CN115478052B - 一种人单核前体细胞体外分离培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单核前体细胞的培养方法，通过加入CHIR99021和SCF等分子从人和其他动物的血液中分离培养出一群单核前体细胞。在该体系中，单核前体细胞可以大量扩增，纯度很高，并在合适的分化培养条件下能够有效地分化成巨噬细胞和树突状细胞等免疫细胞，可以满足大多数的试验和临床需要，应用前景广阔。本发明条件培养的前体细胞可以有效地分化成巨噬细胞和树突状细胞，建立单核前体细胞的体外生长的培养条件，为得到大量的巨噬细胞和树突状细胞奠定了基础，有利于未来肿瘤免疫的发展应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种人单核前体细胞体外分离培养的方法。
背景技术
单核细胞是血液中最大的血细胞，也是体积最大的白细胞，占外周血白细胞数量的3％～8％。单核细胞可以分化为巨噬细胞和树突状细胞。巨噬细胞能够参与固有免疫反应、分泌细胞因子、清除多种病原体，对建立有效的免疫应答具有重要作用，特别是CAR与巨噬细胞的结合，为治疗实体瘤开辟了新的可能性；树突状细胞具有强大的抗原提呈功能，能够启动和调节适应性免疫应答，是感染及肿瘤免疫领域的重要研究对象。但要达到预期的效果还需要克服许多问题，首先是细胞数量的限制，无论是在体外还是在体内注射后，巨噬细胞和树突状细胞的增殖能力很差，甚至不会增殖，有限的细胞数量严重影响了治疗效果，制约了免疫细胞的基础研究和临床转化应用。
发明内容
为解决现有技术中单核细胞的培养增殖问题，本发明提供了一种新型人单核前体细胞体外分离培养的方法，以期提供一种新型免疫细胞在体外建立的方法。本发明在含有DMEM的基础培养基中，通过添加CHIR99021和SCF等小分子，得到培养条件可以用于分离血液样本中单核细胞的前体细胞的分离，并且在此条件下的前体细胞可以很好地在体外进行扩增，维持稳定的状态，表型不发生变化。这些体外培养的单核前体细胞为得到大量的巨噬细胞和树突状细胞奠定了基础，有利于未来肿瘤免疫的发展。
首先，本发明提供了一种人单核前体细胞体外分离培养液，命名为KD-CCM培养液，其包含DMEM基础培养基，还含有CHIR99021、SCF、IL3。
进一步的，所述培养液还包含转铁蛋白、胰岛素、人血清白蛋白、维生素E。
优选的，所述培养液包含480-540ml高糖DMEM、26-32μg/mL转铁蛋白、3-6μg/mL胰岛素、1-3mg/mL人血清白蛋白、1-3μg/mL维生素E、18-24ng/mL SCF、8-12ng/ml IL3和2-4μMCHIR99021；更佳的，所述培养液包含500ml高糖DMEM、30μg/mL转铁蛋白、5μg/mL胰岛素、2mg/mL人血清白蛋白、2μg/mL维生素E、20ng/mL SCF、10ng/ml IL3和3μM CHIR99021。
CHIR99021可以特异性抑制糖原合成激酶3(GSK-3α/β)的活性，是一种有效的药理性的Wnt/beta-catenin信号通路的激活剂。前期有研究发现CHIR99021能通过够促进胚胎干细胞的自我更新。
SCF，即Stem cell factor，干细胞生长因子，可结合到c-Kit受体上，它可作为跨膜蛋白和可溶性蛋白存在，在造血(血细胞生成)、精子发生和黑素生成中起重要作用。
IL3，即白介素3，是白细胞介素家族重要成员之一，由T淋巴细胞所产生，能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能。
在CHIR99021和SCF等小分子存在的培养体系中，我们发现在该条件可以用于血液制品中单核细胞的前体细胞的分离，并且在此条件下的前体细胞可以很好地在体外进行扩增，维持稳定的状态，表型不发生变化。建立单核前体细胞的体外生长的培养条件，为得到大量的巨噬细胞和树突状细胞奠定了基础，有利于未来肿瘤免疫的发展应用。
另一方面，本发明还提供了一种人单核前体细胞体外分离培养的方法，采用上述所述的培养液进行分离培养，培养方法如下：
(1)将血液、Ficoll-PaqueTM PLUS淋巴细胞分离液和DPBS洗涤液在室温预热，在30-40℃水浴中预热KD-CCM培养液；
(2)按照1：1的体积比将DPBS洗涤液和外周血混合，
(3)吸取15ml Ficoll-PaqueTM PLUS液体，对准SepMateTM管的中央的孔加入；
(4)保持SepMateTM管垂直状态，用移液管吸取稀释过的血液样本，沿着管内壁加入；
(5)室温下1200g离心20分钟；
(6)将上层含有的单核细胞倒入新的管中；
(7)室温下以300g离心10分钟；若沉淀的细胞团块是红色的，加入氯化铵红细胞裂解液，彻底混匀细胞，以裂解红细胞；
(8)室温下300g离心10分钟；用DPBS洗涤富集的单核细胞沉淀；
(9)将单核细胞重悬于10毫升KD-CCM培养液中，之后取20μL并与4％台盼蓝溶液按1：1体积比充分混匀，取10μL混合液置于红细胞计数板上，计数活细胞；
(10)根据计数结果，按照1～2×106个/ml的活细胞密度将细胞接种于细胞培养瓶中，此瓶中含有提前预热的KD-CCM培养液；
(11)将含有细胞的培养瓶置于37℃、含5％二氧化碳的温室培养箱中；每天仔细观察细胞的生长情况，约第4～5天时可以看到一群单核细胞前体细胞，细胞较大而亮，边界清楚；
(12)每2至3天更换一次新鲜的KD-CCM培养液；当细胞增殖达70～80％时，用移液器轻轻吹起细胞，收集于15ml离心管中，300g室温离心5分钟，弃上清，再加入1ml新鲜KD-CCM培养液吹散细胞，取20μL进行细胞计数；根据计数结果，将细胞密度稀释至5×105个/ml，接种于新的培养瓶中，置于37℃、含5％二氧化碳的培养箱中继续培养，完成传代；一周后，按照以上方法继续收集细胞，继续培养传代。
收集细胞进行分化或用于后续的基因编辑试验，或将细胞冻存，方法为：用CS10冻存液(品牌：STEMCELL Technologies；货号：07959)将细胞密度调整为1×107个/ml，置于冻存管中，放于-80℃低温冰箱中，后放入-196℃液氮中长期保存细胞。
本发明有效地在体外建立了一种单核前体细胞的培养方法，通过加入CHIR99021和SCF等分子从人和其他动物的血液中分离培养出一群单核前体细胞。在该体系中，单核前体细胞可以大量扩增，纯度高，并在合适的分化培养条件下能够有效地分化成巨噬细胞和树突状细胞等免疫细胞，可以满足大多数的试验和临床需要，应用前景广阔。
本发明具有如下优点：
(1)在DMEM基础培养基中，添加3μΜ CHIR99021和20ng/mL SCF等小分子来维持单核前体细胞的稳定生长。该条件下细胞正常生长，连续传代后，表型可以维持在一定的状态。
(2)与其它单核细胞的培养方法不同，本发明使用了新的培养条件，分离出来的细胞稳定性高，能够连续进行传代，且表型不发生变化。
(3)本发明建立的单核前体细胞可以为研究免疫细胞的发育以及进行肿瘤免疫治疗等开辟新的途径。
(4)该方法可能适用于多种哺乳动物单核前体细胞的分离培养，如人、鼠和猴子等。
附图说明
图1所示为从外周血分离培养的单核前体细胞，在KD-CCM培养液中培养，一周后在倒置显微镜下观察细胞形态，细胞呈集落式生长，且在该条件下可以连续传代培养。图中，那些聚集成团的细胞即为单核前体细胞。
图2所示为由KD-CCM培养基培养的细胞，经M-CSF诱导产生的细胞，荧光实时定量PCR分析CD11b的表达，以及经GM-CSF和IL4诱导产生的细胞，荧光实时定量PCR分析Cd11c的表达。
具体实施方式
下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。
实施例1
[1]按需采集外周血(由健康志愿者提供)装在抗凝管内，4℃保温箱运输至实验室；
[2]将采集的外周血液、Ficoll-PaqueTM PLUS淋巴细胞分离液(品牌：GE；货号：17-1440-02)和DPBS洗涤液在室温预热20分钟。同时，在37℃水浴中预热KD-CCM细胞培养液，成份主要包括：500ml高糖DMEM(GIBCO,货号:12800017)，分别添加终浓度30μg/mL转铁蛋白(Sigma-Aldrich)、5μg/mL胰岛素(Sigma-Aldrich)、2mg/mL人血清白蛋白(Sigma-Aldrich)、2μg/mL维生素E(Sigma-Aldrich)、20ng/mL SCF(Peprotech)、10ng/ml IL3(Peprotech)和3μM CHIR99021(Sigma-Aldrich)；我们将此培养基命名为：KD-CCM培养液(注：培养液的配制和以下的细胞培养操作需要严格无菌操作)；
[3]按照1：1的体积比将DPBS和外周血混合，以稀释样品；
[4]吸取15ml Ficoll-PaqueTM PLUS液体，对准SepMateTM管(品牌：STEMCELLTechnologies；货号：85450)的中央的孔，小心加入；
[5]保持SepMateTM管垂直状态，用移液管吸取稀释过的血液样本，沿着管内壁加入，样本将和密度梯度溶液Ficoll-PaqueTM PLUS在隔离层上面混合；
[6]室温下1200g离心20分钟；
[7]将上层含有的单核细胞倒入新的管中；
[8]以300g室温下离心10分钟；若沉淀的细胞团块是红色的，加入氯化铵红细胞裂解液(品牌：STEMCELL Technologies；货号：07850)，彻底混匀细胞，以裂解红细胞；
[9]室温下300g离心10分钟；
[10]用DPBS洗涤富集的单核细胞沉淀；
[11]注：以300g室温下离心10分钟，建议离心机的刹车可以打开
[12]将细胞重悬于10毫升KD-CCM培养液中，取20μL与0.4％台盼蓝溶液(Sigma-Aldrich)按1：1体积比充分混匀，取10μL混合液置于红细胞计数板上，计数活细胞；
[13]根据计数结果，按照1～2×106个/ml的活细胞密度将细胞接种于细胞培养瓶中，此瓶中含有提前预热的KD-CCM培养液；
[14]将含有细胞的培养瓶置于37℃，含5％二氧化碳的温室培养箱中；
[15]每天仔细观察细胞的生长情况，约第4～5天时可以看到一群单核细胞前体细胞，细胞较大而亮，边界清楚；
[16]每2至3天更换一次新鲜的KD-CCM培养液；
[17]当细胞增殖达70～80％时，用移液器轻轻吹起细胞，收集于15ml离心管中，300g室温离心5分钟，弃上清，再加入1ml新鲜KD-CCM培养基吹散细胞，取20μL进行细胞计数；
[18]根据计数结果，将细胞密度稀释至5×105个/ml，接种于新的培养瓶中，置于37℃，含5％二氧化碳的培养箱中继续培养，完成传代；
一周后，按照以上方法继续收集细胞，继续培养传代，或用于后续的基因编辑试验，或将细胞冻存，方法为：用CS10冻存液(品牌：STEMCELL Technologies；货号：07959)将细胞密度调整为1×107个/ml，置于冻存管中，放于-80℃低温冰箱中，后放入-196℃液氮中长期保存细胞。
细胞形态学观察：
使用Leica DMIL倒置显微镜分别对上述[1]-[19]培养条件下的细胞进行观察，结果发现当培养条件加入3μΜCHIR99021和20ng/mL SCF等小分子时，能够有效地从血液样本中分离出一种单核细胞前体细胞，表型可以在体外稳定维持，并大量扩增。如图1所示，在倒置显微镜下观察细胞形态，细胞呈集落式生长，且在该条件下可以连续传代培养，并在合适的分化培养条件下能够有效地分化成巨噬细胞和树突状细胞等免疫细胞。图中，那些聚集成团的细胞即为单核前体细胞。当此细胞用终浓度为20ng/ml Human M-CSF(Peprotech)诱导6天后，巨噬细胞的标志性基因CD11b的表达显著上调(见图2A)；当用终浓度为750U/ml的Human GM-CSF(Peprotech)和870U/ml的Human IL4(Peprotech)联合处理，7天后树突状细胞的标志基因CD11c的表达被诱导(见图2B)。
应当说明的是，本发明的上述所述之技术内容仅为使本领域技术人员能够获知本发明技术实质而进行的解释与阐明，故所述之技术内容并非用以限制本发明的实质保护范围。本发明的实质保护范围应以权利要求书所述之为准。本领域技术人员应当知晓，凡基于本发明的实质精神所作出的任何修改、等同替换和改进等，均应在本发明的实质保护范围之内。
Claims (7)
1.一种人单核前体细胞体外分离培养液，命名为KD-CCM培养液，其组成为：480-540ml高糖DMEM、26-32 µg/mL转铁蛋白、3-6 µg/mL 胰岛素、1-3 mg/mL 人血清白蛋白、1-3 µg/mL维生素E、18-24 ng/mL SCF、8-12 ng/ml IL3和2-4 μM CHIR99021。
2. 如权利要求1所述的培养液，其特征在于，其组成为：500ml 高糖DMEM、30 µg/mL转铁蛋白、5 µg/mL 胰岛素、2 mg/mL 人血清白蛋白、2 µg/mL维生素E、20 ng/mL SCF、10 ng/ml IL3和3 μM CHIR99021。
3.一种人单核前体细胞体外分离培养的方法，采用权利要求1-2任一项所述的培养液进行分离培养。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，包括下述步骤：
（1）将DPBS洗涤液和血液按照1：1的体积比进行混合以稀释血液样本；
（2）吸取10-20ml Ficoll-Paque™ PLUS淋巴细胞分离液，对准SepMate™ 管的中央的孔加入；保持SepMate™管垂直状态，用移液管吸取稀释过的血液样本，沿着管内壁加入；
（3）于室温1000g-1500g的离心力下离心10-30分钟，然后将上层溶液倒入新的离心管中；（4）再于室温100-500g离心力下离心6-15分钟；
（5）用DPBS洗涤液洗涤富集的单核细胞沉淀，并将单核细胞重悬于6-15毫升KD-CCM培养液中，之后取10-30 μL并与 4%台盼蓝溶液按1：1体积比充分混匀，取6-12 μL混合液置于红细胞计数板上，计数活细胞；
（6）根据计数结果，按照（1~2）×106个/ml的活细胞密度将细胞接种于细胞培养瓶中，此瓶中含有提前预热的KD-CCM培养液；
（7）将含有细胞的培养瓶置于37℃、含5%二氧化碳的温室培养箱中，观察细胞生长情况；
（8）每2至3天更换一次新鲜的KD-CCM培养液；当细胞增殖达70~80%时，用移液器轻轻吹起细胞，收集于离心管中，200-500g离心力下室温离心3-6分钟，弃上清，再加入1-2ml新鲜KD-CCM培养液吹散细胞，取10-30 μL进行细胞计数；根据计数结果，将细胞密度以KD-CCM培养液稀释至（4.8-5.2）×105个/ml，接种于新的培养瓶中，置于37℃、含5%二氧化碳的培养箱中继续培养，完成传代；一周后，按照以上方法继续收集细胞，继续培养传代。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）之前，将血液、Ficoll-Paque™PLUS淋巴细胞分离液和DPBS洗涤液在室温预热，将KD-CCM培养液在30-40℃水浴中预热。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，若沉淀的细胞团块是红色的，加入氯化铵红细胞裂解液，彻底混匀细胞，以裂解红细胞。
7.如权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，包括下述步骤：
（1）将血液、Ficoll-Paque™ PLUS淋巴细胞分离液和DPBS洗涤液在室温预热，在30-40℃水浴中预热KD-CCM培养液；
（2）按照1：1的体积比将DPBS洗涤液和血液混合；
（3）吸取15ml Ficoll-Paque™ PLUS淋巴细胞分离液，对准SepMate™ 管的中央的孔加入；
（4）保持SepMate™管垂直状态，用移液管吸取稀释过的血液样本，沿着管内壁加入；
（5）室温下1200g离心力离心20分钟；
（6）将上层溶液倒入新的离心管中；
（7）室温下以300g离心力离心10分钟；
（8）用DPBS洗涤液洗涤富集的单核细胞沉淀；
（9）将单核细胞重悬于10毫升KD-CCM培养液中，之后取20 μL并与 4%台盼蓝溶液按1：1体积比充分混匀，取10 μL混合液置于红细胞计数板上，计数活细胞；
（10）根据计数结果，按照（1~2）×106个/ml的活细胞密度将细胞接种于细胞培养瓶中，此瓶中含有提前预热的KD-CCM培养液；
（11）将含有细胞的培养瓶置于37℃、含5%二氧化碳的温室培养箱中；每天仔细观察细胞的生长情况，第4~5天时可以看到一群单核细胞前体细胞，细胞较大而亮，边界清楚；
（12）每2至3天更换一次新鲜的KD-CCM培养液；当细胞增殖达70~80%时，用移液器轻轻吹起细胞，收集于15ml离心管中，300g离心力下室温离心5分钟，弃上清，再加入1ml新鲜KD-CCM培养液吹散细胞，取20 μL进行细胞计数；根据计数结果，将细胞密度稀释至5×105个/ml，接种于新的培养瓶中，置于37℃、含5%二氧化碳的培养箱中继续培养，完成传代；一周后，按照以上方法继续收集细胞，继续培养传代。
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