SK138697A3

SK138697A3 - Method for protecting and treating the sensory-neural hearing loss and vestibular disorders by using neurotrophic factor (gdnf) protein product being derived form glial cell line

Info

Publication number: SK138697A3
Application number: SK1386-97A
Authority: SK
Inventors: Ella Magal
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1996-02-23
Filing date: 1997-02-14
Publication date: 1998-02-04
Also published as: CA2217565A1; DK0822829T3; CZ322797A3; NO974767D0; EA199700225A1; ATE211392T1; DE69709458D1; DE69709458T2; HUP9901758A3; ES2170938T3; KR19980703748A; WO1997030722A1; EP0822829B1; JP4028598B2; PT822829E; NO974767L; AU2277997A; KR100271247B1; CN1181704A; EP0822829A1

Description

SpÔsoby ochrany a liečby senzorineurálnej straty sluchu a vestibulárnych porúch pri použití proteínového produktu neurotrofného faktora CGDNF) odvedeného od gliálnej bunkovej línie

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa všeobecne týka spôsobov na zabránenie a/alebo liečenie poškodení alebo degenerácií serizorických buniek vnútorného ucha, ako sú vláskové bunky a sluchové neuróny, podaním proteínového produktu neurotrofného faktora CGDNF) odvodeného od gliálnej bunkovej línie. Vynález sa špecificky týka spôsobov zabránenia a/alebo liečenia straty sluchu spôsobenej rôznymi príčinami.

Dotera iší stav techniky

Neutrofné faktory sú prirodzené proteiny, ktoré sú nachádzané v nervovom systéme a v nervových tkanivách inervovaných nervovým systémom, ktoré účinkujú tak, že navodzujú prežívanie a udržujú feriotypovou diferenciáciu populácie istých nervových a/alebo gliálriych buniek CVaron et al., Ann. Rev. Neuroscience. 1»327. 1979; Thoeneri et al.. Science, 229« 238, 1985) . Vďaka tomuto fyziologickému účinku sú rieurotrofrié faktory využiteľné v liečení degenerácie takýchto nervových buniek a straty diferencovanej funkcie. ktorá vyplýva z nervového poškodenia. Nervové poškodenie je spôsobené stavmi, ktoré ohrozujú prežívanie a/alebo vlastnú funkciu jedného alebo viacerých typov nervových buniek, vrátane» ¢1) fyzikálneho poškodenia, ktoré spôsobuje degeneráciu axonálnych výbežkov Cčo nakoniec spôsobí smrť nervovej bunky) a/alebo spôsobuje poškodenie tela nervovej bunky blízko miesta poškodenia, ¢2) dočasného alebo trvalého obmedzenia krvného toku Cischémie) k časti nervového systému, ako pri mŕtvici, C3) úmyselného alebo náhodného vystavenia neurotoxínom, ako je protiriádorový alebo AIDS chemoterapeutické agens cisplatína a dideoxycytidin. v príslušnom poradí. C 4) chronických metabolických chorôb, ako je diabetes alebo reriálna dysfunkcia, alebo ¢5) neurodegeneratívnych chorôb. ako je Parkinsonova choroba, Alzheimerova choroba a amyotrofická laterálna skleróza, ktoré vznikajú z degenerácie špecifických neuronálnych populácií. Aby boli jednotlivé neurotrofné faktory potenciálne použiteľné pri liečení nervového poškodenia. musí byť trieda alebo triedy poškodených nervových buniek reagujúca na faktor. Bolo stanovené, že všetky neurónové populácie nie sú reagujúce alebo rovnako ovplyvnené všetkými neurotrofnými faktormi.

Prvým identifikovaným neurotrofným faktorom bol nervový rastový faktor CNGF). NGF je prvým členom definovanej rodiny trofických faktorov. nazývaných neurotrofíny, ktorá teraz obsahuje od mozgu odvodený neurotrofný faktor CBDNF), neurotrofín-3 CNT—3). NT-4/5 a NT-6 CThoenen, Trends. Neurosci.. 14 s 165-170. 1991; Snider. Celí. 77 s 627-638. 1994; Bothuell. Ann. Rev. Neuroscience 18« 223-253. 1995). O týchto neurotrofínoch je známe, že účinkujú skrz rodinu trk tyrozínkinázových receptorov, tj. trkA. trkB, trkC a nízkoafinitriého p75 receptora CSnider. Celí. 77s 627-638. 1994; Bothuell, Ann. Rev. Neuroscience 18« 223-253. 1995; Chao et a.. TINSIBi 321-326, 1995).

Neurotrofným faktorom odvodeným od gliálnej bunkovej línie CGDNF) je teraz objavený proteín, ktorý bol identifikovaný a purifikovaný na základe svojej účinnosti na navodenie prežívania a stimulácie transmiterového fenotypu mezencefalických dopamiriergných neurónov in vitro CLin et al., Science, 260« 1130-1132, 1993). GDNF je glykozylovaný disulfidovou väzbou viazaný homodimér, ktorý má určitú štruktúrnu homológiu so superrodinou proteínov transformujúceho rastového faktora beta CTGF-β) CLin et al., Science, 260« 1130-1132, 1993; Krieglstein et al., ENBQ J., 14« 736-742; Poulsen et al., Neurón, 13« 1245-1252, 1994). GDNF inRNA bola detegovaná v svalových a Schuanových bunkách v periférnom nervovom systéme CKenderson et a.. Science, 266« 1062-1064. 1994; Trupp et al.. J. Celí Biol.. 130« 137-148, 1995) a v type I astrocytov v centrálnom nervovom systéme (Schaar et al., Exp. Neurol., 124« 368-371. 1993). In vivo liečba exogénnym GDNF stimuluje dopaminergný fenotyp neurónov substancia nigra a obnovuje funkčné deficity indukované axotóniou alebo dopaminergnými neurotoxlnmi v zvieracom modele Parkinsonovej choroby (Hudson et al., Brain Res. Bull.., 36« 425-432, 1995; Beck et a.. Náture, 373« 339-341, 1995; Tomac et al.. Náture, 373« 335-339, 1995; Hoffer et al., Neurosci. Lett., 182« 107-111, 1994). Aj keď sa súdilo, že je relatívne špecifický pre dopaminergné neuróny, aspoň in vitro, začínajú sa objavovať dôkazy ukazujúce, že GDNF môže mať širšie spektrum neurotrofných cieľov medzi mezencefalickými dopaminergnými a somatickými motorickými neurónmi (Yan et ľletheson. Náture 373« 341-344, 1995; Oppenheim et al.. Náture, 373« 344-346, 1995; Matheson et al., Soc. Neurosci. Abstr., 21« 544. 1995; Trupp et al., J. Celí. Biol. 130« 137-148, 1995). Konkrétne bolo zistené, že GDNF má neurotrofnú účinnosť na cholinergrié motorické neuróny mozgového kmeňa a miechy, ako in vivo, tak aj in vitro COppenheim et al.. Náture. 373« 344-346, 1995; Zurn et al., Neuroreport, 6« 113-118, 1994; Yan et al.. Náture. 373« 34J-344, 1995; Henderson et al., Science, 266« 1062-1064, 1194), na retinálne neuróny, ako na ftoreceptory in vitro (teraz prejednávaná U.S. prihláška pod č. 08/564833, Louis, podaná 29.11.1995) a retinálne gangliové bunky ako in vitro, tak aj in vivo (teraz prejednávaná U.S. prihláška pod č. 118/564458, Yan, podaná 29.11.1995) a ako in vitro. tak aj ni vivo na senzorické neuróny z dorzálneho koreňového ganglia (teraz prejednávaná U.S. prihláška pod č. (J8/564H44, Yan et al., podaná 29.11.1995).

Všeobecne zaujímavá pre predkladaný vynález je U093/06116 (Lin et al., Syntex-Synergen Neuroscience Joint Venture). publikovaná 1.5.1993, ktorá popisuje, že GDNF je užitočný pre liečbu nervového poškodenia, vrátane poškodenia asociovaného s Parkinsonovou chorobou. Tiež je zaujímavá správa Smith-Kastnera et al.. I*lol., Brain Res., 26« 325-330, 1994. že GDNF mRNA sa stal detegovateľným a bol preregulovaný po pilokarpínom Indukovanom záchvate; správy Schaarra et al., Exp. Neurol.. 124« 368-371. 1993 a Schaara et al.,

Exp. Neurol., 130« 387-393, 1994, že bazálne astrocyty predného mozgu exprimovali stredné hladiny GDNF mRNA pri kultivačných podmienkach, ale že GDNF nealteroval ChAT aktivitu predného mozgu: a správa v teraz prejednávanej U.S. prihláške C. 08/535682. podanej 28.10.1995, že GDNF je použiteľný na liečenie poškodenia alebo degenerácie bazálnych cholinergných neurónov predného mozgu. Pokiaľ ide o GDNF, nebolo predtým dokázané, že by navodzoval prežívanie, regeneráciu alebo ochranu pred degeneráciou buniek vnútorného ucha. ako sú vláskové bunky a sluchové neuróny.

Neuroepiteliálne vláskové bunky v Cortiho orgáne vnútorného ucha prenášajú zvuk na nervovú aktivitu, ktorá je prenášaná cez kochleárne delenie Ôsmeho hlavového nervu. Tento nerv je zložený z vláken z troch typov neurónov (Spoedlin. H.H. v Friedmanri, I. Ballantyne, J., vyd. Ultrastructural Atlas of Inner Ear; London, Butteruorth. str. 133-164, 1984): 1) aferentných neurónov, ktoré sú umiestené v spirálnom gangliu a spájajú kochleu s mozgovým kmeňom. 2) pochádzajú zo adrenergných eferentných olivokochleárnych superiórneho olivárneho komplexu neurónov, ktoré pochádzajú neurónov. ktoré a 3) autonómnych z cervikálneho sympatického kmeňa a inervujú kochleu. Pokiaľ ide o ľudí, je to približne □00 aferentných kochleárnych neurónov s myelinizovanými axónmi. ktoré sa každý skladajú z asi 50 lamiel s priemerom 4-6 mm. Táto rýchlosť vedenia, ktorá dĺžke sluchového nervu vláken s bazálnymi histologická štruktúra vytvára jednotnú je významnou funkčnou vlastnosťou. Po je tu trofické usporiadanie aferentných vláknami obtočenými okolo centrálne umiestených apikálnych vláken spôsobom podobným spletenému lanu. Spoedlin, H.H. v Naunton. R.F., fernadex, C. vyd. Evoked Electrical Aktivity in the Auditory Nervous System., London, Academics. str. 21-39, 1978) identifikoval dva typy aferentných neurónov v spirálnom gangliu na základe morfologických rozdielov: typ I buniek (95%) je bipolárny a má myelinizované bunkové telo a axóny, ktoré siahajú k vnútorným vláskovým bunkám. Typ II buniek (5%) je monopolárny s nemyelinizovanými axónmi a siahajúcimi k vonkajším vonkajším vláskovým bunkám Cortiho orgánu. Každá vnútorná vlásková bunka je lnervovaná asi 20 vláknami, kde každé z nich iná synapsie len na jednu bunku. Oproti tomu, vonkajšia vlásková bunka je inervovaná asi šiestimi vláknami, kde sa každé z vláken vetvi k približne 10 bunkám. Vnútri kochley sa vlákna delia na: 1) vnútornú spirálnu skupinu, ktorá primárne vedie ipsilaterálne a má synapsie s aferentnými neurónmi k vnútorným vláskovým bunkám a 2) početnejšiu vonkajšiu radiálnu skupinu, ktorá vedie hlavne kontralaterálne vláskovýini bunkami. Existuje tu frekvenciu, charakteristickú alebo najlepšiu frekvenciu, ale prah ostro rastie pre frekvenciu nad a pod touto hladinou CPickles,

J.O.. v Introduction to the Fyzlology of Hearing, London, Academics Press, str. 71-106, 1982). Jednotlivé vlákna sluchových nervov sa preto javia ako pásmové filtre. Bazilárna membrána preferenčne vibruje pri rôznych frekvenciách, v rôznych vzdialenostiach svojej dĺžky a frekvenčná aktivita každého vlákna a má synapsie s vonkajšími minimálne prah pre jednu kochleárneho nervu bunky. na ktorú kochleárneho nervu je podobná selektivite vnútornej vláskovej je vlákno pripojené. Tak každé vlákno vykazuje presnú krivku pokrývajúcu odlišný rozsah frekvencií než jeho susedné vlákna CEvans, E.F., v Beagley H.A, ed. Audítory Investigation: The Scientific and Technological basis, Neu York. Oxford University Press, 1979). Týmto mechanizmom je komplexný zvuk rozložený do zložiek frekvencií) filtre vnútorného ucha.

Strata sluchu dostatočná na to, aby bola narušená sociálna a pracovaná komunikácia, patri medzi najčastejšie chronické nervové poškodenia v US populácii. Na základe zdravotného dotazníka CVital and health statistics.. Šerieš 10 č. 176. Uashlrigton D.C. CDHHS publikácia č. CPHS) 90-1504), je zhodnotené, že približne 4 % ľudí vo veku pod 45 rokov a 29 % ľudí vo veku nad 65 rokov je heridikepovaných stratou sluchu. Bolo zhodnotené, že viac ako 28 miliónov Američanov má poškodenie sluchu a že najmenej 2 milióny z tejto skupiny sú významne hluchých CA report of the task force na the National Stratégie plaň., Bethseda. ľld.: National Inštitúte of Health, 1989). Prevalencia straty sluchu dramaticky stúpa s vekom. Približne 1 na 1 000 deti má stratu sluchu dostatočne závažnú na to, aby spôsobila nedostatočný vývoj hovoreného jazyka <Gentile, A. et al.. Characterlstics of persons with impaired hearing United States, 1962-1963, Šerieš 10 C. 35. Uashington D.C. Goverment printing Office, 1967 COHHS publikácia C. C PHS) 1000) CHuman communication and its disorders: an overvieu. Bethseda, l*ld. s National Institutes of health, 1970). Viac ako 360 na 1 000 osôb vo veku nad 75 rokov je hendikepovaných stratou sluchu CVital and health statistics..

Šerieš 90-1504).

176. Uashington D.C. COHHS publikácia č. CPHS)

Bolo zhodnotené, že náklady na stratu produktivity, špeciálnej výuky a medikamentóznej liečby môžu prekročiť 30 miliárd dolárov za rok pre choroby sluchu, reči a jazyka <1990 anriual report of the National Deafness and other Communication Disorders Adisory Board. Uashington D.C. Goverment printing Office. 1991 CDHHS publikácia č. (NIH) 91-3189). Najbežnejšie príčiny závažného poškodenia sluchu u deti sú genetické choroby a menirigitída, ktoré tvoria približne 13 percent a 9 percent z celkového počtu, v príslušnom poradí (Hotchklss, D. Demographlc aspecbs of fearing impairment« question and ansuers., 2. vydanie, Uashington D.C.« Gallaudet University Press, 1989). V približne 50 percentách detskej hluchoty je príčina neznáma. ale je to pravdepodobne z genetických príčin alebo predispozícií CNance UE. Sweeney A. Otolaryngol. Clin. North. Am. 1.975s 8» 19-48).

spirálneho spirálneho mozgového

Poškodenie ktorejkoľvek časti sluchovej dráhy, od vonkajšieho zvukovodu až po centrálny nervový systém, môže viesť k strate sluchu. Sluchové ústrojenstvo môže byť ďalej rozdelené na vonkajšie a stredné ucho, vnútorné ucho a sluchový nerv a centrálnu sluchovú dráhu. Sluchová informácia je u ľudí prenášaná z mechanického signálu na nervovo prenášané elektrické impulzy prostredníctvom približne 15 000 neuroepiteliálnych buniek

Cvláskových buniek) a 30 000 neurónov prvého radu <bunky ganglla vnútorného ucha). Všetky centrálne vlákna ganglia tvoria synapsle v kochleárnom jadre pontu kmeňa. Počet neurónov obsiahnutých v sluchovom vnímaní dramaticky stúpa od kochley k sluchovej časti mozgového kmeňa a sluchovej kôry mozgovej. Všetky sluchové informácie sú prenášaná len 15 000 vláskovýml bunkami, z ktorých sú takzvané vnútorné vláskové bunky zásadne významné. pretože vytvárajú synapsie s približne 90 Z z 30 000 primárnych sluchových neurónov. Tak poškodenie relatívne malého poštu buniek v sluchovej periférii môže viesť k významnej strate sluchu. Preto väčšina príčin senzorineurálnej straty sluchu môže byť pripísaná léziám vnútorného ucha (Nadol. J.B., New England Journal of Medicíne. 1993. 329: 1092-1102).

zložená z komplexu inferioris, corporís

Strata sluchu môže byť na úrovni prevodu, senzorineurálnej a centrálnej. Prevodová strata sluchu je spôsobená léziami postihujúcimi vonkajšie alebo stredné ucho, ktoré vedú k deštrukcií normálnej dráhy zvuku zo vzduchu amplifikovaného bubienkovou membránou a kôstkami k tekutine vnútorného ucha. Senzorineurálna strata sluchu je spôsohená léziami kochley alebo sluchového delenia Ôsmeho hlavového nervu. Centrálna strata sluchu je spôsobená léziami centrálnej sluchovej dráhy. 1 á je kochleárrieho a olívárneho jadra, colliculi geniculatae. sluchovej kôry v temporálnych lalokoch a prepájajúcich aferentných a eferentných vláken (Adams. R. D. a Maurice, V. vyd. v Pririciples of Neurology, 19B9, McGrau-Hill Information sevices Company.. str. 226-246).

Ako bolo uvedené predtým, aspoň 50 percent prípadov významnej straty sluchu u detí je má genetické príčiny (Broun

K.S., Med. Clin. North. AM. 1969, 53. 741-72). Ak je zobraná do úvahy pravdepodobností. že genetická predispozícia je Hlavným príčinným faktorom presbyakúzie - čiže s vekom viazanej straty sluchu - ktorá postihuje tretinu populácie nad 75 veku (Nadol. J. B. v Beasley DS, Oavis GA, vyd., Aging« Communicatlon Processes and Disorders., Neu York. Grúne and Stratton, 1981. 63-85), potom sú genetické a dedičné faktory pravdepodobne najbežnejšie vyjadrené ako senzorineurálna strata sluchu než ako prenosová strata sluchu. Geneticky determinovaná senzorineurálna strata sluchu je jasne väčšinovou, ak nie hlavnou, príčinou senzorineurálnej straty sluchu, predovšetkým u deti (Nance UE.

Sueeney A. Otolaryngol. Clin. North Am.. 1975s 8: 19-48). ľledzi najbežnejšie syndrómové senzorineurálne straty sluchy patri Waardenburfov syndróm. Alportov syndróm a Usherov syndróm.

Množstvo bežne používaných liečiv má ototoxické vlastnosti. Najlepšie známe sú aminogLykozidové antibiotiká (Lerner, S.A. et al., vyd. Aminoglycoside ototoxicity. Boston« Little. Broun, 198; Smith, C.R. et al., N. England. J. Med. 1980« 302« 1106-9), kľučkové diuretiká (Bosher. S.K., Acta Otolaryngol. (Stockh) 1980. 90» 4-54), salicyláty (Myers, E.N. et al., N. Engl. J. Med. 1965, 273« 587-90) a antineoplastlcké agens. ako je cisplatlna (Strauss. M. et al.. Laryngoscope 1983. 143« 1263-5). Ototoxicita bola tiež popísaná počas orálneho a parenterálneho podania arytromycínu (Kroboth, P.D. et al., Árch. lntern. Med. 1983, 1« 169-79; Achueltzer. V.G., Olson, N. Árch. Otolaryngol.. 1984. 110« 258-60).

Väčšina ototoxických substancii spôsobuje stratu sluchu poškodením kochley. predovšetkým vláskových buniek a stria vaskularis. Špecializovaného epiteliálneho orgánu vnútri vnútorného ucha. ktorý je zodpovedný za homeostázu tekutín a elektrolytov (Nadol, J.B.. Neu England Journal of Medicíne, 1993, 329« 1092-1102). Sekundárna degenerácia neurónov sa môže vyskytnúť mnoho rokov po ototoxickej udalosti poškodzujúcej vláskové bunky. Existujú dôkazy. že niektoré ototoxické substancie môžu byť selektívne koncentrované vo vnútornom uchu, čo vedie k progresívnej senzoririeurálnej strate sluchu napriek prerušeniu systémového podania (Federspil, P. et al.. J. Infect. Dís. 1976, 134 Suppl« S200-S205).

Trauma spôsobená nadmernou akustickou stimuláciou je inou hlavnou príčinou hluchoty. Existuje individuálna citlivosť na hlukom spôsobenú traumu. Klinicky významná senzorineurálna strata sluchu sa môže vyskytnúť u niektorých osôb po vystavení nadmernej intenzite hluku. aj pod hladinami schválenými Occupation Safety and Helth Agency (Osguthorpe. J.D. ed. Washington D.C.« American Academy of Otolaryngology - Head and

Neck Surgery Foundation, 1988).

DemyelizaCné procesy. ako je roztrúsená skleróza. môžu spôsobovať senzorineurálnu stratu sluchu (Noffsinger. D. et al.. Acta Otolaryngol Suppl. (Stockh) 1972. 3031 1-63). Nedávno bola rozpoznaná forma imunitným systémom sprostredkovanej senzorineurálnej straty sluchu (McOabe, B.F. Ann. Utol. Rhinol. Laryngol.. 1979. 88s 585-9). Strata sluchu je obvykle bilaterálna, rýchlo progresívna (meraná v týždňoch a mesiacoch) a môže alebo nemusí byť asociovaná s vestibulárnymi príznakmi.

Množstvo tumorov, ako primárnych, tak aj metastatických, môže produkovať ako prevodovú stratu sluchu. tak aj senzorineurálnu stratu sluchu, inváziou do vnútorného ucha alebo sluchového nervu (Houck, J.R. et al.. Otolaryngol. Head and Neck Surgery, 1992, 106s 92-7). Množstvo degeneratívnych chorôb s neznámou príčinou môže produkovať senzorineurálnu stratu sluchu. Menierov syndróm (Nadol, J.B. ed. Meniere’s disease> pathogenesis, pathophysiology, dlagnosis and tretment. Amsterdam: Kugler and Ghedini 1989). charakterizovaný fluktujúcou senzorineurálnou stratou sluchu. epizodickým závratom a tinitom. sa zdá byť chorobou spôsobenou narušením homeostázy tekutín vo vnútornom uchu, aj keď patogenéza zostáva nejasná. Náhla senzorineurálna strata sluchu (Uilson, W.R et al.. Árch. Otolaryngol. 1980, 106: 772-6) spôsobujúca strednú až vážnu senzorineurálnu hluchotu, môže byť spôsobený množstvom príčin, vrátane ischémle vnútorného ucha a vírusovej labyrintítís.

Presbyakúzia, strata sluchu asociovaná so starnutím, postihuje viac ako tretinu osôb nad 75 rokov. Najčastejším histopatologickým korelátom presbyakúzie je strata neuroeplteliálnych (vláskových) buniek, neurónov a stria vaskularls periférneho sluchového systému (Schuknecht H.F., Pathology of the Ear. Cambridge, Mass: Harvard Universlty Press, 1974, 388-403). Presbyakúzia je najlepšie chápaná ako následok kumulatívnych účinkov vplyvov niekoľkých nox počas života, vrátane zvukovej traumy, ototoxicity a geneticky ovplyvnenej degenerácie.

Pokial ide o Isté neurotrofické faktory, bolo ukázané, že regulujú diferenciáciu neurónov a ich prežívanie počas vývoja CKorsching S.J. Neurosci. 13s 2739-2748, 1993) a že chránia neuróny proti poškodeniu a toxínmi v dospelosti CHefti, Neurosci. 6s 2155-2162, 1986; Apfel et al.. Ann. Neurol. 29» 87-89, 1991; Hyman et al.. Náture, 350: 23U-233, 1991; Knusel et al.. J. Neurosci. 12: 4391-4402. 1992; Yan et al.. Náture. 360: 753-755. 1992; Koliatsos et al.. Neurón, 10: 359-367, 1993). In situ hybridizačné štúdie ukázali, že mRNA pre neutrofilné receptory TrkB a TrkC sú exprimované vyvíjajúcim sa kochleovestibulárnym gangliom CYlikoski et al., Hear. Res. 65: 69-78, 1993; Schesterson et al., Hearing Res. 73: 92-100. 1994) a že mRNA pre BDNF a NT-3 je nachádzaná vo vnútornom uchu, vrátane Cortiho orgánu CPirvola et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9915-9919, 1992; Schecterson et al., Hearing Res. 73: 92-100, 1994; Wheeler et al., Hearing Res. 73: 46-56, 1994). fyziologická úloha BDNF a NT-3 vo vývoji vestibulárneho a sluchového systému bola skúmaná na myšiach, ktoré mali deléciu BUNF a/alebo ΝΓ-3 génu CErnfors et al.. Neurón 14: 1153-1164, 1995). V kochlee stratili BDNF mutanty typ 2 spirálnych neurónov, čo spôsobilo absenciu inervácie vonkajších viáskových buniek. NT-3 mutanty vykazovali malé množstvo aferentných a stratu 87 X spirálnych neurónov, predpokladane korešpondujúcich typu 1 neurónov. ktoré inervujú vnútornú vláskové bunky. Dvojnásobní mutanti mali aditívnu stratu, kde chýbali všetky vestibulárne a spirálne neuróny. Požiadavky TrkB a IrkC receptorov pre prežitie špecifických neuronálnych populácií a uchovanie cielenej inervácie v periférnom senzorickom systéme vnútorného ucha bol demonštrovaný na štúdii myši nesúcich mutácie zárodočnej línie v katalytickej doméne tyrozinkinázy týchto génov CSchimmang et al., Development. 121: 3381-3391. 1995). Gao et al., CJNeurosci. 15: 5079-5087, 1995) ukázal prežívanie navodzujúce potenciál NT-4/5, BDNF a NT-3 pre neuróny postnatálneho spirálneho ganglla potkana v disoclovaných kultúrach a že NT-4/5 chráni tieto neuróny pred neurotoxickým účinkom protinádorového liečiva cisplatiny. Tiež bolo. pokiaľ ide o BDNF a NT-3, ukázané, že podporujú prežitie sluchových neurónov dospelých potkanov v disociovaných kultúrach (Lefebvre et al., NeuroReport 5: 865-868. 1994).

NeexisLujú žiadne skoršie správy o použití GDNF pri liečení straty sluchu. Pretože narušenie sluchu je vážnym postihnutím, bude identifikácia akéhokoľvek agens a liečebného postupu, ktorý môže chrániť sluchové neuróny a vláskové bunky pred poškodením, veľkým prínosom.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález poskytuje spôsoby liečenia senzorineurálnej straty sluchu. ktoré obsahujú podanie terapeuticky účinného množstva proteínového produktu neurotrofného faktora odvodeného od gliálnej bunkovej línie (GDN) subjektu majúcemu léziu vo vnútornom uchu. Napríklad strata sluchu môže byť asociovaná s poškodením alebo degeneráciou neuroepiteliálnych vláskových buniek Ckochleárnych vláskových buniek) alebo neurónov spirálneho ganglia vo vnútornom uchu.

Predkladaný vynález je založený na objavoch. Že vláskové bunky reagujú na GDNF v zmysle rezistencie ari toxické účinky ototoxínov. ako je cisplatina a neomycín a že sluchové neuróny tiež reagujú na GDNF v zmysle rezistencie na toxické účinky rôznych ototoxínov, ako je cisplatina. neomycín a salicylát sodný. Tak terapeuticky účinné množstvo proteínového produktu GDNF môže byť podané s cieľom navodenia ochrany, prežívania alebo regenerácie vláskových buniek a neurónov spirálneho ganglia.

Tiež bolo objavené. že lézie alebo poruchy vestibulárneho ústrojenstva môže tiež byť liečené podaním terapeuticky účinného množstva proteínového produktu GDNF subjektu. ktorý má takéto lézie a poruchy. Takéto lézie môžu viesť k závratu, vertigu alebo strate rovnováhy.

takýto proteínový produkt GDNF bude ako je znázornený aminokyselinovou 1 <SEQ ID NO« 1). rovnako ako jeho že takýto GDNF

Predpokladá sa, že obsahovať GDNF protein sekvenciou danou na obr varianty a deriváty. Predpokladá sa tiež. proteínový produkt bude obsahovať <met”*) GDNF.

Podľa vynálezu môže byť GDNF proteínový produkt podaný parenterálne v dávke od asi typicky v dávke od asi U. 1 obvykle v dávke od asi 5 ug/kg/deň až asi 100 mg/kg/deň, mg/kg/deň do asi 25 mg/kg/deň a mg/kg/deň do asi 20 mg/kg/deň.

Predpokladá sa tiež, že v závislosti od individuálnych potrieb pacienta a spôsobu podania, môže byť GDNF proteínový produkt podaný v nižSej frekvencii ako raz za týždeň alebo niekoľkokrát za týždeň, alebo denne. Ďalej sa predpokladá, že GDNF proteínový produkt môže byť podaný priamo do stredného ucha alebo vnútorného ucha. Odborníkom bude zrejmé, že takéto podanie malého množstva GDNF proteínového produktu môže byť použité, napríklad, ako priame podanie dávky do stredného ucha alebo do vnútorného ucha. kde dávka je v rozsahu od asi 1 ug/ucho do asi 1 mg/ucho ako jedna injekcia alebo ako viac injekcii.

Ďalej sa predpokladá, že GDNF proteínový produkt môže byť podaný v kombinácii alebo konjunkcii s účinným množstvom druhého terapeutického agens, ako je BDNF alebo NT-3. Vynález tiež poskytuje použitie GDNF proteínového produktu pri výrobe liečiva alebo farmaceutickej kompozície na liečenie poškodenia alebo degenerácie vláskových buniek a sluchových neurónov pre množstvo príčin senzorineurálnej straty sluchu. Takéto farmaceutické kompozície obsahujú topické. orálne alebo pre stredné a vnútorné ucho určené formulácie GDNF proteínových produktov alebo kombinácie s kochleárnymi implantátmi.

Odborníkom bude tiež jasné. Že proces podania môže byť uskutočnený pomocou bunkovej terapie alebo prostriedkami génovej terapie, ako je ďalej popísané nižšie. Napríklad pri génovej terapii sú bunky modifikované tak. aby produkovali a secernovali GDNF proteínový produkt. Bunky môžu byť modifikované ex vivo alebo In vivo. Veľké množstvo aspektov a výhod predkladaného vynálezu bude odborníkom Jasné po porozumení nasledujúcemu detailnému popisu vynálezu, ktorý popisuje Jeho teraz preferovanú realizáciu.

Predkladaný vynález poskytuje spôsoby na ochranu a/alebo liečenie senzorineurálnej straty sluchu podaním terapeuticky účinného množstva proteínového produktu neurotrofného faktora odvodeného od gliálnej bunkovej línie CGDNF). Podľa jedného aspektu vynálezu sú poskytnuté spôsoby na liečenie poškodených vláskových buniek a sluchových neurónov podaním terapeuticky účinného množstva GDNF proteínového produktu prostredníctvom farmaceutickej kompozície, implantácie GDNF exprimujúcich buniek alebo GDNF génovej terapie. Vynález môže byť prakticky uskutočnený pri použití akéhokoľvek biologicky účinného GDNF proteínového produktu, vrátane GDNF proteínu reprezentovaného aminokyselinovou sekvenciou danou v SEQ ID NOs 1, vrátane ich variantov a derivátov. Okrem orálneho, parenterálneho alebo lokálneho podania GDNF proteínového produktu je predpokladané podanie cestou postupov bunkovej terapie alebo génovej terapie.

Predkladaný vynález je založený na začiatočných objavoch, že GDNF chráni vláskové bunky pred ototoxínmi indukovanou bunkovou smrťou v explantátových kultúrach potkaních kochlei a disociovaných neurónov spirálneho ganglía z dospelých potkanov v kultúre. Predpokladá sa, že podanie exogénneho GDNF proteínového produktu bude chrániť vláskové bunky a neuróny spirálneho ganglia pred traumatickým poškodením C ako je zvuková trauma alebo akútna alebo chronická liečba cisplatinou alebo aminoglykozldovými antibiotikami) alebo pred poškodením vzniknutým z nedostatku neurotrofných faktorov spôsobeným prerušením transportu faktorov z axónu do bunkového tela. Pri umožni vláskovým bunkám a/alebo intermitentné lnzulty buď zo liečby ototoxínmi a že spomalí takejto liečbe sa očakáva, že sluchovým neurónom tolerovať zvukovej traumy prostredia, alebo progresívnu degeneráciu sluchových neurónov a vláskových buniek, ktorá je zodpovedná za stratu sluchu pri takých patologických stavoch, ako Je presbyakúzia (na vek viazaná strata sluchu), dedičná senzorlneurálna degenerácia a postldiopatické straty sluchu a že zvuková funkčnú integritu vnútorného ucha. Bude tiež podporovať sluchové neuróny s cieľom lepšej a dlhšej účinnosti kochleárnych implantátov.

Podľa vynálezu môže byť GDNF proteínový produkt podaný do stredného ucha v dávke v rozsahu od asi 1 ug/kg/deň do asi 100 mg/kg/deň. typicky v dávke od asi 0.1 mg/kg/deň do asi 25 mg/kg/deň a obvykle v dávke od asi 5 mg/kg/deň mg/kg/deň. GDNF proteínový produkt môže byť podaný vnútorného ucha v prípade, že invázia do vnútorného do asi 20 priamo do ucha je už uskutočnená, ako je to v prípade kochleárneho implantátu alebo chirurgického výkonu na vnútornom uchu. V takýchto prípadoch bude podané menšie množstvo GDNF proteínového produktu, napríklad v rozsahu od asi 1 ug/ucho do asi 1 mg/ucho v jednej injekcii alebo vo viacerých injekciách. V prípade. že je potrebné chronické podávanie faktora, potom bude umiestená Alzet mlnipumpa pripojená na kanylu. ktorej koniec bude zavedený do stredného alebo vnútorného ucha s cieľom kontinuálneho uvoľňovania faktora. GDNF môže byť tiež vyvinutý vo forme ušných kvapiek, ktoré budú penetrovať cez bubienkovú membránu Bulla. Ďalej sa predpokladá, že GDNF proteínový produkt môže byť podaný s účinným množstvom druhého terapeutického agens na liečenie degenerácie sluchových neurónov, spolu s BDNF a NT-3, rovnako ako aj s inými faktormi a liečivami teraz alebo v budúcnosti používanými na liečenie rôznych patológií vnútorného ucha. Rôzne farmaceutické kompozície a rôzne techniky podania sú podrobnejšie popísané ďalej.

neurotrofný biologicky

Ako je to použitý, termín GDNF proteínový produkt zahrnuje purifikovaný prirodzený, syntetický alebo rekombinantný faktor odvodený od gliálnej bunkovej línie, aktívne varianty GDNF (vrátane inzerčných, substitučných a delečných variantov) a ich chemicky modifikované deriváty. Tiež sú zahrnuté GDNF, ktoré síí v podstate homológne s ľudským GDNF majúcim aminokysellnovú sekvenciu danú v SED ID NDs 1. GDNF proteínové produkty môže existovať ako homodlméry alebo heterodiméry v svojej biologicky aktívnej forme.

Termín biologicky aktívny, ako je tu použitý, znamená, že GDNF proteínový produkt vykazuje podobné rieurotrofné vlastnosti, ale nie všetky zhodné vlastnosti, a nie nevyhnutne v rovnakom stupni, ako GDNF majúci aminokyselinovú sekvenciu dano v SEU ID N0« 1. Výber jednotlivých požadovaných neurotrofných vlastnosti závisí od cieľa na ktorý bude GDNF proteínový produkt podávaný.

Termín v podstate homolégny, ako je tu použitý, znamená majúci stupeň homológle s GDNF majúcim aminokyselinovú sekvenciu danú v SECJ ID NCJs 1, ktorý preferovane presahuje 70 X. lepšie presahuje 80 X a najlepšie presahuje 90 X alebo 95 X. Napríklad stupeň homolégie medzi potkaním proteínom je okolo 93 X a je predpokladané. že preferovaný cicavčí GDNF bude mať podobne vysoký stupeň homolégie. Percento homolégie. ako je tu popisované, je obvykle počítané ako percento aminokyselinových zvyškov nachádzaných v kratšom z dvoch sekvenclí, ktorá je zoradená s identickými aminokyseliriovými rezíduami v porovnávacej sekvencii, kde môžu byť vložené štyri medzery na 100 aminokyselín s cieľom realizácie tohoto zoradenia Cako je dané v Dyahoff. V Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, p. 124, National Giochemical Research Foundation. Uashlngton. D.C. C1972), ktorého poznatky sú tu uvedené ako odkazy). Preferované je percento homolégie, ako je popísané vyššie, počítané ako percento zložiek v menšom z dvoch sekvencii. ktoré môžu tiež byť nájdené vo väčšej z dvoch sekvencii (so zavedením medzier), s tým. Že zložka je definovaná ako sekvencia štyroch susedných aminokyselín. Ako v podstate homolégny je tiež obsiahnutý GDNF proteínový produkt, ktorý môže byť Izolovaný pomocou skríženej reaktivity s protilátkami k GDNF SECJ ID NOt 1, alebo ktorého gény môžu byť izolované hybridizáciou s génom alebo segmentmi génu kódujúceho GDNF SECJ ID NO s 1.

GDNF proteínový produkt podľa tohoto vynálezu môže byť izolovaný alebo generovaný akýmikoľvek prostriedkami. ktoré sú odborníkom známe. Príkladné metódy produkcie GDNF proteínových produktov použiteľných v predkladanom vynálezu sú popísané v U.S. prihláške s poradovým C. 08/182183, podanej 23.5.1994 a jej pôvodnej prihláške; PCT prihláške C. PCT/US92/07888 podanej 17.9.1992, publikovanej ako WO 93/06116 CLin et al.. Syntex-Synergen Neuroscience Joint Venture); európskej patentovej prihláške č. 92921022.7, publikovanej a súvisiacej U.S. prihláške s poradovým 28.91995 CTruncated Glial Celí - Line ako EP 610 254_;C. 08/535681 podanej Derived Neurotrophic

Factor). ktorých objavy sú tu uvedené ako odkazy.

Prirodzene sa vyskytujúce GDNF proteínové produkty sú z prípravkov cicavčích neuronálnych buniek, alebo z cicavčej bunkovej línie secernujúcej alebo exprimujúcej GDNF. Napríklad W0/06116 popisuje Izoláciu GDNF zo séra neobsahujúceho rastové kondlciované médium B49 glioblastómových buniek. GNDF proteínové produkty môžu tiež byť chemicky syntetizované akýmikoľvek odborníkom známymi prostriedkami. GDNF proteínové produkty sú preferovane produkované cestou rekombinantných techník, pretože tie sú schopné dosiahnuť porovnateľne vyššie množstvá proteínu s vyššou čistotou. Rekombinantné formy GDNF proteínového produktu zahrnujú glykozylované a neglykozylované formy proteínu a proteín exprimovaný v bakteriálnych, cicavčích alebo hmyzích systémoch.

Všeobecne. rekombinantné techniky vyžadujú izoláciu génov zodpovedných za kódovanie GDNF. klonovaníe génu vo vhodných vektoroch a bunkových typoch, modifikáciu génu, ak to je žiadúce, pre kódovanie požadovaných variantov a exprimovanie génu tak, aby produkoval GDNF proteínový produkt. Alternatívne, nukleotidová sekvencia kódujúca požadovaný GDNF proteínový produkt môže byť chemicky syntetizovaná. Predpokladá sa, že GDNF proteínový produkt môže byť exprimovaný pri použití nukleotidovej sekvencie. ktorá sa líši v poradí kodónov vďaka degenerácii genetického kódu alebo alelickej variácii. W0 93/06116 popisuje izoláciu a sekvenovanie cDNA klonu potkanieho GDNF génu a Izolovanie, sekvenovanie a expresiu DNA klonu ľudského GDNF génu.

Ďalšie vektory vhodné pre expresiu GDNF proteínového produktu v E. coli sú popísané v publikovanej európskej patentovej prihláške C. EP 0 423 980 CStem Celí Factor) publikovanej 24.5.1991, ktorej objavy sú tu uvedené ako odkazy. DNA sekvencia génu kódujúceho zrelý ľudský GDNF a aminokyselinouá sekvenčia GDNF je ukázaná na obr. 19 CSEQ ID N0»5) UO 93/16116. Obrázok 19 neukazuje celú kódujúcu sekvenciu pre preproporcionálny GDNF, ale prvých 50 aminokyselín ľudského pre-pro GDNF je ukázaných na obrázku 22 CSEQ ID NOs 8) UO 93/16116.

Prirodzene sa vyskytujúci GDNF je disulfidovo viazaný dimér vo svojej biologicky aktívnej forme. Materiál izolovaný po expresii v bakteriálnych systémoch je v podstate biologicky inaktivny a existuje ako monomér. Poskladanie je nevyhnutné pre produkciu biologicky aktívneho disulfidovo viazaného diméru. Procesy na poskladanie a naturáciu GDNF exprimovaného v bakteriálnych systémoch sú popísané vo UO 93/06116. Štandardné in vitro testy na určenie aktivity GDNF sú popísané vo UO 93/06116 a súvisiacej U.S. prihláške č. 08/535681 podanej 28.101995 a sú tu uvedené ako odkazy.

A. Varianty GDNF

Termín GDNF varianty ako je tu použitý zahrnuje polypeptidy, u ktorých boli deletované aminokyseliny C'delečné varianty), inzertované aminokyseliny Cadičné varianty) alebo boli substituované za (substitučné varianty) zvyšky v aminokyselinovej sekvencii prirodzene sa vyskytujúceho GDNF. 1akéto varianty sú pripravené zavedením vhodných nukleotidových zmien do DNA kódujúcej polypeptid alebo in vitro chemickou syntézou požadovaného polypeptidu. Odborníkom bude jasné, že mQže byť poskytnuté množstvo kombinácií delécií, inzercií a substitúcií tak. že konečná molekula má biologickú aktivitu GDNF.

Techniky mutagenéz pre nahradenie, inzercie a delécle jedného alebo vybraných aminokyselinových zvyškov sú odborníkom dobre známe Cnapr. U.S. Patent č. 4518584, ktorého objavy sú tu uvedené ako odkazy). Sú dve základné premenné pri konštrukcii variantov s umiestenie miesta mutácie a charakter mutácie. V príprave GDNF variantov bude výber mutačného miesta a charakter mutácie závisiet od modifikovanej charakteristiky GDNF. Miesta mutácie môžu byť. modifikované jednotlivo alebo sériovo, napr. Cl) substitúciou najprv vybranou konzervatívnou aminokyselinou a až potom radikálnejším výberom podľa dosiahnutých výsledkov. C 2) deléciou cieľového aminokyselínového zvyšku, alebo C 3) inzerciou aminokyselinového zvyšku susedného s vyhľadávaným miestom. Sú preferované konzervatívne zmeny ad 1 do 2ĽI aminokyselín. Ak je určená aminokyselinová sekvencia požadovaného GDNF proteínového produktu, potom je ľahko určená sekvencia nukleovej kyseliny, ktorá bude použitá pre expresiu proteínu. Tiež môžu byC generované N-koncové a C--koncové delečné varianty pomocou proteolytických enzýmov.

Pre GDNF delečné varianty sú delécíe obvykle v rozsahu od 1 do 30 zvyškov, obvyklejšie od 1 do 10 zvyškov a typicky od 1 do 5 susediacich zvyškov. N-koncové, C-koncové a vnútorné intrasekvenčné delécie sú tiež možné. Delécie môžu byť zavedené do regiónov nízkej hnmolúgie sinými členmi TGF-a superrodiny pre modifikáciu GDNF. Delécie v oblastiach významenj homológie s inými členmi TGF-a superrodiny budú pravdepodobne modifikovať biologickú aktivitu GDNF významnejšie. Počet postupných delécií bude vybraný tak, aby bola zachovaná terciárna štruktúra GDNF proteínového produktu v spracovanej doméne. napr. cysteíriové skrížené väzby. Neobmedzujúce príklady delečných variantov obsahujú skrátené GDNF proteínové produkty, ktorým chýba 1 až 40 N-koncových aminokyselín GDNF. alebo varianty, ktorým chýba C-koncový zvyšok GDNF, alebo ich kombinácie, ako je to popísané v súvisiacej U.S. patentovej prihláške č. 0, 8/535681 podanej 28.10.1995. ktorá je tu uvedená ako odkaz.

Pre adičné varianty GDNF obsahujú sekvencie aminokyselinových adícií obvykle N- a/alebo C-koncové fúzie v rozsahu dĺžky od jedného zvyšku do polypeptidov obsahujúcich stovky alebo viac zvyškov, rovnako ako aj vnútornú intrasekvenčné adície jedného alebo mnohých aminokyselinových zvyškov. Vnútorné adicie môžu byť všeobecne v rozsahu od 1 do 10 zvyškov, častejšie v rozsahu od 1 do 5 zvyškov a obvykle v rozsahu od 1 do 3 zvyškov. Príklady N-koncových adičných variantov obsahujú GDNF s N-koncovým metionylovaným zvyškom (artefakt priamej expresie GDNF v bakteriálnej rekombinantnej bunkovej kultúre), ktorý je označený (l*let“ ^x ) GDNF a fúziu heternlógnej N-koncovej signálnej sekvencie na N-koniec GDNF na uľahčenie sekrécie zrelého GDNF z rekombinantných hostiteľských buniek. Takéto signálne sekvencie budú obyčajne získané zo, a tak budú homológne s, zamýšľaného druhu hostiteľskej bunky. Adície môžu tiež obsahovať aminokyselinové sekvencie odvodené od iných neurotrofných. Preferovaným GDNF proteínovým produktom pre použitie podľa predkladaného vynálezu je ľudský (l*let“¹) GDNF.

GDNF substitučné varianty majú aspoň jeden amiriokyselinový zvyšok v aminokyselinovej sekvencii GDNF nahradený iným zvyškom inzertovaným v jeho mieste. Takéto substitučné varianty obsahujú alelické varianty, ktoré sú charakterizované prirodzene sa vyskytujúcimi zmenami nukleotidovej sekvencie v špecifickej populácii. ktoré môžu. ale nemusia. viesť k amlnokyselinovým zmenám. Príklady substitučných variantov (pozri napr. SED ID NOs 50) sú popísané v súvisiacej U.S. prihláške č. 09/535681 podanej 28.10.1995 a sú tu uvedené ako odkaz.

Špecifické mutácie GDNF aminokyselinovej sekvencie môžu vyžadovať modifikácie na glykozylačné miesta (napr. serín, treonín alebo asparagín). Absencia glykozylácie alebo len čiastočná glykozylácia vychádza z aminokyselinovej substitúcie alebo delécie v akomkoľvek na asparagín viazanom glykozylačnom rozpoznávacom mieste alebo v akomkoľvek mieste molekuly, ktoré je modifikované adíciou U-viazaného uhľovodanu. Asparagín viazané glykozylačné rozpoznávacie miesto obsahuje tripeptidovú sekvenciu, ktorá je špecificky rozpoznávané vhodnými bunkovými glykozylačnými enzýmami. Tieto tripeptidové sekvencie sú buď Asn-Xaa-Thr alebo Asn-Xaa-Ser, kde Xaa môže byť akákoľvek aminokyselina iná ako prolín. Množstvo aminokyselinových substitúcii alebo delécií v jednom alebo obidvoch prvej alebo tretej aminokyselinovej pozícii glykozylačného rozpoznávacieho miesta (a/alebo aminokyselinové delécie v druhej pozícii) nevedú ku glykozylácii modifikovanej trípeptidovej sekvencie. Tak expresia vhodne pozmenených nukleotidových sekvencií produkuje varianty, ktoré nie sú glykozylované v tomto mieste. Alternatívne môže byť aminokyselinová sekvencla GDNF modifikovaná pre pridanie glykozylačných miest.

Jeden spôsob na identifikáciu aminokyselinových zvyškov alebo regiónov pre mutagenézu sa nazýva alanín skening mutagenéza“ ako ju popisujú Cunningham a Wells (Science, 244. 1081-1085, 1989). V tomto spôsobe sú identifikované aminokyselinové zvyšky alebo skupiny cieľových zvyškov (napr. nabité zvyšky ako je Arg. Asp, His, Lys a Glu) a sú nahradené neutrálnymi aminokyselinami alebo aminokyselinami so záporným nábojom (najlepšie alanínom alebo polyalanínom) pre narušenie interakcie aminokyselín s okolitým vodným prostredím v bunke alebo mimo bunku. Tieto domény demonštrujúce funkčnú senzitivitu k substitúciám sú potom vylepšené vložením ďalších alebo pozmenených zvyškov v mieste substitúcie. Tak je určené cieľové miesto na zavedenie variácie amlnokyselinovej sekvencie, je uskutočnený alaniri skaning alebo náhodná korešpondujúcom cieľovom kodóne alebo regióne a exprimované varianty GDNF sú vyšetrované na optimálnu kombináciu požadovanej aktivity a stupne aktivity.

mutagenéza na DNA sekvencie

Miesta najväčšieho záujmu pre substitučnú mutagenézu obsahujú miesta. kde sa aminokyseliny nachádzané v GDNF proteinoch od rôznych druhov významne líšia v objeme bočných reťazcov, náboji a/alebo hydrofóbnosti. Inými žiadúcimi miestami sú tie, v ktorých sú jednotlivé zvyšky GDNF podobných proteínov, získaných z rôznych druhov. Identické. Takéto pozície sú všeobecne významné pre biologickú aktivitu proteinu. Najprv sú tieto miesta substituované relatívne konzervatívnym spôsobom. Takéto konzervatívne substitúcie sú ukázané v tabuľke 1 pod kolónkou preferované substitúcie. Ak takéto substitúcie vedú k zmene biologickej aktivity, potom sú zavedené významnejšie zmeny (príklade substitúcie) a/alebo môžu byt uskutočnené iné adície alebo delécie a vzniknutý produkt je vyšetrovaný na svoju aktivitu.

Tabuľka 1

Amlnokyselinové substitúcie

Pôvodný zvyšok	Preferované	substitúcie Príkladné substitúcie
Ala	(A)	Val	Val; Leu; íle
Arg	(R)	Lys	Lys; Gin; Asn
Asn	(N)	Gin	Gin; His; Lys;	Arg
Asp	(D)	Glu	Glu
Cys	(C)	Ser	Ser
Gin	(□)	Asn	Asn
Glu	(E)	Asp	Asp
Gly	(G)	Pro	Pro
His	(H)	Arg	Asn; Gin; Lys;	Arg
íle	(I)	Leu	Leu; Val; Met; norleucín	Ala; Phe;
Leu	(L)	íle	norleucíri; íle Met; Ala; Phe	; Val;
Lys	(K)	Arg	Arg; Gin; Asn
Met	(M)	Leu	Leu; Phe; íle
Phe	(F)	Leu	Leu; Val; íle;	Ala
Pro	(P)	Gly	Gly
Ser	(S)	Thr	Thr
Thr	(T)	Ser	Ser
Trp	(U)	Tyr	Tyr
Tyr	<y>	Phe	Trp; Phe; Thr;	Ser
Val	(V)	Leu	íle; Leu; Met; Ala; norleucín	Phe;
	Pokiaľ ide o konzervatívne modifikácie aminokysellnovej
sekvencie (a	k orešpondujúce	modifikácie kódujúcich	sekvencii

nukleových kyselín), predpokladá sa. že budú produkovať GDNF proteínový produkt majúci funkčnú a chemické charakteristiky podobné prirodzenému GDNF. Oproti tomu. významné modifikácie vo funkčných a/alebo chemických charakteristikách GDNF proteínových produktov môžu byť uskutočnené vybraním substitúcií, ktoré sa slgniflkantnej líšia vo svojom účinku na zachovanie (A) štruktúry kostry polypeptidu v oblasti substitúcie, napríklad konformácie listu alebo skrutkovice . (b) náboja alebo hydrofóbnosti molekuly v cieľovom mieste alebo (C) objeme bočných reťazcov. Prirodzene sa vyskytujúce zvyšky sú rozdelené na skupiny podľa bežných vlastností bočných reťazcov:

1) hydrofóbne: norleucin. Met. Ala. Val, Leu, íle;

2) neutrálne hydrofóbnet Cys, Ser. Thr;

3) kyslé: Asp, Glu;

4) zásadité: Asn, Gin, His, Lys, Arg;

5) zvyšky ovplyvňujúce orientáciu reťazca: Gly, Pro; a

6) aromatické: Trp, Tyr. Phe.

Nekonzervatívne substitúcie vyžadujú zmenu člena jednej z týchto tried za člena inej triedy, takéto substituované zvyšky môžu byť zavedené do regiónov GDNF proteínu, ktoré sú homológne s inými proteínmi TGF-β superrodiny, alebo do nehomológnych regiónov molekuly.

B. Deriváty GDNF

Chemicky modifikované deriváty GDNF alebo variantov GDNF môžu byť odborníkom pripravené podľa tu popísaného popisu. Najvhodnejšie chemické skupiny pre derivatizáciu obsahujú vo vode rozpustné polyméry. Vo vode rozpustný polymér je žiadúci, pretože proteín. na ktorý je pripojený, sa nezráža vo vodnom prostredí, ako je fyziologické prostredie. Preferovane je polymér farmaceutický akceptovateľný pre prípravu terapeutického produktu alebo kompozície. Odborník bude schopný vybrať požadovaný polymér na základe úvahy, či konjugát polymér/proteín bude použitý terapeuticky a ak áno. tak a základe požadovanej dávky. doby cirkulácie, rezistencie na proteolýzu a iných podmienok. Účinnosť derivatizácie môže byť zaistená podaním derivátu, v požadovanej forme (tj. osmotickou pumpou, alebo lepšie injekciou alebo infúziou, alebo ďalej formulovanej pre orálne, pulmonálne alebo iné podanie) a určením jeho účinnosti.

Vhodné vo vode rozpustné polyméry obsahujú, ale nie sú obmedzené na, polyetylénglykol (PEĽ), kopolyméry etylénglykolu/propylénglykolu, karboxymetylcelulózu, dextrán, polyvinylalkohol, polyvinylpyrolidón, poly-1, 3-dioxolan, poly-1, 3, 6-trioxán, etylén/maleínanhydrid kopolymér, polyaminokyseliny (buď homopolymérne alebo náhodné kopolyméry) a dextrán alebo pyrolidún)polyetylénglykol. polypropylénglykolové polypropylénoxid/etylénoxíd kopolyméry, polyoxyetylované polyoly (napr. glyceroly), polyvinylalkohol a ich zmesi. Polyetylénglykol propiónaldehyd môže mat výhodu pri spracovaní vďaka svojej stabilite vo vode.

polyC n-vinyl nomopolyméry.

Polyméry môžu mať akúkoľvek molekulovú hmotnosť a môžu byť vetvené alebo nerozvetvené. Pre polyetylénglykol je preferovaná molekulová hmotnosť v rozsahu od asi 2 kúa do asi 100 kDa na uľahčenie pri manipulácii, a spracovaní (termin asi ukazuje, že v prípravku polyetylénglykolu budú niektoré molekuly mať vyššiu hmotnosť a niektoré nižšiu, ako je stanovená molekulová hmotnosť). Môžu byť použité iné vlastnosti, v závislosti od požadovaného terapeutického profilu (napr. trvanie spomaleného uvoľňovania, účinky, ak nejaké sú, na biologickú aktivitu, ľahkosť manipulácie, stupeň alebo chýbanie antigenicity alebo iné známe účinky polyetylénglykolu na terapeuticky proteín alebo jeho varianty).

Počet takto pripojených polymérových molekúl sa môže odlišovať a odborník bude schopný zistiť účinky na funkciu. Je možné monoderivatizovať, alebo je možné poskytnúť di-m, tri-, tetra- alebo niektoré kombinácie derivatizácie. s rovnakými alebo rôznymi chemickými skupinami (napr. polyméry, ako rôzne hmotnosti polyetylénglykolu). Pomer polymérových molekúl k proteínovým (alebo peptidovým) molekulám sa môže veľmi odlišovať, rovnako ako ich koncentrácia v reakčnej zmesi. Všeobecne, optimálny pomer (u zmysle účinnosti reakcie, v ktorej nie je prebytok nezreagovaného proteíriu alebo polyméru) bude určený faktormi ako je požadovaný stupeň derivatizácie C napr. morio-. di-. tri- atď.), molekulová hmotnosľ. vybraného polyméru, to, či je polymér rozvetvený alebo rierozvetveriý a reakčné podmienky.

skupinu, kyseliny

Molekuly poyletylériglykolu C alebo iných chemických skupín) by mali byť pripojené na protein pri uvážení účinkov na funkčné alebo aritigénne domény proteinu. Existuje veľký počet medót pripojenia, ktoré sú pre odborníkov dosiahnuteľné. Pozri napríklad EP 0 401 384, ktorého objavy sú tu uvedené ako odkaz (pripájanie PEG na G-CSF), pozri tiež Malik et al.. Exp. Hematol.. 20s 1028-1035, 1992 (popisujúce pegyláciu GM-CSF pri použití trezylchloridu). Napríklad polyetylénglykol môže byť kovalentne viazaný na aininokyselinové zvyšky cez reaktívne skupiny, ako je voľná amino alebo karboxylová skupina. Reaktívne skupiny sú tie, na ktoré sa môže viazať aktivovaná molekula polyetylénglykolu. Aminokyselinové zvyšky majúce voľnú amlnoskupinu môžu zahrnovať lyzínové zvyšky a N-koncové aminokyseliriové zvyšky. lie, ktoré majú voľnú karboxylovú zvyšky kyseliny asparágovej, zvyšky C-koncové aminokyselinové zvyšky.

Sulfhydrylové skupiny môžu tiež byť použité ako reaktívne skupiny pre pripojenie molekuly polyetylénglykolu. Na terapeutické ciele je preferované pripojenie aminoskupiny. ako je pripojenie N-koncovej alebo lyzíriovej skupín. Je potrebné sa vyhnúť pripojeniu na zvyšok významný pre väzbu na receptor, ak je väzba na receptor žiadúca.

môžu obsahovať glutámovej a

Je možné požadovať špecificky N-terminálne chemicky modifikovaný protein. Pri použití polyetylénglykolu ako ilustrácie predkladaných kompozícií je možné vybrať z množstva polyetylénglykolových molekúl (podľa molekulovej hmotnosti, vetvenia atď.), pomeru molekúl polyetylénglykolu a molekúl proteinu (alebo peptidu) v reakčnej zmesi, typu realizovanej pegylačnej reakcie a spôsobu získania vybraného N-koncovo skupín, ak pegylovariého pegylovaného proteínu. Spôsobom získania N-koncovo pegylovaného prípravu (tj. separovanie tejto skupiny od Iných monopegylovaných je to nutné) môže byť purifikácia N-koncovo materiálu z populác:ie pegylovaných proteínových molekúl. Selektívna N-koncová chemická modifikácia môže byť uskutočnené redukčnou alkyláciou, ktorá využiva rôzne reaktivity rôznych typov primárnych aminoskupín (lyzínu versus N-koncovej) dostupných pre derlvatizáciu určitého proteínu. Pri vhodných reakčných podmienkach je dosiahnutá v podstate selektívna derivatizácia proteínu na N-koncí s karbonylovou skupinou obsahujúcej polymér. Napríklad je možné selektívne N-koncovo pegylovať proteín uskutočnením reakcie pri pH, ktoré umožňuje využiť výhody rôznej pKa medzi e-aminoskupinou lyzínových zvyškov a a-aminoskupinou N-koncových zvyškov proteínu. Takouto selektívnou derivatizáciou je kontrolované pripojenie vo vode rozpustného polyméru ria proteín s konjugácia s polymérom prebi eha predominantne na N-konci proteínu a bez sígnifikantnej modifikácie iných reaktívnych skupín, ako sú aminoskupiny bočných reťazcov lyzínu. Pri použití redukčnej alkylácie môže byť vo vode rozpustný polymér typu popísaného vyššie a mal by mať jeden reaktívny aldehyd pre pripojenie na proteín. Polyetylénglykolpropiúnaldehyd, obsahujúci jeden reaktívny aldehyd, môže byť použitý.

Predkladaný vynález sa týka použitia derivátov, ktorými sú v prakaryontoch exprimované GDNF alebo jeho varianty, viazaných na aspoň jednu molekulu polyetylénglykalu. rovnako ako sa týka použitia GDNF, alebo jeho variantov, pripojených ria jednu alebo viac molekúl polyetylénglykolu prostredníctvom acyl alebo alkyl väzby.

Pegylácía môže byť uskutočnené akoukoľvek pegylačnou reakciou známou v obore. Pozri napríklad Focus on Grouth Factor. 3 (2)s 4-10, 1992; EP 0 154 316, ktorej objavy sú tu uvedené ako odkazy; EP 0 401 384; a iné publikácie, ktoré sú tu citované a ktoré sa týkajú pegylácie. Pegylácla môže byť uskutočnená acylačnou reakciou alebo alkylačnou reakciou s reaktívnou polyetylénglykolovou molekulou (alebo analogicky reaktívnym vo vode rozpustným polymérom).

Pegylácia acyláciou všeobecne vyžaduje reakciu aktívneho esterového derivátu polyetylénglykolu s GDNF proteínom alebo variantom. Akákoľvek známa alebo v budúcností objavená reaktívna PEG molekula môže byť použitá pre pegyláciu GDNF proteínu alebo variantu. Preferovaným aktivovaným PEG esterom je PEG esterlfiknvaný na N-hydroxysukcínimid. Ako je tu použitý, výraz • acylácia zahrnuje bez obmedzenia nasledujúce typy väzieb medzi terapeutickým proteínom a vo vode rozpustným polymérom, ako je

PEGs amldovú, karbamátovú, uretánovú a podobne. Pozri

Bioconjugate Chem. 5s 133-140, 1994. Reakčné podmienky môžu byť vybrané z akýchkoľvek podmienok známych v obore pegylácle alebo tých, ktoré budú ďalej vyvinuté, ale je potrebné sa vyhnúť podmienkam teploty, rozpúšťadlám a pH, ktoré by mohli inaktivovať GDNF alebo varianty, ktoré sú modifikované.

Pegylácia alebo acylácia povedie k polypegylovaným zlúčeninám podľa predloženého vynálezu GDNF proteínom alebo variantom. Preferovane bude spájacou väzbou väzba amidová. Tiež preferovane bude vzniknutý produkt len (napr. > 95fc) mono-, díalebo tri-pegylovaný. Avšak niektoré druhy s vyšším stupňom pegylácle môžu byť tvorené v množstve závisiacom od špecifických použitých reakčných podmienok. Ak je tn žiadúce, môžu byť viac purifikované pegylované druhy separované zo zmesi, predovšetkým nezreagované druhy, štandardnými purifikačnýmí technikami, • vrátane, okrem iného, dialýzy, vysoľovanla, ultrafiltrácie, iónovovymieňoačovej chromatografie, gélovej filtračnej • chromatografia e elektroforézy.

Pegylácia alkyláclou obyčajne vyžaduje reakciu koncového aldehydového derivátu PEG s GDNF proteínom alebo variantom za prítomnosti redukčného agens. Pegylácia alkyláclou môže tiež viesť k vzniku polypegylovaného GDNF proteínu alebo variantu. Okrem toho je možné upraviť reakčné podmienky s cieľom uľahčenia pegylácle v podstate len na a-mino skupine N-konca GDNF proteínu alebo variantu (tj. inonopegylovaný proteín). V prípade monopegylácie aj polypegylácie sú PEG skupiny preferovane pripojené na proteín prostredníctvom -CH-s-NH- skupiny. S odkazom na -CH_a- skupinu je tento typ väzby tu označovaný ako alkylová väzba.

Derivatizácia cestou redukčnej alkylácie za produkcie monopegylovaných produktov využíva rôzne reaktivity rôznych typov primárnych amirioskupín (lyzín versus N-koncová) dostupných pre derivatizáciu. Reakcia je uskutočnená pri pH, ktorá umožňuje využit výhody rozdielu pKa medzi e-aminoskupinou lyzínových zvyškov a a-aminoskupinou N-koncového zvyšku proteíriu. Takouto selektívnou derivatizáciou je kontrolované pripojenie vo vode polyméru, ktorý obsahuje reaktívnu skupinu, ako je na proteín: Korijugácia s polymérom prebieha na N- konci proteinu a bez signifikantnej rozpustného aldehydová, predominantne modifikácie iných reaktívnych skupín, ako sú aminoskupiny bočných reťazcov lyzínu. V jednom významnom aspekte sa vynález týka použitia v podstate homogénneho prípravku konjugovaných molekúl monopolyméru/GDNF proteín (alebo variant) (čo znamená GDNF proteín alebo variant, na ktorý bola molekula polyméru pripojená v podstate (tj. > 95%) len na jednom mieste). Presnejšie, ak je použitý polyetylénglykol, zahrnuje predkladaný vynález tiež použitie pegylovaného GDNF proteinu alebo variantu. ktorým chýbajú možné antigénne väzbové skupiny a ktoré majú molekulu polyetylénglykolu priamo viazanú na GDNF proteín alebo variant.

Tak je mienené. že GDNF proteín alebo varianty, ktoré sú použité podľa predkladaného vynálezu, môžu obsahovať pegylovaný GDNF proteín alebo varianty, kde je PEG skupina(y) pripojená prostredníctvom acyl- alebo alkylskupín. Ako bolo uvedené vyššie, takéto proteíny môžu byť monopegylované alebo polypegylované (napr. môžu obsahovať 2-6 a lepšie 2-5 PEG skupín. PEG skupiny sú obyčajne pripojené na proteín v a- alebo e-aminoskupinách aminokyselín, ale je tiež možné, aby boli PEG skupiny pripojené na akúkoľvek aminoskupinu pripojenú na proteín, ktorá je dostatočne reaktívna pre pripojenie PEG skupiny pri vhodných reakčných podmienkach.

Molekuly polyméru použité ako v prístupe acylácie, tak aj alkylácie, môžu byt vybrané z mnohých vo vode rozpustných polymérov popísaných vyššie. Vybraný polymér by mal byt modifikovaný tak, aby mal jednu reaktívnu skupinu, ako je reaktívny ester pre acyláctu alebn aldehyd pre alkyláciu. takže stupeň polymerizácie môže byt kontrolovaný ako je dané v predkladanom spôsobe. Príkladom reaktívneho PEG aldehydu je polyetylénglykol propíónaldehyd, ktorý je stabilný vo vode, alebo jeho mono Cl - CIO alkoxy alebo aryloxy deriváty (pozri U.S. Patent 5252714). Polymér môže byt rozvetvený alebo nerozvetvený. Pre acylačné reakcie by polymér mal mať jednu reaktívnu esterovú skupinu. Pre predkladanú redukčnú alkyláciu by vybraný polymér mal mat jednu reaktívnu aldehydovú skupinu. Všeobecne, vo vode rozpustné polyméry nebudú vybrané z prirodzene sa vyskytujúcich glykozylových zvyškov, pretože tieto sú obvykle vhodnejšie vyrobené pomocou cicavčích rekombinantných expresných systémov. Polymér môže mat akúkoľvek molekulovú hmotnosť a môže byt rozvetvený alebo nerozvetvený.

Jednotlivým preferovaným vo vode rozpustným polymérom pre použitie vo vynáleze je polyetylénglykol.. Ako je tu použitý, znamená výraz polyetylénglykol akúkoľvek formu PEG, ktorá bola použitá pre derivatizovanie iných proteiriov, ako je mono-(Cl CIO) alkoxy- alebo aryloxy-polyetylériglykol.

Všeobecne, chemická derivatizácia môže byť uskutočnená pri akýchkoľvek vhodných podmienkach použitých pre reakciu biologicky aktívnych substancií s aktivovanou molekulou polyméru. Metódy na prípravu pegylovaných GDNF proteínov alebo variantov budú všeobecne obsahovať tieto kroky: (a) reakciu GDNF proteínu alebo variantu s polyetylénglykolom (ako je reaktívny esterový alebo aldehydový derivát PEG) pri podmienkach, pri ktorých je proteín pripojený na jednu alebo viac PEG skupín a (b) získanie produktu reakcie. Všeobecne, optimálne reakčné podmienky pre acylačné reakcie budú určené prípad od prípadu na základe známych parametrov a požadovaných výsledkov. Napríklad väčší pomer PEG.Proteín, vyššie percento polypegylovaného produktu.

Redukčná alkylácla s cieľom produkcie v podstate homogénnej populácie molekúl korijugátov monopolymér/GNF proteín C alebo variant) bude všeobecne obsahovať tieto kroky s C a) reakciu GDNF proteínu alebo variantu s reaktívnou PEG molekulou pri podmienkach redukčnej alkylácie, pri pH vhodnom na to, aby bola umožnená selektívna modifikácia a-aminoskupiny na aminokonci uvedeného GDNF proteínu alebo variantu; C b) získanie produktu reakcie.

populácie molekúl konjugátov variant) sú reakčné podmienky umožňujú selektívne pripojenie proteínu, ktorý je použitý, požadovaný väčší prebytok

Pre v podstate homogénne monopolymér/GDNF proteiri C alebo redukčnej alkylácie tie, ktoré skupiny vo vode rozpustného polyméru ria N-koniec GDNF proteínu alebo variantu. Takéto reakčné podmienky obvykle poskytujú pKa rozdiely medzi lyzínovými aminoskupíriami a a-aminoskupínam! na N-konci C kde pKa je pH, pri ktorom je 50% a m in os k upi n protúnovaných a 50% nie). pH tiež ovplyvňuje pomer polyméru k Všeobecne, ak je pH nižšie, potom je polyméru nad proteínom Ctj. s menej reaktívnou N-koncovou a-aminoskuplnou je potrebného viac polyméru na to, aby boli dosiahnuté optimálne podmienky). Ak je pH vyššie, potom nemusí byť pomer polymérsproteín tak vysoký <tj. čím reaktívriejšie skupiny sú dostupné, tým menej molekúl, polyméru je potrebných). Pre ciele predkladaného vynálezu bude všeobecne pH v rozsahu 3-9, preferovane 3-6.

Iným významným činiteľom je molekulová hmotnosť polyméru. Všeobecne, čím vyššia je molekulová hmotnosť polyméru, tým menej molekúl polyméru môže byť pripojených na proteín. Obdobne, vetvenie polyméru musí byť zobrané do úvahy pri optimalizácii týchto parametrov. Všeobecne, čím vyššia je molekulová hmotnosť (alebo viac vetvenia), tým vyšší je pomer polymér«proteín. Všeobecne, pre pegylačné reakcie tu uvádzané je preferovaná priemerná molekulová hmotnosť okolo 2 kDa až 100 kDa. Preferovaná priemerná molekulová hmotnosť je od asi 5 kDa do asi 50 kDa, predovšetkým od 12 kDa do asi 25 kDa. Pomer vo vode rozpustného polyméru ku GDNF proteínu alebo variantu bude obvykle v rozsahu od lsl do 100s 1, preferovane (pre polypegyláciu) lsl až 20:1 a (pre monopegyláciu) 1:1 až 5:1.

Pri použití podmienok ukázaných vyššie bude redukčná alkylácia poskytovať selektívne pripojenie polyméru na akýkoľvek GDNF proteín alebo variant majúci a-aminoskupinu na amiriokonci a * bude poskytovať v podstate homogénny prípravok konjugátu inonopolymér/GDNF proteín (alebo variant). Termín monopoly• mér/GDNF proteín (alebo variant) konjugát, ako je tu použitý, znamená kompozíciu zloženú z jednej molekuly polyméru pripojenej na GDNF proteín alebo GDNF variantný proteín. l*Ionopolymér/GDNF protein (alebo variant) konjugát bude preferovanej mať molekulu umiestenú na N-konci, ale nie na boCnej aminoskupine lyzínu. Prípravok by mal preferovane obsahovať viac ako 90 X moriopolyméru/GDNF proteín (alebo variant) konjugátu a ešte lepšie viac ako 95 X monopolymér/GDNF proteín (alebo variant) konjugátu s tým. že zvyšok pozorovateľných molekúl je nezreagovaný (tj. proteínu chýba polymérová skupina).

Pre predkladanú redukčnú alkyláciu by malo byť redukčné agens stabilné vo vodnom roztoku a preferovane by malo byť schopné redukovať len SchifFovú bázu tvorenú v začiatočnom procese redukčnej alkylácie. Preferované redukčné agens môžu byť vybrané z bórhydridu sodného. kyanobúrhydridu sodného, ' dimetylamirioboránu, trimetylboránu a pyridínboránu. Veľmi preferovaným redukčným agens je kyanobórhydrid sodný. Iné reakčné parametre, ako je rozpúšťadlo, reakčné časy, teploty atď. a prostriedky purifikácie produktu môžu byť určené pre každý prípad osobitne na základe publikovaných inFormácií týkajúcich sa derivatizácie proteínov s vo vode rozpustnými polymérmi (pozri publikácie tu citované).

C. Farmaceutické kompozície GDNF proteínového produktu

Farmaceutické kompozície GDNF proteínového produktu typicky obsahujú terapeuticky účinné množstvo GDNF proteínového produktu v zmesi s jedným alebo viacerými farmaceutický a fyziologicky akceptovateľnými materiálmi prípravku. Vhodné materiály pre formuláciu zahrnujú, ale nie sú obmedzené na, aritioxidanty. prezervatíve, farbivá, ochuťujúce a riediace ageris, emulzifikačné ageris. suspendačrié činidlá, rozpúšťadlá, plnivá, objemové agens. pufre, vehíkulá, riedidlá, excipienty a/alebo farmaceutické adjuvans. Napríklad vhodným vehikulom môže byť voda pre injekcie, fyziologický roztok alebo arteficiálna perilymfa, podľa potreby doplnené inými materiálmi bežne používanými v kompozíciách pre pareriterálne využitie. Neutrálny pufrovaný salinický roztok alebo salinický roztok zmiešaný so sérovým albumínom sú ďalšie príklady vehikúl.

Primárne rozpúšťadlo vo vehikulu môže mať vodný alebo rievodný charakter. Okrem toho, vehikulum môže obsahová Ľ iné farmaceutický akceptovateľné excipienty ria modifikáciu alebo udržanie pH, osmolarity, viskozity, čír osti. farby. sterility, stability. stupňa rozpustenia alebo zápachu formulácie. Obdobne môže vehikulum obsahovať ešte iné farmaceutický akceptovateľné excipienty na modifikáciu alebo udržanie stupňa uvoľňovania GDNF proteínového produktu, alebo na navodenie absorpcie alebo penetrácie GDNF proteínového produktu cej tympariálnu membránu. Takýmito excipientmi sú Lie substancie, ktoré sú obvykle používané na Formulovanie dávok na podanie do stredného ucha, buď vo forme jednej dávky, alebo vo forme viacerých dávok.

Hneď ako bola terapeutická kompozícia formulovaná, môže byť skladovaná v sterilných nádobách ako roztok, suspenzia, gél, emulzia, pevná látka alebo ako dehydratovaný alebo lyofilizovaný prášok. Takéto formulácie môže byť skladované buď vo forme pripravenej na použitie, alebo vo forme, napr. lyofílizovanej, ktorá vyžaduje rekonštitúciu pred podaním.

Optimálne farmaceutické formulácie budú odbornikom určené v závislosti od okolností, ako je spôsob podania a požadovaná dávka. Pozri napríklad Remirigton's Pharmaceutical Sciences. 18. vydanie (1990. Mack Publishing Co., Easton. PA 18042) strany 1435-1712. ktorých poznatky sú tu uvedené ako odkaz. Takéto formulácie môžu ovplyvňovať fyzikálny stav, stabilitu. stupeň uvoľňovania in vivo stupeň iri vivo clearence predkladaných GDNF proteinov, variantov a derivátov.

Iné účinné formy podania, ako sú prípravky do stredného ucha so spomaleným uvoľňovaním, inhalačné hmly alebo orálne aktívne formulácie sú tiež predpokladané. Napríklad v prípravkoch so stálym uvoľňovaním môžu byť. GDNF proteínové produkty naviazané alebo inkorporovarié do jednotlivých prípravkov pol ymérových zlúčenín (ako je kyselina polymliečna, kyselina polyglykolová atrf) alebo do lipozúmov. Tiež môže byť. použitá kyselina hyalurúnová, ktorá môže spôsobiť navodenie trvalej prítomnosti, v cirkulácii. Farmaceutické kompozície GDNF proteínového produktu môžu tiež byť. formulované pre podanie do stredného ucha, napr. infúziou alebo injekciou do tympanálnej membrány a môžu tiež obsahovať prípravky so spomaleným uvoľňovaním alebo trvalou cirkuláciou. Takéto terapeutické prípravky pre podanie do stredného ucha sú typicky vo forme vodného roztoku pre podanie do stredného ucha neobsahujúceho pyrogény a obsahujúceho GDNF proteínový produkt vo farmaceutický akceptovateľnom vehikulu. Jedným z preferovanýeh vehikúl je sterilná destilovaná voda.

Je tiež predpokladané, že určité formulácie obsahujúce GDNF proteínový produkt budú podané orálne. GDNF proteínový produkt, ktorý je popísaný týmto spôsobom. môže byť v kapsulkách a môže byť. formulovaný s alebo bez nosičov obvykle používaných v zlúčeninách pre pevné dávkové formy. Kapsulky môžu byt vyrobené tak, aby uvoľňovali aktívnu časť prípravku v mieste gastroíntestínálneho traktu, kde je biodostupnosť maxlmalizovaná a presystémová degradácia je minimalizovaná. Môžu byť obsiahnuté ďalšie excipienty na uľahčenie absorpcie GDNF proteínového produktu. Riedidlá, ochuťovadlá, vosky s nízkou teplotou topenia, rastlinné oleje, lubrikanty, suspendujúce agens. tablety deziritegrujúce agens a spojivá môžu byť tiež použité.

Formulácie pre prípravky lokálneho podania do ucha. obsahujúce roztoky. suspenzie a masti do stredné ucha. sú odborníkom dobre známe (pozri Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydanie, kapitola 86, str. 1581-1592, ľlack Publlshing Coinpany. 1990) . Sú dostupné iné spôsoby podania, vrátane injekcií do stredného ucha a spôsoby a prostriedky pre produkciu prípravkov do stredného ucha pre takéto spôsoby sú tiež dobre známe.

Ako je tu použité v tejto prihláške, označuje stredné ucho prj.es t or medzi tyinpanálnou membránou a vnútorným uchom. Táto lokalita leží externe vzhľadom na všetky tkanivá vnútorného ucha a nie je vyžadovaný invazívny postup pre prístup do tohoto regiónu, ak bude formulácia vyvinutá tak. aby GDNF penetroval cez tympariálnu membránu. Inak bude materiál zavedený od stredného ucha injekciou cez tympanálnu membránu alebo, v prípade, že je vyžadované opakované podaní e, môže byt v tympanálnej membráne vytvorený otvor. Príklady takýchto systémov obsahujú inzerty a lokálne aplikované kvapky, gély a masti, ktoré môžu byť použité na dopravenie terapeutického materiálu do týchto regiónov. Otvorenie tympanálnej membrány je veľmi častá procedúra uskutočňovaná ambulantným spôsobom, v prípadoch ako je infekcia stredného ucha (obvykle u detí). Otvor sa spontánne uzatvorí počas niekoľkých dní.

V popisovanom použití GDNF proteínového produktu na liečenie chorôb a porúch vnútorného ucha je tiež výhodou, že lokálne aplikovaná formulácia obsahuje agens na navodenie penetrácie alebo transportu terapeutického agens do stredného alebo vnútorného ucha. Napríklad, Ke et al., U.S. 5221696 popisuje použitie materiálov na zvýšenie penetrácie očných preparátov cez rohovku.

Systémy pre vnútorné ucho sú tie systémy, ktoré sú vhodné na to. aby boli použité vnútri akéhokoľvek tkanivového kompartmentu. medzi alebo v okolí, tkanivových vrstiev vnútorného ucha, ako je kochlea alebo vestibulárny orgán. Tieto lokality zahrnujú rôzne štruktúry kochley ako je stria vascularis, Reissnerova membrána. Cortiho orgán, spirálne ligamentum a kochleárne neuróny. Invazivna procedúra nemusí byť vyžadovaná pre prístup k týmto štruktúram. pretože bolo ukázané, že proteín penetruje cez membránu okrúhleho okienka do perilymFy vnútorného ucha. Veľmi vhodným vehikuloin na zavedenie GDNF do vnútorného ucha perietráciou cez membránu okrúhleho okienka je arteficíálna perílymfa. Tento roztok je zložený z 10,00 mM D-g]ukózy, 1,5 mM CaCl, 1, 5 mM MgCl v 1.02 roztoku Oulbeco Fosfátom pufrovaného salinického roztoku v deioriizovanej vode pri 280-300 mOsin a pH 7,2. Ešte iný prípravok môže obsahovať formuláciu GDNF proteínového produktu s agens. ako sú injektovateľné mikrosféry alebo lipozómy pre stredné ucho. ktorý poskytuje pomalé alebo trvalé uvoľňovanie proteínu. ktorý potom môže byť dopravený ako depotriá injekcia. Inými vhodnými, prostriedkami na zavedenie GDNF proteínového produktu do vnútorného ucha sú implaritova teľné prostriedky ria podanie liekov alebo prostriedky, ktoré obsahujú GDNF proteínový produkt a knchleárne implantáty s kanálom, takže GDNF môže byť cez ne kontinuálne podávaný do vnútorného ucha.

Prípravky na ušné lleCenie podľa predkladaného vynálezu, predovšetkým lokálne prípravky. môžu obsahovať iné zložky, napríklad pre stredné ucho akceptovateľné prezervatívy.

tonizu júr.e pufrovacie surfaktant y.

agens. korozpúšťadlá, komplexy agens, antimikrobiálne látky, ako je v obore dobre známe.

tvoriace agens, aritloxldarity a

Napríklad vhodné alkalických kovov toriicitu zvyšujúce agens obsahujú halogenidy (predovšetkým chlorid sodný alebo draselný), mariitol, sorbitol a podobne. Výhodne je pridaný dostatok toriicitu ovplyvňujúceho agens. takže formulácia, ktorá má byť instilovaná do ucha, je kompatibilná s osmolaritou endo a perilymfy. Vhodné prezervatívy zahrnujú. ale nie sú obmedzené na. berizalkochlorid. timerosal. feriytyl alkohol, metylparabén, propylparabén. chlórhexidín, kyselinu sorbovú. a podobne. Peroxid vodíka môže byť tiež použitý ako prezervatív. Vhodné korozpúšťadlá zahrnujú. ale riie sú obmedzené na, glycerín, propylériglykol a polyetylénglykol. Vhodné komplexy tvoriace agens obsahujúc kofeín, polyvinylpyrolidóri, e-cyklodextrín alebo hydroxypropyl-e-cyklodextrín. Pufre môžu byť bežné, ako je borátový, citrátový, fosfátový, bikarbonátový alebo Tris-HCl.

Komponenty formulácii sú prítomné v koncentráciách, ktoré sú akceptovateľné pre podanie do stredného alebo vnútorného ucha. Napríklad sú použité pufre na udržanie fyziologického pH, typicky v rozsahu pH od asi 5 do asi 8.

polyméry alebo prípravku do

Ďalšie zložky formulácií môžu obsahovať materiály, ktoré predlžujú prítomnosť podaného terapeutického agens v strednom uchu, takže maximalizujú lokálny kontakt a navodzujú absorpciu cez membránu okrúhleho okienka. Vhodné materiály zahrnujú gély tvoriace materiály, ktoré zvyšujú viskozitu stredného ucha. Vhodnosť formulácií podľa predkladaného vynálezu na kontrolované uvoľňovanie (napr. trvalé a prolongované pridanie) agens na liečenie vnútorného ucha môže byt určená pomocou rôznych postupov známych v obore. Ešte iný ušný prípravok môže obsahovat účinné množstvo GDNF proteínového produktu v zmesi s netoxickými pre stredné ucho akceptovateľnými excipientmi, ktoré sú vhodné na výrobu tabliet. Rozpustením tabliet v sterilnej vode, alebo v inom vhodnom vehikulu, môžu byť pripravené roztoky na podanie do stredného ucha v jednotkovej dávkovej forme. Vhodné excipienty obsahujú, ale nie sú obmedzené na, inertné rozpúšťadlá, ako je uhličitan alebo hydrogenuhlčitan vápenatý, laktóza, fosforečnan vápenatý alebo spojivá, ako je škrob, želatína alebo arabská guma.

Podanie/dopravenie GDNF proteínového produktu

GDNF proteínový produkt môže byť podaný parenterálne alebo subkutánne lntramuskulárne, intravenózne, transpulmonálne, transdermálne, intratekálne alebo intracerebrálrie. Pri liečení chorobných stavov vnútorného ucha môže byť GDNF proteínová produkt podaný priamo do stredného ucha (alebo priamo do vnútorného ucha, predovšetkým v prípadoch, kde už prebehla invazívna procedúra) lokálnou aplikáciou. Inzerciou injekciou, implantáciou, bunkovou terapiou alebo génovou terapiou. Napríklad iinplantáty so spomaleným uvoľňovaním obsahujúce rieurotrofné faktory umiestené v biodegradovateľnej polymérizovanej matrici môžu dopraviť GDNF proteínový produkt. GDNF proteínový produkt môže byť podaný extracerebrálrie vo Forme, ktorá bola chemicky modifikovaná alebo obalená tak, že prechádza cez hematoencefalickú bariéru, alebo môže byt podaný v spojení s jedným alebo viacerými agens, ktoré sú schopné navadiť penetráciu GDNF proteínového produktu cez bariéru. Podobne, GDNF proteínový produkt môže byť podaný do stredného alebo vnútorného ucha, alebo môže byť podaný vo vrchole tympanálnej membrány v spojení s jedným alebo viacerými agens, ktoré sú schopné navodiť penetráciu alebo transport GDNF proteínového produktu cez membrány ucha. Frekvencia dávkovania bude závisieť od farmakokinetických parametrov GDNF proteínového produktu, ako je formulovaný a od spôsobu podania.

Špecifická dávka muže byť spočítaná po uvážení telesnej hmotnosti. povrchu tela alebo veľkosti orgánu. Ďalšia úprava výpočtu, nevyhnutná pre určenie vhodnej dávky pre liečbu každou z vyššie uvedených formulácií, je rutinne odborníkom uskutočňovaná a je v rozsahu rutinne uskutočňovaných testov, predovšetkým v svetle informácií o dávke a testov tu popísaných. Vhodné dávky môžu byt ozrejmené použiLím zavedených skúšok použitých v konjurikcii s vhodnými dátami dávka-odpoveď. Odborníkom bude jasné, že dávka použitá vo formuláciách na podanie do vnútorného ucha biude minimálna v porovnaní s dávkou použitou pre systémovú injekciu alebo orálne podanie. Konečný dávkový režim využitý v spôsobe na liečenie vyššie uvedených stavov bude určený ošetrujúcim lekárom po zvážení rôznych faktorov, ktoré modifikujú účinok liečiv, napr. veku, stavu, telesnej hmotnosti, pohlavia a diéty pacienta, závažnosti akejkoľvek infekcie, doby podania a iných klinických faktorov. Ako budú uskutočňované štúdie, budú sa objavovať ďalšie informácie o vhodnej dávkovej hladine pre liečenie rôznych chorôb a stavov.

Predpokladá sa. že kontinuálne podanie alebo trvalé podanie GDNF môže byt pre danú liečbu výhodné. Ak je kontinuálne podanie uskutočnené pomocou mechanických prostriedkov, ako je infúzria pumpa, potom sa predpokladá, že môžu byt uskutočnené iné spôsoby kontinuálneho alebo takmer kontinuálneho podania. Napríklad chemická derivatizácia alebo erikapsulácia môžu viest k formám proteínu s trvalým uvoľňovaním, ktoré vedú ku kontinuálnej prítomnosti predvídateľného množstva na základe určeného režimu dávkovania. Tak môžu GDNF proteínuvé produkty obsahovať proteíny derivatizovarié alebo inak formulované na to, aby bolo zrealizované takéto kontinuálne podanie.

Bunková terapia GDNF proteínovým produktom, napr. implantácia buniek produkujúcich GDNF proteínový produkt do stredného alebo do vnútorného ucha, je tiež predpokladaná. Táto realizácia bude vyžadovať implantáciu buniek schopných syntézy a sekrécie biologicky aktívnej formy GDNF proteínového produktu pacientovi. Takéto GDNF proteínový produkt produkujúce bunky môžu byt bunky, ktoré prirodzene produkujú GDNF proteínový produkt Carialógrie s B49 glioblastovýml bunkami) alebo to môžu byt rekombinantné bunky, ktorých schopnosť produkovať GDNF proteínový produkt bola zvýšená transformáciou génom kódujúcim požadovaný GDNF proteínový produkt vo vektore na navodenie jeho expresie a sekrécie. Aby sa minimalizovala potenciálna imunologická reakcia pacienta, ktorému je podaný GDNF proteínový produkt cudzieho druhu. preferuje sa. aby prirodzené bunky produkujúce GDNF proteínový produkt mali ľudský pôvod a aby produkovali ľudský GDNF proteínový produkt. Podobne je preferované. aby rekombinantné bunky produkujúce GDNF proteínový produkt boli transformované expresným vektorom obsahujúcim gén kódujúci ľudský GDNF proteínový produkt. Implantované bunky môžu byt enkapsulované s cieľom vylúčenia Infiltrácie okolitého tkaniva. Ľudské alebo non-ľudské zvieracie bunky môžu byť implantované pacientovi v biokompatibílných, semipermeabilných polymérových kontajneroch alebo membránach. ktoré umožňujú uvoľňovanie GDNF proteínového produktu. ale ktoré bránia v deštrukcii buniek imunitným systémom pacienta alebo inými škodlivými faktormi z okolitých tkanív. Takéto implantáty môžu napríklad byt pripojené ria membránu okrúhleho okienka stredného ucha a môžu produkovať a uvoľňovať GDNF proteínový produkt priamo do perilymfy.

Zamýšľa sa tiež, ež vlastné bunky pacienta môžu byť transformované ex vivo pre produkciu GDNF proteínového produktu môžu byC implantované priamo bez zapuzdrenia. Napríklad môžu byt získané podporné bunky Cortiho orgánu, bunky môžu byť kultivované a transformované vhodným vektorom a transplantované späť do vnútorného ucha pacienta, kde môžu produkovať a uvoľňovať požadovaný GDNF proteín alebo variant GDNF proteinu.

Génová terapia GDNF proteínovým produktom in vivo je tiež plánovaná, zavedením génu kódujúceho GDNF proteínový produkt do cieľových buniek vnútorného ucha prostredníctvom lokálnej injekcie korištruktu nukleovej kyseliny alebo inými prenosovými vektormi.. (HeFti, J. Neurobiol., 25» 1418-1435, 1994). Napríklad sekvencia nukleovej kyseliny, ktorá kóduje GDNF proteínový produkt, môže by Ľ obsiahnutá v adenoasociovariom vírusovom vektore alebo v adenovírusovom vektore pre prenos do buniek vnútorného ucha. Alternatívne vírusové vektory zahrnujú, ale nie sú obmedzené na, retr ovírusové, vírus herpes slmplex a plpllloma vírusové vektory. Fyzikálny prenos, buď in vivo alebo ex vivo, môže byť tiež uskutočnený lipozómami sprostredkovaným transferom, priamou injekciou, (čistá DNA), receptormi sprostredkovaným prenosom (ligand-DNA komplex). elektroporáciou, precipitáciou fosforečnanom vápenatým alebo bombardovaním mikročasticami (génová zbraň).

Metodológia membránového opuzdrenia žijúcich buniek je podobná postupom v obore používaným a príprava opuzdrených buniek a ich implantácia pacientovi môže byť uskutočňovaná bez zbytočných pokusov. Pozri napr. U.S. patenty č. 4892538 a 5106627, kde každý z nich je tu uvedený ako odkaz. Systém na zapuzdrenie žijúcich buniek je popísaný v PCT prihláške UO 91/10425 Aebischera et al., tu uvedenej ako odkaz. Pozri tiež PCP prihlášku UO 91/10470 Aebischera et al., Uiriri et al.. Exper.

Neurol., 113. 322-329, Aebischer et al., Exper. Neurol.. 111. 269-275. 1991i Tresco et al.. ASATO. 38. 17-23. 1992. ktoré sú tu špecificky uvedené ako odkazy. Techniky formulovania mnohých ďalších prostriedkov s trvalým alebo kontrolovaným uvoľňovaním, ako sú lipozúmové nosiče, bioerudovateľné častice alebo korálky a depo ti ié injekcie sú tiež odbor nikom v obore známe.

Je potrebné si tiež povšimnúť. že formulácie GDNF proteínového produktu, ktoré sú tu uvedené, môžu byt použité veterinárne, rovnako ako aj pre ľudí a že termín pacient by nemal byť chápaný obmedzeným spôsobom. V prípade veterinárneho použitia by mal byť rozsah dávok rovnaký ako bolo špecifikované vyššie.

Iné aspekty a výhody predkladaného vynálezu budú ozrejmené nasledujúcimi ilustrativnymi príkladmi. Príklad 1 popisuje účinok podania GDNF proteínového produktu na vláskové bunky kultivačného systému kochleárneho explaritátu. Príklad 2 popisuje účinok podania GDNF proteínového produktu na neuróny splrálneho ganglia v disociovanej bunkovej kultúre generovanej z kochley. Výsledky štúdii kultúr explaritátu Cortiho orgánu a neuroriálnych kultúr splrálneho ganglia dospelého potkana ukazujú, že GDNF proteínový produkt má rieurotrofnú a ochrannú aktivitu pre sluchové neuróny a vláskové bunky Cortiho orgánu proti ototoxínoin, kde pre tieto doteraz nebolo známe, že reagujú na GDNF.

Príklady realizácie vynálezu

Príklad 1

GDNF proteínový produkt chráni kochleárne vláskové bunky pred ototoxicitou

Materiál«

Materiály použité v nasledujúcom príklade boli získané nasledujúcim spôsobom.

Pitevný roztok Cortiho orgánu:

Dulbeccov fosfátom pufrovaný saliriický roztok (PBS; 1 x bez chloridu vápenatého, bez chloridu horečriatého, kat. č. 14190-136, Gibco BRL). obsahujúci 1,5 g], D-glukózy (Dextrúza kat. C.

15023-021, Gibco-BRL).

Kultivačné médium explantátov Cortiho orgánu:

'J.. Dulbeccovo modifikované Eagle médium s vysokým obsahom glukózy (DMEM; 1 x, s L-glutamínom, bez pyruvátu sodného, kat. č. 11965-084. Gibco-BRL).

2. 0, 15 g/lDO ml D-glukózy (Dextróza kat. č. 1.5023-021, Gibco-BRL).

3. IX N-2 Suppleinent (100 x. kat. č. 17502-030, Gibco-BRL).

	4. 100	U/ml Penicilínu G,	draselnej	soli	(Periicillin; kat.
č.	21840-020.	Gibco-BRL).
	Metódy:
	Príprava	média
	DMEM bolo doplnené IX N-2	doplnkom a	bola	pridaná D-glukóza
do	konečnej	koncentrácie 1,5	g/1. Bol	pridaný penicilín 100

jedno tiek/inl. Po zmiešaní bolo médium filtrované a uchované pri 4 °C. Médium bolo čerstvo pripravené tesne pred pokusmi, aby sa minimalizovali variácie medzi experimentmi. Boli použité plastové pipety a kontajnery, aby sa minimalizovala absorpcia proteinu.

Roztoky GDNF proteínového produktu

Purifikované ľudské rekombinaritné GDNF proteínové produkty boli pripravené ako 1 mg/ml roztoky v D-PBS (fosfátom pufrovaný salinický roztok pripravený v destilovanej vode) obsahujúcom päťpercentný hovädzí sérový albumín. Roztoky boli skladované pri -85 °C v alikvótach. Boli pripravené sériové riedenia (0,1; 1;

jamkových mlkroplatrilach. koncentrovaných roztokov pridaných do kultivačného ototoxín obsahujúceho

Desať

GDNF média alebo

10; 25; 50 ng/ml) na 96 mikrolitrov desaťnásobne proteínového produktu bolo explantátu Cortiho orgánu neobsahujúceho (kontrola) (90 ul) . Kontrolné kultúry dostali normálne médium (10 ul) . Ošetrenie! GDNF proteínovým produktom sa začalo ten deň, ktorý bolo umiestené kultivačné médium. Na druhý deň bolo médium vymenené za médium obsahujúce len ototoxín, ototoxín s GDNF alebo bez nich obidvoch (kontrola).

Pitevné nástroje a kultivačné platničky

1. 4 a 5 pitevné kliešte a 4 pitevné skalpely boli do ROBOZ Surgical, Washington, DC.

2. Falcon sterilné 96-jamkové mikroplatničky (ploché dno, kat. č. 3072), plastové výrobky pre tkanivové kultúry a propylénové centrifugačné tuby boli do Beckton-Dicklnson, Lincoln Park, New Jersey.

Ototoxíny a s nimi spojené reagens

1. Roztok neomycinu (kat. č. N1142, Sigma, St. Louis. MO), použitý v konečnej koncentrácii 0,6 ml*l (čerstvý roztok bol vyrobený pre každý pokus pridaním 90 ul lmg/ml neomycinu do 1410 ul média).

2. Cisplatlna (Platiriol-AO., kat. č. NDC 0015-3220-22, Bristol-Myers Squibb Laboratories, Princeton, New Jersey). Použité v konečnej koncentrácii 35 ug/ml (čerstvý roztok bol vyrobený pre každý pokus pridaním 52, 5 ul lmg/ml cisplatíny do 1447, 5 ul média).

3. Triton X-100 (t-oktylferiaxypoly-etoxyetariol., kat. C.

X-100. Sigma. St. Louis. 1*10).

4. Falloidiri C FITC značený. kat. č. P-5282. Sigma. St. Louis. Γ10) .

5. Vectashield (ľlounting Médium. kat. č. H-1000. Vector Burlingame, CA).

Príprava potkanieho explantátu Cortiho orgánu

Explaritáty Cortiho orgánu boli získané od P3-P4 Wistar potkanov. Potkany boli dekapitované, dolná čeľust bola nastrlhnutá a koža bola odstránená. Temporálne kostí boli umiestené do pitevného roztoku, ušná kapsula bola odhalená a kosteno-chrupavkovitá kochleárria kapsula bola opatrne separovaná od temporálnej kosti. Uvoľnená kochlea bola prenesená do ďalšej Petrího misky s pitevným roztokom pre ďalšiu pitvu. Iritaktné Cortiho orgán bol získaný použitím jemných klieští na podržanie centrálneho tkaniva VIII nervu a na jeho odstránenie, potom bola opatrne rozstrihnutá membrána stria vascularis, od apexu po bázu. Cortiho orgán bol potom prenesený do Petrího misky s priemerom 35 mm obsahujúcej chladné PBS doplnené glukózou a pripravené pre kultiváciu.

Kultivačné postupy kochleárnych explaritátov

Kochleárrie explantáty boli kultivované na nepotiahriutých 96 jamkových iníkroplatriíčkách. Jeden Cortiho orgán bol umiestený do jamky a udržiavaný ponorený v médiu. Explantáty boli uchovávané v normálnom médiu 24 hodín (90 ug/jamku). Roztok GDNF proteínu (10 ul) bol pridaný do liečených kultúr a 10 ul média bolo pridaných do koritrôl. Po 24 hodinách inkubácie bolo médium vymenené a explantáty boli vystavené ototoxín-obsahujúcemu médiu (9D ul). s roztokom GDNF proteínu (10 ul) alebo bez neho (kontrola). Kultúry bolí kultivované ďalšie tri dni. Explantáty boli potom fixované 4% paraformaldehydom v 0.1 ΙΊ D-PBS 3D minút pri izbovej teplote a boli spracované pre imuriof arberiie.

Farbenie vláskových buniek FITC-faloídíriom

S cieľom identifikácie a spočítania vláskových buniek v Cortiho orgáne bola použitá metóda priameho imunofarbenia na označenie aktínu prirodzene prítomného v zväzku stereocílíi vláskových buniek. Explantáty boli premyté trikrát D-PBS (200 ul/jamku) a boli permeabilizované 1% Triton X-100 v D-PBS 15 minút pri izbovej teplote. Po trojitom premytí v D-PBS boli explantáty inkubované s FITC-zriačeriým faloidínoin (1:60 zo zásobník, 50 ul/jamku) 45 minút pri izbovej teplote. Platničky boli prekryté hliníkovou fóliou, pretože faloidiri je citlivý na svetla. Po troch ďalších premytiach D-PBS boli značené explantáty umiestené v kvapke glycerolu na mikroskopickom sklíčku, prekryté krycím sklíčkom a uzatvorené lakom na nechty. Explantáty boli prezerané na Nikon Diaphot-300 invertovanom fluorescenčnom mikroskope pri použití FITC filtrov a fluorescenčnej optiky.

Určenie počtu vláskových buniek

Pre každú časť pokusu boli použité 2-4 kochley. V každej kochlee bol počet vláskových buniek počítaný v 2-3 rezoch s dĺžkou 175 um. Boli analyzované leri rezy v strednej časti kochley. Každý pokus bol niekoľkokrát opakovaný. Počet vláskových buniek v kontrolách a cisplatinou alebo neoinycinom ošetrených kultúrach bol vytvorený z analýz 40 kochleí.

Výsledky

Vláskové bunky v plávajúcich kultúrach explantátov neumierali počas pokusnej periódy štyroch dni. Počet faloidíriom sa farbiacich buniek prítomných na konci 4-denriej pokusnej periódy, pri absencii ototoxínov a ošetrenia, bol 105,4 ± 6, 9 (n=28) . Oto toxíny pridané k explaritátom druhý deň po umiestení spôsobovali signifikantnú stratu počtu vláskových buniek po 4 dňoch iri vitro. Expozícia 35 ug/ml clsplatine 24 hodín po umiestení do kultúry spôsobila stratu okolo 80 % vláskových buniek: len 21,2 % ± 6,0 (n=40) začiatočného počtu buniek prežívalo (tabuľka 2) a po expozícii 0.8 ml*l neomycínu prežívalo len 7,4 % ± 4,7 (n=43) vláskových buniek (tabuľka 2).

Tabulka 2

Účinok GDNF ria kochleárrie vláskové bunky vystavené cisplatine

Liečba Prežívanie vláskových buniek (X neošetrených)

GDNF pridaný počas GDNF pridaný 24 hodín po umiestenia na platňu umiestení ria platňu

Cisplatina sama	21, 3 ±	4, 0 (n=30)	21,3 ± 4,0 (ri=30)
Cisplatina +
GDNF. 0,05 ng/ml	35,2 ±	5,4 (n-5)*	ND
Cisplatina +
GDNF, 0. 1 ng/ml	39, 6 ±	10,5 (ri-17)*	37.8 ±11,8 (n=5)*
Cisplatina +
GDNF, 1 ng/ml	46, 7 ±	10,8 (n=20)	51.0 ±8.0 (ri=4)*
Cisplatina +
GDNF. 10 ng/ml	46, 7 ±	7.7 (n=16)*	49.7 ±4.6 (n=5)*
Cisplatina +
GDNF. 25 ng/ml	ND	45,0 ± 12,0 (n=3)
Cisplatina +
GDNF, 50 ng/ml	46, 8 ±	10. 5 (n=31)*	ND

GDNF bol zavedený do kultúr explaritátov buď ten deň. kedy sa umlesťovalo na platňu, alebo 24 hodín po tom. Cisplatina (35 ug/ml) bola pridaný 24 hodín po umiestení na platňu a kultúry boli inkubované ďalšie 3 dni. Vláskové bunky boli farbené FITC-faloidinom. Počet vláskových buniek bol počítaný strednej časti kochley v 2-3 rezoch po 175 um. Výsledky sú vyjadrené ako percento vláskových buniek prítomných v neošetrenej kultúre po 4 dňoch in vitro (105,4 ± 6.9; n=28). Každé číslo je priemer ± SD n kochlei.

** Signifikantne odlišné od clsplatiny samej pri p < 0,05 (t-test)

ND nedefinované

Existoval tu jasný rozdiel v morfológii Cortiho orgánov medzi týmito dvoma ošetreniami» zatiaľ čo ošetrenie neomycínom viedlo k takmer kompletnej strate vláskových buniek, tie, ktoré boli uchované, boli stále organizované v typicky štvorvrstvovej štruktúre (3 vrstvy vonkajších vláskových buniek a jedna vrstva vnútorných vláskových buniek). Ošetrenie cisplatinou. na druhej strane. spOsobilo znaCné narušenie štvorvrstvovej štruktúry a prežívajúce bunky boli náhodne rozmiestené.

V kultúrach, ktoré dostali GDNF počas umiestenia na platňu (predošetrenie), prežíval signifikaritný počet buniek po 3-dennej expozícii ototoxínom (odo dňa 2 do dňa 4). V kultúrach vystavených cisplatine spôsobilo ošetrenie GDNF v koncentráciách D, 05 ng/ml zvýšenie vláskových buniek z 21 Z (neošetrené kultúry) na 35 %. Maximálna ochranná ak tivlta bola dosiahnutá pri D, 1 ng/ml GDNF (41 % prežívania) (tabuľka 3). V kultúrach vystavených rieomycínu zvyšoval GDNF v 0,1 ng/ml počet vláskových buniek zo 7 X na 22 %; maximálna aktivita GDNF (37Z prežívanie) bola pozorovaná pri 10 rig/inl GDNF (tabuľka 3). Ošetrenie GDNF zachovalo štvorvrstvovú morfológiu v neomycínom ošetrených kultúrach, ale nezabránilo jej v narušení cisplatinou.

S cieľom ďalšieho testovania schopnosti GDNF chrániť vláskové bunky pred ototoxicitou bola uskutočnená skupina pokusov, v ktorých bol GDNF pridaný 24 hodín po umiestení na platne, v rovnakej čase, ako boli kultúry vystavené toxínom (koošetrenie) . Výsledky ukazujú, že pri. takýchto podmienkach testu je GDNF schopný chrániť vláskové bunky v rovnakom rozsahu, ako keď je podaný pred vystavením toxinu (tabuľky 2 a 3) .

Tabuľka 3

Účinok GDNF na kochleárrie vláskové bunky vystavené neomycínu

Liečba Prežívanie vláskových buniek (.% neošetrených)

GDNF pridaný počas GDNF pridaný 24 hodín po umiestenia na platňu umiestení na platňu

Neomycín sám

0. 8ml*I 7.1 ±4.2 (n=42) 7.1 ± 4,2 (n=42)

Neomycín +

GDNF, 0, 05 ng/ml	19. 5	i	7. 5	(n=6)~	23, 0	+ 6,2 (n=3)
Neomycín +
GDNF, D, 1 ng/ml	22, 0	+	4. 1	(n=13)“	27, 0	± 14,7 (ri=3)
Neomycín + GDNF. 1 ng/ml Neomycín +	28, 2	+	6. 1	(n=19)*	26, 2	± 6. 4 (n=4)*
GDNF. 10 ng/ml	37. 4	+	4. 8	(η=11)**		ND
Neomycín +
GDNF, 50 ng/ml	34, 4	+	5, 3	(n=7)^M		ND

GDNF bol zavedený do kultúr explantátov buď ten deň, kedy sa umiesťovalo na platňu, alebo 24 hodín po tom. Neomycín C 0, 8 1*1! bol pridaný 24 hodín po umiestení na platňu a kultúry boli inkubované ďalšie 3 dni. Vláskové bunky boli farbené FITC-faloídínom. Počet vláskových buniek bol počítaný v strednej časti kochley v 2-3 rezoch po 175 um. Výsledky sú vyjadrené ako percento vláskových buniek prítomných v neošetrenej kultúre po 4 dňoch in vitro (105,4 ± 6,9; n=28) . Každé číslo je priemer ± SD n kochleí.

** Signifikantne odlišné od clsplatlny samej pri p < 0,05 (t-test)

ND nedefinované

Príklad 2

GDNF proteínový produkt navodzuje prežívanie sluchových neurónov vnútorného ucha (neurónov spirálneho ganglia) a chráni ich pred ototoxinmi

Materiály s

Materiály použité v nasledujúcom príklade boli získané takto:

Bunkové kultivačné médiá

Dulbeccovo glukózy (DMEM, 11765-021). B lí n/streptoinycí n ( č. Dulbeccovo fosfátom modifikované Eaglovo médium s vysokým obsahom č. 11965-092). Hamovo F12 médium (F12; č. 27 doplnok média (č. 17504-010), penici15070-014). L-glutamín (č. 25D3U-016).

pufrovaný salinický roztok (D-PBS; č. 14190-052), myšací laminin (č. 23017-015). hovädzí sérový albumín frakcia V (č. 110-18-017) boli získané od Gibco-BRL, Grand

Island, NY. Teplom iriaktivované konské sérum bolo od HyClone. Logan, Utah. Hydrobromid poly-l_-ornitínu (P-3655), hovädzí inzulín (1-5500). ľudský transferín (T-2252). putrescín (P-6024). progesterón (P-6149) a selenit sodný (S-9133) boli všetky od Sigma Chemical Coinpany, Saint Louis, MO. Papain, deoxyríbonukleáza I (DNÁza) a ovalbumín (Papairiový disociačný systém) boli od Uorthington Biochemicals, Freehold, NJ. Falcon sterilné 96-jamkové mikroplatne (č. 3072), plastové výrobky pre tkanivové kultúry a propy'lénové centrifugačné tuby boli od Beckton-Dickinson, Oxnard, CA. Nitex 20 um nylonová sieC (č. 460) bola od Tetko, Elmsford, NY. 4 pitevné kliešte a 4 pitevné skalpely boli od ROBOZ Surgical. Washington, DC.

Protilátky a s nimi spojené reagens

Králičia polyklonálna protilátka pre neurónšpecifickú enolázu (NSE) bola od Chemicon (č. AB951), biotynylovaný kozí antikráliči IgG (č. BA-1000) a peroxidáza konjugovaný avidíri/biotín komplex (BAC Elite: klt PK-6100) boli od Vector Laboratories, Burlingame, CA. 3’,3'-diaminobenzidin bol od Cappel Laboratories, klest Chester, PA. Superblok blokujúci pufer v PBS (č. 37515) bol d Pierce, RockFord. IL. Triton X-108 (X-100) nonidet P-40 (NB507) a peroxid vodíka (30% objem/objem; H1089) bolí od Sigma. Všetky ďalšie činidlá boli získané od Sigma Chemical Company (Saint Louis. Π0), ak nie je inak upresnené.

Ototoxíny

Cisplatina (Platinol-AQ, č. NDC 0815-3220-22) bola od Bristol-Myers-Squibb, Princeton, NJ, salicylát sodný bol od J.T. Baker, Phillipsburg. NJ. (č. 3872-01) a neomycín bol od Sigma (č. N1142).

Metódy

Príprava média

Bazálne médium bolo pripravené ako 1:1 zmes DMEM a F12 média a bolo doplnené B27 doplnkom média, ktorý bol pridaný ako 50-násobok koncentrácie zásobného roztoku. B27 doplnok média sa skladal z biotínu. L-karnitínu. kortikosterónu. etanolamínu, D(+)-galaktózy, redukovaného glutatiónu, kyseliny linoleovej, kyseliny linolenovej, progesterónu, putrescíriu, retinylacetátu, selénu, Γ3 (trijodo-l-tyronínu, DL-alfa-tokoferolu: vitanímu E), DL-alfa tokoferolacetátu, hovädzieho sérového albumínu, katalázy, inzulínu, superoxid dismutázy a transferínu. L-glutamin bol pridaný v konečnej koncentrácii okolo 2 mM. penicilín asi 100 IU/1 a streptomycín asi 100 mg/1. Teplom inaktivované konské sérum bolo pridané do konečnej koncentrácie 2, 5 %, D-glukóza bola pridaná do konečnej koncentrácie asi 5 g/1, HEPES pufrovacie agens bolo pridané do konečnej koncentrácie asi 20 mM, hovädzí inzulín bol pridaný do konečnej koncentrácie asi 2,5 mg/ml a ľudský transferin bol pridaný do konečnej koncentrácie asi 0,1 mg/ml. Po zmiešaní bolo pH upravené na asi 7.3 a médium bolo uchované pri 4 °C. Médium bolo čerstvo pripravené tesne pred použitím, aby sa minimalizovali variácie medzi experimentmi. Boli použité plastové pipety a kontajnery. aby sa minimalizovala absorpcia proteinu.

Roztoky GDNF proteínového produktu

Purifikované ľudské rekombinaritné GDNF proteínové produkty boli pripravené ako 1 mg/ml roztoky v D-PBS (fosfátom pufrovaný salinický roztok pripravený v destilovanej vode) obsahujúcom päťpercentný hovädzí sérový albumín. Roztoky boli skladované pri -85 °C v alikvótach. Boli pripravené sériové riedenia na 96-jamkových mikroplatniach. Desať míkrolitrov desaťnásobne koncentrovaných roztokov GDNF proteínového produktu bolo pridaných do bunkových kultúr obsahujúcich kultivačné médium (90 Hl). Kontrolné kultúry dostali D-PBS s 5 percentným albumínom (10 ul). Ošetrenie proteínovým produktom začalo jednu hodinu po tom, ako boli bunky umiestené na platne alebo o 24 hodín neskôr, buď samostatne alebo spolu s ototoxínmi.

Príprava ototoxínuv

Neomycín bol pridaný zásobného roztoku (okolo 10^-3 1*1) v 10 ul ria jamku za vzniku konečnej koncentrácie okolo ΙΟ^-* 1*1. Cisplatina bola riedená kultivačným médiom zo zásobného roztoku (1 mg/ml) na roztok 20 ug/inl a pridaná v dávke 10 ulna jamku pri dosiahnutí konečnej koncentrácie 2 jjg/ml. Salicylát sodný bol pripravený z prášku na zásobný roztok s 1 1*1 v PBS a bal ďalej riedený v kultivačnom médiu na 100 ml*l. čo viedlo ku konečnej koncentrácií 10 m? keď bol pridaný v dávke 10 ul/jamku do kultúry.

Kultivačný substrát

S cieľom zaistenia optimálneho pripojenia buniek spirálneho ganglia na substrát a rastu neuritov boli povrchy mikrotitračných platničiek (kultivačný substrát) modifikované sekvenčným potiahnutím poly-L-ornitinom, po ktorom nasledovalo potiahnutie lamínom podľa nasledujúceho postupu. Povrchy platničiek boli úplne pokryté 0, 1 mg/ml sterilného roztoku polyornitinu v 0, 1 1*1 kyseline boritej (pH 8,4) počas aspoň jednej hodiny pri izbovej teplote, potom nasledovalo sterilné premytie Super-C3 vodou. Voda bola potom ašpirovaná a bol pridaný 10 ug/ml roztok myšacieho lamínu v PBS a bol inkubovaný pri 37 °Ľ 2 hodiny. Tieto procedúry boli uskutočnené pred použitím platničiek, aby sa zaistila reprodukovateľnosť výsledkov.

Príprava kultúr buniek potkanieho spirálneho ganglia

Tri až štyri týždne staré Wistar potkany (získané od Jackson Laboratories, Bar Harbor, Plalrie) bolí predávkované injekciou nasledujúceho roztoku s (ketamín (100 mg/ml)s Xylazín (20 mg/ml) a Acopromazín maleát (910 mg/ml) v pomeroch 3s3sl). usmrtené dekapitáciou a bola vypitvaná temporálna kosť s kochleou a bola sterilné prenesená do PBS s 1,5 g/1 glukózy na ľad. Na pokus bolo spracovaných maximálne 30 kochleí. Kochlea bola otvorená a Cortiho orgán kosteným modiolom bol odobraný do 50 ml sklenej skúmavky obsahujúcej 5 inl disoclačného média (120 jednotiek papaínu a 2000 jednotiek DNÁzy v HBSS). Tkanivá boli lnkubované 30 minút pri 37 °C na rotačnej trepačke platní pri asi 200 rpm a potom bol dísociačný roztok nahradený čerstvým a inkubácia pokračovala ďalších 30 minút. Bunky boli potom díspergovarié trituráclou cez ohňom leštené Pasteirove pipety, precedené cez 40 um Nitex nylonovú sieť na odstránenie nedisociovaného tkaniva a ceritrifugované 5 minút pri 200 x g pri použití IEC klinickej centrifúgy. Vzniknutá peleta obsahujúcom ovalbumín a asi 500 povrch štvorpercentného roztoku ovalbumínu (v HBSS) a centrífugovaná asi 6 minút pri 500 x g. Konečná peleta bola resuspendovariá v asi 6 ml kultivačného média a umiestená v množstve 90 ul/jamku na dopredu potiahnutých platniach.

bola resuspendovaná v HBSS jednotiek ONÁzy, umiestená na

Imunohlstochémia buniek spirálneho ganglia

Neuróny spirálneho ganglia boli identifikované imunohistochemlckým farbením pre neurón špecifickou enolázou (NSE). Kultúry buniek spirálneho ganglia boli fixované počas asi 10 minút pri izbovej teplote osempercentným formaldehydom v D-PBS, pH 7. 4, pridané v objme 100 ul/jamku ku kultivačnému médiu a potom odstránené štvorpercentným formaldehydom počas ďalších 10 minút a potom nasledovali tri premytia v D-PBS (100 ul na 6mm jamku). Fixované kultúry boli potom inkubované s Superblock blokujúcom pufri v PBS, obsahujúcom jednopercentný Nonidet P-40 na zvýšenie penetrácie protilátky. Králičie polyklonálne anti-NSE protilátky (Chemícon) boli potom aplikované v riedení 1 s6000 v rovnakom pufri a kultúry boli inkubované ďalšie dve hodiny pri 37 °C na rotačnej trepačke. Po troch premytiach D-PBS boli protilátky naviazané na bunky spirálneho ganglia detegované použitím kozieho antikráličieho biotíriylovariého IgG (Vectastain kit od Vector Laboratories, Burlirigame, CA) v riedení asi ls300. Sekundárna protilátka bola inkubovaná s bunkami počas asi jednej hodiny pri 37 °C, bunky boli premyté trikrát D-PBS. Sekundárna protilátka bola potom značená komplexom avidín-biotín-peroxidáza riedeným 1:300 a bunky boli inkubované počas asi 60 minút pri 37 °C. Po troch ďalších premytiach D-PBS boli značené bunkové kultúry reagované počas 5 minút v roztoku 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, s obsahom 0.042 3', 3'-diaminobenzidín-(HCl) 4, 0,06 2 NiCl_s a 0.02 2 peroxid vodíka.

Určenie prežívania buniek spirálneho ganglia

Po rôznej dobe v kultúre (24 hodín, 3 dni a 4 dni) boli kultúry buniek potkanieho spirálneho ganglia fixované, spracované a imunofarbené na NSE, ako to bolo popísané vyššie a kultúry boli potom vyšetrované optikou s jasným svetlom pri 200-násobnom zväčšení. Boli počítané všetky NSE-pozitivne neuróny prítomné v 6mm jamkách. Životaschopné bunky spirálneho ganglia boli charakterizované ako majúce okrúhle telo v rozsahu od 15 do 40 um a majúce neurltické výbežky. Bunky spirálneho ganglia vykazujúce degeneráciu, ako je nepravidelné, vakuolizovarié perlkaryum alebo fragmentované neurity, boli z počítania vylúčené, avšak väčšina z degenerujúcich buniek spírálneho ganglia bola oddelená z kultivačného substrátu. Počet buniek bol vyjadrený buď ako bunky/6mm jamku alebo ako násobok zmeny vzhľadom na denzitu kontrolných buniek.

Výsledky

Kultúry neurónov potkanieho spírálneho ganglia boli použité na demonštráciu účinku GDNF proteínového produktu na prežívanie a ochranu proti ototoxínom. Bunky spírálneho ganglia boli získané z kochley tri až štyri týždne starých potkanov. Disociované bunky boli potom umiestené na polyornitínom-laminínom potiahnuté mikroplatne v hustote asi 1 kochlea na 2 jamky v DI*1EI*I/F12 doplnenom B27 doplnkom média. 2, 5 percentným teplom inaktívovaným konským sérom, D-glukózou, HEPES. inzulínom a transferínom. Kultúry boli zložené zo zmesi neurónov a nonneurálnych buniek. Avšak jedinými prítomnými neurónmi boli neuróny spírálneho ganglia a boli identifikované prítomnosťou NSE imunoreaktivity. Pri použitej koncentrácii (1 disociovaný Cortiho orgán na 2 jamky) bol počet NSE pozitívnych buniek na jamku 24 hodín po umiestení 127 ± 17 (n%7) pri kontrolných podmienkach (žiadne ďalšie ošetrenie). Na konci pokusu, štyri dni po umiestení na platne. bol počet neurónov redukovaný na 64 ± 4,7, čo reprezentuje 50,5 ± 3,7 z počtu prítomného po 24 hodinách in vitro, pri kontrolných podmienkach.

Účinok podania GDNF proteínového produktu bol hodnotený na prežívanie a morfologickom dozrievaní kultivovaných neurónov potkanieho spírálneho ganglia, rovnako ako aj na ich schopnosti rezistencie na toxické účinky známych ototoxínov ako je cisplatina. Kultúry buniek spírálneho ganglia boli ošetrené 24 hodín po umiestení na platne ľudským rekombiriantným GDNF proteínovým produktom (v rozsahu od 50 samotným, alebo v kombinácií s cisplatinou po umiestení na platne nebol rozdiel v počte sluchových neurónov medzi kontrolnými kultúrami a kultúrami ošetrenými GDNF v množstve 1 rig/ml 10 ng/ml (217 ± 17s 126 ±24 a 125 ± 19 ng/ml do O.1 ng/ml) (35 ug/ml). 24 hodín neurónov na jamku, v príslušnom poradí). Po ďalšej perióde 3 dni neviedlo ošetrenie GDNF v koncentrácii 1 ng/ml k signifikantnému zvýšeniu počtu buniek. Avšak tu bol poznateľný trofický účinok s telo neurónov bolo väčšie a vlákna dlhšie a viac prepracované než v kontrolných kultúrach. V kultúrach ošetrených 10 ng/ml GDNF bolo po 24 hodinách prítomných 722 prežívajúcich neurónov, čo reprezentuje 442 zvýšenie vzhľadom na kontrolné kultúry (tabuľka 4). Trofický účinok bol ešte silnejší než v kultúrach ošetrených 1 ng/ml GDNF.

GDNF tiež chránil neuróny spirálneho ganglia pred toxicitou cisplatiny (tabuľka hodin po umiestení začiatočného počtu

4). Expozícia kultúr 5 ug/ml cisplatiny 24 na platne viedlo k strate približne 94 2 (po 24 hodinách) neurónov po 4 dňoch kultivácie. Ak bol GDNF pridaný spoločne s cisplatinou, bol počet neurónov zistený po 4 dňoch signifikantne vyšší. Tento ochranný účinok GDNF závisel od dávky: 20,1 ± 5, l_s 27.5 ± 3. 2 a 32. 8 ± 1. 0 neurónov prítomných pri začiatku toxickej liečby bolo zistených pri koncentrácii GDNF 1 ng/ml. 10 ng/ml a 25 ng/ml v príslušnom poradí (dáta nie sú ukázané). Tieto výsledky ukazujú, že asi 63 percent neurónov, ktoré reagujú na GDNF (okolo 44 2 populácie neurónov spirálneho ganglia) môže tiež byť chránených pred toxicitou cisplatiny.

Tabuľka 4 Účinok GDNF na prežívanie neurónov spirálneho ganglla
	Prežívanie neurónov spirálneho ganglla (2 začiatočného počtu po 24 hodinách)
Ušetrenie	Žiadne	Cisplatina (5 ug/ml)
Žiadne	48.5 ±4.5 (n=9)	6.1 ± 1,2 (n=3)

GDNF. 10 ng/ml 71.6 ± 7.4* (n=5)

32.8 ± 1.0* (n=3)

GDNF a cisplatina boli pridané ku kultúram disociovaných neurónov spirálneho ganglia 24 hodín po umiestení na platne. Kultúry boli inkubované počas ďalších troch dní a počet neurónov bol určený počítaním NSE imunoreaktívnych buniek. Počet neuronálnych buniek je vyjadrený ako percento neurónov prítomných po 24 hodinách in vitro. Každý výsledok je priemerom ± SD n kultúr.

** Signifikaritne sa líši od cisplatiny samej v p < 0.05

C t-test) **** Signífikantne sa líši od neošetrenej kontroly v p < 0, 05

C t-test)

Príklad 3

GDNF proteínový produkt navodzuje in vivo prežívanie kochleárnych vláskových buniek

Nasledujúci príklad ukazuje, že podanie GDNF proteínového produktu do vnútorného ucha chráni vláskové bunky kochley pred ototoxicitou v zvieracom modeli. GDNF bol zavedený do vnútorného ucha prostredníctvom kanyly zavedenej do scala tympani cez otvor prevŕtaný v bazálnom závite kochley. Kanyla bola pripojená na Alzet minipumpu naplnenú GDNF C50 ng/ml) s rýchlosťou uvoľňovania 0,5 m 1/hod počas 14 dni. S i.m. injekciami cisplatiny sa začalo dva dni po kanylácii, buď 1 mg/ml denne počas 15 dní alebo 7, 5 mg/kg dvakrát počas pätdenných intervalov Cpodľa obrázku 2). Pokus bol skončený po 27 dňoch. Vláskové bunky boli farbené FITC-faloidínom a ich počet bol určený v strednom závite kochley C v aspoň 20% časti stredného závitu). Výsledky sú vyjadrené ako percento straty vláskových buniek pre každé jednotlivé morča pre GDNF ošetrené ucho Cpravé ucho) a neošetrené ucho (ľavé ucho).

Materiály

Materiály použité v nasledujúcom príklade boli získané takto:

Materiály pre prípravu minipumpy:

Lekárska vinylová trubička s veľkosťou V/4, katalógové č. BB317-85 bola od Bolab Products C C 800) 331-7724). Bol použitý Fisherov typ 5 ml plastových pipiet. Bola použitá mikroluménová polyimidová tuba, katalógové č. 8004853 OG (Tampa. Florida). Silicone Medical Products MDX 4-4210 bol od Dow Corning Corporation, Midland. MI. Alzet osmotícká minipumpa upravujúca prietok a Alzet osmotická minipumpa, katalógové č. 2002 boli od Alza corp., Palo Alto, CA. Tápe (TimeMed Tápe). Prosil-28, produkt č. 11975-0 bol od PCR Incorporated. Gainesville Florida. Purifikované ľudské GDNF proteínové produkty boli pripravené ako 50 mg/ml roztok v D-PBS a 0. 1% BSA. Sterilná 0.IX metylénová modrá (katalógové č. M-914D) rozpustená v PBS a minerálny olej (katalógové č. 400-5) boli od Sigma.

Postup prípravy minipumpy

Vinylová tuba bola rozstrihaná na približne štvorpalcové časti a tie boli umiestené do miniatúrneho zveráku. Kus Microlumen polyimidovej tuby (7 mm) bol umiestený do konca viriylovej tuby. Silíkóri bol zmieSaný pridaním približne 10 častí základu a jednej časti tvrdiva ageris. Kvapka bola umiestená v otvore vinylovej tuby pomocou jemnej sondy a Microlumen tuba bola zasunutá do vinylovej. pri ponechaní 3.75 mm dĺžky presahujúcej z vinylovej tuby. Pri použití kvapky silikónu na sonde bol vytvorený malý balónik okolo Microlumen tuby, 0, 5 mm od konca a vysychanie prebehlo cez noc.

Priemer 5 ml pipety bol zvýšený aplikáciou troch koncentrických vrstiev pásky na dolný koniec pipety. Boli ponechané konštantné medzery, kde zostala plpeta nepokrytá. V/4 tuba bola omotaná okolo pipety a závity boli upravené tak, aby tu boli dva voľné konce tuby a aby bol kontinuálny kontakt medzi všetkými závitmi. Dva tenké prúžky pásky boli spojené s okrajmi pásky na pípete s cieľom zaistenia umiestenia závitov. Dve tenké línie superlepidla boli nanesené rovnomerne na závit. Po minimálne jednohodinovom zaschnutí boli voľné konce usporiadané približne paralelne s pípetou a zaistené na mieste jedným prúžkom pásky. Bola nanesená kvapka superlepidla s cieľom zaistenia tuby na závitoch. Nasledovalo zasychanie cez odstránené a závity boli stiahnuté z pipety. bol pripojený na jeden z voľných koncov superlepidla.

noc, páska bola Moderátor prietoku a zaistený kvapkou

Závity boli prepláchriuté IX Prosil-28 vo vode, vypláchnuté vodou a potom premyté 70X etanolom. Etanol bol odstránený injekčnou striekačkou alebo vákuom. Závity boli umiestené vo vákuovej sušičke počas aspoň 30 minút a boli ponechané cez noc v uzatvorenej a tesnej sušičke a potom nasledovala sterilizácia plynom. Počas plnenia boli závity udržiavané, pokiaľ je to možné, horizontálne, aby sa zabránilo gravitačnému pohybu kvapalného GDNF, oleja a farbiva. Tvorba vzduchových bublín v pumpe alebo závitoch bola vylúčená. Pumpa bola ponorená do sterilného PBS a inkubované cez noc pri 37 °C.

Plnenie pumpy metylénovým farbivom bolo uskutočnené udržiavaním pumpy vo vertikálnej polohe. Farbivom naplnená striekačka bola kompletne vložená do pumpy a farbivo bolo injektované, dokiaľ nebola pumpa naplnená, vzduchových bublín do pumpy bola vylúčená, bola umiestená do moderátora prietoku.

Injekcia akýchkoľvek Krátka časť V/4 tuby GDNF bol plnený

BSA, v celkovom objeme pri použití injekčnej v koncentrácii 50 ng/ml v PBS 230ul, do asi 10 mm konca striekačky pripojenej na V/4 + 0, IX kanyly.

tubu. Pre kontrolný pokus bol rovnaký objem PBS + 0, IX BSA naplnený do pumpy. Krátka časť V/4 tuby bola odstránená. Potom bol naplnený minerálny olej do závitu injekčnou striekačkou tak, aby bol bol 2 mm vzduchový priestor a 7 mm minerálneho oleja vložené medzi tekutinou v pumpe a tekutinou v tube (infúzria tekutina). Moderátor prietoku bol kompletne vložený do pumpy.

Inzercia pumpy do vnútorného ucha

Materiály

Tkanivové adhezivne lepidlo - kyanoakrylát - bolo od Vetbond Tissue Adesive. 3M Ariimal Čare Products, St. Paul, MN, Karboxylovaný cement ESPE Durelon, katalógové č. 03828 bol od ESPE-Premier Sales Corp., Norristous. PA. Metylmetakrylát bol od Lang Jet Acrylic, Lang Dental MFG, Co., Wheeling, IL. Pitevné nástroje boli od Roboz Surgical. Bol použitý xylazin. ketamín a buprenorfín. Lubricant Opthalmic ointmerit (AKWA Tesrs) bola od Akorn Inc., Abita Springs, LA, 2X xylokain, katalógové č. NDC 0186-0160-01, bol od ASTRA. Medical Gráde Silicone Grease, výr. č. 51300, bol od Unimed. Durelon Pulver, práškový karboxylátový cement, katalógové č. D-82229, bol od ESPE, Seefeld. Sulfátová masť (Bacitracin Zinc-neomycin, katalógové č. 0168-0012-31) bola od Fougera.

Postupy

Albino moróatá (250-350 g) bola anestézované zmesou xylazinu 10 mg/kg ketamínu 40 ing/kg a buprenorfinu 0.05 mg/kg. Oblasť pravého ucha bola kaudálne vyholená, od asi 2 cm anteriórne od lopatky a postaurikulárne. Lubrikačná očná masť bola vertexu do 4-5 cm posteriórne od Vyholená oblasť bola omytá betadinom aplikovaná na obidve uší. Xylokain bol injektovaný subkutánne do tkanív, ktoré majú byť incidované. Použitím aseptickej techniky bola uskutočnená postaurikulárna incízia. Použití tenkej ihly bol vyvŕtaný otvor do bully s cieľom dosiahnutia stredoušnej dutiny a vizualizácie kochley. Malý otvor bol manuálne vyvŕtaný do kostenej steny bazálneho závitu, pod okrúhlym okienkom použitím tenkej ihly. Koniec kanyly bol vložený do otvoru, dokiaľ silikónová kvapka nedosadla na kosť. čo umiestilo koniec kanyly asi doprostriedku kanálu v scala tympan!. Kvapka kyanoakrylátu bola umiestená do otvoru v bulle. Karboxylátový cement bol umiestený v okolí kanyly cez kyanoakrylát. Po vytvrdnutí cementu bolo umiestenie potvrdené a zvyšok otvoru bol prekrytý karboxylátovým cementom na vrstve silikónového tuku. Bola vytvorená subkutánne vrecko medzi lopatkami na umiestenie pumpy, ktorá bola inzertovaná. Subkutánne vrecko bolo vypláchnuté 3 ml roztoku nitrofurazónu rozpusteného v sterilnom PBS a potom bolo naplnené 3 ml sterilného PBS plus 1% gentamycín na prevenciu infekcie. Po aplikácii nitrofurazónového prášku okolo rany bola incizia uzatvorená klipmi.

Ohlušenie

Materiálys

Cisplatina (Platinol-At'D, katalógové C. NDC 0015-3220-22. bola od Bristol-Myers Squibb Laboratories. Princeton, N.J.

Postup:

Injekcie clsplatiny C i.p.) začali dva dni po implantácii minipumpy. Boli použité dva režimy dávkovania: buď dve 7,5 mg/kg injekcie v dni.

5-denných intervaloch, alebo 1 mg/kg denne, počas 15

Perf úžia ·.

do hlbokej uskutočnená nasledovaná

Po štyroch týždňoch boli inorčatá uvedené anestézie zmesou xylazinu a uketaminu a bola transkardiálna perfúzia ako ľad chladným PBS perfúziou ako ľad chladným 4% paraformaldehydom v PBS. Temporálna kosť bola odstránená a kostená kochlea bola umiestená v 4% paraformaldehyde s cieľom posfixácíe cez noc pri 4 °C.

Farbeniei

Úprava povrchu a farbenie faloidínom boli použité na farbenie vláskových buniek. Kostená kochlea bola otvorená tenkou ihlou alebo čepeľou č. 11. Stria vascularis bola odstránená použitím jemných klieští. V Petriho miske naplnenej PBS bola bazálna membrána starostlivo oddelená od kosteného modlolu.

použitím tenkých ihiel. Bola vynaložená snaha na jej odstránenie v intaktnom stave. Postup farbenia faloidinom bol podobný postupu uskutočnenému pre in vitro explantáty, s týmito zmenami: permeabilizácia bola uskutočnená počas 20-30 minúta a faloidín bol pridaný na 90 minút. Apex, stredný závit a bazálny závit boli pripevnené na 60 x 22 sklenené krycie sklíčka. Bola pridaná

kvapka VECTASHIELD	média	a vzorky	boli	prekryté	22 x 22 mm
krycími sklíčkami a	zaliate	i lakom na	nechty s cieľom	zabránenia
odparenia.
Analýzy dát:
Každá kochlea	bola	vyšetrená	pod	mikroskopom s FITC

filtrovacim setom. Osem segmentov s najväčšou stratou vláskových buniek zo stredného závitu bazálnej membrány bolo vybraných a fotografovaných použitím pripojenej počítačovej tlačiarne. Počítanie vláskových buniek bolo uskutočnené manuálne použitím fotografií. U každého zvieraťa bola porovnávaná strata vláskových buniek v ľavom uchu (ako kontrola, tj. bez infúzie GDNF) voči strate vláskových buniek v pravom uchu (S infúziou GDNF).

Výsledky s

Injekcie cisplatiriy viedli k signifikantnej strate vláskových buniek v kochlee. Táto strata, v rezoch stredného závitu analyzovaných v ľavom uchu troch inorčiat injikovaných cisplatinou 1 mg/kg denne počas 15 dní, bola 49,2%; 21,2% a 46.9%. Tiež pokiaľ Ide o morča, ktorému bolo injektovaných 7,5 mg/kg cisplatíny dvakrát, namiesto 1 mg/kg denne, bola strata 42% vláskových buniek v ľavom uchu. Zavedenie GDNF do pravého vnútorného ucha každého morčaťa viedlo k signifikantnému zníženiu straty vláskových buniek. Pomery medzi počtom stratených vláskových buniek a celkovým počtom vláskových buniek v kochlee boli takéto: 241/486; 113/530 a 244/513 v ľavom uchu, zatiaľ čo ich náprotivky pre pravé ucho (ošetrené GDNF) boli 83/492; 28/498 a 126/512, v príslušnom poradí. Tieto pomery reprezentujú zvýšenie straty vláskových buniek medzi pravým a ľavým uchom pre každé zviera 3 x; 4,2 x a 1, 9 x pre tri zvieratá. Pokiaľ ide o morča, ktorému bola injektovaná cisplatina 7.5 mg/kg, bolo tiež

2-násobné zvýšenie straty vláskových buniek v neošetrenom uchu (ľavom) v porovnaní s ošetreným uchom. (Pozri obrázok 2). Pokial ide o zvieratá, ktorým bola implantovaná minipumpa naplnená vehikulom namiesto GDNF, nebol žiadny rozdiel v počte vláskových buniek nachádzaných v ľavom uchu (neošetrené ucho) a v pravom uchu (Implantovanom uchu).

Príklad 4

Injekcia GDNF proteínového produktu navodzuje prežívanie kochleárnych vláskových buniek in vivo

Nasledujúci príklad ukazuje, že GDNF proteínový produkt chráni kochleárrie vláskové bunky pred ototoxicitou v zvieracom modeli, ak je aplikovaný do stredného ucha. GDNF bol zavedený do pravého ucha jednou injekciou cez tympanálnu membránu v koncentrácii 1 mg/kg v PBS + IX BSA v objeme 125-135 ul. I.m. injekcie cisplatiny začali deň po injekcii GDNF v dávke 7,5 mg/kg dvakrát v 5 dennom intervale. Pokus bol ukončený tri dni po druhej injekcii cisplatiny. Vláskové bunky boli farbené FITC faloidínom a ich počet bol určený v strednom závite kochley (v aspoň 20X časti stredného závitu). Výsledky (obrázok 3) sú vyjadrené ako percento stratených vláskových buniek pre jednotlivé morčatá pre GDNF ošetrené ucho (ľavé ucho).

Materiály»

Použité materiály rovnaké ako v príklade 3.

Postupy:

Alblno morčatá (hmotnosť 600-700 g) bolí anestezlované zmesou xylazínu 10 mg/kg, ketamínu 40 mg/kg abuprenorfínu 0,05 mg/kg. Pod chirurgickým mikroskopom bol vytvorený otvor v tympanálnej membráne pravého ucha prepichnutím membrány 27 gauge ihlou. V Inom mieste tympanálnej membrány bol do stredoušnej dutiny injektovaný ľudský GDNF protein (o koncentrácii 1 mg/kg v PBS + 0,1% BSA) tak, že celá dutina bola naplnená (125-135 ul). Niekoľkým zvieratám bolo injektované len vehikulum (PBS + 0, IX BSA) namiesto GDNF. Ďalší deň bola podaná i.m. Injekcia cisplatiny (7,5 mg/kg). O päť dní neskôr bola podaná druhá injekcia s rovnakou koncentráciou. O tri dní neskôr (8. deň celkovej doby pokusu) boli zvieratá usmrtené, tkanivá boli fixované a kochlea bola analyzovaná ako je popísané v príklade 3.

Výsledky»

Po ôsmich dňoch vykazovali štyri morčatá, ktorým bola injektovaná clsplatina. signifikantnú stratu vláskových buniek v kochlee. V ľavom uchu, kam nebol podaný GDNF, bola strata vláskových buniek v strednom závite kochley: 34 X; 47 Z; 42 Z a 41 Z. Injekcia GDNF do stredoušnej dutiny pravého ucha, 1 mg/kg, redukovala túto stratu signifíkantne: 16 Z; 23 Z; 21 Z a 29 Z, v príslušnom poradí (obrázok 3). Morčatá, ktoré dostali injekciu vehikula namieste GDNF do pravého ucha, nevykazovali rozdiel v počte vláskových buniek medzi pravým (ošetreným) a ľavým (neošetreným) uchom.

Očakáva sa, že veľký počet modifikácii a variácii realizácií vynálezu bude odborníkom zrejmý po pochopení predchádzajúceho popisu a jeho teraz predkladaných preferovaných realizácií.

Zoznam sekvencii (1) Všeobecné informácie:

C i) Prihlasovateľ: Ella Magal (ii) Názov vynálezu: Spôsoby na ochranu a liečenie senzorineurálnej straty sluchu a vestíbulárnych porúch pri použití proteínového produktu neurotrofného faktora (GDNF) odvedeného od gliálnej bunkovej línie (iii) Počet sekvenčil: 1 (iv) Adresa pre korešpodenciu:

(A) Adresa: AľlGEN INC.

(B) Ulica: 1840 DeHavilland Drive (C) Mesto» Thousand Oaks (D) Štát: California (E) Krajina: USA (F) ΖΙΡ» 91320 (v) Počítačovo čítacia forma:

(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém» PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verzia #1.25 (vi) Údaje o súčasnej prihláške:

(A) Číslo prihlášky:

(B) Dátum podania:

(C) Klasifikácia:

(vii) Zástupca/agent - informácie:

(A) Meno: Curry, Daniel R.

(B) Registračné číslo» 32727 (C) Referencie/čislo registra» A-392 (ix) Telekomunikačné informácie» (A) Telefón» 805-447-8102 (B) Telefax. 805-499-8011 (C) Telex.

ΚΗ (2) J ι ιί nrmácie pre KLU J D NIJs I.:

(:L) Charakteristiky sekvencie:

C A) Dĺžka: 134 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Topológia: lineárna (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/klúč: odvodená amlriokysellnová sekvencia pre zrelý ľudský GDNF (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 1:

Ser Pro Asp Lys Gin Met Ala	Val Leu Pro Arg Arg	Glu Arg Asn	Arg
1	S	10	15
Gin	Ala Ala Ala Ala Asn Pro 20	Glu Asn Ser Arg Gly 25	Lys Gly Arg 30	Arg
Gly	Gin Arg Gly Lys Asn Arg 35	Gly Cys Val Leu Thr 40	Ala íle His 45	Leu
Asn	Val Thr Asp Leu .Gly Leu 50 55	Gly Tyr Glu Thr Lys 60	Glu Glu Leu	íle
Phe 65	Arg Tyr Cys Ser Gly Ser 70	Cys Asp Ala Ala Glu 75	Thr Thr Tyr	Asp 80
Lys	Zle Leu Lys Asn Leu Ser 85	Arg Asn Arg Arg Leu 90	Val. Ser Asp 95	Lys
Val	Gly Gin Ala Cys Cys Arg 100	Pro Zle Ala Phe Asp 105	Asp Asp Leu 110	Ser
Phe	Leu Asp* Asp Asn Leu Val	Tyr Kis íle Leu Arg	Lys His Ser	Ala

11S 120 12S

Lys Arg Cys Gly Cys íle

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použitie proteínového produktu neurotrofného faktora odvodeného od gliálnej bunkovej línie (GDNF) pre výrobu farmaceutickej kompozície na liečenie senzorineurálnej straty sluchu.
2. Použitie podľa nároku 1, kde strata je asociovaná s léziou vnútorného ucha.
3. Použitie podľa nároku 1, kde strata sluchu je asociovaná s poškodením alebo degeneráciou neuroepitelíálnych vláskových buniek vnútorného ucha.
4. Použitie podľa nároku 1, kde strata sluchu je asociovaná s poškodením alebo degeneráciou neurónov spirálneho ganglia.
5. Použitie podľa nároku 1, je aminokyselinový sekvericia daná alebo derivát.
6. Použitie podľa nároku 5, aminokysellnovú sekvenciu danú SEi kde GDNF proteínovým produktom SEQ ID NOs 1 alebo jej variant kde GDNF proteínový produkt má I ID NO: 1.

7. Použitie podľa nároku 5, (Met-¹) GDNF. 8. Použitie podľa nároku 1.

podaný v dávke od asi 1 ug/kg/deň
9. Použitie podľa nároku 1, podaný prostredníctvom bunkovej kde bunky boli modifikované tak. GDNF proteínový produkt.

kde GDNF proteínový produkt je kde GDNF proteínový produkt je do asi 100 mg/kg/deň. kde GDNF proteínový produkt je

terapie alebo génovej terapie, aby produkovali a secernovall
10. Použitie podľa nároku 9, kde bunky boli modifikované ex vivo.
11. Použitie podľa nároku 9, kde bunky boli modifikované in vivo.
12. Použitie proteínového produktu neurotrofného faktora odvodeného od gliálriej bunkovej linie (GDNF) pre výrobu farmaceutickej kompozície na liečenie lézii alebo porúch vestibulárneho aparátu.

♦
13. Použitie podľa nároku 12, kde lézia alebo porucha vedie k strate, vertigu alebo strate rovnováhy.
14. Použitie podľa nároku 12, kde GDNF proteínovým produktom je amlnokyselinová sekvencla daná SEQ ID NO: 1 alebo jej variant alebo derivát.

15. Použitie podľa nároku aminokyselinovú sekvenciu danú 14, kde GDNF SEO ID NO: 1. proteínový produkt má 16. (Met“¹) Použitie GDNF. podľa nároku 14, kde GDNF proteínový produkt Je 17. Použitie podľa nároku 12. kde GDNF proteínový produkt Je podaný v dávke od asi 1 ug/kg/deň do asi 100 mg/kg/deň. 18. Použitie podľa nároku 12. kde GDNF proteínový produkt je

podaný prostredníctvom bunkovej terapie alebo génovej terapie, kde bunky boli modifikované tak. aby produkovali a secernovalí GDNF proteínový produkt.
19. Použitie podľa nároku 18, kde bunky boli modifikované ex vivo.
20. Použitie podľa nároku 18, kde bunky boli modifikované in vivo