因子-3(NT-3)、1-100ng/mL的血管内皮生长因子(VEGF)和1-100ng/mL的生长因子(GF)。
在一个优选的实施方案中，所述的使人的体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞的一组培养液中：
其中，所述的细胞培养液A1为含有以下成分的DMEM培养液：
10μM的RHO激酶抑制剂Y-27632、10ng/mL的干细胞因子、10ng/mL的白细胞介素3、10ng/mL的白细胞介素6、10ng/mL的白细胞介素11、10ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子、10ng/mL的粒细胞集落刺激因子、10μg/mL的岩藻多糖、10μg/mL的葡聚糖硫酸酯、10nM的AMD3100、10μM的M-阿仑膦酸钠、10μM的氨羟二磷酸二钠、10ng/mL的神经生长因子和10μM的二甲亚砜；
其中，所述的细胞培养液A2为含有以下成分的DMEM培养液：
10ng/mL的Dkk1蛋白、10ng/mL的Noggin蛋白、10ng/mL的γ-分泌酶抑制剂DAPT、10ng/mL的Sonic hedgehog蛋白(Shh蛋白)、10ng/mL的胰岛素样生长因子、10ng/mL的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子7(CKI-7)、10ng/mL的SMAD3抑制剂SB431542、10ng/mL的Lefly蛋白、500nmol/L的视黄酸(Retinoic acid)、100nmol/L的激活素A(Activin A)、10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、100μM的RHO激酶抑制剂Y-27632、10ng/mL的白细胞介素3(IL3)、10ng/mlL的白细胞介素6(IL6)、10ng/mL的神经生长因子(NGF)和10ng/mL的干细胞因子(SCF)；
其中，所述的细胞培养液A3为含有以下成分的DMEM培养液：
10ng/mL的Dkk1蛋白、10ng/mL的Noggin蛋白、10ng/mL的γ-分泌酶抑制剂DAPT、10ng/mL的Sonic hedgehog蛋白(Shh蛋白)、10ng/mL的胰岛素样生长因子(IGF)、10ng/mL的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子7(CKI-7)、10ng/mL的SMAD3抑制剂SB431542、10ng/mL的Lefly蛋白、200nmol/L的视黄酸(Retinoic acid)、100nmol/L的激活素A(Activin A)、10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、10μM的RHO激酶抑制剂Y-27632、10ng/mL的白细胞介素3(IL3)、10ng/mlL的白细胞介素6(IL6)、10ng/mL的神经生长因子(NGF)、10ng/mL的干细胞因子(SCF)、10ng/mL的成纤维细胞生长因子2(FGF2)、10ng/mL的成纤维细胞生长因子8(FGF8)、10ng/mL的表皮生长因子(EGF)、10ng/mL的GSK-3α/β抑制剂CHIR、10ng/mL的TGFβR-1/ALK5抑制剂RepSox(616452)、10ng/mL的FGFR1特异性拮抗剂SU5402、10ng/mL的脑源性神经营养因子(BDNF)；10ng/mL的神经营养因子-3(NT-3)、10ng/mL的血管内皮生长因子(VEGF)和10ng/mL的生长因子(GF)。
另一个方面，本发明提供了上述细胞培养液A1、细胞培养液A2和细胞培养液A3在使人的体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞中的应用。
再一个方面，本发明提供了一种用于制备自体视网膜干细胞的试剂盒，所述的试剂盒包括本发明提供的细胞培养液A1、细胞培养液A2和细胞培养液A3。
进一步地，所述的试剂盒还包括人的体细胞。
更进一步地，所述的试剂盒中的人的体细胞包括但不限于周围血液细胞、脐带血细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、脂肪细胞。
另一个方面，本发明还提供了所述的试剂盒在制备用于治疗涉及器官再生再造和修复的疾病的药物中的应用。
进一步地，所述的涉及器官再生再造和修复的疾病包括但不限于眼底疾病、眼底损伤、眼底组织衰老。
更进一步地，所述的及器官再生再造和修复的疾病包括但不限于视网膜、视神经和黄斑组织系统等细胞、组织和器官的病理损害、创伤坏死和各种退行性病变。
再一个方面，本发明提供了一种使人的体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
(1)将自体来源的体细胞作为原料细胞以2×106-5×106的密度接种于细胞培养皿中；
(2)在37℃和5％的CO2的环境中，将原料细胞在细胞培养液A1中培养1-3天，得到细胞1；所述的细胞培养液A1为含有以下成分的DMEM培养液：
1-100μM的RHO激酶抑制剂Y-27632(C14H21N3O·2HCl)、1-100ng/mL的干细胞因子(SCF)、1-100ng/mL的白细胞介素3(IL3)、1-100ng/mL的白细胞介素6(IL6)、1-100ng/mL的白细胞介素11(IL11)、1-100ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、1-100ng/mL的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、1-100μg/mL的岩藻多糖、1-100μg/mL的葡聚糖硫酸酯、1-100nM的AMD 3100(1,1'-[1,4-亚苯基双(亚甲基)]双[1,4,8,11-四氮杂环十四烷])、1-100μM的M-阿仑膦酸钠(M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE)、1-100μM的氨羟二磷酸二钠、5-30ng/mL的神经生长因子、5-30μM的二甲亚砜(DMSO)；
(3)在37℃和5％的CO2的环境中，将步骤(2)得到的细胞1再于细胞培养液A2中培养3～6天，得到细胞2；所述的细胞培养液A2为含有以下成分的DMEM培养液：
1-100ng/mL的Dkk1蛋白、1-100ng/mL的Noggin蛋白、1-100ng/mL的γ-分泌酶抑制剂DAPT、1-100ng/mL的Sonic hedgehog蛋白(Shh蛋白)、1-100ng/mL的胰岛素样生长因子(IGF)、1-100ng/mL的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子7(CKI-7)、1-100ng/mL的SMAD3抑制剂SB431542、1-100ng/mL的Lefly蛋白、100-1000nmol/L的视黄酸(Retinoic acid)、10-500nmol/L的激活素A(Activin A)、1-100ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、1-100μM的RHO激酶抑制剂Y-27632、5-30ng/mL的白细胞介素3(IL3)、5-30ng/mlL的白细胞介素6(IL6)、5-30ng/mL的神经生长因子(NGF)、1-100ng/mL的干细胞因子(SCF)；
(4)在37℃和5％的CO2的环境中，将步骤(3)得到的细胞2再于细胞培养液A3中培养3～6天，得到细胞3，细胞3即为自体视网膜干细胞；所述的细胞培养液A3为含有以下成分的DMEM培养液：
1-100ng/mL的Dkk1蛋白、1-100ng/mL的Noggin蛋白、1-100ng/mL的γ-分泌酶抑制剂DAPT、1-100ng/mL的Sonic hedgehog蛋白(Shh蛋白)、1-100ng/mL的胰岛素样生长因子(IGF)、1-100ng/mL的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子7(CKI-7)、1-100ng/mL的SMAD3抑制剂SB431542、1-100ng/mL的Lefly蛋白、100-1000nmol/L的视黄酸(Retinoic acid)、10-500nmol/L的激活素A(Activin A)、1-100ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、5-30μM的RHO激酶抑制剂Y-27632、5-30ng/mL的白细胞介素3(IL3)、5-30ng/mlL的白细胞介素6(IL6)、1-100ng/mL的干细胞因子(SCF)、1-100ng/mL的成纤维细胞生长因子2(FGF2)、1-100ng/mL的成纤维细胞生长因子8(FGF8)、1-100ng/mL的表皮生长因子(EGF)、1-100ng/mL的GSK-3α/β抑制剂CHIR、1-100ng/mL的TGFβR-1/ALK5抑制剂RepSox(616452)、1-100ng/mL的FGFR1特异性拮抗剂SU5402、1-100ng/mL的脑源性神经营养因子(BDNF)、1-100ng/mL的神经生长因子(NGF)、1-100ng/mL的神经营养因子-3(NT-3)、1-100ng/mL的血管内皮生长因子(VEGF)、1-100ng/mL的生长因子(GF)。
在一个优选地实施方案中，所述的制备方法包括以下步骤：
(1)将自体来源的体细胞作为原料细胞以2×106-5×106的密度接种于细胞培养皿中；
(2)在37℃和5％的CO2的环境中，将原料细胞在细胞培养液A1中培养3天，得到细胞1；所述的细胞培养液A1为含有以下成分的DMEM培养液：
10μM的RHO激酶抑制剂Y-27632(C14H21N3O·2HCl)、10ng/mL的干细胞因子(SCF)、10ng/mL的白细胞介素3(IL3)、10ng/mL的白细胞介素6(IL6)、10ng/mL的白细胞介素11(IL11)、10ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、10ng/mL的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、10μg/mL的岩藻多糖、10μg/mL的葡聚糖硫酸酯、10nM的AMD 3100(1,1'-[1,4-亚苯基双(亚甲基)]双[1,4,8,11-四氮杂环十四烷])、10μM的M-阿仑膦酸钠(M-ALENDRONATESODIUM TRIHYDRATE)、10μM的氨羟二磷酸二钠、10ng/mL的神经生长因子和10μM的二甲亚砜(DMSO)；
(3)在37℃和5％的CO2的环境中，将步骤(2)得到的细胞1再于细胞培养液A2中培养6天，得到细胞2；所述的细胞培养液A2为含有以下成分的DMEM培养液：
10ng/mL的Dkk1蛋白、10ng/mL的Noggin蛋白、10ng/mL的γ-分泌酶抑制剂DAPT、10ng/mL的Sonic hedgehog蛋白(Shh蛋白)、10ng/mL的胰岛素样生长因子(IGF)、10ng/mL的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子7(CKI-7)、10ng/mL的SMAD3抑制剂SB431542、10ng/mL的Lefly蛋白、500nmol/L的视黄酸(Retinoic acid)、100nmol/L的激活素A(Activin A)、10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、100μM的RHO激酶抑制剂Y-27632、10ng/mL的白细胞介素3(IL3)、10ng/mlL的白细胞介素6(IL6)、10ng/mL的神经生长因子(NGF)和10ng/mL的干细胞因子(SCF)；
(4)在37℃和5％的CO2的环境中，将步骤(3)得到的细胞2再于细胞培养液A3中培养6天，得到细胞3，细胞3即为自体视网膜干细胞；所述的细胞培养液A3为含有以下成分的DMEM培养液：
10ng/mL的Dkk1蛋白、10ng/mL的Noggin蛋白、10ng/mL的γ-分泌酶抑制剂DAPT、10ng/mL的Sonic hedgehog蛋白(Shh蛋白)、10ng/mL的胰岛素样生长因子(IGF)、10ng/mL的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子7(CKI-7)、10ng/mL的SMAD3抑制剂SB431542、10ng/mL的Lefly蛋白、200nmol/L的视黄酸(Retinoic acid)、100nmol/L的激活素A(Activin A)、10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、10μM的RHO激酶抑制剂Y-27632、10ng/mL的白细胞介素3(IL3)、10ng/mlL的白细胞介素6(IL6)、10ng/mL的神经生长因子(NGF)、10ng/mL的干细胞因子(SCF)、10ng/mL的成纤维细胞生长因子2(FGF2)、10ng/mL的成纤维细胞生长因子8(FGF8)、10ng/mL的表皮生长因子(EGF)、10ng/mL的GSK-3α/β抑制剂CHIR、10ng/mL的TGFβR-1/ALK5抑制剂RepSox(616452)、10ng/mL的FGFR1特异性拮抗剂SU5402、10ng/mL的脑源性神经营养因子(BDNF)、10ng/mL的神经营养因子-3(NT-3)、10ng/mL的血管内皮生长因子(VEGF)和10ng/mL的生长因子(GF)。
进一步地，所述的制备方法中，所述的原料细胞包括但不限于人的周围血细胞、脐带血细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、脂肪细胞。
更进一步地，所述的制备方法中，所述的原料细胞包括但不限于通过商业途径得到的非永生化或永生化的人的各种体细胞株，例如周围血液细胞、脐带血细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、脂肪细胞；常规血库保存的各种血液细胞，例如红细胞、白细胞；新鲜分离制备的人的各种体细胞，例如皮肤细胞、血液有核细胞、脂肪细胞。
根据本发明的一个实施方案，由上述制备方法制备得到的自体视网膜干细胞可以通过以下方法进行检测：利用视网膜干细胞的特异细胞表型Rx、Chx10以及Pax6等作为检测指标，采用细胞形态学和细胞特异免疫荧光技术，观测各种视网膜干细胞的生成速度、生成率、生成数量和纯度。
另一个方面，本发明还提供了由上述试剂盒和制备方法制备得到的视网膜干细胞在制备视网膜细胞和视网膜组织工程中的应用。
本发明所述的GSK-3α/β抑制剂CHIR为CHIR99021或CHIR98014。
本发明中所述细胞培养液A1、细胞培养液A2和细胞培养液A3中的涉及到的所有成分可以通过商业途径直接购买，也可以从生物体中提取；其中的蛋白质类成分还可以是通过基因重组技术获得的相应重组蛋白。
和现有技术相比，本发明至少具备以下有益效果：
1、应用人自体血液细胞作为原料细胞制备视网膜干细胞，原料来源更加多样、方便、安全且易获得。
2、本发明研发了一组由各种小分子物质组成的能使人的体细胞逆向分化产生人血源性自体视网膜干细胞的细胞培养液配方，使得视网膜干细胞的制备更加方便易行，且更加容易进行大规模产业化生产。
3、本发明提供的应用小分子物质组成的细胞培养液配方，在不改变人的体细胞染色体DNA序列，不插入任何外来基因或DNA片段的情况下，快速使人的自体血液细胞逆向分化产生人血源性自体视网膜干细胞，更加安全有效。
4、本发明提供的制备方法经放大实验后的生产工艺流程可以被严格地、多次地、系统地进行流式细胞技术检测和免疫细胞化学技术检测，因此，作为自体种子细胞和自体再生修复细胞，本发明还大大具备对自体视网膜干细胞和视网膜细胞进行大规模产业化生产的潜力。
5、与利用基因重组技术的iPS干细胞诱导产生的自体视网膜干细胞相比较，本发明提供了一种在不改变体细胞染色体DNA序列，不插入任何外来基因或DNA片段的情况下，本发明应用多种小分子物质组成的一组细胞培养液配方和制备方法，使血液单个核细胞快速逆向分化，生产人自体视网膜干细胞，这是一种新型技术方法。所生产的人自体视网膜干细胞接近于自然干细胞，且无iPS的致癌风险、生产工艺简单、生产耗时短、安全性高。本发明提供的培养液配方、试剂盒和制备方法技术独创新颖，为解决眼科类疾病治疗领域目前所存在的困难提供了新的思路和途径，并解决了人自体视网膜干细胞的方便快捷的来源困难的问题。
6、与利用胚胎干细胞(ESCs)诱导的异体视网膜干细胞以及脐带血干细胞/间充质干细胞诱导产生的视网膜干细胞技术相比较，本发明提供的细胞培养液、试剂盒和制备方法原料来源更简易方便、生产速度更快、培养时间更短、产量巨大、纯度更高、生产更稳定、污染机率小、不存在异体免疫排斥问题，且制备得到的自体视网膜干细胞生物特性更加稳定。
7、本发明提供的自体视网膜干细胞的制备方法经验证可备工艺放大，相应地生产技术和工艺流程可以被严格地、多次地、系统地全程监控，可以进行规模性生产，具有大规模工业化和产业化生产自体视网膜干细胞和视网膜细胞的潜力。因此，在眼科医学领域，作为眼底自体种子细胞和再生修复细胞、自体组织器官工程和自体视网膜干细胞生产储存库等产业化领域，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是实施例3中的原料细胞以及尤其制备得到的人血源性自体视网膜干细胞的显微视图。
图2是实验例1中人血源性自体视网膜干细胞与一抗以及二抗反应后的荧光照片。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1使人的体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞的一组培养液
包括细胞培养液A1、细胞培养液A2和细胞培养液A3。
在10～100级洁净度的安全操作台里操作，4～10℃的低温条件下配制。
细胞培养液A1的配制：
在500mL DMEM培养液(购自GICO公司)中加入以下成分：
10μM的RHO激酶抑制剂Y-27632(购自Sigma公司)、10ng/mL的干细胞因子(购自R&D公司)、10ng/mL的白细胞介素3(购自R&D公司)、10ng/mL的白细胞介素6(购自R&D公司)、10ng/mL的白细胞介素11(购自R&D公司)、10ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子(购自R&D公司)、10ng/mL的粒细胞集落刺激因子(购自R&D公司)、10μg/mL的岩藻多糖、(购自Sigma公司)10μg/mL的葡聚糖硫酸酯(购自Sigma公司)、10nM的AMD 3100(购自Sigma公司)、10μM的M-阿仑膦酸钠(购自Sigma公司)、10μM的氨羟二磷酸二钠(购自Sigma公司)、10ng/mL的神经生长因子(购自R&D公司)和10μM的二甲亚砜(购自Sigma公司)；充分溶解，然后经0.22微米孔径的滤器过滤、消毒，配制成细胞培养液A1。
细胞培养液A2的配制：
在500mL DMEM培养液(购自GICO公司)中加入以下成分：
10ng/mL的Dkk1蛋白(购自R&D公司)、10ng/mL的Noggin蛋白(购自R&D公司)、10ng/mL的γ-分泌酶抑制剂DAPT(购自R&D公司)、10ng/mL的Sonic hedgehog蛋白(购自R&D公司)、10ng/mL的胰岛素样生长因子(购自R&D公司)、10ng/mL的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子7(购自Sigma公司)、10ng/mL的SMAD3抑制剂SB431542(购自Sigma公司)、10ng/mL的Lefly蛋白(购自R&D公司)、500nmol/L的视黄酸(购自Sigma公司)、100nmol/L的激活素A(购自R&D公司)、10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(购自R&D公司)、100μM的RHO激酶抑制剂Y-27632(购自Sigma公司)、10ng/mL的白细胞介素3(购自R&D公司)、10ng/mlL的白细胞介素6(购自R&D公司)、10ng/mL的神经生长因子(购自R&D公司)和10ng/mL的干细胞因子(购自R&D公司)；充分溶解，然后经0.22微米孔径的滤器过滤、消毒，配制成细胞培养液A2。
细胞培养液A3的配制：
在500mL DMEM培养液中加入以下成分：
10ng/mL的Dkk1蛋白(购自R&D公司)、10ng/mL的Noggin蛋白(购自R&D公司)、10ng/mL的γ-分泌酶抑制剂DAPT(购自R&D公司)、10ng/mL的Sonic hedgehog蛋白(购自R&D公司)、10ng/mL的胰岛素样生长因子(购自R&D公司)、10ng/mL的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子7(购自Sigma公司)、10ng/mL的SMAD3抑制剂SB431542(购自Sigma公司)、10ng/mL的Lefly蛋白(购自R&D公司)、200nmol/L的视黄酸(购自Sigma公司)、100nmol/L的激活素A(购自R&D公司)、10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(购自R&D公司)、10μM的RHO激酶抑制剂Y-27632(购自Sigma公司)、10ng/mL的白细胞介素3(购自R&D公司)、10ng/mlL的白细胞介素6(购自R&D公司)、10ng/mL的神经生长因子(购自R&D公司)、10ng/mL的干细胞因子(购自R&D公司)、10ng/mL的成纤维细胞生长因子2(购自R&D公司)、10ng/mL的成纤维细胞生长因子8(购自R&D公司)、10ng/mL的表皮生长因子(购自R&D公司)、10ng/mL的GSK-3α/β抑制剂CHIR(购自Sigma公司)、10ng/mL的TGFβR-1/ALK5抑制剂RepSox(购自R&D公司)、10ng/mL的FGFR1特异性拮抗剂SU5402(购自Sigma公司)、10ng/mL的脑源性神经营养因子(购自R&D公司)；10ng/mL的神经营养因子-3(购自R&D公司)、10ng/mL的血管内皮生长因子(购自R&D公司)和10ng/mL的生长因子(购自R&D公司)；充分溶解，然后经0.22微米孔径的滤器过滤、消毒，配制成细胞培养液A3。
实施例2用于制备自体视网膜干细胞的试剂盒
包括实施例1中的细胞培养液A1、细胞培养液A2、细胞培养液A3；还包括人的体细胞。
实施例3采用周围静脉血制备视网膜干细胞的方法
1、血液样本来源：无菌采集由科研工作人员捐赠的周围静脉血。采集周围静脉血前应征得供血本人或直系亲属的同意，并记录供血本人及家庭的遗传和传染病史以及医院所有相关的病毒检查结果。
2、分离单个核细胞：血液样本采用Ficoll标准分离技术分离单个核细胞，作为原料细胞，原料细胞的显微视图如图1-A所示。
3、视网膜干细胞的制备：
采用实施例1制备的细胞培养液A1、细胞培养液A2和细胞培养液A3；
将获得的单个核细胞以5x106的密度，用细胞培养液A1，在37℃和5％的CO2培养箱中培养3天，得到细胞1；然后换用细胞培养液A2，对细胞1以5x106的密度在37℃和5％的CO2培养箱进行培养3-6天，得到细胞2；然后换用细胞培养液A3，对细胞2以5x106的密度在37℃和5％的CO2培养箱进行培养3-6天，得到细胞3，细胞3即为人血源性自体视网膜干细胞，其显微视图如图1-B和图1-C所示；轻轻吹打细胞3，使细胞3完全悬浮后，收集细胞3于离心管中，进行离心操作，然后使用生理盐水对悬浮的细胞3进行清洗操作，重复清洗操作3次后，将细胞3悬浮于生理盐水中。
实验例1血源性自体视网膜干细胞的检测
利用视网膜干细胞的特异细胞表型(Rx、Chx10和Pax6)、色素上皮干细胞的特异细胞表型(Mitf)等作为检测指标，采用细胞免疫荧光技术检测实施例3制备的血源性自体视网膜干细胞的阳性率、生成速度、生成率、生成数量和纯度
免疫荧光检测方法：
将实施例3制备的血源性自体视网膜干细胞涂于聚-D-赖氨酸的载玻片上，用细胞制片离心机在1800RCF下转动抛片2分钟制成细胞玻片并做好标记，将细胞玻片晾干后存放于-20℃冰箱中冻存；从-20℃冰箱中取出细胞玻片在室温晾干，在反面用记号笔划定区域。然后使用4％多聚甲醛固定，经过0.1％的Triton X-100打孔5分钟以及磷酸盐缓冲液(PBS，pH值为7.4)的清洗后，使用10％正常山羊血清在室温的条件下封闭1小时，得到样品；将第一抗体试剂加入样品中，所使用的第一抗体为兔抗人DDX4/Pax6多克隆抗体(1:100稀释)，在4℃的条件下使样品中的抗原与第一抗体反应12小时(过夜)；然后在使用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗样品后，将与第一抗体相对应的第二抗体加入到样品中，第二抗体为FITC标记标记的羊抗兔IgG(1:200稀释)使样品中的第一抗体与第二抗体反应1小时；在室温的条件下使用DAPI(1:1000)进行染核步骤。在使用磷酸盐缓冲液PBS清洗后，对样品进行封片剂封片操作，所使用封边剂为甘油/PBS封片剂(甘油：PBS＝1：9，pH8.0-8.5)。最后使用倒置荧光显微镜观察拍照，在6-8小时内完成各种拍照。
图2示出了实施例3制得的血源性自体视网膜干细胞在与一抗(兔抗人DDX4/Pax6单克隆抗体)及二抗(FITC标记标记的羊抗兔IgG)反应后，可以在荧光显微镜观察到荧光部分，从而说明实施例3中所制得的细胞确系视网膜干细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.使人体的单个核细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞的一组培养液，其特征在于：所述的 一组培养液包括细胞培养液A1、细胞培养液A2和细胞培养液A3；
所述的细胞培养液A1、细胞培养液A2和细胞培养液A3在10～100级洁净度的安全操作台里操作，4～10℃的低温条件下配制；
细胞培养液A1的配制：
在500mL DMEM培养液中加入以下成分：
10μM的RHO激酶抑制剂Y-27632、10ng/mL的干细胞因子、10ng/mL的白细胞介素3、10ng/mL的白细胞介素6、 10ng/mL的白细胞介素11、10ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子、10ng/mL的粒细胞集落刺激因子、10μg/mL的岩藻多糖、10μg/mL的葡聚糖硫酸酯、10nM的AMD 3100、10μM的 M-阿仑膦酸钠、10μM的氨羟二磷酸二钠、10ng/mL的神经 生长因子和10μM的二甲亚砜；充分溶解，然后经0.22微米 孔径的滤器过滤、消毒，配制成细胞培养液A1；
细胞培养液A2的配制：
在500mL DMEM培养液中加入以下成分：
10ng/mL的Dkk1蛋白、10ng/mL的Noggin蛋白、10ng/ mL的γ-分泌酶抑制剂DAPT、10ng/mL的Sonic hedgehog蛋白、10ng/mL的胰岛素样生长因子、10ng/mL的细胞周期蛋白依赖性激酶抑 制因子7、10ng/mL的SMAD3抑制剂SB431542、10ng/mL的 Lefly蛋白、500nmol/L的视黄酸、100nmol/L的激活素A、10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、100μM的RHO激酶抑制剂Y-27632、10ng/mL的白细胞介素3、10ng/mL的白细胞介素 6、10ng/mL的神经生长因子和10ng/mL的干细胞因子；充分溶解，然后经0.22微米孔径的滤器过滤、消毒，配制成细胞培养液A2；
细胞培养液A3的配制：
在500mL DMEM培养液中加入以下成分：
10ng/mL的Dkk1蛋白、10ng/mL的Noggin蛋白、10ng/ mL的γ-分泌酶抑制剂DAPT、10ng/mL的Sonic hedgehog蛋白、10ng/mL的胰岛素样生长因子、10ng/mL的细胞周期蛋白依赖性激酶抑 制因子7、10ng/mL的SMAD3抑制剂SB431542、10ng/mL的 Lefly蛋白、200nmol/L的视黄酸、100nmol/L的激活素A、10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、10μM的RHO激酶抑制剂Y-27632、10ng/mL的白细胞介素3、10ng/mL的白细胞介素6、10ng/mL的神经生长因子、10ng/mL的干细胞因子、10ng/mL的成纤维细胞生长因子2、10ng/mL的成纤维细胞生长因子8、10ng/mL的表皮生长因子、10ng/mL的GSK-3α/β抑制剂CHIR、10ng/mL的TGFβR-1/ALK5抑制剂RepSox、10ng/mL的FGFR1 特异性拮抗剂SU5402、10ng/mL的脑源性神经营养因子； 10ng/mL的神经营养因子-3、10ng/mL的血管内皮生长因子和 10ng/mL的生长因子；充分溶解，然后经0.22微米孔径的滤器过滤、消毒，配 制成细胞培养液A3。
2.一种用于制备自体视网膜干细胞的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括权利要求1所述的一组培养液。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括人体的单个核细胞。
4.权利要求1所述的一组培养液和权利要求2-3任意一项所述的试剂盒在制备用于治疗涉及视网膜再生再造和修复的疾病的药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的涉及视网膜再生再造和修复的疾病为视 网膜组织和器官的病理损害、创伤坏死和各种退行性病 变。
6.一种使人体的单个核细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞的制备方法，其特征在于：所述 的制备方法包括以下步骤：
(1)将自体来源的人体单个核细胞作为原料细胞以2×106-5×106的密度接种于细胞培养皿中；
(2)在37℃和5％的CO2的环境中，将原料细胞在细胞培养液A1中培养3天，得到细胞1；所述的细胞培养液A1为含有以下成分的DMEM培养液：
10μM的RHO激酶抑制剂Y-27632、10ng/mL的干细胞因子、10ng/mL的白细胞介素3、10ng/mL的白细胞介素6、 10ng/mL的白细胞介素11、10ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子、10ng/mL的粒细胞集落刺激因子、10μg/mL的岩藻多糖、10μg/mL的葡聚糖硫酸酯、10nM的AMD 3100、10μM的 M-阿仑膦酸钠、10μM的氨羟二磷酸二钠、10ng/mL的神经 生长因子和10μM的二甲亚砜
(3)在37℃和5％的CO2的环境中，将步骤(2)得到的细胞1再于细胞培养液A2中培养3～6天，得到细胞2；所述的细胞培养液A2为含有以下成分的DMEM培养液：
10ng/mL的Dkk1蛋白、10ng/mL的Noggin蛋白、10ng/ mL的γ-分泌酶抑制剂DAPT、10ng/mL的Sonic hedgehog蛋白、10ng/mL的胰岛素样生长因子、10ng/mL的细胞周期蛋白依赖性激酶抑 制因子7、10ng/mL的SMAD3抑制剂SB431542、10ng/mL的 Lefly蛋白、500nmol/L的视黄酸、100nmol/L的激活素A、10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、100μM的RHO激酶抑制剂Y-27632、10ng/mL的白细胞介素3、10ng/mL的白细胞介素 6、10ng/mL的神经生长因子和10ng/mL的干细胞因子；
(4)在37℃和5％的CO2的环境中，将步骤(3)得到的细胞2再于细胞培养液A3中培养3～6天，得到细胞3，细胞3即为自体视网膜干细胞；所述的细胞培养液A3为含有以下成分的DMEM培养液：
10ng/mL的Dkk1蛋白、10ng/mL的Noggin蛋白、10ng/ mL的γ-分泌酶抑制剂DAPT、10ng/mL的Sonic hedgehog蛋白、10ng/mL的胰岛素样生长因子、10ng/mL的细胞周期蛋白依赖性激酶抑 制因子7、10ng/mL的SMAD3抑制剂SB431542、10ng/mL的 Lefly蛋白、200nmol/L的视黄酸、100nmol/L的激活素A、10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、10μM的RHO激酶抑制剂Y-27632、10ng/mL的白细胞介素3、10ng/mL的白细胞介素6、10ng/mL的神经生长因子、10ng/mL的干细胞因子、10ng/mL的成纤维细胞生长因子2、10ng/mL的成纤维细胞生长因子8、10ng/mL的表皮生长因子、10ng/mL的GSK-3α/β抑制剂CHIR、10ng/mL的TGFβR-1/ALK5抑制剂RepSox、10ng/mL的FGFR1 特异性拮抗剂SU5402、10ng/mL的脑源性神经营养因子； 10ng/mL的神经营养因子-3、10ng/mL的血管内皮生长因子和 10ng/mL的生长因子。
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