CN1181704A - 胶质细胞神经营养因子(gdnf)在治疗听觉疾病中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明一般涉及经过施用胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)防止和/或治疗耳蜗(和前庭)毛细胞和螺旋神经节神经元损伤或退化的方法。更具体地说,本发明涉及治疗感觉神经性听力丧失的方法。

Description

胶质细胞神经营养因子(GDNF)在治疗听觉疾病中的用途

发明的背景

一般来说，本发明涉及经过施用胶质细胞系产生的神经营养因子(GDNF)蛋白产物来防止和/或治疗内耳感觉细胞，如毛细胞和听觉神经元的损伤或退化的方法。更具体地说，本发明涉及防止和/或治疗由各种原因引起的听力丧失的方法。

神经营养因子是在神经系统或由神经系统的神经支配的非神经组织中发现的天然蛋白质，其功能是促进存活并维持某些神经和/或胶质细胞群体的表型分化(Varon等，神经科学回顾年报，1：327，1979；Thoenen等，科学，229：238，1985)。由于该生理作用，神经营养因子在治疗这类神经细胞的退化和由神经损伤引起的分化功能丧失中有用。由损伤一种或多种类型的神经细胞的存活和/或适当功能的情况引起的神经损伤包括：(1)物理损伤，它引起轴突突起(它随后引起神经细胞死亡)和/或靠近损伤位点的神经细胞体退化，(2)部分神经系统的暂时或永久性停止血流(局部缺血)，如中风，(3)有意或偶尔接触神经毒素，如癌和AIDS化学治疗剂，分别为顺氯氨铂和双脱氧胞苷，(4)慢性代谢疾病，如糖尿病或肾机能障碍，或(5)诸如帕金森氏疾病，阿耳氏海默症和肌萎缩性侧索硬化的神经退化性疾病，它由特定神经元群体的退化引起。为了使特定神经营养因子在治疗神经损伤中有用，损伤神经细胞的一种或多种类型必须对该因子反应。已确定不是所有的神经元群体都对所有的神经营养因子应答或同等受其影响。

待鉴定的第一个神经营养因子是神经生长因子(NGF)。NGF是定义的营养因子家族的第一个成员，其中该营养因子称为神经营养蛋白，一般包括大脑来源的神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3(NT-3)，NT-4/5，和NT-6(Thoenen，神经科学动向：14：165-170，1991；Snider，细胞，77：627-638，1994；Bothwell，神经科学回顾年报，18：223-253，1995)。已知这些神经营养蛋白经过trk酪氨酸激酶受体家族，即trkA，trkB，trkC和低亲合力的p75受体发挥作用(Snider，细胞，77：627-638，1994；Bothwell，神经科学回顾年报，18：223-253，1995；Chao等，TINS 18：321-326，1995)。

胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)是一种最近发现的蛋白质，使用基于其在体外促进存活和刺激中脑多巴胺能的神经元的递质表型的效力的试验来鉴定和纯化(Lin等，科学，260：1130-1132，1993)。GDNF是糖苷化的二硫键连接的同型二聚体，它与转化生长因子β(TGF-β)超家族蛋白质有一些结构同源性(Lin等，科学，260：1130-1132，1993；Krieglstein等，EMBO J.14：736-742，1995；Poulsen等，神经元，13：1245-1252，1994)。在外周神经系统肌肉和Schwann细胞中(Henderson等，科学，266：1062-1064，1994；Trupp等，细胞生物学杂志，130：137-148，1995)以及在中央神经系统I型星形细胞中(Schaar等，神经学实验，124：368-371，1993)已检测到GDNF mRNA。在体内，用外源性GDNF处理刺激灰质神经元的多巴胺能表型并恢复在帕金森氏疾病动物模型中由轴突切除或多巴胺能神经毒素引起的功能缺陷(Hudson等，大脑研究通报，36：425-432，1995；Beck等，自然，373：339-341，1995；Tomac等，自然，373：335-339，1995；Hoffer等，神经科学通讯，182：107-111，1994)。尽管最初认为至少在体外GDNF对多巴胺能神经元具有相对的特异性，但现在出现的证据表明GDNF除对中脑多巴胺能和躯体运动神经元外具有更广泛的神经营养靶向(Yan和Matheson，自然，373：341-344，1995；Oppenheim等，自然，373：344-346，1995；Matheson等，神经科学联合会交流文摘，21，544，1995；Trupp等，细胞生物学杂志，130：137-148，1995)。具体地说，发现GDNF对体内和体外的脑干和脊髓胆碱能运动神经元(Oppenheim等，自然，373：344-346，1995；Zurn等，神经报道，6：113-118，1994；Yan等，自然，373：341-344，1995；Henderson等，科学，266：1062-1064，1994)，对视神经元，如体外光感受器(申请日为1995年11月29日，Louis的目前未决的美国申请流水号08/564,833)和体外及体内的视神经节细胞(申请日为1995年11月29日的Yan的目前未决的美国申请流水号08/564,458)和对来自后根神经节的感觉神经元在体外和体内(申请日为1995年11月29日的Yan等的目前未决的美国申请流水号08/564,844)都有神经营养效力。

对本发明一般感兴趣的是1993年4月1日公开的WO93/06116(Lin等，Syntex-Synergen Neuroscience Joint Venture)，它报道了GDNF对于治疗神经损伤，包括与帕金森氏疾病相关的损伤有用。还感兴趣的是在Schmidt-Kastner等，分子大脑研究，26：325-330，1994中报道的可检测到GDNF mRNA且在毛果碱诱导的发作后GDNFmRNA上调；在Schaar等，神经学实验，124：368-371，1993和Schaar等，神经学实验，130：387-393，1994中报道的在培养条件下基部前脑星形细胞表达中等水平的GDNF mRNA，但GDNF不改变基部前脑ChAT活性；在1995年9月28日申请的目前未决的美国申请流水号08/535,682中报道了GDNF对于治疗基部前脑胆碱能神经元的损伤或退化有用。但以前未显示GDNF促进对诸如毛细胞和听神经元的内耳细胞退化的存活，再生或保护。

内耳Corti器官的神经上皮毛细胞将声音转导成神经活性，沿第八脑神经的耳蜗部分传递。这一神经由来自3类神经元的纤维组成(Spoendlin，H.H.在：Friedmann，I.Ballantyne，J.，编辑，内耳的超微结构图谱；伦敦，Butterworth，pp.133-164，1984)：1)传入神经元，位于螺旋神经节且连接耳蜗与脑干。2)传出橄榄体耳蜗神经，它在上橄榄复合物中产生，3)自主肾上腺素能神经元，它在颈交感神经于中产生并支配耳蜗。在人类，有大约30,000个具有有髓轴突的传入耳蜗神经元，各轴突由大约50层的薄层组成，直径4-6μm。该组织学结构形成了均匀传导速率的基础，它是一个重要的功能特征。在听神经的全长上，有传入纤维的营养结构，具有以螺旋绳状方式绕中央放置的“顶端”纤维包裹的“基部”纤维。Spoendlin(Spoendlin，H.H.在Naunton，R.F.，Fernadex，C.编辑，听神经系统的诱发电活性。伦敦，学院出版社，pp.21-39，1978)根据形态学区别在螺旋神经节中鉴定了两类传入神经元：I型细胞(95％)具有两极且具有有髓细胞体和伸向内部毛细胞的轴突。II型细胞(5％)是单极的且具有无髓轴突并伸向Corti器外部毛细胞。每个内部毛细胞受大约20个纤维支配，每根纤维仅与一个细胞有突触。相反，每个外部毛细胞受大约6根纤维支配，且每根纤维分枝支持大约10个细胞。在耳蜗内，纤维分成：1)内部螺旋组，它最初从同侧产生并以传入神经元突触内部毛细胞，和2)更多的外部辐射组，主要从相反侧产生并直接与外部毛细胞突触。在一个频率，特征性或最佳频率处有最小阈值，但对于频率高于和低于该水平时阈值突然升高(Pickles，J.O.在：听力生理学入门，伦敦，学院出版社，pp.71-106，1982)。因此单个听神经纤维似乎作为带通过滤波器发挥作用。基膜沿其长度在不同的距离时振动偏向不同的频率，各耳蜗神经纤维的频率选择与纤维所连接的内部毛细胞相似。因此，各耳蜗神经纤维表现出从其相邻纤维覆盖不同频率范围的转变曲线(Evans，E.F.在：Beagley H.A.编辑，听觉研究：科学和技术基础。纽约，Oxord大学出版社，1979)。以该机制，内耳滤波器将复合声音分解成频率成份(频率分解)。

足以影响交际和与工作有关的联系的听力丧失程度是在美国公众中最常见的慢性神经损伤。根据健康访问资料(生命和健康统计。系列10，第176号，华盛顿区，(DHHS出版号，(PHS)90-1504))，估计大约4％的45岁以下的人和大约29％的65岁或以上的人具有障碍性听力丧失。估计超过2千8百万的美国人具有听力损伤且其中2百万之多的人极度耳聋(国家统计计划任务报告，Bethesda，Md.：国家卫生研究院，1989)。听力丧失的流行随年龄显著增加。大约每1000个婴儿中有1个听力丧失的严重程度足以阻止口语的独立发展(Gentile，A等，听力损伤的病人特征：美国，1962-1963，系列10，第35号。华盛顿区：政府出版室，1967(DHHS出版号，(PHS)1000)(人类交往和其疾病：综述，Bethesda，Md.：国家卫生研究院，1970)。75岁以上每1000人中超过360人具有障碍性听力丧失(生命和健康统计。系列10，第176号，华盛顿区(DHHS出版号：(PHS)90-1504)。

估计对于听，说和语言疾病每年花费的产值损失，特殊教育和医学治疗超过300亿美元(国家耳聋和其它交往疾病顾问委员会1990年年度报告，华盛顿区：政府出版室，1991。(DHHS出版号：(NIH)91-3189)。儿童极度耳聋的大多数常见病因是遗传疾病和脑膜炎，分别占总数的大约13％和9％(Hotchkiss，D.听力损伤的人口统计情况：问题和答案。第二版，华盛顿，D.C.：Gallaudet大学出版社，1989)。在儿童耳聋的病例中大约50％的病例不知其病因，但很可能是由于遗传原因或诱因(Nance WE.Sweeney A.Otolaryngol.Clin.NorthAm 1975；8：19-48)。

从外部听觉通道到中央神经系统，沿听觉途径的任意一处的损伤都可能导致听力丧失。听觉器官可分成外耳、中耳、内耳和听觉神经及中央听觉途径。经过内耳大约15,000个神经上皮细胞(毛细胞)和30,000第一级神经元(螺旋神经节细胞)的活动将人类的听觉信息从机械信号转导成神经传导的电脉冲。所有的螺旋神经节神经元的中央纤维在脑干桥的耳蜗核中形成突触。从耳蜗到听觉脑干和听觉脑皮层，与听力有关的神经元数目显著增加。所有听觉信息仅由15,000个毛细胞转导，其中数目为3500个的所谓的内部毛细胞十分重要，因为它们与30,000一级听觉神经元的大约90％形成突触。因此，在听觉外周相当少数细胞的损伤可能导致基本上丧失听力。因而，感觉神经丧失的大多数原因可能归因于内耳病灶(Nadol，J.B.，新英格兰医学杂志，1993，329：1092-1102)。

听力丧失可能在传导水平，感觉神经和中央水平上。传导性听力丧失由涉及外耳或中耳的病灶引起，导致由鼓膜和听小骨放大的空气传播的声音向内耳流体的正常途径破坏。感觉神经性听力丧失由耳蜗或第八脑神经听觉部分的病灶引起。中央听觉丧失由中央听觉途径的损伤引起。它们由耳蜗和背侧橄榄核复合物，下丘脑，中间膝状体，颞叶听觉脑皮层和互相连系的传入和传出纤维束组成(Adams.R.D.和Maurice，V.编辑，在：神经学原理，1989。McGraw-Hill信息服务公司，p226-246)。

如前所述，至少50％的极度耳聋的儿童病例具有遗传学原因(Brown.K.S.北美临床医学，1969；53：741-72)。如果考虑到遗传素质是老年性或与年龄相关的听力丧失(影响75岁以上的1/3的人)的主要引发因素的可能性，遗传和遗传因素很可能是听力丧失的一个最常见的诱因。遗传异常表现为感觉神经性听力丧失比传导性听力丧失要常见得多。遗传决定的感觉神经性听力丧失很明显占大多数，如果感觉神经性丧失不是主要的原因，特别是在儿童中(Nance WE，Sweeney A.北美临床耳鼻喉科学1975；8：19-48)。感觉神经丧失的最常见的综合症形式是Waardenburg氏综合症，Alport氏综合症和Usher氏综合症。

许多常用的药品具有听觉毒性特征。最熟知的是氨基糖苷抗生素(Lerner，S.A.等编辑，氨基糖苷听觉毒性。Boston：Little，Brown，1981；Smith，C.R.等，新英格兰医学杂志，1980；302：1106-9)，环状利尿剂(Bosher，S.K.，耳鼻喉科学报，(Stockh)1980；90：4-54)，水杨酸盐(Myers，E.N.等，新英格兰医学杂志，1965；273：587-90)和抗肿瘤剂，如顺氯氨铂(Strauss，M.等，喉镜，1983；143：1263-5)。也描述了口服或肠胃外施用红霉素的听觉毒性(Kroboth，P.D.等，Arch.Intern.Med.1983；1：16979；Achweitzer，V.G.，Olson.N.耳鼻喉科学学报，1984；110：258-60)。

大多数听觉毒性物质经过损伤耳蜗，特别是听毛细胞和负责液体和电解质内环境稳定的内耳特化的上皮器官血管纹引起听力丧失(Nadol，J.B.新英格兰医学杂志1993，329：1092-1102)。次级神经退化可在听觉毒性过程影响毛细胞后许多年才发生。有证据表明尽管使用间断的全身性用药，但某些听毒性物质可能选择性地在内耳浓缩，导致感觉神经逐渐丧失(Federspil，P.等，传染病杂志，1976；134增刊：S200-S205)。

过强声刺激引起的创伤是耳聋的另一起因。有些个体对噪声创伤敏感。临床上重要的感觉神经听力丧失可能出现在接触高强度噪声的一些人中，即使在职业安全和健康机构批准的噪声水平之下(Osguthorpe，J.P编辑，华盛顿区：美国耳鼻喉科学院-头颈外科基金会，1988)。

脱髓鞘过程，如多处硬化可能引起感觉神经听力丧失(Noffsinger，D等，耳鼻喉科学学报增刊(Stockh)1972；303：1-63)。最近，已识别一种免疫介导的感觉神经听力丧失形式(McCabe，B.F.耳鼻喉科学年报，1979；88：585-9)。听力丧失通常是双侧的且迅速恶化(在12周和几月内测出)，可能与前庭症状相关或无关。

各种肿瘤，包括原发性和转移性肿瘤都经过侵入内耳或听神经产生传导性听力丧失或感觉神经听力丧失(Houck，J.R.等，耳鼻喉科学头颈外科，1992；106：92-7)。各种未知原因的退化性疾病可能产生感觉神经性听力丧失。Meniere氏综合症(Nadol，J.B.编辑，Meniere氏疾病，病因，病理，诊断和治疗。Amsterdam：Kugler和Ghedini 1989)特征为波动性感觉神经听力丧失，间断性退化和耳鸣，它似乎由内耳液体内环境平衡性疾病引起，尽管发病机理仍然未知。引起中度至严重感觉神经性耳聋的突然自发性感觉神经性听力丧失(Wilson，W.R.等，耳鼻喉科学学报，1980；106：772-6)可能由各种原因引起，包括内耳局部缺血和病毒性迷路炎。

老年性耳聋，与年龄相关的听力丧失影响超过1/3的75岁以上的老年人。老年性耳聋最常见的组织病理学关联是失去神经上皮(毛)细胞，神经元和外周听觉系统的血管纹(Schuknecht H.F.耳病理学，Cambridge，Mass：哈佛大学出版社，1974：388-403)。老年性耳聋最好理解为由生活中的一些有害影响，包括噪声创伤、耳毒性和遗传引起的退化的累积效应产生。

某些神经营养性因子已显示出在发育过程中调节神经元分化和存活(Korsching S.J.神经科学，13：2739-2748，1993)并在成年人中保护神经元抵抗损伤和毒性(Hefti，神经科学，6：2155-2162，1986；Apfel等，神经学年报29：87-89，1991；Hyman等，自然，350：230-233，1991；Knusel等，神经科学杂志，12：4391-4402，1992；Yan等，自然，360：753-755，1992；Koliatsos等，神经元，10：359-367，1993)。原位杂交研究表明神经营养蛋白受体TrkB和TrkC的mRNA由发育的耳蜗前庭神经节表达(Ylikoski等，听力研究，65：69-78，1993；Schecterson等，听力研究，73：92-100，1994)，BDNF和NT-3的mRNA在内耳，包括Corti氏器中发现(Pirvola等，美国国家科学院院刊，89：9915-9919，1992；Schecterson等，听力研究，73：92-100，1994；Wheeler等，听力研究，73：46-56，1994)。在携带缺失了BDNF和/或NT-3基因的小鼠中研究了在前庭和听觉系统发育中BDNF和NT-3的生理作用(Ernfors等，神经元14：1153-1164，1995)。在耳蜗中，BDNF突变体失去2型螺旋神经元，引起外毛细胞缺乏神经支配。NT-3突变体显示出缺乏传入神经和失去87％的螺旋神经元。很可能相应于1型神经元，它支配内毛细胞。双重突变体进一步缺失，失去所有的前庭和螺旋神经元。经过研究携带在这些基因酪氨酸激酶催化区有种系突变的小鼠证实特定神经元群体的存活和内耳外周感觉系统靶神经支配的维持需要TrkB和TrkC受体(Schimmang等，发育，121：3381-3391，1995)。Gao等，(神经科学杂志，15：5079-5087，1995)显示了NT-4/5，BDNF和NT-3对解离的培养物中大鼠出生后的螺旋神经节神经元的促进存活效力且NT-4/5保护这些神经元抵抗抗癌药，顺氯氨铂的神经毒性影响。另外，还显示BDNF和NT-3支持解离的培养物中成年大鼠听觉神经元的存活(Lefebvre等，神经报道，5：865-868，1994)。

以前尚无报道使用GDNF治疗听力丧失。由于听力损伤是严重的疾病，鉴定能保护听神经元和毛细胞免受损伤的任何试剂和治疗方法都将会有极大的益处。

发明概述

本发明提供了治疗感觉神经性听力丧失的方法，包含给具有内耳损伤的受试者施用治疗上有效量的胶质细胞系产生的神经营养因子(GDNF)蛋白质产物。例如，听力丧失可以与神经上皮毛细胞(耳蜗毛细胞)或内耳螺旋神经节神经元的损伤或退化相联系。

本发明是基于毛细胞对GDNF应答，抵抗诸如顺氯氨铂和新霉素的听觉毒素的有毒效应，听觉神经元也对GDNF应答抵抗诸如例如顺氯氨铂，新霉素和水杨酸钠的各种听觉毒素的有毒效应的发现。因此，可施用治疗上有效量的GDNF蛋白产物以促进毛细胞和螺旋神经节神经元的保护、存活或再生。

也已经发现前庭器的损伤或障碍也可经过给具有该损伤或障碍的受试者施用治疗上有效量的GDNF蛋白质产物来进行治疗。这类损伤可导致头晕，眩晕或失去平衡。

预期该GDNF蛋白质产物可包括诸如图1(SEQ ID NO：1)所示的氨基酸序列描述的GDNF蛋白质及其变异体和衍生物。还预期该GDNF蛋白质产物可包括[Met^-1]GDNF。

根据本发明，经肠胃外施用GDNF蛋白质产物的剂量范围从大约1μg/kg/天到大约100mg/kg/天，典型的剂量为大约0.1mg/kg/天到大约25mg/kg/天，通常的剂量为大约5mg/kg/天到大约20mg/kg/天。还预期根据不同病人的需要和用药途径，以较低的频率，如每周一次或每周几次，而不是每天一次提供GDNF蛋白质产物。还预期GDNF蛋白质产物可直接施用到中耳或内耳。本领域的技术人员可预料到可使用更少量的GDNF蛋白产物用药，例如，在一次注射或多次注射中，直接中耳或内耳用药剂量范围大约为1μg/耳到大约1mg/耳。

还预期该GDNF蛋白质产物可与有效量的第二治疗剂，如BDNF和NT-3组合或连接来用药。本发明还提供了GDNF蛋白产物在生产用于治疗各种病因的感觉神经性听力丧失中毛细胞和听神经元损伤或退化的药物或药用组合物中的应用。该药用组合物包括局部用药，口服剂或中耳及内耳GDNF蛋白产物组合物或与耳蜗埋植体结合。

本领域的技术人员可预料到用药方法可经过细胞治疗和基因治疗方法实现，如下作进一步的描述。例如，在基因治疗方法中，细胞被修饰成生产和分泌GDNF蛋白产物。细胞可取自体外或在体内进行修饰。考虑到以目前优选的其实施方案进行描述的本发明的下列详细描述，本发明的许多其它的方面和优势对本领域的技术人员而言将是显而易见的。

发明详述

本发明提供了经过施用治疗上有效量的胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)蛋白产物来防止和/或治疗感觉神经性听力丧失的方法。根据本发明的一个方面，提供了经过以药用组合物的方式施用治疗上有效量的GDNF蛋白产物，植入表达GDNF的细胞或GDNF基因治疗来治疗损伤的毛细胞和听神经元的方法。使用任何生物学活性GDNF蛋白质产物，包括在SEQ ID NO：1中描述的氨基酸序列所代表的GDNF蛋白质，包括其变异体和衍生物可实施本发明。除了口服，胃肠外或局部传递GDNF蛋白质产物外，经过细胞治疗和基因治疗方法用药也是可预料到的。

本发明所基于的最初的发现是在大鼠耳蜗分离块培养物中和从成年大鼠培养物中解离的螺旋神经节神经元中GDNF保护毛细胞免受听觉毒素诱导的细胞死亡。预期施用外源性GDNF蛋白质产物会保护毛细胞和螺旋神经节神经元免受创伤(如噪声创伤和顺氯氨铂及氨基糖苷抗生素的急性或慢性治疗)或免受因阻断该因子从轴突运输到细胞体引起缺乏神经营养因子而产生的损伤。预期该治疗使毛细胞和/或听神经元能耐受由环境噪声损伤或用听觉毒素治疗引起的间歇性损害并延缓听神经元和毛细胞的逐渐退化，该退化在诸如老年性耳聋(与年龄有关的听力丧失)，遗传的感觉神经退化和后天自发性听力丧失的病理情况下导致听力丧失且该治疗能保护内耳的功能完整性。它还支持听觉神经元使耳蜗植入体更好和更长地工作。

根据本发明，可将GDNF蛋白产物施用进中耳的剂量范围从大约1μg/kg/天到大约100mg/kg/天，典型的剂量为大约0.1mg/kg/天到大约25mg/kg/天，通常的剂量为大约5mg/kg/天到大约20mg/kg/天。在发病已经在内耳位置，如在耳蜗植入过程或内耳手术的情况下，可将GDNF蛋白产物直接用药进内耳。在这些情况下，可施用较小量的GDNF蛋白质产物，例如，在单次注射或多次注射中从大约1μg/耳到大约1mg/耳。在需要慢性施用该因子的情况下，可将Alzet微型泵附着于一个插管上，插管尖端导入中耳或内耳以连续释放该因子。GDNF也可形成穿透Bulla的鼓膜的滴耳剂形式。还可预期GDNF蛋白质产物与有效量的第二治疗剂一起施用以治疗听神经元退化，以及与BDNF和NT-3以及其它因子或药品一起使用以便现在或将来用于治疗各种内耳病理。各种药物制剂和不同的传递技术在下面进行更详细的描述。

本文所使用的术语“GDNF蛋白质产物”包括纯化的天然的，合成的或重组的胶质细胞系来源的神经营养因子，具有生物学活性的GDNF变异体(包括插入，取代和缺失变异)和其化学修饰的衍生物。也包括与具有SEQ ID NO：1描述的氨基酸序列的人GDNF基本上同源的GDNF。在其生物学活性形式中，GDNF蛋白产物可能以同型二聚体或异型二聚体存在。

本文使用的术语“生物学活性”指GDNF蛋白产物与具有SEQ IDNO：1描述的氨基酸序列的GDNF相比表现出相似的神经营养特性，但不必具有全部相同的特征，也不必具有相同的程度。感兴趣的具体神经营养特征的选择取决于施用GDNF蛋白产物的用途。

本文使用的术语“基本上同源”指与具有SEQ ID NO：1描述的氨基酸序列的GDNF的同源程度优选超过70％，最优选超过80％，更优选超过90％或95％。例如，大鼠和人蛋白质的同源程度为大约93％，预期优选的哺乳动物GDNF同样具有高程度的同源性。本文描述的同源性百分数典型地以在两个序列中较小的一个中发现的氨基酸残基百分数来计算，该较小的序列与被比较的序列中的相同氨基酸残基进行序列对比，其中为了帮助该对比可在100个氨基酸长度中导入4个缺口(如Dayhoff在蛋白质序列和结构图谱，Vol 5，p124，国家生化研究基金会，华盛顿区(1972)中所述，其内容以参考文献编入本文)。优选的上文所述的同源性百分数以在两个序列中较小的序列上发现的各单元也在两个序列的较大序列中发现的百分数来计算(导入缺口)，一个单元定义为4个连续氨基酸的序列。基本上同源还包括用与抗SEQ IDNO：1的GDNF的抗体的交叉反应性特征分离的任意GDNF蛋白质产物或可通过与编码SEQ ID NO：1的GDNF的基因或基因片段杂交分离的其基因。

根据本发明的GDNF蛋白质产物可用本领域的技术人员已知的任意方法分离或产生。在本发明中有用的生产GDNF蛋白质产物的举例性方法在1994年5月23日申请的英国申请系列号08/182,183和其母申请；1992年9月17日申请的，以WO93/06116公开的PCT申请号PCT/US92/07888(Lin等，Syntex-Synergen Neuroscience Joint Venture)；以EP 610254公开的欧洲专利申请号92921022.7和1995年9月28日申请的共同拥有，共同未决的美国申请系列号08/535,681中描述(“截短的胶质细胞系来源的神经营养因子”)，这些文献的内容以参考文献编入本文。

天然存在的GDNF蛋白质产物可从哺乳动物神经元细胞制品或从分泌或表达GDNF的哺乳动物细胞系中分离。例如，WO93/06116描述了从B49胶质母细胞瘤细胞的无血清生长条件培养基中分离GDNF。GDNF蛋白质产品也可用本领域的技术人员已知的任意方法经化学合成。优选经重组技术生产GDNF蛋白质产物，因为它们能获得相对更高纯度的更大量的蛋白质。重组GDNF蛋白质产物形式包括该蛋白质的糖基化和非糖基化形式以及在细菌，哺乳动物或昆虫细胞系统中表达的蛋白质。

一般来说，重组技术包括分离编码GDNF的基因，在合适的载体和细胞类型中克隆该基因，如果需要，将基因修饰成编码所述的变异体，表达该基因以产生GDNF蛋白质产物。另外，编码所需GDNF蛋白质产物的核苷酸序列可经化学合成。预期使用由于遗传密码的简并性或等位基因变异在密码子使用上有区别的核苷酸序列可表达GDNF蛋白质。WO93/06116描述了大鼠GDNF基因cDNA克隆的分离和测序以及人GDNF基因基因组DNA克隆的测序和表达。WO93/06116也描述了表达GDNF蛋白产物的载体、宿主细胞和培养物生长条件。适于在大肠杆菌中表达GDNF蛋白质产物的其它载体在1991年4月24日公开的欧洲专利申请号EP0423980(“干细胞因子”)中公开，其说明书以参考文献编入本文。编码成熟人GDNF的基因的DNA序列和GDNF的氨基酸序列在WO93/06116图19(SEQ ID NO：5)中显示。图19未显示GDNF前体原(Pre-Pro)部分的完整编码序列，但人GDNF前体原的前50个氨基酸在WO93/06116图22(SEQ ID NO：8)中显示。

天然存在的GDNF在其生物学活性形式中是二硫键二聚体。在细菌系统表达后分离的物质基本上具有生物学活性，且以单体存在。再折叠对生产生物学活性二硫键型二聚体是必需的。细菌系统中表达的GDNF的再折叠和复性方法在WO93/06116中描述。测定GDNF活性的标准体外试验在WO93/06116和1995年9月28日申请的共同拥有，共同未决美国申请系列号08/535,681中描述，本文引用以供参考。

A.GDNF变异体

本文使用的术语“GDNF变异体”包括在天然存在的GDNF氨基酸序列中发生了氨基酸残基的缺失(“缺失变异体”)，插入(“添加变异体”)或取代(“取代变异体”)的多肽。经过将合适的核苷酸改变导入编码该多肽的DNA中或经体外化学合成所需的多肽制备该变异体。本领域的技术人员可预料得到可制备缺失、插入和取代的许多组合，只要最终的分子具有GDNF生物学活性。

取代，插入或缺失一个或多个选定的氨基酸残基的诱变技术对本领域的技术人员来说是熟知的(例如，美国专利号4,518,584，其说明书以参考文献引入本文)。在变异体构建中有两类基本的变化：突变位点的位置和突变特征。在设计GDNF变异体时，突变位点和突变特性的选择取决于待修饰的GDNF的特征。突变位点可单独或进行一系列的修饰，例如，经过(1)首先选择保守氨基酸取代，然后根据要达到的结果用更多的基团选择取代，(2)缺失靶氨基酸残基，或(3)插入与选定位点相邻的氨基酸残基。优选从1到20个氨基酸的保守改变。一旦测定所需GDNF蛋白质产物的氨基酸序列，就容易测定表达该蛋白质所用的核酸序列。也可经蛋白水解酶产生N端和C端的缺失变异体。

对于GDNF缺失变异体，缺失一般大小从大约1到30个残基，更通常的是从大约1到10个残基，典型地从大约1到5个连续的残基。预期可以是N端，C端和内部序列内缺失。可将缺失导入与其它TGF-β超家族成员且有低同源性的区域以修饰GDNF的活性。在与其它TGF-β超家族序列基本上同源的区域的缺失很可能更明显地改变GDNF生物学活性。保守缺失的数目的选择应保护GDNF蛋白质产物在受影响区域的三级结构，例如，半胱氨酸的交联。缺失变异体的非限制性例子包括缺失GDNF1至40个N端氨基酸的截短的GDNF蛋白质产物或缺失GDNFC端残基的变异体或其组合，如在1995年9月28日申请的共同拥有，共同未决美国申请系列号08/535,681中所述，本文以参考文献引用。

对于GDNF添加变异体，氨基酸序列的添加典型地包括长度范围从一个残基到含一百或更多残基的多肽的N和C端融合以及内部序列内添加一个或多个氨基酸残基。内部添加一般范围可从大约1到10个残基，更典型的是从大约1到5个残基，通常从大约1到3个氨基酸残基。N端添加变异体的例子包括命名为[Met^-1]GDNF的具有N端甲硫氨酰残基的GDNF(GDNF在细菌重组细胞培养物中直接表达的假象)，以及为了利于从重组宿主细胞分泌成熟GDNF而融合到GDNF N端的异源性N-端信号序列。这些信号序列一般从目的宿主细胞种类获得因而与之同源。添加也可包括来自其它神经营养因子的序列的氨基酸序列。根据本发明使用的优选的GDNF蛋白质产物是重组人[Met^-1]GDNF。

GDNF取代变异体去掉GDNF氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基且在其位置插入不同的残基。这种取代变异体包括等位基因变异体，其特征在于群体种类中天然存在的核苷酸序列改变可能或不会导致氨基酸改变。取代变异体的例子(例如，见SEQ ID NO：50)在共同拥有、共同未决的1995年9月28日申请的美国申请系列号08/535,681中公开，本文引用以供参考。

GDNF氨基酸序列的具体突变可包括对糖基化位点(例如，丝氨酸，苏氨酸或天冬酰胺)的修饰。糖基化的缺乏或仅部分糖基化由在连接糖基化识别位点的天冬酰胺上或在经添加O-连接的糖类修饰分子的任意位点上氨基酸的取代或缺失引起。天冬酰胺连接的糖基化识别位点包括由合适的细胞糖基化酶特异性识别的三肽序列。这些三肽序列是Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser，其中Xaa可以是非Pro的任意氨基酸。在糖基化识别位点的第一或第三氨基酸位置中的一个或两个位置上的各种氨基酸取代或缺失(和/或在第二位置的氨基酸缺失)导致在修饰的三肽序列上无糖基化。因此，表达适当改变的核苷酸序列产生在该位点未糖基化的变异体。另外，GDNF氨基酸序列可修饰成增加糖基化位点。

鉴定GDNF氨基酸残基或区域诱变的一个方法是Cunningham和Wells(科学，244：1081-1085，1989)所述的所谓的“丙氨酸扫描诱变”。在该方法中，鉴定一个氨基酸残基或靶残基组(例如，诸如Arg，Asp，His，Lys和Glu的带电残基)并用中性或带负电的氨基酸(最优选丙氨酸或多聚丙氨酸)取代以影响该氨基酸与细胞内或外的周围水环境的相互作用。然后经过在取代位点导入添加的或改变的残基挑选出显示对取代具有功能敏感性的区域。从而确定导入氨基酸序列改变的靶位点，在相应的靶密码子或DNA序列区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，筛选具有所需活性和活性程度的最佳组合的表达的GDNF变异体。

取代诱变最感兴趣的位点包括从不同种类的GDNF蛋白质中发现的氨基酸在侧链大小，电荷和/或疏水性方面基本上不同的位点。其它感兴趣的位点是从不同种类获得的GDNF样蛋白质的特定残基是相同的那些位点。这些位置一般对蛋白质的生物学活性是重要的。最初，这些位点以相当保守的方式进行取代。这些保守的取代在表1中显示，表头下面是优选的取代。如果该取代导致生物学活性改变，那占导入更重大的改变(举例性取代)，和/或进行其它的添加或缺失并筛选所得产物的活性。

                       表1

                    氨基酸取代

   原始残基     优选的取代     举例性取代

    Ala(A)         Val         Val；Leu；Ile

    Arg(R)         Lys         Lys；Gln；Asn

    Asn(N)         Gln         Gln；His；Lys；Arg

    Asp(D)         Glu         Glu

    Cys(C)         Ser         Ser

    Gln(Q)         Asn         Asn

    Glu(E)         Asp         Asp

    Gly(G)         Pro         Pro

    His(H)         Arg         Asn；Gln；Lys；Arg

    Ile(I)         Leu         Leu；Val；Met；Ala；

                               Phe；正亮氨酸

    Leu(L)         Ile         正亮氨酸；Ile；Val；

                               Met；Ala；Phe

    Lys(K)         Arg         Arg；Gln；Asn

    Met(M)         Leu         Leu；Phe；Ile

    Phe(F)         Leu         Leu；Val；Ile；Ala

    Pro(P)         Gly         Gly

    Ser(S)         Thr         Thr

    Thr(T)         Ser         Ser

    Trp(W)         Tyr         Tyr

    Tyr(Y)         Phe         Trp；Phe；Thr；Ser

    Val(V)         Leu         Ile；Leu；Met；Phe；

                               Ala；正亮氨酸

对氨基酸序列的保守性修饰(和对编码核苷酸序列的相应修饰)预期产生具有相似于天然GDNF的功能和化学特征的GDNF蛋白质产物。相反，GDNF蛋白质产物功能和/或化学特征的重大改变可经过选择其对保持下列特征的影响上明显不同的取代来实现，(a)取代区域多肽骨架的结构，例如，片层或螺旋构象，(b)分子在靶位点上的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小。根据常见的侧链特征将天然存在的残基分成组：

1)疏水：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；

2)中性亲水：Cys，Ser，Thr；

3)酸性：Asp，Glu；

4)碱性：Asn，Gln，His，Lys，Arg；

5)影响链方向的残基：Gly，Pro；

6)芳环的：Trp，Tyr，Phe。

非保守性取代可包含这些类别中的一个成员被另一个交换。该取代的残基可导入与其它TGF-β超家族蛋白同源的GDNF蛋白质区或该分子的不同源区。

B.BDNF衍生物

GDNF的化学修饰的衍生物或GDNF变异体可按本文说明书的教导由本领域的技术人员来制备。最适于衍变的化学基团包括水溶性多聚体。水溶性多聚体是需要的，因为附着于其上的蛋白质在含水环境如生理环境中不沉淀。优选的多聚体对于制备治疗性产品或组合物是药用上可接受的。本领域的技术人员将根据诸如多聚体/蛋白质连接物是否在治疗上使用，如果是，所需的剂量，循环时，对蛋白水解的抗性和其它因素的考虑选择所需的多聚体。衍变的效果可经过以所需的形式(即，经过渗压泵，或更优选的是经注射或输注或进一步配成口服，肺或其它传递途径)施用该衍生物并测定其效果来证实。

合适的水溶性多聚体包括，但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚1，3-二氧戊环，聚1，3，6-三氧六环，乙烯/马来酸酐共聚物，多聚氨基酸(同型多聚体或随机共聚物)，葡聚糖或多聚(正-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，聚丙二醇同型多聚体，聚氧丙烯/氧乙烯共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)，聚乙烯醇和其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性可能在生产上具有优势。

多聚体可以是任意分子量的，且可以是分枝或不分枝的。对于聚乙二醇，为便于处理和生产优选的分子量范围以大约2kDa到大约100kDa(术语“大约”表示在聚乙二醇制品中，有些分子可能比所述分子量更大或更小)。根据所需的治疗情况可使用其它大小(例如，所需的缓释期限，效果，如果对生物学活性有影响的话，便于操作，抗原性程度或无以及聚乙二醇对治疗性蛋白质或变异体的其它已知影响)。

这样附着上的多聚体分子的数目可以改变，本领域的技术人员可证实对功能的影响。可进行单一衍变，或用相同或不同化学基团(例如，多聚体，如不同分子量的聚乙二醇)提供双重，三重，四重衍变或其组合。多聚体分子与蛋白质(或肽)分子的比例可以随其在反应混合物中的浓度而改变。一般来说，最佳比例(关于反应效率，没有剩余的未反应的蛋白质或多聚体)可用诸如所需衍变程度(例如，单一，二重，三重等)，选定多聚体的分子量，多聚体是否分枝和反应条件的因素来确定。

考虑到对蛋白质功能或抗原区的影响，聚乙二醇分子(或其它化学部分)应附着于蛋白质上。对本领域的技术人员来说有许多附着方法可使用。例如，见EP 0401384，本文引用其说明书以供参考(将PEG偶联到G-CSF上)，也见Malik等，Exp.Hematol.，20：1028-1035，1992(报道了使用tresyl chloride使GM-CSF PEG化)。例如，聚乙二醇可经过反应基团，如自由氧基或羧基共价结合到氨基酸上。反应性基团是活化的聚乙二醇分子可结合的那些基团。具有自由氨基的氨基酸残基可包括赖氨酸残基和N末端氨基酸残基。具有自由羧基的那些氨基酸残基包括天冬氨酸残基，谷氨酸残基，和C末端氨基酸残基。巯基也可用作附着聚乙二醇分子的反应性基团。为达到治疗目的，优选在氨基上附着，如在N端或赖氨酸基团上附着。如果需要受体结合，应避免在对受体结合较重要的残基上附着。

可能特别需要一种N端化学修饰的蛋白质。使用聚乙二醇作为对本发明的组合物的一种解释，选择各种聚乙二醇分子(以分子量，分枝等)，反应混合物中聚乙二醇分子对蛋白质(或肽)分子的比例，所进行的PEG化反应的类型和获得选定的N端PEG化蛋白质的方法。获得N端PEG化制品(即，如果需要的话从其它单个PEG化群体中分离该部分)的方法可经过从PEG化蛋白质分子群体中纯化N端PEG化物质。选择性N端化学修饰可经过利用可获得的不同类第一氨基(赖氨酸与N末端)的不同反应性经还原性烷基化在特定蛋白质中衍变来实现。在合适的反应条件下，实现蛋白质在N端与含羰基的多聚体的明显选择性衍化。例如，可经过在允许利用赖氨酸残基ε-氨基和该蛋白质N端残基α-氨基之间的pKa差异的pH下进行反应来选择性地在N端PEG化该蛋白质。经过这种选择性衍化，控制水溶性多聚体附着于蛋白质上：与多聚体的连接主要发生在该蛋白质的N末端，且对其它反应性基团，如赖氨酸侧链氨基不发生明显的修饰。使用还原性烷基化时，水溶性多聚体可以是上面所述的类型，且应具有单个反应性醛基以偶联蛋白质。可使用含单个反应醛基的聚乙二醇丙醛。

本发明包含使用原核生物表达的GDNF或其变异体的衍生物，与至少一个聚乙二醇分子相联，以及使用GDNF或其变异体经酰基或烷基键附着于一个或多个聚乙二醇分子上。

用本领域已知的任意PEG化反应可实现PEG化。例如，见：生长因子聚焦，3(2)：4-10，1992；EP 0154316，(本文引用其说明书以供参考)，EP 0401384；和本文引用的涉及PEG化的其它文献。经过与反应性聚乙二醇分子(或类似的反应性水溶性多聚体)进行酰基化反应或烷基化反应可实现PEG化。

以酰基化进行的PEG化一般包含将聚乙二醇的活性酯衍生物与GDNF蛋白质或变异体进行反应，任何已知的或随后发现的反应性PEG分子可用于实现对GDNF蛋白质或变异体的PEG化。优选的活化PEG酯是酯化到N-羟基琥珀酰亚胺上的PEG。本文使用的“酰基化”预期包括非限制性的治疗性蛋白质与诸如PEG的水溶性多聚体之间的下列类型的键：酰胺，氨基甲酸酯，尿烷等。见生物连接化学，5：133-140，1994。反应条件可从任意PEG化技术中已知的条件或随后建立的条件中选择，但应避免使待修饰的GDNF或变异体失活的温度，溶剂和pH条件。

经乙酰化的PEG化一般产生多个PEG化的GDNF蛋白质或变异体。优选的是，连接键可以是酰胺。还优选的是，所得的产品基本上只有(例如，＞95％)单个，双重或三重PEG化。然而，根据使用的特异性反应条件可形成一定量的更高程度的PEG化的一些种类。如果需要，更纯化的PEG化种类可用标准纯化技术，包括透析，盐析，超滤，离子交换色谱，凝胶过滤色谱和电泳等从混合物，特别是未反应的种类中分离。

经烷化进行的PEG化一般涉及在还原剂存在的条件下将PEG的末端醛衍生物与GDNF蛋白质或变异体发生反应。经烷化进行的PEG化也能产生多个PEG化的GDNF蛋白质或变异体。另外，可控制反应条件以便基本上仅在GDNF蛋白质或变异体的N端α-氨基上进行PEG化(即，单个PEG化的蛋白质)。在单个PEG化或多个PEG化的情况下，PEG基团优选经-CH₂-NH-基团附着到蛋白质上。特别是对于-CH₂基团，这类键本文称为“烷基”键。

经还原性烷基化产生单个PEG化产品的衍变利用了可用于衍化的不同类第一氨基(赖氨酸与N未端)的不同反应性。反应在允许利用赖氨酸残基ε-氨基和蛋白质N端残基α-氨基之间的pKa区别的pH下进行。经过该选择性衍变，控制含有诸如醛的反应基团的水溶性多聚体附着到蛋白质上：与多聚体的连接主要发生在该蛋白质的N端且诸如赖氨酸侧链氨基的其它反应性基团不发生明显的修饰。在一个重要的方面中，本发明包含使用单个多聚体/GDNF蛋白质(或变异体)连接分子的基本上匀质的制品(指多聚体分子基本上仅(即，＞95％)在单个位置附着于GDNF蛋白质或变异体上)。更具体地说，如果使用聚乙二醇，本发明还包含使用缺乏可能的抗原性连接基团，且具有直接偶联到GDNF蛋白质或变异体上的聚乙二醇分子的PEG化的GDNF蛋白质或变异体。

因此，可预期根据本发明使用的GDNF蛋白质产品可包括PEG化的GDNF蛋白质或变异体，其中PEG基团经酰基或烷基附着。如上所述，该产品可以是单个PFG化的或多个PFG化的(例如，含2-6，优选2-5个PEG基团)。PEG基团一般在氨基酸的α-或ε-氨基上附着于蛋白质上，但也包含PEG基团附着于蛋白质的任意氨基上，只要该氨基有足够的反应性，能在合适的反应条件下附着于PEG基团上。

用于酰基化和烷基化研究的多聚体分子可选自如上所述的水溶性多聚体。选择的多聚体应修饰成具有单个反应基团，如优选用于酰基化的活性酯或用于烷基化的醛、以便按本方法控制多聚化程度。举例性的活性PEG醛是聚乙二醇丙醛(它具有水稳定性)或其单个C1-C10烷氧或芳氧衍生物(见，美国专利5252714)。多聚体可以是分枝的或不分枝的。对于酰化反应，选择的多聚体应具有单个反应性酯基。对于还原性烷基化，选择的多聚体应具有单个反应性醛基。一般来说，水溶性多聚体不应从天然存在的糖苷残基中选择，因为它们通常更便于由哺乳动物重组表达系统制备。多聚体可以是任意分子量，且可以是分枝或不分枝的。

本文使用的特别优选的水溶性多聚体是聚乙二醇。本文使用的聚乙二醇意味着包含用于衍变其它蛋白质的PEG的任意形式，如单个(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇。

一般来说，化学衍变可在用于使生物活性物质与活化的多聚体分子反应的任意合适条件下进行。制备PEG化GDNF分子或变异体的方法一般包含下列步骤：(a)在蛋白质被一个或多个PEG基团附着的条件下使GDNF蛋白质或变异体与聚乙二醇(如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应，(b)获得反应产物。一般来说，酰基化反应的最佳反应条件可根据已知参数和所需结果逐项测定。例如，PEG：蛋白质的比率越大，多个PEG化的产品百分数越大。

生产单个多聚体/GDNF蛋白质(或变异体)连接物分子的基本上均一的群体的还原性烷基化一般包括下列步骤：(a)在还原性烷基化条件下，在适于在所说GDNF蛋白质或变异体氨基末端的α-氨基上进行选择性修饰的pH下将GDNF蛋白质或变并体与反应性PEG分子进行反应；(b)获得反应产物。

对于单个多聚体/GDNF蛋白质(或变异体)连接体分子的基本上均一的群体；还原性烷化反应条件是允许水溶性多聚体基团选择性附着到GDNF蛋白质或变异体N端的那些条件  该反应条件一般提供赖氨酸氨基和N端α-氨基之间的pKa差异(pKa指50％的氨基质子化而50％未质子化时的pH)。pH也影响所使用的多聚体与蛋白质的比率。一般来说，如果pH较低，需要的多聚体超过蛋白质的量越大(即，N-端α-氨基的反应性越小，实现最佳条件所需的多聚体越多)。如果pH更高，多聚体：蛋白质比率就不必这样大(即，可利用的反应基团越多，所需的多聚体分子越小)。为达到本发明的目的，pH一般落入3-9的范围内，优选3-6的范围。

另一种重要的考虑是多聚体的分子量。一般来说，多聚体的分子量越高，可附着于蛋白质上的多聚体分子越少。同样，当选择这些参数时应考虑多聚体的分枝。一般来说，分子量越高(或分枝越多)，多聚体蛋白质比率越高。一般情况下，对于本文涉及的PEG化反应，优选平均分子量为大约2kDa到大约100kDa。优选的平均分子量是大约5kDa到大约50kDa，特别优选大约12kDa到大约25kDa。水溶性多聚体与GDNF蛋白质或变异体的比率一般范围从1∶1到100∶1，优选(对多个PEG化)1∶1到20∶1和(对于单个PEG化)1∶1到5∶1。

使用上面所述的条件，进行还原性烷基化以便将多聚体选择性地附着到在氨基末端具有α-氨基的任意GDNF蛋白质或变异体上，并提供单个多聚体/GDNF蛋白质(或变异体)连接物的基本上均一的制品。这里使用的术语“单个多聚体/GDNF蛋白质(或变异体)连接物”指由单个多聚体分子附着到GDNF蛋白质或GDNF变异体蛋白质分子上组成的组合物。单个多聚体/GDNF蛋白质(或变异体)连接物优选多聚体分子位于N端，而不在赖氨酸氨基侧链上。该制品优选是超过90％的单个多聚体/GDNF蛋白质(或变异体)连接物，更优选超过95％的单个多聚体/GDNF蛋白质(或变异体)连接物，剩余的可观察的分子是未反应的(即，没有多聚体基团的蛋白质)。

对于还原性烷基化，还原剂应在水溶液中是稳定的，且优选能仅能还原在还原性烷基化起始过程中形成的Schiff碱。优选的还原剂可选自氢硼化钠，氰基氢硼化钠，二甲胺甲硼烷，三甲胺甲硼烷和吡啶甲硼烷。特别优选的还原剂是氰基氢硼化钠。其它反应参数，如溶剂，反应时间、温度，等及产物纯化的方法可根据涉及用水溶性多聚体衍变蛋白质的公开的信息(见本文引用的文献)逐个测定。

C.GDNF蛋白质产物的药用组合物

GDNF蛋白质产物的药用组合物典型地包括与一种或多种药用上和生理学上可接受的配制物质混合的治疗上有效量的GDNF蛋白质产物。合适的配制物质包括，但不限于抗氧化剂，防腐剂，生色剂，调味剂和稀释剂，乳化剂，悬浮剂，溶剂，填充剂，膨胀剂，缓冲液，传递载体，稀释剂，赋形剂和/或药用佐剂。例如，合适的载体可以是注射用水，生理盐水溶液或人工外淋巴，很可能补充一些在肠胃外用药的组合物中常用的其它物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的举例性载体。

载体中的第一溶剂可以是天然含水或不含水的。另外，载体可含有其它药用上可接受的赋形剂以修饰或维持pH，渗透压，粘滞度，澄清度，颜色，无菌性，稳定性，溶解率或组合物的气味。同样，载体还可含有其它的药用上可接受的赋形剂以修饰或维持GDNF蛋白质产物的释放率或促进GDNF蛋白产物的吸收或透过鼓膜。这些赋形剂是通常和习惯用于配制以单位剂量或多剂量形式中耳用药的剂型的那些物质。

一旦配制了治疗性组合物，可作为溶液，悬液，凝胶，乳剂，固体或脱水的或冻干的粉末贮存于无菌小瓶中。这类配制品可以易于使用的形式或以诸如施用前需重新配制的冻干的形式贮存。

最适的药用配制品可由本领域的技术人员根据诸如用药途径和所需剂量的考虑来确定。例如，见Remington氏药用科学，第18版(1990，Mack出版公司，Easton，PA18042)第1435-1712页，本文引用其内容以供参考。该配制品可影响该GDNF蛋白质，变异体和衍生物的物理状态，稳定性，体内释放速率和体内清除速率。

其它有效的用药形式，如中耳缓释型配方，吸入雾剂，或口服活性配方也是可想象的。例如，在缓释型配方中，GDNF蛋白产物可结合到或掺入多聚体化合物(如聚乳酸，聚糖酸等)或脂质体的特定制品中。也可使用Hylauronic acid，它可能具有延长在循环中的滞留时间的效力。GDNF蛋白质产物的药用组合物也可配制成用于中耳用药，例如，经鼓膜输注或注射，也可包括缓释或滞留循环的配方。这类中耳用药的治疗组合物典型地以无热原的包含溶于药用上可接受的载体中的GDNF蛋白产物的中耳可接受的水溶液的形式。优选的载体是无菌蒸馏水。

还预期含GDNF蛋白产物的某些配方经口服用药。以该方式用药的GDNF蛋白产物可用胶囊包装且可使用或不用习惯用于混合固体剂量形式的那些载体来配制。胶囊可设计成在生物利用率最大和前期系统降解最小时在胃肠道释放组合物的活性部分。可包括其它的赋形剂以利于GDNF蛋白产物的吸收。也可利用稀释剂，调味剂，低溶点蜡，植物油，润滑剂，悬浮剂，片剂分解剂和结合剂。

包括中耳溶液，悬液和软膏的局部耳制品的配制对本领域的技术人员而言是熟知的(见Remington氏药用科学，第18版，第86章，第1581-1592页，Mack出版公司，1990)。也可利用其它的用药方式，包括注射进中耳。生产适于这类用药方式的中耳制品的方法和方式也是熟知的。

在本申请中使用的“中耳”指鼓膜与内耳之间的空间。该位置在所有内耳组织的外部，如果形成一种配制品使GDNF透过鼓膜就可不需侵害性程序来进入该区域。否则，将经过鼓膜注射将物质导入中耳，如果需要重复用药，在鼓膜上将会形成一个孔。该系统的例子包括插入剂和可用于将治疗物质传递到这些区域的“局部”应用的滴剂，凝胶或软膏。在诸如中耳感染的病例中(通常是儿童)，在鼓膜上开口是根据临床调查最常用的方法。几天后开口自发关闭。

在这里描述的治疗内耳疾病或损伤的GDNF蛋白产物的应用中，局部应用的制剂包括促进治疗剂穿透或运输进中耳和内耳的试剂也具有优势。该试剂在本领域中是已知的。例如，Ke等，美国专利5221696公开了使用物质来增强眼制品穿透角膜。

内耳系统是那些适合于在内耳组织层内，之间或周围的任何组织分室，如耳蜗和前庭器内使用的系统。这些位置包括耳蜗的不同结构，如血管纹，Reissner氏膜，柯蒂氏器，螺旋韧带和耳蜗神经元。由于已显示蛋白质能穿透窗孔周围膜进入内耳外淋巴，所以不需侵害性程序就能进入这些结构。对于经穿透窗孔周围膜将GDNF导入内耳特别合适的载体是人造外淋巴。该溶液由10.00mM D-葡萄糖，1.5mM CaCl，1.5mM MgCl溶液于1.0％Dulbeco氏磷酸盐缓冲溶液的去离子水溶液中组成，渗透压为280-300mOsm，pH为7.2。还有另一制品可包含GDNF蛋白产物与诸如可注射进中耳的微球体或脂质体的试剂的配制器，它提供了缓慢或持久释放的蛋白质，然后可作为贮存注射物传递。将GDNF蛋白质产物导入内耳的其它合适的方法包括可植入的药品传递装置，它含有GDNF蛋白质产品以及具有一个通道的耳蜗埋植体，使GDNF能通过该通道连续传递进内耳。

本发明的耳治疗制品，特别是局部制品可包括其它成份，例如，中耳可接受的防腐剂，张力剂，潜溶剂，复合剂，缓冲剂，抗微生物剂，抗氧化剂和表面活性剂，正如本领域所熟知的。例如，合适的张力增强剂包括碱金属卤盐(优选氯化钠或氯化钾)，甘露醇，山梨醇等。加入足够的张力增强剂是有利的，这可使滴入耳内的组合物与内和外淋巴的渗压相配伍。合适的防腐剂包括但不限于氯苄烷氨，硫柳汞，苯乙醇，对羟苯甲酸甲酯，对羟苯甲酸丙酯，氯苯胍亭，山梨酸等。也可使用过氧化氢作防腐剂。合适的潜溶剂包括但不限于甘油，丙二醇和聚乙二醇。合适的复合剂包括咖啡因，聚乙烯吡咯烷酮，β-环糊精或羟丙基-β环糊精。缓冲液可以是常规缓冲液，如硼酸盐，柠檬酸盐，磷酸盐，碳酸氢盐或Tris-HCl。

制剂的成份以中耳或内耳用药位点可接受的浓度存在。例如，缓冲液用于将组合物维持在生理pH或略低的pH下，典型地在从大约5到大约8的pH范围。

其它的制剂成份可包括能延长施用的治疗剂在中耳的停留时间以扩大局部接触并促进通过窗孔周围膜的吸收的物质。合适的物质包括使中耳制品粘度增加的多聚体或凝胶形成物质。用于控制内耳治疗剂释放(例如，滞留并延长传递)的本发明的制剂的合适性可用本领域已知的各种程序测定。另一耳制剂可包括与适于生产片剂的无毒性的中耳治疗可接受的赋形剂混合的有效量的GDNF。经将片剂溶于无菌水或其它合适的载体中，可以单位剂量的形式制备中耳治疗溶液。合适的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，如碳酸钙，碳酸钠或碳酸氢钠，乳糖，或磷酸钙，或粘合剂，如淀粉，明胶或阿拉伯胶。GDNF蛋白产物的施用/传递：

GDNF蛋白产物经皮下，肌肉内，静脉内，经肺部，经皮肤，膜内或脑内途径肠胃外用药。为了治疗内耳症状，GDNF蛋白产物可经局部应用，插入，注射，埋植，细胞治疗或基因治疗施用进中耳(或直接施用进内耳，特别是已在该处发生侵害性程序的情况下)。例如，含有包埋于生物可降解的多聚体基质中的神经营养因子的缓释型埋植体。GDNF蛋白质产物可经脑外以化学修饰或包装的形式用药以便经过血脑屏障，或可与一种或多种能促进GDNF蛋白质产物穿过屏障的试剂连接用药。同样，GDNF蛋白质产物可在中耳或内耳用药，或可在鼓膜顶部与一种或多种能促使GDNF蛋白质产物穿透或运输通过该耳膜的试剂连接用药。剂量频率取决于配制的GDNF蛋白质产物的药物动力学参数和用药途径。

可根据体重、体表面积或器官大小的考虑计算具体剂量。为确定包含各种上述组合物的合适治疗剂量所必需的计算的进一步选择可由本领域的普通技术人员按常规做出且在常规进行的工作范围内，特别是在本文公开的剂量信息和试验的教导下。合适的剂量可通过使用与合适的剂量反应数据结合使用的已建立的测定剂量的试验来确定。本领域的技术人员可预料到内耳施用的组合物所用的剂量比系统注射或口服所用的剂量要小。

涉及治疗上述症状的方法的最终剂量方案由出诊医生考虑影响药物作用的各种因素，例如，年龄，症状，体重，性别和病人食谱，感觉的严重性，用药时间和其它临床因素来确定。随着所进行的研究，将会得到关于治疗各种疾病和症状的合适的剂量水平的进一步的信息。

可想象连续用药或持久传递GDNF对于提供治疗具有优势。尽管连续用药可经过机械装置，如用一个输注泵来实现，但预期可实施连续或几乎连续用药的其它方式。例如，化学衍变或包装可产生持久释放形式的蛋白质，根据确定的剂量方案，它具有以可预料的量连续存在的效应。因此，GDNF蛋白质产品包括衍生的或配制的蛋白质以实现该连续用药。

也包含GDNF蛋白质产物的细胞治疗，例如，中耳或内耳埋植生产GDNF蛋白质产品的细胞。该实施方案也包含将能合成和分泌GDNF蛋白质产物的生物活性形式的细胞植入病人体内。该生产GDNF蛋白质产品的细胞可以是GDNF蛋白质产物天然生产者的细胞(类似于B49胶质母细胞瘤细胞)或可以是重组细胞，其生产GDNF蛋白质产物的能力经过用存在于适于促进其表达和分泌的载体中的编码所需GDNF蛋白质产品的基因转化进行了改变。为了减小在施用外源种类的GDNF蛋白质产物的病人中的潜在的免疫学反应，优选生长GDNF蛋白质产物的天然细胞来源于人类且产生人GDNF蛋白质产物  同样，优选生产GDNF蛋白质产物的重组体细胞用含编码人GDNF蛋白质产物的基因的表达载体转化。植入的细胞可被包装以避免周围组织渗入。人类或非人类哺乳动物细胞可在允许释放GDNF蛋白产物，但防止病人免疫系统或周围组织的其它有害因素破坏细胞的生物相容性、半透性多聚体外套或膜中植入病人体内，例如，这种埋植体可附着于中耳窗孔周围膜上以便直接生产并释放GDNF蛋白质产物进入外淋巴。

还预期可体外转化病人自身的细胞以生产GDNF蛋白产物并不经包装直接植入。例如，可回收柯蒂氏器支持细胞，培养细胞并用合适的载体转化，然后移植进病人内耳，移植细胞在此生产并释放所需的GDNF蛋白质或GDNF蛋白质变异体。

也可想象经定位注射核酸构建体或其它合适的传递载体将编码GDNF蛋白质产物的基因导入靶向内耳细胞进行体内GDNF蛋白质产物的基因治疗。(Hefti，神经生物学杂志，25：1418-1435，1994)。例如，编码GDNF蛋白质产物的核酸序列可包含在腺伴随病毒载体或腺病毒载体中以传递进内耳细胞。另外的病毒载体包括，但不限于，逆转录病毒，单纯疱疹病毒和乳头状瘤病毒载体。合适的体内或体外的物理转移也可经过脂质体介导的转移，直接注射(裸露的DNA)，受体介导的转移(配体-DNA复合物)。电穿孔，磷酸钙沉淀或微粒轰击(基因柱)实现。

用于活细胞膜包装的方法学是本领域的普通技术人员所熟悉的，包装细胞的制备和其移入病人不需过多的实验就能实施，例如，见美国专利号4,892,538，5,011,472和5,106,627，它们分别被特别地编入本文以供参考。包装活细胞的系统在Aebischer等的PCT申请WO91/10425中描述，特别引入本文以供参考。也见Aebischer等的PCT申请WO91/10470，Winn等，实验神经学，113：322-329，1991；Aebischer等，实验神经学，111：269-275，1991；Tresco等，ASAIO，38：17-23，1992，它们分别特别引入本文以供参考。配制各种其它的持久的或控制型传递工具，如脂质体载体，生物腐蚀性颗粒或珠和贮存注射剂的技术也是本领域的技术人员已知的。

应注意到本文描述的GDNF蛋白产物的配制品可用于兽医学以及人类的应用，术语“病患者”不应以限制性方式进行解释。在兽医学应用的情况下，剂量范围应与上面限定的相同。

本发明的其它方面和优势根据下面解释性实施例的考虑应是可理解的。实施例1描述了GDNF蛋白产物用药用耳蜗外植块培养系统中的毛细胞的影响。实施例2阐述了GDNF蛋白质产物用药对从耳蜗产生的解离细胞培养物中螺旋神经节神经元的影响。柯蒂氏器外植块培养物研究的结果和成年大鼠螺旋神经节神经元培养物的结果证实了GDNF蛋白质产物对于听神经元和柯蒂氏器毛细胞抵抗听觉毒素具有神经营养和保护性活性，这是以前未知的GDNF活性。

实施例

实施例1

GDNF蛋白质产物保护耳蜗毛细胞抵抗听觉毒素材料：

用于下面实施例的材料获得如下：柯蒂氏器解剖液：

Dulbecco′氏磷酸盐缓冲溶液(PBS；1×，无氯化钙，无氯化镁。产品目录号14190-136，Gibco BRL)，含1.5g/L D-葡萄糖(葡萄糖，产品目录号15023-021，Gibco BRL)。柯蒂氏器外植块培养基

1.高葡萄糖Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM；1×，含有L-谷氨酰胺，无丙酮酸钠。产品目录号11965-084，Gibco BRL)

2. 0.15g/100ml D-葡萄糖(葡萄糖，产品目录号15023-021，Gibco BRL)

3. 1％N-2补充液(100×，产品目录号17502-030，GibcoBRL)

4. 100单位/ml青霉素G钾(青霉素；产品目录号21840-020，Gibco BRL)方法：培养基的制备：

DMEM用1％N-2补充液补充，加入D-葡萄糖至终浓度为1.5g/l。以100单位/ml加入青霉素。混合后，过滤培养基并在4℃下保存。培养基在用前新制备以减小实验期间变化。全部使用塑料管和容器以减小蛋白质吸附。GDNF蛋白质产物溶液：

在含5％牛血清白蛋白的D-PBS(用蒸馏水制备的磷酸盐缓冲液)中将纯化的人重组GDNF蛋白质产品制备成1mg/ml的溶液。溶液在-85℃以等分试样贮存。在96孔微量平板中制备系列稀释(0.1；1；10；25；50ng/ml正常培养基)。向含听毒素或不含(对照)的柯蒂氏器外植块培养基(90μl)中加入10μl 10倍浓缩的GDNF蛋白质产物溶液。对照培养物接受正常培养基(10μl)。在接种的当天开始用GDNF蛋白质产物处理。在第二天，培养基换成仅含听毒素，含听毒素与GDNF或都不含(对照)的培养基。解剖工具和培养皿：

1. 4′和5″解剖镊和4″解剖剪来自Roboz Surgical，华盛顿区。

2. Falcon无菌96孔微量平板(平底，产品目录号3072)，组织培养塑料器皿和聚丙烯离心管来自Beckton-Dickinson，Lincoln Park，New Jersey。听毒素和有关试剂：

1.新霉素溶液(产品目录号N1142，Sigma，St.Louis.MO)，以0.6mM的终浓度使用(每次实验经加入90μl 1mg/ml新霉素到1410μl培养基中制备新鲜溶液)。

2.顺氯氨铂(Platinol-AQ。产品目录号NDC 0015-3220-22，Bristol-Myers Squibb Laboratories，Princeton，New Jersey)。以35μg/ml的终浓度使用(每次实验经过向1447.5μl培养基中加入52.5μl1mg/ml的顺氯氨铂制备新鲜溶液)。

3.Triton X-100(叔-辛基苯氧基聚乙氧乙醇，产品目录号X-100，Sigma，St.Louis，MO)

4.鬼笔环肽(FITC标记的。产品目录号P-5282，Sigma，St.Louis，MO)

5.Vectashield(封固培养基，产品目录号H-1000，Vector，Burlingame，CA)大鼠柯蒂氏器外植块的制备

从P3-P4 Wistar大鼠获得柯蒂氏器外植块。将大鼠断头，切下下颌并去掉皮肽。在解剖液中收集颞骨，暴露听泡，小心从颞骨上分离骨-软骨耳蜗泡。游离的耳蜗转移到另一个含有解剖液的培养皿中进一步解剖。使用小颞子夹住中央VIII神经组织并将其去掉获得完整的柯蒂氏器，然后从顶或底开始小心剥去血管纹膜。然后将柯蒂氏器转移到含有补充了葡萄糖的冷PBS的35mm直径培养皿中并准备培养。耳蜗外植体培养程序：

耳蜗外植体在未覆盖的96孔微量平板上培养。将单个柯蒂氏器放于孔中并在培养基上漂浮维持。外植块在正常培养基中维持24小时(90μl/孔)。将GDNF蛋白质溶液(10μl)加入“未处理”的培养物中，且将10μl培养基加入对照中。培养24小时后，更换培养基并将外植块与含听毒素的培养基(90μl)及GDNF蛋白质溶液(10μl)或无该蛋白质(对照)的培养液接触。培养物再培养另外3天。然后用溶于0.1M D-PBS中的4％多聚甲醛在室温下固定30分钟并加工用于免疫染色。FITC-鬼笔环肽染色毛细胞：

为了鉴定和计数柯蒂氏器中的毛细胞，用直接免疫染色方法标记天然存在于毛细胞静纤毛束中的肌动蛋白。用D-PBS(每孔200μl)洗涤外植块三次并用1％Triton X-100的D-PBS在室温下渗透15分钟。在D-PBS中洗涤3次后，用FITC标记的鬼笔环肽(以1∶60来自贮液，50μl/孔)在室温下培养外植块45分钟。用铝箔覆盖平板，因为鬼笔环肽具有光敏感性。用D PBS洗涤超过3次后，将标记的外植块放于显微镜载玻片上的一滴甘油中，用盖玻片覆盖并用指甲油密封。外植块在Nikon Diaphot 300倒置荧光显微镜下使用FITC滤光器和荧光镜片观察。毛细胞数的测定：

对于每个实验点，使用2至4个耳蜗。在每个耳蜗中，在长度各为175μm的2-3个区域中计数毛细胞的数目。仅分析在耳蜗中央转角的区域。各实验重复几次。每个实验点分析40个耳蜗产生在对照和顺氯氨铂或新霉素处理的培养物中毛细胞的数目。结果：

在四天的实验期间漂浮的外植块培养物中的毛细胞不死亡。由此，在不存在听毒素和处理的情况下，在4天实验期间最后存在的鬼笔环肽染色的细胞数是105.4±6.9(n＝28)。在接种后第二天将听毒素加入外植块后在体外培养4天后发现引起毛细胞数明显减少。接种后24小时接触35μg/ml顺氯氨铂引起大约80％的毛细胞丢失，仅有21.2％±6.0(n＝40)的毛细胞起始数存活(表2)且接触0.8mM新霉素后，仅7.4％±4.7(n＝43)的毛细胞存活(表2)。

                            表2

            GDNF对接触顺氯氨铂的耳蜗毛细胞的影响

	毛细胞存活率(％未处理的)
			处理	接种时加入GDNF	接种24小时后加入GDNF
仅含顺氯氨铂(35μg/ml)	21.3±4.0(n＝30)	21.3±4.0(n＝30)
			顺氯氨铂+GDNF，0.05ng/ml	35.2±5.4(n＝5)*	ND
顺氯氨铂+GDNF，0.1ng/ml	39.6±10.5(n＝17)*	37.8±11.8(n＝5)*
			顺氯氨铂+GDNF，1ng/ml	46.7±10.8(n＝20)*	51.0±8.0(n＝4)*
顺氯氨铂+GDNF，10ng/ml	46.7±7.7(n＝16)*	49.7±4.6(n＝5)*
			顺氯氨铂+GDNF，25ng/ml	ND	45.0±12.0(n＝3)*
顺氯氨铂+GDNF，50ng/ml	46.8±10.5(n＝13)*	ND

在接种的当天或24小时后将GDNF导入外植块培养物。接种24小时后加顺氯氨铂(35μg/ml)，培养物再培养另外3天。用FITC-鬼笔环肽染色毛细胞。在耳蜗中央转角的各175μm的2-3个区域中计算毛细胞数目。结果以体外培养4天后占存在于未处理的培养物中毛细胞的百分数来表达(105.4±6.9；n＝28)。各数目是平均值±n个耳蜗的SD。^*与仅含顺氯氨铂有显著的差异，p＜0.05(t检验)ND：未测定

在这两种处理之间，柯蒂氏器的形态学有显著的差异：用新霉素处理导致毛细胞几乎全部丧失，空出的部分仍有典型的4排结构(3排外毛细胞和一排内毛细胞)。另一方面，顺氯氨铂处理引起4排结构明显破坏，存活的细胞随机分布。

在接种时接受GDNF的培养物中(预处理)，较大数目的毛细胞在与听毒素接触的3天(从第2到第4天)中存活。在接触顺氯氨铂的培养物中，用浓度为0.05ng/ml之低的GDNF处理引起存活的毛细胞从21％(未处理的培养物)增加到35％。用0.1ng/ml GDNF达到最大保护活性(41％存活)(表3)。在接触新霉素的培养物中，0.1ng/ml GDNF使毛细胞数从7％增加到22％；用10ng/ml GDNF可见到最大GDNF活性(37％存活)(表3)。在新霉素处理的培养物中GDNF处理保护4排的形态学，但不能防止顺氯氨铂对其破坏。

为了试验GDNF挽救毛细胞抵抗听毒性的进一步的能力，进行了一套实验，其中GDNF在接种24小时后与培养物接触听毒素的同时加入GDNF(共同处理)。结果表明在该实验范例中，GDNF能与接触内毒素前加入同样程度地挽救毛细胞(表2和3)。

                                  表3

                  GDNF对接触新霉素的耳蜗毛细胞的影响

	毛细胞存活率(％表处理的)
			处理	接种时加入GDNF	接种24小时后加入GDNF
仅用新霉素(0.8mM)	7.1±4.2(n＝42)	7.1±4.2(n＝42)
			新霉素+GDNF，0.05ng/ml	19.5±7.5(n＝6)*	23.0±6.2(n＝3)*
新霉素+GDNF，0.1ng/ml	22.0±4.1(n＝13)*	27.0±14.7(n＝3)*
			新霉素+GDNF，1ng/ml	28.2±6.1(n＝19)*	26.2±6.4(n＝4)*
新霉素+GDNF，10ng/ml	37.4±4.8(n＝11)*	ND
			新霉素+GDNF，50ng/ml	34.4±5.3(n＝7)*	ND

在接种的当天(预处理)或接种24小时后(共同处理)将GDNF导入外植块培养物中。接种24小时后加入新霉素(0.8M)，将培养物再培养另外3天。用FITC-鬼笔环肽染色毛细胞。在耳蜗中部转角各175μm的2-3个区域中计算毛细胞数目。结果以占体外培养4天后未处理的培养物中存在的毛细胞数的百分数来表达(105.4±6.9；n＝28)，各数目是平均值±n个耳蜗的SD。^*以p＜0.05与仅含新霉素有显著的差异(t检验)。ND：未检测

实施例2

GDNF蛋白质产物促进内耳听神经元(螺旋

神经节神经元)的存活并保护其抵抗听毒素材料：

用于下面实施例的材料按如下获得。细胞培养基

高葡萄糖Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM；#11965-092)，Ham氏F12培养基(F12：#11765-021)，B27培养基补充液(#17504-010)，青霉素/链霉素(#15070-014)，L-谷氨酰胺(#25030-016)，Dulbecco氏磷酸盐缓冲溶液(D-PBS；#14190-052)，小鼠层粘连蛋白(#23017-015)，牛血清白蛋白和部分V(#110-18-017)全部来自GIBCO/BRL，Grand Island，NY。加热灭活的马血清来自HyClone，Logan，Utah。聚-L-鸟氨酸溴化氢(P-3655)，牛胰岛素(I-5500)，人转铁蛋白(T-2252)，腐胺(P-6024)，孕酮(P-6149)和亚硒酸钠(S-9133)都来自Sigma化学公司，Saint-Louis，MO。木瓜蛋白酶，脱氧核糖核酸酶[(DNA酶)和卵清蛋白(木瓜蛋白酶解离系统)来自Worthington生化公司，Freehold，NJ.Falcon无菌96孔微量平板(#3072)，组织培养塑料器皿和聚丙烯离心管来自Beckton-Dickinson，Oxnard，CA。Nitex 20μm尼龙网(#460)来自Tetko，Elmsford，NY。4″解剖镊和4″解剖剪来自Roboz Surgieal，华盛顿区。抗体和有关试剂

神经元特异性烯醇化酶(NSE)兔多克隆抗体来自Chemicon(#AB951)，生物素标记的羊抗兔IgG(#BA-1000)和过氧化物酶连接的抗生物素蛋白/生物素复合物(ABC Elite；试剂盒PK-6100)来自载体实验室，Burlingame，CA。3′，3′-二氨基联苯胺来自Cappel实验室，West Chester，PA。PBS中的超封闭封闭缓冲液(#37515)来自Pierce，Pockford，IL。Triton X-100(×100)，Nonidet P-40(N 6507)和过氧化氢(30％，v/v；H1009)来自Sigma。所有其它试剂从Sigma化学公司(Saint-Louis，MO)获得，除非另有说明。听毒素

顺氯氨铂(Platinol-AQ，#NDC0015-3220-22)来自Bristol-Myers-Squibb，Princeton，NJ。水杨酸钠来自J.T.Baker，Phillipsburg，NJ。(#3872-01)，新霉素来自Sigma(#N1142)。方法：培养基的制备

按1∶1混合DMEM和F12培养基，补充以50倍浓缩贮液加入的B27培养基补充液来制备基础培养基。B27培养基补充液由生物素，L-肉毒碱，皮质酮，乙醇胺，D(+)-半乳糖，还原的谷胱甘肽，亚油酸，亚麻酸，孕酮，腐胺，乙酸视黄酯，硒，T3(三碘-1-甲腺原氨酸，DL-α-生育酚；维生素E)，DL-α-生育酚乙酸酯，牛血清白蛋白，过氧化氢酶，胰岛素，超氧化物歧化酶和转铁蛋白组成。以大约2mM的终浓度加入L-谷氨酰胺，青霉素为大约100IU/1，链霉素为大约100mg/l。加热灭活的马血清以大约2.5％的终浓度加入，D-葡萄糖以大约5g/l的终浓度加入，HEPES缓冲剂以大约20mM的终浓度加入，牛胰岛素以大约2.5mg/ml的终浓度加入，人转铁蛋白以大约0.1mg/ml的终浓度加入。混合后，将pH调至大约7.3，培养基在大约4℃保存。培养基在用前新制备以减小实验期间的变化。全部使用塑料的吸管和容器以减小蛋白质吸附。GDNF蛋白质产物溶液

纯化的人重组GDNF蛋白质产物在含5％牛血清白蛋白的D-PBS(用蒸馏水配制的磷酸盐缓冲液)中制备成1mg/ml的溶液。溶液在-85℃以等分试样贮存。在96孔微量平板中制备系列稀释。将10μl 10倍浓缩的GDNF蛋白质产物溶液加入含培养基的细胞培养物(90μl)中。对照培养物接受含5％白蛋白的D-PBS(10μl)。接种细胞1小时后向培养物中加入GDNF蛋白质产物处理剂或在24小时后单独或与听毒素一起加入。听毒素制品

直接从贮液(大约10^-3M)以每孔10μl加入新霉素使终浓度为大约10^-4M。用培养基稀释贮液(1mg/ml)的顺氯氨铂至20μg/ml的溶液并以每孔10μl加入使终浓度为2μg/ml。从粉末将水杨酸钠在PBS中配成1M的贮液，进一步在培养基中稀释成100mM，当以10μl/孔加入培养物时产生10mM的终浓度。培养基质

为了使螺旋神经节细胞在基质上最佳附着并使轴突过度生长，经过用聚L-鸟氨酸及随后用层粘连蛋白根据下面程序依次覆盖改良微滴度平板表面(培养基质)。平板表面用在0.1M硼酸(pH8.4)中的多聚鸟氨酸的0.1mg/ml无菌溶液在室温下完全复盖至少一小时，接着用Super-Q水无菌洗涤。然后吸出洗涤水并加入溶于PBS中的10μg/ml小鼠层粘连蛋白溶液在37℃培养2小时。这些程序在使用平板前临时进行以保证结果的可重复性。大鼠螺旋神经节细胞培养物的制备

用过量的下列溶液(Ketamine(100mg/ml)；Xylazine(20mg/ml)和Acopromazine Maleate 910mg/ml)以3∶3∶1的比例)注射3至4周龄的Wistar大鼠(从Jackson实验室获得，Bar Harbor，Maine)，经断头处死，解剖下带耳蜗的颞骨并无菌转移进冰上的含1.5g/l葡萄糖的PBS中。每次实验处理最多30个耳蜗。打开耳蜗，将带骨蜗轴的柯蒂氏器收集进50ml无菌管中，该管中含有5ml解离培养基(120单位的木瓜蛋白酶和2000单位的DNA酶存在于HBSS中)。将组织在大约37℃下在大约200rpm的旋转平台型摇床中培养30分钟，然后将解离溶液替换成新鲜的并继续培养另外30分钟。经过用火磨光的巴斯德吸管捣碎分散细胞，通过一个40μm的Nitex尼龙网过滤以弃去未解离的组织，使用IEC临床离心管在200×g下再离心5分钟。所得的细胞沉淀重悬于含卵清蛋白和大约500单位DNA酶的HBSS中，在上面覆盖4％的卵清蛋白溶液(在HBSS中)并在500×g下离心大约6分钟。最后的沉淀重悬进大约6ml的培养基中并在预先覆盖的平板上以90μl/孔接种。螺旋神经节细胞的免疫组织化学

经过对神经元特异性的烯醇化酶(NSE)进行免疫组织化学染色鉴定螺旋神经节神经元。用8％的多聚甲醛D-PBS溶液(pH7.4)在室温下固定螺旋神经节细胞培养物大约10分钟，以100μl/孔加入培养基，然后用100μl 4％多聚甲醛代替再10分钟，接着在D-PBS(每6-mm孔200μl)中洗涤3次。然后在含1％Nonidet P-40的PBS超封闭封闭缓冲液中培养固定的培养物以增强抗体的通透。然后将兔多克隆抗-NSE抗体(Chemicon)在相同的缓冲液中以1∶6000稀释应用，培养物在摇床上37℃培养2小时。用D-PBS洗涤3次后，使用大约1∶300稀释的羊抗免生物标记的IgG(来自Vector实验室的Vectastain试剂盒，Burlmgame，CA)检测螺旋神经节细胞结合的抗体。第二抗体在37℃下与细胞培养大约1小时，然后用D-PBS洗涤细胞3次。用1∶300稀释的抗生物素蛋白，生物素过氧化物酶复合物标记第二抗体，在37℃下培养细胞大约60分钟。用D-PBS洗涤超过3次后，标记的细胞培养物在含0.04％ 3′，3′-二氨基联苯胺-(HCl)4，0.06％NiCl₂和0.02％过氧化氢的0.1M Tris-HCl，pH7.4的溶液中反应5分钟。测定螺旋神经节细胞存活率

培养不同时间后(24小时，3天和4天)，固定大鼠螺旋神经节细胞培养物，按上面所述加工并免疫染色NSE，用明视野镜片在200×放大倍数下检查培养物。计数存在于6-mm孔中的所有NSE阳性神经元。活的螺旋神经节细胞的特征为具有大小为15-40μm的圆细胞体并带有轴突延伸。从计数值中排除显示退化信号的螺旋神经节细胞，如具有不规则的，液泡化的核固体或片断化的轴突(然而，大多数退化的螺旋神经节细胞从培养基质上脱离)、细胞数以每个6mm孔中的细胞数或相对于对照细胞密度的倍性改变来表达。结果：

大鼠螺旋神经节神经元培养物用于证实GDNF蛋白质产物对存活和抵抗听毒素的影响。从3至4周龄的大鼠耳蜗获得螺旋神经节细胞。将解离的细胞以大约每2孔1个耳蜗的密度接种进聚鸟氨酸-层粘连蛋白覆盖的微滴度平板上，平板孔中含有补充有B27培养基补充液，2.5％加热灭活的马血清，D-葡萄糖，HEPES，胰岛素和转铁蛋白的DMEM/F12。培养物由神经元和非神经元细胞的混合物组成。然而，只有存在的神经元是螺旋神经节神经元并用NSE免疫反应活性的存在进行了鉴定。在接种浓度下(一个解离的柯蒂氏器接种进2个孔中)，接种24小时后每孔NSE阳性细胞数在对照条件(未加处理)下是127±17(n＝7)。在实验最后，接种4天后，每孔的神经元数目减少到64±4.7，它代表在对照条件下体外培养24小时后存在的数目的50.5％±3.7。

评价了施用GDNF蛋白质产物对培养的大鼠螺旋神经节神经元的存活和形态学成熟的影响以及对其抵抗诸如顺氯氨铂的已知听毒素的毒性效应的影响。螺旋神经节细胞培养物在接种24小时后用单独的人重组GDNF蛋白质产物(范围从50ng/ml至0.1ng/ml)或与顺氯氨铂(35μg/ml)结合处理。接种24小时后，对照培养物与用1ng/ml和10ng/mlGDNF处理的培养物之间听神经元数目无区别(分别为127±17；126±24和125±19个神经元/孔)。再过3天后，以1ng/ml浓度的GDNF处理不产生明显的神经元细胞数增加。然而有显著的营养效应：与对照相比神经元细胞体更大，纤维更长且更复杂  在用10ng/ml GDNF处理的培养物中，存在的神经元在24小时后大约72％存活，表示比对照培养物增加44％(表4)。营养效应比用1ng/ml GDNF处理的培养物更强。

GDNF也保护螺旋神经节神经元抵抗顺氯氨铂毒性(表4)。培养物接种24小时后与5μg/ml顺氯氨铂接触导致4天后在培养物中丧失94％的神经元起始数(在24小时时)，当GDNF与顺氯氨铂一起加入时，4天后发现神经元数目明显更高。GDNF的这些保护性效应是剂量依赖性的：用1ng/ml，10ng/ml和25ng/ml浓度的GDNF分别发现毒性处理开始存在的神经元为20.1±5.1；27.5±3.2和32.8±1.0(数据未显示)。这些结果表明：与GDNF反应的大约63％的神经元(大约44％的螺旋神经节神经元群体)也能抵抗顺氯氨铂毒性。

                      表4

           GDNF对螺旋神经节神经元存活率的影响

	螺旋神经节神经元存活率(％24小时后起始数)
			处理	未处理	顺氯氨铂(5μg/ml)
未处理	48.5±4.5(n＝9)	6.1±1.2(n＝3)
			GDNF，10ng/ml	71.6±7.4**(n＝5)	32.8±1.0*(n＝3)

GDNF和顺氯氨铂在接种24小时后加入解离的螺旋神经节神经元培养物中。培养物再培养另外3天，经计数NSE-免疫反应性细胞测定神经元数目。神经元细胞数目以体外培养24小时后存在的神经元百分数来表达。各结果是平均值±n个培养物的SD。^*以p＜0.05与单独用顺氯氨铂处理有显著的差异(t-检验)。^**以p＜0.05与未处理的对照有显著的差异(t-检验)。

实施例3

GDNF蛋白质产物促进内耳毛细胞的体内存活

下面实施例证实在动物模型中内耳施用GDNF蛋白质产物保护耳蜗毛细胞抵抗听毒素。GDNF经过一个插管通过在耳蜗基部转角钻孔压入鼓阶而导入内耳。插管与装有GDNF(50ng/ml)的Alzet微型泵相连，以0.5μl/小时的速率释放14天。插管2天后开始肌肉内注射顺氯氨铂，以1mg/ml每天注射15天或以7.5mg/kg注射2次，间隔为5天(插图2)。27天后终止实验。用FITC鬼笔环肽染色毛细胞，在耳蜗中央转角处(至少20％的中央转角部分)测定其数目。结果以每只单个的豚鼠GDNF处理的耳(右耳)和未处理的耳(左耳)毛细胞丢失的百分数来表达。材料：

用于下述实施例的材料获得如下：微型泵制备材料：

医用乙烯基管大小V/4，目录号BB 317-85来自Bolab Products[(800)331-7724]。使用Fisher牌5ml塑料吸管。使用微型腔聚亚胺管，目录#8004853 OG(Tampa Florida)。硅氧烷医用产品MDX 4-4210来自Dow Corning Corporation，Midland，MI。Alzet渗压微型泵流速调节器和Alzet渗压微型泵，目录号2002来自Alza Corp.，Palo Alto，CA。Tap(TimeMed tape)。Prosil-28产品号11975-0来自PCRIncorparated，Gainesville Florida。纯化的人重组GDNF蛋白质产品在D-PBS和0.1％BSA中配制成50ng/ml的溶液。无菌0.1％亚甲兰(目录号M-9140)溶于PBS，矿物油(目录号400-5)来自Sigma。微型泵制备程序：

乙烯基管切成大约4英寸的部分并通过小型钳放置。将一片微型腔聚亚腔管(7mm)放进乙烯管末端。经过加入大约10份碱和1份清除剂混合硅氧烷。使用细小的探针将一滴放于乙烯基管的开口端，将微型腔管压进乙烯基管，使从乙烯基管延伸出3.75mm长。使用在探针上的一滴硅氧烷在微型腔管从顶端0.5mm处产生一个小球，使其过夜干燥。

经过在吸管长度上应用3个同心层的带增加5ml吸管的直径。在吸管未覆盖处留下一个均匀的缺口。将V/4管缠绕在吸管上，调节线圈使管的2端松散且所有线圈间连续相连。将2个薄层条形带与吸管上带的边缘并排以确保线圈固定。在线圈上均匀地涂上2条细线型超强胶。干燥1小时后，松散端与吸管几乎平行排列并保证用一条带固定。用一滴超强胶将管固定于线圈上。干燥过夜后，去掉带，线圈从吸管上滑下。将流速调节器插入一个松散端并用一滴超强胶固定。

用1％Prosil-28水溶液冲洗线圈，用水彻底漂洗，然后用70％乙醇冲洗。借助于注射器或真空器去掉乙醇。将线圈放于带真空器的干燥器内至少30分钟并在密封干燥器内放置过夜，接着进行气体灭菌。在装载过程中，线圈装置尽可能保持水平以防止GDNF，油和染料的重力牵引运动。避免在泵或线圈中形成气泡。泵浸入无菌PBS中并在37℃保温过夜。

经过将泵固定于垂直位置进行用亚甲蓝装载泵。将一个装有染料的注射器完全插入泵，注射染料直至泵溢出。避免将气泡注射进泵。将短片无菌V/4管放在流速调节器上。使用与V/4管相连的注射器将总体积为230μl，溶于PBS+0.1％BSA的浓度为50ng/ml的GDNF上样到大约10mm插管尖端内。作为载体对照实验，将相同体积的PBS+0.1％BSA上样到泵中。去掉短片V/4管。然后用注射器将矿物油上样到线圈装置上，其方式为使2mm空气间隔和7mm矿物油插入泵液体和线路液(输注液体)之间。将流速调节器完全插入进泵中。泵插入内耳材料：

组织粘附胶-氰基丙烯酸酯来自Vetbond Tissue Adhesive，3MAnimal Care Products，St.Paul，MN。羧化粘合剂ESPEDurelon，目录号#03828来自ESPF-Premier Sales Corp.，NorristownPA。异丁烯酸甲酯来自Lang Jet Acrylic，Lang Dental MFG.Co.，Wheeling，IL。解剖工具来自Roboz Surgical。使用甲苯噻嗪，氯胺酮和叔丁啡。润滑眼膏(AKWA Tears)来自Akorn Inc.，Abita SpringsLA。Xylocaine 2％，目录号NDC 0186-0160-01来自ASTRA。医用级硅氧烷脂，Art.No.51，300来自Unimed。Durelon粉碎的粉状羧化粘合物，目录号D-82229来自ESPE，Seefeld。硫酸软膏(BacitracinZinc-新霉素，目录号0168-0012-31)来自Fougera。方法：

用甲苯噻嗪10mg/kg，氯氨酮40mg/kg和叔丁啡0.05mg/kg的混合物麻醉Albino豚鼠(250-350g)。右耳区从尾部剃毛，从头顶前端大约2cm开始到肩胛后骨和耳后4-5cm。剃毛的区域用聚烯吡酮碘洗涤。将Xylocaine经皮下注射进组织以便切开。使用无菌技术，做一个耳后切口。使用细针在耳泡上钻一个孔以暴露中耳腔并观察耳蜗。使用细针在圆窗孔下基部转角的骨壁上手工钻一小孔。将插管的顶端插入孔中直至硅氧烷滴抵住骨壁，它使插管尖端位于鼓阶通道的大约中途。将一滴氰化丙烯酸酯放在耳泡孔处。在氰化丙烯酸酯上围绕插管放置羧化粘合胶。一旦粘合胶变硬，证实其位置，剩余的孔在硅氧烷脂层的顶端用羧化粘合胶覆盖。在肩胛骨之间制备一个皮下袋以容纳随后插入的泵。皮下袋用3ml溶于无菌PBS的呋喃西林溶液漂洗一次，然后用3ml无菌PBS加1％庆大霉素充满以防止感染。在伤口周围施用呋喃西林粉末后用伤口钳关闭切口。致聋：材料：

顺氯氨铂(Platmd-AQ)，目录号NDC0015-3220-22来自Bristol-Myers Squibb实验室，普林斯顿，新泽西州。方法：

在微型泵植入2天后开始注射顺氯氨铂(i.p.)。使用2种施用方法：以5天的间隔注射2次，每次7.5mg/kg，或每天1mg/kg，注射15天。灌注：

4周后，豚鼠用甲苯噻嗪和氯氨酮的混合物深度麻醉，用冰冷的PBS及随后用冰冷的4％多聚甲醛PBS溶液经心脏灌注。取出颞骨，将骨耳蜗放入4％多聚甲醛中4℃进行后固定过夜。染色：

表面制品和鬼笔环肽染色方法用于染色毛细胞。用细针或#11刀片打开骨耳蜗。使用小镊子取出血管纹。在充满PBS的培养皿中，用细针小心地从骨蜗轴中解剖出基底膜。小心将其完整取出。鬼笔环肽染色方法与体外外植块所进行的相似，除了有下列变化：通透进行20-30分钟，鬼笔环肽加入90分钟。在60×22盖玻片上封固顶部，中央转角和基部转角块。加入一滴VECTASHIELD封固培养基，用22×22mm盖玻片覆盖样品并用指甲油密封以防止蒸发。数据分析

各耳蜗在具有一套FITC滤光片的显微镜下检查。选择从基底膜中央转角具有最大毛细胞丢失的8个区域并使用附着的计算机印像机照像。使用照片手工进行毛细胞计数。在每只动物中，将左耳毛细胞的丢失(作为对照，即，无GDNF输注)与右耳中的毛细胞丢失(输注GDNF)进行比较。结果：

顺氯氨铂注射导致耳蜗毛细胞明显丢失。在用每天1mg/kg顺氯氨铂注射15天的3只豚鼠左耳中分析的中央转角部分中该丢失为49.2％；21.2％和46.9％。在用7.5mg/kg两次代替每天1mg/kg顺氯氨铂注射的豚鼠中，左耳毛细胞丢失42％。将GDNF导入各豚鼠右内耳导致毛细胞丢失的明显减少。在耳蜗中计数的丢失的毛细胞数与总毛细胞数之间的比率如下：在左耳(对照)中为241/486；113/530和244/513，而其相对侧右耳(GDNF处理的)中分别为83/492；28/498和126/512。这些比率表示对3只动物而言每只动物左耳与右耳之间毛细胞丢失增加3倍；4.2倍和1.9倍。在用7.5mg/kg顺氯氨铂注射的豚鼠中，与处理的耳相比未处理的耳(左耳)毛细胞丢失增加2倍。(见图2)。在用载体代替GDNF充满微量泵植入的动物中，在左耳(未处理耳)和右侧(植入的)耳中发现的毛细胞数目无区别。

实施例4

GDNF蛋白质产物注射促进体内耳蜗毛细胞的存活

下面实施例证实GDNF蛋白质产物当施用进中耳时在动物模型中保护耳蜗毛细胞抵抗听毒性。将125-135μl体积的以1mg/ml的浓度溶于PBS+1％BSA中的溶液通过鼓膜单次注射将GDNF导入右侧中耳。在GDNF注射1天后以7.5mg/kg开始顺氯氨铂肌肉内注射2次，间隔5天。第二次顺氯氨铂注射3天后终止实验。用FITC-鬼笔环肽染色毛细胞，在耳蜗中部转角(至少20％的中部转角部分)测定其数目。结果(图3)以每只单个豚鼠GDNF处理的耳(右耳)和未处理耳(左耳)的毛细胞丢失百分数来表达。材料：

用于该实验的材料与实施例3所用的相同。方法：

用甲苯噻嗪10mg/kg，氯氨酮40mg/kg和叔丁啡0.05mg/kg的混合物麻醉Albino豚鼠(重600-700g)。在手术显微镜下，经过将27号针头插入膜在右耳鼓膜上打一孔。在鼓膜的另一位置，将人蛋白质GDNF(以1mg/ml的浓度溶于PBS+1％BSA中)注射进中耳腔使全腔充满(125-135μl)。几只动物仅用载体(PBS+0.1％BSA)代替GDNF注射。第二天，进行顺氯氨铂(7.5mg/kg)的肌肉内注射。5天后，以相同的浓度进行第二次注射。3天后(总实验时间为8天)，按实施例3所述处死动物，固定组织并分析耳蜗。结果：

在第8天，用顺氯氨铂注射的4只豚鼠表现出耳蜗毛细胞的明显丢失。在左耳(未接受GDNF的耳)中，耳蜗中部转角毛细胞的丢失是：34％；47％；42％和41％以1mg/ml将GDNF注射进右侧中耳腔时，该丢失明显减少；分别为16％；23％；21％和29％(图3)。接受载体代替GDNF注射进右耳的豚鼠中，右(处理)和左(未处理)耳之间不表现出毛细胞数目的差异。

考虑到本发明优选的其实施方案的上述描述，对本领域的技术人员而言可预期发生在本发明实施中的许多改良和变化。

                       序列表(1)一般信息：(i)申请人：Ella Magal(ii)发明题目：用胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)蛋

             白质产物防止和治疗感觉神经性听力丧失和前庭

             疾病的方法(iii)序列数：1个(iv)联系地址：

  (A)联系人：Amgen.Inc.

  (B)街道：1840 DeHavilland Drive

  (C)城市：千橡树

  (D)州：加利福利亚州

  (E)国家：美国

  (F)邮编：91320(v)计算机可读形式：

  (A)媒体类型：软盘

  (B)计算机：IBM PC兼容机

  (C)操作系统：PC DOS/MS-DOS

  (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25(iv)目前申请资料：

  (A)申请号：

  (B)申请日：

  (C)分类：(viii)委托/代理人信息：

  (A)姓名：Curry，Daniel R.

  (B)登记号：32,727

  (C)参考/存档号：A-392(ix)电信信息：

  (A)电话：805-447-8102

  (B)电传：805-499-8011

(C)电报：(2)SEQ ID NO：1信息：(i)序列特征：(A)长度：134个氨基酸残基(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ix)特征：(A)名称/键：成熟人GDNF的推断的氨基酸序列。(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Ser Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg

1               5                   10                 15Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg

           20                  25                  30Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu

        35                  40                 45Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile

    50                 55                  60Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp

65                  70                  75                  80Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys

                85                  90                  95Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser

           100                 105                 110Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala

       115                 120                 125Lys Arg Cys Gly Cys Ile

   130

Claims (20)

1.胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)蛋白质产物在用于生产治疗神经性听力丧失的药用组合物的用途。

2.根据权利要求1的用途，其中听力丧失与内耳损伤相关。

3.根据权利要求1的作用，其中听力丧失与内耳神经上皮毛细胞的损伤或退化相关。

4.根据权利要求1的用途，其中的听力丧失与螺旋神经节神经元的损伤或退化相关。

5.根据权利要求1的用途，其中的GDNF蛋白质产物是SEQ IDNO：1所述的氨基酸序列或其变异体或衍生物。

6.根据权利要求5的用途，其中的GDNF蛋白质产物具有SEQ IDNO：1所述的氨基酸序列。

7.根据权利要求5的用途，其中的GDNF蛋白质产物是[Met^-1]GDNF。

8.根据权利要求1的用途，其中GDNF蛋白质产物以大约1μg/kg/天到大约100mg/kg/天的剂量用药。

9.根据权利要求1的用途，其中GDNF蛋白质产物经细胞治疗或基因治疗方式用药，其中细胞已被修饰成生产和分泌GDNF蛋白质产物。

10.根据权利要求9的用途，其中的细胞已被体外修饰。

11.根据权利要求9的用途，其中的细胞在体内进行了修饰。

12.胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)蛋白质产物在生产治疗前庭器损伤或破坏的药用组合物中的用途。

13.根据权利要求12的用途，其中的损伤或破坏导致眩晕，头晕或失去平衡。

14.根据权利要求12的用途，其中的GDNF蛋白质产物是SEQ IDNO：1所述的氨基酸序列或其变异体或衍生物。

15.根据权利要求14的用途，其中的GDNF蛋白质产物具有SEQ IDNO：1所述的氨基酸序列。

16.根据权利要求14的用途，其中的GDNF蛋白质产物是[Met^-1]GDNF。

17.根据权利要求12的用途，其中GDNF蛋白质产物以大约1μg/kg/天到大约100mg/kg/天的剂量用药。

18.根据权利要求12的用途，其中的GDNF蛋白质产物经细胞治疗或基因治疗方式用药，其中细胞已被修饰成生产和分泌GDNF蛋白质产物。

19.根据权利要求18的用途，其中细胞在体外被修饰。

20.根据权利要求18的用途，其中细胞在体内被修饰。

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