JPH11504351A - 神経膠細胞系由来神経栄養因子（ｇｄｎｆ）タンパク質産物を使用する感覚神経性聴力損失及び前庭障害の予防及び治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は一般には、神経膠細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を投与することにより、蝸牛（及び前庭）毛細胞及び螺旋神経節ニューロンの損傷又は変性を予防及び／又は治療するための方法に関する。この発明はより具体的には、感覚神経性聴力損失の治療方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 神経膠細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質産物を 使用する感覚神経性聴力損失及び前庭障害の予防及び治療方法 発明の背景 本発明は一般には、神経膠細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質産 物を投与することにより、毛細胞や聴覚ニューロン等の内耳感覚細胞の損傷又は 変性を予防及び／又は治療するための方法に関する。本発明は具体的には、種々 の原因による聴力損失を予防及び／又は治療するための方法に関する。 神経栄養因子は神経系、又は神経系が分布する非神経組織、に存在し、所定の 神経及び／又は神経膠細胞集団の生存を助長すると共にその表現型分化を維持す るように機能する天然タンパク質である（Ｖａｒｏｎら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅ ｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１：３２７，１９７９； Ｔｈｏｅｎｅｎら，Ｓｃｉｅ ｎｃｅ，２２９：２３８，１９８５）。この生理的役割により、神経栄養因子は このような神経細胞の変性と神経損傷に起因する分化機能の損失を治療するのに 有用である。神経損傷は１種以上の神経細胞の生存及び／又は適正機能を妨げる 条件により生じ、このような条件としては、（１）損傷部位の 近傍の軸索突起（神経細胞死をもたらす）及び／又は神経細胞体の変性をもたら す物理的損傷、（２）発作等のように神経系の一部分への血流の一時的又は永久 的停止（虚血）、（３）夫々癌及びＡＩＤＳ化学療法剤であるシスプラチン及び ジデオキシシチジン等の神経毒への意図的又は偶発的暴露、（４）糖尿病又は腎 不全等の慢性代謝疾患、あるいは（５）特定ニューロン集団の変性に起因するパ ーキンソン病、アルツハイマー病及び筋萎縮性側索硬化症等の神経変性疾患が挙 げられる。特定の神経栄養因子が神経損傷の治療に潜在的に有用であるためには 、損傷神経細胞の種類がこの因子に反応性でなければならない。全てのニューロ ン集団が全神経栄養因子に反応性又は等しく作用を受ける訳ではないことは立証 されている。 最初に同定された神経栄養因子は神経成長因子（ＮＧＦ）であった。ＮＧＦは ニューロトロフィンと呼ばれる確定ファミリーの栄養因子の第１員であり、ニュ ーロトロフィンは現在、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン −３（ＮＴ−３）、ＮＴ−４／５及びＮＴ−６を含む（Ｔｈｏｅｎｅｎ，Ｔｒｅ ｎｄｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１４：１６５−１７０，１９９１； Ｓｎｉｄｅ ｒ，Ｃｅｌｌ，７７：６２７−６３８， １９９４； Ｂｏｔｈｗｅｌｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１８： ２２３−２５３，１９９５）。これらのニューロトロフィンはｔｒｋチロシンキ ナーゼレセプターのファミリー、即ちｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、ｔｒｋＣ及び低親和 性ｐ７５レセプターを介して作用することが知られている（Ｓｎｉｄｅｒ，Ｃｅ ｌｌ，７７：６２７−６３８，１９９４； Ｂｏｔｈｗｅｌｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１８：２２３−２５３，１９９５； Ｃｈａｏら，ＴＩ ＮＳ １８：３２１−３２６，１９９５）。 神経膠細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）は最近発見されたタンパク質であ り、インビトロで中脳ドーパミン作動性ニューロンの生存を助長してその伝達物 質表現型を刺激する効果に基づくアッセイを使用して同定及び精製された（Ｌｉ ｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：１１３０−１１３２，１９９３）。ＧＤＮＦは トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのタンパ ク質に多少の構造相同をもつグリコシル化ジスルフィド結合ホモダイマーである （Ｌｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：１１３０−１１３２，１９９３； Ｋｒ ｉｅｇｌｓｔｅｉｎら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１４：７３６−７４ ２，１９９５； Ｐｏｕｌｓｅｎら，Ｎｅｕｒｏｎ，１３：１２４５−１２５２ ，１９９４）。ＧＤＮＦ ｍＲＮＡは末梢神経系の筋及びシュワン細胞（Ｈｅｎ ｄｅｒｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：１０６２−１０６４，１９９４； Ｔｒｕｐｐら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３０：１３７−１４８，１９９５ ）と中枢神経系のＩ型星状細胞（Ｓｃｈａａｒら，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１ ２４：３６８−３７１，１９９３）で検出されている。インビボでは外来ＧＤＮ Ｆによる治療は黒質ニューロンのドーパミン作動性表現型を刺激し、パーキンソ ン病の動物モデルで軸索切断又はドーパミン作動性神経毒により誘発した機能欠 損を回復する（Ｈｕｄｓｏｎら，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．，３６：４２ ５−４３２，１９９５； Ｂｅｃｋら，Ｎａｔｕｒｅ，３７３：３３９−３４１ ，１９９５；Ｔｏｍａｃら，Ｎａｔｕｒｅ，３７３：３３５−３３９，１９９５ ； Ｈｏｆｆｅｒら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，１８２：１０７−１１１ ，１９９４）。ＧＤＮＦは最初は少なくともインビトロではドーパミン作動性ニ ューロンに比較的特異的であると考えられていたが、中脳ドーパミン作動性及び 体運動ニューロン以外にも広範な神経栄養ターゲットをもつらしい ということが証明され始めている(ＹａｎとＭａｔｈｅｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３７３：３４１−３４４，１９９５； Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ， ３７３：３４４−３４６，１９９５； Ｍａｔｈｅｓｏｎら，Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒ ｏｓｃｉ．Ａｂｓｔｒ，２１，５４４，１９９５； Ｔｒｕｐｐら，Ｊ．Ｃｅｌ ｌ Ｂｉｏｌ．，１３０：１３７−１４８，１９９５)。特に、ＧＤＮＦはイン ビボ及びインビトロの両者で脳幹及び脊髄索コリン作動性運動ニューロン（Ｏｐ ｐｅｎｈｅｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ，３７３：３４４−３４６，１９９５； Ｚｕ ｒｎら,Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ,６：１１３−１１８，１９９４；Ｙａｎら,Ｎ ａｔｕｒｅ,３７３：３４１−３４４，１９９５；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら，Ｓｃ ｉｅｎｃｅ，２６６：１０６２−１０４，１９９４）、インビトロで光受容体等 の網膜ニューロン（現在係属中のＬｏｕｉｓの１９９５年１１月２９日付け米国 特許出願第０８／５６４，８３３号）、インビボ及びインビトロの両者で網膜神 経節細胞（現在係属中のＹａｎの１９９５年１１月２９日付け米国特許出願第０ ８／５６４，４５８号）、並びにインビボ及びインビトロの両者で背根神経節か らの感覚ニューロン（現在係属中のＹａｎらの１９９５年１１月２９日 付け米国特許出願第０８／５６４，８４４号）に神経栄養効果をもつことが判明 した。 本発明の一般関連技術は１９９３年４月１日公開ＷＯ９３／０６１１６（Ｌｉ ｎら，Ｓｙｎｔｅｘ−Ｓｙｎｅｒｇｅｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｉｎ ｔ Ｖｅｎｔｕｒｅ）に記載されており、この文献はＧＤＮＦがパーキンソン病 に関連する損傷を含む神経損傷の治療に有用であることを報告している。他の関 連文献として、Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｋａｓｔｎｅｒら，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ．Ｒｅ ｓ．，２６：３２５−３３０，１９９４は、ＧＤＮＦ ｍＲＮＡが検出可能にな り、ピロカルピンで誘発した発作後にアップレギュレートされたと報告しており 、Ｓｃｈａａｒら，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１２４：３６８−３７１，１９９ ３及びＳｃｈａａｒら，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ.，１３０：３８７−３９３，１ ９９４は、基底前脳星状細胞が培養条件下で中レベルのＧＤＮＦ ｍＲＮＡを発 現したが、ＧＤＮＦは基底前脳ＣｈＡＴ活性を変えなかったと報告しており、現 在係属中の１９９５年９月２８日付け米国特許出願第０８／５３５，６８２号、 ＧＤＮＦが基底前脳コリン作動性ニューロンの損傷又は変性の治療に有用である と報告している。ＧＤＮ Ｆが毛細胞及び聴覚ニューロン等の内耳細胞の生存、再生又はその変性防御を助 長することはまだ示されていない。 内耳のコルチ器における神経上皮毛細胞は音を神経活性に変換し、第８脳神経 の蝸牛区に沿って伝達する。この神経は３種のニューロン（Ｓｐｏｅｎｄｌｉｎ ，Ｈ．Ｈ．Ｉｎ： Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｉ．Ｂａｌｌａｎｔｙｎｅ，Ｊ．編， Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｔｌａｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｎｅｒ Ｅ ａｒ； Ｌｏｎｄｏｎ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，１３３〜１６４頁，１９８４ ）、即ち１）螺旋神経節にあり、蝸牛を脳幹に連結する輸入ニューロン、２）上 オリーブ核コンプレックスに始まる輸出オリーブ蝸牛ニューロン、及び３）頚部 交感神経幹に始まり、蝸牛を神経支配する自律アドレナリン作動性ニューロンか らの繊維から構成される。ヒトでは、各々約５０のラメラから構成され、直径４ 〜６μｍの有髄軸索をもつ約３０，０００の輸入蝸牛ニューロンが存在する。こ の組織学的構造は重要な機能的特徴の１つである均一伝導速度の基礎を形成する 。聴覚神経の全長を通して輸入繊維の栄養構造が存在し、中心に配置された「先 端」繊維に「基底」繊維が縄状に巻き付けられている。Ｓｐｏｅｎｄｌｉｎ（Ｓ ｐｏｅｎｄｌｉｎ， Ｈ．Ｈ．Ｉｎ： Ｎａｕｎｔｏｎ，Ｒ．Ｆ．， Ｆｅｒｎａｄｅｘ，Ｃ．編，Ｅ ｖｏｋｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ Ａｕｄ ｉｔｏｒｙ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２１〜３９頁，１９７８）は形態学的な相違に基づいて螺旋神経 節における２種の輸入ニューロンを同定した。Ｉ型細胞（９５％）は双極性であ り、有髄細胞体と内耳細胞まで突出する軸索をもつ。ＩＩ型細胞（５％）は単極 性であり、有髄軸索をもち、コルチ器の外部毛細胞まで突出している。各内部毛 細胞には、各々ただ１個の細胞にシナプスを形成する約２０本の繊維が神経分布 する。他方、各外部毛細胞には約６本の繊維が神経分布し、各繊維は約１０個の 細胞に達するように分岐している。蝸牛の内部で繊維は１）主に同側に現れ、内 部毛細胞への輸入ニューロンと共にシナプスを形成する内部螺旋群と、２）主に 対側に現れ、外部毛細胞と直接シナプスを形成するより多数の外部放射群に分け られる。特徴的又は最良の周波数である１つの周波数に最小閾値が存在するが、 このレベルの上下の周波数で閾値は急激に上昇する（Ｐｉｃｋｌｅｓ，Ｊ．Ｏ． Ｉｎ： Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｐｈｙｓ ｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈｅａｒｉｎｇ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ ｅｓｓ，７１〜１０６頁，１９８２）。従って、単一の聴覚神経繊維が帯域フィ ルターとして挙動すると思われる。基底膜はその長さ方向の種々の距離で種々の 周波数に優先的に振動し、各蝸牛神経繊維の周波数選択性はその繊維が連結され ている内部毛細胞と似ている。即ち、各蝸牛神経繊維はその隣接繊維と異なる周 波数範囲をカバーする回転曲線を示す（Ｅｖａｎｓ，Ｅ．Ｆ．Ｉｎ： Ｂｅａｇ ｌｅｙ Ｈ．Ａ．編，Ａｕｄｉｔｏｒｙ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ： Ｔｈ ｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９ ７９）。このメカニズムにより、複合音は内耳のフィルターにより成分周波数に 分解される（周波数分解）。 社会的及び職業関連コミュニケーションを妨げるに十分な程度の聴力損失は米 国人の最も一般的な慢性神経障害のひとつに数えられる。健康面接データ（Ｖｉ ｔａｌ ａｎｄ ｈｅａｌｔｈ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．Ｓｅｒｉｅｓ １０． Ｎｏ．１７６．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（ＤＨＨＳ ｐｕｂｌ ｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．（ＰＨＳ）９０−１５０４））によると、４５歳未満の 人口の約４％及び６５歳以上の人口の約２９％が障害性聴力損失をもつと推定さ れる。２８，０００，０００人を越える米国人が聴力障害をもち、このうちの２ ，０００，０００人もが重度軟調であると推定されている（国家戦略計画特別委 員会報告，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．： Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，１９８９）。聴力損失の有病率は年齢と共に劇的に増 加する。１０００人中約１人の乳児が介助なしに会話の進歩が得られないほど重 度の聴力損失をもつ（Ｇｅｎｔｉｌｅ，Ａ．ら，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｓ ｏｆ ｐｅｒｓｏｎｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｈｅａｒｉｎｇ： 米国，１９６２−１９６３．Ｓｅｒｉｅｓ １０．Ｎｏ．３５.Ｗａｓｈｉｎｇ ｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｏｆｆｉｃｅ, １９６７（ＤＨＨＳ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．（ＰＨＳ）１０００）） （Ｈｕｍａｎ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｉｓｏｒｄｅ ｒｓ： ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．： Ｎａｔｉｏｎ ａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ ｈｅａｌｔｈ，１９７０）。 ７５歳以上では１０００人中３６０人以上が障害性聴力損失をもつ（Ｖｉｔａｌ ａｎｄ ｈｅａｌｔｈ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．Ｓｅｒｉｅｓ １０．Ｎｏ． １７６．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（ＤＨＨＳ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．（ＰＨＳ）９０−１５０４）。 聴力、発語及び言語の障害のために、生産性の損失、特殊教育及び医療治療費 用は年間３００億ドルを越えると推定されている（１９９０ ａｎｎｕａｌ ｒ ｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅａｆｎｅｓｓ ａｎｄ ｏ ｔｈｅｒ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ａｄｖｉｓｏｒ ｙ Ｂｏａｒｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐ ｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ，１９９１．（ＤＨＨＳ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏ ｎ ｎｏ.（ＮＩＨ）９１−３１８９）。小児の重度難聴の一般的な主原因は遺 伝的障害と髄膜炎であり、夫々全体の約１３％及び９％を占める(Ｈｏｔｃｈｋ ｉｓｓ，Ｄ．Ｄｅｍｏｇｒａｐｈｉｃ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅａｒｉｎｇ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ： ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａｎｓｗｅｒｓ．第 ２版，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．： Ｇａｌｌａｕｄｅｔ Ｕｎｉｖｅ ｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。小児難聴の症例の約５０％は原因が分か っていないが、遺伝的原因又は素質によると思われる（Ｎａｎｃｅ ＷＥ，Ｓｗ ｅｅｎｅｙ Ａ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ １９ ７５；８：１９−４８）。 外耳道から中枢神経系までの聴覚経路のいずれかの場所が損傷すると聴力損失 を生じ得る。聴覚器は外耳及び中耳と、内耳及び聴覚神経と、中枢聴覚経路に分 けられる。ヒトにおける聴覚情報は内耳で約１５，０００個の神経上皮細胞（毛 細胞）と３０，０００個の一次ニューロン（螺旋神経節細胞）の作用により機械 的信号から神経伝導電気パルスに変換される。螺旋神経節ニューロンの全中心繊 維は橋脳幹の蝸牛核でシナプスを形成する。聴覚に関与するニューロンの数は蝸 牛から聴覚脳幹及び聴覚皮質まで劇的に増加する。全聴覚情報は僅か１５，００ ０個の毛細胞によって伝達され、そのうち３５００個の所謂内部毛細胞が３０， ０００個の一次聴覚ニューロンの約９０％とシナプスを形成するので特に重要で ある。従って、聴覚末梢の比較的少数の細胞が損傷しただけでも実質的な聴力損 失を生じかねない。従って、感覚神経損失の殆どの原因は内耳の病変に あると言うことができる（Ｎａｄｏｌ，Ｊ．Ｂ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９３，３２９：１０９２−１１０ ２）。 聴力損失は伝導性、感覚神経及び中枢レベルで発生し得る。伝導性聴力損失は 、空中の音が鼓膜と小骨により増幅されて内耳液まで運ばれる正常経路を破壊す る外耳及び中耳の病変に起因する。感覚神経性聴力損失は蝸牛又は第８脳神経の 聴覚区の病変に起因する。中枢聴力損失は中枢聴覚経路の病変に起因する。この 経路は蝸牛及び背側オリーブ核コンプレックス、下丘、内側膝状体、側頭葉の聴 覚皮質並びに相互に連結する輸入及び輸出繊維路から構成される（Ａｄａｍｓ Ｒ．Ｄ．とＭａｕｒｉｃｅ，Ｖ．編，ｉｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎ ｅｕｒｏｌｏｇｙ．１９８９．ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏ ｎ ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ．２２６〜２４６頁）。 上述のように、小児重度難聴の症例の少なくとも５０％は遺伝的原因による（ Ｂｒｏｗｎ，Ｋ．Ｓ．Ｍｅｄ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ ＡＭ．１９６９；５３： ７４１−７２）。７５歳以上の人口の３分の１に及ぶ老人性難聴−年齢関連聴力 損失−の 主原因が遺伝素質であるという可能性（Ｎａｄｏｌ，Ｊ．Ｂ．Ｉｎ：Ｂｅａｓｌ ｅｙ ＤＳ，Ｄａｖｉｓ ＧＡ編，Ａｇｉｎｇ： Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｇ ｒｕｎｅ＆ Ｓｔｒａｔｔｏｎ，１９８１：６３−８５）を考慮するならば、遺 伝因子は恐らく聴力損失のただ１つの最も一般的な原因である。遺伝異常は伝導 性聴力損失よりも感覚神経性聴力損失として発現される頻度のほうが著しく高い 。遺伝的に決定された感覚神経性聴力損失は特に小児では感覚神経損失の主原因 でないとして明らかに重要である（Ｎａｎｃｅ ＷＥ，Ｓｗｅｅｎｅｙ Ａ．Ｏ ｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ １９７５；８：１９−４ ８）。感覚神経損失の最も一般的な疾病形態にはワールデンブルグ症候群、アル ポート症候群及びアシャー症候群がある。 種々の慣用薬剤は聴器毒性をもつ。最もよく知られているのはアミノグリコシ ド抗生物質（Ｌｅｒｎｅｒ，Ｓ．Ａ．ら編，Ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｏ ｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｂｏｓｔｏｎ： Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ，１９８１ ； Ｓｍｉｔｈ,Ｃ.Ｒ.ら,Ｎ Ｅｎｇｌ.Ｊ.Ｍｅｄ.１９８０； ３ ０２：１１０６−９）、ループ利尿薬（Ｂｏｓｈｅｒ，Ｓ．Ｋ．，Ａｃｔａ Ｏ ｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．（Ｓｔｏｃｋｈ）１９８０； ９０：４−５４）、サリ チル酸塩（Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｎ．ら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９６５； ２７３：５８７−９０）及びシスプラチン等の抗癌剤（Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍ．ら ，Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ １９８３； １４３：１２６３−５）である。聴 器毒性はエリスロマイシンの経口及び非経口投与中にも報告されている（Ｋｒｏ ｂｏｔｈ，Ｐ．Ｄ．ら，Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．１９８３； １：１ ６９−７９； Ａｃｈｗｅｉｔｚｅｒ，Ｖ．Ｇ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｎ．Ａｒｃｈ． Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．１９８４； １１０：２５８−６０）。 大部分の聴器毒性物質は蝸牛、特に体液及び電解質のホメオスタシスに関与す る内耳内の特殊上皮器官である聴覚毛細胞及び血管条を損傷することにより聴力 損失をもたらす（Ｎａｄｏｌ，Ｊ．Ｂ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ． １９９３，３２９：１０９２−１１０２）。毛細胞を冒す聴器毒性イベント後何 年も経ってから二次神経変性が生じることもある。聴器毒性物質によっては内耳 内に選択的に集中し、全身投与を停止 しても進行性感覚神経損失をもたらすことも立証されている（Ｆｅｄｅｒｓｐｉ ｌ，Ｐ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９７６； １３４ Ｓｕｕｐｌ：Ｓ ２００−Ｓ２０５）。 音響過剰刺激による外傷も難聴の原因となる。雑音からの外傷に対する感受性 には個人差がある。Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｈｅａ ｌｔｈ Ａｇｅｎｃｙ（Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ，Ｊ．Ｄ．編，Ｗａｓｈｉｎｇｔ ｏｎ Ｄ．Ｃ．： Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｏｔｏｌａｒｙ ｎｇｏｌｏｇｙ−Ｈｅａｄ ａｎｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇｅｒｙ Ｆｏｕｎｄａ ｔｉｏｎ，１９８８）により認可されているレベルを下回っていても、人によっ ては高強度雑音で臨床的に重度の感覚神経性聴力損失を生じることがある。 多発性硬化症等の脱髄過程も感覚神経性聴力損失の原因となることがある（Ｎ ｏｆｆｓｉｎｇｅｒ，Ｄら，Ａｃｔａ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｓｕｐｐｌ( Ｓｔｏｃｈ)１９７２； ３０３：１−６３）。より最近では、ある形態の免疫 媒介感覚神経性聴力損失が認められている（ＭｃＣａｂｅ，Ｂ．Ｆ．Ａｎｎ Ｏ ｔｏｌ Ｒｈｉｎｏｌ Ｌａｒｙｎｇｏｌ １９７９；８８：５８５−９）。聴 力損失は通常は両側性であり、迅速進 行性であり（週及び月で測定）、前庭症状を伴う場合と伴わない場合がある。 一次及び転移性を問わずに種々の腫瘍は内耳又は聴覚神経を侵すことにより伝 導性聴力損失又は感覚神経性聴力損失を誘発することがある（Ｈｏｕｃｋ，Ｊ． Ｒ．ら，Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ １９９２； １０６：９２−７）。原因が分かっていない種々の変性疾患も感覚神経性聴力 損失を生じることがある。メニエール病（Ｎａｄｏｌ，Ｊ．Ｂ．編，Ｍｅｎｉｅ ｒｅ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ： ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｐａｔｈｏｐｈｙｓ ｉｏｌｏｇｙ，ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ａｍｓｔｅ ｒｄａｍ： Ｋｕｇｌｅｒ ＆ Ｇｈｅｄｉｎｉ １９８９）は変動性感覚神経 性聴力損失、エピソードめまい及び耳鳴を特徴とし、内耳内の体液ホメオスタシ ス不全に起因するらしいが、病因はまだ分かっていない。中〜重度の感覚神経性 難聴の原因となる突発特発性感覚神経性聴力損失（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｗ.Ｒ.ら,Ａ ｒｃｈ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ １９８０； １０６：７７２−６）は、内耳 虚血及びウイルス性内耳炎を含む種々の原因に起因するらしい。 加齢に関連する聴力損失である老人性難聴は７５歳以上の人口の３分の１以上 に及ぶ。老人性難聴の最も一般的な組織病理相関は末梢聴覚系の神経上皮（毛） 細胞、ニューロン及び血管条の損失である（Ｓｃｈｕｋｎｅｃｈｔ Ｈ．Ｆ．Ｐ ａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｅａｒ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ： Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９７４：３８８−４０ ３）。老人性難聴は雑音外傷、聴器毒性及び遺伝による変性を含む生存中の数種 の有害な影響の相乗作用に起因するという説が最も有力である。 所定の神経栄養因子は、発生中のニューロン分化及び生存を調節したり（Ｋｏ ｒｓｃｈｉｎｇ Ｓ.Ｊ.Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：２７３９−２７４８，１９９ ３）、成人でニューロンを損傷及び毒素から防御する（Ｈｅｆｔｉ，Ｎｅｕｒｏ ｓｃｉ．６:２１５５−２１６２,１９８６; Ａｐｆｅｌら,Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏ ｌ ２９：８７−８９，１９９１； Ｈｙｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３５０：２ ３０−２３３，１９９１； Ｋｎｕｓｅｌら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２:４ ３９１−４４０２，１９９２； Ｙａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３６０：７５３−７ ５５，１９９２； Ｋｏｌｉａｔｓｏｓら，Ｎｅｕｒｏｎ，１０： ３５９−３６７，１９９３）ことが示されている。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイ ゼーション研究によると、ニューロトロフィンレセプターＴｒｋＢ及びＴｒｋＣ のｍＲＮＡは蝸牛前庭神経節の発生により発現され（Ｙｌｉｋｏｓｋｉら，Ｈｅ ａｒ．Ｒｅｓ．６５：６９−７８ １９９３； Ｓｃｈｅｃｔｅｒｓｏｎら，Ｈ ｅａｒｉｎｇ Ｒｅｓ．７３：９２−１００ １９９４）、ＢＤＮＦ及びＮＴ− ３のｍＲＮＡはコルチ器を含む内耳に存在する（Ｐｉｒｖｏｌａら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ８９：９９１５−９９１９,１９９２; Ｓ ｃｈｅｃｔｅｒｓｏｎら，Ｈｅａｒｉｎｇ Ｒｅｓ．７３：９２−１００，１９ ９４； Ｗｈｅｅｌｅｒら，ＨｅａｒｉｎｇＲｅｓ．７３：４６−５６，１９９ ４）。前庭及び聴覚系の発生におけるＢＤＮＦ及びＮＴ−３の生理的役割は、欠 失ＢＤＮＦ及び／又はＮＴ−３遺伝子をもつマウスで検討された（Ｅｒｎｆｏｒ ｓら，Ｎｅｕｒｏｎ １４：１１５３−１１６４，１９９５）。蝸牛でＢＤＮＦ 突然変異体は２型螺旋ニューロンを失い、外部毛細胞神経支配の不在をもたらし た。ＮＴ−３突然変異体は求心性神経の欠乏を示し、内部毛細胞を神経支配する １型ニューロンに対応すると予想される螺旋ニューロンの８ ７％を失った。二重突然変異体は付加的損失があり、全前庭及び螺旋ニューロン を欠失していた。内耳の末梢感覚系で特定ニューロン集団の生存とターゲット神 経支配の維持にＴｒｋＢ及びＴｒｋＣレセプターが必要であることは、これらの 遺伝子のチロシンキナーゼ触媒ドメインに生殖系列突然変異をもつマウスを試験 することにより立証された（Ｓｃｈｉｍｍａｎｇら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １２１：３３８１−３３９１，１９９５）。Ｇａｏら（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １５：５０７９−５０８７，１９９５）は解離培養物でラット生後螺旋神経節ニ ューロンについてＮＴ−４／５、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３の生存助長能を示し、Ｎ Ｔ−４／５がこれらのニューロンを抗癌薬剤であるシスプラチンの神経毒性作用 から防御することを示した。更に、ＢＤＮＦとＮＴ−３は解離培養物で成体ラッ ト聴覚ニューロンの生存を助けることも示されている（Ｌｅｆｅｂｖｒｅら，Ｎ ｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ ５：８６５−８６８，１９９４）。 聴力損失の治療にＧＤＮＦを使用することはまだ報告されていない。聴力障害 は重度の苦痛であるため、聴覚ニューロン及び毛細胞を損傷から防御することが 可能な物質及び治療方法を同定できるならば極めて有益である。 発明の要約 本発明は、内耳に病変をもつ対象に治療的に有効な量の神経膠細胞系由来神経 栄養因子(ＧＤＮＦ)タンパク質産物を投与することを特徴とする感覚神経性聴力 損失の治療方法を提供する。例えば、聴力損失は内耳における神経上皮毛細胞（ 蝸牛毛細胞）又は螺旋神経節ニューロンの損傷又は変性に関連し得る。 本発明は、毛細胞がシスプラチンやネオマイシン等の聴器毒素の毒性作用を阻 止することによりＧＤＮＦに応答し、聴覚ニューロンも例えばシスプラチン、ネ オマイシン及びサリチル酸ナトリウム等の種々の聴器毒素の毒性作用を阻止する ことによりＧＤＮＦに応答するという発見に基づく。従って、治療的に有効な量 のＧＤＮＦタンパク質産物を投与すると、毛細胞及び螺旋神経節ニューロンの防 御、生存又は再生を助長することができる。 前庭器に病変又は障害をもつ対象に治療的に有効な量のＧＤＮＦタンパク産物 を投与することによりこのような病変又は障害を治療できることも発見された。 このような病変はめまい感、めまい又は平衡損失の原因となり得る。 このようなＧＤＮＦタンパク質産物は図１（配列番号１）に 示すアミノ酸配列により示されるようなＧＤＮＦタンパク質とその変異体及び誘 導体を含み得るし、また、このようなＧＤＮＦタンパク質産物は［Ｍｅｔ^-1］Ｇ ＤＮＦをも含み得る。 本発明によると、ＧＤＮＦタンパク質産物は約１μｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍ ｇ／ｋｇ／日の用量、典型的には約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約２５ｍｇ／ｋｇ／ 日の用量、通常は約５ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で非経口投 与することができる。個々の患者の必要及び投与経路によっては毎日でなく週に １回又は週に数回といった低頻度でＧＤＮＦタンパク質産物を投与してもよい。 更に、ＧＤＮＦタンパク質産物を中耳又は内耳に直接投与してもよい。より少量 のＧＤＮＦタンパク質産物をこのように投与する場合には、例えば片耳約１μｇ 〜約１ｍｇを１回又は複数回に分けて直接中耳又は内耳に投与すればよいことが 当業者に理解されよう。 ＧＤＮＦタンパク質産物を有効量のＢＤＮＦ及びＮＴ−３等の第２の治療物質 と組み合わせるか又は結合して投与することもできる。本発明は更に、感覚神経 性聴力損失の種々の原因となる毛細胞及び聴覚ニューロンの損傷又は変性の治療 用医薬又は医薬組成物の製造におけるＧＤＮＦタンパク質産物の使用も 提供する。このような医薬組成物は局所、経口もしくは中耳及び内耳投与用ＧＤ ＮＦタンパク質産物製剤又は該製剤と蝸牛インプラントとの併用を含む。 投与方法は以下に詳述するような細胞治療及び遺伝子治療手段により達成でき ることも当業者に理解されよう。例えば、遺伝子治療手段では、ＧＤＮＦタンパ ク質産物を産生及び分泌するように細胞を改変しておく。細胞はエクスビボ又は インビボのどちらで改変してもよい。本発明のその他の多数の態様及び利点は、 本発明の好適態様に関する以下の詳細な説明から当業者に理解されよう。 発明の詳細な説明 本発明は治療的に有効な量の神経膠細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タン パク質産物を投与することにより感覚神経性聴力損失を予防及び／又は治療する ための方法を提供する。本発明の１態様によると、医薬組成物、ＧＤＮＦ発現細 胞の移植又はＧＤＮＦ遺伝子治療により治療的に有効な量のＧＤＮＦタンパク質 産物を投与することにより、損傷毛細胞及び聴覚ニューロンを治療するための方 法が提供される。本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列により示されるＧＤ ＮＦタンパク質と その変異体及び誘導体を含む任意の生物学的に活性なＧＤＮＦタンパク質産物を 使用することにより実施できる。ＧＤＮＦタンパク質産物は経口、非経口又は局 所送達以外に、細胞治療及び遺伝子治療法で投与することも予想される。 本発明は元々、ＧＤＮＦがラットの蝸牛の外植片培養物及び成体ラットからの 培養解離螺旋神経節ニューロンで聴器毒素に誘発される細胞死から毛細胞を防御 するという発見に基づく。外来ＧＤＮＦタンパク質産物の投与は、毛細胞及び螺 旋神経節ニューロンを外傷損傷（例えば雑音外傷や、シスプラチン及びアミノグ リコシド抗生物質の急性又は慢性治療）又は軸索から細胞体への因子の輸送の遮 断による神経栄養因子の欠乏に起因する損傷から防御すると予想される。このよ うな治療は、毛細胞及び／又は聴覚ニューロンが環境雑音外傷又は聴器毒素治療 からの断続的傷害に耐えられるようにし、老人性難聴（年齢関連聴力損失）、遺 伝感覚神経変性及び特発後の聴力損失等の症状で聴力損失に関与する聴覚ニュー ロン及び毛細胞の進行性変性を遅らせ、内耳の機能的完全性を維持すると予想さ れる。このような治療は更に、蝸牛インプラントがより良好で長期的に機能でき るように聴覚ニューロンを補助する。 本発明によると、ＧＤＮＦタンパク質産物は約１μｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍ ｇ／ｋｇ／日の用量、典型的には約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約２５ｍｇ／ｋｇ／ 日の用量、通常は約５ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で中耳に投 与することができる。蝸牛インプラント法や内耳外科処置等で内耳を予め適当に 侵襲処置してある場合には、ＧＤＮＦタンパク質産物を内耳に直接投与してもよ い。このような場合には、例えば片耳約１μｇ〜約１ｍｇ程度の少量のＧＤＮＦ タンパク質産物を１回又は複数回に分けて投与する。因子の慢性投与が必要な場 合には、Ａｌｚｅｔミニポンプをカニューレに装着し、カニューレの先端を中耳 又は内耳に導入して因子を連続放出する。ＧＤＮＦを耳滴剤として調製し、胞の 鼓膜に浸透させてもよい。更に、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３並びに種々の内耳疾患の 治療に現在又は将来使用される他の因子又は薬剤と共に、有効量の第２の聴覚ニ ューロン変性治療用治療物質とＧＤＮＦタンパク質産物を併用投与することも考 えられる。種々の医薬製剤及び種々の送達方法については以下に詳述する。 本明細書で使用する「ＧＤＮＦタンパク質産物」なる用語は、精製した天然、 合成又は組換え神経膠細胞系由来神経栄養因子、 生物学的に活性なＧＤＮＦ変異体（挿入、置換及び欠失変異体を含む）、及びそ の化学的修飾誘導体を含む。配列番号１に示すアミノ酸配列をもつヒトＧＤＮＦ に実質的に相同のＧＤＮＦも含まれる。ＧＤＮＦタンパク質産物はその生物学的 に活性な形態でホモダイマー又はヘテロダイマーとして存在し得る。 本明細書で使用する「生物学的に活性」なる用語は、ＧＤＮＦタンパク質産物 が配列番号１に示すアミノ酸配列をもつＧＤＮＦと必ずしも全く同一の性質を同 一程度まで示す訳ではないとしても、類似の神経栄養性質を示すことを意味する 。特定の着目神経栄養性質の選択は、ＧＤＮＦタンパク質産物の投与用途に依存 する。 本明細書で使用する「実質的に相同」なる用語は、配列番号１に示すアミノ酸 配列をもつＧＤＮＦと好ましくは＞７０％、より好ましくは＞８０％、更に好ま しくは＞９０％又は９５％の相同性をもつことを意味する。例えば、ラットとヒ トタンパク質の相同性は約９３％であり、好ましい哺乳動物ＧＤＮＦは同様に高 い相同性をもつと考えられる。本明細書に記載する相同百分率は一般に、（その 開示内容を参考資料として本明細書の一部とするＤａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５，ｐ．１２ ４，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎ ｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７２）に記載されている ように）４つの１００アミノ酸長ギャップを導入すればその整列を補助できると きに、比較する配列中の同一アミノ酸残基と整列する２つの配列の小さいほうに 存在するアミノ酸残基の百分率として計算される。好ましくは、上記のような相 同百分率は（ギャップを導入した）２つの配列の大きいほうにも存在し得る２つ の配列の小さいほうに存在する成分の百分率として計算され、成分は４つの連続 アミノ酸の配列として定義される。配列番号１のＧＤＮＦに対する抗体との交差 反応性により単離可能であるか又は配列番号１のＧＤＮＦをコードする遺伝子も しくは遺伝子のセグメントとのハイブリダイゼーションによりその遺伝子を単離 することが可能な任意のＧＤＮＦタンパク質産物も実質的に相同とみなされる。 本発明によるＧＤＮＦタンパク質産物は、当業者に公知の任意の手段により単 離又は製造できる。本発明で有用なＧＤＮＦタンパク質産物の製造方法の例は、 １９９４年５月２３日付け 米国特許出願第０８／１８２，１８３号とその親出願；１９９２年９月１７日付 けで出願され、ＷＯ９３／０６１１６として公開されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／Ｕ Ｓ９２／０７８８８号（Ｌｉｎら，Ｓｕｎｔｅｘ−Ｓｙｎｅｒｇｅｎ Ｎｅｕｒ ｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｉｎｔ Ｖｅｎｔｕｒｅ）；ＥＰ６１０２５４として公 開されたヨーロッパ特許出願第９２９２１０２２．７号；及び本願と同一名義の 同時係属中の１９９５年９月２８日付け米国特許出願第０８／５３５，６８１号 （“Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｇｌｉａｌ Ｃｅｌｌ−Ｌｉｎｅ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ”）に記載されており、これらの文献 の開示内容は参考資料として本明細書の一部とする。 天然に存在するＧＤＮＦタンパク質産物は哺乳動物ニューロン細胞調製物、又 はＧＤＮＦを分泌もしくは発現する哺乳動物細胞系から単離することができる。 例えば、ＷＯ９３／０６１１６はＢ４９膠芽腫細胞の無血清成長ならし培地から のＧＤＮＦの単離を記載している。ＧＤＮＦタンパク質産物は当業者に公知の任 意の手段により化学的に合成することもできる。ＧＤＮＦタンパク質産物は高純 度で比較的多量のタンパク質が得ら れるという理由で組換え技術により製造するのが好ましい。組換えＧＤＮＦタン パク質産物形態は、タンパク質のグリコシル化及び非グリコシル化形態を含み、 タンパク質は細菌、哺乳動物又は昆虫細胞系で発現される。 一般に、組換え技術はＧＤＮＦのコーディングに関与する遺伝子を単離し、適 当なベクター及び細胞型で遺伝子をクローニングし、必要に応じて所望の変異体 をコードするように遺伝子を改変し、ＧＤＮＦタンパク質産物を産生するように 遺伝子を発現させる。あるいは、所望のＧＤＮＦタンパク質産物をコードするヌ クレオチド配列を化学的に合成することもできる。遺伝暗号又は対立遺伝子変異 の縮重によりコドン使用が異なるヌクレオチド配列を使用してＧＤＮＦタンパク 質産物を発現させてもよいと考えられる。ＷＯ９３／０６１１６はラットＧＤＮ Ｆ遺伝子のｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定と、ヒトＧＤＮＦ遺伝子のゲノ ムＤＮＡクローンの単離、配列決定及び発現を記載している。ＷＯ９３／０６１ １６は更にＧＤＮＦタンパク質産物の発現用ベクター、宿主細胞及び培養増殖条 件も記載している。大腸菌でのＧＤＮＦタンパク質産物の発現に適した他のベク ターは、その開示内容を参考資料として本明細書の一 部とする１９９１年４月２４日公開ヨーロッパ特許出願第ＥＰ０４２３９８０号 （“Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ”）に開示されている。成熟ヒトＧＤＮ Ｆをコードする遺伝子のＤＮＡ配列とＧＤＮＦのアミノ酸配列はＷＯ９３／０６ １１６の図１９（配列番号５）に示されている。図１９はＧＤＮＦのプレプロ部 分の完全コーディング配列は示さず、ヒトプレプロＧＤＮＦの最初の５０個のア ミノ酸はＷＯ９３／０６１１６の図２２（配列番号８）に示されている。 天然に存在するＧＤＮＦはその生物学的活性形態ではジスルフィド結合型ダイ マーである。細菌系で発現後に単離された材料はほぼ生物学的に不活性であり、 モノマーとして存在する。生物学的に活性なジスルフィド結合型ダイマーを製造 するには再折りたたみが必要である。細菌系で発現されるＧＤＮＦの再折りたた み及び天然化はＷＯ９３／０６１１６に記載されている。ＧＤＮＦ活性の標準イ ンビトロ定量アッセイはＷＯ９３／０６１１６と、本願と同一名義の同時係属中 の１９９５年９月２８日付け米国特許出願第０８／５３５，６８１号に記載され ており、参考資料として本明細書の一部とする。 Ａ．ＧＤＮＦ変異体 本明細書で使用する「ＧＤＮＦ変異体」なる用語は、天然に存在するＧＤＮＦ のアミノ酸配列内の残基からアミノ酸を欠失（「欠失変異体」）、挿入（「付加 変異体」）又は置換（「置換変異体」）したポリペプチドを含む。このような変 異体はポリペプチドをコードするＤＮＡに適当なヌクレオチド変更を導入するか 又は所望のポリペプチドのインビトロ化学合成により製造される。最終分子がＧ ＤＮＦ生物活性をもつ限り、欠失、挿入及び置換の多数の組み合わせを実施でき ることが当業者に理解されよう。 １種以上の選択されたアミノ酸残基の置換、挿入又は欠失のための突然変異誘 発技術は当業者に周知である（例えばその開示内容を参考資料として本明細書の 一部とする米国特許第４，５１８，５８４号参照）。変異体の構築には、突然変 異部位の位置と突然変異の種類という２つの主要な変数がある。ＧＤＮＦ変異体 を設計する際には、突然変異部位及び突然変異の種類の選択は変更しようとする ＧＤＮＦ特性に依存する。突然変異部位は例えば（１）まず保存性アミノ酸選択 で置換してから達成しようとする結果に応じてよりラジカルな選択で置換するか 、 （２）標的アミノ酸残基を欠失させるか、又は（３）指定部位に隣接するアミノ 酸残基を挿入することにより個々に又は連続的に変えられる。１〜２０個のアミ ノ酸の保存性変更が好ましい。所望のＧＤＮＦタンパク質産物のアミノ酸配列が 決定されると、タンパク質の発現に使用する核酸配列は容易に決定される。Ｎ末 端及びＣ末端欠失変異体もタンパク分解酵素により製造できる。 ＧＤＮＦ欠失変異体では、欠失は一般に約１〜３０残基、より一般には約１〜 １０残基、典型的には約１〜５連続残基である。Ｎ末端、Ｃ末端及び内部配列内 欠失が予想される。他のＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーと相同性の低い 領域に欠失を導入してＧＤＮＦの活性を変更してもよい。他のＴＧＦ−βスーパ ーファミリー配列と実質的に相同な領域における欠失は、ＧＤＮＦ生物活性をよ り有意に変更させると思われる。連続欠失の数は患部領域におけるＧＤＮＦタン パク質産物の三次構造即ちシステイン架橋を維持するように選択される。欠失変 異体の非限定的な例としては、参考資料として本明細書の一部とする本願と同一 名義の同時係属中の１９９５年９月２８日付け米国特許出願第０８／５３５，６ ８１号に記載されているよ うに、ＧＤＮＦの１〜４０個のＮ末端アミノ酸を欠失する截頭ＧＤＮＦタンパク 質産物、ＧＤＮＦのＣ末端残基を欠失する変異体、又はその組み合わせが挙げら れる。 ＧＤＮＦ付加変異体では、アミノ酸配列付加は典型的には１個の残基から１０ ０個以上の残基を含むポリペプチドまでのＮ及び／又はＣ末端融合と、単一又は 多重アミノ酸残基の内部配列内付加を含む。内部付加は一般に約１〜１０残基、 より典型的には約１〜５残基、通常は約１〜３アミノ酸残基であり得る。Ｎ末端 付加変異体の例としては、［Ｍｅｔ^-1」ＧＤＮＦと呼ばれるＮ末端メチオニル残 基をもつＧＤＮＦ（細菌組換え細胞培養物におけるＧＤＮＦの直接発現アーチフ ァクト）と、組換え宿主細胞から成熟ＧＤＮＦの分泌を容易にするようにＧＤＮ ＦのＮ末端に異種Ｎ末端シグナル配列を融合したものが挙げられる。このような シグナル配列は一般に所期宿主細胞種から得られ、従ってこのような細胞種に相 同である。付加は更に、他の神経栄養因子の配列から誘導されるアミノ酸配列も 含む。本発明による使用に好ましいＧＤＮＦタンパク質産物は組換えヒト［Ｍｅ ｔ^-1］ＧＤＮＦである。 ＧＤＮＦ置換変異体はＧＤＮＦアミノ酸配列から少なくとも １個のアミノ酸残基を除去し、その場所に別の残基を挿入している。このような 置換変異体としては、種集団に天然に存在するヌクレオチド配列変更があり、ア ミノ酸変更を伴っても伴わなくてもよい対立遺伝子変異体が挙げられる。置換変 異体の例は、本願と同一名義の同時係属中の１９９５年９月２８日付け米国特許 出願第０８／５３５，６８１号（例えば配列番号５０参照）に開示されており、 参考資料として本明細書の一部とする。 ＧＤＮＦアミノ酸配列の特定突然変異は、グリコシル化部位（例えばセリン、 スレオニン又はアスパラギン）の修飾でもよい。グリコシル化又は単に部分的な グリコシル化の不在は、任意のアスパラギン結合型グリコシル化認識部位又はＯ 結合型炭水化物の付加により修飾された分子の任意の部位におけるアミノ酸置換 又は欠失により生じる。アスパラギン結合型グリコシル化認識部位は、適当な細 胞グリコシル化酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列を含む。これら のトリペプチド配列はＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ又はＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒであ り、ここでＸａａはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり得る。グリコシル化認識 部位の第１又は第３のアミノ酸位置の一方又 は両方における種々のアミノ酸置換又は欠失（及び／又は第２の位置のアミノ酸 欠失）は、修飾トリペプチド配列に非グリコシル化を生じる。こうして、適当な 改変ヌクレオチド配列の発現は、該当部位がグリコシル化されていない変異体を もたらす。あるいは、グリコシル化部位を付加するようにＧＤＮＦアミノ酸配列 を改変してもよい。 突然変異誘発のためのＧＤＮＦアミノ酸残基又は領域の同定方法の１例は、Ｃ ｕｎｎｉｎｇｈａｍとＷｅｌｌｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８ ５，１９８９）により記載されているような「アラニン走査突然変異誘発」と呼 ばれる方法である。この方法では、アミノ酸残基又は標的残基群を同定し（例え ばＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ等の帯電残基）、細胞内又は外部 の周囲水性環境とアミノ酸の相互作用に影響を与えるように中性又は負に帯電し たアミノ酸（より好ましくはアラニン又はポリアラニン）で置換する。次に、置 換部位の付加又は代替残基を導入することにより、置換に対して機能的感受性を 示す領域を確定する。こうしてアミノ酸配列変異を導入するための標的部位を決 定し、ＤＮＡ配列の対応する標的コドン又は領域でアラニン走査又はランダム突 然変異誘 発を行い、所望の活性と活性度の最適な組み合わせを求めて発現ＧＤＮＦ変異体 をスクリーニングする。 置換突然変異誘発に最も有利な部位としては、種々の種からのＧＤＮＦタンパ ク質に存在するアミノ酸の側鎖量、電荷及び／又は疎水性が実質的に異なる部位 が挙げられる。他の有用な部位は、種々の種から得られるＧＤＮＦ様タンパク質 の特定残基が同一である部位である。このような位置は一般にタンパク質の生物 活性に重要である。まず、これらの部位を比較的保存的な方法で置換する。この ような保存的な置換は表１の好適置換の欄に示す。このような置換が生物活性を 変化させる場合には、より実質的な変更（置換例）を導入するか、及び／又は他 の付加又は欠失を行い、得られた産物の活性をスクリーニングしてもよい。 アミノ酸配列の保存的改変（及びコーディング核酸配列の対応する改変）は、 天然ＧＤＮＦに似た機能的及び化学的特性をもつＧＤＮＦタンパク質産物を生じ ると予想される。他方、ＧＤＮＦタンパク質産物の機能的及び／又は化学的特性 の実質的変更は、（ａ）置換領域におけるポリペプチド主鎖の例えばシートもし くは螺旋コンホメーションとしての構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷も しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖のバルクを維持する効果に有意差のある置換を選 択することにより達成できる。天然に存在する残基は共通側鎖性質に基づいて下 記グループに分類される： １）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ； ２）中性疎水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ； ３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ； ４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ； ５）連鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び ６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。 非保存的置換はこれらの分類のメンバーの相互交換を含み得る。このような置 換残基は、他のＴＧＦ−βスーパーファミリ ータンパク質と相同のＧＤＮＦタンパク質の領域、又は分子の非相同領域に導入 され得る。 Ｂ．ＧＤＮＦ誘導体 ＧＤＮＦ又はＧＤＮＦ変異体の化学修飾誘導体は本明細書の開示に基づいて当 業者により製造できる。誘導体化に最適な化学部分としては水溶性ポリマーが挙 げられる。水溶性ポリマーは、これと結合したタンパク質が生理的環境等の水性 環境で沈殿しないという理由で望ましい。ポリマーは治療用製品又は組成物の製 造に医薬的に許容可能であることが好ましい。当業者は、ポリマー／タンパク質 結合体が治療用に使用されるのであるか、また、そうであるならば所望用量、循 環時間、タンパク分解に対する耐性等の要件に基づいて所望のポリマーを選択す ることができよう。誘導体化の有効性は、所望形態（即ち浸透圧ポンプ、又はよ り好ましくは注射もしくは注入、又は別の経口、肺もしくは他の送達経路用製剤 ）で誘導体を投与し、その有効性を調べることにより確認できる。 使用可能な水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール （ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキ シメチルセルロース、デキ ストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオ キソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリ マー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマー）、デキストラン又 はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリ コールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、 ポリオキシエチル化ポリオール類（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコー ル、及びそれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアル デヒドはその水中安定性により製造上有利であり得る。 ポリマーは任意の分子量のものでよく、枝分かれしていてもいなくてもよい。 ポリエチレングリコールの場合、好適分子量は取り扱い及び製造を容易にするた めに約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａである（「約」なる用語は、ポリエチレングリ コールの調製物が指定分子量よりも高分子量又は低分子量の分子も含むことを示 す）。所望の治療特性（例えば所望の持続放出期間、場合により生物活性に及ぼ す効果、取り扱い易さ、抗原性の程度又は欠失及び治療用タンパク質又は変異体 に及ぼすポリエチレングリコールの他の公知効果）に応じて他の分子量を使用し てもよい。 こうして結合されるポリマー分子の数は一定でなく、当業者は機能に及ぼす効 果を確認することができよう。モノ誘導体化してもよいし、同一又は異なる化学 部分（例えば種々の分子量のポリエチレングリコール等のポリマー）とジ、トリ 、テトラ等の誘導体化の組み合わせを提供してもよい。ポリマー分子とタンパク 質（又はペプチド）分子の割合は反応混合物中のそれらの濃度と同様に可変であ る。一般に、（過剰の未反応タンパク質又はポリマーが存在しないという反応効 率の点で）最適比は所望の誘導体化度（例えばモノ、ジ、トリ等）、選択したポ リマーの分子量、ポリマーが枝分かれしているか否か、及び反応条件等の因子に より決定されよう。 ポリエチレングリコール分子（又は他の化学種）はタンパク質の機能又は抗原 領域に及ぼす効果を考慮してタンパク質に結合すべきである。多数の結合方法が 当業者に利用可能である。例えばその開示内容を参考資料として本明細書の一部 とするＥＰ０４０１３８４（Ｇ−ＣＳＦへのＰＥＧの結合）や、Ｍａｌｉｋら， Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２０：１０２８−１０３５，１９９２（塩化トレシ ルを使用したＧＭ−ＣＳＦのペグ化 を報告）を参照されたい。例えば、遊離アミノ又はカルボキシル基等の反応基を 介してポリエチレングリコールをアミノ酸残基に共有結合できる。反応基とは、 活性化ポリエチレングリコール分子を結合できるような基である。遊離アミノ基 をもつアミノ酸残基としてはリシン残基とＮ末端アミノ酸残基が挙げられる。遊 離カルボキシル基をもつアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミ ン酸残基、及びＣ末端アミノ酸残基が挙げられる。ポリエチレングリコール分子 を結合するための反応基としてスルフヒドリル基を使用してもよい。治療目的に はＮ末端又はリシン基に結合するなどアミノ基に結合するのが好ましい。レセプ ター結合が所望される場合には、レセプター結合に不可欠な残基に結合すること は避けるべきである。 特にＮ末端化学修飾タンパク質が望ましい場合もある。本発明の組成物の例と してポリエチレングリコールを使用すると、種々のポリエチレングリコール分子 （分子量、枝分かれ等）から反応混合物中のポリエチレングリコール分子とタン パク質（又はペプチド）の割合、実施すべきペグ化反応の種類、及び選択された Ｎ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択することができる。Ｎ末端ペグ化調製 物を獲得（即ち必要に応じてこの 部分を他のモノペグ化部分から分離）する方法は、Ｎ末端ペグ化材料をペグ化タ ンパク質分子の集団から精製することにより実施できる。選択的Ｎ末端化学修飾 は、特定タンパク質で誘導体化に利用可能な種々の型の一次アミノ基（リシンと Ｎ末端）の反応性の差を利用する還元アルキル化により実施できる。適当な反応 条件下では、カルボニル基を含むポリマーでＮ末端のタンパク質の実質的に選択 的な誘導体化が達せられる。例えば、リシン残基のεアミノ基とタンパク質のＮ 末端残基のαアミノ基のｐＫａ差を利用できるようなｐＨで反応を実施すること により、タンパク質を選択的にＮ末端ペグ化することができる。このような選択 的誘導体化により、タンパク質への水溶性ポリマーの結合は制御され、ポリマー との結合は主にタンパク質のＮ末端で行われ、リシン側鎖アミノ基等の他の反応 基の有意修飾は生じない。還元アルキル化を使用する場合、水溶性ポリマーは上 記種類のものでよく、タンパク質との結合のために単一反応性アルデヒドをもつ べきである。単一反応性アルデヒドを含むポリエチレングリコールプロピオンア ルデヒドを使用することができる。 本発明は、少なくとも１個のポリエチレングリコール分子に 結合した原核発現ＧＤＮＦ又はその変異体である誘導体の使用と、アシル又はア ルキル結合を介して１個以上のポリエチレングリコール分子に結合したＧＤＮＦ 又はその変異体の使用を意図する。 ペグ化は当該技術分野で公知のペグ化反応の任意のものにより実施することが できる。例えば、Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ,３（２） ：４−１０,１９９２； その開示内容を参考資料として本明細書の一部とする ＥＰ０１５４３１６；及び本明細書に引用する他のペグ化に関する文献を参照さ れたい。ペグ化は反応性ポリエチレングリコール分子(又は類似の反応性水溶性 ポリマー)とのアシル化反応又はアルキル化反応を介して実施することができる 。 アシル化によるペグ化は、一般にポリエチレングリコールの活性エステル誘導 体をＧＤＮＦタンパク質又は変異体と反応させることからなる。任意の公知又は その後発見された反応性ＰＥＧ分子を使用してＧＤＮＦタンパク質又は変異体の ペグ化を実施することができる。好ましい活性化ＰＥＧは、Ｎ−ヒドロキシスク シンイミドにエステル化したＰＥＧである。本明細書で使用する「アシル化」な る用語は、非限定例として治療用タ ンパク質とＰＥＧ等の水溶性ポリマーの間のアミド、カルバメート、ウレタン等 の型の結合を含むものとする。Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，５：１ ３３−１４０，１９９４参照。反応条件はペグ化技術で公知の条件又はその後開 発された条件の任意のものから選択することができ、修飾しようとするＧＤＮＦ 又は変異体を不活化するような温度、溶媒及びｐＨ条件は避けるべきである。 アシル化によるペグ化は、一般にポリペグ化ＧＤＮＦタンパク質又は変異体を 生じる。結合はアミド結合が好ましい。得られる生成物は実質的に単独に（例え ば＞９５％）モノ、ジ又はトリペグ化されることが好ましい。しかし、使用する 特定反応条件に依存する量でもっと高いペグ化度の種が形成されることもある。 所望により、特に透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル 濾過クロマトグラフィー及び電気泳動等の標準精製技術により、より高純度のペ グ化種を混合物、特に未反応種から分離してもよい。 アルキル化によるペグ化は、一般にＰＥＧの末端アルデヒド誘導体を還元剤の 存在下でＧＤＮＦタンパク質又は変異体と反応させることからなる。アルキル化 によるペグ化もポリペグ化 ＧＤＮＦタンパク質又は変異体を生成することができる。更に、ＧＤＮＦタンパ ク質又は変異体（即ちモノペグ化タンパク質）のＮ末端の実質的にαアミノ基の みのペグ化を助長するように反応条件を操作することもできる。モノペグ化又は ポリペグ化のいずれの場合も、ＰＥＧ基は−ＣＨ₂−ＮＨ−基を介してタンパク 質に結合するのが好ましい。特に−ＣＨ₂−については、この型の結合を本明細 書では「アルキル」結合と呼ぶ。 還元アルキル化による誘導体化によりモノペグ化物を生成するには、誘導体化 に利用可能な種々の型の一次アミノ基（リシンとＮ末端）の反応性の差を利用す る。反応は、リシン残基のεアミノ基とタンパク質のＮ末端残基のαアミノ基の ｐＫａ差を利用できるようなｐＨで実施される。このような選択的誘導体化によ り、アルデヒド等の反応基を含む水溶性ポリマーとタンパク質の結合は制御され 、ポリマーとの結合は主にタンパク質のＮ末端で行われ、リシン側鎖アミノ基等 の他の反応基の有意修飾は生じない。主要な１態様では、本発明はモノポリマー ／ＧＤＮＦタンパク質（又は変異体）結合体分子の実質的に均一な調製物（即ち ポリマー分子が実質的に単一位置のみ（即ち＞９５％）に結合しているＧＤＮＦ タンパク質又は変異体）の 使用を意図する。より詳細には、ポリエチレングリコールを使用する場合には、 本発明は場合により抗原性結合基を欠失し且つＧＤＮＦタンパク質又は変異体に 直接結合したポリエチレングリコール分子をもつペグ化ＧＤＮＦタンパク質又は 変異体の使用も包含する。 従って、本発明により使用するＧＤＮＦタンパク質産物はＰＥＧ基がアシル又 はアルキル基を介して結合したペグ化ＧＤＮＦタンパク質又は変異体を含み得る と予想される。上述のように、このような産物はモノペグ化物でもポリペグ化物 （例えば２〜６、好ましくは２〜５個のＰＥＧ基を含む）でもよい。ＰＥＧ基は 一般にアミノ酸のα又はεアミノ基でタンパク質に結合しているが、タンパク質 に結合した任意のアミノ基であって、適当な反応条件下でＰＥＧ基に結合するよ うに十分反応性のアミノ基にＰＥＧ基を結合することも考えられる。 アシル化又はアルキル化アプローチの両者で使用されるポリマー分子は上記水 溶性ポリマーから選択することができる。選択されるポリマーは好ましくは本発 明の方法で実現されるように重合度を調節できるように、アシル化には活性エス テル、アルキル化にはアルデヒド等の単一反応基をもつように修飾すべ きである。反応性ＰＥＧアルデヒドの１例は水に安定性のポリエチレングリコー ルプロピオンアルデヒド、又はそのモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシもしくはアリー ルオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号参照）。ポリマーは枝 分かれしていてもいなくてもよい。アシル化反応では、選択されるポリマーは単 一反応性エステル基をもつべきである。本発明の還元アルキル化では、選択され るポリマーは単一反応性アルデヒド基をもつべきである。一般に、天然に存在す るグリコシル残基は通常哺乳動物組換え発現系により簡便に作成されるので、水 溶性ポリマーは天然グリコシル残基からは選択されない。ポリマーは任意の分子 量のものでよく、枝分かれしていてもいなくてもよい。 本発明で使用するのに特に好ましい水溶性ポリマーはポリエチレングリコール である。本明細書で使用するポリエチレングリコールとは、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０ ）アルコキシ又はアリールオキシポリエチレングリコール等の他のタンパク質を 誘導体化するために使用されている形態のＰＥＧの任意のものを意味する。 一般に、化学誘導体化は生物学的に活性な物質を活性化ポリ マー分子と反応させるために使用される任意の適切な条件下で実施することがで きる。ペグ化ＧＤＮＦタンパク質又は変異体の製造方法は一般に、（ａ）タンパ ク質が１個以上のＰＥＧ基と結合するような条件下でＧＤＮＦタンパク質又は変 異体をポリエチレングリコール（例えばＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド 誘導体）と反応させる段階と、（ｂ）反応生成物を得る段階を含む。一般に、ア シル化反応に最適な反応条件は公知パラメーターと所望の結果に基づいて個別に 決定される。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比が大きいほどポリペグ化物の百分 率は高い。 還元アルキル化によりモノポリマー／ＧＤＮＦタンパク質（又は変異体）結合 体分子の実質的に均一な集合を製造する方法は、一般に（ａ）ＧＤＮＦタンパク 質又は変異体のアミノ末端でαアミノ基の選択的修飾を可能にするのに適したｐ Ｈで還元アルキル化条件下でＧＤＮＦタンパク質又は変異体を反応性ＰＥＧ分子 と反応させる段階と、（ｂ）反応生成物を得る段階を含む。 モノポリマー／ＧＤＮＦタンパク質（又は変異体）結合体分子の実質的に均一 な集合では、還元アルキル化反応条件はＧＤ ＮＦタンパク質又は変異体のＮ末端に水溶性ポリマー部分を選択的に結合させる 条件である。このような反応条件は一般に、リシンアミノ基とＮ末端のαアミノ 基の間にｐＫａ差を提供する（ｐＫａはアミノ基の５０％がプロトン化され、５ ０％がプロトン化されないｐＨである）。ｐＨは使用するポリマーとタンパク質 の比にも影響を与える。一般に、ｐＨが低い場合には、タンパク質に対してより 過剰のポリマーが所望される（即ちＮ末端αアミノ基が低反応性であるほど最適 条件を達成するために多量のポリマーが必要になる）。ｐＨが高い場合には、ポ リマー：タンパク質比を高くする必要はない（即ち反応性の高い基を利用できる ので、少数のポリマー分子しか必要としない）。本発明の目的には、ｐＨは一般 に３〜９、好ましくは３〜６である。 別の重要な要件はポリマーの分子量である。一般に、ポリマーの分子量が高い ほど少数のポリマー分子をタンパク質に結合すればよい。同様に、これらのパラ メーターを最適化する際にはポリマーの枝分かれも考慮すべきである。一般に、 分子量が高いほど（又は枝分かれ度が高いほど）ポリマー：タンパク質比は高い 。一般に、本発明で意図するペグ化反応では、好まし い平均分子量は約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａである。好ましい平均分子量は約５ ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、特に好ましくは約１２ｋＤａ〜約２５ｋＤａである。水 溶性ポリマーとＧＤＮＦタンパク質又は変異体の比は１：１〜１００：１、好ま しくは（ポリペグ化では）１：１〜２０：１、（モノペグ化では）１：１〜５： １である。 上記条件を使用すると、還元アルキル化はアミノ末端にαアミノ基をもつ任意 のＧＤＮＦタンパク質又は変異体にポリマーを選択的に結合することができ、モ ノポリマー／ＧＤＮＦタンパク質（又は変異体）結合体の実質的に均一な調製物 を提供する。「モノポリマー／ＧＤＮＦタンパク質（又は変異体）結合体」なる 用語は、本明細書ではＧＤＮＦタンパク質又はＧＤＮＦ変異タンパク質の分子に 結合した単一ポリマー分子から構成される組成物を意味するために使用される。 モノポリマー／ＧＤＮＦタンパク質（又は変異体）結合体はリシンアミノ側基で なくＮ末端に配置されたポリマー分子をもつことが好ましい。調製物は好ましく は＞９０％モノポリマー／ＧＤＮＦタンパク質（又は変異体）結合体、より好ま しくは＞９５％モノポリマー／ＧＤＮＦタンパク質（又は変異体）結合体であり 、識別可 能な分子の残余は未反応である（即ちポリマー部分を欠くタンパク質）。 本発明の還元アルキル化では、還元剤は水溶液中で安定であるべきであり、還 元アルキル化の初期過程で形成されるシッフ塩基のみを還元できることが好まし い。好ましい還元剤はホウ水素化ナトリウム、シアノホウ水素化ナトリウム、ジ メチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン及びピリジンボランから選択する ことができる。特に好ましい還元剤はシアノホウ水素化ナトリウムである。溶媒 、反応時間、温度等の他の反応パラメーターと生成物の精製手段は、水溶性ポリ マーによるタンパク質の誘導体化に関する公開情報に基づいて個々に決定するこ とができる（本明細書中に引用した文献参照）。 Ｃ．ＧＤＮＦタンパク質産物医薬組成物 ＧＤＮＦタンパク質産物医薬組成物は典型的には、１種以上の医薬的及び生理 的に許容可能な配合剤との混合物として治療的に有効な利用のＧＤＮＦタンパク 質産物を含む。使用可能な配合剤の非限定的な例としては、酸化防止剤、防腐剤 、着色剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、懸濁剤、溶剤、充填剤、増量剤、緩衝液、 送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤及び／又は医薬アジュバ ントが挙げられる。例えば、使用可能なビヒクルとしては注射用水、生理的食塩 水又は人工外リンパが挙げられ、場合により非経口投与用組成物で慣用の他の材 料を補充してもよい。他のビヒクルの例としては中性緩衝塩水や血清アルブミン と混合した塩水もある。 ビヒクル中の一次溶媒は実際水性でも非水性でもよい。更に、ビヒクルは製剤 のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、無菌性、安定性、溶解速度又は臭いを変更 又は維持するために他の医薬的に許容可能な賦形剤も含有していてもよい。同様 に、ビヒクルはＧＤＮＦタンパク質産物の放出速度を変更もしくは維持するため 、又はＧＤＮＦタンパク質産物の鼓膜吸収もしくは浸透を助長するために更に他 の医薬的に許容可能な賦形剤を含有していてもよい。このような賦形剤は単回用 量又は複数回用量形態で中耳投与剤を調合するために通常慣習的に使用されてい る物質である。 一旦治療用組成物が調合されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、固体 又は脱水もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアルに保存することができる。こ のような製剤は即使用可能な形態で保存してもよいし、例えば投与前に再構成が 必要な凍 結乾燥形態で保存してもよい。 最適医薬製剤は、投与経路や所望用量等の要件に応じて当業者により決定され る。例えばその開示内容を参考資料として本明細書の一部とするＲｅｍｉｎｇｔ ｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１８版（１９９ ０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ.，Ｅａｓｔｏｎ,ＰＡ １８０４２ ）１４３５〜１７１２頁参照。このような製剤は本発明のＧＤＮＦタンパク質、 変異体及び誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出速度及びインビボクリア ランス速度に影響を与え得る。 中耳遅延放出製剤、吸入ミスト、又は経口活性製剤等の他の有効な投与形態も 考えられる。例えば、徐放製剤ではＧＤＮＦタンパク質産物を（ポリ乳酸、ポリ グリコール酸等の）ポリマー化合物の粒状調製物又はリポソームに結合又は組み 込んでもよい。ヒアルロン酸も使用でき、これは循環における持続期間を助長す る効果をもち得る。ＧＤＮＦタンパク質産物医薬組成物は、例えば鼓膜注入又は 注射により中耳投与用に調合してもよいし、遅延放出又は持続循環製剤でもよい 。このような中耳投与治療組成物は典型的には医薬的に許容可能なビヒクル中に ＧＤＮＦタンパク質産物を含み、発熱物質を含まない中耳に許容可能な水溶液の 形態である。ビヒクルの好適例は滅菌蒸留水である。 ＧＤＮＦタンパク質産物を含む製剤の所定のものは経口投与用に調合すること も考えられる。このように投与するＧＤＮＦタンパク質産物はカプセル封入して もよいし、固体剤形の調合で慣習的に使用されているキャリヤーの存在下又は不 在下で調合してもよい。カプセルは胃腸管内で生体内利用性が最大になり且つ全 身前の分解が最初になるような時点で製剤の活性部分を放出するように設計する ことができる。ＧＤＮＦタンパク質産物を吸収し易くするために他の賦形剤も配 合してもよい。希釈剤、芳香剤、低融点ろう、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩 壊剤及び結合剤も使用してもよい。 中耳溶液、懸濁液及び軟膏を含む局所耳製剤の調合は当業者に周知である（Ｒ ｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１ ８版，８６章、１５８１〜１５９２頁，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ ｍｐａｎｙ，１９９０参照。）。中耳への注射を含む他の投与方法も利用可能で あり、このような投与方法に適した中耳製剤の製造方 法及び手段も周知である。 本明細書で使用する「中耳」とは、鼓膜と内耳の間のスペースを意味する。こ の位置は全内耳組織の外側にあり、ＧＤＮＦが鼓膜に浸透するように製剤を製造 する場合にはこの領域にアクセスするために侵襲操作は不要である。そうでない 場合には、鼓膜に注射して材料を中耳に導入するか、又は反復投与が必要な場合 には鼓膜に穴をあける。このような系の例としては、これらの領域に治療物質を 送達するために使用可能なインサートや、「局所」投与滴剤、ゲル又は軟膏が挙 げられる。鼓膜開口は中耳の感染等の場合（通常は小児）に外来で非常に頻繁に 利用される方法である。穴は数日後に自然に閉じる。 内耳疾患又は損傷の治療用ＧＤＮＦタンパク質産物の本発明の使用では、局所 投与製剤が中耳及び内耳への治療物質の浸透及び輸送を助長する物質を含むよう にしても有利である。このような物質は当該技術分野で公知である。例えば、Ｋ ｅらの米国特許第５，２２１，６９６号は、眼科製剤の角膜浸透を強化するため の物質の使用を開示している。 内耳系は蝸牛及び前庭器等の内耳の組織層の内部、その間又はその周囲の任意 の組織区画で使用するのに適した系である。 これらの場所は血管条、ライスネル膜、コルチ器、螺旋靭帯及び蝸牛ニューロン 等の蝸牛の種々の構造を含む。タンパク質は正円窓の膜を通って内耳の外リンパ に浸透することが示されているので、これらの構造にアクセスするには侵襲操作 は不要である。正円窓膜浸透によりＧＤＮＦを内耳に導入するのに特に適したビ ヒクルは人工外リンパである。この溶液は２８０〜３００ｍＯｓｍでｐＨ７．２ の脱イオン水中のダルベッコのリン酸緩衝塩水の１．０％溶液中１０．００ｍＭ Ｄ−グルコース、１．５ｍＭ ＣａＣｌ₂、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂から構成さ れる。更に、中耳注射用マイクロスフェア又はリポソーム等の物質とＧＤＮＦタ ンパク質産物の製剤とし、タンパク質を遅延又は持続放出し、デポー注射剤とし て送達できるようにしてもよい。ＧＤＮＦタンパク質産物の他の使用可能な内耳 導入手段としては、ＧＤＮＦタンパク質産物を含む移植可能な薬剤送達デバイス や、ＧＤＮＦを内耳に連続的に送達できるように貫通トンネルをもつ蝸牛インプ ラントが挙げられる。 本発明の耳治療用製剤、特に局所製剤は当業者に周知のような他の成分、例え ば中耳に許容可能な防腐剤、張度強化剤、補助溶剤、錯生成剤、緩衝剤、抗微生 物剤、酸化防止剤及び界面 活性剤も含み得る。例えば、使用可能な張度強化剤としてアルカリ金属ハロゲン 化物（好ましくは塩化ナトリウム及び塩化カリウム）、マンニトール、ソルビト ール等が挙げられる。耳に注入しようとする製剤が内リンパ及び外リンパの浸透 圧に適合できるように十分な張度強化剤を添加すると有利である。使用可能な防 腐剤の非限定的な例としては、塩化ベンズアルコニウム、チメロサール、フェネ チルアルコール、メチルパラベン、プロピルバラベン、クロルヘキシジン、ソル ビン酸等が挙げられる。過酸化水素も防腐剤として使用できる。使用可能な補助 溶剤の非限定的な例としては、グリセリン、プロピレングリコール及びポリエチ レングリコールが挙げられる。使用可能な錯生成剤としてはカフェイン、ポリビ ニルピロリドン、β−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−β−シクロ デキストリンが挙げられる。緩衝液は硼酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、重炭酸塩 又はＴｒｉｓ−ＨＣｌ等の慣用緩衝液であり得る。 製剤成分は中耳又は内耳投与部位に許容可能な濃度で存在する。例えば、組成 物を生理的ｐＨ又はそれよりも僅かに低いｐＨ、典型的には約５〜約８のｐＨ範 囲内に維持するように緩衝液を使用する。 付加的な製剤成分としては、局所接触を最大にして正円窓膜への吸収を助長す るように中耳投与治療物質の滞留時間を延長する物質が挙げられる。使用可能な 物質としては、中耳製剤の粘度を増加するポリマー又はゲル形成材料が挙げられ る。本発明の製剤が内耳治療剤の制御放出（例えば持続及び延長送達）に適して いるか否かは当該技術分野で公知の種々の方法により決定できる。更に別の耳製 剤は錠剤製造に適した中耳治療に許容可能な非毒性賦形剤との混合物として有効 量のＧＤＮＦタンパク質産物を含むものでもよい。錠剤を滅菌水、又は他の適当 なビヒクルに溶かすことにより、中耳治療用溶液を単位剤形で製造できる。使用 可能な賦形剤の非限定的な例としては、不活性希釈剤（例えば炭酸カルシウム、 炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ラクトース又はリン酸カルシウム）又は結 合剤（例えば澱粉、ゼラチン又はアラビアゴム）が挙げられる。ＧＤＮＦタンパク質産物の投与／送達 ＧＤＮＦタンパク質産物は皮下、筋肉内、静脈内、経肺、経皮、鞘内又は大脳 内経路で非経口投与することができる。内耳症状の治療には、局所塗布、インサ ート、注射、インプラント、細胞治療又は遺伝子治療によりＧＤＮＦタンパク質 産物を中耳 に（又は特に予め侵襲操作が適正に行われている場合には内耳に直接）投与する ことができる。例えば、生分解性ポリマーマトリックスに封入された神経栄養因 子を含む遅延放出インプラントはＧＤＮＦタンパク質産物を送達できる。ＧＤＮ Ｆタンパク質産物は血液脳関門を通過するように化学修飾又はパッケージングさ れた形態で大脳外に投与してもよいし、ＧＤＮＦタンパク質産物の関門浸透を助 長することが可能な１種以上の物質と併用投与してもよい。同様に、ＧＤＮＦタ ンパク質産物は中耳又は内耳に投与してもよいし、ＧＤＮＦタンパク質産物の鼓 膜浸透又は輸送を助長することが可能な１種以上の物質と共に鼓膜の頂部に投与 してもよい。投与頻度は調合するＧＤＮＦタンパク質産物の薬物動態パラメータ ーと投与経路に依存する。 特定用量は体重、体表面積又は器官寸法を考慮して計算することができる。上 記製剤の各々を利用する治療に適した用量を決定するために必要な詳しい計算は 当業者により日常的に実施され、特に本明細書に開示する用量情報及びアッセイ を参考にすれば、日常的に実施される作業の範囲内である。適当な用量は適当な 用量応答データと組み合わせて用量を決定する確立アッセイを使用することによ り確認できる。内耳投与製剤で使用 される用量は全身注射又は経口投与で使用する用量に比較して非常に少量である ことが当業者に理解されよう。 上記症状の治療方法に必要な最終投与計画は、薬剤の作用を変える種々の因子 、例えば患者の年齢、症状、体重、性別及び食事、感染重篤度、投与時間並びに 他の臨床因子を考慮して主治医により決定される。試験を実施するにつれて種々 の疾患及び症状の治療に適した用量レベルについて更に情報が得られよう。 所与の治療にはＧＤＮＦの連続投与又は持続送達が有利であると予想される。 連続投与は注入ポンプ等の機械的手段により実施してもよいが、他の連続又はほ ぼ連続投与方法も実施できると考えられる。例えば、化学的誘導体化又はカプセ ル封入のにより、決定された投与計画に基づいて予想可能な量で連続存在の効果 をもつ持続投与形態のタンパク質が得られる。従って、ＧＤＮＦタンパク質産物 はこのような連続投与を実施するように誘導体化又は他の方法で調合されたタン パク質を含む。 ＧＤＮＦタンパク質産物細胞治療、例えばＧＤＮＦタンパク質産物を産生する 細胞の中耳又は内耳移植も考えられる。この態様では、生物学的に活性な形態の ＧＤＮＦタンパク質産物を 合成及び分泌することが可能な細胞を患者に移植する。このようなＧＤＮＦタン パク質産物産生細胞は、ＧＤＮＦタンパク質産物の天然産生細胞（Ｂ４９膠芽腫 細胞に類似）でもよいし、所望のＧＤＮＦタンパク質産物の発現及び分泌を助長 するのに適したベクターで該所望のＧＤＮＦタンパク質産物をコードする遺伝子 で形質転換することによりＧＤＮＦタンパク質産物産生能を増加させた組換え細 胞でもよい。外来種のＧＤＮＦタンパク質産物の投与患者における潜在的免疫反 応を最小にするためには、ＧＤＮＦタンパク質産物を産生する天然細胞はヒト起 源であり、ヒトＧＤＮＦタンパク質産物を産生することが好ましい。同様に、Ｇ ＤＮＦタンパク質産物を産生する組換え細胞はヒトＧＤＮＦタンパク質産物をコ ードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換することが好ましい。周囲組織の 浸潤を避けるために移植細胞をカプセル封入してもよい。ＧＤＮＦタンパク質産 物の放出を可能にし且つ患者の免疫系又は周囲組織からの他の有害因子による細 胞の破壊を阻止する生体適合性の半透ポリマーエンクロージャー又は膜にヒト又 は非ヒト動物細胞を入れて患者に移植してもよい。例えばこのようなインプラン トを中耳の正円窓膜に付着し、ＧＤＮＦタンパク質産物を外リ ンパに直接産生及び放出させてもよい。 ＧＤＮＦタンパク質産物を産生するように患者自身の細胞をエクスビボ形質転 換し、カプセル封入せずに直接移植することも考えられる。例えば、コルチ器を 支持する細胞を取り出し、細胞を培養して適当なベクターで形質転換させ、患者 の内耳に再移植し、所望のＧＤＮＦタンパク質又はＧＤＮＦタンパク質変異体を 産生及び放出させてもよい。 核酸構築物又は他の適当な送達ベクターの局所注射によりＧＤＮＦタンパク質 産物をコードする遺伝子を標的内耳細胞に導入するインビボＧＤＮＦタンパク質 産物遺伝子治療も考えられる（Ｈｅｆｔｉ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，２５： １４１８−１４３５，１９９４）。例えば、ＧＤＮＦタンパク質産物をコードす る核酸配列をアデノ随伴ウイルスベクター又はアデノウイルスベクターに入れて 内耳細胞に送達してもよい。その他のウイルスベクターの非限定例としては、レ トロウイルス、単純ヘルペスウイルス及びパピローマウイルスベクターが挙げら れる。リポソームによる導入、直接注射（裸のＤＮＡ）、レセプターによる導入 （リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿 又は微粒子ボンバードメン ト（遺伝子銃）により適宜インビボ又はエクスビボで物理的導入を実施すること もできる。 生きた細胞の膜カプセル封入方法は当業者に周知であり、カプセル封入細胞の 製造と患者へのその移植は過度の実験なしに実施することができる。例えば各々 特に参考資料として本明細書の一部とする米国特許第４，８９２，５３８号、５ ，０１１，４７２号及び５，１０６，６２７号参照。生きた細胞をカプセル封入 するためのシステムは、特に参考資料として本明細書の一部とするＡｅｂｉｓｃ ｈｅｒらのＰＣＴ出願第ＷＯ９１／１０４２５号に記載されている。各々特に参 考資料として本明細書の一部とするＡｅｂｉｓｃｈｅｒらのＰＣＴ出願第ＷＯ９ １／１０４７０号； Ｗｉｎｎら，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１１３：３２ ２−３２９，１９９１； Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ． ，１１１：２６９−２７５，１９９１； Ｔｒｅｓｃｏら，ＡＳＡＩＯ，３８： １７−２３，１９９２も参照されたい。リポソームキャリヤー、生体腐食性粒子 又はビーズ及びデポー注射剤等の種々の他の持続又は制御送達手段の製造方法も 当業者に周知である。 本明細書に記載するＧＤＮＦタンパク質産物製剤はヒトと共 に獣医学にも使用することができ、「患者」なる用語は制限的に解釈されるべき でないことに留意すべきである。獣医学用途の場合には、用量範囲は上記と同一 にすべきである。 本発明の他の態様及び利点は以下の実施例を考察することにより理解されよう 。実施例１はＧＤＮＦタンパク質産物投与が蝸牛外植片培養系で毛細胞に及ぼす 効果に関する。実施例２は蝸牛から生成した解離細胞培養物においてＧＤＮＦタ ンパク質産物投与が螺旋神経節ニューロンに及ぼす効果に関する。コルチ器外植 片培養試験及び成体ラット螺旋神経節ニューロン培養試験の結果、従来はＧＤＮ Ｆ応答性であることがわかっていなかった聴覚ニューロン及びコルチ器の毛細胞 でＧＤＮＦタンパク質産物は聴器毒素に対する神経栄養及び防御活性をもつこと が判明した。 実施例 実施例１ ＧＤＮＦタンパク質産物は蝸牛毛細胞を聴器毒素から防御する材料 本実施例で使用した材料は次のように獲得した。コルチ器解離溶液 １．５ｇ／Ｌ Ｄ−グルコース（デキストロース、Ｃａｔ．＃１５０２３−０ ２１，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含有するダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢ Ｓ；１ｘ、塩化カルシウムと塩化マグネシウムを含有せず。Ｃａｔ．＃１４１９ ０−１３６，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）。コルチ器外植片培養培地 １．グルコース濃度の高いダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ；１Ｘ、Ｌ −グルタミンを含有し、ピルビン酸ナトリウムを含有せず。Ｃａｔ．＃１１９６ ５−０８４，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）。 ２．０．１５ｇ／１００ｍｌ Ｄ−グルコース（デキストロース、Ｃａｔ．＃ １５０２３−０２１，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）。 ３．１％ Ｎ−２補充剤（１００Ｘ，Ｃａｔ．＃１７５０２−０３０，Ｇｉｂ ｃｏ ＢＲＬ）。 ４．１００単位／ｍｌ ペニシリンＧ、カリウム（ペニシリン； Ｃａｔ．＃ ２１８４０−０２０，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）。方法 培地の調製 ＤＭＥＭに１％ Ｎ−２補充剤を補充し、Ｄ−グルコースを最終濃度１．５ｇ ／Ｌまで加えた。１００単位／ｍｌのペニシリンを加えた。混合後、培地を濾過 し、４℃に維持した。培地は実験間の変動を最小にするために使用直前に新たに 調製した。タンパク質吸着を最小にするために一貫してプラスチックピペット及 び容器を使用した。ＧＤＮＦタンパク質産物溶液 ５％ウシ血清アルブミンを含有するＤ−ＰＢＳ（蒸留水で調製したリン酸緩衝 塩水溶液）中１ｍｇ／ｍｌ溶液として精製ヒト組換えＧＤＮＦタンパク質産物を 調製した。溶液を−８５℃でアリコートとして保存した。９６穴マイクロプレー トで連続希釈液（正規培地中０．１、１、１０、２５及び５０ｎｇ／ｍｌ）を調 製した。聴器毒素を含むか含まない（対照）コルチ器外植片培養培地（９０μｌ ）に１０倍濃縮ＧＤＮＦタンパク質産物溶液１０μｌを加えた。対照培地には正 規培地（１０μｌ）を加えた。プレーティング日にＧＤＮＦタンパク質産物処理 を開始した。２日目に、聴器毒素を単独で含有するか、ＧＤＮＦ と併有するか又はどちらも含まない（対照）培地に培地を交換した。解剖器具及び培養皿 １．４”及び５”解剖鉗子と４”解剖鋏はＲｏｂｏｚ Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｗ ａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣから入手した。 ２．Ｆａｌｃｏｎ滅菌９６穴マイクロプレート（平底、Ｃａｔ．＃３０７２） 、組織培養プラスチック容器及びポリプロピレン遠心管はＢｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉ ｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙから入手し た。聴器毒素及び関連試薬 １．ネオマイシン溶液（Ｃａｔ．＃Ｎ１１４２，Ｓｉｇｍａ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉ ｓ，ＭＯ）を最終濃度０．６ｍＭで使用した（培地１４１０μｌに１ｍｇ／ｍｌ ネオマイシン９０μｌを加えることにより各実験毎に新鮮な溶液を調製した）。 ２．シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ−ＡＱ．Ｃａｔ．＃ＮＤＣ ００１５− ３２２０−２２，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）。３５μｇ／ｍｌの 最終濃度で使用した（培地１４４７．５μｌに１ｍｇ／ｍｌシスプラチ ン５２．５μｌを加えることにより各実験毎に新鮮な溶液を調製した）。 ３．Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノ ール、Ｃａｔ．＃Ｘ−１００，Ｓｉｇｍａ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｅｓ，ＭＯ）。 ４．ファロイジン（ＦＩＴＣ標識。Ｃａｔ．＃Ｐ−５２８２，Ｓｉｇｍａ．Ｓ ｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。 ５．Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（検鏡溶媒，Ｃａｔ．＃Ｈ−１０００，Ｖｅｃｔ ｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）。ラットコルチ器外植片の調製 Ｐ３−Ｐ４Ｗｉｓｔａｒラットからコルチ器外植片を得た。ラットを断頭し、 下顎を切り開き、皮膚を取り出した。解離溶液で側頭骨を集め、迷路骨包を露出 させ、側頭骨から軟骨性蝸牛包を注意深く分離した。解離溶液を入れた別のペト リ皿に分離した蝸牛を移し、更に解離した。細鉗子を使用して中枢ＶＩＩＩ神経 組織を取り出すことにより無傷のコルチ器を得た後、頂部又は底部から出発して 血管条膜を注意深く剥離した。次に、グルコースを補充した冷ＰＢＳを入れた直 径３５ｍｍペトリ皿にコルチ器を移し、培養の準備を整えた。コルチ器外植片培養手順 コルチ外植片を９６穴無被覆マイクロプレートで培養した。ウェルにコルチ器 を１個ずつ入れ、培地中に浮遊するように維持した。外植片を正規培地に２４時 間（９０μｌ／ウェル）維持した。「処理」培養物にはＧＤＮＦタンパク質溶液 （１０μｌ）を加え、対照には培地１０μｌを加えた。２４時間インキュベーシ ョン後に培地を交換し、ＧＤＮＦタンパク質溶液（１０μｌ）を含むか又は含ま ない（対照）聴器毒素含有培地（９０μｌ）に暴露した。培養物を更に３日間イ ンキュベートした。次に外植片を０．１Ｍ Ｄ−ＰＢＳ中４％パラホルムアルデ ヒドで室温で３０分間固定し、免疫染色処理した。毛細胞のＦＩＴＣ−ファロイジン染色 コルチ器内の毛細胞を確認及び計数するために、直接免疫染色法を使用して毛 細胞の不動毛束に天然に存在するアクチンを標識した。外植片をＤ−ＰＢＳ（各 ウェル２００μｌ）で３回洗浄し、Ｄ−ＰＢＳ中１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ を室温で１５分間浸透させた。Ｄ−ＰＢＳで３回洗浄後、外植片をＦＩＴＣ標識 ファロイジン（ストックからの１：６０、５０μｌ／ウェル）と共に室温で４５ 分間インキュベートした。ファロイ ジンは感光性なので、プレートにアルミニウム箔を被せた。Ｄ−ＰＢＳで更に３ 回洗浄後、標識した外植片を顕微鏡スライド上のグリセロール滴内に置き、ガラ スカバースリップを被せてマニキュア液で密封した。ＦＩＴＣフィルター及び蛍 光レンズを用いてＮｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ−３００倒立蛍光顕微鏡で外植片 を観察した。毛細胞数の測定 各実験点毎に２〜４個の蝸牛を使用した。各蝸牛で各々長さ１７５μｍの２〜 ３セクションにおける毛細胞の数を計数した。蝸牛の中央螺旋のセクションのみ を分析した。各実験を数回繰り返した。各点４０個の蝸牛を分析することにより 、対照及びシスプラチン又はネオマイシンで処理した培養物中の毛細胞の数を調 べた。結果 浮遊外植片培養物中の毛細胞は４日間の実験期間中に死滅しなかった。従って 、聴器毒素及び処理の不在下で４日間の実験期間の終わりに存在するファロイジ ン染色細胞の数は１０５．４±６．９（ｎ＝２８）であった。プレーティング後 ２日目に外植片に聴器毒素を加えると、４日後にインビトロで検出され る毛細胞の数は有意に減少した。プレーティングから２４時間後に３５μｇ／ｍ ｌシスプラチンに暴露すると、毛細胞の約８０％が失われ、毛細胞の初期数の２ １．２％±６．０（ｎ＝４０）しか生存せず（表２）、０．８ｍＭネオマイシン に暴露後は、毛細胞の７．４％±４．７（ｎ＝４３）しか生存しなかった（表２ ）。 （表２の脚注） ＧＤＮＦはプレーティング日又はプレーティングから２４時間後に外植片培養物 に加えた。シスプラチン（３５μｇ／ｍｌ）はプレーティングから２４時間後に 加え、培養物を更に３日間インキュベートした。毛細胞はＦＩＴＣ−ファロイジ ンで染色した。各々１７５μｍの２〜３セクションで蝸牛の中央螺旋における毛 細胞の数を計数した。４日後に未処理培養物にインビトロで存在する毛細胞の百 分率として結果を表す（１０５．４±６．９； ｎ＝２８）。各数はｎ個の蝸牛 の平均±ＳＤである。 ＊シスプラチン単独との有意差ｐ＜０．０５（ｔ試験）。 ＮＤ：測定せず。 この２種の処理間にはコルチ器の形態に顕著な差があり、ネオマイシンで処理 すると毛細胞はほぼ完全に失われたが、処理しないものは典型的な４列構造（外 側毛細胞３列と内側毛細胞１列）のままであった。他方、シスプラチンで処理す ると４列構造は著しく乱れ、生存細胞はランダムな配置になった。 プレーティング時にＧＤＮＦを加えた培養物（前処理）では、３日間聴器毒素 暴露（２〜４日目）しても有意数の毛細胞が生 存した。シスプラチンに暴露した培養物では、０．０５ｎｇ／ｍｌといった低濃 度のＧＤＮＦで処理しても生存毛細胞は２１％（未処理培養物）から３５％に増 加した。０．１ｎｇ／ｍｌ ＧＤＮＦで最大防御活性に達した（４１％生存）（ 表３）。ネオマイシンに暴露した培養物では、０．１ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦで毛 細胞の数は７％から２２％に増加し、１０ｎｇ／ｍｌＧＤＮＦで最大ＧＤＮＦ活 性（３７％生存）が観察された（表３）。ＧＤＮＦ処理はネオマイシン処理培養 物では４列形態を維持したが、シスプラチンによるその破壊を阻止することはで きなかった。 ＧＤＮＦが聴器毒素から毛細胞を防御する能力を更に試験するために、プレー ティングから２４時間後に培養物を毒素に暴露すると同時にＧＤＮＦを添加する １組の実験を実施した（同時処理）。その結果、この実験パラダイムではＧＤＮ Ｆは毒素暴露前と同一程度まで毛細胞を防御できることが判明した（表２及び３ ）。 （表３の脚注） ＧＤＮＦはプレーティング日（前処理）又はプレーティングから２４時間後（同 時処理）に外植片培養物に加えた。ネオマイシン（０．８Ｍ）はプレーティング から２４時間後に加え、培養物を更に３日間インキュベートした。毛細胞はＦＩ ＴＣ−ファロイジンで染色した。各々１７５μｍの２〜３セクションで蝸牛の中 央螺旋における毛細胞の数を計数した。４日後に未処理培養物にインビトロで存 在する毛細胞の百分率として結果を表す（１０５．４±６．９； ｎ＝２８）。 各数はｎ個の蝸牛 の平均±ＳＤである。 ＊ネオマイシン単独との有意差ｐ＜０．０５（ｔ試験）。 ＮＤ：測定せず。 実施例２ ＧＤＮＦタンパク質産物は内耳聴覚ニューロン（螺旋神経節ニューロン）の生存 を助長し、聴器毒素から防御する材料 本実施例で使用した材料は次のようにして得た。細胞培地 グルコース濃度の高いダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ；＃１１９６５ −０９２）、ハムＦ１２培地（Ｆ１２；＃１１７６５−０２１）、Ｂ２７培地補 充剤（＃１７５０４−０１０）、ペニシリン／ストレプトマイシン（＃１５０７ ０−０１４）、Ｌ−グルタミン（＃２５０３０−０１６）、ダルベッコのリン酸 緩衝塩水溶液（Ｄ−ＰＢＳ；＃１４１９０−０５２）、マウスラミニン（＃２３ ０１７−０１５）、ウシ血清アルブミン及びフラクションＶ（＃１１０−１８− ０１７）は全てＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから入手 した。熱不活化ウマ血清はＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａ ｈから入手した。臭化水素酸ポリ−Ｌ−オルニチン（Ｐ−３６５５）、ウシイン シュリン（Ｉ−５５００）、ヒトトランスフェリン（Ｔ−２２５２）、プトレシ ン（Ｐ−６０２４）、プロゲステロン（Ｐ−６１４９）及び亜セレン酸ナトリウ ム（Ｓ−９１３３）は全てＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓ ａｉｎｔ−Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手した。パパイン、デオキシリボヌクレアー ゼＩ（ＤＮアーゼ）及びオボアルブミン（パパイン解離系）はＷｏｒｔｈｉｎｇ ｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪから入手した。Ｆ ａｌｃｏｎ滅菌９６穴マイクロプレート（＃３０７２）、組織培養プラスチック 容器及びポリプロピレン遠心管はＢｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｏｘｎ ａｒｄ，ＣＡから入手した。Ｎｉｔｅｘ ２０μｍナイロンメッシュ（＃４６０ ）はＴｅｔｋｏ，Ｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＮＹから入手した。４”解剖鉗子及び４” 解剖鋏はＲｏｂｏｚ Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣから入手 した。抗体及び関連試薬 ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）ウサギポリクローナル抗体はＣｈｅｍ ｉｃｏｎ（＃ＡＢ９５１）から入手し、ビオ チン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（＃ＢＡ−１０００）とペルオキシダーゼ結合アビジ ン／ビオチン複合体（ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ；キットＰＫ−６１００）はＶｅｃｔ ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡから入手した。 ３’，３’−ジアミノベンジジンはＣａｐｐｅｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡから入手した。ＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｂｌｏｃ ｋブロッキング緩衝液（＃３７５１５）はＰｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉ Ｌから入手した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｘ１００）、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ −４０（Ｎ６５０７）及び過酸化水素（３０％ｖ／ｖ；Ｈ１００９）はＳｉｇｍ ａから入手した。特に指定しない限り、他の全試薬はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ−Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。聴器毒素 シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ−ＡＱ，＃ＮＤＣ ００１５−３２２０−２ ２）はＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ から入手し、サリチル酸ナトリウムはＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂ ｕｒｇ，ＮＪ（＃３８７２−０１）から入手し、ネオマイシンはＳｉｇ ｍａ（＃Ｎ１１４２）から入手した。方法 培地の調製 ＤＭＥＭとＦ１２培地の１：１混合物として基礎培地を調製し、Ｂ２７培地補 充剤を５０倍濃縮ストック溶液として補充した。Ｂ２７培地補充剤はビオチン、 Ｌ−カルニチン、コルチコステロン、エタノールアミン、Ｄ（＋）−ガラクトー ス、還元型グルタチオン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシ ン、酢酸レチニル、セレン、Ｔ３（トリヨード−１−チロニン、ＤＬ−α−トコ フェロール；ビタミンＥ）、ＤＬ−α−酢酸トコフェロール、ウシ血清アルブミ ン、カタラーゼ、インシュリン、スーパーオキシドジスムターゼ及びトランスフ ェリンから構成される。約２ｍＭの最終濃度のＬ−グルタミン、約１００ＩＵ／ ｌのペニシリン及び約１００ｍｇ／ｌのストレプトマイシンを加えた。熱不活化 ウマ血清を最終濃度約２.５％まで加え、Ｄ−グルコースを最終濃度約５ｇ／ｌ まで加え、ＨＥＰＥＳ緩衝剤を最終濃度約２０ｍＭまで加え、ウシインシュリン を最終濃度約２．５ｍｇ／ｍｌまで加え、ヒトトランスフェリンを最終濃度約０ ．１ｍｇ／ｍｌまで加えた。混合後、ｐ Ｈを約７．３に調整し、培地を４℃に維持した。培地は実験間の変動を最小にす るために使用直前に新たに調製した。タンパク質吸着を最小にするために一貫し てプラスチックピペット及び容器を使用した。ＧＤＮＦタンパク質産物溶液 ５％ウシ血清アルブミンを含有するＤ−ＰＢＳ（蒸留水で調製したリン酸緩衝 塩水溶液）中１ｍｇ／ｍｌ溶液として精製ヒト組換えＧＤＮＦタンパク質産物を 調製した。溶液を−８５℃でアリコートとして保存した。９６穴マイクロプレー トで連続希釈液を調製した。培養物を含む培地（９０μｌ）に１０倍濃縮ＧＤＮ Ｆタンパク質産物溶液１０μｌを加えた。対照培地には５％アルブミンを含むＤ −ＰＢＳ（１０μｌ）を加えた。細胞を接種してから１時間後又は２４時間後に 培養物にＧＤＮＦタンパク質産物を単独又は聴器毒素と共に加えた。聴器毒素調製物 １０μｌ／ウェルのネオマイシンをストック溶液（約１０^-3Ｍ）に直接加え、 最終濃度約１０^-4Ｍとした。シスプラチンをストック溶液（１ｍｇ／ｍｌ）から の培地で２０μｇ／ｍｌ溶液になるまで希釈し、各ウェル１０μｌの割合で加え 、最終濃 度２μｇ／ｍｌとした。サリチル酸ナトリウムを粉末からＰＢＳ中１Ｍストック 溶液に調製し、培地で更に１００ｍＭまで希釈し、最終濃度１０ｍＭとして培地 に１０μｌ／ウェルを加えた。培養基質 螺旋神経節細胞の最適な基質結合と神経突起生長を助長するために、下記手順 に従ってポリ−Ｌ−オルニチン、次いでラミニンで順次被覆することによりマイ クロタイタープレート表面（培養基質）を修飾した。０．１Ｍ硼酸（ｐＨ８．４ ）中０．１ｍｇ／ｍｌ滅菌ポリオルニチン溶液で少なくとも１時間室温でプレー ト表面を完全に覆った後、Ｓｕｐｅｒ−Ｑ水で滅菌洗浄した。次に水洗物を吸引 し、ＰＢＳ中マウスラミニンの１０μｇ／ｍｌ溶液を加え、３７℃で２時間イン キュベートした。これらの手順は結果の再現性を確保するためにプレートの使用 直前に実施した。ラット螺旋神経節細胞培養物の調製 ３〜４週齢Ｗｉｓｔａｒラット（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅから入手）に３：３：１の割合のケタミン （１００ｍｇ／ｍｌ）、キ シラジン(２０ｍｇ／ｍｌ)及びマレイン酸アコプロマジン(９１０ｍｇ／ｍｌ)か らなる過剰量の溶液を注射し、断頭により殺し、蝸牛を含む側頭骨を切り取り、 氷上１．５ｇ／Ｌグルコースを含むＰＢＳに滅菌下に移した。各実験毎に最大３ ０個の蝸牛を処理した。蝸牛を開き、解離培地（ＨＢＳＳ中パパイン１２０単位 及びＤＮアーゼ２０００単位）５ｍｌを入れた５０ｍｌ滅菌管で蝸牛軸を含むコ ルチ器を集めた。組織を約３７℃で回転台震盪器で約２００ｒｐｍで３０分間イ ンキュベートした後、解離溶液を新鮮なものに交換し、更に３０分間インキュベ ーションを行った。次に火仕上げパスツールピペットで粉砕しながら細胞を分散 させ、４０μｍ Ｎｉｔｅｘナイロンメッシュで篩別して未解離組織を廃棄し、 ＩＥＣ臨床用遠心機を使用して２００ｘｇで５分間遠心分離した。得られた細胞 ペレットをオボアルブミンと約５００単位のＤＮＡアーゼを含むＨＢＳＳに再懸 濁し、（ＨＢＳＳ中）４％オボアルブミン溶液に重層し、５００ｘｇで約６分間 遠心分離した。最終ペレットを培地約６ｍｌに再懸濁し、予備被覆プレートに９ ０μｌ／ウェルの割合で接種した。螺旋神経節細胞の免疫組織化学 ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）免疫組織化学染色により螺旋神経節ニ ューロンを同定した。螺旋神経節細胞の培養物をＤ−ＰＢＳ，ｐＨ７．４中８％ パラホルムアルデヒドで室温で約１０分間固定し、１００μｌ／ウェルの割合で 培地に加えた後、４％パラホルムアルデヒド１００μｌで更に１０分間置換し、 次いでＤ−ＰＢＳ（６ｍｍウェル当たり２００μｌ）で３回洗浄した。次に固定 した培養物を１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０を含有するＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｂｌ ｏｃｋブロッキング緩衝液中でインキュベートして抗体の浸透を増した。次にウ サギポリクローナル抗ＮＳＥ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を同一緩衝液中１：６０ ００の希釈度で加え、培養物を回転震盪器で３７℃で２時間インキュベートした 。Ｄ−ＰＢＳで３回洗浄後、ヤギ抗ウサギポリクローナルビオチン化ＩｇＧ（Ｖ ｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡのＶｅｃ ｔａｓｔａｉｎキット）を約１：３００の希釈度で使用することにより、螺旋神 経節細胞と結合した抗体を検出した。二次抗体を細胞と共に３７℃で約１時間イ ンキュベートした後、細胞をＤ−ＰＢＳで３回洗浄した。次に二次抗体を１： ３００に希釈したアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼで標識し、細胞を３７ ℃で約６０分間インキュベートした。Ｄ−ＰＢＳで更に３回洗浄後、０．０４％ ３’，３’−ジアミノベンジジン−（ＨＣｌ）４、０．０６％ ＮｉＣｌ₂及び ０．０２％過酸化水素を含有する０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４の溶 液中で標識細胞培養物を５分間反応させた。螺旋神経節細胞生存の測定 種々の培養時間（２４時間、３日間及び４日間）後、ラット螺旋神経節細胞培 養物を上述のように固定、処理及びＮＳＥ免疫染色した後、明光レンズを使用し て培養物を２００倍で試験した。６ｍｍウェル中に存在する全ＮＳＥ陽性ニュー ロンを計数した。生存可能な螺旋神経節細胞は神経突起のある１５〜４０μｍの 寸法の円形体をもっていた。不規則な空胞性核周囲部細胞体又は断片化神経突起 をもつなど変性の徴候を示す螺旋神経節細胞は計数から省いた（但し、変性螺旋 神経節細胞の大部分は培養基質から分離していた）。細胞数／６ｍｍウェル又は 対照細胞密度に対する倍数変化として細胞数を表した。結果 ラット螺旋神経節ニューロンの培養物を使用してＧＤＮＦタ ンパク質産物が生存及び聴器毒素防御に及ぼす効果を立証した。螺旋神経節細胞 は３〜４週齢ラット蝸牛から得た。次に、Ｂ２７培地補充剤、２．５％熱不活化 ウマ血清、Ｄ−グルコース、ＨＥＰＥＳ、インシュリン及びトランスフェリンを 補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２中でポリオルニチン−ラミニンを被覆したマイクロプ レートにウェル２個当たり蝸牛約１個の密度で解離細胞を接種した。培養物はニ ューロンと非ニューロン細胞の混合物から構成した。但し、存在するニューロン は螺旋神経節ニューロンのみとし、ＮＳＥ免疫反応性の存在により同定した。接 種濃度（ウェル２個につき解離コルチ器１個）で接種から２４時間後にウェル当 たりのＮＳＥ陽性細胞の数は対照条件下（添加処理なし）では１２７±１７（ｎ ＝７）であった。接種から４日後の実験の終了時に各ウェルのニューロンの数は ６４±４．７まで減少し、これは対照条件下でインビトロ２４時間後に存在する 数の５０．５％±３．７に相当する。 ＧＤＮＦタンパク質産物投与が培養ラット螺旋神経節ニューロンの生存及び形 態的成熟とシスプラチン等の公知聴器毒素の毒性作用を阻止する能力に及ぼす効 果を調べた。接種から２４時間後に螺旋神経節細胞培養物をヒト組換えＧＤＮＦ タンパク 質産物（５０ｎｇ／ｍｌ〜０．１ｎｇ／ｍｌ）単独又はシスプラチン（３５μｇ ／ｍｌ）と併用して処理した。接種から２４時間後に対照培養物と１ｎｇ／ｍｌ 及び１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦで処理した培養物間に聴覚ニューロン数の差はな かった（夫々各ウェル当たりニューロン１２７±１７、１２６±２４及び１２５ ±１９）。更に３日後に１ｎｇ／ｍｌの濃度のＧＤＮＦで処理したが、ニューロ ン細胞数の有意増加は生じなかった。他方、顕著な栄養効果があり、対照培養物 よりもニューロン細胞体は大きく、繊維は長く緻密であった。１０ｎｇ／ｍｌの ＧＤＮＦで処理した培養物では、２４時間後に存在するニューロンの約７２％が 生存し、対照培養物に比較して４４％増加した（表４）。栄養効果は１ｎｇ／ｍ ｌのＧＤＮＦで処理した培養物よりも更に強かった。 ＧＤＮＦは更に、螺旋神経節ニューロンをシスプラチン毒性から防御した（表 ４）。接種から２４時間後に５μｇ／ｍｌのシスプラチンに培養物を暴露すると 、４日間培養後のニューロンの初期数（２４時間）の約９４％が損失した。シス プラチンと共にＧＤＮＦを加えると、４日後に存在するニューロンの数は有意に 高かった。ＧＤＮＦのこの防御効果は用量依存性であ り、夫々１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ及び２５ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ濃度で、 毒性処理開始時に存在するニューロンの２０．１±５．１、２７．５±３．２及 び３２．８±１．０が検出された（データは示さず）。これらの結果から明らか なように、ＧＤＮＦに応答するニューロンの約６３％（螺旋神経節ニューロン集 団の約４４％）をシスプラチン毒性から防御することもできる。 （表４の脚注） プレーティングから２４時間後にＧＤＮＦとシスプラチンを解離螺旋神経節ニュ ーロン培養物に加えた。培養物を更に３日間インキュベートし、ＮＳＥ免疫反応 性細胞を計数することによりニューロンの数を測定した。ニューロン細胞数は２ ４時間後 にインビトロで存在するニューロンの百分率として表す。各結果はｎ個の培養物 の平均±ＳＤである。 ＊シスプラチン単独との有意差ｐ＜０．０５（ｔ試験）。 ＊＊未処理対照との有意差ｐ＜０．０５（ｔ試験）。 実施例３ ＧＤＮＦタンパク質産物は蝸牛毛細胞のインビトロ生存を助長する 本実施例は、ＧＤＮＦタンパク質産物の内耳投与が動物モデルで蝸牛毛細胞を 聴器毒性から防御することを立証する。蝸牛の基底螺旋に明けた穴から鼓膜にカ ニューレを挿入することにより内耳にＧＤＮＦを導入した。カニューレをＡｌｚ ｅｔミニポンプに連結し、ＧＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を０．５μｌ／時の放出 速度で１４日間供給した。カニューレ挿入から２日後に毎日１ｍｇ／ｍｌを１５ 日間又は５日おきに７．５ｍｇ／ｋｇを２回の用量でシスプラチン筋肉内注射を 開始した（図２Ａ）。２７日後に実験を終了した。毛細胞をＦＩＴＣ−ファロイ ジンで染色し、蝸牛の中央螺旋（中央螺旋部分の少なくとも２０％）におけるそ の数を調べた。個々のモルモットのＧＤＮＦで処理した耳（右耳）と未処理の耳 （左耳）で失われた毛細 胞の百分率として結果を表す。材料 本実施例で使用した材料は次のようにして得た。ミニポンプ作成材料 サイズＶ／４、カタログ番号ＢＢ３１７−８５の医療用ビニルチューブはＢｏ ｌａｂ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ［（８００）３３１−７７２４］から入手した。Ｆｉ ｓｈｅｒブランドの５ｍｌプラスチックピペットを使用した。Ｍｉｃｒｏｌｕｍ ｅｎポリイミドチューブ、カタログ＃８００４８５３ ＯＧ（Ｔａｍｐａ Ｆｌ ｏｒｉｄａ）を使用した。シリコーン医療製品ＭＤＸ４−４２１０はＤｏｗ Ｃ ｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩから入手した。 Ａｌｚｅｔ浸透圧ミニポンプ流量調節器とＡｌｚｅｔ浸透圧ミニポンプ、カタロ グ番号２００２はＡｌｚａ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡから入手し た。テープ（ＴｉｍｅＭｅｄテープ）、Ｐｒｏｓｉｌ−２８、製品番号１１９７ ５−０はＰＣＲ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ Ｆｌｏ ｒｉｄａから入手した。精製ヒト組換えＧＤＮＦタンパク質産物はＤ−ＰＢＳ及 び０．１％ＢＳＡ中５０ｎｇ／ｍｌ溶液として調製した。 ＰＢＳに溶かした滅菌０．１％メチレンブルー(カタログ＃Ｍ−９１４０)と鉱油 （カタログ＃４００−５）はＳｉｇｍａから入手した。ミニポンプ作成手順 ビニルチューブを約４インチセクションに切断し、ミニ万力の中に置いた。Ｍ ｉｃｒｏｌｕｍｅｎポリイミドチューブの一片（７ｍｍ）をビニルチューブの端 部に挿入した。基剤約１０部と硬化剤１部を加えることによりシリコーンを混合 した。細いプローブを使用してビニルチューブの開口に液滴を落とし、ビニルチ ューブから３．７５ｍｍの距離までＭｉｃｒｏｌｕｍｅｎチューブをビニルチュ ーブに押し込んだ。先端から０．５ｍｍにプローブでシリコーン滴を落としてＭ ｉｃｒｏｌｕｍｅｎチューブの周囲に小球を形成し、一晩乾燥させた。 ピペットの長手方向に３層のテープを同心円状に巻き付けることにより５ｍｌ ピペットの直径を増した。一定のギャップを残してピペットを露出させた。ピペ ットにＶ／４チューブを巻き付け、チューブの両端が余り且つ全ての巻きが連続 的に接触するように巻きを調節した。２本の細いテープストリップをピペット上 のテープの縁部と整列させ、巻きを固定した。スーパ ーグルを巻きの上に２本の細い線状に均等に塗布した。最低１時間乾燥後、余っ た両端をピペットにほぼ平行に整列させ、１本のテープストリップで固定した。 スーパーグル１滴でチューブを巻きに固定した。一晩乾燥後、テープを剥がし、 ピペットから巻きを外した。余った端の一方に流量調節器を挿入し、スーパーグ ル１滴で固定した。 コイルを水中１％Ｐｒｏｓｉｌ−２８でフラッシュし、十分に水洗した後、７ ０％エタノールでフラッシュした。エタノールを注射器又は吸気により除去した 。コイルを吸気下に乾燥器に少なくとも３０分間放置し、密閉気密乾燥器に一晩 保持した後、ガス滅菌した。装填操作中、コイルデバイスはＧＤＮＦ、油及び染 料の液体が重力により移動しないようにできるだけ水平に維持した。ポンプ又は コイル中に気泡が形成しないようにした。ポンプを滅菌ＰＢＳに浸し、３７℃で 一晩インキュベートした。 ポンプを鉛直位置に保持することにより、ポンプにメチレン染料を装填した。 染料を装填した注射器をポンプに完全に挿入し、ポンプからオーバーフローする まで染料を注入した。ポンプに気泡が注入しないようにした。滅菌Ｖ／４チュー ブの短片 を流量調節器に配置した。Ｖ／４チューブと連結した注射器を使用してＰＢＳ＋ ０．１％ＢＳＡ中５０ｎｇ／ｍｌの濃度で合計容量２３０μｌのＧＤＮＦをカニ ューレ先端から約１０ｍｍ以内に装填した。ビヒクル対照実験では、同一容量の ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡをポンプに装填した。Ｖ／４チューブの短片を除去した 。次いで、ポンプ液体とチューブ液体（注入液）の間に２ｍｍのエアスペースと ７ｍｍの鉱油が介在するように、注射器でコイルデバイスに鉱油を装填した。流 量調節器をポンプに完全に挿入した。内耳へのポンプ挿入 材料 組織接着剤であるシアノアクリレートはＶｅｔｂｏｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ａｄ ｈｅｓｉｖｅ，３Ｍ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓｔ．Ｐａ ｕｌ，ＭＮから入手した。カルボキシレートセメントＥＳＰＥ Ｄｕｒｅｌｏｎ 、カタログ＃０３８２８はＥＳＰＥ−Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｓａｌｅｓ Ｃｏｒｐ． ，Ｎｏｒｒｉｓｔｏｗｎ ＰＡから入手した。メチルメタクリレートはＬａｎｇ Ｊｅｔ Ａｃｒｙｌｉｃ，Ｌａｎｇ Ｄｅｎｔａｌ ＭＦＧ，Ｃｏ．，Ｗｈｅ ｅｌｉｎｇ，ＩＬ から入手した。解剖器具はＲｏｂｏｚ Ｓｕｒｇｉｃａｌから入手した。キシラ ジン、ケタミン及びブプレノルフィンを使用した。潤滑眼科用軟膏（ＡＫＷＡ Ｔｅａｒｓ）はＡｋｏｒｎＩｎｃ．，Ａｂｉｔａ Ｓｐｒｉｎｇｓ ＬＡから入 手した。キシロカイン２％、カタログ番号ＮＤＣ０１８６−０１６０−０１はＡ ＳＴＲＡから入手した。医療グレードシリコーン油、Ａｒｔ．Ｎｏ．５１．３０ ０はＵｎｉｍｅｄから入手した。Ｄｕｒｅｌｏｎ Ｐｕｌｖｅｒ粉末カルボキシ レートセメント、カタログ番号Ｄ−８２２２９はＥＳＰＥ，Ｓｅｅｆｅｌｄから 入手した。硫酸塩軟膏（バシトラシン亜鉛−ネオマイシン、カタログ番号０１６ ８−００１２−３１）はＦｏｕｇｅｒａから入手した。手順 Ａｌｂｉｎｏモルモット（２５０〜３５０ｇ）にキシラジン１０ｍｇ／ｋｇ、 ケタミン４０ｍｇ／ｋｇ及びブプレノルフィン０．０５ｍｇ／ｋｇの混合物を麻 酔した。頭頂の約２ｃｍ前方から尾方に肩甲骨から４〜５ｃｍ後方までの後耳介 の右耳領域の毛を剃った。毛を剃った領域をベタジンで洗浄した。潤滑眼科用軟 膏を両目に塗布した。切開しようとする組織にキシロ カインを皮下注射した。無菌法を使用して後耳介切開を行った。細針を使用して 胞に穴をあけ、中耳腔を露出させ、蝸牛が見えるようにした。細針を使用して正 円窓の下の基底螺旋の骨壁に手作業で小さい穴をあけた。シリコーン滴が骨に達 するまでカニューレの先端を穴に挿入し、カニューレ先端を鼓室階管のほぼ中間 に配置した。シアノアクリレート滴を胞穴に滴下した。シアノアクリレートを覆 うカニューレの周囲にカルボキシレートセメントを塗布した。セメントが硬化し たら配置を確認し、穴の残余はシリコーン油層の頂部のカルボキシレートセメン トで覆った。肩甲骨の間にポンプを収容する皮下ポケットを形成してポンプを挿 入した。皮下ポケットをニトロフラゾンの滅菌ＰＢＳ溶液３ｍｌで１回濯いだ後 、１％ゲンタマイシンを含む滅菌ＰＢＳ３ｍｌを充填して感染を防止した。ニト ロフラゾン粉末を傷の周囲に塗布した後に切開部を傷クリップで閉じた。難聴 材料 シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ−ＡＱ）、カタログ番号ＮＤＣ００１５−３ ２２０−２２はＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏ ｎ，Ｎ．Ｊ．から入手した。手順 ミニポンプ移植から２日後にシスプラチン注射（ｉ．ｐ．）を開始した。７． ５ｍｇ／ｋｇを５日置いて２回注射するか、又は毎日１ｍｇ／ｋｇを１５日間注 射する２通りの投与パラダイムを使用した。潅流 ４週間後にモルモットにキシラジンとケタミンの混合物を強く麻酔し、氷冷Ｐ ＢＳ、次いでＰＢＳ中氷冷４％パラホルムアルデヒドを経心臓潅流した。側頭骨 を取り出し、蝸牛骨を４％パラホルムアルデヒドに浸けて４℃で一晩後固定した 。染色 表面調製及びファロイジン染色法を使用して毛細胞を染色した。蝸牛骨を細針 又は＃１１ブレードで開いた。細鉗子を用いて血管条を取り出した。ＰＢＳを満 たしたペトリ皿で細針を使用して蝸牛軸骨から基底膜を注意深く解離した。無傷 で取り出すように注意した。ファロイジン染色手順は、２０〜３０分間浸透させ てファロイジンを９０分間加えた以外はインビトロ外植片に実施したと同様であ った。頂、中央及び基底螺旋片を６ ０ｘ２２ガラスカバースリップに載せた。ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ検鏡溶媒１滴 を加え、試料に２２ｘ２２ｍｍカバースリップを被せ、蒸発しないようにマニキ ュア液で密封した。データ分析 各蝸牛をＦＩＴＣフィルターセットで顕微鏡試験した。基底膜の中心螺旋から 毛細胞損失が最大の８個のセグメントを選択し、付属コンピュータープリンター を使用して写真印刷した。写真を使用して毛細胞計数を手動で行った。各動物で 左耳（ＧＤＮＦを注入しない対照）の毛細胞損失を右耳（ＧＤＮＦ注入）の毛細 胞損失と比較した。結果 シスプラチン注射の結果、蝸牛の毛細胞の有意損失が生じた。毎日１ｍｇ／ｋ ｇのシスプラチンを１５日間注射した３匹のモルモットの左耳で分析した中央螺 旋セクションにおけるこの損失は４９．２％、２１．２％及び４６．９％であっ た。毎日１ｍｇ／ｋｇでなくシスプラチン７．５ｍｇ／ｋｇを２回注射したモル モットも、左耳の毛細胞は４２％損失した。モルモットの各々の右内耳にＧＤＮ Ｆを導入すると、毛細胞の損失は有意に低下した。蝸牛で計数した毛細胞損失数 と合計毛細胞数の比 は、左耳（対照）では２４１／４８６、１１３／５３０及び２４４／５１３であ り、対応する右耳（ＧＤＮＦ処理）では夫々８３／４９２、２８／４９８及び１ ２６／５１２であった。これらの比は３匹の動物で各動物の左耳の毛細胞損失が 右耳の３倍、４．２倍及び１．９倍に相当する。７．５ｍｇ／ｋｇシスプラチン を注射したモルモットでも、未処理耳（左）の毛細胞損失は処理耳に比較して２ 倍であった（図２参照）。ＧＤＮＦの代わりにビヒクルを満たしたミニポンプを 移植した動物では、左耳（未処理耳）と右耳（移植）に毛細胞数の差はなかった 。 実施例４ ＧＤＮＦタンパク質産物は蝸牛毛細胞のインビボ生存を助長する 本実施例は、ＧＤＮＦタンパク質産物が中耳に投与したときに動物モデルで蝸 牛毛細胞を聴器毒性から防御することを立証する。ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中１ｍｇ ／ｍｌの濃度で１２５〜１３５μｌの容量を鼓膜に１回注射することにより右中 耳にＧＤＮＦを導入した。ＧＤＮＦ注射から１日後に５日置きに７．５ｍｇ／ｋ ｇ２回のシスプラチン筋肉内注射を開始した。２回目のシスプラチン注射から３ 日後に実験を終了した。毛細胞をＦ ＩＴＣ−ファロイジンで染色し、蝸牛の中央螺旋（中央螺旋部分の少なくとも２ ０％）でその数を測定した。ＧＤＮＦで処理した耳（右耳）と未処理耳（左耳） について各モルモットで損失した毛細胞の百分率として結果（図３）を表す。材料 この実験で使用した材料は実施例３で使用した材料と同一であった。手順 Ａｌｂｉｎｏモルモット（体重６００〜７００ｇ）にキシラジン１０ｍｇ／ｋ ｇ、ケタミン４０ｍｇ／ｋｇ及びブプレノルフィン０．０５ｍｇ／ｋｇの混合物 を麻酔した。外科用顕微鏡で観察しながら２７ゲージ針を鼓膜に挿入することに より右耳の鼓膜によりに穴をあけた。鼓膜の別の場所には、腔全体を満たす(１ ２５〜１３５μｌ)ようにヒトタンパク質ＧＤＮＦ(ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中１ｍｇ ／ｍｌの濃度)を中耳腔に注射した。数匹の動物にはＧＤＮＦでなくビヒクルの み(ＰＢＳ＋０.１％ＢＳＡ)を注射した。翌日、シスプラチン（７．５ｍｇ／ｋ ｇ）を筋肉内注射した。５日後に同一濃度で２回目の注射を行った。３日後（全 実験期間の８日）に実施例３に記載したように動物 を殺し、組織を固定して蝸牛を分析した。結果 シスプラチンを注射した４匹のモルモットは８日目に蝸牛における毛細胞の有 意損失を示した。ＧＤＮＦを投与しなかった左耳では蝸牛の中央螺旋における毛 細胞の損失は３４％、４７％、４２％及び４１％であった。右中耳の腔に１ｍｇ ／ｍｌのＧＤＮＦを注射すると、この損失は夫々１６％、２３％、２１％及び２ ９％と有意に低下した（図３）。右耳にＧＤＮＦでなくビヒクル注射したモルモ ットは右（処理）耳と左（未処理）耳の間に毛細胞数の差を示さなかった。 本発明の好ましい態様に関する以上の記載を考察することにより、本発明の実 施における多数の変更及び変形が当業者に予想されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．感覚神経性聴力損失の治療用医薬組成物の製造のための、神経膠細胞系由来 神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質産物の使用。 ２．聴力損失が内耳病変に関連する請求項１に記載の使用。 ３．聴力損失が内耳における神経上皮毛細胞の損傷又は変性に関連する請求項１ に記載の使用。 ４．聴力損失が螺旋神経節ニューロンの損傷又は変性に関連する請求項１に記載 の使用。 ５．ＧＤＮＦタンパク質産物が配列番号１に示すアミノ酸配列又はその変異体も しくは誘導体である請求項１に記載の使用。 ６．ＧＤＮＦタンパク質産物が配列番号１に示すアミノ酸配列をもつ請求項５に 記載の使用。 ７．ＧＤＮＦタンパク質産物が［Ｍｅｔ^-1］ＧＤＮＦである請求項５に記載の使 用。 ８．ＧＤＮＦタンパク質産物を約１μｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の 用量で投与する請求項１に記載の使用。 ９．ＧＤＮＦタンパク質産物を産生及び分泌するように細胞を 改変しておく細胞治療又は遺伝子治療手段によりＧＤＮＦタンパク質産物を投与 する請求項１に記載の使用。 １０．細胞をエクスビボ改変しておく請求項９に記載の使用。 １１．細胞をインビボ改変しておく請求項９に記載の使用。 １２．前庭器の病変又は障害の治療用医薬組成物の製造のための、神経膠細胞系 由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）タンパク質産物の使用。 １３．病変又は障害がめまい感、めまい又は平衡損失をもたらす請求項１２に記 載の使用。 １４．ＧＤＮＦタンパク質産物が配列番号１に示すアミノ酸配列又はその変異体 もしくは誘導体である請求項１２に記載の使用。 １５．ＧＤＮＦタンパク質産物が配列番号１に示すアミノ酸配列をもつ請求項１ ４に記載の使用。 １６．ＧＤＮＦタンパク質産物が［Ｍｅｔ^-1］ＧＤＮＦである請求項１４に記載 の使用。 １７．ＧＤＮＦタンパク質産物を約１μｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日 の用量で投与する請求項１２に記載の使用。 １８．ＧＤＮＦタンパク質産物を産生及び分泌するように細胞 を改変しておく細胞治療又は遺伝子治療手段によりＧＤＮＦタンパク質産物を投 与する請求項１２に記載の使用。 １９．細胞をエクスビボ改変しておく請求項１８に記載の使用。 ２０．細胞をインビボ改変しておく請求項１８に記載の使用。