CN102604886A - 使人的体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞和自体视网膜细胞的方法、试剂盒及用途 - Google Patents

使人的体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞和自体视网膜细胞的方法、试剂盒及用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种使人的体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞和自体视网膜细胞的方法，所述方法包括：采用含有不同植物提取物和蛋白成分的培养液分步骤培养人的体细胞，从而使所述体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞，及继续产生多种自体视网膜细胞。本发明在2-3周内即可产生数百亿的第1代自体视网膜干细胞。这种植物和蛋白诱导性人自体视网膜干细胞具有与人自然视网膜干细胞类似的细胞特异表型和多种细胞分化能力，该自体视网膜干细胞及自体视网膜细胞不仅对视网膜色素变性等疾病治疗领域有良好的应用前景，而且在再生医学、自体组织器官工程领域具有良好的潜在应用前景，并具有大规模工业化和产业化生产自体视网膜干细胞和视网膜细胞的可能性。

Description

使人的体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞和自体视网膜细胞的方法、试剂盒及用途
技术领域
本发明涉及领域属于生物医学技术领域，具体而言，本发明涉及一种使人的体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞及自体视网膜细胞的细胞培养方法和应用。 
背景技术
随着医学科学的进步、诊疗手段的不断提高，感染性眼病和白内障等致盲性眼病已得到有效的诊治，与此同时、视网膜变性疾病的发病率和致盲率却有上升的趋势，成为世界范围内的主要致盲眼病之一，目前其治疗不仅是眼科学也是神经科学研究的热点和难点。 
虽然近十几年来，国内外曾有学者采用视网膜移植、基因疗法、药物、细胞因子以及人工视觉等多方面对视网膜变性疾病的治疗进行尝试，并取得了很大进展，但至今尚未能在临床上得到推广应用，其原因是感光细胞再生和视功能重建的问题未能得到根本解决。 
直到最近，近年兴起的干细胞研究为治疗该类疾病提供了新思路。科学家不但已经利用胚胎干细胞成功恢复视网膜变性小鼠的视力，重建该动物模型的视网膜。而且采用由人胚胎干细胞分化的异体视网膜干细胞也已经成功恢复视网膜色素变性患者的视力；但是因为长期疗效和安全性问题不能临床推广。因此如何快速获得大量高纯度并具高度分化潜能的自体视网膜干细胞是眼科学及生物学家面临的重大挑战。 
近年来，应用基因重组技术已经证明，体细胞可以被重新编码而逆向分化，产生被称为诱导性自体多能干细胞(iPS干细胞)，为自体干细胞的生产技术提供了新的途经。 
体细胞是干细胞顺向分化产生的，具有某些具体功能的子代细胞。体细胞的染色体DNA和干细胞的染色体DNA在基因结构和基因的数量上并不存在差异。体细胞和干细胞之间的最主要的差别可能只是某些功能基因处于不同的活性表达状态。功能基因表达的差异决定了细胞的具体功能和形态的差异。我们推测， 干细胞向体细胞顺向分化的程序启动后，干细胞本身的干细胞特性决定基因的开关就被关闭，随后，干细胞就分化形成了具有某种特定功能的体细胞；换句话说，在体细胞染色体DNA序列中仍然存在视网膜干细胞特性决定基因，例如Pax6、Rx、Mitf、Chx10，这些基因只是处于关闭或静止状态。利用某些物质打开体细胞DNA序列中的视网膜干细胞特性决定基因Pax6、Rx、Mitf、Chx10等开关，这些体细胞就可能重新逆向分化而形成新的视网膜干细胞，进而分化形成自体视网膜细胞。 
在本项发明中，从血液单个核细胞等人的体细胞逆向分化，数周内即可产生百亿数量级别的第一代自体视网膜干细胞，不仅为多种眼科疾病的治疗提供了一种新的独特的多能干细胞，而且对视网膜组织器官工程和自体视网膜干细胞生产的产业化发展提供了良好基础。 
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：研发一种新的人的体细胞逆向分化调控技术，在不改变人的体细胞染色体DNA序列，不插入任何外来基因或DNA片段的情况下，应用含有某些植物提取物和蛋白的一系列配方，在体外重新激活体细胞DNA序列中的视网膜干细胞特性决定基因开关，使这些体细胞重新逆向分化而形成新的视网膜干细胞和自体视网膜细胞。 
为了解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供使人的体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞的方法。本发明的另一个目的是提供采用该自体视网膜干细胞产生自体视网膜细胞的方法。本发明的又一个目的是提供通过上述方法获得的自体视网膜干细胞和自体视网膜细胞，以及其在制备治疗多种疾病的药物中的应用。本发明的再一个目的是提供在上述方法中所采用的含有植物提取物和蛋白的多种细胞培养液以及该培养液的应用。此外，本发明还提供相应的用于制备自体视网膜干细胞和自体视网膜细胞的试剂盒。 
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 
一方面，本发明提供一种使人的体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞的方法，所述方法包括： 
将人的体细胞在细胞培养液D1中培养72小时，所述细胞培养液D1为DMEM、并含有枸杞子提取物1-100mg/ml、菊花提取物1-100mg/ml、Y-276325-30μM、白细胞介素3(IL3)5-30ng/ml、白细胞介素6(IL6)5-30ng/ml、神经生长 因子1-100ng/ml、二甲亚砜(DMSO)5-30μM；然后换用细胞培养液D2培养9-15天，所述细胞培养液D2为DMEM、并含有枸杞子提取物1-100mg/ml、菊花提取物1-100mg/ml、水蛭提取物1-100mg/ml、Y-27632 5-30μM、白细胞介素3(IL3)5-30ng/ml、白细胞介素6(IL6)5-30ng/ml、神经生长因子5-30ng/ml、Dkk-15-30ng/ml、Lefty-A 5-30ng/ml；再换用细胞培养液D3继续培养10-20天，所述细胞培养液D3为DMEM、并含有枸杞子提取物1-100mg/ml、菊花提取物1-100mg/ml、水蛭提取物1-100mg/ml、Y-27632 5-30μM、B27 2％(v/v)、白细胞介素3(IL3)5-30ng/ml、白细胞介素6(IL6)5-30ng/ml、神经生长因子5-30ng/ml、Dkk-15-30ng/ml、Lefty-A 5-30ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)5-30ng/ml、血管内皮生长因子5-30ng/ml、生长因子2 5-30ng/ml从而获得植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞。 
优选地，在5％CO2和37℃条件下进行细胞培养。 
在上述方法中，所述人的体细胞包括但不限于人的周围血液细胞、脐带血细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、脂肪细胞。优选地，在将人的体细胞以细胞培养液D1培养之前，先以2-5×106的密度，在5％CO2和37℃条件下培养24-48小时。 
优选地，先将细胞在细胞培养液D1中培养72小时，所述细胞培养液D1为DMEM、并含有枸杞子提取物50mg/ml、菊花提取物50mg/ml、Y-27632 10μM、白细胞介素3(IL3)10ng/ml、白细胞介素6(IL6)10ng/ml、神经生长因子10ng/ml、二甲亚砜(DMSO)10μM；然后换用细胞培养液D2继续培养9-15天，所述细胞培养液D2为含有枸杞子提取物50mg/ml、菊花提取物50mg/ml、水蛭提取物50mg/ml、Y-27632 10μM、白细胞介素3(IL3)(IL3)10ng/ml、白细胞介素6(IL6)10ng/ml、神经生长因子10ng/ml、Dkk-1 10ng/ml、Lefty-A10ng/ml的DMEM；再换用细胞培养液D3继续在5％CO2和37℃条件下培养10-20天，所述细胞培养液D3为含有枸杞子提取物50mg/ml、菊花提取物50mg/ml、水蛭提取物50mg/ml、Y-27632 10μM、B272％(v/v)、白细胞介素3(IL3)10ng/ml、白细胞介素6(IL6)10ng/ml、神经生长因子10ng/ml、Dkk-1 10ng/ml、Lefty-A10ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)10ng/ml、血管内皮生长因子10ng/ml、生长因子2 10ng/ml的DMEM，从而获得植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞。 
另一方面，本发明提供二种产生自体视网膜细胞的方法，所述方法包括： 
采用细胞培养液D4培养上述得到的植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞，培养15-20天形成视杆细胞、视锥细胞和色素上皮细胞，所述细胞培养液D4为DMEM、并含有B272％(v/v)、Y-27632 5-30μM、神经生长因子1-100ng/ml、B型转化生长因子(TGF-β)1-100ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)1-100ng/ml、胰岛素1-100ng/ml、血管内皮生长因子-1100ng/ml、Dkk-11-100ng/ml、Lefty-A 1-100ng/ml、RA 1-100ng/ml、牛磺酸(taurine)5-30μM、二甲亚砜(DMSO)5-30μM； 
优选地，在5％CO2和37℃条件下进行细胞培养； 
优选地，在得到的植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞在细胞培养液D4中培养9-15天形成视杆细胞、视锥细胞和色素上皮细胞，所述细胞培养液D4为含有Y-27632 10μM、神经生长因子10ng/ml、B型转化生长因子(TGF-β)10ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)10ng/ml、胰岛素10ng/ml、血管内皮生长因子10ng/ml、Dkk-110ng/ml、Lefty-A 10ng/ml、RA 5ng/ml、牛磺酸(taurine)10μM、二甲亚砜(DMSO)10μM的DMEM。 
采用细胞培养液D5培养上述得到的植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞，培养15-20天形成视神经节细胞，所述细胞培养液D5为DMEM、并含有B272％(v/v)、Y-27632 5-30μM、神经生长因子1-100ng/ml、B型转化生长因子(TGF-β)1-100ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)1-100ng/ml、胰岛素1-100ng/ml、血管内皮生长因子1-100ng/ml、Dkk-1 1-100ng/ml、Lefty-A1-100ng/ml、RA 1-100ng/ml、牛磺酸(taurine)5-30μM、Heparin 1-100μg/ml、二甲亚砜(DMSO)5-30μM； 
优选地，在5％CO2和37℃条件下进行细胞培养； 
优选地，在得到的植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞在细胞培养液D5中培养9-15天形成视神经节细胞，所述细胞培养液D5为DMEM、并含有B27 2％(v/v)、Y-27632 10μM、神经生长因子10ng/ml、B型转化生长因子(TGF-β)10ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)10ng/ml、胰岛素10ng/ml、血管内皮生长因子10ng/ml、Dkk-1 10ng/ml、Lefty-A 10ng/ml、RA 5ng/ml、牛磺酸(taurine)10μM、Heparin 2μg/ml、二甲亚砜(DMSO)10μM。 
另一方面，本发明提供由上述方法制备的自体视网膜干细胞和自体视网膜 细胞。 
本发明还提供所述自体视网膜干细胞和自体视网膜细胞的应用，优选地，本发明提供所述自体视网膜干细胞和自体视网膜细胞在制备用于治疗涉及器官再生再造和修复的疾病药物中的应用；优选地，所述疾病为视网膜、神经组织系统等细胞、组织和器官的病理损害、创伤坏死和各种退行性变性；进一步优选地，所述疾病为眼科疾病、视网膜变性疾病、视神经疾病；更优选地，所述疾病为老年黄斑变性、视网膜色素变性、视神经受损萎缩。 
又一方面，本发明提供用于使人的体细胞逆向分化的细胞培养液，其中所述培养液选自细胞培养液D1、D2、D3、D4和D5，所述培养液D1为DMEM，并含有枸杞子提取物1-100mg/ml、菊花提取物1-100mg/ml、y-27632 5-30μM、白细胞介素3(IL3)5-30ng/ml、白细胞介素6(IL6)5-30ng/ml、神经生长因子1-100ng/ml、二甲亚砜(DMSO)5-30μM；所述培养液D2为DMEM，并含有枸杞子提取物1-100mg/ml、菊花提取物1-100mg/ml、水蛭提取物1-100mg/ml、Y-27632 5-30μM、白细胞介素3(IL3)5-30ng/ml、白细胞介素6(IL6)5-30ng/ml、神经生长因子5-30ng/ml、Dkk-1 5-30ng/ml、Lefty-A5-30ng/ml；所述细胞培养液D3为DMEM、并含有枸杞子提取物1-100mg/ml、菊花提取物1-100mg/ml、水蛭提取物1-100mg/ml、Y-27632 5-30μM、B272％(v/v)、白细胞介素3(IL3)5-30ng/ml、白细胞介素6(IL6)5-30ng/ml、神经生长因子5-30ng/ml、Dkk-1 5-30ng/ml、Lefty-A 5-30ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)5-30ng/ml、血管内皮生长因子5-30ng/ml、生长因子25-30ng/ml；所述细胞培养液D4为DMEM、并含有B272％(v/v)、Y-27632 5-30μM、神经生长因子1-100ng/ml、B型转化生长因子(TGF-β)1-100ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)1-100ng/ml、胰岛素1-100ng/ml、血管内皮生长因子1-100ng/ml、Dkk-1 1-100ng/ml、Lefty-A 1-100ng/ml、RA 1-100ng/ml、牛磺酸(taurine)5-30μM、二甲亚砜(DMSO)5-30μM；所述细胞培养液D5为DMEM、并含有B272％(v/v)、Y-27632 5-30μM、神经生长因子1-100ng/ml、B型转化生长因子(TGF-β)1-100ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)1-100ng/ml、胰岛素1-100ng/ml、血管内皮生长因子1-100ng/ml、Dkk-11-100ng/ml、Lefty-A1-100ng/ml、RA 1-100ng/ml、牛磺酸(taurine)5-30μM、Heparin 1-100μg/ml、二甲亚砜(DMSO)5-30μM。 
此外，本发明提供上述细胞培养液D1、D2和D3在培养人的体细胞使之逆向分化产生自体视网膜干细胞中的应用。 
本发明还提供细胞培养液D1、D2、D3、D4和D5在培养人的体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞，进而分化产生自体视网膜细胞中的应用。 
再一方面，本发明提供用于制备自体视网膜干细胞的试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述细胞培养液D1、D2和D3；优选地，所述试剂盒进一步包括人的体细胞；所述体细胞包括但不限于周围血液细胞、脐带血细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、脂肪细胞。 
本发明还提供用于制备自体视网膜细胞的试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述细胞培养液D1、D2、D3、D4和D5；优选地，所述试剂盒进一步包括人的体细胞；所述体细胞包括但不限于周围血液细胞、脐带血细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、脂肪细胞。 
本发明还提供所述试剂盒在制备自体视网膜干细胞和自体视网膜细胞以及制备用于治疗涉及器官再生再造和修复的疾病药物中的应用； 
优选地，所述疾病为视网膜、神经组织系统等细胞、组织和器官的病理损害、创伤坏死和各种退行性变性； 
进一步优选地，所述疾病为眼科疾病、视网膜变性疾病、视神经疾病； 
更优选地，所述疾病为老年黄斑变性、视网膜色素变性、糖尿病视网膜变性、视神经受损萎缩。 
以下是本发明的详细描述： 
为完成本发明涉及到以下技术问题： 
(1)选用什么样的人的体细胞作为逆向分化生产人自体视网膜干细胞的原料细胞； 
(2)怎样处理和培养各种原料细胞； 
(3)怎样使原料细胞逆向分化生产植物和蛋白诱导性人自体视网膜干细胞； 
(4)怎样检测生产的植物和蛋白诱导性人自体视网膜干细胞； 
(5)怎样从植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞分化产生自体视网膜细胞； 
(6)怎样检测生产的自体视网膜细胞。 
因此，本发明的发明目的可以通过下述方法得以实现： 
选用的人的原料体细胞包括但不限于人的脐带血细胞、胎盘细胞、可商购 获得的非永生化和永生化的人的各种体细胞株、常规血库保存的血液和白细胞悬液、新鲜分离制备的人的皮肤细胞、血液有核细胞、脂肪细胞，可以是周围血液细胞、脐带血细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、脂肪细胞。 
选用的原料体细胞的培养包括：以2-5×106的密度，用相应的细胞培养液在5％CO2和37℃条件下培养24-48小时； 
使原料细胞逆向分化生产人自体视网膜干细胞包括：用相应的原料体细胞用相应的细胞培养液在5％CO2和37℃条件下培养24-48小时后，换用细胞培养液D1(DMEM、枸杞子提取物50mg/ml、菊花提取物50mg/ml、Y-27632 10μM、白介素-310ng/ml、白介素-610ng/ml、神经生长因子10ng/ml、DMSO 10μM)继续在5％CO2和37℃条件下培养72小时，然后换用细胞培养液D2(DMEM、枸杞子提取物50mg/ml、菊花提取物50mg/ml、水蛭提取物50mg/ml、Y-2763210μM、白介素3 10ng/ml、白介素6 10ng/ml、神经生长因子10ng/ml、Dkk-110ng/ml、Lefty-A 10ng/ml)继续在5％CO2和37℃条件下培养9-15天；再换用细胞培养液D3(DMEM、枸杞子提取物50mg/ml、菊花提取物50mg/ml、水蛭提取物50mg/ml、Y-27632 10μM、B272％(v/v)、白介素3 10ng/ml、白介素610ng/ml、神经生长因子10ng/ml、Dkk-1 10ng/ml、Lefty-A 10ng/ml、b生长因子10ng/ml、血管内皮生长因子10ng/ml、生长因子2 10ng/ml)继续在5％CO2和37℃条件下培养10-20天，形成植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞。 
根据本发明的一个实施方案，所获得的人自体视网膜干细胞可以通过以下方法进行检测：利用视网膜祖细胞和视神经祖细胞的特异细胞表型(Rx、Chx10和Pax6)、色素上皮祖细胞的特异细胞表型(Mitf)、光感受器前体细胞的特异细胞表型(Crx、Nrl)等作为检测指标，在换用细胞培养液D3继续培养后的第3、第6、第9和第12天，分别采用RT-PCR、细胞免疫荧光技术，观测各种视网膜干细胞的生成速度、生成率、生成数量和纯度(采用Pax6、Rx、Chx10、Mitif等作为检测指标及其检测，参考Meyer JS等人的“Modeling early retinaldevelopment with human embryonic and induced pluripotent stem cells”PNAS 2009；106，16543-4.Osakada F等人的“In vitro differentiation ofretinal cells from human pluripotent stem cells by small-moleculeinduction”Journal of Cell Science.2009，122，3169-3179)。 
根据本发明的另一个实施方案，从植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞分 化产生视杆细胞、视锥细胞和色素上皮细胞包括：经细胞培养液D3培养形成的植物和蛋白诱导性视网膜干细胞，应用细胞培养液D4(DMEM、B27 2％(v/v)、Y-27632 10μM、神经生长因子10ng/ml、B型转化生长因子(TGF-β)10ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)10ng/ml、胰岛素10ng/ml、血管内皮生长因子10ng/ml、Dkk-1 10ng/ml、Lefty-A 10ng/ml、RA 5ng/ml、牛磺酸(taurine)10μM、二甲亚砜(DMSO)10μM)继续培养15-20天形成自体视网膜视杆细胞、视锥细胞和色素上皮细胞。 
根据本发明的另一个实施方案，从植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞分化产生节细胞包括：经细胞培养液D3培养形成的植物和蛋白诱导性视网膜干细胞，应用细胞培养液D5(DMEM、B27 2％(v/v)、Y-27632 10μM、神经生长因子10ng/ml、B型转化生长因子(TGF-β)10ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)10ng/ml、胰岛素10ng/ml、血管内皮生长因子10ng/ml、Dkk-110ng/ml、Lefty-A 10ng/ml、RA 5ng/ml、牛磺酸(taurine)10μM、Heparin 2μg/ml、二甲亚砜(DMSO)10μM)继续培养15-20天形成自体视网膜节细胞。 
根据本发明的又一个实施方案，生产的各种类型的自体视网膜细胞可以通过以下方法进行检测：采用细胞免疫荧光技术和反转录PCR技术检测视网膜细胞，如视杆细胞(Rhodopsin、Recoverin)、视锥细胞(Blue opsin、Red/grennopsin)、节细胞(MAth5、Brn3b)、色素上皮细胞(RPE-65、CRALBP)特异蛋白的表达(参考Meyer JS等人的“Modeling early retinal development with humanembryonic and induced pluripotent stem cells”PNAS 2009；106，16543-4.Osakada F等人的“Stepwise differentiation of pluripotent stem cells intoretinal cells”Nat Protocoll 2009；4(6)：811-24)。 
根据本发明获得的植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞，可以作为器官再生再造和修复的优良的种子细胞，对视神经萎缩、损伤、老年黄斑变性、视神经外伤、视网膜病变、脉络膜裂伤、糖尿病性视网膜病变、视网膜挫伤、视网膜脱离等眼睛疾病具有再生再造和修复的潜能，有良好的治疗应用前景； 
此外植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞还可应用于视网膜体外组织工程，生产自体视网膜干细胞和视网膜细胞。 
植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞和视网膜细胞生产工艺流程可以被严格地、多次地、系统地进行流式细胞技术检测和免疫细胞化学技术检测，因此， 作为自体种子细胞和自体再生修复细胞，本发明还具有将自体视网膜干细胞和视网膜细胞大规模产业化的可能性。 
与现有技术相比，本发明至少具有以下几个优点： 
一、本发明不同于已有的利用基因重组技术诱导体细胞逆向分化产生干细胞(iP干细胞)，提供了一种生产自体视网膜干细胞和自体视网膜细胞的新型技术方法，利用植物提取物和蛋白配方技术诱导体细胞逆向分化产生的干细胞(Plants and Proteins induced pluripotent stem cell，PPiPS干细胞)，使得细胞结果接近于自然干细胞，安全性高。具体而言，本发明通过采用人的常规的体细胞，在不改变体细胞染色体DNA序列，不插入任何外来基因或DNA片段的情况下，应用经过筛选优化设计的植物提取物和蛋白配方使体细胞重新逆向分化而形成自体视网膜干细胞，并进而分化成为自体视网膜细胞。技术独创新颖，为解决眼科类疾病治疗领域目前所存在的困难提供了新的思路和途径，并解决了人自体视网膜干细胞和视网膜细胞来源困难的问题。 
二、本发明的方法可以直接采用分离自患者的体细胞，使该体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞和自体视网膜细胞，应用此自体视网膜干细胞和自体视网膜细胞避免了采用异体视网膜干细胞或异体视网膜细胞移植带来的免疫排斥，为临床应用提供了显著的便利条件。 
三、采用本发明的方法制备的自体视网膜干细胞和视网膜细胞具有正常2倍体的染色体核型。在两组裸鼠移植试验中，裸鼠皮下移植注射1×108个植物和蛋白诱导性视网膜干细胞或1×108个人自然胚胎干细胞，观察接种部位有否肿瘤形成，连续观察90天后，发现采用本发明的植物和蛋白诱导性视网膜干细胞的试验组10只裸鼠无一例产生肿瘤，人自然胚胎干细胞试验组10只裸鼠全部产生肿瘤，因此本发明的植物和蛋白诱导性视网膜干细胞和视网膜细胞具有较高的安全性。本发明还是一种在任何年龄的人个体中均可以生产自体视网膜干细胞和视网膜细胞的新技术方法，可以广泛应用于不同年龄阶层中患有相关疾病的受众群体。 
四、已证明采用本发明的方法可以使200ml人周围血液在3-4周内产生几百亿数量级别的第1代自体视网膜干细胞和视网膜细胞，生产速度快，产量达到1-1.5×1011；利用自体视网膜干细胞和视网膜细胞的特异表型作为检测指标，植物和蛋白诱导性人自体视网膜干细胞和视网膜细胞的生产工艺流程可以被严 格地、多次地、系统地进行流式细胞技术和免疫细胞化学技术检测，因此，作为自体种子细胞和再生修复细胞，在再生医学、自体组织器官工程和自体视网膜干细胞生产的产业化领域，植物和蛋白诱导性人自体干细胞可能具有良好的潜在应用前景，并具有大规模工业化和产业化生产自体视网膜干细胞和视网膜细胞的可能性。 
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中： 
图1中，1-A为原料细胞，1-B、C为视网膜干细胞； 
图2-A为使用反转录PCR检查显示为植物和蛋白诱导性视网膜干细胞具有的Rx、Pax6、Mitf、Chx10、Six3、Six6、Sox2、Lhx2的特异mRNA；图2-B使用免疫荧光化学检查显示植物和蛋白诱导性视网膜干细胞具有Pax6、Rx、Mitf和Chx10特异表型； 
图3为使用免疫荧光化学检查显示植物和蛋白诱导性视锥细胞具有Blueopsin、Red/grenn opsin特异表型； 
图4为使用免疫荧光化学检查显示植物和蛋白诱导性视杆细胞具有Rhodopsin、Recoverin特异表型； 
图5为使用反转录PCR检查显示为植物和蛋白诱导性视锥、视杆细胞、节细胞具有的Blue opsin、Red/grenn opsin、Rhodopsin、Recoverin和MAth5的特异mRNA； 
图6为使用免疫荧光化学检查显示植物和蛋白诱导性色素上皮细胞具有的RPE-65、CRALBP特异表型； 
图7为使用免疫荧光化学检查显示植物和蛋白诱导性节细胞具有的MAth5、Brn3b特异表型。 
具体实施方式
通过下面的详述，将对本发明的操作方法及特点和优点作进一步说明，当然，应该指出的是尽管本文描述以下几种案例，人们也可以根据本发明的基础，提出各种变化和个性的形式也是可能的。 
使用的培养液为： 
细胞培养液D1：DMEM(购自GICO公司)、含枸杞子提取物(购自河南天然植 物原料厂、郑州荔诺生物科技有限公司)50mg/ml、菊花提取物(购自河南天然植物原料厂、郑州荔诺生物科技有限公司)50mg/ml、Y-27632(购自Sigma公司)10μM、白细胞介素3(IL3)(购自R&D公司)10ng/ml、白细胞介素6(IL6)(购自R&D公司)10ng/ml、神经生长因子(购自R&D公司)10ng/ml、二甲亚砜(DMSO)(购自Sigma公司)10μM； 
细胞培养液D2：DMEM(购自GICO公司)、含枸杞子提取物(购自河南天然植物原料厂、郑州荔诺生物科技有限公司)50mg/ml、菊花提取物(购自河南天然植物原料厂、郑州荔诺生物科技有限公司)50mg/ml、水蛭提取物(购自郑州荔诺生物科技有限公司)50mg/ml、Y-27632(购自Sigma公司)10μM、白细胞介素3(IL3)(购自R&D公司)10ng/ml、白细胞介素6(IL6)(购自R&D公司)10ng/ml、神经生长因子(购自R&D公司)10ng/ml、Dkk-1(购自Sigma公司)10ng/ml、Lefty-A(购自Sigma公司)10ng/ml； 
细胞培养液D3：DMEM(购自GI CO公司)、含枸杞子提取物(购自河南天然植物原料厂、郑州荔诺生物科技有限公司)50mg/ml、菊花提取物(购自河南天然植物原料厂、郑州荔诺生物科技有限公司)50mg/ml、水蛭提取物(购自郑州荔诺生物科技有限公司)50mg/ml、Y-27632(购自Sigma公司)10μM、B27(购自Sigma公司)2％(v/v)、白细胞介素3(IL3)(购自R&D公司)10ng/ml、白细胞介素6(IL6)(购自R&D公司)10ng/ml、神经生长因子(购自R&D公司)10ng/ml、Dkk-1(购自Sigma公司)10ng/ml、Lefty-A(购自Sigma公司)10ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(购自R&D公司)(bFGF)10ng/ml、血管内皮生长因子(购自R&D公司)10ng/ml、生长因子(购自R&D公司)210ng/ml； 
细胞培养液D4：DMEM(购自GICO公司)、含B27(购自Sigma公司)2％(v/v)、Y-27632(购自Sigma公司)10μM、神经生长因子(购自R&D公司)10ng/ml、B型转化生长因子(购自R&D公司)(TGF-β)10ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(购自R&D公司)(bFGF)10ng/ml、胰岛素(购自R&D公司)10ng/ml、血管内皮生长因子(购自R&D公司)10ng/ml、Dkk-1(购自Sigma公司)10ng/ml、Lefty-A(购自Sigma公司)10ng/ml、RA(购自Sigma公司)5ng/ml、牛磺酸(taurine)(购自Sigma公司)10μM、二甲亚砜(DMSO)(购自Sigma公司)10μM； 
细胞培养液D5：DMEM(购自GICO公司)、含B27(购自Sigma公司)2％(v/v)、Y-27632(购自Sigma公司)10μM、神经生长因子(购自R&D公司)10ng/ml、B 型转化生长因子(TGF-β)(购自R&D公司)10ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(购自R&D公司)10ng/ml、胰岛素(购自R&D公司)10ng/ml、血管内皮生长因子(购自R&D公司)10ng/ml、Dkk-1(购自Sigma公司)10ng/ml、Lefty-A(购自Sigma公司)10ng/ml、RA(购自Sigma公司)5ng/ml、牛磺酸(taurine)(购自Sigma公司)10μM、Heparin(购自Sigma公司)2μg/ml、二甲亚砜(DMSO)(购自Sigma公司)10μM。 
实施例1：采用周围静脉血/脐带血作为原料细胞，生产植物和蛋白诱导性视网膜干细胞
周围静脉血和脐带血(科研工作人员捐赠、北京望京医院、北京五洲女子医院等)无菌采集。采集周围静脉血/脐带血前应征得供血本人或直系亲属的同意，并记录供血本人及家庭的遗传和传染病史以及医院所有相关的病毒检查结果。 
周围静脉血/脐带血常规抗凝，4℃保存。在24小时之内送至干细胞制作生产中心。在中心需要再做相应的病毒检测后，进入中心电脑登记程序，在记录相应的条形码编号后，血液标本进入无菌干细胞生产车间。 
在干细胞生产室，血液标示应用Ficoll标准分离技术(《现代免疫学》第十二章第288页)分离单个核细胞后，进行单个核细胞计数。应用DMEM培养液以2-5x106的密度，在5％CO2和37℃条件下培养24-48小时；换用细胞培养液D1继续在5％CO2和37℃条件下培养72小时，然后换用细胞培养液D2继续在5％CO2和37℃条件下培养9-15天；再换用细胞培养液D3继续在5％CO2和37℃条件下培养10-20天，形成植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞。 
检测生产的人自体视网膜干细胞的方法：利用视网膜祖细胞和视神经祖细胞的特异细胞表型(Rx、Chx10和Pax6)、色素上皮祖细胞的特异细胞表型(Mitf)、光感受器前体细胞的特异细胞表型(Crx、Nrl)等作为检测指标，在换用细胞培养液D3继续培养后的第6、第9、第12和第15天，分别采用流式细胞仪、细胞免疫荧光技术和RT-PCR技术检测，观测各种视网膜干细胞的生成速度、生成率、生成数量和纯度。 
实施例2采用周围静脉血/脐带血作为原料细胞，生产植物和蛋白诱导性视网膜细胞
周围静脉血和脐带血(科研工作人员捐赠、北京望京医院、北京五洲女子医院等)无菌采集。采集周围静脉血/脐带血前应征得供血本人或直系亲属的同意，并记录供血本人及家庭的遗传和传染病史以及医院所有相关的病毒检查结果。 
周围静脉血/脐带血常规抗凝，4℃保存。在24小时之内送至干细胞制作生产中心。在中心需要再做相应的病毒检测后，进入中心电脑登记程序，在记录相应的条形码编号后，血液标本进入无菌干细胞生产车间。 
在干细胞生产室，血液标示应用Ficoll标准分离技术(《现代免疫学》第十二章第288页)分离单个核细胞后，进行单个核细胞计数。应用DMEM培养液以2-5x106的密度，在5％CO2和37℃条件下培养24-48小时；换用细胞培养液D1继续在5％CO2和37℃条件下培养72小时，然后换用细胞培养液D2继续在5％CO2和37℃条件下培养9-15天；再换用细胞培养液D3继续在5％CO2和37℃条件下培养10-20天，形成植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞。 
从植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞分化产生视网膜细胞的方法： 
1)从植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞分化产生视杆细胞、视锥细胞和色素上皮细胞： 
经细胞培养液D3培养形成的植物和蛋白诱导性视网膜干细胞，应用D4细胞培养液继续培养15-20天形成自体视网膜视杆细胞、视锥细胞和色素上皮细胞。 
2)从植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞分化产生节细胞： 
经细胞培养液D3培养形成的植物和蛋白诱导性视网膜干细胞，应用D5细胞培养液继续培养15-20天形成自体视网膜节细胞。 
检测生产的各种类型的自体视网膜细胞的方法： 
采用细胞免疫荧光技术和RT-PCR技术检测视网膜细胞，如视杆细胞(Rhodopsin、Recoverin)、视锥细胞(Blue opsin、Red/green opsin)、节细胞(MAth5、Brn3b、Thy-1)、色素上皮细胞(RPE-65、CRALBP、PEDF、GFAP、Six3、Six6、Lhx2)特异蛋白的表达。 
实施例3
本实施例对实施例1中制备的植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞进行裸鼠移植的安全性研究，具体如下。 
在两组裸鼠移植试验中，裸鼠皮下移植注射1×108个植物和蛋白诱导性的视网膜干细胞或1×108个人自然胚胎干细胞(北京望京医院)，观察接种部位有否肿瘤形成。连续观察90天。 
结果显示，植物和蛋白诱导性视网膜干细胞试验组10只裸鼠无一例产生肿瘤，具有较高的安全性；而人自然胚胎干细胞试验组10只裸鼠全部产生肿瘤。 

Claims (14)

1.一种使人的体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞的方法，其中，所述方法包括：
将人的体细胞在细胞培养液D1中培养72小时，所述细胞培养液D1为DMEM、并含有枸杞子提取物1-100mg/ml、菊花提取物1-100mg/ml、Y-27632 5-30μM、白细胞介素3(IL3)5-30ng/ml、白细胞介素6(IL6)5-30ng/ml、神经生长因子1-100ng/ml、二甲亚砜(DMSO)5-30μM；然后换用细胞培养液D2培养9-15天，所述细胞培养液D2为DMEM、并含有枸杞子提取物1-100mg/ml、菊花提取物1-100mg/ml、水蛭提取物1-100mg/ml、Y-27632 5-30μM、白细胞介素3(IL3)5-30ng/ml、白细胞介素6(IL6)5-30ng/ml、神经生长因子5-30ng/ml、Dkk-15-30ng/ml、Lefty-A 5-30ng/ml；再换用细胞培养液D3继续培养10-20天，D3培养液为DMEM、并含有枸杞子提取物1-100mg/ml、菊花提取物1-100mg/ml、水蛭提取物1-100mg/ml、Y-276325-30μM、B272％(v/v)、白细胞介素3(IL3)5-30ng/ml、白细胞介素6(IL6)5-30ng/ml、神经生长因子5-30ng/ml、Dkk-15-30ng/ml、Lefty-A 5-30ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)5-30ng/ml、血管内皮生长因子5-30ng/ml、生长因子5-30ng/ml从而获得植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞；
优选地，在5％CO2和37℃条件下进行细胞培养。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述人的体细胞包括但不限于人的脐带血细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、血液有核细胞、脂肪细胞、血液等；
优选地，在人的体细胞以细胞培养液D1培养之前，先以2-5×106的密度，在5％CO2和37℃条件下培养24-48小时；
优选地，先将细胞在细胞培养液D1中培养72小时，所述细胞培养液D1为含有枸杞子提取物50mg/ml、菊花提取物50mg/ml、Y-27632 10μM、白细胞介素3(IL3)10ng/ml、白细胞介素6(IL6)10ng/ml、神经生长因子10ng/ml、二甲亚砜(DMSO)10μM的DMEM；然后换用细胞培养液D2培养9-15天，所述细胞培养液D2为含有枸杞子提取物50mg/ml、菊花提取物50mg/ml、水蛭提取物50mg/ml、Y-27632 10μM、白细胞介素3(IL3)10ng/ml、白细胞介素6(IL6)10ng/ml、神经生长因子10ng/ml、Dkk-1 10ng/ml、Lefty-A 10ng/ml；再换用细胞培养液D3继续在5％CO2和37℃条件下培养10-20天，所述细胞培养液D3为DMEM，并含有枸杞子提取物50mg/ml、菊花提取物50mg/ml的DMEM、水蛭提取物50mg/ml、Y-27632 10μM、B272％(v/v)、白细胞介素3(IL3)10ng/ml、白细胞介素6(IL6)10ng/ml、神经生长因子10ng/ml、Dkk-1 10ng/ml、Lefty-A10ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)10ng/ml、血管内皮生长因子10ng/ml、生长因子210ng/ml，从而获得植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞。
3.一种从植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞分化自体视网膜视锥、视杆细胞和色素上皮细胞的方法，其中，所述方法包括：将如权利要求1或2所述的植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞采用培养液D4培养15-20天形成视锥细胞、视杆细胞和色素上皮细胞；所述培养液D4为DMEM、B272％(v/v)、Y-276325-30μM、神经生长因子1-100ng/ml、B型转化生长因子(TGF-β)1-100ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)1-100ng/ml、胰岛素1-100ng/ml、血管内皮生长因子1-100ng/ml、Dkk-1 1-100ng/ml、Lefty-A 1-100ng/ml、RA 1-100ng/ml、牛磺酸(taurine)5-30μM、二甲亚砜(DMSO)5-30μM；
优选地，所述细胞的扩增传代在5％CO2和37℃条件下进行；
优选地，将如权利要求2所述的植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞在培养液D4中培养9-15天形成视锥细胞、视杆细胞和色素上皮细胞，所述细胞培养液D4为含有Y-27632 10μM、神经生长因子10ng/ml、B型转化生长因子(TGF-β)10ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)10ng/ml、胰岛素10ng/ml、血管内皮生长因子10ng/ml、Dkk-1 10ng/ml、Lefty-A 10ng/ml、RA 5ng/ml、牛磺酸(taurine)10μM、二甲亚砜(DMSO)10μM的DMEM。
4.一种从植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞分化产生节细胞的方法，其中，所述方法包括：将如权利要求1或2所述的植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞采用培养液D5，培养15-20天形成节细胞；所述培养液D5为DMEM、B272％(v/v)、Y-27632 5-30μM、神经生长因子1-100ng/ml、B型转化生长因子(TGF-β)1-100ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)1-100ng/ml、胰岛素1-100ng/ml、血管内皮生长因子1-100ng/ml、Dkk-1 1-100ng/ml、Lefty-A1-100ng/ml、RA 1-100ng/ml、牛磺酸(taurine)5-30μM、Heparin 1-100μg/ml、二甲亚砜(DMSO)5-30μM；
优选地，所述细胞的扩增传代在5％CO2和37℃条件下进行；
优选地，将如权利要求2所述的植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞在培养液D5中培养9-15天分化产生节细胞，培养液D5为DMEM、B272％(v/v)、Y-27632 10μM、神经生长因子10ng/ml、B型转化生长因子(TGF-β)10ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)10ng/ml、胰岛素10ng/ml、血管内皮生长因子10ng/ml、Dkk-1 10ng/ml、Lefty-A 10ng/ml、RA 5ng/ml、牛磺酸(taurine)10μM、Heparin 2μg/ml、二甲亚砜(DMSO)10μM。
5.如权利要求1-2中任一项所述的方法制备的植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞。
6.如权利要求3-4中任一项所述的方法制备的自体视锥细胞、视杆细胞、色素上皮细胞及视网膜节细胞。
7.如权利要求5所述的植物和蛋白诱导性自体视网膜干细胞在制备用于治疗视网膜疾病的药物和用于治疗涉及器官再生再造和修复的疾病药物中的应用；
优选地，所述疾病为老年黄斑变性、视网膜色素变性、视神经损伤、萎缩。
8.如权利要求6所述的植物和蛋白诱导性自体视网膜细胞在制备用于治疗视网膜疾病及视神经疾病的药物和用于治疗涉及器官再生再造和修复的疾病药物中的应用；
优选地，所述疾病为视网膜变性、视神经损伤、萎缩。
9.一种用于使人的体细胞逆向分化的培养液，其中，所述培养液选自细胞培养液D1、D2、D3、D4和D5，所述细胞培养液D1为DMEM、并含有枸杞子提取物1-100mg/ml、菊花提取物1-100mg/ml、Y-27632 5-30μM、白细胞介素3(IL3)5-30ng/ml、白细胞介素6(IL6)5-30ng/ml、神经生长因子1-100ng/ml、二甲亚砜(DMSO)5-30μM；所述细胞培养液D2为DMEM、并含有枸杞子提取物1-100mg/ml、菊花提取物1-100mg/ml、水蛭提取物1-100mg/ml、Y-276325-30μM、白细胞介素3(IL3)5-30ng/ml、白细胞介素6(IL6)5-30ng/ml、神经生长因子5-30ng/ml、Dkk-1 5-30ng/ml、Lefty-A 5-30ng/ml；所述细胞培养液D3为DMEM、并含有枸杞子提取物1-100mg/ml、菊花提取物1-100mg/ml、水蛭提取物1-100mg/ml、Y-27632 5-30μM、B27 2％(v/v)、白细胞介素3(IL3)5-30ng/ml、白细胞介素6(IL6)5-30ng/ml、神经生长因子5-30ng/ml、Dkk-1 5-30ng/ml、Lefty-A 5-30ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)5-30ng/ml、血管内皮生长因子5-30ng/ml、生长因子2 5-30ng/ml；所述细胞培养液D4为DMEM、B27 2％(v/v)、Y-27632 5-30μM、神经生长因子1-100ng/ml、B型转化生长因子(TGF-β)1-100ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)1-100ng/ml、胰岛素1-100ng/ml、血管内皮生长因子1-100ng/ml、Dkk-1 1-100ng/ml、Lefty-A 1-100ng/ml、RA 1-100ng/ml、牛磺酸(taurine)5-30μM、二甲亚砜(DMSO)5-30μM；所述细胞培养液D5为DMEM、B27 2％(v/v)、Y-27632 5-30μM、神经生长因子1-100ng/ml、B型转化生长因子(TGF-β)1-100ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)1-100ng/ml、胰岛素1-100ng/ml、血管内皮生长因子1-100ng/ml、Dkk-1 1-100ng/ml、Lefty-A 1-100ng/ml、RA1-100ng/ml、牛磺酸(taurine)5-30μM、Heparin 1-100μg/ml、二甲亚砜(DMSO)5-30μM。
10.如权利要求9所述的细胞培养液D1、D2和D3在培养人的体细胞使之逆向分化产生自体视网膜干细胞中的应用。
11.如权利要求9所述的细胞培养液D1、D2、D3、D4和D5在培养人的体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞，进而分化产生视锥细胞、视杆细胞、色素上皮细胞、节细胞中的应用。
12.一种用于制备自体视网膜干细胞的试剂盒，其中，所述试剂盒包括如权利要求9所述的细胞培养液D1、D2和D3；
优选地，所述试剂盒进一步包括人的体细胞；所述体细胞包括但不限于人的脐带血细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、血液有核细胞、脂肪细胞。
13.一种用于制备自体视网膜视锥细胞、视杆细胞、色素上皮细胞及节细胞的试剂盒，其中，所述试剂盒包括如权利要求9所述的细胞培养液D1、D2、D3、D4和D5；
优选地，所述试剂盒进一步包括人的体细胞；所述体细胞包括但不限于人的脐带血细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、血液有核细胞、脂肪细胞。
14.如权利要求12或13所述的试剂盒在制备自体视网膜干细胞和用于治疗视网膜及视神经疾病的药物以及用于治疗涉及器官再生再造和修复的疾病药物中的应用；
优选地，所述疾病为视网膜变性、视神经损伤、萎缩；
更优选地，所述疾病为老年黄斑变性、视网膜色素变性、糖尿病视网膜变性。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103343108A (zh) * 2013-01-05 2013-10-09 天津市环湖医院 促进大鼠神经干细胞分化的方法
CN106148271A (zh) * 2016-05-31 2016-11-23 宁夏医科大学 一种枸杞菊花提取液培养晶状体上皮细胞的方法
CN106822182A (zh) * 2016-12-27 2017-06-13 广州姿生生物科技有限公司 一种细胞提取物及其用途
CN107034175A (zh) * 2016-02-03 2017-08-11 成都中医药大学 枸杞子的新用途
CN107326009A (zh) * 2017-05-02 2017-11-07 深圳百年干细胞技术研究院有限公司 使血液单个核细胞逆向分化产生人血源性自体视网膜干细胞的方法、试剂盒及用途

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103343108A (zh) * 2013-01-05 2013-10-09 天津市环湖医院 促进大鼠神经干细胞分化的方法
CN103343108B (zh) * 2013-01-05 2014-10-22 天津市环湖医院 促进大鼠神经干细胞分化的方法
CN107034175A (zh) * 2016-02-03 2017-08-11 成都中医药大学 枸杞子的新用途
CN106148271A (zh) * 2016-05-31 2016-11-23 宁夏医科大学 一种枸杞菊花提取液培养晶状体上皮细胞的方法
CN106822182A (zh) * 2016-12-27 2017-06-13 广州姿生生物科技有限公司 一种细胞提取物及其用途
CN107326009A (zh) * 2017-05-02 2017-11-07 深圳百年干细胞技术研究院有限公司 使血液单个核细胞逆向分化产生人血源性自体视网膜干细胞的方法、试剂盒及用途
CN107326009B (zh) * 2017-05-02 2019-03-08 深圳百年干细胞技术研究院有限公司 使血液单个核细胞逆向分化产生人血源性自体视网膜干细胞的方法、试剂盒及用途

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