CZ322797A3

CZ322797A3 - Použití proteinového produktu neurotrofního faktoru (GDNF) odvozeného od gliální buněčné linie

Info

Publication number: CZ322797A3
Application number: CZ973227A
Authority: CZ
Inventors: Ella Magal
Original assignee: Amgen Inc.
Priority date: 1996-02-23
Filing date: 1997-02-14
Publication date: 1998-01-14
Also published as: CA2217565A1; DK0822829T3; NO974767D0; EA199700225A1; ATE211392T1; DE69709458D1; DE69709458T2; HUP9901758A3; ES2170938T3; KR19980703748A; WO1997030722A1; EP0822829B1; SK138697A3; JP4028598B2; PT822829E; NO974767L; AU2277997A; KR100271247B1; CN1181704A; EP0822829A1

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se obecně týká způsobů pro zabránění a/nebo léčbu poškození nebo degenerace senzorických buněk vnitřního ucha, jako jsou vláskové buňky a sluchové neurony, podáním proteinového produktu neurotrofního faktoru (GDNF) odvozeného od gliální buněčné linie. Vynález se specificky týká způsobů zabránění a/nebo léčby ztráty sluchu způsobené různými příčinami.

Dosavadní stav techniky

Neurotrofní faktory jsou přirozené proteiny, které jsou nacházeny v nervovém systému a v nenervových tkáních inervovaných nervovým systémem, které účinkují tak, že navozují přežívání a udržují fenotypovou diferenciaci populace jistých nervových a/nebo gliálních buněk (Varon et al., Ann. Rev. Neuroscience , 1: 327, 1979; Thoenen et al., Science, 229: 238, 1985). Díky tomuto fyziologickému účinku jsou neurotrofní faktory využitelné v léčbě degenerace takových nervových buněk a ztráty diferencované funkce, která vyplývá z nervového poškozeni.

Nervové poškození je způsobeno stavy, které ohrožují přežívání /nebo vlastní funkci jednoho nebo více typů nervových buněk, včetně: (1) fyzikálního poškození, které způsobuje degeneraci axonálních výběžků (což nakonec způsobí smrt nervové buňky) a/nebo způsobuje poškození těla nervové buňky poblíž místa poškození, (2) dočasného nebo trvalého omezení krevního toku /

(ischemie) k části nervového systému, jako u mrtvice, (3) úmyslné nebo náhodné vystavení neurotoxinům, jako je protinádorové nebo AIDS chemoterapeutické agens cisplatina a dideoxycytidin, v příslušném pořadí, (4) chronických metabolických onemocnění jako je diabetes nebo renální dysfunkce, nebo (5) neurodegenerativních onemocnění jako je Parkinsonova choroba, Aízheimerova nemoc a amyotrofická laterální sklerosa, které vznikají z degenerace specifických neuronáiních populací. Aby byly jednotlivé neurotrofní faktory potenciálně použitelné v léčbě nervového poškození, musí být třída nebo třídy poškozených nervových buněk reagující na faktor. Bylo stanoveno, že všechny neuronové populace nejsou reagující na nebo stejně ovlivněné všemi neurotrofnimi faktory.

Prvním identifikovaným neurotrofním faktorem byl nervový růstový faktor (NGF). NGF je prvním členem definované rodiny trofických faktorů, nazývaných neurotrofiny, která nyní obsahuje z mozku odvozený neurotrofní faktor (BDNF), neurotrofin - 3 (NT-3), NT-4/5, a NT-6 (Thoenen, Trends. Neurosci., 14: 165

- 170, 1991; Snider, Cell, 77: 627 - 638, 1994; Bothwell, Ann. Rev. Neuroscience 18: 223 - 253, 1995). O těchto neurotrofinech je známo, že účinují přes rodinu trk tyrosin kinasových receptorů, t.j. trkA, trkB, trkC a nízkoafinitního p75 receptorů (Snider, Cell, 77: 627 - 638, 1994; Bothwel1 / Ann. Rev. Neuroscience 18: 223 - 253, 1995; Chao et al., TINS 18: 321

- 326, 1995).

Neurotrofní faktor odvozený od gliální buněčné linie (GDNF) je nyní objevený protein, který byl identifikován a purifikován na základě svoji účinnosti na navození přežívání a stimulace transmiterového fenotypu mesencefalických dopaminergních neuronů • · • · · · • · • * · • · · • · · · · in vitro (Lin et al. , Science, 260: 1130 - 1132, 1993). GDNF je glykosylovaný disulfidovou vazbou vázaný homodimer, který má určitou strukturální homologii se superrodinou proteinů transformujícího růstového faktoru beta (TGF-β) (Lin et al., Science, 260: 1130 - 1132, 1993; Krieglstein et al., EMBO J.,

14: 736 - 742, 195; Poulsen et al., Neuron, 13: 1245 - 1252, 1994). GDNF mRNA byla detekována ve svalových a Schwanových buňkách v periferním nervovém systému (Henderson et al., Science, 266: 1062 - 1064, 1994; Trupp et al., J. Cell Biol., 130: 137

- 148, 1995) a v typu I astrocytů v centrálním nervovém systému (Schaar et al., Exp. Neurol., 124: 368 - 371, 1993). In vivo léčba exogenním GDNF stimuluje dopaminergní fenotyp neuronů substancia nigra a obnovuje funkční deficity indukované axotomií nebo dopaminergními neurotoxiny u zvířecího modelu Parkinsonovy choroby (Hudson et al., Brain Res. Bull., 36: 425 - 432, 1995; Beck et al., Nátuře, 373: 339 - 341, 1995; Tomac et al., Nátuře, 373: 335 - 339, 1995; Hoffer et al., Neurosci. Lett., 182: 107

- 111, 1994). Ačkoliv se soudilo, že je relativně specifický pro dopaminergní neurony, alespoň in vitro, začínají se objevovat důkazy ukazující, že GDNF může mít širší spektrum neurotrofních cílů mezi mesencephalickými dopaminergními a somatickými motorickými neurony (Yan et Matheson, Nátuře 373: 341 - 344,

1995; Oppenheim et al., Nátuře, 373: 344 - 346, 1995; Matheson et al., Soc. Neurosci. Abstr., 21: 544, 1995; Trtipp et al., J. Cell. Biol. 130: 137 - 148, 1995). Konkrétně, bylo zjištěno, že GDNF má neurotrofní účinnost na cholinergní motorické neurony mozkového kmene a míchy, jak in vivo, tak in vitro (Oppenheim et al., Nátuře, 373: 344 - 346, 1995; Zurn et al., Neuroreport, 6: 113

- 118, 1994; Yan et al., Nátuře, 373: 341 - 344, 1995; Henderson et al., Science, 266: 1062 - 1064, 1994), na retinální neurony, jako na ftoreceptory in vitro (nyní projednávaná U.S. přihláška

I pod č. -08/564833, Louis, podaná 29.11.1995) a retinální gangliové buňky jak in vitro, tak in vivo (nyní projednávaná U.S. přihláška pod č. 08/564458, Yan, podaná 29.11.1995) a jak in vitro, tak in vivo na sensorické neurony z dorsálního kořenového ganglia (nyní projednávaná U.S. přihláška pod č. 08/564844, Yan et al., podaná 29.11.1995).

Obecně zajímavá pro předkládaný vynález je W093/06116 (Lin et al., Syntex - Synergen Neuroscience Joint Venture), publikovaná 1.5.1993, která popisuje, že GDNF je užitečný pro léčbu nervového poškození, včetně poškození asociovaného s Parkinsonovou chorobou. Také zajímavá je zpráva Smith-Kastnera et al., Mol. Brain Res., 26: 325 - 330, 1994, že GDNF mRNA se stal detekovatelným a byl přeregulován po pilokarpinem indukovaném záchvatu; zprávy Schaara et al., Exp. Neurol., 124: 368 - 371, 1993 a Schaara et al., Exp. Neurol., 130: 387 - 393, 1994, že bazální astrocyty předního mozku exprivovaly střední hladiny GDNF mRNA za kultivačních podmínek, ale že GDNF nealteroval ChAT aktivitu předního mozku; a zpráva v nyní projednávané U.S. přihlášce č. 08/535682 podané 28.10.1995, že GDNF je použitelný pro léčbu poškození nebo degenerace basálních cholinergních neuronů předního mozku. U GDNF nebylo dříve ukázáno, že by navozoval přežívání, regeneraci nebo ochranu před degenerací buněk vnitřního ucha jako vláskových buněk a -Sluchových neuronů.

Neuroepiteliální vláskové buňky v Cortiho orgánu vnitřního ucha, přenášejí zvuk do nervové aktivity, která je přenášena přes kochleární dělení osmého hlavového nervu. Tento nerv se skládá z vláken ze tří typů neuronů (Spoedlin, Η. H. v Friedmann, I. Ballantyne, J., vyd. Ultrastructural Atlas of Inner Ear; London, Butterworth, str. 133 - 164, 1984): 1) aferentních

I neuronů, které jsou umístěny ve spirálním gangliu a spojují kochleu s mozkovým kmenem. 2) eferentních olivokochleárních neuronů, které pocházejí ze superiorního olivárnlho komplexu a 3) autonomních adrenergních neuronů, které pocházejí z cervikálního sympatického kmene a inervují kochleu. U lidí zde je přibližně 30000 aferentních kochleárních neuronů, s myelinizovanými axony, které se každý skládají z asi 50 lamel o průměru 4-6 pm. Tato histologická struktura vytváří jednotnou ryhlost vedení, která je významnou funkční vlastností. V průběhu délky sluchového nervu je zde trofické uspořádání aferentních vláken, s bazálními vlákny obtočenými okolo centrálně umístěných apikálních vláken způsobem podobným spletenému lanu. Spoedlin (Spoedlin, H.H. v Naunton, R.F. , Fernadex, C. vyd.

Evoked Electrical Aktivity in the Auditory Nervous System.

London, Academics Press, str. 21 - 39, 1978) identifikoval dva typy aferentních neuronů ve spirálním gangliu na základě morfologických rozdílů: typ I buněk (95%) je bipolární a má myelinizované buněčné tělo a axony, které sahají k vnitřním vláskovým buňkám. Typ II buněk (5%) jsou monopolární s nemyelinizovanými axony a sahají k zevním vláskovým buňkám Cortiho orgánu. Každá vnitřní vlásková buňka je inervována asi 20 vlákny, kde každé z nich má synapse pouze na jednu buňku. Oproti tomu, zevní vlásková buňka je inervována asi šesti vlákny, kde se každé z vláken větví k přibližně 10 buňkám. Uvnitř kochley se vlákna děli na: 1) vnitřní spirální skupinu, která primárně vede ipsi 1aterálně a má synapse s aferentními neurony k vnitřním vláskovým buňkám, a 2) početnější zevní radiální skupinu, která vede hlavně kontralaterálně a má synapse se zevními vláskovými buňkami. Existuje zde minimální práh pro jednu frekvenci, charakteristickou nebo nejlepší frekvenci, ale práh ostře narůstá pro frekvence nad a pod touto hladinou (Pickles, J. O.,

I • « · · · · · ·· ·· ·· ·· • · · · · · ··· ·· · · · · · v Introduction to the Fyziology of Hearing, London, Academics Press, str. 71 - 106, 1982). Jednotlivá vlákna sluchových nervů se proto jeví být pásmovými filtry. Basilární membrána preferenčně vibruje při různých frekvencích, v různých vzdálenostech své délky, a frekvenční selektivita každého vlákna kochleárního nervu je obdobná selektivitě vnitřní vláskové buňky, na kterou je vlákno připojeno. Tak každé vlákno kochleárního nervu vykazuje přesnou křivku pokrývající odlišný rozsah frekvencí než jeho sousední vlákna (Evans, E. F., v: Beagley H. A. ed. Auditory Investigation: The Scientific and

Technological basis, New York, Oxford University Press, 1979). Tímto mechanismem je komplexní zvuk rozložen do složek frekvencí (rozklad frekvencí) filtry vnitřního ucha.

Ztráta sluchu dostatečná pro narušení sociální a pracovní komunikace patří mezi nejčastější chronická nervová poškození v US populaci. Na základě zdravotního dotazníku (Vital and health statistics., Series 10 č. 176. Washington D.C. (DHHS publikace č. (PHS) 90-1504), je zhodnoceno, že přibližně 4 % lidí pod 45 let věku a 29 % lidí nad 65 let věku je hendikepováno ztrátou sluchu. Bylo zhodnoceno, že více než 28 milionů Američanů má poškození sluchu a že nejméně 2 miliony z této skupiny jsou významně hluší (A report of the task force on the National Strategie pian. Bethseda, Md.: National Institute of Health, 4989). Prevalence ztráty sluchu dramaticky stoupá s věkem. Přibližně 1 na 1000 dětí má ztrátu sluchu dostatečně závažnou k tomu, aby způsobila nedostatečný vývoj mluveného jazyka (Gentile, A. et al.,

Characteristics of persons with impaired hearing: United States, 1962 - 1963. Serie 10. č. 35. Washington D.C.: Goverment printing Office, 1967 (DHHS publikace č. (PHS) 1000) (Human communication and its disorders: an overview. Bethseda, Md.: National /

Institutes of health, 1970). Více než 360 na 1000 osob ve věku nad 75 let je hendikepováno ztrátou sluchu (Vítal and health statistics., Series 10 č. 176. Washington D.C. (DHHS publikace č.

(PHS) 90-1504).

Bylo zhodnoceno, že náklady na ztrátu produktivity, speciální výuku a medikamentosní léčbu mohou překročit 30 miliard dolarů za rok pro choroby sluchu, řeči a jazyka (1990 annual report of the National Deafness and other Communication Disorders Adisory Board. Washington, D.C.: Goverment Printing Office, 1991. (DHHS publikace č. (NIH) 91 - 3189). Nejběžnější příčiny závažného poškození sluchu u dětí jsou genetické choroby a meningitida, které tvoří přibližně 13 procent a 9 procent celkového počtu, v příslušném pořadí (Hotchkiss, D. Demographic aspects of hearing impairment: questions and answers., 2. vydání, Washington D.C.: Gallaudet University Press, 1989). V přibližně 50 procentech dětské hluchoty je příčina neznámá, ale je to pravděpodobně z genetických příčin nebo predispozic (Nance WE, Sweeney A. Otolaryngol. Clin. North Am. 1975: 8: 19 - 48).

Poškození kterékoliv části sluchové dráhy, od zevního zvukovodu po centrální nervový systém, může vést ke ztrátě sluchu. Sluchové ústrojí může být dále rozděleno na zevní a střední ucho, vnitřní ucho a sluchový nerv a -centrální sluchovou dráhu. Sluchová informace je u lidí přenášena z mechanického signálu na nervově přenášené elektrické impulsy prostřednictvím přibližně 15000 neuroepiteliálních buněk (vláskových buněk) a 30000 neuronů prvního řádu (buňky spirálního ganglia vnitřního ucha). Všechna centrální vlákna neuronů spirálního ganglia tvoří synapse v kochleárním jádře pontu mozkového kmene. Počet neuronů obsažených ve sluchovém vnímání dramaticky stoupá od kochley ke

I

sluchové části mozkového kmene a sluchové kůry mozkové. Všechny sluchové informace jsou přenášeny pouze 15000 vláskovými buňkami, ze kterých jsou takzvané vnitřní vláskové buňky zásadně významné, protože vytvářejí synapse s přibližně 90 % ze 30000 primárních sluchových neuronů. Tak poškození relativně malého počtu buněk ve sluchové periferii může vést k významné ztrátě sluchu. Proto, většina příčin sezorineurální ztráty sluchu může být připsána lésím vnitřního ucha (Nadol, J. B., New England Journal of Medicine, 1993, 329: 1092 - 1102).

Ztráta sluchu může být na úrovni převodu, sensorineurální a centrální. Převodová ztráta sluchu je způsobena lésemi postihujícími zevní nebo střední ucho, které vedou k destrukci normální dráhy zvuku ze vzduchu amplifikovaného bubínkovou membránou a kůstkami k tekutině vnitřního ucha. Sensorineurální ztráta sluchu je způsobena lésemi kochley nebo sluchového dělení osmého hlavového nervu. Centrální ztráta sluchu je způsobena lésemi centrální sluchové dráhy, Tato se skládá z komplexu kochleárního a olivárního jádra, colliculi inferiores, corporis geniculatae mediaes, sluchové kúry v temporálních lalocích a propojujících aferentních a eferentních vláken (Adams R. D. a Maurice, V. vyd. v Principles of Neurology, 1989, McGraw-Hill Information Services Company., str. 226 - 246).

Jak bylo zmíněno dříve, alespoň 50 procent případů významné ztráty sluchu u dětí je z genetických příčin (Brown K. S., Med. Clin. North AM. 1969, 53: 741 - 72). Pokud je vzata do úvahy pravděpodobnost, že genetická predispozice je hlavním příčinným faktorem presbyacuse - neboli s věkem vázané ztráty sluchu - která postihuje třetinu populace nad 75 let věku (Nadol, J. B. v Beasley DS, Davis GA, vyd., Aging: Communication Processes and • ·· ·· ···· • · · · · · · • · · · · · • · ·· ··· · • · · · · ··· ·· ·· ·

Disorders., New York: Grune and Stratton, 1981: 63 - 85), pak jsou genetické a dědičné faktory pravděpodobně nejběžnější příčinnou ztráty sluchu. Genetické anomálie jsou nejčastěji vyádřeny jako sensorineurální ztráta sluchu než jako přenosová ztráta sluchu. Geneticky determinovaná sensorineurální ztráta sluchu je jasně většinovou, ne-li hlavní příčinou sensorineurální ztráty sluchu, zejména u dětí (Nance WE, Sweeney A. Otolaryngol. Clin. North Am., 1975: 8:19 - 48). Mezi nejběžnější syndromové formy sensorineurální ztráty sluchu patří Waardenburgův syndrom, Alportův syndrom a Usherův syndrom.

Množství běžně používaných léčiv má ototoxické vlastnosti. Nejlépe známými jsou aminoglykosidová antibiotika (Lerner, S. A. et al., vyd. Aminoglycoside ototoxicity. Boston: Little, Brown, 198; Smith, C. R. et al., N. Engand. J. Med. 1980: 302: 1106 9), kličková diuretia (Bosher, S. K., Acta Otolaryngol. (Stockh) 1980, 90: 4 - 54), salicyláty (Myers, E. N. et al., N.Engl. J. Med. 1965, 273: 587 - 90) a antineoplastická agens jako je cisplatina (Strauss, M. et al., Laryngoscope 1983, 143: 1263 5). Ototoxicita byla také popsána během orálního a parenterálního podání erythromycinu (Kroboth, P. D. et al., Arch. Intern. Med. 1983, 1: 169 - 79; Achweitzer, V. G., Olson, N. Arch.

Otolaryngol., 1984, 110: 258 - 60).

Většina ototoxických substancí způsobuje ztrátu sluchu poškozením kochley, zejména sluchových vláskových buněk a stria vaskularis, specializovaného epiteliálního orgánu uvnitř vnitřního ucha, který je zodpovědný za homeostazu tekutin a elektrolytů (Nadol, J. B., New England Journal of Medicine,

1993, 329: 1092 - 1102). Sekundární degenerace neuronů se může vyskytnout mnoho let po ototoxické události poškozující vláskové

I

buňky. Existují důkazy, že některé ototoxické substance mohou být selektivně koncentrovány ve vnitřním uchu, což vede k progresivní sensorineurální ztrátě sluchu navzdory přerušení systémového podání (Federspil, P. et al., J. Infect. Dis. 1976, 134 Suppl:

S200 - S205).

Trauma způsobené nadměrnou akustickou stimulací je jinou hlavní příčinou hluchoty. Existuje individuální citlivost na hlukem způsobené trauma. Klinicky významná sensorineurální ztráta sluchu se může vyskytnout u některých osob po vystavení nadměrné intenzitě hluku, i pod hladinami schválenými Occupation Safety and Health Agency (Osguthorpe, J. D. ed. Washington D.C.:

American Academy of Otoaryngology - Head and Neck Surgery Foundation, 1988).

Demyelinizační procesy, jako je roztroušená sklerosa, mohou způsobovat sensorineurální ztrátu sluchu (Noffsinger, D. et al., Acta Otolaryngol Suppl (Stockh) 1972, 303: 1 - 63). Nedávno byla rozpoznána forma imunitním systémem zprostředkované sensorineurální ztráty sluchu (McCabe, B. F. Ann. Otol. Ehinol. Laryngol., 1979, 88: 585 - 9). Ztráta sluchu je obvykle bilaterální, rychle progresivní (měřená v týdnech a měsících) a může nebo nemusí být asociována s vestibulárními příznaky.

Množství tumorů, jak primárních, tak metastatických, může produkovat jak převodovou ztrátu sluchu, tak sensorineurální ztrátu sluchu, invazí do vnitřního ucha nebo sluchového nervu (Houck, J. R., et al., Otolaryngol. Head and Neck Surgery, 1992, 106: 92 - 7).Množství degenerativních onemocnění neznámé příčiny může produkovat sensorineurální ztrátu sluchu. Menierúv syndrom (Nadol, J. B. ed. Meniere's disease: pathogenesis,

pathophysiology, diagnosis and treatment. Amsterdam: Kugler and Ghedini 1989), charakterizovaný fluktuující sesorineurální ztrátou sluchu, episodickou závratí a tinitem, se zdá být onemocněním způsobeným narušení homeostasy tekutin ve vnitřním uchu, ačkoliv patogenese zůstává nejasná. Náhlá sensorineurální ztráta sluchu (Wilson, W. R. et al., Arch. Otolaryngol. 1980,

106: 772 - 6) zbůsohující střední až vážnou sensorineurální hluchotu, může být způsobena řadou příčin, včetně ischemie vnitřního ucha a virové labyrint itis.

Presbyacuse, ztráta sluchu asociovaná se stárnutím, postihuje více než třetinu osob nad 75 let věku. Nejčastějším histopatologickým korelátem presbyacuse je ztráta neuroepiteliálních (vláskových) buněk, neuronů a stria vaskularis periferního sluchového systému (Schuknecht H. F. Pathology of the Ear, Cambridge, Mass: Harvard University Press, 1974, 388 - 403). Presbyacusis je nejlépe chápána jako následek kumulativních účinků vlivů několika nox v průběhu života, včetně zvukového traumatu, ototoxicity a geneticky ovlivněné degenerace.

U jistých neurotrofických faktorů bylo ukázáno, že regulují diferenciaci neuronů a jejich přežívání během vývoje (Korsching S. J. Neurosci. 13: 2739 - 2748, 1993) a že chrání neurony proti poškození a toxiny v dospělosti (Hefti, Neurosci. 6: 2155 - 2162, 1986; Apfel et al., Ann. Neurol. 29: 87 - 89, 1991; Hyman et al., Nátuře, 350: 230 - 233, 1991; Knusel et al., J. Neurosci. 12:

4391 - 4402, 1992; Yan et al., Nátuře, 360: 753 - 755, 1992; Koliatsos et al., Neuron, 10: 359 - 367, 1993). In šitu hybridizační studie ukázaly, Že mRNA pro neurotrofinové receptory TrkB a TrkC jsou exprivovány vyvíjejícím se kochleovestihulárním gangliem (Ylikoski et al., Hear. Res. 65: 69 - 78, 1993;

/

Schecterson et al., Hearing Res. 73: 92 - 100, 1994) a že mRNA pro BDNF a NT-3 je nacházena ve vnitřním uchu, včetně Cortiho orgánu (Pirvola et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 9915 9919, 1992; Schecterson et al., Hearing Res. 73: 92 - 100, 1994; Wheeler et al., Hearing Res. 73: 46 - 56, 1994). Fyziologická role BDNF a NT-3 ve vývoji vestibulárního a sluchového systému byla zkoumána na myších, které měly deleci BDNF a/nebo NT-3 genu (Ernfors et al., Neuron 14: 1153 - 1164, 1995). V kochlee ztratily BDNF mutanty typ 2 spirálních neuronů, což způsobilo absenci inervace vnějších vláskových buněk. NT-3 mutanty vykazovaly malé množství aferentních a ztrátu 87 % spirálních neuronů, předpokládané korespondujících typu 1 neuronů, které inervují vnitřní vláskové buňky. Dvojnásobní mutanti měly aditivní ztrátu, kde chyběly všechny vestibulární a spirální neurony. Požadavek TrkB a TrkC receptorů pro přežití specifických neuronálních populací a uchování cílené inervace v periferním sensorickém systému vnitřního ucha byl demonstrován na studiu myší nesoucích mutace zárodečné linie v katalytické doméně tyrosin kinasy těchto genů (Schimmang et al., Devolopment, 121: 3381 - 3391, 1995). Gao et al., (J. Neurosci. 15: 5079 - 5087, 1995) ukázal přežívání navozující potenciál NT-4/5, BDNF a NT-3 pro neurony postnatálního spirálního ganglia krysy v disociovaných kulturách a že NT-4/5 chrání tyto neurony před neurotoxickým účinkem protinádorového léčiva -cisplatiny. Také bylo u BDNF a NT-3 ukázáno, že podporují přežití sluchových neuronů dospělých krys v disociovaných kulturách (Lefebvre et al., NeuroReport 5: 865 - 868, 1994).

Neexistují žádné dřívější zprávy o použití GDNF v léčbě ztráty sluchu. Protože narušení sluchu je vážným postižením, bude identifikace jakéhokoliv agens a léčebného způsobu, který může

chránit sluchové neurony a vláskové buňky před poškozením velkým přínosem.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje způsoby léčby sensorineurální ztráty sluchu, obsahující podání terapeuticky účinného množství proteinového produktu neurotrofního faktoru odvozeného od gliální buněčné linie (GDNF) subjektu majícímu lési ve vnitřním uchu. Například, ztráta sluchu může být asociována s poškozením nebo degenerací neuroepiteliálních vláskových buněk (kochleárních vláskových buněk) nebo neuronů spirálního ganglia ve vnitřním uchu.

Předkládaný vynález je založen na objevech, že vláskové buňky reagují na GDNF ve smyslu resistence na toxické účinky ototoxinú, jako je cisplatina a neomycin, a že sluchové neurony také reagují na GDNF ve smyslu resistence na toxické účinky různých ototoxinú, jako je cisplatina, neomycin a salicylát sodný. Tak terapeuticky účinné množství proteinového produktu GDNF může být podáno pro navození ochrany, přežívání nebo regenerace vláskových buněk a neuronů spirálního ganglia.

Také bylo objeveno, že lése nebo poruchy vestibulárního ústrojí mohou také být léčeny podáním terapeuticky účinného množství proteinového produktu GDNF subjektu, který má takové lése nebo poruchy. Takové lése mohou vést k závrati, vertigu nebo ztrátě rovnováhy.

Je předpokládáno, že takový proteinový produkt GDNF bude obsahovat GDNF protein jak je znázorněn aminokyselinovou sekvencí danou na obr. 1 (SEQ ID NO: 1), stejně jako jeho varianty a deriváty. Je také předpokládáno, že takový GDNF proteinový produkt bude obsahovat (Met^-1) GDNF.

Podle vynálezu může být GDNF proteinový produkt podán parenterálně v dávce od asi 1 pg/kg/den až asi 100 mg/kg/den, typicky v dávce od asi 0,1 mg/kg/den do asi 25 mg/kg/den a obvykle v dávce od asi 5 mg/kg/den do asi 20 mg/kg/den. Je také předpokládáno, že, v závislosti na individuálních potřebách pacienta a způsobu podání, může být GDNF proteinový produkt podán v nižší frekvenci jako je jednou za týden nebo několikrát za týden, nebo denně. Je dále předpokládáno, že GDNF proteinový produkt může být podán přímo do středního ucha nebo vnitřního ucha. Odborníkům bude zřejmé, že takové podání malého množství GDNF proteinového produktu může být použito, například, jako přímé podání dávky do středního ucha nebo do vnitřního ucha, kde dávka je v rozsahu od asi 1 pg/ucho do asi 1 mg/ucho jako jedna injekce nebo jako více injekcí.

Dále je předpokládáno, že GDNF proteinový produkt může být podán v kombinaci nebo konjunkci s účinným množstvím druhého terapeutického agens, jako je BDNF nebo NT-3. Vynález také poskytuje použití GDNF proteinového produktu ve výrobě léčiva nebo farmaceutické kompozice pro léčbu poškoz-ení nebo degenerace vláskových buněk a sluchových neuronů pro celou řadu příčin sensorineurální ztráty sluchu. Takové farmaceutické kompozice obsahuji topické, orální, nebo pro střední a vnitřní ucho určené formulace GDNF proteinových produktů nebo kombinace s kochleárními implantáty.

Odborníkům bude také jasné, že proces podání může být proveden • « » « · ♦ * · · » · » ♦ · pomocí buněčné terapie nebo prostředky genové terapie, jak je dále popsáno níže. Například, při genové terapii jsou buňky modifikovány tak, aby produkovaly a secernovaly GDNF proteinový produkt. Buňky mohou být modifikovány ex vivo nebo in vivo. Velké množství aspektů a výhod předkládaného vynálezu bude odborníkům jasné po porozumění následujícímu detailnímu popisu vynálezu, který popisuje jeho nyní preferovaná provedení.

Předkládaný vynález poskytuje způsoby pro ochranu a/nebo léčbu sensorineurální ztráty sluchu podáním terapeuticky účinného množství proteinového produktu neurotrofního faktoru dvozeného od gliální buněčné linie (GDNF). Podle jednoho aspektu vynálezu jsou poskytnuty způsoby pro léčbu poškozených vláskových buněk a sluchových neuronů podáním terapeuticky účinného množství GDNF proteinového produktu prostřednictvím farmaceutické kompozice, implantace GDNF exprivujících buněk nebo GDNF genové terapie. Vynález může být prakticky proveden za použití jakéhokoliv biologicky aktivního GDNF proteinového produktu, včetně GDNF proteinu representovaného aminokyselinovou sekvencí danou v SEQ ID NO: 1, včetně jejích variant a derivátů. Kromě orálního, parenterálního nebo lokálního podání GDNF proteinového produktu je předpokládáno podání cestou postupů buněčné terapie nebo genové terapie.

Předkládaný vynález je založen na počátečních objevech, že GDNF chrání vláskové buňky před ototoxiny indukovanou buněčnou smrtí v explantátových kulturách krysích kochleí a dissociovaných neuronů spirálního ganglia z dospělých krys v kultuře. Je předpokládáno, že podání exogeního GDNF proteinového produktu bude chránit vláskové buňky a neurony spirálního ganglia před traumatickým poškozením (jako je zvukové trauma nebo akutní nebo

I e · · · · · * · · ··« »· • ·· ·· · · * * * • * · * » · « · · « · chronická léčba cisplatinou nebo aminoglykosidovými antibiotiky) nebo před poškozením vzniklým z nedostatku neurotrofních faktorů způsobeným přerušením transportu faktorů z axonů do buněčného těla. U takové léčby je očekáváno, že umožní vláskovým buňkám a/nebo sluchovým neuronům tolerovat intermitentní insulty bud ze zvukového traumatu prostředí, nebo léčby ototoxiny a že zpomalí progresivní degeneraci sluchových neuronů a vláskových buněk, která je odpovědná za ztrátu sluchu u takových patologických stavů jako je presbyacuse (na věk vázaná ztráta sluchu), dědičná sensorineurální degenerace a post-idiopatické ztráty sluchu a že zachová funkční integritu vnitřního ucha. Bude také podporovat sluchové neurony pro lepší a delší účinnost kochleárních implantátů.

Podle vynálezu může být GDNF proteinový produkt podán do středního ucha v dávce v rozsahu od asi 1 pg/kg/den do asi 100 mg/kg/den, typicky v dávce od asi 0,1 mg/kg/den do asi 25 mg/kg/den a obvykle v dávce od asi 5 mg/kg/den do asi 20 mg/kg/den. GDNF proteinový produkt může být podán přímo do vnitřního ucha v případě, že invaze do vnitřního ucha je již prováděna, jak je tomu v případě kochleárního implantátu nebo chirurgického výkonu na vnitřním uchu. V takových případech bude podáno menší množství GDNF proteinového produktu, například v rozsahu od asi 1 pg/ucho do asi 1 mg/ucho v jedné injekci nebo ve více injekcích. V případě, že je zapotřebí chronické podávání faktoru, potom bude umístěna Alzet minipumpa připojená na kanylu, jejíž konec bude zaveden do středního nebo vnitřního ucha pro kontinuální uvolňování faktoru. GDNF může také být vyvinut ve formě ušních kapek, které budou penetrovat přes bubínkovou membránu Bulla. Je dále předpokládáno, že GDNF proteinový produkt může být podán s účinným množstvím druhého terapeutického agens ··· ··· ·· ····· ····· · · · pro léčbu degenerace sluchových neuronů, spolu s BDNF a NT-3, stejně jako s jinými faktory a léčivy nyní nebo v budoucnu používanými pro léčbu různých patologií vnitřního ucha. Různé farmaceutické kompozice a různé techniky podání jsou podrobněji popsány dále.

Jak je zde použito, termín GDNF proteinový produkt zahrnuje purifikovaný přirozený, syntetický nebo rekombinantní neurotrofní faktor odvozený od gliální buněčné linie, biologicky aktivní varianty GDNF (včetně inserčních, substitučních a delečních variant) a jejich chemicky modifikované deriváty. Také jsou zahrnuty GDNF, které jsou v podstatě homologní s lidským GDNF majícím aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 1. GDNF proteinové produkty mohou existovat jako homodimery nebo heterodimery ve své biologicky aktivní formě.

Termín biologicky aktivní jak je zde použit znamená, že GDNF proteinový produkt vykazuje podobné neurotrofní vlastnosti, ale nikoliv všechny shodné vlastnosti, a ne nezbytně ve stejném stupni, jako GDNF mající aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 1. Výběr jednotlivých požadovaných neurotrofních vlastností na účelu, za kterým bude GDNF proteinový produkt podáván.

Termín v podstatě homologní jak je zde použit znamená mající stupeň homologie s GDNF majícím aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 1, který preferovaně přesahuje 70 %, lépe přesahuje 80 % a nejlépe přesahuje 90 % nebo 95 %. Například, stupeň homologie mezi krysím a lidským proteinem je okolo 93%, a je předpokládáno, že preferovaný savčí GDNF bude mít podobně vysoký stupeň homologie. Procento homologie jak je zde popisováno je • ·· · ·· ······ ···· ···· · · · ··· · · · ··· ·· ·· ·· ·« ···· ··· · · · ·· ··· ·· ··· ·· · · * obvykle počítáno jako procento aminokyselinových zbytků nacházených v kratší ze dvou sekvencí, která je seřazena s identickými aminokyselinovými residui ve srovnávané sekvenci, kde mohou být vloženy čtyři mezery na 100 aminokyselin pro provedení tohoto seřazení (jak je dáno v Dayhoff, v Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. S, p. 124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. (1972), jehož poznatky jsou zde uvedeny jako odkazy). Preferovaně je procento homologie jak je popsáno výše počítáno jako procento složek v menší ze dvou sekvencí, které mohou také být nalezeny ve větší ze dvou sekvencí (se zavedením mezer), s tím, že složka je definována jako sekvence čtyřech sousedních aminokyselin. Jako v podstatě homologní je také obsažen GDNF proteinový produkt, který může být izolován pomocí zkřížené reaktivity s protilátkami k GDNF SEQ ID NO: 1 nebo jehož geny mohou být izolovány hybridizací s genem nebo segmenty genu kódujícího GDNF SEQ ID NO: 1.

GDNF proteinový produkt podle tohoto vynálezu může být izolován nebo generován jakýmikoliv prostředky, které jsou odborníkům známy. Příkladné metody pro produkci GDNF proteinových produktů použitelných v předkládaném vynálezu jsou popsány v U. S. přihlášce pořadové č. 08/182183 podané 23.5.1994 a její původní přihlášce; v PCT přihláška č. PCT/US92/07888 podané 17.9.1992, publikované jako WO 93/06116 (Lin et al., Syntex-Synergen Neuroscience Joint Venture); v evropské patentové přihlášce č. 92921022.7, publikované jako EP 610 254; a související U.S. přihlášce pořadové č. 08/535 681 podané 28.9.1995 (Truncated Glial Cell - Line Derived Neurotrophic Factor), jejichž objevy jsou zde uvedeny jako odkazy.

I

Přirozeně se vyskytující GDNF proteinové produkty z přípravků savčích neuronálních buněk, nebo ze savčí buněčné linie secernující nebo exprivující GDNF. Například, WO 93/06116 popisuje izolaci GDNF ze séra prostého růstového kondiciovaného media B49 glioblastomových buněk. GDNF proteinové produkty mohou také být chemicky syntetizovány jakýmikoliv odborníkům známými prostředky. GDNF proteinové produkty jsou preferovaně produkovány cestou rekombinantních technik, protože ty jsou schopné dosáhnout srovnatelně vyšších množství proteinu vyšší čistoty.

Rekombinantní formy GDNF proteinového produktu zahrnují glykosylované a neglykosylované formy proteinu a protein exprivovaný v bakteriálních, savčích nebo hmyzích systémech.

Obecně, rekombinantní techniky vyžadují izolaci genů odpovědných za kódování GDNF, klonování genu ve vhodných vektorech a buněčných typech, modifikaci genu pokud je to žádoucí pro kódování požadovaných variant a exprivování genu tak, aby produkoval GDNF proteinový produkt. Alternativně, nukleotidové sekvence kódující požadovaný GDNF proteinový produkt může být chemicky syntetizována. Je předpokládáno, že GDNF proteinový produkt může být exprivován za použití nukleotidové sekvence, která se liší v pořadí kodonů díky degeneraci genetického kódu nebo alelické variaci. WO 93/06166 popisuje izolaci a sekvencování cDNA klonu krysího GDNF genu, a izolování, sekvencování a expresi DNA klonu lidského GDNF genu.

Další vektory vhodné pro expresi GDNF proteinového produktu v E. coli jsou popsány v publikované evropské patentové přihlášce č. EP 0 423 980 (Stem Cell Factor) publikované 24.5.1991, jejíž objevy jsou zde uvedeny jako odkazy. DNA sekvence genu kódujícího zralý lidský GDNF a aminokyselinová sekvence GDNF je

I • ·· · ·· ······ ···· ···· · · · ··· ··· · » · • · ·· ·· ·· ···· ··· ··· · · ····· ····· · · * ukázána na obr. 19 (SEQ ID NO: 5) WO 93/06116. Obrázek 19 neukazuje celou kódující sekvenci pro pre-proporcionální GDNF, ale prvních 50 aminokyselin lidského pre-pro GDNF je ukázáno na obrázku 22 (SEQ ID NO: 8) WO 93/06116.

Přirozeně se vyskytující GDNF je disulfidově vázaný dimer ve své biologicky aktivní formě. Materiál izolovaný po expresi v bakteriálních systémech je v podstatě biologicky inaktivní a existuje jako monomer. Poskládání je nezbytné pro produkci biologicky aktivního disulfidově vázaného dimeru. Procesy pro poskládání a naturaci GDNF exprivovaného v bakteriálních systémech jsou popsány ve WO 93/06116. Standardní in vitro testy pro určení aktivity GDNF jsou popsány ve WO 93/06116 a související U.S. přihlášce č. 08/535681 podané 28.10.1995, a jsou zde uvedeny jako odkazy.

A. Varianty GDNF

Termín GDNF varianty jak je zde použit zahrnuje polypeptidy, u kterých byly deletovány aminokyseliny (deleční varianty), insertovány aminokyseliny (adiční varianty) nebo byly substituovány za (substituční varianty) zbytky v aminokyselinové sekvenci přirozeně se vyskytujícího GDNF. Takové varianty jsou připraveny zavedením vhodných nukleotidových změn do DNA kódující polypeptid nebo in vitro chemickou syntesou požadovaného polypeptidu.Odborníkům bude jasné, že může být poskytnuto mnoho kombinací delecí, insercí a substitucí tak, že konečná molekula má biologickou aktivitu GDNF.

Techniky mutagenese pro nahrazení, inserce a delece jednoho nebo více vybraných aminokyselinových zbytků jsou odborníkům

I

dobře známé (např. U.S. Patent č. 4518584, jehož objevy jsou zde uvedeny jako odkazy). Jsou dvě základní proměnné při konstrukci variant: umístění místa mutace a charakter mutace. V přípravě GDNF variant bude výběr mutačního místa a charakter mutace záviset na modifikované charakteristice GDNF. Místa mutace mohou být modifikována jednotlivě nebo sériově, např. (1) substitucí nejprve vybranou konservativní aminokyselinou a až potom radikálnější výběr podle dosažených výsledků, (2) delecí cílového aminokyselinového zbytku, nebo (3) insercí aminokyselinového zbytku sousedního k vyhledanému místu. Jsou preferovány konzervativní změny od 1 do 20 aminokyselin. Pokud je určena aminokyselinová sekvence požadovaného GDNF proteinového produktu, pak je snadno určena sekvence nukleové kyseliny, která bude použita pro expresi proteinu. Také mohou být generovány Nkoncové a C-koncové deleční varianty za pomoci proteolytických enzymů.

Pro GDNF deleční varianty jsou delece obvykle v rozsahu od 1 do 30 zbytků, obvykleji od 1 do 10 zbytků a typicky od 1 do 5 sousedících zbytků. N-koncové, C-koncové a vnitřní intrasekvenční delece jsou také možné. Delece mohou být zavedeny do regionů nízké homologie s jinými členy TGF-β super rodiny pro modifikaci aktivity GDNF. Delece v oblastech významné homologie s jinými členy TGF-β super rodiny budou pravděpodobně modifikovat biologickou aktivitu GDNF významněji. Počet postupných delecí bude vybrán tak, aby byla zachována terciární struktura GDNF proteinového produktu ve zpracované doméně, např. cysteinové zkřížené vazby. Neomezující příklady delečních variant obsahují zkrácené GDNF proteinové produkty, kterým chybí 1 až 40 N-koncových aminokyselin GDNF, nebo varianty, kterým chybí C.koncový zbytek GDNF, nebo jejich kombinace, jak je popsáno v

I • · ·· ···· související U.S. patentové přihlášce č. 08/535681 podané

28.10.1995, která je zde uvedena jako odkaz.

Pro adiční varianty GDNF obsahují sekvence aminokyselinových adic obvykle N- a/nebo C-koncové fuze v rozsahu délky od jednoho zbytku do polypeptidů obsahujících stovky nebo více zbytků, stejně jako vnitřní intrasekvenční adice jednoho nebo mnoha aminokyselinových zbytků. Vnitřní adice mohou být obecně v rozsahu od 1 do 10 zbytků, častěji v rozsahu od 1 do 5 zbytků a obvykle v rozsahu od 1 do 3 zbytků. Příklady N-koncových adičních variant obsahují GDNF s N-koncovým methionylovaným zbytkem (artefakt přímé exprese GDNF v bakteriální rekombinantní buněčné kultuře), který je označen (Met^-1)GDNF a fúzi heterologní N-koncové signální sekvence na N-konec GDNF pro usnadnění sekrece zralého GDNF z rekombinantních hostitelských buněk. Takové signální sekvence budou obyčejně získány z, a tak budou homologní k, zamýšlenému druhu hostitelské buňky. Adice mohou také obsahovat aminokyselinové sekvence odvozené od jiných neurotrofních Preferovaným GDNF proteinovým produktem pro použití podle předkládaného vynálezu je lidský (Met~¹)GDNF.

GDNF substituční varianty mají alespoň jeden aminokyselinový zbytek v aminokyselinové sekvenci GDNF nahrazen jiným zbytkem insertovaným v jeho místě.Takové substituční varianty obsahují alelické varianty, které jsou charakterizovány přirozeně se vyskytujícími změnami nukleotidové sekvence ve specifické populaci, které mohou, ale nemusejí vést k aminokyselinovým změnám. Příklady substitučních variant (viz např. SEQ ID NO: 50) jsou popsány v souévisející U.S. přihlášce č. 08/535681 podané 28.10.1995, a jsou zde uvedeny jako odkaz.

Specifické mutace GDNF aminokyselinové sekvence mohou vyžadovat modifikace na glykosylační místa (např. serin, threonin nebo asparagin). Absence glykosylace nebo pouze částečná glykosylace vychází z aminokyselinové substituce nebo delece v jakémkoliv na asparagin vázaném glykosylačním rozpoznávacím místě nebo v jakémkoliv místě molekuly, které je modifikováno adicí O-vázaného uhlovodanu. Asparagin vázané glykosylační rozpoznávací místo obsahuje tripeptidovou sekvenci, která je specificky rozpoznáváva vhodnými buněčnými glykosylačními enzymy. Tyto tripeptidové sekvence jsou bud Asn-Xaa-Thr nebo Asn-Xaa-Ser, kde Xaa může být jakákoliv aminokyselina jiná než prolin. Množství aminokyselinových substitucí nebo deleci v jednom nebo obou první nebo třetí aminokyselinové pozice glykosylačního rozpoznávacího místa (a/nebo aminokyselinové delece ve druhé pozici) nevedou ke glykosylaci modifikované tripeptidové sekvence. Tak, exprese vhodně pozměněných nukleotidových sekvencí produkuje varianty, které nejsou glykosylovány v tomto místě. Alternativně může být aminokyselinová sekvence GDNF modifikována pro přidání glykosylačních míst.

Jeden způsob pro identifikaci aminokyselinových zbytků nebo regionů pro mutagenesi se nazývá alanin scanning mutagenese jak jí popisuje Cunningham a Wells (Science, 244: 1081 - 1085, 1989). V tomto způsobu jsou identifikovány aminokyselinové zbytky nebo skupiny cílových zbytků (např. nabité zbytky Jako je Arg, Asp, His, Lys, a Glu) a jsou nahrazeny neutrálními aminokyselinami nebo aminokyselinami se záporným nábojem (nejlépe alaninem nebo polyalaninem) pro narušní interakce aminokyselin s okolním vodným prostředím v buňce nebo mimo buňku. Tyto domény demonstrující funkční sensitivitu k substitucím jsou potom vylepšeny vložením dalších nebo pozměněných zbytků v místě substituce. Tak je určeno cílové místo pro zavedení variace aminokyselinové sekvence, je

I ····· ····· · · · proveden alanin scanning nebo náhodná mutagenese na korespondujícím cílovém kodonu nebo regionu DNA sekvence a exprivované varianty GDNF jsou vyšetřovány na optimální kombinaci požadované aktivity a stupně aktivity.

Místa největšího zájmu pro substituční mutagenesi obsahují místa, kde se aminokyseliny nacházené v GDNF proteinech od různých druhů významně liší v objemu postraních řetězců, náboji, a/nebo hydrofobnosti. Jinými žádoucími místy jsou ty, ve kterých jsou jednotlivé zbytky GDNF podobných proteinů, získaných z různých druhů, identické. Takové pozice jsou obecně významné pro biologickou aktivitu proteinu. Nejprve jsou tato místa substituována relativně konservativním způsobem. Takové konservativní substituce jsou ukázány v tabulce 1 pod kolonkou preferované substituce. Pokud takové substituce vedou ke změně biologické aktivity, pak jsou zavedeny významnější změny (příkladně substituce), a/nebo mohou být provedeny jiné adice nebo delece a vzniklý produkt je vyšetřován na svou aktivitu.

I

Tabulka 1

Aminokyselinové substituce

Původní zbytek	Preferovaná substituce	Příkladné substituce
Ala (A)	Val	Val; Leu; Ile
Arg (R)	Lys	Lys; Gin; Asn
Asn (N)	Gin	Gin; His; Lys; Arg
Asp (D)	Glu	Glu
Cys (C)	Ser	Ser
Gin (Q)	Asn	Asn
Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro	Pro
His (H)	Arg	Asn; Gin; Lys; Arg
Ile (I)	Leu	Leu; Val; Met; Ala; Phe; norleucine
Leu (L)	Ile	norleucine; Ile; Val; Met; Ala; Phe
Lys (K)	Arg	Arg; Gin; Asn
Met (M)	Leu	Leu; Phe; Ile
Phe (F)	Leu	Leu; Val; Ile; Ala
Pro (P)	Gly	Gly
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr	Tyr
Tyr (Y)	Phe	Trp; Phe; Thr; Ser
Val (V)	Leu	Ile; Leu; Met; Phe;

Ala; norleucine

I

U konzervativních modifikací aminokyselinové sekvence (a korespondujících modifikací kódujících sekvencí nukleových kyselin) se předpokládá, že budou produkovat GDNF proteinový produkt, mající funkční a chemické charakteristiky podobné přirozenému GDNF. Oproti tomu, významné modifikace ve funkčních a/nebo chemických charakteristikách GDNF proteinových produktů mohou být provedeny vybráním substitucí, které se signifikantně liší ve svém účinku na zachování (a) struktury kostry polypeptidu v oblasti substituce, například, konformace listu nebo šroubovice, (b) náboje nebo hydrofobnosti molekuly v cílovém místě, nebo (c) objemu postraních řetězců. Přirozeně se vyskytující zbytky jsou rozděleny na skupiny podle běžných vlastností postraních řetězců:

1) hydrofobni: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

2) neutrální hydrofilní: Cys, Ser, Thr;

3) kyselé: Asp, Glu;

4) zásadité; Asn, Gin, His, Lys, Arg;

5) zbytky ovlivňující orientaci řetězce: Gly, Pro; a

6) aromatické: Trp, Tyr, Phe.

Nekonzervativní substituce vyžadují změnu člena jedné z těchto tříd za člena jiné třídy. Takové substituované zbytky mohou být zavedeny do regionů GDNF proteinu, které jsou homologní s jinými proteiny TGF-β super rodiny, nebo do nehomologních regionů molekuly.

B. Deriváty GDNF

Chemicky modifikované deriváty GDNF nebo variant GDNF mohou být odborníkem připraveny podle zde daného popisu. Nejvhodnější chemické skupiny pro derivatizaci obsahují ve vodě rozpustné

I • · · · * · • · · polymery. Ve vodě rozpustný polymer je žádoucí, protože protein, na který je připojen, se nesráží ve vodném prostředí, jako je fyziologické prostředí. Preferovaně je polymer farmaceuticky akceptovatelný pro přípravu terapeutického produktu nebo kompozice. Odborník bude schopen vybrat požadovaný polymer na základě úvahy, zda konjugát polymer/protein bude použit terapeuticky, a pokud ano, tak na základě požadované dávky, doby cirkulace, resistence na proteolýzu a jiných podmínek. Účinnost derivatizece může být zajištěna podáním derivátu, v požadované formě (t.j. osmotickou pumpou, nebo lépe injekcí nebo infusí, nebo dále formulované pro orální, pulmonální nebo jiný způsob podání) a určením jeho účinnosti.

Vhodné ve vodě rozpustné polymery obsahují, ale nejsou omezeny na, polyěthylenglykol (PEG), kopolymery ethylenglykolu/propylenglykolu, karboxymethylcelulozu, dextran, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, poly-1,3-dioxolan, poly-1,3,6 - trioxan, ethylen/maleinanhydrid kopolymer, polyarainokyseliny (bud homopolymery nebo náhodné kopolymery) a dextran nebo poly(n-vinyl pyrrolidon)polyěthylenglykol, polypropylenglykolové homopolymery, polypropylenoxid/ethy1enoxid kopolymery, polyoxyethylované polyoly (např. glycerol), polyvinylalkohol, a jejich směsi. Polyěthylenglykol propionaldehyd mohou mít výhodu při zpracování díky své stabilitě ve vodě.

Polymery mohou být jakékoliv molekulové hmotnosti a mohou být větvené nebo nevětvené. Pro polyěthylenglykol je preferovaná molekulová hmotnost v rozsahu od asi 2 kDa do asi 100 kDa pro usnadnění při manipulaci a zpracování (termín asi ukazuje, že v přípravku polyethylenglykolu budou některé molekuly mít vyšší .28 hmotnost a některé nižší, než je stanovená molekulová hmotnost). Mohou být použity jiné velikosti, v závislosti na požadovaném terapeutickém profilu (např. trvání zpomaleného uvolňování, účinky, pokud nějaké jsou, na biologickou aktivitu, snadnost manipulace, stupeň nebo chybění antigenicity nebo jiné známé účinky polyethylénglykolu na terapeutický protein nebo jeho varianty).

Počet takto připojených polymerových molekul se může lišit a odborník bude schopen zjistit účinky na funkci. Je možné monoderivatizovat, nebo je možno poskytnout di-, tri-, tetranebo některé kombinace derivatizace, se stejnými nebo různými chemickými skupinami (např. polymery, jako jsou různé hmotnosti polyethylénglykolu). Poměr polymerových molekul k proteinovým (nebo peptidovým) molekulám se může velmi lišit, stejně jako jejich koncentrace v reakční směsi. Obecně, optimální poměr (ve smyslu účinnosti reakce, ve které není přebytek nezreagovaného proteinu nebo polymeru) bude určen faktory jako je požadovaný stupeň derivatizece (např. mono-, di-, tri- atd.), molekulová hmotnost vybraného polymeru, to, zda je polymer rozvětven nebo nerozvětven a reakční podmínky.

Molekuly polyethylénglykolu (nebo jiných chemických skupin) by měly být připojeny na protein s uvážením účinků na funkční nebo antigení domény proteinu. Existuje velký počet metod pro připojení, které jsou odborníkům dosažitelné. Viz například EP 0 401 384, jehož objevy jsou zde uvedeny jako odkaz (připojování PEG na G-CSF), viz též Malík et al., Exp. Hematol., 20: 1028 - 1035, 1992 (popisující pegylaci GM-CSF za použití tresylchloridu). Například, polyethylenglykol může být kovalentně vázán na aminokyselinové zbytky přes reaktivní skupiny, jako je volná • »

amino nebo karboxylové skupina. Reaktivní skupiny jsou ty, na které se může vázat aktivovaná molekula polyethyienglykolu. Aminokyselinové zbytky mající volnou aminoskupinu mohou zahrnovat lysinové zbytky a N-koncové aminokyselinové zbytky. Ty, které mají volnou karboxylovou skupinu mohou obsahovat zbytky kyseliny aspartové, zbytky kyseliny glutamové a C-koncové aminokyselinové zbytky. Sulfhydrylové skupiny mohou také být použity jako reaktivní skupiny pro připojení molekuly polyethyienglykolu. Pro terapeutické účely je preferováno připojení aminoskupiny, jako je připojení N-koncové nebo lysinové skupiny. Je třeba se vyhnout připojení na zbytek významný pro vazbu na receptor, pokud je vazba na receptor žádoucí.

Je možné požadovat specificky N-terminálně chemicky modifikovaný protein. Za použití polyethyienglykolu jako ilustrace předkládaných kompozic je možné vybrat z množství polyethylenglykolových molekul (podle molekulové hmotnosti, větvení atd.), poměru molekul polyethyienglykolu a molekul proteinu (nebo peptidu) v reakční směsi, typu provedené pegylační reakce, a způsobu získání vybraného N-koncově pegylovaného proteinu. Způsobem získání N-koncově pegylovaného přípravku (t.j. separování této skupiny od jiných monopegylovaných skupin, pokud je to nutné) může být purifikace N-koncově pegylovaného materiálu z populace pegylovanýcji proteinových molekul. Selektivní N-koncová chemická modifikace může být provedena redukční alkylací, která využívá různé reaktivity různých typů primárních aminoskupin (lysinu versus N-koncové) dostupných pro derivatizaci určitého proteinu. Za vhodných reakčních podmínek je dosaženo v podstatě selektivní derivatizace proteinu na N-konci s karbonylovou skupinou obsahující polymer. Například, je možné selektivně N-koncově pegylovat protein provedením reakce při pH, které umožňuje využít výhody rozdílné pKa mezi e-aminoskupinou lysinových zbytků a a-aminoskupinou N-koncových zbytků proteinu. Takovou selektivní derivatizací je kontrolováno připojení ve vodě rozpustného polymeru na protein: konjugace s polymerem probíhá predominantně na N-konci proteinu a bez signifikantní modifikace jiných reaktivních skupin, jako jsou aminoskupiny postraních řetězců lysinu. Za použití redukční alkylace může být ve vodě rozpustný polymer typu popsaného výše, a měl hy mít jeden reaktivní aldehyd pro připojení na protein. Polyethylenglykolpropionaldehyd, obsahující jeden reaktivní aldehyd, může být použit.

Předkládaný vynález se týká použití derivátů, kterými jsou v prokaryontech exprivované GDNF nebo jeho varianty, vázaných na alespoň jednu molekulu polyethylenglykolu, stejně jako se týká použití GDNF, nebo jeho variant, připojených na jednu nebo více molekul polyethylenglykolu prostřednictvím acyl nebo alkyl vazby.

Pegylace může být provedena jakoukoliv pegylační reakcí známou v oboru. Viz například, Focus on Growth Factors, 3 (2): 4 - 10, 1992; EP 0 154 316, jejíž objevy jsou zde uvedeny jako odkaz; EP 0 401 384; a jiné publikace, které jsou zde citované a které se týkají pegylace. Pegylace může být provedena acylační reakcí nebo alkylační reakcí s reaktivní polyethylenglykolovou molekulou (nebo analogicky reaktivním ve vodě rozpustným polymerem).

Pegylace acylací obecně vyžaduje reakci aktivního esterového derivátu polyethylenglykolu s GDNF proteinem nebo variantou. Jakákoliv známá nebo v budoucnu objevená reaktivní PEG molekula může být použita pro pegylaci GDNF proteinu nebo varianty. Preferovaným aktivovaným PEG esterem je PEG · · * • · · » » • · · · u. · · · · »· r • · · · > »' ····· ·»··· ·» · esterifikovaný na N-hydroxysuccinimid. Jak je zde použito acylace zahrnuje bez omezení následující typy vazeb mezi terapeutickým proteinem a ve vodě rozpustným polymerem jako je PEG: amidovou, karbamatovou, urethanovou a podobně. Viz Bioconjugate Chem. 5: 133 - 140, 1994. Reakční podmínky mohou být vybrány z jakýchkoliv podmínek známých v oboru pegylace nebo těch, které budou dále vyvinuty, ale je třeba se vyhnout podmínkám teploty, rozpouštědlům a pH, které by mohly inaktivovat GDNF nebo varianty, které jsou modifikovány.

Pegylace nebo acylace obyčejně povede k poly-pegylovaným sloučenina podle předloženého vynálezu GDNF proteinům nebo variantám. Preferované bude spojující vazbou vazba amidová. Také preferovaně bude vzniklý produkt pouze (např. >

95%) mono-, di-, nebo tri-pegylovaný. Nicméně, některé druhy s vyšším stupněm pegylace mohou být tvořeny v množství závisejícím na specifických použitých reakčních podmínkách. Pokud je to žádoucí, mohou být více purifikované pegylované druhy separovány ze směsi, zejména nezreagované druhy, standardními purifikačními technikami, včetně, mimo jiné, dialýsy, vysolování, ultrafi 1trace, iontové výměnné chromatografie, gelové filtrační chromatografie a elektroforesy.

Pegylace alkylací obyčejně vyžaduje reakci koncového aldehydového derivátu PEG s GDNF proteinem nebo variantou za přítomnosti redukčního agens. Pegylace alkylací může také vést ke vzniku poly-pegylovaného GDNF proteinu nebo varianty. Kromě toho, je možné upravit reakční podmínky pro usnadnění pegylace v podstatě pouze na a-amino skupině N-konce GDNF proteinu nebo varianty (t.j. monopegylovaný protein). V případě monopegylace i polypegylace jsou PEG skupiny preferovaně připojeny na protein

prostřednictvím -CH2-NH- skupiny. S odkazem na -CH2- skupinu je tento typ vazby zde označován jako alkylová vazba.

Derivatizace cestou redukční alkylace za produkce monopegylovaných produktů využívá různé reaktivity různých typů primárních aminoskupin (lysin versus N-koncová) dostupných pro derivatizaci. Reakce je provedena při pH, které umožňuje využít výhody rozdílu pKa mezi e-aminoskupinou lysinových zbytků a a-aminoskupinou N-koncového zbytku proteinu. Takovou selektivní derivatizaci je kontrolováno připojení ve vodě rozpustného polymeru, který obsahuje reaktivní skupinu jako je aldehydová, na protein: konjugace s polymerem probíhá predominantně na N- konci proteinu a bez signifikantní modifikace jiných reaktivních skupin, jako jsou aminoskupiny postraních řetězců lysinu.

V jednom významném aspektu se vynález týká použití v podstatě homogenního přípravku konjugovaných molekul monopolymeru/GDNF protein (nebo varianta) (což znamená GDNF protein nebo varianta, na kterou byla molekula polymeru připojena v podstatě (t.j. >

95%) pouze jednom místě). Přesněji, pokud je použit polyethylenglykol, zahrnuje předkládaný vynález také použití pegylovaného GDNF proteinu nebo varianty, kterým chybí možné antigenní vazebné skupiny a které mají molekulu polyethylenglykolu přímo vázanou na GDNF protein nebo variantu.

Tak je míněno, že GDNF protein nebo varianty, které jsou použity podle předkládaného vynálezu, mohou obsahovat pegylovaný GDNF protein nebo varianty, kde je PEG skupina (y) připojena prostřednictvím acyl nebo alkyl skupin. Jak bylo uvedeno výše, takové proteiny mohou být monopegylovány nebo polypegylovány (např. mohou obsahovat 2 - 6, a lépe 2-5 PEG skupin. PEG skupiny jsou obyčejně připojeny na protein v a- nebo e33 * · · ·· ······ • · ···· · * · • · « · · ··· • ·· ·· ·· ···« • · * · · · · ·· ····· ·< · aminoskupinách aminokyselin, ale je také možné, aby byly PEG skupiny připojeny na jakoukoliv aminoskupinu připojenou na protein, která je dostatečně reaktivní pro připojení PEG skupiny za vhodných reakčních podmínek.

Molekuly polymeru použité jak v přístupu acylace, tak alkylace, mohou být vybrány z mnoha ve vodě rozpustných polymerů popsaných výše. Vybraný polymer by měl být modifikován tak, aby měl jednu reaktivní skupinu, jako je aktivní ester pro acylaci nebo aldehyd pro alkylaci, takže stupeň polymerizace muže být kontrolován jak je dáno v předkládaném způsobu. Příkladem reaktivního PEG aldehydu je polyethylenglykol propionaldehyd, který je stabilní ve vodě, nebo jeho mono Cl - CIO alkoxy nebo aryloxy deriváty (viz U.S. Patent 5252714). Polymer může být rozvětvený nebo nerozvětvený. Pro acylační reakce by polymer měl mít jednu reaktivní esterovou skupinu. Pro předkládanou redukční alkylaci by vybraný polymer měl mít jednu reaktivní aldehydovou skupinu. Obecně, ve vodě rozpustné polymery nebudou vybrány z přirozeně se vyskytujících glykosylových zbytků, protože tyto jsou obvykle vhodněji vyrobeny savčími rekombinantními expresními systémy. Polymer může být jakékoliv molekulové hmotnosti a může být rozvětvený nebo nerozvětvený.

Jednotlivým preferovaným ve vodě rozpustným polymerem pro —» použití ve vynálezu je polyethylenglykol. Jak je zde použito, znamená polyethylenglykol jakoukoliv formu PEG, která byla použita pro derivatizování jiných proteinů, jako je mono-(Cl CIO) alkoxy- nebo aryloxy-polyethylenglykol.

Obecně, chemická derivatizace může být provedena za jakýchkoliv vhodných podmínek použitých pro reakci biologicky

aktivních substancí s aktivovanou molekulou polymeru. Metody pro přípravu pegylovaných GDNF proteinů nebo variant budou obecně obsahovat kroky: (a) reakce GDNF proteinu nebo varianty s polyethylenglykolem (jako je reaktivní esterový nebo aldehydový derivát PEG) za podmínek, za kterých je protein připojen na jednu nebo více PEG skupin, a (b) získání produktu reakce. Obecně, optimální reakční podmínky pro acylační reakce budou určeny případ od případu na základě známých parametrů a požadovaných výsledků. Například, větší poměr PEG:protein, vyšší procento polypegylovaného produktu.

Redukční alkylace pro produkci v podstatě homogenní populace molekul konjugátů mono-polymer/GDNF protein (nebo varianta) bude obecně obsahovat kroky: (a) reakce GDNF proteinu nebo varianty s reaktivní PEG molekulou za podmínek redukční alkylace, při pH vhodném pro umožnění selektivní modifikace a-aminoskupiny na aminokonci uvedeného GDNF proteinu nebo varianty; a (b) získání reakčního produktu.

Pro v podstatě homogenní populace molekul konjugátů mono-polymer/GDNF protein (nebo varianta) jsou reakční podmínky redukční alkylace ty, které umožňují selektivní připojení skupiny ve vodě rozpustného polymeru na N-konec GDNF proteinu nebo varianty. Takové reakční podmínky obvykle poskytují pKa rozdíly mezi lysinovými aminoskupinami a a-aminoskupinou na N-konci (kde pKa je pH, při kterém je 50% aminoskupin protonováno a 50% nikoliv). pH také ovliivňuje poměr polymer ku proteinu, který je použit. Obecně, pokud je pH nižší, pak je požadován větší přebytek polymeru nad proteinem (t.j. s méně reaktivní N-koncovou a-aminoskupinou je potřeba více polymeru pro dosažení optimálních podmínek). Pokud je pH vyšší, pak nemusí být poměr

polymer:protein tak vysoký (t.j. čím reaktivnější skupiny jsou dostupné, tím méně molekul polymeru je potřeba). Pro účely předkládaného vynálezu bude obecně pH v rozsahu 3-9, preferovaně 3-6.

Jiným významným činitelem je molekulová hmotnost polymeru. Obecně, čím vyšší molekulová hmotnost polymeru, tím méně molekul polymeru může být připojeno na protein. Obdobně, větvení polymeru musí být vzato do úvahy při optimalizaci těchto parametrů.

Obecně, čím vyšší molekulová hmotnost (nebo více větvení), tím vyšší poměr polymer:protein. Obecně, pro pegylační reakce zde uváděné je preferovaná průměrná molekulová hmotnost okolo 2 kDa až do 100 kDa. Preferovaná průměrná molekulová hmotnost je od asi 5 kDa do asi 50 kDa, zejména od 12 kDa do asi 25 kDa. Poměr ve vodě rozpustného polymeru ku GDNF proteinu nebo variantě bude obvykle v rozsahu od 1:1 do 100:1, preferovaně (pro polypegylaci) 1:1 až 20:1 a (pro monopegylaci) 1:1 až 5:1.

Za použití podmínek ukázaných výše bude redukční alkylace poskytovat selektivní připojení polymeru na jakýkoliv GDNF protein nebo variantu mající a-aminoskupinu na amino konci a bude poskytovat v podstatě homogenní přípúravek konjugátu monopolymer/GDNF protein (nebo varianta). Termín monopolymer/GDNF protein (nebo varianta) konjugát jak je zde použit znamená kompozici složenou z jedné molekuly polymeru připojené na GDNF protein nebo GDNF variantní protein. Monopolymer/GDNF protein (nebo varianta) konjugát bude preferovaně mít molekulu polymeru umístěnou na N-konci, ale nikoliv na postranní aminoskupině lysinu. Přípravek by měl preferovaně obsahovat více než 90 % monopolymer/GDNF protein (nebo varianta) konjugátu, a ještě lépe více než 95 %

monopolymer/GDNF protein (nebo varianta) konjugátu se tím, že zbytek pozorovatelných molekul je nezreagován (t.j. proteinu chybí polymerová skupina).

Pro předkládanou redukční alkylaci by mělo být redukční agens stabilní ve vodném roztoku a preferovaně by mělo být schopné redukovat pouze Schiffovu basi tvořenou v počátečním procesu redukční alkylace. Preferovaná redukční agens mohou být vybrána z borohydridu sodného, kyanoborohydridu sodného, dimethylaminboranu, trimethylboranu a pyridinhoranu. Zejména preferovaným redukčním agens je kyanoborohydrid sodný. Jiné reakční parametry, jako je rozpouštědlo, reakční časy, teploty atd. a prostředky purifikace produktu mohou být určeny případ od případu na základě publikovaných informací týkajících se derivatizace proteinů s ve vodě rozpustnými polymery (viz publikace zde citované).

C. Farmaceutické kompozice GDNF proteinového produktu

Farmaceutické kompozice GDNF proteinového produktu typicky obsahují terapeuticky účinné množství GDNF proteinového produktu ve směsi s jedním nebo více farmaceuticky a fyziologicky akceptovatelnými materiály přípravku. Vhodné materiály pro formulaci zahrnují, ale nejsou omezeny na, antioxidanty, preservativa, barviva, ochucující a ředící agens, emulsifikační agens, suspendační činidla, rozpouštědla, plnidla, objemová agens, pufry, vehikula, ředidla, excipienty a/nebo farmaceutická adjuvans. Například, vhodným vehikulem může být voda pro injekce, fyziologický roztok, nebo arteficiální perilymfa, podle potřeby doplněné jinými materiály běžně používanými v kompozicích pro parenterální použití. Neutrální pufrovaný salinický roztok nebo

I salinický roztok smísený se sérovým albuminem jsou dalšími příklady vehikulí.

Primární rozpouštědlo ve vehikulu může být vodného nebo nevodného charakteru. Kromě toho, vehikulum může obsahovat jiné farmaceuticky akceptovatelné excipienty pro modifikaci nebo udržení pH, osmolarity, viskozity, čirosti, barvy, sterility, stability, stupně rozpuštění, nebo zápachu formulace. Obdobně může vehikulum obsahovat ještě jiné farmaceuticky akceptovatelné excipienty pro modifikaci nebo udržení stupně uvolňování GDNF proteinového produktu, nebo pro navození absorpce nebo penetrace GDNF proteinového produktu přes tympanální membránu. Takovými excipienty jsou ty substance, které jsou obvykle používány pro formulování dávek pro podání do středního ucha bud ve formě jedné dávky, nebo ve formě více dávek.

Jakmile byla terapeutická kompozice formulována, může být skladována ve sterilních nádobách jako roztok, suspense, gel, emulse, pevná látka nebo jako dehydratovaný nebo lyofi 1 izovaný prášek. Takové formulace mohou být skladovány bud ve formě připravené pro použití, nebo ve formě, např. lyofi 1 izované, která vyžaduje rekonstituci před podáním.

Optimální farmaceutické formulace budou odborníkem určeny v závislosti na okolnostech jako je způsob podání a požadovaná dávka. Viz například Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) strany 1435 - 1712, jejíž poznatky jsou zde uvedeny jako odkaz. Takové formulace mohou ovlivňovat fyzikální stav, stabilitu, stupeň uvolňování in vivo a stupeň in vivo clearense předkládaných GDNF proteinů, variant a derivátů.

I

Jiné účinné formy podání, jako jsou přípravky do středního ucha se zpomaleným uvolňováním, inhalační mlhy eho orálně aktivní formulace jsou také předpokládány. Například, v přípravcích se stálým uvolňováním mohou být GDNF proteinové produkty navázány nebo inkorporovány do jednotlivých přípravků polymerických sloučenin (jako je kyselina polymléčná, kyselina polyglykolová atd.) nebo do liposomů. Také může být použita kyselina hyáluronová, která může způsobit navození trvalé přítomnosti v cirkulaci. Farmaceutické kompozice GDNF proteinového produktu mohou také být formulovány pro podání do středního ucha, např. infusi nebo injekci do tympanální membrány a mohou také obsahovat přípravky se zpomaleným uvolňováním nebo trvalou cirkulací.

Takové terapeutické přípravky pro podání do středního ucha jsou typicky ve formě pyrogenú prostého, pro podání do středního ucha akceptovatelného vodného roztoku obsahujícího GDNF proteinový produkt ve farmaceuticky akceptovatelném vehikulu. Jedním preferovaným vehikulem je sterilní destilovaná voda.

Je také předpokládáno, že určité formulace obsahující GDNF proteinový produkt budou podány orálně. GDNF proteinový produkt, který je podán tímto způsobem, může být v kapslích a může být formulová s nebo bez nosičů obvykle používaných ve sloučeninách pro pevné dávkové formy. Kapsle mohou být vyrobeny tak, aby uvolňovaly aktivní část přípravku v místě gas-trointest inálního traktu, kde je biodostupnost maximalizována a pre-systemová degradace je minimalizována. Mohou být obsaženy další excipienty pro usnadnění absorpce GDNF proteinového produktu. Ředidla, dochucovadla, vosky s nízkou teplotou tání, rostlinné oleje, lubrikanty, suspendující agens, tablety desintegrující agens a pojivá mohou být také použity.

I

Formulace pro přípravky pro lokální podání do ucha, obsahující roztoky, suspenze a masti do středního ucha, jsou odborníkům dobře známé (viz Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, kapitola 86, str. 1581 - 1592, Mack Publishing Company, 1990). Jsou dostupné jiné způsoby podání, včetně injekcí do středního ucha a způsoby a prostředky pro produkci přípravků do středního ucha vhodných pro takové způsoby podání jsou také dobře známé.

Jak je použito v této přihlášce označuje střední ucho prostor mezi tympanální membránou a vnitřním uchem. Tato lokalitra leží externě vzhledem ke všem tkáním vnitřního ucha a není vyžadován invazivní postup pro přístup do tohoto regionu, pokud bude formulace vyvinuta tak, aby GDNF penetroval přes tympanální membránu. Jinak bude materiál zaveden do středního ucha injekcí přes tympanální membránu nebo, v případě, že je vyžadováno opakované podání, může být v tympanální membráně vytvořen otvor. Příklady takových systémů obsahují inserty a lokálně aplikované kapky, gely a masti, které mohou být použity pro dopravení terapeutického materiálu do těchto regionů.

Otevření tympanální membrány je velmi častá procedura prováděná ambulantním způsobem, v případech jako je infekce středního ucha (obvykle u dětí). Otvor se spontáně uzavře během několika dní.

V popisovaném použití GDNF proteinového produktu pro léčbu chorob a poruch vnitřního ucha je také výhodou, že lokálně aplikovaná formulace obsahuje agens pro navození penetrace nebo transportu terapeutického agens do středního nebo vnitřního ucha. Například, Ke et al., U.S. 5221696 popisuje použití materiálů pro zvýšení penetrace očních preparátů přes rohovku.

Systémy pro vnitřní ucho jsou ty systémy, které jsou vhodné pro použití uvnitř jakéhokoliv tkáňového kompártmentu, mezi nebo v okolí tkáňových vrstev vnitřního ucha, jako je kochlea nebo vestibulární orgán. Tyto lokality zahrnují různé struktury kochley jako je stria vascularis, Reissnerova membrána, Cortiho orgán, spirální ligamentum a kochleární neurony. Invazivní procedura nemusí být vyžadováno pro přístup k těmto strukturám, protože bylo ukázáno, že protein penetruje přes membránu okrouhlého okénka do perilymfy vnitřního ucha. Zejména vhodným vehikulem pro zavedení GDNF do vnitřního ucha penetrací přes membránu okrouhlého okénka je arteficiální perilymfa. Tento roztok se skládá z 10,00 mM D-glukosy, 1,5 mM CaCl, 1,5 mM MgCl v 1,0% roztoku Dulbeco fosfátem pufrovaného salinického roztoku v deionizované vodě při 280 - 300 mOsm a pH 7,2. Ještě jiný přípravek může obsahovat formulaci GDNF proteinového produktu s agens, jako jsou injektovatelné mikrosféry nebo liposomy pro střední ucho, který poskytuje pomalé nebo nebo trvalé uvolňování proteinu, který potom může být dopraven jako depotní injekce. Jinými vhodnými prostředky pro zavedení GDNF proteinového produktu do vnitřního ucha jsou impantovatelné prostředky pro podání léků nebo prostředky, které obsahují GDNF proteinový produkt a kochleární implantáty s kanálem, takže GDNF může být přes něj kontinuálně podáván do vnitřního ucha.

Přípravky pro ušní léčbu podle předkládaného vynálezu, zejména lokální přípravky, mohou obsahovat jiné složky, například pro střední ucho akceptovatelné preservativy, tonizující agens, korozpouštědla, komplexy tvořící agens, pufrovací agens, antimikrobiální látky, antioxidanty a surfaktanty, jak je v oboru dobře známo. Například, vhodná toníci tu zvyšující agens obsahují halogenidy alkalických kovů (zejména chlorid sodný nebo draselný)

manitol, sorbitol a podobně.Výhodně je přidáno dostatek tonicitu ovlivňujícího agens, takže formulace, která má být instilována do ucha je kompatibilní s osmolaritou endo a perilymfy. Vhodné preservativy zahrnují, ale nejsou omezeny na, benzalkochlorid, thimerosal, fenythyl alkohol, methylparaben, propylparaben, chlorhexidin, sorbic acid a podobně. Peroxid vodíku může být také použit jako preserativ. Vhodná korozpouštědla zahrnují, ale nejsou omezena na, glycerin, propylenglykol a polyethylenglykol. Vhodná komplexy tvořící agens obsahují kofein, polyvinylpyrrolidon, beta-cyklodextrin nebo hydroxypropyl-beta-cyklodextrin. Pufry mohou být běžné pufry jako je borátový, citrátový, fosfátový, bikarbonátový nebo Tris-HCl.

Komponenty formulací jsou přítomny v koncentracích, které jsou akceptovatelné pro podání do středního nebo vnitřního ucha. Například, jsou použity pufry pro udržení fyziologického pH kompozice nebo pro udržení o něco nižšího pH, typicky v rozsahu pH od asi 5 do asi 8.

Další složky formulací mohou obsahovat materiály, které prodlužují přítomnost podaného terapeutického agens ve středním uchu, takže maximalizují lokální kontakt a navozují absorpci přes membránu okrouhlého okénka. Vhodné materiály zahrnují polymery nebo gely tvořící materiály, které zvyšují vřskozitu přípravku do středního ucha. Vhodnost formulací podle předkládaného vynálezu pro kontrolované uvolňování (např. trvalé a prolongované podání) agens pro léčbu vnitřního ucha může být určena různými postupy známými v oboru. Ještě jiný ušní přípravek může obsahovat účinné množství GDNF proteinového produktu ve směsi s netoxickými pro střední ucho akceptovatelnými excipienty, které jsou vhodné pro výrobu tablet. Rozpuštěním tablet ve sterilní vodě, nebo v jiném

I

vhodném vehikulu, mohou být připraveny roztoky pro podání do středního ucha v jednotkové dávkové formě. Vhodné excipienty obsahují, ale nejsou omezeny na, inertní rozpouštědla, jako je uhličitan nebo hydrogenuhličitan vápenatý, laktosa, fosforečnan vápenatý nebo pojivá, jako je škrob, želatina nebo arabská guma.

Podání/dopravení GDNF proteinového produktu

GDNF proteinový produkt může být podán parenterálně subkutánně, intramuskulárně, intravenosně, transpulmonálně, transdermálně, intrathekálně nebo intracerebrálně. Pro léčbu chorobných stavů vnitřního ucha může být GDNF proteinový produkt podán přímo do středního ucha (nebo přímo do vnitřního ucha, zejména v případech, kde již proběhla invazivní procedura) lokální aplikací, insercí, injekcí, implantací, buněčnou terapií nebo genovou terapií. Například, implantáty se zpomaleným uvolňováním obsahující neurotrofní faktory umístěné v biodegradovatelné polymerové matrici mohou dopravit GDNF proteinový produkt. GDNF proteinový produkt může být podán extracerebrálně ve formě, která byla chemicky modifikována nebo obalena tak, že prochází hematoencephalickou barierou, nebo může být podán ve spojení s jedním nebo více agens, která jsou schopná navodit penetraci GDNF proteinového produktu přes barieru. Obdobně, GDNF proteinový produkt může být podán do středního nebo do vnitřního ucha, nebo může být podán ve vrcholu tympanální membrány ve spojení s jedním nebo více agens, která jsou schopna navodit penetraci nebo transport GDNF proteinového produktu přes membrány ucha. Frekvence dávkování bude záviset na farmakokinetických parametrech GDNF proteinového produktu jak je formulován a na způsobu podání.

I

Specifická dávka může být spočítána po uvážení tělesné hmotnosti, povrchu těla nebo velikosti orgánu. Další úprava výpočtů nezbytná pro určení vhodné dávky pro léčbu každou z výše uvedených formulací je rutinně odborníky prováděna a je v rozsahu rutinně prováděných testů, zejména ve světle informací o dávce a testů zde popsaných. Vhodné dávky mohou být ozřejměny za použití zavedených zkoušek použitých v konjunkci s vhodnými daty dávka odpověd. Odborníkům bude jasné, že dávka použitá ve formulacích pro podání do vnitřního ucha bude minimální ve srovnání s dávkou použitou pro systémovou injekci nebo orální podání. Konečný dávkový režim využitý ve způsobu pro léčbu výše uvedených stavů bude určen ošetřujícím lékařem, po zvážení různých faktorů, které modifikují účinek léčiv, např. věku, stavu, tělesné hmotnosti, pohlaví a diety pacienta, závažnosti jakékoliv infekce, době podání a jiných klinických faktorů. Jak budou prováděny studie, budou se objevovat další informace o vhodné dávkové hladině pro léčbu různých onemocnění a stavů.

Je předpokládáno, že kontinuální podání nebo trvalé podání GDNF může být pro danou léčbu výhodné. Pokud je kontinuální podání provedeno mechanickými prostředky, jako je infusní pumpa, pak je předpokládáno, že mohou být provedeny jiné způsoby kontinuálního nebo téměř kontinuálního podání. Například, chemická derivatizace nebo enkapsulace mohou^vést k formám proteinu s trvalým uvolňováním, které vedou ke kontinuální přítomnosti předvídatelného množství na základě určeného režimu dávkování. Tak mohou GDNF proteinové produkty obsahovat proteiny derivat izované nebo jinak formulované pro provedení takového kontinuálního podání.

Buněčná terapie GDNF proteinovým produktem, např. implantace buněk produkujících GDNF proteinový produkt do středního nebo do vnitřního ucha, je také předpokládána. Toto provedení bude vyžadovat implantaci buněk schopných syntesy a sekrece biologicky aktivní formy GDNF proteinového produktu pacientovi. Takové GDNF proteinový produkt produkující buňky mohou být buňky, které přirozeně produkují GDNF proteinový produkt (analogní k B49 glioblastomovým buňkám) nebo to mohou být rekombinantní buňky, jejichž schopnost produkovat GDNF proteinový produkt byla zvýšena transformací genem kódujícím požadovaný GDNF proteinový produkt ve vektoru pro navození jeho exprese a sekrece. Aby se minimalizovala potenciální imunologická reakce pacienta, kterému je podán GDNF proteinový produkt cizího druhu je preferováno, aby přirozené buňky produkující GDNF proteinový produkt byly lidského původu a aby produkovaly lidský GDNF proteinový produkt. Obdobně, je preferováno, aby rekombinantní buňky produkující GDNF proteinový produkt byly transformovány expresním vektorem obsahujícím gen kódující lidský GDNF proteinový produkt. Implantované buňky mohou být enkapsulovány pro vyloučení infiltrace okolní tkáně. Lidské nebo non-lidské zvířecí buňky mohou být implantovány pacientovi v biokompatibilnich, semipermeabilnich polymerových kontainerech nebo membránách, které umožňují uvolňování GDNF proteinového produktu, ale které brání destrukci buněk imunitním systémem pacienta nebo jinými škodlivými faktory z okolních tkání. Takové implantáty mohou například být připojeny na membránu okrouhlého okénka středního ucha a mohou produkovat a uvolňovat GDNF proteinový produkt přímo do perilymfy.

Je také zamýšleno, že vlastní buňky pacienta mohou být transformovány ex vivo pro produkci GDNF proteinového produktu mohou být implantovány přímo bez opouzdření. Například, mohou být

I ·· · · · · * · · · * · *·* * fc · «· • * Μ · « * · · * * · · · získány podpůrné buňky Cortiho orgánu, buňky mohou být kultivovány a transformovány vhodným vektorem a transplantovány zpět do vnitřního ucha pacienta, kde mohou produkovat a uvolňovat požadovaný GDNF protein nebo variantu GDNF proteinu.

Genová terapie GDNF proteinovým produktem in vivo je také plánována, zavedením genu kódujícího GDNF proteinový produkt do cílových buněk vnitřního ucha prostřednictvím lokální injekce konstruktu nukleové kyseliny nebo jinými přenosovými vektory. (Hefti, J. Neurobiol., 25: 1418 - 1435, 1994). Například, sekvence nukleové kyseliny kódujíc GDNF proteinový produkt může být obsažena v adeno-asociováném virovém vektoru nebo v adenovirovém vektoru pro přenos do buněk vnitřního ucha. Alternativní virové vektory zahrnují, ale nejsou omezeny na, retrovirové, virus herpes simplex a papilloma virové vektory. Fyzikální přenos, bud in vivo nebo ex vivo, může být také proveden liposomy zprostředkovaným transferem, přímou injekcí, (pouhá DNA), receptory zprostředkovaným přenosem (ligand - DNA komplex), elektroporací, precipitací fosforečnanem vápenatým nebo bombardováním mikročásticemi (genová zbraň).

Metodologie membránového opouzdření žijících buněk je podobná postupům v oboru používaným a příprava opouzdřených buněk a jejich implantace pacientovi může být provedena bez zbytečných pokusů. Viz např. U.S: patenty č. 4892538 a 5106627, kde každý z nich je zde uveden jako odkaz. System pro opouzdření žijících buněk je popsán v PCT přihlášce WO 91/10425 Aebischera et al., zde uvedené jako odkaz. Viz též PCP přihlášku WO 91/10470 Aebischera et al., Winn et al., Exper. Neuroí., 113: 322 - 329, Aebischer et al., Exper. Neuroí., 111: 269 - 275, 1991; Tresco et al., ASAIO, 38: 17 - 23, 1992, které jsou zde specificky uvedeny

I

* *

·.· * • · t · · jako odkazy. Techniky pro formulování mnoha dalších prostředků s trvalým nebo kontrolovaným uvolňováním, jako jsou liposomové nosiče, bio-erodovatelné částice nebo korálky a depotní injekce jsou také odborníkům v oboru známé.

Je třeba si také povšimnout, že formulace GDNF proteinového produktu, které jsou zde uvedené, mohou být použity pro veterinární použití stejně jako pro použití u lidí a že termín pacient by neměl být chápán omezeným způsobem. V případě veterinárního použití by měl být rozsah dávek stejný jak bylo specifikováno výše.

Jiné aspekty a výhody předkládaného vynálezu budou ozřejměny následujícími ilustrativními příklady. Příklad 1 popisuje účinek podání GDNF proteinového produktu na vláskové buňky kultivačního systému kochleárního explantátu. Příklad 2 popisuje účinek podání GDNF proteinového produktu na neurony spirálního ganglia v disociované buněčné kultuře generované z kochley. Výsledky studií kultur explantátu Cortiho orgánu a neuronálních kultur spirálního ganglia dospělé krysy ukazují, že GDNF proteinový produkt má neurotrofní a ochrannou aktivitu pro sluchové neurony a vláskové buňky Cortiho orgánu proti ototoxinům, kde u těchto nebylo dosud známo, že reagují na GDNF.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

GDNF proteinový produkt chrání kochleární vláskové buňky před ototoxici tou

I

Materiál:

Materiály použité v následujícím příkladu byly získány následujícím způsobem.

Pitevní roztok Cortiho orgánu:

Dulbeccův fosfátem pufrovaný salinický roztok (PBS; lx bez chloridu vápenatého, bez chloridu hořečnatého. kat. č. 14190-136, Gibco BRL), obsahující 1,5 g/1 D-glukosy (Dextrosa kat. č. 15023-021, Gibco-BRL).

Kultivační medium explantátů Cortiho orgánu:

1. Dulbeccovo modifikované Eagle medium s vysokým obsahem glukosy (DMEM; lx, s L-glutaminem, bez pyruvátu sodného, kat. č. 11965-084, Gibco-BRL).

2. 0,15 g/100 ml D-glukosy (Dextrosa kat. č. 15023-021, Gibco-BRL).

3. 1% N-2 Supplement (100 x, kat. č. 17502-030, Gibco-BRL).

4. 100 U/ml Penicilinu G, draselné soli (Penicillin; kat. č. 21840-020, Gibco-BRL).

Metody:

Příprava media

DMEM bylo doplněno 1% N-2 doplňkem a byla přidána D-glukosa do konečné koncentrace 1,5 g/1. Byl přidán penicilín 100 jednotek/ml. Po smísení bylo medium filtrováno a uchováváno při 4 °C. Medium bylo čerstvě připraveno těsně před pokusy, aby se

I

minimalizovaly variace mezi experimenty. Byly použity plastové pipety a kontainery, aby se minimalizovala absorpce proteinu.

Roztoky GDNF proteinového produktu

Purifikované lidské rekombinantní GDNF proteinové produkty byly připraveny jako 1 mg/ml roztoky v D-PBS (fosfátem pufrovaný salinický roztok připravený v destilované vodě) obsahujícím pětiprocentní hovězí sérový albumin. Roztoky byly skladovány při -85 °C v aliquotách. Byla připravena sériová ředění (0,1; 1; 10; 25; 50 ng/ml) na 96 jamkových mikroplotnách. Deset mikrolitrů desetinásobně koncentrovaných roztoků GDNF proteinového produktu bylo přidáno do kultivačního media explantátu Cortiho orgánu obsahujícího ototoxin nebo nikoliv (kontrola) (90 μΐ).Kontrolní kultury dostaly normální medium (10 μΐ). Ošetření GDNF proteinovým produktem začalo v den umístění do kultivačního media. Druhý den bylo medium vyměněno za medium obsahující pouze ototoxin, ototoxin s GDNF nebo bez obou těchto (kontrola).

Pitevní nástroje a kultivační plotny

1. 4 a 5 pitevní kleště a 4 pitevní skalpely byly od ROBOZ Surgical, Washington, DC.

2. Falcon sterilní 96-jamkové mikroplotny (ploché dno, kat. č. 3072), plastové výrobky pro tkáňové kultury a propylenové centrifugační tuby byly od Beckton-Dickinson, Lincoln Park, New Jersey.

Ototoxiny a s nimi spojená reagens

1. Roztok neomycinu (kat. č. N1142, Sigma. St. Louis, MO),

použitý v konečné koncentraci 0,6 mM (čerstvý roztok byl vyroben pro každý pokus přidáním 90 μΐ lmg/ml neomycinu do 1410 μΐ media).

2. Cisplatina (Platinol-AQ., kat. č. NDC 0015-3220-22, Bristol-Myers Squibb Laboratories, Princeton, New Jersey).

Použita v konečné koncentraci 35 pg/ml (čerstvý roztok byl vyroben pro každý pokus přidáním 52,5 μΐ lmg/ml cisplatiny do 1447,5 μΐ media).

3. Triton X-100 (t-oktylfenoxypoly-ethoxyethanol., kat. č. X-100, Sigma, St. Louis, MO).

4. Falloidin (FITC značený, kat. č. P-5282, Sigma, St. Louis, MO) .

5. Vectashield (Mounting Medium, kat. č. H-1000, Vector, Burlingame, CA).

Příprava krysího explantátů Cortiho orgánu

Explantáty Cortiho orgánu byly získány od P3-P4 Wistar krys. Krysy byly dekapitovány, dolní čelist byla nastřižena a kůže byla odstraněna. Temporální kost byla umístěna do pitevního roztoku, ušní kapsula byla odhalena a kostně-chrupavčitá kochleární kapsula byla opatrně separována od temporální~> kost i. uvolněná kochlea byla přčenesena do další Petriho misky s pitevním roztokem pro další pitvu. Intaktní Cortiho orgán byl získán za použití jemných klíštěk pro podržení centrální tkáně VIII nervu a pro jeho odstranění, potom byla opatrně roztřižena membrána stria vascularis, od apexu po basi. Cortiho orgán byl potom přenesen do Petriho misky o průměru 35 mm obsahující chladné PBS doplněné glukosou a připravéné pro kultivaci.

i • ·· ·· ··· • · β * * · • « * * « · • ·· · · ···· • * · · · » · · ·· ·· 4

Kultivační postupy kochleárních explantátů

Kochleární explantáty byly kultivovány na nepotažených 96 jamkových mikroplotnách. Jeden Cortiho orgán byl umístěn do jamky a udržován ponořený v mediu. Explantáty byly uchovávány v normálním mediu po 24 hodin (90 pg/jemku). Roztok GDNF proteinu (10 μΐ) byl přidán do léčených kultur a 10 μΐ media bylo přidáno do kontrol. Po 24 hodinách inkubace bylo medium vyměněno a explantáty byly vystaveny ototoxin-obsahujíčímu mediu (90 μΐ), s rostokem GDNF proteinu (10 μΐ) nebo bez něj (kontrola). Kultury byly kultivovány po další tři dny. Explantáty byly potom fixovány 4% paraformaldehydem v 0,1 M D-PBS po 30 minut při pokojové teplotě a byly zpracovány pro imunobarvení.

Barvení vláskových buněk FITC-faloidinem

Pro identifikaci a spočítání vláskových buněk v Cortiho orgánu byla použita metoda přímého imunobarvení pro označení aktinu přirozeně přítomného ve svazku stereocilií vláskových buněk. Explantáty byly promyty třikrát D-PBS (200 μΐ/jamku) a byly permeabi1 izovány 1% Triton X-100 v D-PBS po 15 minut při pokojové teplotě. Po trojím promytí v D-PBS byly explantáty inkubovány s FITC-značeným faloidinem (1:60 ze zásobníku, 50 μΐ/jamku) po 45 minut při pokojové teplotě. Plotny byly překryty hliníkovou folií, protože faloidin je citlivý na světlo. Po třech dalších proraytích D-PBS byly značené explantáty umístěny v kapce glycerolu na mikroskopickém sklíčku, překryty krycím sklíčkem a uzavřeny lakem na nehty. Explantáty byly prohlíženy na Nikon Diaphot - 300 invertovaném fluorescenčním mikroskopu, za použití FITC filtrů a fluorescenční optiky.

Určení počtu vláskových buněk

Pro každou část pokusy byly použity 2-4 kochley. V každé kochlee byl počet vláskových buněk počítán ve 2 - 3 řezech délky 175 pm. Byly analyzovány pouze řezy ve střední části kochley. Každý pokus byl několikrát opakován, počet vláskových buněk v kontrolách a cisplatinou nebo neomycinem ošetřených kulturách byl vytvořen z analýz 40 kochleí.

Výs1edky

Vláskové buňky v plovoucích kulturách explantátů neumíraly v průběhu pokusné periodu čtyřech dnů. Počet faloidinem se barvících buněk přítomných na konci 4 denní pokusné periody, za absence ototoxinú a ošetření, byl 105,4 + 6,9 (n=28). Ototoxiny přidané k explantátúm druhý den po umístění způsobovaly signifikantní ztrátu počtu vláskových buněk po 4 dnech in vitro. Expozice 35 pg/ml cisplatině 24 hodin po umístění do kultury způsobila ztrátu okolo 80% vláskových buněk: pouze 21,2 % + 6,0 (n=40) počátečního počtu buněk přežívalo (tabulka 2) a po expozici 0,8 mM neomycinu přežívalo pouze 7,4 % + 4,7 (n=43) vláskových buněk (tabulka 2).

I

Tabulka 2 účinek GDNF na kochleární vláskové buňky vystavené cisplatině

Přežívání vláskových buněk (% neošetřených)

Léčba

GDNF přidán v době umístění na plotnu

GDNF přidán 24 hodin po umístění na plotnu

Cisplatina samotná	21,3	+	4,0	(n =	30)	21,3	+	4,0 (n =	30)
Cisplatina +	35,2	+	5,4	(n =	·· 5)*		ND
GDNF, 0,05 ng/ml
Cisplatina +	39,6	+	10,5	(n	= 17)*	37,8	+	11,8 (n	= 5)*
GDNF, 0,1 ng/ml
Cisplatina +	46,7	+	10,8	(n	= 20)*	51,0	+	8,0 (n =	4)*
GDNF, 1 ng/ml
Cisplatina +	46,7	+	7,7	(n	= 16)*	49,7	+	4,6 (n =	5)*
GDNF, 10 ng/ml
Cisplatina +		ND			45,0	+	12,0 (n	= 3)*
GDNF, 25 ng/ml
Cisplatina +	46,8	+	10,5	(n	= 13)*			ND

GDNF, 50 ng/ml

GDNF byl zaveden do kultur explantátů bud v den umístění na plotnu, nebo 24 hodin po. Cisplatina (35 pg/ml) byla přidána 24 hodin po umístění na plotnu a kultury byly inkubovány po další 3 dny. Vláskové buňky byly barveny FITC-faloidinem. Počet vláskových buněk byl počítán ve střední části kochley ve 2 - 3 řezech po 175 pm. Výsledky jsou vyjádřeny jako procento vláskových buněk přítomných v neošetřené kultuře po 4 dnech in vitro (105,4 + 6,9; n=28). Každé číslo je průměr + SD n kochleí.

* Signifikantně odlišné od cisplatiny samotné při p<0,05 (t-test) ND - nedefinováno

I

Existoval zde jasný rozdíl v morfologii Cortiho orgánů mezi těmito dvěma ošetřeními: zatímco ošetření neomycinem vedlo k téměř kompletní ztrátě vláskových buněk, ty které byly uchovány byly stále organizovány v typické čtyřvrstevné struktuře (3 vrstvy zevních vláskových buněk a jedna vrstva vnitřních vláskových buněk). Ošetření cisplatinou, na druhé straně, způsobilo značné narušení čtyřvrstevné struktury a přežívající buňky byly náhodně rozmístěny.

V kulturách, které dostaly GDFN v době umístění na plotny (předošetření), přežíval signifikantní počet buněk 3-denní expozici ototoxinům (od dne 2 do dne 4). V kulturách vystavených cisplatině způsobilo ošetření GDNF v koncentracích 0,05 ng/ml zvýšení přežívání vláskových buněk ze 21 % (neošetřené kultury) na 35 %. Maximální ochranná aktivita byla dosažena při 0,1 ng/ml GDNF (41 % přežívání) (tabulka 3). V kulturách vystavených neomycinu zvyšoval GDNF v 0,1 ng/ml počet vláskových buněk ze 7 % na 22 %; maximální aktivity GDNF (37% přežívání) bylo pozorováno při 10 ng/ml GDNF (tabulka 3). Ošetření GDNF zachovalo čtyřvrstvou morfologii v neomycinem ošetřených kulturách, ale nezabránilo jejímu narušení cisplatinou.

Pro další testování schopnosti GDNF chránit vláskové buňky před ototoxicitou byla provedena sada pokusů, ve kterých byl GDNF přidán 24 hodin po umístění na plotny, ve stejné době, jako byly kultury vystaveny toxinúm (ko-ošetření). Výsledky ukazují, že za takovýchto podmínek testu je GDNF schopen chránit vláskové buňky ve stejném rozsahu jako když je podán před vystavením toxinu (tabulky 2 a 3).

I

Tabulka 3 účinek GDNF na kochleární vláskové buňky vystavené neomycinu

Přežívání vláskových buněk (% neošetřených)

Léčba době	GDNF přidán v umístění na plotnu	GDNF přidán 24 hodin
po umístění	na plotnu
Neomycin samotný 0,8mM	7,1 + 4,2 (n = 42)	7,1 ± 4,2	(n = 42)
Neomycin +	19,5 + 7,5 (n = 6)*	23,0 + 6,2	(n = 3)
GDNF, 0,05 ng/ml
Neomycin +	22,0 ± 4,1 (n = 13)*	27,0 + 14,7	(n = 3)*
GDNF, 0,1 ng/ml
Neomycin +	28,2 ± 6,1 (n = 19)*	26,2 + 6,4	(n = 4)*
GDNF, 1 ng/ml
Neomycin +	37,4 ± 4,8 (n = 11)*	ND
GDNF, 10 ng/ml
Neomycin +	34,4 ± 5,3 (n = 7)*	ND
GDNF, 50 ng/ml
GDNF byl zaveden do	kultur explantátů bud	v den umístění na
plotnu, nebo 24 hodin	po. Neomycin (0,8 M) byl přidán 24

hodin po umístění na plotnu a kultury byly inkubovány po další 3 dny. Vláskové buňky byly barveny FITC-faloidinem. Počet vláskových buněk byl počítán ve střední části kochley ve 2 - 3 řezech po 175 pm. Výsledky jsou vyjádřeny jako procento vláskových buněk přítomných v neošetřené kultuře po 4 dnech in vitro (105,4 + 6,9; n=28) Každé číslo je průměr + SD n kochleí.

I

Příklad 2

GDNF proteinový produkt navozuje přežívání sluchových neuronů vnitřního ucha (neuronů spirálního ganglia) a chrání je před ototoxiny.

Materiály:

Materiály použité v následujícím příkladu byly získány následovně.

Buněčná kultivační media

Dulbecco modifikované Eaglovo medium s vysokým obsahem glukosy (DMEM, č. 11965 - 092), Hamovo F12 medium (F12; č. 11765 - 021),

B 27 doplněk media (č. 17504 - 010), penicilin/streptomycin (č. 15070 - 014), L-glutamin (č. 25030 - 016), Dulbeccův fosfátem pufrovaný salinický roztok (D-PBS; č. 14190 - 052), myší laminin (č. 23017 - 015), hovězí sérový albumin a frakce V (č. 110 - 18 - 017) byly získány od Gibco-BRL, Grand Island, NY. Teplem inaktivované koňské sérum bylo od HyClone, Logan, Utah. Hydrobromid poly-L-ornitinu (P-3655), hovězí insulin (1-5500), lidský transferin (T-2252), putrescin (P-6024), progesteron (P—6149) a selenit sodný (S-9133) byly všechny od Sigma Chemical Company, Saint Louis, MO. Papain, deoxyribonukleasa I (DNAsa) a ovalbumin (Papainový disociační systém) byly od Worthington Biochemicals, Freehold, NJ. Falcon sterilní 96-jamkové mikroplotny (č. 3072), plastové výrobky pro tkáňové kultury a propylenové centrifugační tuby byly od

Beckton-Dickinson, Oxnard, CA. Nitex 20 pm nylonová síť (č. 460) byla od Tetko, Elmsford, NY. 4 pitevní kleště a 4 pitevní skalpely byly od ROBOZ Surgical, Washington, DC.

»·· · » » »· ····« ····· *· ·

Protilátky a s nimi spojená reagens

Králičí polyklonální protilátka pro neuron specifickou enolázu (NSE) byla od Chemicon (č. AB951), biotynylovaný kozí anti králičí IgG (č. BA - 1000) a peroxidasa konjugovaný avidin/biotin komplex (BAC Elitě; kit PK - 6100) byly od Vector Laboratories, Burlingame, CA. 3', 3' - diaminobenzidine byl od Cappel Laboratories, West Chester, PA. Superblock blokující pufr v PBS (č. 37515) byl od Pierce, Rockford, IL. Triton X - 100 (X-100), nonidet P-40 (N6507) a peroxid vodíku (30% objem/objem; H1009) byly od Sigma. Všechna další činidla byla získána od Sigma Chemical Company (Saint - Louis, MO), pokud není jinak upřesněno.

Ototoxiny

Cisplatona (Platinol - AQ, č. NDC 0015 - 3220 - 22) byla od Bristol - Myers - Squibb, Princeton, NJ, salicylát sodný byl od J. T. Baker, Phi11ipsburg, NJ. (č. 3872 - 01) a neomycin byl od Sigma (č. NI 142).

Metody

Příprava media

Bazální medium bylo připraveno jako 1:1 směs DMEM a F12 media a bylo doplněno B27 doplňkem media, který byl přidán jako 50-násobek koncentrace zásobního roztoku. B27 doplněk media se skládal z biotinu, L-karnitinu, kortikosteronu, ethanolaminu, D(+)-galaktosy, redukovaného glutathionu, kyseliny linoleové, kyseliny linolenové, progesteronu, putrescinu, retinylacetátu, selenu, T3 (trijodo - 1 - thyroninu, DL-alfa-tokoferolu; vitaminu

I

Ε), DL-alfa tokoferolacetátu, hovězího sérového albuminu, katalasy, insulinu, superoxid dismutasy a transferinu. L-glutamin byl přidán v konečné koncentraci okolo 2 mM, penicilín asi 100 IU/1 a streptomycin asi 100 mg/1. Teplem inaktivované koňské sérum bylo přidáno do konečné koncentrace okolo 2,5 procent, D-glukosa byla přidána do konečné koncentrace asi 5 g/1, HEPES pufrovací agens bylo přidáno do konečné koncentrace asi 20 mM, hovězí inzulín byl přidán do konečné koncentrace asi 2,5 mg/ml a lidský transferin byl přidán do konečné koncentrace asi 0,1 mg/ml. Po smísení bylo pH upraveno na asi 7,3 a medium bylo uchováváno při 4 °C. Medium bylo čerstvě připraveno těsně před použitím, aby se minimalizovaly variace mezi experimenty. Byly použity plastové pipety a kontainery, aby se minimalizovala absorpce proteinu.

Roztoky GDNF proteinového produktu

Purifikované lidské rekombinantní GDNF proteinové produkty byly připraveny jako 1 mg/ml roztoky v D-PBS (fosfátem pufrovaný salinický roztok připravený v destilované vodě) obsahujícím pětiprocentní hovězí sérový albumin. Roztoky byly skladovány při

-85 °C v aliquotách. Byla připravena sériová ředění na 96 jamkových mikroplotnách. Deset mikrolitrú desetinásobně koncentrovaných roztoků GDNF proteinového produktu bylo přidáno —* do buněčných kultur obsahujících kultivačního medium (90 μΐ).Kontrolní kultury dostaly D-PBS s 5 procentním albuminem (10 μΐ). Ošetření GDNF proteinovým produktem začalo jednu hodinu poté, co byly buňky umístěny na plotny nebo o 24 hodin později, bud samostatně nebo spolu s ototoxiny.

e · » · * · ·· ··«· «·· ·«· » · •c· ·· ····· · · ·

Příprava ototoxinů

Neomycin byl přidán ze zásobního rostoku (okolo ΙΟ³ M) v 10 μΐ na jamku za vzniku konečné koncentrace okolo 10~⁴ M.

Cisplatina byla ředěna kultivačním mediem ze zásobního roztoku (1 mg/ml) na roztok 20 pg/ml a přidána v dávce 10 μΐ na jamku za dosažení konečné koncentrace 2 pg/ml. Salicylát sodný byl připraven z prášku na zásobní roztok o 1 M v PBS a byl dále ředěn v kultivačním mediu na 100 mM, což vedlo ke konečné koncentraci 10 mM, když byl přidán v dávce 10 μΐ/jamku do kultury.

Kultivační substrát

Pro zajištění optimýálního připojení buněk spirálního ganglia na substrát a růstu neuritů byly povrchy mikrotitračních ploten (kultivační substrát) modifikovány sekvenčním potažením poly-L-ornithinem, po kterém následovalo potažení lamininem podle následujícího postupu. Povrchy ploten byly úplně pokryty 0,1 mg/ml sterilního roztoku polyornithinu v 0,1 M kyselině borité (pH 8,4) po alespoň jednu hodinu při pokojové teplotě, potom následovalo sterilní promytí Super-Q vodou. Voda byla potom aspirována a byl přidán 10 pg/ml roztok myšího lamininu v PBS a byl inkubován při 37 °C po dvě hodiny. Tyto procedury byly provedeny těsně před použitím ploten, aby se-zajistila reprodukovatelnost výsledků.

Příprava kultur buněk krysího spirálního ganglia

Tři až čtyři týdny staré Wistar krysy (získané od Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) byly předávkovány injekcí následujícího roztoku: (ketamin (100 mg/ml); Xylazin (20 mg/ml) a

I

Acopromazin maleát 910 mg/ml) v poměrech 3:3:1), usmrceny dekapitací a byla vypitvána temporální kost s kochleou a byla sterilně přenesena do PBS s 1,5 g/1 glukosy na led. Na pokus bylo zpracováno maximálně 30 kochleí. Kochlea byla otevřena a Cortiho orgán s kostěným modiolem byl odebrán do 50 ml skleněné zkumavky obshující 5 ml disociačního media (120 jednotek papainu a 2000 jednotek DNAsy v HBSS). Tkáň byla inkubována po 30 minut při 37 °C na rotační třepačce ploten při asi 200 rpm a potom byl disociační roztok nahrazen čerstvím a inkubace pokračovala po dalších 30 minut. Buňky byly potom disperzovány triturací přes ohněm leštěné Pasteirovy pipety, procezeny přes 40 pm Nitex nylonovou síť pro odstranění nedisociované tkáně a centrifugovány po pět minut při 200 x g za použití IEC klinické centrifugy. Vzniklá buněčná peleta byla resuspendována v HBSS obsahujícím ovalbumin a asi 500 jednotek DNAsy, umístěna na povrch čtyřprocentního roztoku ovalbuminu (v HBSS) a centrifugována po asi 6 minut při 500 x g. Konečná peleta byla resuspendována v asi 6 ml kultivačního media a umístěna v množství 90 μΐ/jamku na předem potažených plotnách.

Imunohistochemie buněk spirálního ganglia

Neurony spirálního ganglia byly identifikovány imunohistochemickým barvením pro neuron specifickou enolasu (NSE). Kultury buněk spirálního ganglia byly fixovány po asi 10 minut při pokojové teplotě osmiprocentním formaldehydem v D-PBS, pH 7,4, přidány v objemu 100 μΐ/jamku ke kultivačnímu mediu a potom odstraněny čtyř procentním formaldehydem po dalších 10 minut, a potom následovaly tři promytí v D-PBS (100 μΐ na 6 - mm jamku). Fixované kultury byly potom inkubovány v Superblock blokujícím pufru v PBS, obsahujícím jedno procentní Nonidet P-40 /

pro zvýšení penetrace protilátky. Králičí polyklonální anti-NSE protilátky (Chemicon) byly potom aplikovány v ředění 1:6000 ve stejném pufru a kultury byly inkubovány po další dvě hodiny při 37 °C na rotační třepačce. Po třech promytích D-PBS byly protilátky navázané na buňky spirálního ganglia detekovány za použití kozího anti králičího biotiny1 ováného IgG (Vectastain kit od Vector Laboratories, Burlingame, CA) v ředění asi 1:300. Sekundární protilátka byla inkubována s buňkami po asi jednu hodinu při 37 °C, buňky byly potom promyty třikrát D-PBS. Sekundární protilátka byla potom značena komplexem avidin biotin - peroxidasa ředěným 1:300 a buňky byly inkubovány po dobu asi 60 minut při 37 °C. Po třech dalších promytích D-PBS byly značené buněčné kultury reagovány po 5 minut v roztoku 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, obsahujícím 0,04% 3', 3' diaminobenzidin-(HCl) 4, 0,06 procentní N1CI2 a 0,02 procentní peroxid vodíku.

Určení přežívání buněk spirálního ganglia

Po různé době v kultuře (24 hodin, 3 dny a 4 dny) byly kultury buněk krysího spirálního ganglia fixovány, zpracovány a imunobarveny na NSE jak bylo popsáno výše a kultury byly potom vyšetřovány optikou s jasným světlem při 200xnásobném zvětšení. Byly počítány všechny NSE-pozitivní neurony přítomné v 6-mm jamkách. Životaschopné buňky spirálního ganglia byly charakterizovány jako mající okrouhlé tělo v rozsahu od 15 - 40 pm a mající neuritické výběžky. Buňky spirálního ganglia vykazující degeneraci, jako je nepravidelné, vakuolizované perikaryum nebo fragmentované neurity, byly z počítání vyloučeny většina z degenerujících buněk spirálního ganglia, nicméně, byla oddělena z z kultivačního substrátu). Počet buněk byl vyjádřen

bud jako buňky/6-mm jamku nebo jako násobek změny vzhledem k densitě kontrolních buněk.

Výsledky

Kultury neuronů krysího spirálního ganglia byly použity pro demonstraci účinku GDNF proteinového produktu na přežívání a ochranu proti ototoxinúm. Buňky spirálního ganglia byly získány z kochleí tři až čtyři týdny starých krys. Disociované buňky byly potom umístěny na polyornithinem-lamininem potažené mikroplotny v hustotě asi 1 kochlea na 2 jamky v DMEM/F12 doplněném B27 doplňkem media, 2,5 procentním teplem inaktivovaným koňským sérem, D-glukosou, HEPES, inzulínem a transferinem. Kultury se skládaly ze směsi neuronů a non-neuronálních buněk. Nicméně, jedinými přítomnými neurony byly neurony spirálního ganglia a byly identifikovány přítomností NSE imunoreaktivity. Při použité koncentraci (1 disociovaný Cortiho orgán na 2 jamky) byl počet NSE pozitivních buněk na jamku 24 hodin po umístění 127 + (n = 7) za kontrolních podmínek (žádné další ošetření). Na konci pokusu, čtyři dny po umístění na plotny, byl počet neuronů redukován na 64 + 4,7, což representuje 50,5 + 3,7 počtu přítomného po 24 hodinách in vitro, za kontrolních podmínek.

Účinek podání GDNF proteinového produktu byl hodnocen na přežívání a morfologickém dozrávání kultivovaných neuronů krysího spirálního ganglia, stejně jako na jejich schopnosti resistence na toxické účinky známých ototoxinů jako je cisplatina. Kultury buněk spirálního ganglia byly ošetřeny 24 hodin po umístění na plotny lidským rekombinantním GDNF proteinovým produktem (v rozsahu od 50 ng/ml do 0,1 ng/ml) samotným, nebo v kombinaci s cisplatinou (35 pg/ml). 24 hodin po umístění na plotny nebyl rozdíl v počtu sluchových neuronů mezi kontrolními kulturami a

I kulturami ošetřenými GDNF v množství 1 ng/ml a 10 ng/ml (127 +

17; 126 + 24 a 125 + 19 neuronů na jamku, v příslušném pořadí).

Po další periodě 3 dní nevedlo ošetření GDNF v koncentraci 1 ng/ml ke signifikantnímu zvýšení počtu buněk. Byl zde, nicméně, znatelný trofický účinek: tělo neuronů bylo větší a vlákna delší a více propracované než v kontrolních kulturách. V kulturách ošetřených 10 ng/ml GDNF bylo po 24 hodinách přítomnbo 72% přežívajících neuronů, což representuje 44% zvýšení vzhledem ke kontrolním kulturám (tabulka 4). Trofický účinek byl ještě silnější než v kulturách ošetřených 1 ng/ml GDNF.

GDNF také chránil neurony spirálního ganglia před toxicitou cisplatiny (tabulka 4). Expozice kultur 5 pg/ml cisplatiny 24 hodin po umístění na plotny vedlo ke ztrátě přibližně 94 % počátečního počtu (po 24 hodinách) neuronů po 4 dnech kultivace. Pokud byů GDNF přidán společně s cisplatinou, byl počet neuronů nalezený po 4 dnech signifikantně vyšší. Tento ochranný účinek GDNF byl závislý na dávce: 20,1 + 5,1; 27,5 + 3,2; a 32,8 + 1,0 neuronů přítomných při začátku toxické léčby bylo nalezeno při koncentrací GDNF 1 ng/ml, 10 ng/ml a 25 ng/ml v příslušném pořadí (data nejsou ukázána). Tyto výsledky ukazují, že asi 63 procent neuronů, které reagují na GDNF (okolo 44 % populace neuronů spirálního ganglia) může také být chráněno před toxicitou cisplatiny.

I

Tabulka 4

Účinek GDNF na přežívání neuronů spirálního ganglia

Přežívání neuronů spirálního ganglia (% počátečního počtu po 24 hodinách)

Ošetření

2ádné

GDNF, 10 ng/ml

Žádné

48.5 + 4,5 (n = 9)

71.6 + 7,4** (n = 5)

Cisplatina (5 pg/ml)

6,1 ± 1,2 (n = 3)

32,8 + 1,0 * (n = 3)

GDNF a cisplatina byly přidány ke kulturám disociovaných neuronů spirálního ganglia 24 hodin po umístění na plotny.

Kultury byly inkubovány po další tři dny a počet neuronů byl určen počítáním NSE imunoreaktivních buněk. Počet neuronálních buněk je vyjádřen jako procento neuronů přítomných po 24 hodinách in vitro. Každý výsledek je průměrem + SD n kultur.

* Signifikantně se liší od cisplatiny samotné- v p < 0,05 (t-test) ** Signifikantně se liší od neošetřené kontroly v p < 0,05 (t-test) • * · fe * • · * • · · » · · ·

Příklad 3

GDNF proteinový produkt navozuje in vivo přežívání kochleárních vláskových buněk

Následující příklad ukazuje, že podání GDNF proteinového produktu do vnitřního ucha chrání vláskové buňky kochley před ototoxicitou ve zvířecím modelu. GDNF byl zaveden do vnitřního ucha prostřednictvím kanyly zavedené do scala tympani přes otvor provrtaný v bazálním závitu kochley. Kanyla byla připojena na Alzet minipumpu naplněnou GDNF (50 ng/ml) s rychlostí uvolňování 0,5 μΐ/hod po 14 dní. S i.m. injekcemi cisplatiny se začalo dva dny po kanylaci, bud 1 mg/ml denně po 15 dní nebo 7,5 mg/kg dvakrát, v pětidenních intervalech (podle obrázku 2). Pokus byl ukončen po 27 dnech. Vláskové buňky byly barveny FITC-faloidinem a jejich počet byl určen ve středním závitu kochley (v alespoň 20% části středního závitu). Výsledky jsou vyjádřeny jako procento ztráty vláskových buněk pro každé jednotlivé morče pro GDNF ošetřené ucho (pravé ucho) a neošetřené ucho (levé ucho).

Materiály

Materiály použité v následujícím přikladu byly získány následovně.

Materiály pro přípravu minipumpy:

Lékařská vinylová trubička velikost V/4, katalogové č. BB317-85 byla od Bolab Products ((800) 331 - 7724). Byl použit Fisherův typ 5 ml plastových pipet. Byla použita mikrolumenová polyimidová tuba, katalogové č. 8004853 OG (Tampa, Florida). Silicone Medical Product MDX 4-4210 byl od Dow Corning

I i

Corporation, Midland, MI. Alzet osmotická minipupma upravující průtok a Alzet osmotická minipumpa, katalogové č. 2002 byly od Alza corp., Palo Alto, CA. Tápe (TimeMed Tápe). Prosil - 28, produkt č. 11975 - 0 byl od PCR Incorporated, Gainesville Florida. Purifikované lidské GDNF proteinové produkty byly připraveny jako 50 ng/ml roztok v D-PBS a 0,1% BSA. Sterilní 0,1% methylenová modř (katalogové č. M-9140) rozpuštěná v PBS a minerální olej (katalogové č. 400-5) byly od Sigma.

Postupy přípravy minipumpy

Vinylová tuba byla rozstříhána na přibližně čtyřpalcové části a ty byly umístěny do miniaturního svěráku. Kus Microlumen polyimidové tuby (7 mm) byl umístěn do konce vinylové tuby. Silikon byl smísen přidáním přibližně 10 částí základu a jedné části tvrdidla agens. Kapka byla umístěna v otvoru vinylové tuby za pomoci jemné sondy a Microlumen tuba byla zasunuta do vinylové, za ponechání 3,75 mm délky přesahující z vinylové tuby. Za použití kapky silikonu na sondě byl vytvořen malý balónek okolo Microlumen tuby, 0,5 mm od konce a vysychání proběhlo přes noc.

Průměr 5 ml pipety byl zvýšen aplikací tří koncentrických vrstev pásky na dolní konec pipety. Byly ponechány konstantní mezery, kde zůstala pipeta nepokryta. V/4 tubá byla omotána okolo pipety a závity byly upraveny tak, aby zde byly dva volné konce tuby a aby byl kontinuální kontakt mezi všemi závity. Dva tenké proužky pásky byly spojeny a okraji pásky na pipetě pro zajištění umístění závitů.Dvě tenké linie super lepidla byly naneseny rovnoměrně na závity. Po minimálně jednohodinovém zaschnutí byly volné konce uspořádány přibližně paralelně k pipetě a zajištěny na místě jedním proužkem pásky. Byla nanesena kapka superlepidla • ·

* v » »· · >

pro zajištění tuby na závitech. Následovalo zasychání přes noc, páska byla odstraněna a závity byly staženy z pipety. Moderátor průtoku byl připojen na jeden z volných konců a zajištěn kapkou superlepidla.

Závity byly propláchnuty 1% Prosil - 28 ve vodě, vypláchnuty vodou a potom promyty 70% ethanolem. Ethanol byl odstraněn injekční stříkačkou nebo vakuem. Závity byly umístěny ve vakuové sušičce po alespoň 30 minut a byly ponechány přes noc v uzavřené a těsné sušičce a potom následovala sterilizace plynem. Během plnění byly závity udržovány pokud možno horizontálně, aby se zabránilo gravitačnímu pohybu kapalného GDNF, oleje a barviva. Tvorba vzduchových bublin v pumpě nebo závitech byla vyloučena. Pumpa byla ponořena do sterilního PBS a inkubována přes noc při 37 °C.

Plnění pumpy methylenovým barvivém bylo provedeno udržováním pumpy ve vertikální poloze. Barvivém naplněná stříkačka byla kompletně vložena do pumpy a barvivo bylo injikováno dokud nebyla pumpa naplněna. Injekce jakýchkoliv vzduchových bublin do pumpy byla vyloučena. Krátká část V/4 tuby byla umístěna do moderátoru průtoku. GDNF byl plněn v koncentraci 50 ng/ml v PBS + 0,1% BSA, v celkovém objemu 230 μΐ, do asi 10 mm konce kanyly, za použití injekční stříkačky připojené na V/4 tubu. Pro kontrolní pokus byl stejný objem PBS + 0,1% BSA naplněn do pumpy. Krátká část V/4 tuby byla odstraněna. Potom byl naplněn minerální olej do závitu injekční stříkačkou tak, aby byl 2 mm vzduchový prostor a 7 mm minerálního oleje vloženy mezi tekutinou v pumpě a tekutinou v tubě (infusní tekutina). Moderátor průtoku byl kompletně vložen do pumpy.

I

Inserce pumpy do vnitřního ucha

Materiály

Tkáňové adhesivní lepidlo - kyanoakrylát bylo od Vetbond Tissue Adhesive, 3M Animal Care Products, St. PAul, MN.

Karboxylatový cement ESPE Durelon, katalogové č. 03828 byl od ESPE-Premier Sales Corp., Norristown, PA. Methylmethakrylát byl od Lang Jet Acrylic, Lang Dental MFG, Co., Wheeling, IL. Pitevní nástroje byly od Roboz Surgical. Byl použit xylazin, ketamin a buprenorfin. Lubricant Opthalmic ointment (AKWA Tears) byla od Akorn lne., Abita Springs, LA. 2% xylokain, katalogové č. NDC 0186-0160-01, byl od ASTRA. Medical Grade Silicone Grease, výr. č. 51300, byl od Unimed. Durelon Pulver práškový karboxylátový cement, katalogové č. D-82229, byl od ESPE, Seefeld. Sulfátová mast (Bacitracin Zinc-neomycin, katalogové č. 0168-0012-31) byla od Fougera.

Postupy

Albino morčata (250 - 350 g) byla anestezována směsí xylazinu 10 mg/kg, ketaminu 40 mg/kg a buprenorfinu 0,05 mg/kg. Oblast pravého ucha byla kaudálně vyholena, od asi 2 cm anteriorně od vertexu do 4 - 5 cm posteriorně od lopatky a postaurikulárně. Vyholená oblast byla omyta betadinem. Lubrikáňní oční mast byla aplikována na obě uši. Xylokain byl injikován subkutánně do tkání, které mají být incidovány. Za použití aseptické techniky byla provedena postauriculární incize. Za použití tenké jehly byl vyvrtán otvor do bully pro obnažení středoušní dutiny a vizualizaci kochley. Malý otvor byl manuálně vyvrtán do kostěné stěny bazálního závitu, pod okruhlým okénkem za použiti tenké jehly. Konec kanýly byl vložen do otvoru, dokud silikonová kapka i

nedosedla na kost, což umístilo konec kanyly asi doprostřed kanálu ve scala tympani. Kapka kyanoakrylátu byla umístěna do otvoru v bulle. Karboxylátový cement byl umístěn v okolí kanyly přes cyanoakrylát. Po vytvrdnutí cementu bylo umístění potvrzeno a zbytek otvoru byl překryt karboxylátovým cementem na vrstvě siliconového tuku. byla vytvořena subkutánní kapsa mezi lopatkami pro umístění pumpy, která byla insertována. Subkutánní kapsa byla vypláchnuta 3 ml roztoku nitrofurazonu rozpuštěného ve sterilním PBS a potom byla naplněna 3 ml sterilního PBS plus 1% gentamycin pro prevenci infekce. Po aplikaci nitrofurazonového prášku okolo rány byla incize uzavřena klipy.

Ohlušení

Materiály:

Cisplatina (Platinol - AQ), katalogové č. NDC 0015-3220-22, byla od Bristol-Myers Squibb Laboratories, Princeton. N.J.

Postup:

Injekce cisplatiny (i.p.) začaly dva dny po implantaci minipumpy. byly použity dva režimy dávkování: bud dvě 7,5 mg/kg injekce v 5 denních intervalech, nebo 1 mg/kg denně, po 15 dní.

Perfuze:

Po čtyřech týdnech byla morčata uvedena do hluboké anestezie směsí xylazinu a wketaminu a byla provedena transkardiální perfuse jako led chladným PBS následovaná perfusí jako led chladným 4% paraformaldehydem v PBS. Temporální kost byla odstraněna a kostěná kochlea byla umístěna ve 4% paraformaldehydu

I • · pro postfixaci přes noc při 4 °C.

Barvení:

Úprava povrchu a barvení faloidinem byly použity pro barvení vláskových buněk. Kostěná kochlea byla otevřena tenkou jehlou nebo čepelí č. 11. Stria vaskularis byla odstraněna za použití jemných klíštěk. V Petriho misce naplněné PBS byla bazální membrána pečlivě oddělena od kostěného modiolu, za použití tenkých jehel. Byla vynaložena snaha pro její odstranění v intaktním stavu. Postup barvení faloidinem byl podobný postupu provedenému pro in vitro explantáty, s následujícími změnami: permeabi1 izace byla provedena po 20 - 30 minut a faloidin byl přidán na 90 minut. Apex, střední závit a bazální závit byly připevněny na 60 x 22 skleněná krycí sklíčka. Byla přidána kapka VECTASHIELD media a vzorky byly překryty 22 x 22 mm krycími sklíčky a zality lakem na nehty pro zabránění odpaření.

Analýzy dat:

Každá kochle byla vyšetřena pod mikroskopem s FITC filtrovacím setem. Osm segmentů s největší ztrátou vláskových buněk ze středního závitu bazální membrány bylo vybráno a fotografováno za použití připojeného počítačové tiskárny. Počítání vláskových buněk bylo provedeno manuálně, za použití fotografií. U každého zvířete byla srovnávána ztráta vláskových buněk v levém uchu (jako kontrola, t.j. bez infuse GDNF) vůči ztrátě vláskových buněk v pravém uchu (s infusí GDNF).

Výsledky:

Injekce cisplatiny vedly k signifikantní ztrátě vláskových

I buněk v kochlei. tato ztráta, v řezech středního závitu analyzovaných v levém uchu třech morčat injikovaných cisplatinou 1 mg/kg denně po 15 dní, byla 49,2%; 21,2% a 46,9%. Také u morčete, kterému bylo injikováno 7,5 mg/kg cisplatiny dvakrát, místo 1 mg/kg denně, byla ztráta 42% vláskových buněk v levém uchu. Zavedení GDNF do pravého vnitřního ucha každého morčete vedlo k signifikantnímu snížení ztráty vláskových buněk. Poměry mezi počtem ztracených vláskových buněk a celkovým počtem vláskových buněk v kochlei byly následující: 241/486; 113/530 a 244/513 v levém uchu, zatímco jejich protějšky pro pravé ucho (ošetřené GDNF) byly 83/492; 28/498 a 126/512, v příslušném pořadí. Tyto poměry representují zvýšení ztráty vláskových buněk mezi pravým a levým uchem pro každé zvíře 3x; 4,2x a l,9x pro tři zvířata. U morčete, kterému byla injikována cisplatina 7,5 mg/kg bylo také 2-násobné zvýšení ztráty vláskových buněk v neošetřeném uchu (levém) ve srovnání s ošetřeným uchem. (Viz obrázek 2). U zvířat, kterým byla implantována minipumpa naplněná vehikulem místo GDNF nebyl žádný rozdíl v počtu vláskových buněk nacházených v levém uchu (neošetřené ucho) a v pravém uchu (implantovaném uchu).

Příklad 4

Injekce GDNF proteinového produktu navozuje přežívání kochleárních vláskových buněk in vivo

Následující příklad ukazuje, že GDNF proteinový produkt chrání kochleární vláskové buňky před ototoxicitou ve zvířecím modelu, pokud je aplikován do středního ucha.GDNF byl zaveden do pravého ucha jednou injekcí přes tympanální membránu v koncentraci 1

I • * « r · « * • «· * « »· ··«· mg/kg v PBS + 1% BSA v objemu 125 - 135 μΐ. I.m. injekce cisplatiny začaly den po injekci GDNF v dávce 7,5 mg/kg dvakrát, v 5 denním intervalu. Pokus byl ukončen tři dny po druhé injekci cisplatiny. Vláskové buňky byly barveny FITC faloidinem a jejich počet byl určen ve středním závitu kochley (v alespoň 20% části středního závitu). Výsledky (obrázek 3) jsou vyjádřeny jako procento ztracených vláskových buněk pro jednotlivá morčata pro GDNF ošetřené ucho (pravé ucho) a neostřené ucho (levé ucho).

Materiály:

Použité materiály byly stejné jako v příkladu 3.

Postupy:

Albino morčata (hmotnosti 600 - 700 g) byla anestezována směsí xylazinu 10 mg/kg, ketaminu 40 mg/kg a buprenorfinu 0,05 mg/kg. Pod chirurgickým mikroskopem byl vytvořen otvor v tympanální membráně pravého ucha propíchnutím membrány 27 gauge jehlou.

V jiném místě tympanální membrány byl do středoušní dutiny injikován lidský GDNF protein (v koncentraci 1 mg/kg v PBS +

0,1% BSA) tak, že celá dutina byla naplněna (125 - 135 μ1). Několika zvířatům bylo injikováno pouze vehikulum (PBS + 0,1%

BSA) místo GDNF. Další den byla podána i.m. injekce cisplatiny (7,5 mg/kg). 0 pět dní později byla podána druhá injekce stejné koncentrace. 0 tři dny později (8. den celkové doby pokusu) byla zvířata usmrcena, tkáně byly fixovány a kochlea byla analyzována jak je popsáno v příkladu 3.

Výsledky:

Po osmi dnech vykazovala čtyři morčata, kterým byla injikována

cisplatina, signifikantní ztrátu vláskových buněk v kochlei. V levém uchu, kam nebyl podán GDNF, byla ztráta vláskových buněk ve středním závitu kochlei: 34 %; 47 %; 42 % a 41 %. Injekce GDNF do středoušní dutiny pravého ucha, 1 mg/kg, redukovala tuto ztrátu signifikantně: 16 %; 23 %; 21 % a 29 %, v příslušném pořadí (obrázek 3). Morčata, která dostala injekci vehikula místo GDNF do pravého ucha, nevykazovala rozdíl v počtu vláskových buněk mezi pravým (ošetřeným) a levým (neošetřeným) uchem.

Je očekáváno, že velký počet modifikací a variací provedení vynálezu bude odborníkům zřejmý po pochopení předchozího popisu a jeho nyní předkládaných preferovaných provedení.

I

Seznam sekvencí (1) Obecné informace:

(i) Přihlašovatel: Ella Magal (ii) Název vynálezu: Způsoby pro ochranu a léčbu sensorineurální ztráty sluchu a vestibulárních poruch za použití proteinového produktu neurotrofního faktoru (GDNF) odvozeného od gliální buněčné linie.

(iii) Počet sekvencí: 1 (iv) Adresa pro korespondenci

(A)	Adresa: AMGEN INC.
(B)	Ulice	: 1840 DeHavilland
(C)	Město	: Thousand Oaks
(D)	Stát:	California
(E)	Země:	USA
(F)	ZIP:	91320

(v) Počítačová čtecí forma:

(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verse #1.25 (vi) Údaje o současné přihlášce:

(A) Číslo přihlášky:

(B) Datum podání:

(C) Klasifikace:

ΊΑ

(viii) Zástupce/agent informace (A) Jméno: Curry, Daniel R.

(B) Registrační číslo: 32727 (C) Reference/číslo rejstříku: A-392 (ix) Telekomunikační informace:

(A)	Telefon:	805-447-8102
(B)	Telefax:	805-499-8011
(C)	Telex:

(2) Informace pro SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 134 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ix) Vlastosti:

(A) Jméno/klíč: odvozená aminokyselinová sekvence pro zralý lidský GDNF

(xi)

Popis sekvence:SEQ ID NO:

1:

Ser

Pro

Asp

Lys

Gin

Met

Ala

Val

Leu

Pro

Arg

Glu

Arg

Asn

Arg

1

5

10

15

Gin

Ala

Asn

Pro

Glu

Asn

Ser

Arg

Gly

Lys

Gly

Arg

20

25

30

Gly

Gin

Arg

Gly

Ly3

Asn

Arg

Gly

Cys

Val

Leu

Thr

Ala

Ile

His

Leu

35

40

45

Asn

Val

Thr

Asp

Leu

.Gly

Leu

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

Leu

Ile

50

55

60

Phe

Arg

Tyr

Cys

Ser

Gly

Ser

Cy3

Asp

Ala

Glu

Thr

Tyr

Asp

65

70

75

80

Lye

Ile

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser

Arg

Asn

Arg

Leu

Val.

Ser

Asp

Lys

85

90

95

Val

Gly

Gin

Ala

Cys

Arg

Pro

Ile

Ala

Phe

Asp

Leu

Ser

100

105

110

Phe

Leu

/ Asp

Asp

Asn

Leu

Val

Tyr

His

Ile

Leu

Arg

Lys

His

Ser

Ala

115

120

125

Λ »

PATENTOVÉ nároky

Claims

PATENTOVÉ nároky

1. Použití proteinového produktu neurotrofního faktoru odvozeného od gliální buněčné linie (GDNF) pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčbu sensorineurální ztráty sluchu.
2. Použití podle nároku 1, kde ztráta sluchu je asociována s lézí vnitřního ucha.
3. Použití podle nároku 1, kde ztráta sluchu je asociována s poškozením nebo degenerací neuroepiteliálních vláskových buněk vnitřního ucha.
4. Použití podle nároku 1, kde ztráta sluchu je asociována s poškozením nebo degenerací neuronů spirálního ganglia.
5. Použití podle nároku 1, kde GDNF proteinovým produktem je aminokyselinová sekvence daná SEQ ID NO: 1 nebo její varianta nebo derivát.
6. Použití podle nároku 5, kde GDNF proteinový produkt má aminokyselinovou sekvenci danou SEQ ID NO: 1.
7. Použití podle nároku 5, kde GDNF proteinový produkt je (Met-i) GDNF.
8. Použití podle nároku 1, kde GDNF proteinový produkt je podán v dávce od asi 1 pg/kg/den do asi 100 mg/kg/den.
9. Použití podle nároku 1, kde GDNF proteinový produkt je podán prostřednictvím buněčné terapie nebo genové terapie, kde buňky byly modifikovány tak, aby produkovaly a secernovaly GDNF proteinový produkt .
10. Použití podle nároku 9, kde buňky byly modifikovány ex vivo.
11. Použití podle nároku 9, kde buňky byly modifikovány in vivo.
12. Použití proteinového produktu neurotrofního faktoru odvozeného od gliální buněčné linie (GDNF) pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčbu lézí nebo poruch vestibulárního aparátu.
13. Použití podle nároku 12, kde léze nebo porucha vede k závrati, vertigu nebo ztrátě rovnováhy.
14. Použití podle nároku 12, kde GDNF proteinovým produktem je aminokyselinová sekvence daná SEQ ID NO: 1 nebo její varianta nebo derivát.
15. Použití podle nároku 14, kde GDNF proteinový produkt má aminokyselinovou sekvenci danou SEQ ID NO: 1.
16. Použití podle nároku 14, kde GDNF proteinový produkt je (Met-i) GDNF.
17. Použití podle nároku 12, kde GDNF proteinový produkt je

I podán v dávce od asi 1 pg/kg/den do asi 100 mg/kg/den.
18. Použití podle nároku 12, kde GDNF proteinový produkt je podán prostřednictvím buněčné terapie nebo genové terapie, kde buňky byly modifikovány tak, aby produkovaly a secernovaly GDNF proteinový produkt.
19. Použití podle nároku 18, kde buňky byly modifikovány ex vivo.
20. Použití podle nároku 18, kde buňky byly modifikovány in vivo.