CN112920998B - 一种成年鼠耳蜗体培养体系的建立方法及其应用 - Google Patents

一种成年鼠耳蜗体培养体系的建立方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种成年鼠耳蜗体培养体系的建立方法及其应用。本发明是将成年鼠的带有骨性支架的内耳感觉上皮和螺旋神经节神经元的共培养结构置于培养液中进行培养，定期更换培养液；培养液的组分包括N2、B27和青霉素。本发明建立了首个成年哺乳动物耳蜗感觉上皮和螺旋神经节神经元的一体化培养体系，能长时程的维持内耳感觉上皮结构的完整以及支持细胞和螺旋神经节神经元的存活，为研究成年哺乳动物内耳支持细胞增殖与转分化、毛细胞分化与成熟、新生毛细胞与螺旋神经节神经元突触连接的建立等提供了研究模型，填补了领域内的模型的空白，研究水平达到国际领先。

Description

一种成年鼠耳蜗体培养体系的建立方法及其应用
技术领域
本发明属于耳蜗体外培养技术领域，具体涉及一种成年鼠耳蜗体培养体系的建立方法及其应用。
背景技术
根据世界卫生组织2019年的统计数据，目前全球约有4.66亿听力障碍患者，占全部人口的5％以上，并且随着年龄的增长，患病率呈显著增高趋势，在65岁以上的老年患者中大于30％存在致残性的听力障碍，是严重威胁人类健康的重大疾病。目前的研究认为内耳感受器中发挥机械-电转换作用的关键组分——毛细胞不可逆的损伤和缺失是导致感音神经性耳聋的最重要原因，同时哺乳动物耳蜗毛细胞在成年阶段不能够自发再生是耳聋难以治愈的关键。
哺乳动物的Corti器由支持细胞和毛细胞构成，但是相对于鱼类，两栖类以及禽类等非哺乳类脊椎动物而言，哺乳动物的听觉上皮形成特殊的极性结构，支持细胞和毛细胞功能进一步特化，缺乏或者仅有有限的再生能力，为毛细胞再生和听觉功能恢复带来了很大的挑战。
与哺乳动物不同，低等脊椎动物比如斑马鱼、两栖类和鸟类等的内耳感受器毛细胞损伤之后，周围支持细胞能够自发增殖并且转分化为毛细胞，重建听觉上皮并促进功能的恢复。因此利用模式生物探索毛细胞再生的调控机制，对于激活哺乳动物毛细胞再生促进听觉功能恢复具有重要的意义。新生鼠耳蜗感觉上皮的体外培养体系已经被广泛的应用在毛细胞再生的研究中，并且筛选出了一系列能够促进毛细胞再生的调控因子，但是由于缺乏成年鼠耳蜗的体外培养体系，这些调控因子在成年阶段促进毛细胞再生的有效性得不到到高效的验证，而本发明面对的绝大部分患者是成年人甚至老年人，哺乳动物成年以后毛细胞的有效再生对于感音神经性耳聋的治疗具有更大的价值，因此迫切需要建立成年鼠耳蜗的体外培养体系，快速高效的筛选成年毛细胞再生策略。
传统的新生鼠耳蜗基底膜培养中，将基底膜从骨性结构中完整分离出来，贴附在培养皿底部，在合适的培养体系中能够长时程维持组织活性，但是成年后耳蜗严重骨化伴随着感觉上皮韧性的降低，在基底膜分离的过程中不可避免的带来结构的损伤，此外由于基底膜中成纤维细胞数量和增殖活性的降低，不能够很好的伸展和粘附在培养皿的底部，易发生折叠和卷曲，进一步加重基底膜细胞的损伤，因此在长时程的培养过程将损失绝大部分的毛细胞和支持细胞，无法开展相关研究工作。
发明内容
本发明的目的是提供一种成年鼠耳蜗体培养体系的建立方法及其应用。本发明发现精细耳蜗结构对于成年阶段耳蜗感觉上皮细胞的存活可能具有重要的意义，因此在保存耳蜗骨性支架和立体结构的条件下进行感觉上皮和螺旋神经节神经元的培养，建立了全世界首个成年哺乳动物耳蜗感觉上皮的立体培养体系，在这个体系中大部分的支持细胞能够存活3周以上，能够被腺病毒高效转染表达外源性的基因Atoh1，实现支持细胞向毛细胞的直接转分化，并能够与神经元建立物理连接；该体系为研究毛细胞再生信号调控、再生毛细胞和神经元之间突触形成以及毛细胞保护和再生药物筛选等提供了研究模型。
本发明提供了一种成年鼠耳蜗体外培养体系的建立方法，是将成年鼠的带有骨性支架的内耳感觉上皮和螺旋神经节神经元的共培养结构置于培养液中进行培养，定期更换培养液；培养液的组分包括N2、B27和青霉素。
作为上述方案的进一步改进：
优选的，成年鼠的带有骨性支架的内耳感觉上皮和螺旋神经节神经元的共培养结构的获取包括步骤：裂开小鼠头骨和脑组织，锐性离断听神经和面神经后取出两侧颞骨，置于冰的HBSS液中，打开听泡，去除周围软组织及多余骨质；打开耳蜗顶部的骨性结构，去除前庭膜，分离并去除螺旋韧带；打开耳蜗底部的骨性结构，从内耳骨性结构上钝性分离前庭部分，在仅保留的耳蜗部分结构上去除圆窗膜。
优选的，成年鼠为6-8周小鼠；培养的条件为含5％CO2的37℃的无菌环境；培养液的更换周期为1天。本发明采用的小鼠包括C57BL/6小鼠；本发明培养是在每孔含0.5mL的培养液的48孔板中进行，采用的无菌环境为无菌培养箱。
优选的，培养液的组分还包括等体积的DMEM和F12；每0.5mL培养液中，100×N2的加入量为5μL，50×B27的加入量为10μL；培养液中青霉素的终浓度为50IU/mL。
本发明提供了一种判定采用上述方法培养的感觉上皮细胞的存活状态的方法，即采用Gfi1 Cre-tdTomato和Sox2 Cre-tdTomato小鼠分别特异性的标记毛细胞和支持细胞，通过连续3天注射他莫昔芬的方式激活tdTomato的表达，将Sox2+支持细胞标记上红色荧光后解剖耳蜗进行培养，之后在特定的时间观察荧光的分布范围和强度从而判定细胞的存活状态。对于毛细胞，可以在分离后即刻，培养30分钟，培养150分钟，培养12小时，培养24小时时进行观察；对于支持细胞，可以在分离后即刻，培养7天，培养14天，培养21天时进行观察。
本发明提供了一种判定采用上述方法培养的螺旋神经节神经元的存活状态的方法，即在特定的时间固定培养的标本，组织脱钙后制备冰冻切片，联合TUJ1、Myo7a和Sox2的染色明确神经节神经元的存活状态，以及神经纤维的存活和伸展情况。本发明培养的标本在4％多聚甲醛固定，4℃过夜，然后是在120mM EDTA脱钙作用1-2天，脱钙的耳蜗按照标准程序进行感觉上皮的分离，制备厚度为10μm的冰冻切片，并进行后续的免疫荧光染色。
本发明培养的共培养结构，对于支持细胞，顶段和中顶段支持细胞存活状态较好，在连续三周的培养过程中支持细胞的数目相对稳定，大部分支持细胞能存活至2-3周，维持了耳蜗Corti器的三维立体结构，并且持续表达支持细胞特异性的分子标志物；对于毛细胞，培养30分钟后外毛细胞明显肿胀，部分缺失，培养150分钟后，仅顶圈残留少量外毛细胞，培养24小时后，外毛细胞完全死亡；内毛细胞在短期的培养过程中存活状况良好，在听觉上皮中的位置相对固定，仍表达特异性的毛细胞标记Myo7a和纤毛蛋白Espin，在长期培养的过程中内毛细胞存活的变异较大；对于螺旋神经节神经元，长时间培养后仍有大量螺旋神经节神经细胞存活，感觉上皮区域由于外毛细胞大量死亡，神经突起大部分回缩，有少部分残留在上皮局部，末梢形成膨大，此外残留的部分内毛细胞和神经元之间的联系仍然存在，可追随TuJ1的荧光信号至神经元胞体。
本发明提供了一种实现成年鼠支持细胞向毛细胞转分化的方法，将表达Atoh1的Ad5病毒在无血清培养液稀释到5×1010，然后以(1-5)×1010pfu/mL滴度加至上述培养的共培养结构中，置于含5％CO2的37℃无菌培养环境中过夜，每日更换培养液；培养时间为14天。培养后14天固定标本，分离内耳感觉上皮，并进行免疫组织化学染色，观察有异位毛细胞的产生，同时进行相关鉴定。
本发明提供了实现成年鼠支持细胞向毛细胞转分化的方法在探索哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路在毛细胞再生调控中的关键作用中的应用。本发明发现耳蜗体外培养过程中伴随着mTOR信号通路的活化，可能在毛细胞再生调控中发挥重要作用。此前的研究表明在成年鼠阶段内耳感觉上皮中上调Atoh1不能够产生新生毛细胞，而本发明目前的研究结果显示体外培养的成年哺乳动物耳蜗中支持细胞能够转分化为毛细胞，展示出体外培养体系与体内环境中存在差异。PI3K/mTOR信号通路通过调控Cap-依赖蛋白翻译的起始调控对细胞生长和大小进行调节，有研究表明mTOR信号通路在包括神经轴突在内的等多种组织细胞的再生过程中发挥重要作用。本发明前期的研究表明在磷酸化的S6(p-S6)在内耳听觉上皮中的表达具有发育依赖性，胚胎发育的早期存在大量的p-S6，但是在成年阶段p-S6仅局限表达在内外柱细胞中，有研究认为在应激状态下，如组织缺氧，mTOR信号受到抑制从而维持机体能量的稳定和存活，是一个在进化过程的保守的应激反应。由于体外培养对于听觉上皮细胞而言是一个应激的过程，本发明通过检测培养5天后的听觉上皮中p-S6的表达，了解mTOR信号通路的活化状态。结果表明，相对于成年鼠耳蜗p-S6表达局限于内外柱细胞，培养后的感觉上皮中p-S6的表达显著上调，不仅仅局限于柱状细胞，而是表达在绝大部分Sox-2阳性的支持细胞以及部分周围细胞中。培养以后的感觉上皮，mTOR信号通路全面活化，本来在成年鼠阶段局限于内外柱细胞的mTOR信号通路的重要靶标p-S6，在几乎所有的支持细胞和周围细胞中出现表达上调，但是EdU增殖实验显示，支持细胞仍处于增殖后的静止状态。这些研究均表明，在此培养体系中，支持细胞在一定程度上维持了其特性，但是分化相关基因表达有所下调，mTOR信号通路存在不同程度的活化，可能是体外培养体系中毛细胞能够再生的关键调控因素。
本发明提供了上述方法培养的共培养结构在成年哺乳动物内耳支持细胞增殖与转分化相关研究、毛细胞分化与成熟相关研究、新生毛细胞与螺旋神经节神经元突触连接相关研究中的应用。
本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：本发明建立了首个成年哺乳动物耳蜗感觉上皮和螺旋神经节神经元的一体化培养体系，能够长时程的维持内耳感觉上皮结构的完整以及支持细胞和螺旋神经节神经元的存活，为研究成年哺乳动物内耳支持细胞增殖与转分化、毛细胞分化与成熟、新生毛细胞与螺旋神经节神经元突触连接的建立提供了研究模型。该发明将用于筛选促进成年哺乳动物耳蜗毛细胞的小分子化合物，研究多种基因调控对耳蜗支持细胞增殖和分化的调控机制，探索促进毛细胞分化成熟并建立神经环路的生物学策略，有力的推动耳神经疾病的听觉功能的重建研究。本发明成果构建出的成年哺乳动物耳蜗感觉上皮与螺旋神经节神经元一体化培养体系，填补了领域内的模型的空白，研究水平达到国际领先。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例成年鼠耳蜗培养中，通过解剖维持的耳蜗的形态和结构图；其中：(a1)成年小鼠耳蜗顶面观-虚线表示需要去除的耳蜗顶圈骨质部分，以及去除相应骨质之后的局部放大图片；(a2)成年小鼠耳蜗底面观-虚线圆表示需要去除的耳蜗底圈骨质部分，以及去除相应骨质之后的局部放大图片；(b)利用Gfi1-Cre-Tm-red转基因小鼠特异性的将耳蜗感觉上皮中毛细胞标记上红色荧光，实时观察毛细胞的存活状态，结果发现外毛细胞的消失在培养30分钟就开始了，在12小时，来自外毛细胞区域的荧光信号几乎完全消失，相比之下，大多数内毛细胞在培养中存活长达24小时以上；(c)利用Sox2-CreER-Tm-red转基因小鼠特异性的奖耳蜗感觉上皮中支持细胞标记上红色荧光，实时观察支持细胞的存活状态，结果发现感觉上皮去的荧光信号在培养21天后持续存在，表明大部分SC在长期培养中存活。
图2为本发明实施例螺旋神经节神经元在成年鼠耳蜗培养体系中长期存活效果图；其中：(a)用TUJ1标记法检测新鲜解剖的成人耳蜗内的螺旋神经节神经元；(b)培养5天或(c)14天后，蜗轴中仍可见大量的TUJ1+螺旋神经节神经元，整体结构维护良好。
图3为本发明实施例腺病毒能够感染培养的成年鼠耳蜗感觉上皮中各支持细胞亚型和SC亚型和内毛细胞效果图；其中：(a，b)Ad-GFP感染培养成年鼠耳蜗(顶圈和部分中圈)的表面图，GFP主要定位于感觉上皮区(SER)和边缘区(Lib)；(c，d)SER的横切面显示感染的支持细胞亚型(SOX2+/GFP+)，根据其在Corti器官中的位置，包括内外支柱细胞(IPCs和OPCs)、Deiters细胞(DCs)和内指细胞(IPhCs)，Corti隧道以虚线区域标示；(e)Ad-GFP亦能感染存活的内毛细胞(MYO7A+/GFP+)；(f，g)定量和比较Ad-GFP感染的支持细胞和内毛细胞比率；(h1-h3)谱系追踪研究表明，培养的SOX2-CreER-Tm-red成年鼠耳蜗中，Tm-red和GFP共定位于感觉上皮的支持细胞；(h，i1-i3)感觉上皮区域的横切面显示Tm-red和GFP在SCs中共定位。
图4为本发明实施例Atoh1诱导产生的产生新生毛细胞能够与螺旋神经元建立物理连接效果图；其中：(a1-a3)新鲜解剖的成年鼠耳蜗显示螺旋神经节神经纤维在感觉上皮区的分布；(b1-b3)卡那霉素/速尿共同注射造成成年鼠耳蜗外毛细胞损伤模型中，观察到外毛细胞的缺失和神经纤维从感觉上皮区域的退缩；(c1-c3)卡那霉素/速尿共同注射造成成年鼠耳蜗外毛细胞损伤模型中，用Ad-V5感染培养14天后，成年鼠耳蜗外毛细胞区未见新生毛细胞和神经纤维，存活的内毛细胞部分与残余的神经纤维直接接触(箭头)；(d1-d3)卡那霉素/速尿共同注射造成成年鼠耳蜗外毛细胞损伤模型中，用Ad-Atoh1感染培养14天，耳蜗外毛细胞区出现新生毛细胞样细胞和神经纤维的分布；新生毛细胞(MYO7A+)直接与神经突(箭头)接触。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
本发明涉及的实验动物具体如下：本发明所用动物为6-8周C57BL/6小鼠，Sox2-CreER转基因小鼠和tdTomato报告小鼠来自Jackson实验室(编号#017593；007914)；在Gfi1启动子控制下表达tdTomato的转基因小鼠(Gfi1tm1(Cre)Gan；R26tdTomato)，所有实验都是在符合道德规范的情况下进行的，并得到了马萨诸塞州眼耳动物护理委员会和哈佛医学院的批准。
本发明采用的谱系追踪技术：6-8周龄Sox2-CreER/tdTf/f小鼠每天注射他莫昔芬(75mg/kg)，连续3天激活tdTomato的表达将Sox2+支持细胞标记上红色荧光后解剖耳蜗培养，用以后续的研究中追踪支持细胞。
病毒转染技术：病毒转染时，以(1-5)×1010pfu/ml滴度将腺病毒加入培养物中过夜，然后用新鲜培养基替代。Ad-Atoh1和Ad-V5购自马里兰州Rockville的SignaGen实验室。Ad-GFP购自得克萨斯州休斯顿贝勒医学院的载体实验室。
免疫荧光标记技术：培养的标本在4％多聚甲醛固定，4℃过夜，然后是在120mMEDTA脱钙作用1-2天，脱钙的耳蜗按照标准程序进行感觉上皮的分离，并进行后续的免疫荧光染色，使用的抗体见表1所示。
表1使用的抗体情况
Figure BDA0002937093680000061
共聚焦成像技术：共聚焦显微镜使用莱卡TCS SP8和莱卡应用套件高级荧光(LASAF)软件V2.6.0。图像采集采用不同激光通道顺序扫描。使用ImageJ包(https://imagej.nih.gov/ij)处理共焦图像。Z-stacks相同数量的相邻的图像光学部分被用于处理相同的参数，包括中值滤波和调整亮度和对比度。
本发明涉及的技术步骤如下：(1)保留骨性支架的耳蜗感觉上皮和螺旋神经节神经元三维培养体系的建立，实时显示毛细胞和支持细胞的存活状态，利用组织铺片和切片技术明确毛细胞、支持细胞以及螺旋神经节神经元的存活状态；(2)腺病毒高效转染耳蜗感觉上皮支持细胞，表达外源性基因Atoh1，实现支持细胞向毛细胞的直接转分化，并与神经元建立物理连接；(3)探索mTOR信号通路在毛细胞再生调控中的关键作用。
其中步骤(1)通过如下方法实现：
第一步，建立保留骨性支架的内耳感觉上皮和螺旋神经节神经元的共培养体系。
使用Isoflorane麻醉6-8周C57BL/6小鼠后断头，使用无菌器械经正中矢状裂开头骨和脑组织，锐性离断听神经和面神经后取出两侧颞骨，置于冰的HBSS液中，在解剖显微镜下暴露听泡，使用镊子打开听泡，去除周围软组织及多余骨质，用无菌镊子打开耳蜗顶部的骨性结构，用纤细的金属针去除前庭膜，仔细分离并去除螺旋韧带，在此过程中减少对感觉上皮的触碰和损伤；同时用镊子打开耳蜗底部的骨性结构，以使培养液能够充分的渗透并接触到耳蜗感觉上皮；从内耳骨性结构上钝性分离前庭部分，在仅保留的耳蜗部分结构上去除圆窗膜，促使培养液充分接触耳蜗底圈部分。将解剖后的带有骨性支架的内耳感觉上皮和螺旋神经节神经元的共培养结构，置于每孔含0.5ml的培养液的48孔板中，在含5％CO2的37℃无菌培养箱中继续培养。培养液由等比例的DMEM和F12构成，并添加N2(100×)，B27(50×)和青霉素，每0.5mL所述培养液中，100×N2的加入量为5μL，50×B27的加入量为10μL，青霉素的终浓度为50IU/mL；每日更换培养液，分别在培养的第4天，第7天，第14天和第21天固定标本，组织脱钙后分离内耳感觉上皮，通过免疫组织化学染色，观察组织的整体保存情况和细胞亚群的存活状态。
第二步，利用转基因动物，实时显示内耳感觉上皮中毛细胞和支持细胞的存活状态。
分别应用Gfi1 Cre-tdTomato和Sox2 Cre-tdTomato小鼠分别特异性的标记毛细胞和支持细胞，存活的细胞将在荧光显微镜下呈现出红色荧光，在固定的时间(毛细胞：分离后即刻，培养30分钟，培养150分钟，培养12小时，培养24小时；支持细胞：分离后即刻，培养7天，培养14天，培养21天)观察荧光的分布范围和强度能够了解细胞的存活状态。
第三步，通过培养后的组织切片中蜗轴区域螺旋神经节神经元的密度了解神经元存活状态。
在本发明的培养体系中，尽量保持了螺旋神经节和感觉上皮之间连接的完整性，在长时间的培养之后，固定标本，脱钙后制备厚度为10μm的冰冻切片，联合TUJ1、Myo7a和Sox2的染色明确神经节神经元的存活状态，以及神经纤维的存活和伸展情况。
长时程培养后发现：这种保留骨性之间的成年哺乳动物耳蜗整体培养体系，能够很好的保持感觉上皮结构的完整性和螺旋神经节神经元。就支持细胞而言，依据内外柱状细胞之间的隧道将感觉上皮支持细胞分为内侧部和外侧部两部分，并根据感觉上皮的位置将其分为4段，分别是顶段，中顶段，中底段和底段，并选择不同的培养时间点的多个样本进行Sox-2的免疫组织化学染色，分段分部计数sox-2阳性细胞的数目，结果显示在长期的培养过程中，支持细胞的数目随着培养时间的延长逐渐减少，相对而言，顶段和中顶段存活状态较好，在连续三周的培养过程中支持细胞的数目相对稳定大部分的支持细胞能够存活至2-3周，维持了耳蜗Corti器的三维立体结构，并且持续表达支持细胞特异性的分子标志物。就毛细胞而言，外毛细胞对于环境的变化非常敏感，培养30分钟后外毛细胞明显肿胀，部分缺失，培养150分钟后，仅顶圈残留少量的外毛细胞，培养12小时及24小时之后，外毛细胞完全死亡；内毛细胞抵抗体外培养环境的能力较强，在短期的培养过程中存活状况良好，在听觉上皮中的位置相对固定，仍表达特异性的毛细胞标记Myo7a和纤毛蛋白Espin，但在长期培养的过程中，内毛细胞存活的变异较大。就螺旋神经节神经元而言，在长时间的培养之后，TUJ1染色结果显示，仍有大量的螺旋神经节神经细胞存活，感觉上皮区域由于外毛细胞的大量死亡，神经突起大部分回缩，仍有少部分残留在上皮局部，末梢形成膨大，此外残留的部分内毛细胞和神经元之间的联系仍然存在，可以追随TuJ1的荧光信号至神经元胞体。成年鼠耳蜗培养中，通过解剖维持的耳蜗的形态和结构如图1所示；螺旋神经节神经元在成年鼠耳蜗培养体系中长期存活效果如图2所示。
其中步骤(2)通过如下方法实现：
第一步，利用腺病毒载体成功转染培养的成年哺乳动物感觉上皮，实现外源基因的高效和广泛表达，为培养体系内的基因调控提供了技术手段。
将表达GFP的Ad5病毒在无血清培养液稀释到1×1010，将培养的耳蜗放入病毒工作液中，置于含5％CO2的37℃无菌培养箱过夜，次日更换培养基。在不同的培养时间点固定标本，分离内耳感觉上皮，并进行免疫组织化学染色，观察转染的效率和外源性基因的表达水平。结果发现：Ad5-GFP转染培养的成年鼠耳蜗后，感觉上皮区域和Limbus区域均能被病毒转染并特异性的表达GFP，感觉上皮区存活的内毛细胞和支持细胞的各亚群，包括内外柱细胞、Deiter细胞、Border细胞等均在在短期内(12小时)开始表达GFP信号，并且这种GFP信号在培养的状态下能够持续14天以上，为利用此模型进行基因功能的研究奠定了基础。
第二步，利用腺病毒载体高表达对毛细胞分化具有重要作用的基因Atoh1，实现支持细胞向毛细胞的直接转分化，新生毛细胞能够与螺旋神经节神经元建立物理连接。
将表达Atoh1的Ad5病毒在无血清培养液稀释到5×1010，将培养的耳蜗放入病毒工作液中，置于含5％CO2的37℃无菌培养箱过夜，次日更换培养基。培养后14天固定标本，分离内耳感觉上皮，并进行免疫组织化学染色，观察有异位毛细胞的产生，同时进行相关鉴定。结果发现，在培养的成年哺乳动物耳蜗中，高表达Atoh1能够促使感觉区支持细胞转分化为毛细胞，并表达包括Parvalbumin、Myo7a、Espin等在内的多种毛细胞标记物，部分新生毛细胞呈现出PTPRQ和Actin阳性的幼稚纤毛样结构和动纤毛结构。
联合毛细胞和神经纤维标志物的染色结果显示，在感觉上皮区新生的毛细胞能够趋化螺旋神经节神经元生长神经纤维，并与新生毛细胞建立物理连接，表现在感觉上皮区域神经纤维密度的整体增加，同时观察到神经纤维对毛细胞的缠绕与物理接触现象。腺病毒能够感染培养的成年鼠耳蜗感觉上皮中各支持细胞亚型和SC亚型和内毛细胞如图3所示。Atoh1诱导产生的产生新生毛细胞能够与螺旋神经元建立物理连接如图4所示。
本发明建立的系统能够同时培养内耳感觉上皮和螺旋神经节神经元，同时在有毛细胞新生的情况下能够趋化神经元纤维的生长，将为研究毛细胞再生、突触功能的建立提供很好的模型。
其中步骤(3)通过如下方法实现：耳蜗体外培养过程中伴随着mTOR信号通路的活化，可能在毛细胞再生调控中发挥重要作用。
此前的研究表明在成年鼠阶段内耳感觉上皮中上调Atoh1不能够产生新生毛细胞，而本发明目前的研究结果显示体外培养的成年哺乳动物耳蜗中支持细胞能够转分化为毛细胞，展示出体外培养体系与体内环境中存在差异。PI3K/mTOR信号通路通过调控Cap-依赖蛋白翻译的起始调控对细胞生长和大小进行调节，有研究表明mTOR信号通路在包括神经轴突在内的等多种组织细胞的再生过程中发挥重要作用。本发明前期的研究表明在磷酸化的S6(p-S6)在内耳听觉上皮中的表达具有发育依赖性，胚胎发育的早期存在大量的p-S6，但是在成年阶段p-S6仅局限表达在内外柱细胞中，有研究认为在应激状态下，如组织缺氧，mTOR信号受到抑制从而维持机体能量的稳定和存活，是一个在进化过程的保守的应激反应。由于体外培养对于听觉上皮细胞而言是一个应激的过程，本发明通过检测培养5天后的听觉上皮中p-S6的表达，了解mTOR信号通路的活化状态。结果表明，相对于成年鼠耳蜗p-S6表达局限于内外柱细胞，培养后的感觉上皮中p-S6的表达显著上调，不仅仅局限于柱状细胞，而是表达在绝大部分Sox-2阳性的支持细胞以及部分周围细胞中。培养以后的感觉上皮，mTOR信号通路全面活化，本来在成年鼠阶段局限于内外柱细胞的mTOR信号通路的重要靶标p-S6，在几乎所有的支持细胞和周围细胞中出现表达上调，但是EdU增殖实验显示，支持细胞仍处于增殖后的静止状态。这些研究均表明，在此培养体系中，支持细胞在一定程度上维持了其特性，但是分化相关基因表达有所下调，mTOR信号通路存在不同程度的活化，可能是体外培养体系中毛细胞能够再生的关键调控因素。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的发明内容。

Claims (5)

1.一种成年鼠耳蜗体外培养体系的建立方法，其特征在于：将成年鼠的带有骨性支架的内耳感觉上皮和螺旋神经节神经元的共培养结构置于培养液中进行培养，定期更换培养液；所述培养液的组分包括N2、B27和青霉素；
成年鼠的带有骨性支架的内耳感觉上皮和螺旋神经节神经元的共培养结构的获取包括步骤：裂开小鼠头骨和脑组织，锐性离断听神经和面神经后取出两侧颞骨，置于冰的HBSS液中，打开听泡，去除周围软组织及多余骨质；打开耳蜗顶部的骨性结构，去除前庭膜，分离并去除螺旋韧带；打开耳蜗底部的骨性结构，从内耳骨性结构上钝性分离前庭部分，在仅保留的耳蜗部分结构上去掉圆窗膜；
所述培养液的组分还包括等体积的DMEM和F12；每0.5mL所述培养液中，100×N2的加入量为5μL，50×B27的加入量为10μL，青霉素的终浓度为50IU/mL；
采用Gfi1 Cre-tdTomato 和Sox2 Cre-tdTomato小鼠分别特异性的标记毛细胞和支持细胞，通过连续3天注射他莫昔芬的方式激活tdTomato的表达，将Sox2+支持细胞标记上红色荧光后解剖耳蜗进行培养，之后在特定的时间观察荧光的分布范围和强度从而判定细胞的存活状态；
在特定的时间固定培养的标本，组织脱钙后制备冰冻切片，联合TUJ1、Myo7a和Sox2的染色明确神经节神经元的存活状态，以及神经纤维的存活和伸展情况；
对于支持细胞，顶段和中顶段支持细胞存活状态较好，在连续三周的培养过程中支持细胞的数目相对稳定，大部分支持细胞能存活至2-3周，维持了耳蜗Corti器的三维立体结构，并且持续表达支持细胞特异性的分子标志物；对于毛细胞，培养30分钟后外毛细胞明显肿胀，部分缺失，培养150分钟后，仅顶圈残留少量外毛细胞，培养24小时后，外毛细胞完全死亡；内毛细胞在短期的培养过程中存活状况良好，在听觉上皮中的位置相对固定，仍表达特异性的毛细胞标记Myo7a和纤毛蛋白Espin，在长期培养的过程中内毛细胞存活的变异较大；对于螺旋神经节神经元，长时间培养后仍有大量螺旋神经节神经细胞存活，感觉上皮区域由于外毛细胞大量死亡，神经突起大部分回缩，有少部分残留在上皮局部，末梢形成膨大，此外残留的部分内毛细胞和神经元之间的联系仍然存在，可追随TuJ1的荧光信号至神经元胞体。
2.根据权利要求1所述的成年鼠耳蜗体外培养体系的建立方法，其特征在于：所述成年鼠为6-8周小鼠；所述培养的条件为含5% CO2的37℃的无菌环境；所述培养液的更换周期为1天。
3.一种实现成年鼠支持细胞向毛细胞转分化的方法，其特征在于：将表达Atoh1的Ad5病毒在无血清培养液稀释到5×1010，然后以（1-5）×1010pfu /mL滴度加至权利要求1-2任一项所述的方法培养的共培养结构中，置于含5% CO2的37℃无菌培养环境中过夜，每日更换培养液；培养时间为14天。
4.权利要求3所述的方法在探索mTOR信号通路在毛细胞再生调控中的关键作用中的应用。
5.根据权利要求1-2任一项所述的方法培养的共培养结构的应用，其特征在于：在成年哺乳动物内耳支持细胞增殖与转分化相关研究、毛细胞分化与成熟相关研究、新生毛细胞与螺旋神经节神经元突触连接相关研究中的应用。
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