KR20220084282A - Ipsc로부터의 피질 신경 전구 세포 - Google Patents
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Abstract
인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 유래된 신경 전구 세포 라인 (NPC)의 생산이 본원에 기재된다. 이들 iPSC-유래 NPC는 ALS 동물 모델의 척수 내로 효율적으로 생착되고, 임상 연구에서 사용된 태아-유래 세포와 유사한, 병든 운동 뉴런에 대한 신경보호를 제공한다. GDNF 발현의 유도성 발현을 포함하는, AAVS1 안전 착지 부위에 삽입된 단일 카피 GDNF 작제물로 클론 라인을 생성하였다. 이들 새로운 iPSC-유래 NPC 라인은 임상적으로 관련된 생산량으로 스케일링가능하고, GDNF를 균일하게 생산하고, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 등의 신경퇴행성 질환에 대한 유망한 새로운 조합 요법을 나타낸다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2019년 10월 22일 출원된 미국 가출원 번호 62/924,523의 35 U.S.C. §119(e) 하의 이익을 청구하며, 이 가출원의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
이소성 단백질을 유도가능한 방식으로 발현하도록 조작되고 이식 숙주에서의 생착(engraftment)을 위해 사용될 수 있는 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 유래된 신경 전구 세포 (NPC)가 본원에 기재된다. 청구된 발명은 신경퇴행을 포함하는 재생 의학 및 퇴행성 질환의 기술 분야에 관한 것이다.
신경퇴행성 질환은 고령화 인구에 대해 계속해서 증가할 심각한 경제적 및 치료 부담이다. 이들 질환 중에는 미국에서 대략 30,000명의 개인을 괴롭히는 근위축성 측삭 경화증 (ALS)이 있다. 현재 이 질환을 치료하는 데 사용되는 단지 두가지 FDA-승인 약물, 에다라본 및 릴루졸이 존재하며, 둘 다 질환의 진행을 단지 약간 늦춘다. 유망한 전임상 치료는 지지성 신경교 세포의 이식 및 신경교 세포 라인-유래 신경영양 인자 (GDNF)의 전달을 포함하였다. 본 발명자들의 그룹은 성상세포로 분화할 수 있고 렌티바이러스로 트랜스펙션되어 GDNF를 안정적으로 생산할 수 있는 인간 태아-유래 신경 전구 세포 (fNPC)를 생산하고 광범위하게 특성화하였다. 이들 GDNF-생산 세포는 척수 내로 효율적으로 생착되고 SOD1 ALS 래트에서 ChAT+ 운동 뉴런의 손실을 늦춘다. 이들 세포는 임상 우수 제조 관행 (cGMP) 하에 뱅킹되었으며 본 발명자들은 최초 세포로서 ALS 환자의 척수에 세포를 전달하는 1/2a상 시험 및 유전자 요법을 완료하였다. 유망하지만, fNPC의 스케일링가능한 사용은 출발 물질의 이용가능성에 의해 제한되고 제한된 확장 가능성을 갖는다. 또한, 이들 세포에서 GDNF 발현을 유도하는 데 사용되는 렌티바이러스 형질도입은 다양한 카피 수 및 GDNF 생산 수준을 갖는 이종 집단을 초래한다. 따라서, 이식 숙주 내로 생착될 수 있는 세포, 및 클론성을 포함하는, 신경퇴행성 치료에 적합한 이식 물질의 재생가능한 공급원을 생성하는 것에 대한 큰 필요성이 당업계에서 존재한다.
인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 유래된 스케일링가능한, 임상 우수 제조 관행 (cGMP)-적용가능한 신경 전구 세포 라인의 생산이 본원에 기재된다. 이들 iPSC 유래 세포는 ALS 래트 척수 내로 효율적으로 생착되고, 임상 연구에서 사용된 태아-유래 세포와 유사한, 병든 운동 뉴런에 대한 신경보호를 제공한다. iPSC의 클론 확장 능력을 활용하여, AAVS1 안전 착지 부위에 삽입된 단일 카피 GDNF 작제물로 클론 라인을 생성하였다. 이들 라인은 GDNF를 균일하게 발현하고 생산한다. 이는 조절된 GDNF 발현을 위한 테트라사이클린-유도성 프로모터를 포함하는 보다 정교한 작제물로 iPSC-유래 신경 전구 세포 라인을 생성하기 위한 플랫폼을 제공하였다. 이들 새로운 iPSC-기반 라인은 임상적으로 관련된 생산량으로 스케일링가능하고, GDNF를 균일하게 생산하고, 생체내에서 최대 3개월 동안 안전하고, ALS에 대한 유망한 새로운 조합 요법을 나타낸다.
도 1a-1c는 pB-RTP-Tet-GDNF/memClover-FLuc 벡터의 개략도를 나타낸다. (도 1a) pBase 플라스미드와 조합되어 트랜스펙션시 게놈으로 안정적으로 통합되도록 설계된 pB-RTP-Tet-GDNF/memClover-FLuc 플라스미드. (도 1b) pBase 플라스미드 (도 1c) 독시사이클린의 존재 하에서만 발현되거나 구성적으로 발현되는 이식유전자.
도 2는 AAVS1-teton-hGDNF의 벡터 맵을 나타낸다. AAVS와 같은 게놈 세이프 하버(genomic safe harbor)를 표적화하는 데 사용될 수 있는 상동 재조합 서열인 HA-L 및 HA-R 암(arm)이 나타나 있다.
도 3은 pDonor-Teton3g-2a-TagBFP-V5-nls-p2a-puroR WPRE_Insulated mpclover-2a-luc2pest-2a-gdnf wpre의 벡터 맵을 나타낸다.
도 4는 인간 PPP1R12C 유전자의 엑손 1과 2 사이의 내인성 유전자좌의 AAVS1 표적화의 개략도를 나타낸다. 초기에, 상류 PPP1R12C에 연결된 스플라이스 수용자에 의해 구동되는 리포터/선택 카세트 (형광 및 항생제 선택을 위한 TagBFP2 및 PuroR)로 이루어진 수용체 "착지 부위" 및 LoxP 및 FRT 부위에 의해 플랭킹된 구성적 CAG 프로모터 구동된 td-Tomato 적색 형광 시스트론은 안정적으로 통합되었다. 그 후, 이들 리포터에 대한 안정적인 선택시, 이들 세포는 FlpO 및 Cre를 발현하는 플라스미드 및 LoxP 및 FRT 플랭킹된 선택/리포터 카세트 및 dox-유도성 mpClover/Luc2p/GDNF 시스트론 함유 플라스미드를 함유하는 공여자 플라스미드로 리포펙션되었다.
도 5a-5d는 iNPC가 CNS10-NPC와 조성이 유사함을 보여준다. CNS10-NPC 및 iNPC는 동결보존 및 단일-세포 RNAseq에 대한 어느 하나의 과정으로부터 곧바로 단일 세포로 해리되거나 배양 배지에서 7일 동안 플레이팅 및 성장되었다. (도 5a) 세포의 편향되지 않은 클러스터링은 iPSC가 iNPC (분홍색) 및 CNS10-NPC로부터 분리되어 있음을 보여준다. 일부 iNPC는 CNS10-NPC와 클러스터링된 것으로 관찰된다. (도 5b) 각 클러스터의 전사체 발현은 카테고리 당 25-50개의 유전자로 구성된 모듈과 유사하게 점수화되었다. 스케일: 황색 = 높은 발현, 보라색 = 낮은 발현. (도 5c) 편향되지 않은 클러스터의 특징 플롯은 iNPC 및 CNS10-NPC에서 성숙 및 미성숙 성상세포-관련 전사체의 발현을 나타내지만, iPSC는 그렇지 않다. (도 5d) iNPC 및 CNS10-NPC의 제7일 배양물에 대한 면역세포화학은 시험관내에서 두 세포 유형 모두에서 S100β (회색) 및 GFAP (백색) 단백질의 발현을 나타낸다. iNPC 삽입물은 성상세포 인자와 배양 35일 후 GFAP (회색) 발현을 나타낸다. 스케일 바 = 75 μm, 삽입 25 μm.
도 6a-6d는 iPSC 라인에서 GDNF-발현 조작을 위한 구성적 및 유도성 작제물을 나타낸다. (도 6a) AAVS1 표적화된 GDNF 발현 작제물의 구성요소를 보여주는 도. (도 6b) GDNF ELISA는 구성적 GDNF 작제물을 보유하는 iNPC가 렌티바이러스 형질도입된 iNPC 및 CNS10-NPC 세포 둘 다에 대해 유사한 수준의 GDNF를 생산함을 입증한다. (도 6c) V1 유도성 작제물을 갖는 iNPC의 GDNF ELISA는 독시사이클린 첨가 및 회수에 반응하여 강건하고 효율적인 유도 및 감쇠를 나타낸다. (도 6d) V1 유도성 작제물을 갖는 iNPC는 식수 중에 독시사이클린이 제공된 WT 래트의 요추 척수에 이식시 GDNF를 발현하지 못한다. 스케일 바 = 75 μm.
도 7은 AAVS1의 TALEN 표적화를 나타낸다. 우측 및 좌측 TALE 뉴클레아제 뿐만 아니라 AAVS1 상동성을 보여주는 개략도.
도 8a-8b는 iPSC-유래 세포가 생존하고 ChAT+ 운동 뉴런을 보호함을 보여준다. 요추 척수에서 GDNF를 생산하기 위해 렌티바이러스로 형질도입된 현재 iNPC로 SOD1G93A 래트를 이식하였다. (도 8a) 10K 세포/부위 n=5 동물. 이식은 숙주 ChAT+ 운동 뉴런을 보존하였다. (도 8b) 50K 세포/부위 n=3 동물. 세포는 보호성이 아니었고 숙주 뉴런을 치환하였다. 스케일 바 250 μm.
도 9a-9b는 9개월 후 누드 래트의 척수에서의 iNPC의 생착을 나타낸다. 요추 척수를 절단하고, 인간 핵 (SC121, 녹색) 및 증식 세포 (Ki67, 백색)에 대해 염색하였다. 좌측 상의, 척수의 내측, 복측 뿔의 한쪽 측면에서의 iNPC-GDNFCONST-V1 생착의 lw 확대 이미지. 상자는 양성 인간 세포 (도 9a) 및 음성 인간 세포 (도 9b)를 보여주는 보다 높은 배율 영역을 나타낸다. 별표는 중심 관을 나타낸다. 스케일 바 100 μm 및 보다 높은 배율에서 25 μm.
도 10은 AAVS1-Tet-On-3G-GDNF (서열 번호: 5)의 벡터 맵을 나타낸다.
도 11은 예시적인 분화 프로토콜 및 타임라인의 개략도를 나타낸다.
도 2는 AAVS1-teton-hGDNF의 벡터 맵을 나타낸다. AAVS와 같은 게놈 세이프 하버(genomic safe harbor)를 표적화하는 데 사용될 수 있는 상동 재조합 서열인 HA-L 및 HA-R 암(arm)이 나타나 있다.
도 3은 pDonor-Teton3g-2a-TagBFP-V5-nls-p2a-puroR WPRE_Insulated mpclover-2a-luc2pest-2a-gdnf wpre의 벡터 맵을 나타낸다.
도 4는 인간 PPP1R12C 유전자의 엑손 1과 2 사이의 내인성 유전자좌의 AAVS1 표적화의 개략도를 나타낸다. 초기에, 상류 PPP1R12C에 연결된 스플라이스 수용자에 의해 구동되는 리포터/선택 카세트 (형광 및 항생제 선택을 위한 TagBFP2 및 PuroR)로 이루어진 수용체 "착지 부위" 및 LoxP 및 FRT 부위에 의해 플랭킹된 구성적 CAG 프로모터 구동된 td-Tomato 적색 형광 시스트론은 안정적으로 통합되었다. 그 후, 이들 리포터에 대한 안정적인 선택시, 이들 세포는 FlpO 및 Cre를 발현하는 플라스미드 및 LoxP 및 FRT 플랭킹된 선택/리포터 카세트 및 dox-유도성 mpClover/Luc2p/GDNF 시스트론 함유 플라스미드를 함유하는 공여자 플라스미드로 리포펙션되었다.
도 5a-5d는 iNPC가 CNS10-NPC와 조성이 유사함을 보여준다. CNS10-NPC 및 iNPC는 동결보존 및 단일-세포 RNAseq에 대한 어느 하나의 과정으로부터 곧바로 단일 세포로 해리되거나 배양 배지에서 7일 동안 플레이팅 및 성장되었다. (도 5a) 세포의 편향되지 않은 클러스터링은 iPSC가 iNPC (분홍색) 및 CNS10-NPC로부터 분리되어 있음을 보여준다. 일부 iNPC는 CNS10-NPC와 클러스터링된 것으로 관찰된다. (도 5b) 각 클러스터의 전사체 발현은 카테고리 당 25-50개의 유전자로 구성된 모듈과 유사하게 점수화되었다. 스케일: 황색 = 높은 발현, 보라색 = 낮은 발현. (도 5c) 편향되지 않은 클러스터의 특징 플롯은 iNPC 및 CNS10-NPC에서 성숙 및 미성숙 성상세포-관련 전사체의 발현을 나타내지만, iPSC는 그렇지 않다. (도 5d) iNPC 및 CNS10-NPC의 제7일 배양물에 대한 면역세포화학은 시험관내에서 두 세포 유형 모두에서 S100β (회색) 및 GFAP (백색) 단백질의 발현을 나타낸다. iNPC 삽입물은 성상세포 인자와 배양 35일 후 GFAP (회색) 발현을 나타낸다. 스케일 바 = 75 μm, 삽입 25 μm.
도 6a-6d는 iPSC 라인에서 GDNF-발현 조작을 위한 구성적 및 유도성 작제물을 나타낸다. (도 6a) AAVS1 표적화된 GDNF 발현 작제물의 구성요소를 보여주는 도. (도 6b) GDNF ELISA는 구성적 GDNF 작제물을 보유하는 iNPC가 렌티바이러스 형질도입된 iNPC 및 CNS10-NPC 세포 둘 다에 대해 유사한 수준의 GDNF를 생산함을 입증한다. (도 6c) V1 유도성 작제물을 갖는 iNPC의 GDNF ELISA는 독시사이클린 첨가 및 회수에 반응하여 강건하고 효율적인 유도 및 감쇠를 나타낸다. (도 6d) V1 유도성 작제물을 갖는 iNPC는 식수 중에 독시사이클린이 제공된 WT 래트의 요추 척수에 이식시 GDNF를 발현하지 못한다. 스케일 바 = 75 μm.
도 7은 AAVS1의 TALEN 표적화를 나타낸다. 우측 및 좌측 TALE 뉴클레아제 뿐만 아니라 AAVS1 상동성을 보여주는 개략도.
도 8a-8b는 iPSC-유래 세포가 생존하고 ChAT+ 운동 뉴런을 보호함을 보여준다. 요추 척수에서 GDNF를 생산하기 위해 렌티바이러스로 형질도입된 현재 iNPC로 SOD1G93A 래트를 이식하였다. (도 8a) 10K 세포/부위 n=5 동물. 이식은 숙주 ChAT+ 운동 뉴런을 보존하였다. (도 8b) 50K 세포/부위 n=3 동물. 세포는 보호성이 아니었고 숙주 뉴런을 치환하였다. 스케일 바 250 μm.
도 9a-9b는 9개월 후 누드 래트의 척수에서의 iNPC의 생착을 나타낸다. 요추 척수를 절단하고, 인간 핵 (SC121, 녹색) 및 증식 세포 (Ki67, 백색)에 대해 염색하였다. 좌측 상의, 척수의 내측, 복측 뿔의 한쪽 측면에서의 iNPC-GDNFCONST-V1 생착의 lw 확대 이미지. 상자는 양성 인간 세포 (도 9a) 및 음성 인간 세포 (도 9b)를 보여주는 보다 높은 배율 영역을 나타낸다. 별표는 중심 관을 나타낸다. 스케일 바 100 μm 및 보다 높은 배율에서 25 μm.
도 10은 AAVS1-Tet-On-3G-GDNF (서열 번호: 5)의 벡터 맵을 나타낸다.
도 11은 예시적인 분화 프로토콜 및 타임라인의 개략도를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
기재된 바와 같이, 본 발명자들은 성상세포로 분화될 수 있고 렌티바이러스로 트랜스펙션되어 GDNF를 안정적으로 생산할 수 있는 태아 신경전구 세포 (fNPC)로서 임상 연구를 추구하였다. 이들 GDNF-생산 세포는 척수에 효율적으로 생착되고 SOD1 ALS 래트에서 ChAT+ 운동 뉴런의 손실을 늦춘다. 이들 놀라운 전진에도 불구하고, 태아 신경전구 세포는 여러 단점을 갖는다. 첫째, 재생불가능 공급원으로서의 태아 조직의 이용가능성 및 변동. 이는 태아 조직의 단일 라인, G010을 기반으로 하는 본 발명자들의 임상 시험을 포함한다. 이 라인에는 제한된 양의 물질이 남아 있으며 새로운 스톡을 얻기 위한 공급원이 없다. 줄기 세포의 태아 공급원의 두 번째 주요 단점은 태아 신경전구 세포 공급원 사용시 이종 집단을 생성하는 렌티바이러스 접근법을 사용하여 창출되는 랜덤 통합이다.
이들 제한은 본원에 제공된 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 유래된 신경 전구 세포에 의해 특정적으로 해결된다. 태아 세포 공급원의 첫 번째 한계를 해결하는 iPSC는 주문형 생산이 가능한 재생가능 세포 공급원이다. 두 번째 제한은 iPSC의 클론 확장 능력에 의해 제거되며, 여기서는 유도성 발현 시스템을 포함하거나 CRISPR과 같은 유전 편집 기술을 활용하는 유전 작재물을 균일하게 도입할 수 있다. 자가 요법을 위한 전례 없는 기회와 같은 추가적인 이점이 존재하며, 가능하게는 동종이계 인간 세포 이식에서의 면역 거부를 둘러싼 복잡성을 우회할 수 있다. 본 발명자들 자신의 연구를 포함하는 iPSC는 신경 전구세포-유사 세포를 생산하는 데 사용되었지만, 본원에 기재된 iPSC-유래 신경 전구 세포는 이식 숙주에 생착될 수 있다. 이 중요한 특성은 이식을 통한 재생 의학을 위한 기재된 세포의 사용에 대한 실행가능성을 지지한다.
손실된 세포를 대체하거나, 손상 환경을 변조하거나, 숙주 뉴런을 보호 및 재생하기 위한 허용 환경을 창출하기 위해 뇌 또는 척수로 인간 신경 전구 세포를 이식하는 것은 오랫동안 신경 질환에 대한 유망한 치료적 전략이었다. 이전에, 본 발명자들은 부착 iPSC를 확장이 가능한 자유-부동 구(sphere) (EZ 구)로 변환시킬 수 있었다. 이러한 EZ 구는 전체-트랜스 레티노산 (ATRA) 및 표피 성장 인자 (EGF) 및 섬유아세포 성장 인자-2 (FGF-2) 미토겐의 조합을 사용하여 척수 표현형을 갖는 NPC 구로 분화될 수 있었다. 그러나, 이러한 세포는 효율적으로 생착되지 않음으로써 재생 의학 요법에서의 이들의 효과적인 사용을 제한하였다.
임상적 사용을 향한 iPSC-유래 NPC의 개발 진전은 하기를 포함할 수 있다: 1) 안전성; 2) 정상적인 세포유전학 상태의 유지; 3) 가능한 악성 종양 형성을 피하기 위한 잔류 만능 세포의 부족; 4) 많은 수의 세포를 확장하는 재현성; 및 5) 본원에 제공된 세포의 생존, 통합, 및 관련 중추 신경계 영역으로의 생착.
뉴런 대체가 미래의 임상 이식 시험을 위한 한 가지 전략이지만, 성상교세포는 인간 뇌 및 척수에서 가장 풍부한 세포 유형이며 이제 뇌 기능에 대하여 뉴런만큼 중요한 것으로 이해된다. 이들은 또한 많은 신경퇴행성 질환과 관련되어 왔고, 아마도 가장 좋은 예는 ALS일 것이다. ALS에서, 신경교 기능장애는 운동 뉴런의 비-세포 자율적 사망을 초래하는 것으로 나타났다. 나이브(naive) 또는 분비 성장 인자인 성상세포의 대체는 ALS 모델에서 유익한 것으로 나타났다. 본 발명자들의 이전 연구는, fNPC가 이후에 장기간에 걸쳐 설치류 뇌 및 척수 내에서 미성숙 및 성숙 성상세포로 분화되는 성상교 전구세포를 생성할 수 있음을 보여주었다. 인간 PSC는 또한 더 성숙한 성상세포로 지시될 수 있다. 이러한 PSC-유래 성숙 성상세포는 이식에서 생존할 수 있지만, iPSC로부터 생성된 미성숙 NPC는 시험관내 배양 및 확장이 더 쉽고 생체내 이동, 통합 및 복원에 더 잘 적합화되는 세포를 제공할 수 있다.
추가로, 줄기 세포-유래 신경 전구세포를 사용하여 뇌에 영양 인자를 사용하는 것은 혈액 뇌 장벽을 우회하는 강력한 방식이다. 생체외 유전자 변형 세포를 사용하여 손상 부위에 다양한 성장 인자를 전달하는 것은 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 파킨슨병, 헌팅턴병 및 알츠하이머병의 질환 모델에서 숙주 뉴런을 지지하는 것으로 나타났다. 이와 병행하여, 신경교 세포 라인-유래 신경영양 인자 (GDNF)의 전달은 파킨슨병 환자에게 이점을 제공하였으며 현재 ALS 환자에 대한 1/2a상 임상 시험에서 시험되고 있다. 영양 인자의 이점을 최대한 활용하고 세포에 의해 전달되는 영양 인자의 잠재적인 원치 않는 효과를 막기 위해, 성장 인자 분비의 조절이 여러 신경퇴행성 질환에 대한 유망한 방안이다. 만성 영양 인자 전달은, 유전자 발현 및 하류 신호 활성화가 밀접하게 연결된 과정이기 때문에, 부작용이 있는 경우 중단 또는 용량 조정을 금지한다. 유전자 발현의 시기 및 크기에 대한 제어의 부족은 치료의 효능을 제한하고 의도하지 않은 세포 효과를 도입할 수 있다.
이들 목적을 위해, 테트라사이클린 (Tet)-조절 시스템이 다양한 방법론에서 유전자 발현을 시간적 및 공간적으로 조절하는 데 사용되었다. 이는 Tet 유사체인 독시사이클린 (dox)의 존재 하에 Tet-조절 프로모터의 하류에서 유전자 발현을 침묵시키는 박테리아 Tet 전사활성화제 (tTA)를 포함한다. 이 "Tet-Off" 시스템에 추가로, "Tet-On" 시스템은 dox의 존재 하에 이식유전자 발현을 활성화하기 위해 역 tTA (rtTA)를 사용한다. 신경 줄기 세포 집단에서의 tTA 및 rtTA 변이형의 사용은 탐구되지 않았다.
여기서, 본 발명자들은 확장가능 인간 iPSC-유래 신경 전구 세포 (iPSC-유래 NPC)의 생산에 대한 새로운 프로토콜을 보고한다. 이들 인간 iPSC-유래 NPC는 현탁액 배양으로서 장기간에 걸쳐 쉽게 전파될 수 있으며 임상 연구에서 안전하고 효과적인 것으로 입증된 인간 태아 유래 신경 전구 세포 (fNPC)와 유사하다. 주사 후, iNPC는 종양 형성 또는 과성장의 징후 없이 성공적으로 생착되며, 또한 유사 fNPC 이식보다 우수하지는 않더라도 그와 유사하게 수행하는 것으로 보인다. 본 발명자들의 결과는 fNPC의 공급, 확장 및 윤리적 우려를 갖지 않는 인간 신경 전구 세포의 새로운 공급원을 설명하므로, ALS와 같은 신경퇴행성 질환에 대한 줄기 세포-기반 치료적 접근에 이상적일 수 있다.
생성된 iPSC-유래 NPC의 다양성을 기반으로 하여, 이들 세포는 ALS의 맥락에서 성공적인 태아 G010 세포에 대한 완전히 적합하고 우수한 대체물의 역할을 할 수 있다. 추가 개발에는 SOD-1 래트에서의 iPSC-유래 NPC 성장 및 생착의 평가, 및 이들 iPSC 유래 NPC의 장기간 종양발생에 대한 검사가 포함될 것이다. 이는 추가로 SOD-1 래트에서의 추가 효능 연구를 포함한다. 또한 이들 연구는, SOD-1 래트가 SOD-1의 특정 세포 용량에서 척수에서의 생착 및 신경보호 효과를 나타냈음을 관찰한 예비 결과를 확인시켜 줄 것이다. 또한, 9개월에 걸친 안전성/종양발생 연구로서 누드 래트에서의 종양발생 연구가 진행 중이다.
추가의 정보가 하기에서 확인되며, 이들은 전체적으로 본원에 참조로 포함된다: 예를 들어, 미국 출원 번호 62/644,332, 62/773,752, PCT 출원 번호 PCT/US2019/022595, PCT 공개 번호 WO 2017/131926, Sareen 등 "Human neural progenitor cells generated from induced pluripotent stem cells can survive, migrate, and integrate in the rodent spinal cord" J. Comp. Neurol. 2014 August 15; 522(12): 2707-2728, 및 Akhtar 등 "A Transposon-Mediated System for Flexible Control of Transgene Expression in Stem and Progenitor-Derived Lineages" Stem Cell Reports. 2015 Mar 10; 4(3): 323-331.
유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 신경 전구 세포 (iNPC)를 생성하기 위한 방법이 본원에 기재된다. 다양한 구현예에서, 본원에 제공된 iNPC는 복수의 유도-만능 줄기 세포로부터 생성된다. 다양한 구현예에서, 본원에 제공된 iNPC는 적어도 하나의 줄기 세포 마커를 발현하는 복수의 세포로부터 생성된다. iPSC의 특성은 하기에서 추가로 논의된다.
유도 만능 줄기 세포
유도 만능 세포는 분화된 체세포의 재프로그래밍에 의해 생성된다. 분화는 생리학적 맥락 하에 일반적으로 비가역적이지만, 체세포를 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)로 재프로그래밍하기 위한 여러 방법이 개발되었다. 예시적인 방법은 당업자에게 공지되어 있고 하기에 간략하게 기재된다. 본원에 제공된 iPSC는 하기에 추가로 기재된 방법에 의해 생성될 수 있거나, 또는 이들은 상업적 공급원, 예를 들어 ThermoFisher Scientific®, STEMCELL TECHNOLOGIES® 또는 Applied StemCell®로부터 입수가능한 것들로부터 얻을 수 있다.
체세포를 iPS 세포로 재프로그래밍하는 방법은 예를 들어 하기에 기재되어 있으며, 이들은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다: 미국 특허 번호 8,129,187 B2; 8,058,065 B2; 미국 특허 출원 2012/0021519 A1; Singh 등 Front. Cell Dev. Biol. (2015년 2월); 및 Park 등, Nature 451: 141-146 (2008). 구체적으로, iPSC는 재프로그래밍 전사 인자의 조합을 도입함으로써 체세포로부터 생성된다. 재프로그래밍 인자는, 예를 들어, 단백질, 핵산 (mRNA 분자, DNA 작제물 또는 이를 인코딩하는 벡터) 또는 임의의 이들의 조합으로서 도입될 수 있다. 소분자는 또한 도입된 전사 인자를 증대시키거나 보완할 수 있다. 추가의 인자가, 예를 들어, 재프로그래밍의 효율에 영향을 미치는 것으로 결정되었지만, 조합시 체세포를 유도 만능 상태로 재프로그래밍하기에 충분한 4개의 재프로그래밍 인자의 표준 세트는 Oct4 (옥타머 결합 전사 인자-4), SOX2 (성 결정 영역 Y)-박스 2, Klf4 (크루펠 유사 인자-4), 및 c-Myc를 포함한다. LIN28 + Nanog, Esrrb, Pax5 shRNA, C/EBPβ, p53 siRNA, UTF1, DNMT shRNA, Wnt3a, SV40 LT(T), hTERT)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 추가의 단백질 또는 핵산 인자 (또는 이들을 인코딩하는 작제물) 또는 BIX-01294, BayK8644, RG108, AZA, 덱사메타손, VPA, TSA, SAHA, PD0325901 + CHIR99021(2i) 및 A-83-01을 포함하나 이에 제한되지는 않는 소분자 화학 작용제가 4개의 재프로그래밍 인자의 기본 또는 표준 세트로부터의 하나의 또는 다른 재프로그래밍 인자를 대체하거나, 재프로그래밍의 효율을 향상시키는 것으로 나타났다.
재프로그래밍은 분화된 세포 (예: 체세포)의 분화 상태를 변경하거나 역전시키는 과정이다. 다시 말해서, 재프로그래밍은 세포의 분화를 보다 미분화된(undifferentiated) 또는 보다 원시적인 유형의 세포로 역으로 구동하는 과정이다. 많은 1차 세포를 배양에 배치하면 완전히 분화된 특징의 일부 손실을 초래할 수 있음이 인지되어야 한다. 그러나, 분화된 세포라는 용어에 포함된 이러한 세포를 단순히 배양한다고 해서 이들 세포가 분화되지 않은 세포 또는 만능 세포가 되는 것은 아니다. 분화된 세포의 만능성으로의 전이는, 분화된 세포가 배양에 배치될 때 분화된 특징의 부분적 손실로 이어지는 자극을 넘어서는 재프로그래밍 자극을 필요로 한다. 재프로그래밍된 세포는 또한, 일반적으로 배양에서 단지 제한된 수의 분열에 대한 능력을 갖는 1차 세포 부모에 비해, 성장 잠재력의 손실 없이 연장된 패시징(passaging)의 능력의 특징을 갖는다.
재프로그래밍될 세포는 재프로그래밍 전에 부분적으로 또는 최종적으로 분화될 수 있다. 따라서, 재프로그래밍될 세포는 성체 또는 체세포 줄기 세포 뿐만 아니라 최종 분화 체세포일 수 있다.
일부 구현예에서, 재프로그래밍은 분화된 세포 (예를 들어, 체세포)의 분화 상태의 만능 상태 또는 다능 상태로의 완전한 복귀를 포함한다. 재프로그래밍은 세포에 의한 특정 유전자의 발현을 초래할 수 있으며, 그의 발현은 재프로그래밍에 추가로 기여한다.
출발 세포의 집단으로부터 유래된 재프로그래밍의 효율 (즉, 재프로그래밍된 세포의 수)은 하기 문헌에 의해 나타난 바와 같이 다양한 소분자의 첨가에 의해 향상될 수 있다: Shi, Y., 등 (2008) Cell-Stem Cell 2:525-528, Huangfu, D., 등 (2008) Nature Biotechnology 26(7):795-797, 및 Marson, A., 등 (2008) Cell-Stem Cell 3:132-135. 재프로그래밍 효율을 향상시키는 작용제의 일부 비-제한적 예는, 특히, 가용성 Wnt, Wnt 제어 배지, BIX-01294 (G9a 히스톤 메틸트랜스퍼라제), PD0325901 (MEK 억제제), DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제, 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제, 발프로산, 5'-아자시티딘, 덱사메타손, 수베로일아닐리드, 히드록삼산 (SAHA), 비타민 C, 및 트리코스타틴 (TSA)을 포함한다.
단리된 iPSC 클론은 하나 이상의 줄기 세포 마커의 발현에 대해 시험될 수 있다. 체세포로부터 유래된 세포에서의 이러한 발현은 세포를 유도 만능 줄기 세포로 식별한다. 줄기 세포 마커는, 특히, SSEA3, SSEA4, CD9, Nanog, Oct4, Fbx15, Ecat1, Esg1, Eras, Gdf3, Fgf4, Cripto, Dax1, Zpf296, Slc2a3, Rex1, Utf1, 및 Nat1을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, Nanog 및 SSEA4를 발현하는 세포는 만능성으로 식별된다.
본원에 기재된 임의의 측면의 일부 구현예에서, 본원에 기재된 세포는 적어도 하나의 만능 줄기 세포 마커를 발현한다. 줄기 세포 마커의 발현을 검출하는 방법은, 예를 들어, RT-PCR 및 인코딩된 폴리펩티드의 존재를 검출하는 면역학적 방법, 예컨대 웨스턴 블롯, 면역세포화학 또는 유세포 분석을 포함할 수 있다. 세포내 마커는 RT-PCR을 통해 가장 잘 식별될 수 있는 반면, 세포 표면 마커는 예를 들어 면역세포화학에 의해 쉽게 식별된다.
단리된 세포의 만능 줄기 세포 특징은 iPSC가 3개의 배엽 각각의 세포로 분화하는 능력을 평가하는 시험에 의해 확인될 수 있다. 일례로서, 누드 마우스의 기형종 형성을 사용하여 단리된 클론의 만능 특징을 평가할 수 있다. 세포를 누드 마우스에 도입하고 상이한 생식 계열 계통의 마커에 대해 특이적인 항체를 사용하는 조직학 및/또는 면역조직화학을 세포로부터 발생하는 종양에 대해 수행한다. 세 가지 배엽, 내배엽, 중배엽 및 외배엽 모두로부터의 세포를 포함하는 종양의 성장은 추가로 세포가 만능 줄기 세포임을 나타내거나 확인시켜 준다.
일반적으로, 분화 과정 전반에 걸쳐, 만능 세포는 특정 발달 계통, 예를 들어 1차 배엽-외배엽, 중배엽, 또는 내배엽을 따르는 발달 경로를 따를 것이다.
배아 배엽은 모든 조직 및 기관이 유래하는 공급원이다. 배엽은 특정 바이오마커의 발현 및 유전자 발현에 의해 식별될 수 있다. 이들 바이오마커를 검출하기 위한 검정은, 예를 들어, RT-PCR, 면역조직화학, 및 웨스턴 블롯팅을 포함한다. 초기 중배엽 세포에 의해 발현되는 바이오마커의 비-제한적 예는, 특히, HAND1, ESM1, HAND2, HOPX, BMP10, FCN3, KDR, PDGFR-α, CD34, Tbx-6, Snail-1, Mesp-1, 및 GSC를 포함한다. 초기 외배엽 세포에 의해 발현되는 바이오마커는, 특히, TRPM8, POU4F1, OLFM3, WNT1, LMX1A 및 CDH9를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 초기 내배엽 세포에 의해 발현되는 바이오마커는 LEFTY1, EOMES, NODAL 및 FOXA2를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 당업자는 세포 유형을 기반으로 한 분화 프로토콜을 수행하는 동안 모니터링할 계통 마커 및 그 세포가 발달에서 유래된 배엽을 결정할 수 있다.
방법
시험관내 특정 발달 계통의 유도는 계통 투입을 촉진하는 특정 작용제, 벡터, 또는 이들의 조합의 존재 하에 줄기 세포 (예를 들어, 본원에 제공된 iPSC)를 배양함으로써 달성된다. 일반적으로, 본원에 제공된 방법은 세포 배양 배지에 작용제 (예: 소분자, 성장 인자, 사이토카인, 폴리펩티드, 벡터 등)를 단계적으로 첨가하거나 iPSC의 신경 전구 세포 계통으로의 분화를 촉진하는 작용제와 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 특히, 전사 인자 및 성장 인자 신호전달이 분화를 유도하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 VegT, Wnt 신호전달 (예를 들어, β-카테닌을 통한), 골 형태발생 단백질 (BMP) 경로, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 경로, 및 TGFβ 신호전달 (예: 액티빈 A)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 하기 문헌 참조: Sareen 등 J Comp Neurol. (2014), Baharvand H, 등 Neural differentiation from human embryonic stem cells in a defined adherent culture condition. Int J Dev Biol. 2007; 51:371-378.
세포 개체발생의 맥락에서, 용어 "분화" 또는 "분화하는"은, "분화된 세포"가 그의 전구체 세포보다 발달 경로를 더 아래로 진행한 세포를 의미하는, 상대적인 용어이다. 따라서, 일부 구현예에서, 재프로그래밍된 세포는 계통-제한된 전구체 세포 (예컨대 중배엽 줄기 세포)로 분화할 수 있고, 이는 차례로 경로의 더욱 아래에서 다른 유형의 전구체 세포 (예컨대 조직 특이적 전구체)로, 또한 이어서 특정 조직 유형에서 특징적인 역할을 하고 더 증식하는 능력을 보유하거나 보유하지 않을 수 있는 말기 분화 세포로 분화할 수 있다.
일반적으로, 시험관내-분화된 세포는 단계적 과정 전반에 걸쳐 만능 마커 (예: HNF4-α, AFP, GATA-4, 및 GATA-6)의 하향조절을 나타내고 계통-특이적 바이오마커 (예를 들어, 중배엽, 외배엽 또는 내배엽 마커)의 발현의 증가를 나타낸 것이다. 예를 들어, 인간 만능 줄기 세포 라인의 특성화 및 특정 계통에 따른 분화를 기재하는 하기 문헌 참조: Tsankov 등 Nature Biotech (2015). 분화 과정은 당업계에 공지된 많은 방법에 의해 효율에 대해 모니터링될 수 있다. 이는 표준 기술, 예를 들어 면역세포화학, RT-PCR, 유세포 분석, 기능 검정, 현미경검사 등을 사용한 배엽 바이오마커의 존재의 검출을 포함한다.
방법:
본원에 제공된 방법은 (i) 일정량의 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 제공하는 단계; (ii) RHO 키나제 억제제의 존재 하에 iPSC를 배양하는 단계; (iii) 단층을 생성하는 단계; (iv) LDN 및 SB의 존재 하에 상기 iPSC를 추가로 배양하는 단계; 및 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 표피 성장 인자 (EGF) 및 백혈병 억제 인자 (LIF)의 존재 하에 상기 iPSC를 추가로 배양함으로써, iPSC-유래 NPC를 생성하는 단계를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본원에 제공된 일정량의 iPSC는 현탁액 중의 iPSC를 포함한다. 다양한 구현예에서, 단층의 생성은 배양된 iPSC를 진탕시키는 것을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본원에 제공된 iPSC는 Rho 키나제 억제제 (ROCK 억제제)의 존재 하에 배양된다. 현재의 방법과 상용성인 여러 Rho 키나제 억제제가 존재한다. 특정 구현예에서, Rho 키나제 억제제는 파수딜, 리파수딜, 네타르수딜, RKI-1447, Y-27632, GSK429286A, Y-30141, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, Rho 키나제 억제제는 Y27632 이염화물 수화물을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 iPSC는 적어도 약 0.5 μM 내지 약 12 μM의 Rho 키나제 억제제의 농도에서 배양된다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 iPSC는 약 5 μM의 Rho 키나제 억제제의 농도로 배양된다. 특정 구현예에서, Rho 키나제 억제제의 농도는 적어도 1 μM 이상, 적어도 2 μM 이상, 적어도 3 μM 이상, 적어도 4μM 이상, 적어도 5μM 이상, 적어도 6 μM 이상, 적어도 7μM 이상, 적어도 8 μM 이상, 적어도 9 μM 이상, 적어도 10 μM 이상, 적어도 11 μM 이상, 최대 12 μM이다. 특정 구현예에서는, Rho 키나제 억제제를 적용한 후 세포를 플레이팅하고 LDN 및/또는 SB 중 하나 이상을 포함하는 배지로 처리한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 iPSC는 배양에서 적어도 8시간 이상, 적어도 12시간 이상, 적어도 24시간 이상, 적어도 48시간 이상, 적어도 36시간 이상, 적어도 72시간 이상, 최대 3일 동안 Rho 키나제 억제제 (ROCK 억제제)의 존재 하에 배양된다.
다양한 구현예에서, 본원에 제공된 iPSC는 LDN 및 SB 중 하나 이상의 존재 하에 배양된다.
LDN은 액티빈 수용체-유사 키나제 (ALK) 폴리펩티드의 소분자 억제제이다. 구체적으로, LDN은 액티빈 수용체-유사 키나제-2 (ALK2), ALK3 및 ALK6 수용체를 표적화한다. SB는 ATP 결합 부위에 대해 경쟁함으로써 ALK5 (IC50 = 94 nM), ALK4 (IC50 = 140 nM), 및 ALK7을 억제하는 TGF-β/액티빈/NODAL 경로의 선택적이고 강력한 억제제이다. 이는 BMP 유형 I 수용체 ALK2, ALK3, 및 ALK6을 억제하지 않는다 (예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 하기 문헌 참조: Inman 등 (2002) Molecular pharmacology 62 1 65--74.; 및 Tchieu 등 Cell Stem Cell 21(3) 399-410.e7. (2017); 및 Laping 등 (2002) Molecular pharmacology. 62 1 58―64). ALK의 억제는 골 형태발생 (BMP) 경로 및 TGFβ 신호전달 경로를 억제함으로써 전구 세포 및 iPSC의 분화를 촉진한다. SB (예: SB431542)와 조합된 LDN (예: LDN193189)의 억제 칵테일은 이중 SMAD 억제 (dSMADi)에 의해 중추 신경계 세포의 효율적인 생성을 가능하게 한다. dSMADi의 변형은 전뇌, 중뇌 및 척수 전구 세포를 포함하는 배아의 신경축을 따라 많은 상이한 신경 아형을 생성할 수 있다 (예를 들어, 하기 문헌 참조: Tchieu 등 Cell Stem Cell 21(3) 399-410.e7. (2017)). LDN193189 (예: STEMCELL TECHNOLOGIES-카탈로그 # 72147), SB-431542 (GlaxoSmithKline®), LDN189, LDN-212854, 및 그의 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 당업계에 공지된 LDN 여러 소분자, SB 소분자, 및 ALK 억제제가 존재한다.
다른 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 배양에서 약 7일 내지 약 13일 동안 LDN 및 SB의 존재 하에 iPSC를 배양하는 것을 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 방법은 배양에서 적어도 48시간 이상, 적어도 36시간 이상, 적어도 72시간 이상, 적어도 3일 이상, 적어도 4일 이상, 적어도 5일 이상, 적어도 6일 이상, 적어도 7일 이상, 적어도 8일 이상, 적어도 9일 이상, 적어도 10일 이상, 적어도 11일 이상, 적어도 12일 이상, 적어도 13일 이상, 적어도 14일 이상, 최대 약 15일 동안 LDN의 존재 하에 iPSC를 추가로 배양하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 방법은 배양에서 적어도 48시간 이상, 적어도 36시간 이상, 적어도 72시간 이상, 적어도 3일 이상, 적어도 4일 이상, 적어도 5일 이상, 적어도 6일 이상, 적어도 7일 이상, 적어도 8일 이상, 적어도 9일 이상, 적어도 10일 이상, 적어도 11일 이상, 적어도 12일 이상, 적어도 13일 이상, 적어도 14일 이상, 최대 약 15일 동안 SB의 존재 하에 iPSC를 추가로 배양하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 방법은 배양에서 적어도 48시간 이상, 적어도 36시간 이상, 적어도 72시간 이상, 적어도 3일 이상, 적어도 4일 이상, 적어도 5일 이상, 적어도 6일 이상, 적어도 7일 이상, 적어도 8일 이상, 적어도 9일 이상, 적어도 10일 이상, 적어도 11일 이상, 적어도 12일 이상, 적어도 13일 이상, 적어도 14일 이상, 최대 약 15일 동안 LDN 및 SB의 존재 하에 iPSC를 추가로 배양하는 것을 포함한다.
다른 구현예에서, 방법은 약 4.75 내지 약 5.75 μg/mL의 존재 하에 본원에 제공된 iPSC를 배양하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 방법은 적어도 3.0 μg/mL 이상 LDN, 적어도 3.25 μg/mL 이상 LDN, 적어도 4.25 μg/mL 이상 LDN, 적어도 4.5 μg/mL 이상 LDN, 적어도 4.75 μg/mL 이상 LDN, 적어도 5.0 μg/mL 이상 LDN, 적어도 5.25 μg/mL 이상 LDN, 적어도 5.5 μg/mL 이상 LDN, 적어도 5.75 μg/mL 이상 LDN, 적어도 6.0 μg/mL 이상 LDN, 적어도 6.25 μg/mL 이상 LDN, 적어도 6.5 μg/mL 이상 LDN, 적어도 6.75 μg/mL 이상 LDN, 적어도 7.0 μg/mL 이상 LDN, 적어도 7.25 μg/mL 이상 LDN, 적어도 7.5 μg/mL 이상 LDN, 적어도 7.75 μg/mL 이상 LDN, 최대 8 μg/mL LDN의 농도의 존재 하에 본원에 제공된 iPSC를 배양하는 것을 포함한다.
다른 구현예에서, 방법은 약 0.5 μM 내지 약 4 μM SB의 존재 하에 본원에 제공된 iPSC를 배양하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 방법은 적어도 0.5 μM 이상 SB, 적어도 0.75 μM 이상 SB, 적어도 1.0 μM 이상 SB, 적어도 1.25 μM 이상 SB, 적어도 1.5 μM 이상 SB, 적어도 1.75 μM 이상 SB, 적어도 2.0 μM 이상 SB, 적어도 2.25 μM 이상 SB, 적어도 2.5 μM 이상 SB, 적어도 2.75 μM 이상 SB, 적어도 3.0 μM 이상 SB, 적어도 3.25 μM 이상 SB, 적어도 3.5 μM 이상 SB, 적어도 3.75 μM 이상 SB, 최대 4.0 μM SB의 농도의 존재 하에 본원에 제공된 iPSC를 배양하는 것을 포함한다.
다른 구현예에서, 본원에 제공된 iPSC는 배양에서 적어도 8시간 이상, 적어도 12시간 이상, 적어도 24시간 이상, 적어도 48시간 이상, 적어도 36시간 이상, 적어도 72시간 이상, 적어도 3일 이상,, 적어도 4일 이상, 적어도 5일 이상, 적어도 6일 이상, 적어도 7일 이상, 적어도 8일 이상, 적어도 9일 이상, 적어도 10일 이상, 적어도 11일 이상, 적어도 12일 이상, 적어도 13일 이상, 적어도 14일 이상, 적어도 15일 이상, 최대 16일 동안 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 표피 성장 인자 (EGF), 및 백혈병 억제 인자 (LIF) 중 하나 이상의 존재 하에 추가로 배양된다.
다른 구현예에서, 본원에 제공된 iPSC는 배양에서 적어도 8시간 이상, 적어도 12시간 이상, 적어도 24시간 이상, 적어도 48시간 이상, 적어도 36시간 이상, 적어도 72시간 이상, 적어도 3일 이상,, 적어도 4일 이상, 적어도 5일 이상, 적어도 6일 이상, 적어도 7일 이상, 적어도 8일 이상, 적어도 9일 이상, 적어도 10일 이상, 적어도 11일 이상, 적어도 12일 이상, 적어도 13일 이상, 적어도 14일 이상, 적어도 15일 이상, 최대 16일 동안 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 표피 성장 인자 (EGF), 및 백혈병 억제 인자 (LIF)의 존재 하에 추가로 배양된다.
다른 구현예에서, 본원에 제공된 iPSC는 적어도 약 50 ng/ml 최대 약 200 ng/ml의 농도로 섬유아세포 성장 인자 (FGF)의 존재 하에 추가로 배양된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 iPSC는 적어도 50 ng/mL 이상, 적어도 75 ng/mL 이상, 적어도 100 ng/mL 이상, 적어도 125 ng/mL 이상, 적어도 150 ng/mL 이상, 적어도 175 ng/mL 이상 내지 약 200 ng/ml의 농도로 섬유아세포 성장 인자 (FGF)의 존재 하에 추가로 배양된다.
다른 구현예에서, 본원에 제공된 iPSC는 적어도 약 50 ng/ml 최대 약 200 ng/ml의 농도로 표피 성장 인자 (EGF)의 존재 하에 추가로 배양된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 iPSC는 적어도 50 ng/mL 이상, 적어도 75 ng/mL 이상, 적어도 100 ng/mL 이상, 적어도 125 ng/mL 이상, 적어도 150 ng/mL 이상, 적어도 175 ng/mL 이상 내지 약 200 ng/ml의 농도로 EGF의 존재 하에 추가로 배양된다.
다른 구현예에서, 본원에 제공된 iPSC는 적어도 약 50 ng/ml 최대 약 200 ng/ml의 농도로 백혈병 억제 인자 (LIF)의 존재 하에 추가로 배양된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 iPSC는 적어도 50 ng/mL 이상, 적어도 75 ng/mL 이상, 적어도 100 ng/mL 이상, 적어도 125 ng/mL 이상, 적어도 150 ng/mL 이상, 적어도 175 ng/mL 이상 내지 약 200 ng/ml의 농도로 LIF의 존재 하에 추가로 배양된다.
iPSC는 상기에 기재된 인자 중 임의의 하나 이상의 존재 하에 배양될 수 있다. 다른 구현예에서, iPSC는 조합되어 하기 인자 각각의 존재 하에 배양된다: RHO 키나제 억제제; LDN; SB; FGF; EGF; 및 LIF.
임의의 하나의 측면의 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 iNPC 분화 단계를 포함한다. 예시적 iNPC 분화 프로토콜은 하기와 같다:
1. 약 80-100% 컨플루엔시(confluency)로 6개 웰 플레이트에서 성장한 iPSC의 웰의 임의의 #로 출발한다. 세포가 더 높은 밀도 및 플레이트 웰에 있는 경우, 더 큰 분할을 수행하는 것이 허용가능하다. 예를 들어: 2개 웰-> 시드 3개 웰. 일반적으로, 1:1 비율로 분할하는 것이 가장 안전하다. 완전 컨플루언트(confluent) 웰 (갭 없음)이 분할 후에 필수적이고, 따라서 이를 달성하는 임의의 분할 비율이 허용가능하다.
2. 배지를 흡인하고, 각 웰에 1.5 mL의 Accutase™를 첨가한다.
3. 대략 5분 (필요한 경우 +2-5분) 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션한다.
a. 인큐베이터에서 3분 후, 플레이트의 측면을 가볍게 두드려 세포 상승을 용이하게 한다.
4. 세포가 탈착되면, 1.5 mL의 mTesR™ 배지를 각 웰에 첨가하고, 웰의 저부에서 세포를 계속 온화하게 세척한다. 세포가 웰의 저부에 점착되어 남아 있는 경우, 배지를 서서히 분배하면서 피펫 팁을 사용하여 세포를 온화하게 긁어낸다.
5. 세포 현탁액을 라벨링된 15 mL 원뿔형 튜브로 전달한다.
6. 세포 현탁액을 1,500 rpm (~300 g)으로 3 분 동안 스핀 다운한다.
7. 세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의하며, 온화하게 상청액을 흡인한다.
8. 세포 펠릿을 5 uM의 작업 농도로 mTesR 배지 + ROCK 억제제 중에 온화하게 재현탁시킨다.
a. 재현탁할 부피는 시딩된 웰의 수에 따라 달라진다.
9. 웰 당 3 mL의 세포 + mTeSR + ROCK 억제제를 시딩한다.
10. 인큐베이터로 전달하고, X-Y 운동으로 플레이트를 온화하게 진탕시켜 세포를 균일하게 분포시킨다.
11. 다음 날: 세포가 충분히 부착되고 좋은 단층을 형성한 경우, 아래에 요약된 분화 프로토콜로 진행한다. - 전체 배지 변경, 하루 3 mL를 웰의 측면 아래로 온화하게 공급한다.
a. 제1-10일 - 전체 배지를 신경 유도 배지 (NIM)로 교체한다.
b. NIM의 10회 공급 후, 각 웰 상의 배지를 5 uM ROCK 억제제를 함유하는 SEFL로 교체한다. 이어서, 세포 스크레이퍼를 사용하여 각 웰로부터 세포를 상승시키고 T25 플라스크 내로 전달한다.
c. 다음 날 - 50-75% 배지를 신선한 SEFL 배지로 교체한다. 가능한 한 많은 잔해를 제거한다. 필요에 따라 잔해를 제거하기 위해 구 배양의 처음 며칠 동안 더 큰 배지 변경을 수행할 수 있다.
d. 구로서 유지한다 - 보다 빠르게 컨디셔닝하지 않은 경우 3일마다 50%를 공급한다.
구 배양 및 유지:
·
미리 배지를 컨디셔닝하지 않은 경우 3일마다 구를 공급한다.
·
배지는 일반적으로 격일로 컨디셔닝되어야 하고, 이는 오렌지-황색 배지 색으로 표시된다.
·
구를 크기 및 밀도를 기반으로 하여 7-10일마다 세단한다.
·
세포 클럼핑 및 플라스크 저부에 대한 접착이 발생하면, 구를 온화하게 분쇄하고 플라스크 저부 아래로 배지를 세척하여 세포를 빼낸다.
표 1: 신경 유도 배지를 위한 시약
표 2: 피질 구 성장 배지를 위한 시약
벡터
유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 신경 전구 세포 (NPC)를 생성하는 상기 언급된 방법에 의해 제조된 일정량의 iPSC-유래 NPC를 제공하고, 적어도 2개의 벡터를 iPSC-유래 NPC에 도입하는 것을 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 신경 전구 세포 (NPC)를 생성하는 상기 언급된 방법에 의해 제조된 일정량의 iPSC-유래 NPC를 제공하고, 적어도 하나의 벡터를 iPSC-유래 NPC에 도입하는 것을 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 예시적 벡터는 도 1a-도 4, 도 6a, 도 7, 및 도 10에 기재되어 있다.
본원에 기재된 방법에 의해 생산된 iPSC-유래 NPC는 ALS 등의 질환을 치료하기 위해 사용되는 치료적 작용제를 포함한, 펩티드 및 단백질을 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 예시적 벡터는 도 1a-도 4, 도 6a, 도 7, 및 도 10에 나타나 있다.
벡터는 숙주 세포로의 전달 또는 상이한 숙주 세포 사이의 유전 물질의 전달을 위해 설계된 핵산 작제물이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 벡터는 바이러스성 또는 비-바이러스성일 수 있다. 용어 "벡터"는 적절한 제어 요소와 연관될 때 복제할 수 있고 유전 물질을 세포로 전달할 수 있는 모든 유전 요소를 포함한다. 벡터는 클로닝 벡터, 발현 벡터, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 인공 염색체, 바이러스, 비리온 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 벡터는 플라스미드 및 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
발현 벡터는 벡터 상의 전사 조절 서열에 연결된 안에 함유된 핵산 서열로부터 RNA 또는 폴리펩티드의 발현을 지시하는 벡터이다. 발현된 서열은 종종 세포에 대해 이종성일 것이지만 반드시 그런 것은 아니다. 발현 벡터는 추가의 요소를 포함할 수 있고, 예를 들어, 발현 벡터는 2개의 복제 시스템을 가질 수 있고, 따라서 이것이 2개의 유기체, 예를 들어 발현을 위한 동물 세포 및 클로닝 및 증폭을 위한 원핵 숙주에서 유지되는 것을 가능하게 한다. "발현"은 RNA 및 단백질을 생산하고 적절한 경우 단백질을 분비하는 데 관련된 세포 과정을 지칭하며, 이는 적용가능한 경우, 예를 들어, 전사, 전사체 처리, 번역 및 단백질 접힘, 변형 및 처리를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "발현 생성물"은 유전자로부터 전사된 RNA, 및 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역에 의해 얻어진 폴리펩티드를 포함한다.
다른 구현예에서, 본원에 제공된 벡터 또는 벡터들은 piggyBac 벡터 및 pBase 벡터를 포함한다. 다른 구현예에서, piggyBac 벡터는 5'에서 3' 방향으로, 구성적 프로모터, tet 반응성 요소를 포함하는 유도성, 양방향 폴리시스트론 프로모터, 및 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 발현 카세트, 2개의 트랜스포존 요소, 및 적어도 하나의 상동 재조합 서열을 포함하며, 여기서 2개의 트랜스포존 요소는 발현 카세트를 플랭킹한다.
다른 구현예에서, 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 서열은 신경영양 인자를 포함한다. 다른 구현예에서, 신경영양 인자는 신경교 유래 신경영양 인자 (GDNF)를 포함한다. 인간 GDNF에 대한 코딩 서열은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 NCBI 유전자 ID 2668, >NC_000005.10:c37840044-37812677 호모 사피엔스 염색체 5, GRCh38.p13 1차 어셈블리 (서열 번호: 2)이다. 인간 GDNF에 대한 RNA 전사체 서열 또한 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 NCBI 참조 서열: NM_000514.4 호모 사피엔스 신경교 세포 유래 신경영양 인자 (GDNF), 전사체 변이형 1, mRNA (서열 번호: 3)이다.
또한, 인간 GDNF 및 그의 변이형의 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 신경교 세포 라인-유래 신경영양 인자 이소형 1 프리프로프로테인 [호모 사피엔스], NCBI 참조 서열: NP_000505.1 (서열 번호: 4)이다.
다른 구현예에서, 본원에 제공된 piggyBac 벡터는 5'에서 3' 방향으로, 구성적 프로모터, tet 반응성 요소를 포함하는 유도성, 양방향 폴리시스트론 프로모터, 및 GDNF를 인코딩하는 서열을 포함하는 발현 카세트, 2개의 트랜스포존 요소, 및 적어도 하나의 상동 재조합 서열을 포함하며, 여기서 2개의 트랜스포존 요소는 발현 카세트를 플랭킹한다.
다른 구현예에서, tet 반응성 요소는 GDNF 이식유전자의 생체내 발현을 구동한다.
다른 구현예에서, 상동 재조합 서열은 게놈 세이프 하버를 표적화할 수 있는 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 게놈 세이프 하버는 하기 중 하나이다: 아데노-연관 바이러스 부위 1 (AAVS1), 케모카인 (C-C 모티프) 수용체 5 (CCR5) 유전자, 마우스 Rosa26 유전자좌의 인간 이종상동체. 다른 구현예에서, 신경 전구 세포는 생착 신경 전구 세포이다.
상기 언급된 벡터의 예는, 도 1a에 도시된, pB-RTP-Tet-GDNF/memClover-FLuc" [piggyBac-Reverse transactivator/TagBFP2nls/PacR-Tet inducible-GDNF/membrane Clover-Firefly Luciferase] [서열 번호: 1]이다.
여기서, 벡터는 2개의 프로모터 - 구성적으로 활성인 CMV/Chick β-액틴 (CAG로 공지됨) 프로모터 및 유도성, 양방향 TRE-Bi 프로모터를 포함한다. CAG 프로모터는 rtTA-V10 (tet-ON으로 공지됨) 전사활성화제, TagBFP2-V5nls (V5 태그 및 핵 국소화 서열을 갖는 향상된 청색 형광 단백질), 및 퓨로마이신 내성 유전자의 구성적 발현을 구동한다. 탠덤의 이식유전자는 자가-절단 펩티드 링커 (P2A)에 의해 분리된다. 여기서, 테트라사이클린 유사체 또는 유도체인 독시사이클린을 첨가하면 rtTA-V10 전사활성화제가 TRE-Bi 프로모터에 결합하고 하류 이식유전자의 전사를 촉매한다. TRE-Bi 프로모터의 제1 시스트론은 미리스토일화 및 팔미토일화 (MyrPalm) 클로버 리포터 (mpClover), 그 후 불안정화된 반딧불이 루시페라제 (Luc2P)를 보유한다. 유도성 TRE-Bi 프로모터의 하류의 제2 시스트론은 증가된 유전자 발현을 위한 우드척 간염 바이러스 전사-후 요소 (WPRE)가 뒤따르는 GDNF와 같은 신경영양 인자를 인코딩할 수 있다. 전사를 종료하고 가짜 이식유전자 발현을 방지하기 위해 각 요소의 하류에 토끼 베타-글로빈 polyA가 배치되었다. pB-RTP-Tet-GDNF/memClover-FLuc 벡터는 pBase 플라스미드와 함께 형질감염되어 안정적인 게놈 통합을 촉진할 수 있다. 상기 언급된 벡터의 또 다른 예는 pDonor-Teton3g-2a-TagBFP-V5-nls-p2a-puroR WPRE_Insulated mpclover-2a-luc2pest-2a-gdnf wpre를 포함한다.
다른 구현예에서, 적어도 하나의 벡터는 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 발현 카세트, 적어도 하나의 상동 재조합 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 단백질 또는 펩티드는 신경영양 인자를 포함한다. 다른 구현예에서, 신경영양 인자는 신경교 유래 신경영양 인자 (GDNF)를 포함한다. 다른 구현예에서, 구성적 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 (PGK 프로모터)이다. 다른 구현예에서, 상동 재조합 서열은 게놈 세이프 하버를 표적화할 수 있는 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 게놈 세이프 하버는 하기 중 하나이다: 아데노-연관 바이러스 부위 1 (AAVS1), 케모카인 (C-C 모티프) 수용체 5 (CCR5) 유전자, 마우스 Rosa26 유전자좌의 인간 이종상동체. 다른 구현예에서, 유도성 프로모터는 테트라사이클린-계열 항생제에 의해 조절되는 프로모터를 포함한다. 다른 구현예에서, 테트라사이클린-계열 항생제는 독시사이클린을 포함한다. 다른 구현예에서, 유도성 프로모터는 역 테트라사이클린-제어된 전사활성화제 (rtTA) 또는 tet-On 고급 전사활성화제 (rtTA2S-M2)에 의해 조절된다. 다른 구현예에서, iPSC-유래 NPC는 생착 iPSC-유래 NPC이다. 다른 구현예에서, iPSC-유래 NPC는 게놈적으로 통합된 발현 카세트를 발현한다. 다른 구현예에서, 게놈적으로 통합된 발현 카세트는 게놈 세이프 하버에 있다.
또한, iPSC-유래 NPC가 게놈적으로 통합된 발현 카세트를 발현하는, 상기 언급된 방법에 의해 제조된 일정량의 세포가 본원에 기재된다. 예를 들어, 일정량의 iPSC-유래 NPC를 제공하고, 적어도 하나의 벡터를 도입하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된 신경교 유래 신경영양 인자 (GDNF)의 유도성 발현이 가능한 일정량의 iPSC-유래 NPC. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 벡터는 piggyBac 벡터 및 pBase 벡터를 iPSC-유래 NPC에 도입하는 것을 포함하며, 여기서 piggyBac 벡터는 구성적 프로모터, tet 반응 요소를 포함하는 유도성, 양방향 폴리시스트론 프로모터, 및 GDNF를 인코딩하는 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 본원에 제공된 세포는 실질적으로 균질하다.
다양한 구현예에서, 벡터는 적어도 하나의 상동 재조합 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 세포는 하나 이상의 벡터로부터 발현 카세트를 발현한다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 벡터로부터 발현 카세트를 발현하는 세포는 뉴클레오펙션되거나, 트랜스펙션되거나, 또는 전기천공되거나 또는 당업계에 공지된 다른 유전자 전달 기술에 놓인 것이다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 벡터는 piggyBac 벡터, pBase 벡터, 또는 둘 다를 포함한다. 다른 구현예에서, piggyBac 벡터는 적어도 2개의 프로모터를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 프로모터는 유도성이다. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 유도성 프로모터는 폴리시스트론이다. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 유도성, 폴리시스트론 프로모터는 양방향성이다. 다른 구현예에서, 발현 카세트는 게놈적으로 통합된다. 다른 구현예에서, 발현 카세트는 치료적 단백질 또는 펩티드를 인코딩한다. 다른 구현예에서, 치료적 단백질 또는 펩티드는 신경영양 인자를 포함한다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 벡터는 2개의 트랜스포존 요소에 의해 플랭킹된 유전자 발현 카세트를 갖는 벡터를 포함한다. 다양한 구현예에서, 2개의 트랜스포존 요소는 piggyBac 말단 반복부 (PB TR)를 포함한다. 다양한 구현예에서, 벡터는 구성적 프로모터를 포함하고, 이는 CMV/Chick β-액틴 (CAG로 공지됨) 프로모터를 포함한다. 다양한 구현예에서, 벡터는 유도성, 양방향 프로모터를 포함하고, 이는 TRE-Bi 프로모터를 포함한다. 다양한 구현예에서, 구성적 프로모터는 tet 반응 요소에 작동가능하게 연결된다. 다양한 구현예에서, "tet-on" 요소는 예를 들어 rTA를 포함한다. 다른 구현예에서, rTA는 rtTA-V10을 포함한다. 다양한 구현예에서, 구성적 프로모터는, 예를 들어 네오마이신 또는 퓨로마이신을 포함하는 선택 인자에 작동가능하게 연결된다. 다양한 구현예에서, 유도성, 양방향 프로모터는 폴리시스트론이다. 다양한 구현예에서, 유도성 양방향 프로모터는 제1, 제2 또는 제3 또는 그 초과의 시스트론에서 요소에 작동가능하게 연결된다. 다양한 구현예에서, 제1, 제2 또는 제3 또는 그 초과의 시스트론은 이식유전자를 포함한다. 다양한 구현예에서, 이식유전자에는 하나 이상의 전사-후 요소가 뒤따른다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 전사-후 요소는 우드척 간염 바이러스 전사-후 요소 (WPRE)를 포함한다.
다양한 구현예에서, 이식유전자에는 하나 이상의 poly-A 테일이 뒤따른다. 이는, 예를 들어, 토끼 베타-글로빈 polyA를 포함한다. 다양한 구현예에서, 이식유전자는 신경영양 인자이다. 다양한 구현예에서, 신경영양 인자는 신경교 유래 신경영양 인자 (GDNF)를 포함한다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 벡터는 당업계에 공지된 VCre (Vlox 및 유도체), SCre (Slox 및 유도체), Dre (Rox 및 유도체), 및 phiC31 (attb) 또는 다른 재조합효소를 포함하는 재조합효소를 인코딩하는 벡터를 포함한다.
다양한 구현예에서, 벡터는 AAVS1을 포함하는 안전 착지 부위의 표적화를 촉진하는 하나 이상의 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 AAVS1 표적화된 GDNF 발현 작제물을 포함한다. 본원에 제공된 AAVS1 부위는 개방 염색질의 영역에 남아 있고, 여기에 삽입된 작제물은 분화된 세포 자손 (예를 들어, iNPC의 것)에서 발현을 유지하는 데 유용하다.
다양한 요소에서, 유도성 카세트 주위의 하나 이상의 격리자(insulator) 요소는 세포 분화 동안 잠재적인 침묵화를 감쇠시킨다. 다양한 구현예에서, 발현 카세트는 하나 이상의 서브-카세트를 포함하며, 여기서 각각의 서브-카세트는 1) 프로모터 2) 이식유전자 및 3) polyA 전사 정지 요소를 포함한다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 서브-카세트를 포함하는 발현 카세트는 구성적 서브-카세트 및 유도성 서브-카세트를 포함한다. 예를 들어, 구성적 서브-카세트는 rTA 전사활성화제를 발현하는 구성적 프로모터를 포함하고, 유도성 서브-카세트는 GDNF 등의 신경영양 인자를 발현하는 유도성 프로모터 및 임의로 하나 이상의 리포터 단백질을 포함한다.
다양한 구현예에서, 벡터는 적어도 하나의 상동 재조합 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 상동 재조합 서열은 게놈 세이프 하버를 표적화할 수 있는 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 게놈 세이프 하버는 하기 중 하나이다: 아데노-연관 바이러스 부위 1 (AAVS1), 케모카인 (C-C 모티프) 수용체 5 (CCR5) 유전자, 마우스 Rosa26 유전자좌의 인간 이종상동체.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 벡터는 포유동물 발현 벡터를 사용하여 세포에서 하나 이상의 서열의 발현을 구동할 수 있다. 포유동물 발현 벡터의 예는 pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329: 840) 및 pMT2PC (Kaufman, 등, 1987. EMBO J. 6: 187-195)를 포함한다. 포유동물 세포에서 사용시, 발현 벡터의 제어 기능은 전형적으로 하나 이상의 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스, 원숭이 바이러스 40, 및 본원에 개시되고 당업계에 공지된 다른 것들로부터 유래된다. 원핵 및 진핵 세포 둘 다에 대한 다른 적합한 발현 시스템에 대해서는 예를 들어 하기 문헌 참조: Chapters 16 and 17 of Sambrook, 등, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
일부 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 특정 세포 유형에서 우선적으로 외인성 서열의 발현을 지시할 수 있다 (예를 들어, 조직-특이적 조절 요소는, 예를 들어, 본원에 제공된 iPSC 또는 신경 전구 세포에서 핵산을 발현하는 데 사용됨). 조직-특이적 조절 요소는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 뉴런-특이적 프로모터는 하기 문헌에서 논의되어 있다: Byrne 및 Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477). 발달-조절된 프로모터, 예를 들어 뮤린 혹스 프로모터 (Kessel 및 Gruss, 1990. Science 249: 374-379) 및 α-태아단백질 프로모터 (Campes 및 Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546)가 또한 포함된다.
본원에 제공된 벡터를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있고 상기에서 논의되었다. 단지 예로서, 폴리펩티드 발현 (예: 신경영양 인자, GDNF)은 조절가능할 수 있다. 이는 예를 들어 TALEN 및 상동 재조합 접근법에 의해 달성될 수 있다 (예를 들어 도 7 및 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 하기 문헌 참조: Akhtar 등 Inducible Expression of GDNF in Transplanted iPSC-Derived Neural Progenitor Cells. Stem Cell Reports. 2018;10(6):1696-1704. doi:10.1016/j.stemcr.2018.03.024).
일부 구현예에서, 본원에 제공된 핵산 서열은 통합 벡터를 통해 본원에 기재된 세포에 전달된다. 통합 벡터는 숙주 세포 염색체 내로 영구적으로 혼입된 그의 전달된 RNA/DNA를 갖는다. 비-통합 벡터는 에피솜으로 남아 있는데, 이는 그 안에 함유된 핵산이 숙주 세포 염색체로 통합되지 않음을 의미한다. 통합 벡터의 예는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 하이브리드 아데노바이러스 벡터, 및 단순 포진 바이러스 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 핵산 서열은 비-통합 벡터를 통해 본원에 기재된 세포에 전달된다. 비-통합 벡터는 비-통합 바이러스 벡터를 포함한다. 비-통합 바이러스 벡터는, 이들이 이들의 게놈을 숙주 DNA 내로 혼입하지 않기 때문에, 통합 레트로바이러스에 의해 제기되는 주요 위험 중 하나를 제거한다. 일례는 제한된 자가-복제가 가능하고 포유동물 세포에서 기능하는 것으로 공지된 엡스타인 바르(Epstein Barr) oriP/핵 항원(Nuclear Antigen)-1 ("EBNA1") 벡터이다. 엡스타인-바르 바이러스로부터의 두 요소, oriP 및 EBNA1를 함유하는, 바이러스 레플리콘 영역 oriP에 대한 EBNA1 단백질의 결합은 포유동물 세포에서 플라스미드의 비교적 장기간 에피솜 존재를 유지한다. oriP/EBNA1 벡터의 이러한 특정 특징은 이를 통합이 없는 숙주 세포의 생성에 대해 이상적으로 만든다. 다른 비-통합 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 포함한다.
또 다른 비-통합 바이러스 벡터는 RNA 센다이(Sendai) 바이러스 벡터이고, 이는 감염된 세포의 핵에 들어가지 않고도 단백질을 생산할 수 있다. F-결핍 센다이 바이러스 벡터는 몇 번의 패시지(passage) 동안 감염된 세포의 세포질에 남아 있지만, 빠르게 희석되고 여러 패시지 (예: 10회 패시지) 후에 완전히 소실된다. 이는 표적 세포에서의 선택된 이종 유전자 또는 유전자들의 자가-제한 일시적 발현을 허용한다.
비-통합 벡터의 또 다른 예는 미니서클 벡터이다. 미니서클 벡터는 플라스미드 백본(backbone)이 방출되어 발현될 진핵생물 프로모터 및 cDNA(들)만 남겨진 원형화된 벡터이다.
상기에 언급된 바와 같이, 일부 구현예에서, 본원에 제공된 핵산 서열은 바이러스 벡터로부터 세포에서 발현된다. "바이러스 벡터"는 바이러스 기원의 적어도 하나의 요소를 포함하고 바이러스 벡터 입자 내로 패키징되는 능력을 갖는 핵산 벡터 작제물을 포함한다. 바이러스 벡터는 비-필수 바이러스 유전자 대신에 본원에 기재된 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 함유할 수 있다. 벡터 및/또는 입자는 시험관내 또는 생체내에서 핵산을 세포 내로 전달하기 위한 목적으로 활용될 수 있다.
벡터를 세포로 도입하는 방법은, 예를 들어, 뉴클레오펙션, 트랜스펙션, 전기천공 등을 통한 것으로, 당업계에 공지되어 있다. 다른 구현예에서, 적어도 2개의 벡터를 도입하는 방법은 하기 중 하나 이상을 포함한다: 뉴클레오펙션, 트랜스펙션 및 전기천공. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 벡터의 도입은 하기 중 하나 이상을 포함한다: 뉴클레오펙션, 트랜스펙션 및 전기천공. 그러나, 본원에 제공된 핵산 서열 및 벡터는 세포 내로의 핵산의 도입을 용이하게 하는 임의의 트랜스펙션 시약 또는 다른 물리적 수단을 사용하여 전달될 수 있다.
핵산의 비-바이러스 전달 방법은 리포펙션, 뉴클레오펙션, 미세주사, 바이오리스틱스, 바이로솜, 리포솜, 면역리포솜, 폴리양이온 또는 지질: 핵산 접합체, 네이키드(naked) DNA, 인공 비리온 및 DNA의 작용제-강화 흡취(uptake)를 포함한다. 리포펙션은 예를 들어 미국 특허 번호 5,049,386, 4,946,787; 및 4,897,355)에 기재되어 있고 리포펙션 시약은 상업적으로 판매된다 (예: Transfectam™ 및 Lipofectin™). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 Felgner, WO 91/17424; WO 91/16024의 것들을 포함한다. 전달은 세포에 (예: 시험관내 또는 생체외 투여) 또는 표적 세포에 (예: 생체내 투여) 대해 이루어질 수 있다.
면역지질 복합체와 같은 표적화된 리포솜을 포함하는 지질: 핵산 복합체의 제조는 당업자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, 하기 문헌 참조: Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese 등, Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr 등, Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy 등, Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao 등, Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad 등, Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); 미국 특허 번호 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 및 4,946,787).
본원에 제공된 요망되는 작제물 및/또는 벡터를 발현하는 클론은 리포터 폴리펩티드 발현 (예: GFP 또는 형광 태그)을 기반으로 선택될 수 있고, AAVS1 부위로의 통합은 핵산 시퀀싱을 통해 확인될 수 있다. 당업계에 공지된 방법에 의해 최종 벡터를 변형시켜 리포터 폴리펩티드 서열 또는 태그를 제거할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 리포터 폴리펩티드 서열을 배제한다. 일부 구현예에서, 대상체 내로 생착될 iNPC는 형광 태그를 발현하지 않는다.
iNPC
본원에 제공된 작제물을 발현하는 본원에 제공된 유도-만능 줄기 세포 (iPSC)는 당업계에 공지된 방법에 의해 분화, 확장, 및 세포 뱅킹에 대해 선택될 수 있다. iNPC는 상기에 기재된 상기 언급된 방법에 의해 iPSC를 배양함으로써 생성되고 iNPC 마커에 대해 평가될 것이다. 신경 전구 세포 마커의 비-제한적 예는 하기를 포함한다: 네스틴, VIM, TUBB3, MAP2, APQ4, S100β, SC121, ChAT, BCL11B, SATB2, 아넥신 V, 및 GFAP. 본원에 제공된 iNPC는 또한 성상세포를 확립하고 생성하는 능력을 가질 것이다. 성상세포에 대한 마커의 비-제한적 예는 GFAP, EAAT1/GLAST, EAAT2/GLT-1, 글루타민 합성효소, S100β, 및 ALDH1L1을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 iNPC는 신경 전구 세포의 적어도 하나의 표현형 특징을 갖는다. iNPC의 특성화는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 확립된 NPC 유전자 또는 마커에 대한 qPCR, 플레이트-다운, 면역세포화학 (ICC), 웨스턴 블롯팅, 현미경검사, 및 기능 분석 (예: 대사 검정 또는 전기생리학적 검정)에 의해 수행될 수 있다. GDNF에 대한 ICC 및 ELISA를 사용하여 GDNF 생산의 시험관내 수준 및 테트라사이클린 조절의 역학을 특성화할 수 있다.
다양한 구현예에서, iPSC-유래 NPC는 세포 라인으로서 연속 패시징할 수 있다.
다른 구현예에서, iPSC-유래 NPC (iNPC)는 응집할 수 있다. 다른 구현예에서, iNPC는 복수의 신경구로서 응집된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "신경구"는 적어도 하나의 신경 세포 마커를 발현하는 복수의 세포의 응집체를 지칭한다. 본원에 제공된 iNPC는 피질 신경 전구세포의 마커 뿐만 아니라 성숙 성상세포 및 미성숙 성상세포 둘 다와 관련된 유전자를 발현한다. 본원에 제공된 iNPC는 구 또는 응집체로서 확장되고/거나, 배양에서 사상위족(filopodia)을 발달시키고/거나, 신경 전구세포 마커 (예: 네스틴)를 발현하고/거나, 성상세포로 분화될 수 있다.
다른 구현예에서, iPSC-유래 NPC는 대상체에서의 조직 내로 생착된다. 다른 구현예에서, iNPC 신경구는 대상체 내로 생착된다.
생착을 위한 세포 조성물
본원에 제공된 바와 같은 대상체에 대한 인간 iNPC의 투여 방법은 이러한 세포를 포함하는 치료적 조성물의 사용을 포함한다. 치료적 조성물은 세포 조성물과 함께 생리학적으로 용인가능한 담체 및 임의로 적어도 하나의 추가의 생물활성제, 폴리펩티드(들), 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산(들), 또는 본원에 기재된 바와 같은 인자(들)를 활성 성분으로서 그 안에 용해된 또는 분산된 상태로 함유한다.
다양한 구현예에서, 치료적 조성물은 요망되는 경우가 아니면 치료 목적으로 포유동물 또는 인간 환자에게 투여될 때 실질적으로 면역원성이 아니다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "제약학적으로 허용가능한", "생리학적으로 용인가능한" 및 그의 문법적 변형은, 이들이 조성물, 담체, 희석제 및 시약을 언급할 때, 상호교환적으로 사용되며, 메스꺼움, 현기증, 위장 장애, 이식 거부, 알레르기 반응 등과 같은 바람직하지 않은 생리학적 효과의 생산 없이, 물질이 포유동물 상에 또는 그에 투여 가능함을 나타낸다. 제약학적으로 허용가능한 담체는 요망되는 경우가 아니면 혼합되는 작용제에 대한 면역 반응의 상승을 촉진하지 않을 것이다. 그 안에 용해된 또는 분산된 활성 성분을 함유하는 조성물의 제조는 당업계에서 잘 이해되며, 제형을 기반으로 하여 제한될 필요는 없다. 전형적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능하게 제조되지만, 사용 전에 액체 중의 용해 또는 현탁에 적합한 고체 형태가 제조될 수도 있다.
인간을 위한 이식 조성물은 부형제로서 하나 이상의 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 물질을 포함할 수 있다. 반면, 세포 배양 조성물 (인간 이식을 위한 것이 아님)은 전형적으로 부형제로서 세포 배양 배지와 같은 연구 시약을 사용할 것이다. iNPC는 또한 FDA-승인 매트릭스/스캐폴드 중에서 또는 특정 질환 또는 병태에 적합한 FDA-승인 약물 (예: 릴루졸 (Sanofi-Aventis, LLC®에 의해 제조된 Rilutek®) 또는 에다라본 (Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation®에 의해 제조된 Radicava®))과 조합되어 투여될 수 있다.
생리학적으로 용인가능한 담체는 당업계에 널리 공지되어 있다. 예시적 액체 담체는 활성 성분 및 물 이외의 물질을 함유하지 않거나 생리학적 pH 값의 인산나트륨과 같은 완충제, 생리 식염수 또는 둘 다, 예컨대 인산염-완충 식염수를 함유하는 멸균 수용액이다. 또한, 수성 담체는 염화나트륨 및 염화칼륨, 덱스트로스, 폴리에틸렌 글리콜 및 기타 용질과 같은 염 뿐만 아니라 하나 초과의 완충 염을 함유할 수 있다. 액체 조성물은 또한 물에 추가로, 또한 물을 제외하고 액체 상을 함유할 수 있다. 이러한 추가의 액체 상의 예는 글리세린, 면실유와 같은 식물성 오일, 및 물-오일 에멀젼이다. 특정 장애 또는 병태의 치료에 효과적인 본원에 기재된 바와 같은 세포 조성물에 사용되는 활성 화합물의 양은 장애 또는 병태의 성질에 의존할 것이고, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이식" 또는 "생착"은, 요망되는 효과(들)가 생산되도록, 요망되는 부위, 예컨대 손상 또는 복구 부위에서의 도입된 세포의 적어도 부분적 국소화를 제공하는 방법 또는 경로에 의한, 본원에 제공된 바와 같은 세포, 예를 들어 iNPC 또는 신경구의 대상체 내로의 배치의 맥락으로 사용된다. 세포, 예를 들어 iNPC, 또는 이들의 분화된 자손 (예: 성상세포 등)은 척수 또는 뇌에 직접 임플란트될 수 있거나, 대안적으로 임플란트된 세포의 적어도 일부 또는 세포의 구성요소가 생존가능하게 남아 있는 대상체의 요망되는 위치로의 전달을 제공하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 대상체에게 투여 후 세포의 생존가능 기간은 짧게는 몇 시간, 예를 들어 24시간 내지 몇 일, 길게는 수 년, 즉 장기간 생착일 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 척수가 급성 손상 또는 세포 사망을 포함하는 질환으로부터 치유될 수 있을 정도로 성체 신경 전구세포가 증식하지 않음에 따라 iNPC의 장기간 생착이 요망된다. 다른 구현예에서, 세포는 복강내 또는 정맥내 경로와 같은 간접적 전신 투여 경로를 통해 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "투여", "도입" 및 "이식"은, 요망되는 효과(들)가 생산되도록, 요망되는 부위, 예컨대 손상 또는 복구 또는 질환 부위에서의 도입된 세포의 적어도 부분적 국소화를 제공하는 방법 또는 경로에 의한, 본원에 기재된 바와 같은 세포, 예를 들어 iNPC의 대상체 내로의 배치의 맥락으로 상호교환적으로 사용된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 투여되는 iNPC 또는 그의 자손은 동종이계 세포 또는 하나 이상의 공여자로부터 얻어진 그의 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "동종이계"는, 하나 이상의 유전자좌의 유전자가 동일하지 않은, 동일한 종의 하나 이상의 상이한 공여자로부터 얻어진 또는 그로부터 유래된 (예를 들어, 그로부터 분화된) 세포를 지칭한다. 예를 들어, 대상체에게 투여되는 NPC는 한 명 이상의 혈연이 없는 공여자 대상체 또는 한 명 이상의 비-동일 형제자매로부터 얻어진 제대혈로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전적으로 동일한 동물 또는 일란성 쌍생아로부터 얻어진 것들과 같은 동계 세포 집단이 사용될 수 있다. 이 측면의 다른 구현예에서, 세포는 자가 세포이고; 즉, 세포는 대상체로부터 얻거나 단리되고 (또는 그로부터 유래되고) 동일한 대상체에게 투여되며, 즉, 공여자와 수용자가 동일하다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물에 유용한 세포는 자가 공급원으로부터 유래된다. 본원에서 제공되는 iNPC (또는 이들의 분화된 자손)는 본질적으로 자가 공급원으로부터 유래되기 때문에, 또 다른 대상체 또는 대상체 그룹으로부터의 세포를 사용하는 것과 비교하여 생착 거부 또는 알레르기 반응의 위험이 감소된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 생착에 유용한 세포는 비-자가 공급원으로부터 유래된다. 추가로, iPSC의 사용은 배아 공급원으로부터 얻어진 세포의 필요성을 무효화한다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에서의 사용을 위한 iNPC를 생성하는 데 사용되는 줄기 세포는 배아 줄기 세포가 아니다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에서의 사용을 위한 iNPC는 GDNF-발현 iNPC이다.
질환의 치료 방법
일정량의 iPSC-유래 NPC (iNPC)를 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 세포는 치료적 단백질 또는 펩티드를 발현하고, 추가로 여기서 세포, 치료적 단백질 또는 펩티드, 또는 둘 다는 질환 또는 병태를 치료할 수 있는 것인, 치료 방법이 본원에 기재된다. 다른 구현예에서, 세포는 iPSC-유래 NPC이다. 다른 구현예에서, 세포는 GDNF-발현 iNPC이다.
일정량의 iPSC-유래 NPC를 신경퇴행성 질환을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 세포는 질환을 치료할 수 있는 신경영양 인자를 유도가능하게 발현하는 것인, 치료 방법이 본원에 기재된다. 다른 구현예에서, iPSC-유래 NPC는 뉴클레오펙션에 의해 도입된 게놈적으로 통합된 발현 카세트를 발현하고, 발현 카세트는 구성적 프로모터, tet 반응 요소를 포함하는 유도성, 양방향 폴리시스트론 프로모터, 및 신경교 유래 신경영양 인자 (GDNF)를 인코딩하는 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 벡터는 적어도 하나의 상동 재조합 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 방법은 테트라사이클린, 그의 유사체 또는 유도체의 투여를 포함한다. 다른 구현예에서, 벡터는 폴리펩티드 리포터 서열을 배제한다. 다른 구현예에서, 벡터는 녹색 형광 단백질 (GFP) 서열을 배제한다.
일정량의 세포를 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 세포는 치료적 단백질 또는 펩티드를 발현하고, 추가로 여기서 세포, 치료적 단백질 또는 펩티드, 또는 둘 다는 질환 또는 병태를 치료할 수 있는 것인, 치료 방법이 본원에 기재된다. 상기 언급된 방법 구현예 각각 및 모두에서, 세포는 iPSC-유래 NPC이다. 상기 언급된 방법 구현예 각각 및 모두에서, 세포는 하나 이상의 벡터로부터 발현 카세트를 발현한다. 상기 언급된 방법 구현예 각각 및 모두에서, 하나 이상의 벡터로부터 발현 카세트를 발현하는 세포는 뉴클레오펙션되거나, 트랜스펙션되거나, 또는 전기천공된 것이다. 상기 언급된 방법 구현예 각각 및 모두에서, 하나 이상의 벡터는 piggyBac 벡터, pBase 벡터, 또는 둘 다를 포함한다. 상기 언급된 방법 구현예 각각 및 모두에서, piggyBac 벡터는 적어도 2개의 프로모터를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 프로모터는 유도성이다. 상기 언급된 방법 구현예 각각 및 모두에서, 적어도 하나의 유도성 프로모터는 폴리시스트론이다. 상기 언급된 방법 구현예 각각 및 모두에서, 적어도 하나의 유도성, 폴리시스트론 프로모터는 양방향성이다. 상기 언급된 방법 구현예 각각 및 모두에서, 발현 카세트는 게놈적으로 통합된다. 상기 언급된 방법 구현예 각각 및 모두에서, 발현 카세트는 치료적 단백질 또는 펩티드를 인코딩한다. 상기 언급된 방법 구현예 각각 및 모두에서, 치료적 단백질 또는 펩티드는 신경영양 인자를 포함한다. 상기 언급된 방법 구현예 각각 및 모두에서, 신경영양 인자는 신경교 유래 신경영양 인자 (GDNF)를 포함한다. 상기 언급된 방법 구현예 각각 및 모두에서, 질환 또는 병태는 신경퇴행성 질환이다. 상기 언급된 방법 구현예 각각 및 모두에서, 신경퇴행성 질환은 근위축성 측삭 경화증 (ALS)이다. 상기 언급된 방법 구현예 각각 및 모두에서, 일정량의 세포의 투여는 주사을 포함한다. 상기 언급된 방법 구현예 각각 및 모두에서, 방법은 테트라사이클린, 그의 유사체 또는 유도체의 투여를 포함한다.
또한, 일정량의 iPSC-유래 NPC를 신경퇴행성 질환을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 세포는 질환을 치료할 수 있는 신경영양 인자를 유도가능하게 발현하는 것인, 치료 방법이 본원에 기재된다. 상기 언급된 방법 구현예 각각 및 모두에서, iPSC-유래 NPC는 뉴클레오펙션에 의해 도입된 게놈적으로 통합된 발현 카세트를 발현하고, 발현 카세트는 구성적 프로모터, tet 반응 요소를 포함하는 유도성, 양방향 폴리시스트론 프로모터, 및 신경교 유래 신경영양 인자 (GDNF)를 인코딩하는 서열을 포함한다. 상기 언급된 방법 구현예 각각 및 모두에서, 방법은 테트라사이클린, 그의 유사체 또는 유도체의 투여를 포함한다.
측정된 또는 측정가능 파라미터는 질환의 임상적으로 검출가능한 마커, 예를 들어, 임상 또는 생물학적 마커의 상승 또는 하강된 수준, 뿐만 아니라 질환 또는 장애에 대한 증상 또는 마커의 임상적으로 허용되는 스케일과 관련된 파라미터를 포함한다. 그러나, 본원에 개시된 바와 같은 조성물 및 제형의 전체적 사용은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 것임이 이해될 것이다. 필요한 정확한 양은 치료되는 질환의 유형과 같은 인자에 따라 달라질 것이다.
iNPC를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환, 장애, 척수 손상, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 또는 감염의 치료 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 예상되는 장애, 예를 들어 ALS의 방지를 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다.
측정된 또는 측정가능 파라미터는 질환의 임상적으로 검출가능한 마커, 예를 들어, 임상 또는 생물학적 마커의 상승 또는 하강된 수준, 뿐만 아니라 질환 또는 장애에 대한 증상 또는 마커의 임상적으로 허용되는 스케일과 관련된 파라미터를 포함한다. 그러나, 본원에 개시된 바와 같은 조성물 및 제형의 전체적 사용은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 것임이 이해될 것이다. 필요한 정확한 양은 치료되는 질환의 유형과 같은 인자에 따라 달라질 것이다.
용어 "유효량"은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 손상, 질환, 또는 장애를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 질환 또는 장애의 적어도 하나 이상의 증상을 완화시키기 위해 필요한 iNPC의 집단의 양을 지칭한다. "유효량"은 요망되는 효과, 예를 들어, 신경퇴행성 손상 후 운동 뉴런의 보호, 신경 전구 세포 집단의 대체 등을 제공하기에 충분한 조성물의 양에 관한 것이다. 따라서, 용어 "치료 유효량"은 신경퇴행성 질환 또는 장애를 갖는, 또는 이에 대한 위험이 있는 대상체와 같은 전형적인 대상체에게 투여될 때 특정 효과를 촉진하기에 충분한 iNPC 또는 이러한 세포의 조성물의 양을 지칭한다. 유효량은 또한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 질환의 증상의 발달을 방지하거나 지연시키거나, 질환의 증상의 경과를 변경 (예를 들어, 질환의 증상의 진행을 늦추는 것이지만, 이에 제한되지는 않음)시키거나, 또는 질환의 증상을 역전시키기에 충분한 양을 포함한다. 임의의 주어진 경우에 대해 적절한 "유효량"은 일상적인 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있음이 이해된다.
일부 구현예에서, 대상체는 본원에 기재된 방법에 따라 세포를 투여하기 전에 뇌, 척수, 또는 뉴런에 영향을 미치는 질환 또는 장애를 갖는 것으로 먼저 진단된다. 일부 구현예에서, 대상체는 세포를 투여하기 전에 질환 (예: ALS) 또는 장애가 발병할 위험이 있는 것으로 먼저 진단된다.
본원에 기재된 다양한 측면에서의 사용을 위해, iNPC의 유효량은 적어도 1 X 103, 적어도 1 X 104, 적어도 1 X 105 ,적어도 5 X 105, 적어도 1 X 106, 적어도 2 X 106, 적어도 3 X 106, 적어도 4 X 106, 적어도 5 X 106, 적어도 6 X 106, 적어도 7 X 106, 적어도 8 X 106, 적어도 9 X 106, 적어도 1 X 107, 적어도 1.1 X 107, 적어도 1.2 X 107, 적어도 1.3 X 107, 적어도 1.4 X 107, 적어도 1.5 X 107, 적어도 1.6 X 107, 적어도 1.7 X 107, 적어도 1.8 X 107, 적어도 1.9 X 107, 적어도 2 X 107, 적어도 3 X 107, 적어도 4 X 107, 적어도 5 X 107, 적어도 6 X 107, 적어도 7 X 107, 적어도 8 X 107, 적어도 9 X 107, 적어도 1 X 108, 적어도 2 X 108, 적어도 5 X 108, 적어도 7 X 108, 적어도 1 X 109, 적어도 2 X 109, 적어도 3 X 109, 적어도 4 X 109, 적어도 5 X 109개 또는 그 초과의 iNPC를 포함한다. iNPC의 유효량은 생착 부위의 크기 및 면적에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 시신경 내로의 iNPC의 생착을 위해, 약 1000 내지 10,000개의 iNPC가 사용될 수 있다. 반면, 척수 내로의 iNPC의 생착은 약 1 X 106 내지 약 5 X 109개 또는 그 초과의 iNPC 정도의 더 많은 세포를 필요로 할 수 있다. 숙련된 의사는 주어진 생착 절차에 필요한 세포의 수를 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, iNPC를 포함하는 조성물은 본원에 제공된 벡터 중 임의의 하나 이상으로 처리되고, 이러한 세포가 단독으로 투여될 때의 생착보다 적어도 20% 더 큰 효율로 표적 조직 (예: 척수)에서 운동 뉴런의 보호를 허용하고; 다른 구현예에서, 이러한 효율은, 본원에 제공된 벡터 (예: GDNF를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터) 없이 iNPC가 단독으로 투여될 때의 생착의 효율보다 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 100배 또는 그 초과이다.
일부 구현예에서, iNPC를 포함하는 조성물은 본원에 제공된 벡터 중 임의의 하나 이상으로 처리되고, 이러한 세포가 단독으로 투여될 때의 생착보다 적어도 20% 더 큰 효율로 표적 조직 (예: 척수)에서 세포의 생착을 허용하고; 다른 구현예에서, 이러한 효율은, 본원에 제공된 벡터 (예: GDNF를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터) 없이 iNPC가 단독으로 투여될 때의 생착의 효율보다 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 100배 또는 그 초과이다.
일부 구현예에서, 유효량의 iNPC는 척수내 투여 또는 전달에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 유효량의 iNPC는 정맥내 투여와 같은 전신 투여에 의해 대상체에게 투여된다.
어구 "전신 투여", "전신적으로 투여되는", "말초 투여" 및 "말초적으로 투여되는"은, 표적 부위, 조직, 또는 기관 내로의 직접 투여가 아닌, 대신 대상체의 순환계로 도입되도록 하는 iNPC 집단의 투여를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
제형의 선택은 사용된 특정 조성물 및 투여될 iNPC의 수에 따라 달라질 것이며; 이러한 제형은 숙련된 의사에 의해 조정될 수 있다. 그러나, 예로서, 조성물이 제약학적으로 허용가능한 담체 중의 iNPC인 경우, 조성물은 용액 mL 당 세포의 유효 농도의 적절한 완충액 (예: 식염수 완충액) 중의 세포 현탁액일 수 있다. 제형은 또한 세포 영양소, 단순 당 (예: 삼투압 조절용) 또는 세포의 생존력을 유지하기 위한 기타 성분을 포함할 수 있다. 대안적으로, 제형은 생분해성 스캐폴드와 같은 스캐폴드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체의 치료를 보조하기 위한 추가의 작용제가 기재된 바와 같은 iNPC로의 치료 전 또는 후에 투여될 수 있다. 이러한 추가의 작용제는 전구 세포의 투여를 위한 표적 조직을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 추가의 작용제는 투여된 세포의 척수 또는 다른 요망되는 투여 부위 내로의 생착 및 성장을 지지하도록 iNPC 후에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 작용제는 FGF, EGF, 또는 LIF 등의 성장 인자를 포함한다.
치료의 효능은 숙련된 임상의에 의해 결정될 수 있다. 그러나, 임의의 하나의 또는 모든 증상, 또는 질환, 예를 들어, 신경퇴행성 질환, ALS, 척수 손상 및/또는 장애의 다른 임상적으로 허용되는 증상 또는 마커가, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 인간 iNPC를 포함하는 조성물로의 치료 후 적어도 10%만큼 감소되는 경우, 치료가 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "효과적 치료"인 것으로 고려된다. 이들 지표를 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고/있거나 본원에 기재되어 있다.
신경퇴행성 질환 또는 장애, 또는 신경학적 손상의 지표는 기능적 지표 또는 파라미터, 예를 들어, 특히, 근육 약화, 조정력 문제, 근육 경직, 근육 손실, 근육 경련, 또는 과민성 반사, 피로 또는 실신감, 언어 장애 또는 성대 경련, 삼키기 어려움, 침흘림, 자제력 부족, 경미한 인지 장애, 심한 변비, 의도하지 않은 심한 체중 감소, 숨가쁨, 또는 팔다리/사지 (예: 발 또는 팔) 들기 어려움을 포함한다.
신경학적 기능 파라미터를 평가하는 데 사용될 수 있는 임상 시험의 비-제한적 예는 하기를 포함한다: 근전도 (EMG), MRI, 신경 전도 연구, 혈액 시험, 척수 천자, 또는 근육 생검.
필수적이거나 요망되는 경우, 손상 또는 질환의 동물 모델을 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 특정 조성물의 효과를 판단할 수 있다. 예를 들어, ALS의 유전적 설치류 모델인, 작업 예 및 예를 들어 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Gurney ME 등 Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science 1994; 264: 1772 - 1775]에 상세히 기재된 SOD1G93A.
일부 선택된 정의:
당업자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가인 많은 방법 및 물질을 인식할 것이다. 실로, 본 발명은 어떠한 방식으로도 기재된 방법 및 물질로 제한되지 않는다.
편의상, 명세서, 실시예, 및 첨부된 특허범위에서 사용되는 일부 용어 및 어구의 의미를 하기에 제공한다. 달리 언급되거나 문맥으로부터 암시되지 않는 한, 하기 용어 및 어구는 하기에 제공된 의미를 포함한다. 정의는 특정 구현예의 설명을 보조하기 위해 제공되며, 청구된 기술을 제한하려는 의도가 아니고, 이는 기술의 범위가 청구범위에 의해서만 제한되기 때문이다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 이 기술이 속하는 당업계의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 당업계에서의 용어의 사용과 본원에 제공된 그의 정의 사이에 명백한 불일치가 있는 경우, 명세서 내에 제공된 정의가 우선한다.
생물학 및 분자 생물학에서의 통상적 용어의 정의는, 그의 내용이 모두 전체적으로 본원에 참조로 포함되는 하기 문헌들에서 찾아볼 수 있다: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter 등 (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); 및 Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis 등, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; 및 Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737).
본원에서 인용된 모든 참조문헌은 완전히 설명된 것처럼 그 전체가 참조로 포함된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 이 기술이 속하는 당업계의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 하기 문헌은 본 출원에서 사용되는 많은 용어에 대한 일반적인 지침을 당업자에게 제공한다: Singleton 등, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3 rd ed., Revised, J. Wiley & Sons (New York, NY 2006); 및 Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4 th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012).
당업자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가인 많은 방법 및 물질을 인식할 것이다. 실로, 본 발명은 어떠한 방식으로도 기재된 방법 및 물질로 제한되지 않는다.
용어 "제어 요소"는, 수용 세포에서 코딩 서열의 복제, 전사 및 번역을 총괄적으로 제공하는, 프로모터 영역, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, 상류 조절 도메인, 복제 기점, 내부 리보솜 진입 부위 ("IRES"), 인핸서 등을 총괄적으로 지칭한다. 선택된 코딩 서열이 적절한 숙주 세포에서 복제, 전사 및 번역될 수 있는 한, 이들 제어 요소 모두가 항상 존재할 필요는 없다.
용어 "프로모터 영역"은 DNA 조절 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 영역을 지칭하기 위해 그의 통상적인 의미로 본원에서 사용되며, 여기서 조절 서열은 RNA 폴리머라제에 결합하고 하류 (3'-방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 유전자로부터 유래된다.
"작동가능하게 연결된"은 그와 같이 기재된 구성요소가 그의 통상적 기능을 수행하도록 구성된 요소의 배열을 지칭한다. 따라서, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제어 요소는 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 제어 요소는, 이들이 그의 발현을 지시하도록 기능하는 한, 코딩 서열과 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 번역되지 않았지만 전사된 개재 서열이 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 고려될 수 있다.
본원에 제공된 인코딩 서열, 프로모터 및 기타 유전 요소의 맥락에서, 용어 "이종"은 요소가 비교되는 엔티티(entity)의 나머지 부분의 것과 유전형적으로 구별되는 엔티티로부터 유래됨을 나타낸다. 예를 들어, 유전자 공학 기술에 의해 본원에 제공된 세포로 도입된 프로모터 또는 유전자는 이종 폴리뉴클레오티드라고 한다. "내인성" 유전 요소는, 다른 요소가 이웃하는 위치로 인위적으로 도입될 수는 있지만, 자연에서 발생하는 염색체의 동일한 위치에 있는 요소이다.
용어 "환자", "대상체" 및 "개인"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 예방적 치료를 포함하는 치료가 제공되는 동물, 특히 인간을 지칭한다. 용어 "대상체"는 본원에서 사용되는 바와 같이 인간 및 비-인간 동물을 지칭한다. 용어 "비-인간 동물" 및 "비-인간 포유동물"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물, 예컨대 비-인간 영장류 (특히 고등 영장류), 양, 개, 설치류 (예: 마우스 또는 래트), 기니피그, 염소, 돼지, 고양이, 토끼, 소, 및 비-포유동물, 예컨대 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 임의의 측면의 하나의 구현예에서, 대상체는 인간이다. 임의의 측면의 또 다른 구현예에서, 대상체는 실험 동물 또는 질환 모델로서의 동물 대체물이다. 임의의 측면의 또 다른 구현예에서, 대상체는 반려 동물 (예: 개, 고양이, 래트, 기니피그, 햄스터 등)을 포함하는 가축이다. 대상체는 이전에 질환에 대한 치료를 받은 적이 있을 수 있거나, 질환에 대한 치료를 받은 적이 없다. 대상체는 이전에 질환을 갖는 것으로 진단된 적이 있을 수 있거나, 질환을 갖는 것으로 진단된 적이 없다.
용어 "마커"는 본원에서 사용되는 바와 같이 세포의 특징 및/또는 표현형을 기재하기 위해 사용된다. 마커는 관심 특징을 포함하는 세포의 선택을 위해 사용될 수 있으며 특정 세포에 따라 다를 수 있다. 마커는 특정 세포 유형의 세포, 또는 세포 유형에 의해 발현되는 분자의 형태학적, 구조적, 기능적 또는 생화학적 (효소적) 특징 여부에 관계 없이 특징이다. 하나의 측면에서, 이러한 마커는 단백질이다. 이러한 단백질은 항체 또는 당업계에서 이용가능한 다른 결합 분자에 대한 에피토프를 소유할 수 있다. 그러나, 마커는 단백질 (펩티드 및 폴리펩티드), 지질, 다당류, 핵산 및 스테로이드를 포함하나 이에 제한되지는 않는 세포 내 또는 세포 상에서 나타나는 임의의 분자로 이루어질 수 있다. 형태학적 특징 또는 속성의 예는 형상, 크기, 및 핵 대 세포질 비율을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 기능적 특징 또는 속성의 예는 특정 기질에 부착하는 능력, 특정 염료를 혼입하거나 배제하는 능력, 및 특정 계통을 따라 분화하는 능력을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 마커는 당업자에게 이용가능한 임의의 방법에 의해 검출될 수 있다. 마커는 또한 형태학적 특징의 부재 또는 단백질, 지질 등의 부재일 수 있다. 마커는 폴리펩티드의 존재 및/또는 부재 및 기타 형태학적 또는 구조적 특징의 고유한 특징 패널의 조합일 수 있다. 하나의 구현예에서, 마커는 세포 표면 마커이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "스캐폴드"는 세포의 부착 및 증식에 적합한 표면을 제공하는 생체적합성 물질을 포함하는 구조를 지칭한다. 스캐폴드는 기계적 안정성 및 지지를 추가로 제공할 수 있다. 스캐폴드는 증식하는 세포 집단에 의해 가정되는 3차원 형상 또는 형태에 영향을 미치거나 이를 제한하기 위해 특정 형상 또는 형태로 존재할 수 있다. 이러한 형상 또는 형태는 필름 (예: 3차원보다 실질적으로 더 큰 2차원을 갖는 형태), 리본, 코드, 시트, 플랫 디스크, 실린더, 구, 3차원 비정질 형상 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
어구 "제약학적으로 허용가능한"은, 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 합리적인 이점/위험 비율에 상응하는, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
용어 "저감", "감소된", "감소" 또는 "억제"는 모두 통계적으로 유의한 양만큼의 특성, 수준, 또는 기타 파라미터의 저감 또는 저하를 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 일부 구현예에서, "감소하다", "감소" 또는 "저감" 또는 "억제"는 전형적으로 참조 수준 (예를 들어, 주어진 치료의 부재 하에)과 비교하여 적어도 10%만큼의 저감을 의미하고, 예를 들어, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 그 초과만큼의 저감을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "감소" 또는 "억제"는 참조 수준과 비교하여 완전한 억제 또는 감소를 포함하지 않는다. "완전한 억제"는 참조 수준과 비교하여 100% 억제이다. 저감은 바람직하게는 주어진 장애가 없는 개인에 대한 정상 범위 이내와 같은 허용되는 수준까지 낮아질 수 있다.
용어 "증가된", "증가", "증가하다", 또는 "향상" 또는 "활성화"는 모두 통계적으로 유의한 양만큼의 특성, 수준, 또는 기타 파라미터의 증가를 일반적으로 의미하기 위해 본원에서 사용되며; 의심의 여지를 없애기 위해, 용어 "증가된", "증가" 또는 "향상" 또는 "활성화"는 참조 수준과 비교하여 적어도 10%의 증가, 예를 들어 참조 수준과 비교하여 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 최대 100% (100% 포함) 증가 또는 10-100% 사이의 임의의 증가, 또는 참조 수준과 비교하여 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가, 적어도 약 20배 증가, 적어도 약 50배 증가, 적어도 약 100배 증가, 적어도 약 1000배 증가 또는 그 초과를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변조"는, 이들 용어가 본원에 정의된 바와 같이 주어진 파라미터를 증가 또는 저감시키는 것을 포함하는 효과를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "참조 수준"은 정상적인, 다른 경우에는 영향받지 않은 세포 집단 또는 조직 (예: 건강한 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플, 또는 이전 시점에 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플, 예를 들어 질환을 갖는 것으로 진단되기 전에 환자로부터 얻어진 생물학적 샘플, 또는 본원에 개시된 바와 같은 조성물, 폴리펩티드, 또는 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산과 접촉된 적이 없는 생물학적 샘플)을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "적절한 대조군"은 처리되지 않은, 다른 경우에는 동일한 세포 또는 집단 (예: 본원에 기재된 작용제 또는 조성물에 의해 접촉되지 않았거나, 비-대조 세포와 비교하여, 동일한 방식으로 접촉되지 않았던, 예를 들어 상이한 지속기간 동안 접촉되었던 생물학적 샘플을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 시험관내 분화된 세포 (예: iNPC) 또는 시험관내-분화된 세포의 배양에 적용되는 용어 "표현형 특징"은, 세포 기능의 척도로서 본원에 기재된 임의의 파라미터를 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같은 "표현형 특징의 변화"는 참조 수준 또는 적절한 대조군에 대한 기능적 특성의 통계적으로 유의한 증가 또는 저감에 의해 표시된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는"은, 제시된 정의된 요소에 추가로 다른 요소가 또한 존재할 수 있음을 의미한다. "포함하는"의 사용은 제한이 아니라 포함을 나타낸다.
용어 "이루어진"은, 구현예의 설명에서 언급되지 않은 임의의 요소를 제외한, 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 방법, 및 이들의 각각의 구성요소를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "본질적으로 이루어진"은 주어진 구현예에 대해 요구되는 요소들을 지칭한다. 용어는 기술의 해당 구현예의 기본적이고 신규한 또는 기능적 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가의 요소의 존재를 허용한다.
단어 "또는"은, 문맥이 명백하게 달리 표시하지 않는 한, "및"을 포함하도록 의도된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 특정 구현예를 설명하고 청구하는 데 사용되는 성분의 양, 농도, 반응 조건 등과 같은 특성을 표현하는 숫자는 일부 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 서면 설명 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 파라미터는 특정 구현예에 의해 얻고자 하는 요망되는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 일부 구현예에서, 수치 파라미터는 보고된 유효 숫자의 수에 비추어, 또한 통상적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다. 본 발명의 일부 구현예의 광범위한 범위를 기재하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 구체적 예에 기재된 수치는 가능한 한 정확하게 보고된다. 본 발명의 일부 구현예에 제공된 수치는 그의 각각의 시험 측정에서 나타난 표준 편차로부터 필수적으로 발생하는 특정 오류를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 본 발명의 특정 구현예를 설명하는 맥락에서 (특히 하기 청구범위의 특정 맥락에서) 사용되는 유사한 참조는 단수 및 복수 둘 다를 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 본원에서 값의 범위를 언급하는 것은, 단지, 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하는 속기 방법으로서 역할을 하도록 의도된다. 본원에 달리 표시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 본원에서 개별적으로 언급된 것처럼 명세서에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법은, 본원에 달리 표시되지 않는 한 또는 달리 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 특정 구현예와 관련하여 제공된 임의의 모든 예, 또는 예시적 언어 (예: "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하도록 의도되며 달리 청구된 본 발명의 범위에 대한 제한을 부여하지 않는다. 명세서의 어떠한 언어도 본 발명의 실행에 필수적인 임의의 비-청구 요소를 나타내는 것으로 해석되어선 안 된다.
본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 약어 "예(e.g.)"는 라틴어 "Exempli gratia"로부터 유래된 것으로, 본원에서 비-제한적 예를 나타내기 위해 사용된다. 따라서 약어 "예"는 용어 "예를 들어"와 동의어이다.
본원에 기재된 다양한 측면의 예시적 구현예는 하기와 같이 정의될 수 있다:
구현예 1: (i) 일정량의 줄기 세포를 제공하고; (ii) RHO 키나제 억제제 (ROCK 억제제)의 존재 하에 줄기 세포를 배양하고; (iii) 세포의 단층을 생성하고; (iv) LDN 및 SB 중 하나 이상의 존재 하에 세포를 배양하고; (v) FGF, EGF 및 LIF 중 하나 이상의 존재 하에 세포를 배양하여 신경 전구 세포 (NPC)를 생성하는 것을 포함하는, 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 신경 전구 세포 (iNPC)의 생성 방법.
구현예 2: 줄기 세포가 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)인, 구현예 1의 방법.
구현예 3: NPC가 유도 만능 줄기 세포 유래 NPC (iNPC)인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 4: 단층의 생성이 배양된 iPSC를 진탕시키는 것을 포함하는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 5: 세포를 약 7 내지 약 13일 동안 LDN 및 SB 중에서 배양하는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 6: 세포를 약 7 내지 약 13일 동안 (i) 약 4.75 μg/mL 내지 약 5.75 μg/mL LDN; 및/또는 (ii) 약 0.5 μM 내지 약 4 μM SB 중에서 배양하는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 7: LDN이 LDN193189이고, SB가 SB-431542인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 8: ROCK 억제제가 파수딜, 리파수딜, 네타르수딜, RKI-1447, Y-27632, GSK429286A, Y-30141, 또는 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 9: ROCK 억제제가 Y-27632인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 10: 세포를 적어도 약 7 내지 약 16일 동안 약 5 μM Y-27632 중에서 배양하는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 11: 세포를 적어도 약 8시간 내지 16일 동안 FGF, EGF, 및 LIF 중에서 배양하는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 12: 세포를 적어도 약 3일 내지 약 16일 동안 100 ng/mL의 FGF, 100 ng/mL의 EGF, 및 100 ng/mL의 LIF 중에서 배양하는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 13: iPSC-유래 NPC (iNPC)가 신경구로서 응집되는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 14: iPSC-유래 NPC가 생착 iPSC-유래 NPC인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 15: 세포를 하나 이상의 벡터와 접촉시키는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 16: 세포를, (a) (i) 구성적 프로모터, (ii) tet 반응성 요소를 포함하는 유도성, 양방향 폴리시스트론 프로모터, 및 (iii) 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 발현 카세트; (b) 2개의 트랜스포존 요소; 및 (c) 적어도 하나의 상동 재조합 서열을 포함하며, 여기서 2개의 트랜스포존 요소는 발현 카세트를 플랭킹하는 것인 벡터와 접촉시키는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 17: 세포를 신경영양 인자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터와 접촉시키는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 18: 신경영양 인자가 신경교 세포 라인-유래 신경영양 인자 (GDNF)인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 19: (i) 임의의 상기 구현예의 방법에 의해 제조된 일정량의 iPSC-유래 NPC를 제공하고; (ii) 적어도 2개의 벡터를 iPSC-유래 NPC에 도입하는 것을 포함하는 방법.
구현예 20: 적어도 2개의 벡터의 도입이 뉴클레오펙션, 트랜스펙션 및 전기천공 중 하나 이상을 포함하는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 21: 적어도 2개의 벡터가 piggyBac 벡터 및 pBase 벡터를 포함하는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 22: 적어도 하나의 벡터가 바이러스 벡터를 포함하는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 23: 벡터가 AAV 또는 렌티바이러스 벡터인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 24: piggyBac 벡터가 (a) (i) 구성적 프로모터, (ii) tet 반응성 요소를 포함하는 유도성, 양방향 폴리시스트론 프로모터, 및 (iii) 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 발현 카세트; (b) 2개의 트랜스포존 요소; 및 (c) 적어도 하나의 상동 재조합 서열을 포함하며, 여기서 2개의 트랜스포존 요소는 발현 카세트를 플랭킹하는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 25: 단백질 또는 펩티드가 신경영양 인자를 포함하는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 26: 신경영양 인자가 신경교 유래 신경영양 인자 (GDNF)를 포함하는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 27: 상동 재조합 서열이 게놈 세이프 하버를 표적화할 수 있는 서열을 포함하는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 28: 게놈 세이프 하버가 아데노-연관 바이러스 부위 1 (AAVS1), 케모카인 (C-C 모티프) 수용체 5 (CCR5) 유전자, 마우스 Rosa26 유전자좌의 인간 이종상동체 중 하나인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 29: 신경 전구 세포가 생착 신경 전구 세포인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 30: 임의의 상기 구현예의 방법에 의해 제조된 일정량의 세포.
구현예 31: 세포가 게놈적으로 통합된 발현 카세트를 발현하는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법 또는 일정량의 세포.
구현예 32: 게놈적으로 통합된 발현 카세트가 게놈 세이프 하버에 있는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법 또는 일정량의 세포.
구현예 33: (i) 상기 구현예 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 일정량의 iPSC-유래 NPC를 제공하고; (ii) 적어도 하나의 벡터를 iPSC-유래 NPC에 도입하는 것을 포함하는 방법.
구현예 34: 적어도 하나의 벡터가 뉴클레오펙션, 트랜스펙션 및 전기천공 중 하나 이상을 포함하는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 35: 적어도 하나의 벡터가 (a) 하기를 포함하는 발현 카세트: (i) 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 구성적 또는 유도성 프로모터; 및 (ii) 적어도 하나의 상동 재조합 서열을 포함하는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 36: 단백질 또는 펩티드가 신경영양 인자를 포함하는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 37: 신경영양 인자가 신경교 유래 신경영양 인자 (GDNF)를 포함하는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 38: 구성적 프로모터가 3-포스포글리세레이트 키나제 (PGK 프로모터)인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 39: 상동 재조합 서열이 게놈 세이프 하버를 표적화할 수 있는 서열을 포함하는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 40: 게놈 세이프 하버가 아데노-연관 바이러스 부위 1 (AAVS1), 케모카인 (C-C 모티프) 수용체 5 (CCR5) 유전자, 마우스 Rosa26 유전자좌의 인간 이종상동체 중 하나인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 41: 유도성 프로모터가 테트라사이클린-계열 항생제에 의해 조절되는 프로모터를 포함하는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 42: 테트라사이클린-계열 항생제가 독시사이클린을 포함하는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 43: 유도성 프로모터가 역 테트라사이클린-제어된 전사활성화제 (rtTA) 또는 tet-On 고급 전사활성화제 (rtTA2S-M2)에 의해 조절되는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 44: 역 테트라사이클린-제어된 전사활성화제 (rtTA) 또는 tet-On 고급 전사활성화제 (rtTA2S-M2)가 세포에서 GDNF의 발현을 촉진하는 것인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 45: iPSC-유래 NPC가 생착 iPSC-유래 NPC인, 상기 구현예 중 어느 하나의 방법.
구현예 46: iPSC-유래 NPC가 게놈적으로 통합된 발현 카세트를 발현하는 것인, 임의의 상기 구현예의 방법에 의해 제조된 일정량의 세포.
구현예 47: 게놈적으로 통합된 발현 카세트가 게놈 세이프 하버에 있는 것인, 임의의 상기 구현예의 일정량의 세포.
구현예 48: 게놈 세이프 하버가 AAVS1인, 임의의 상기 구현예의 일정량의 세포.
구현예 49: 임의의 상기 구현예의 일정량의 세포 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 이식 조성물.
구현예 50: 대상체의 척수 내로 생착되는 임의의 상기 구현예의 이식 조성물.
구현예 51: 신경퇴행성 질환에 대한 치료로서의 사용을 위한 임의의 상기 구현예의 이식 조성물.
구현예 52: 신경퇴행성 질환이 근위축성 측삭 경화증 (ALS)인, 임의의 상기 구현예의 이식 조성물.
구현예 53: (a) 대상체에게 임의의 상기 구현예의 방법에 의해 제조된 iNPC를 투여하고; 임의로 (b) 대상체에게 ALS에 대한 추가의 치료를 투여하는 것을 포함하는, ALS의 치료 방법.
구현예 54: 추가의 치료가 릴루졸 또는 에다라본 중 하나 이상인, 임의의 상기 구현예의 방법.
본원에 기재된 다양한 방법 및 기술은 본 발명을 수행하기 위한 많은 방식을 제공한다. 물론, 기재된 모든 목적 또는 이점이 반드시 본원에 기재된 임의의 특정 구현예에 따라 달성될 수 있는 것은 아님을 이해하여야 한다. 따라서, 예를 들어, 당업자는, 본원에 교시되거나 제안될 수 있는 다른 목적 또는 이점을 반드시 달성하지는 않으면서, 본원에 교시된 바와 같은 하나의 이점 또는 이점의 그룹을 달성하거나 최적화하는 방식으로 방법이 수행될 수 있음을 인식할 것이다.
다양한 유리한 및 불리한 대안이 본원에서 언급된다. 일부 바람직한 구현예는 하나, 또 다른 하나, 또는 여러 유리한 특징을 특정적으로 포함하면서, 다른 구현예는 하나, 또 다른 하나, 또는 여러 불리한 특징을 특정적으로 배제하면서, 또한 다른 구현예는 하나, 또 다른 하나, 또는 여러 유리한 특징의 포함에 의해 현재의 불리한 특징을 특정적으로 완화함을 이해하여야 한다.
또한, 당업자는 상이한 구현예로부터 다양한 특징의 응용가능성을 인식할 것이다. 유사하게, 상기에서 논의된 다양한 요소, 특징 및 단계, 뿐만 아니라 각각의 이러한 요소, 특징 또는 단계에 대한 다른 공지된 등가물이 본원에 기재된 원리에 따라 방법을 수행하기 위해 당업자에 의해 혼합 및 매칭될 수 있다. 다양한 요소, 특징, 및 단계 중, 다양한 구현예에서 일부는 특정적으로 포함되고 다른 것들은 특정적으로 배제될 것이다.
본 발명이 특정 구현예 및 예의 맥락에서 개시되었지만, 본 발명의 구현예가 구체적으로 개시된 구현예를 넘어 다른 대안적 구현예 및/또는 그의 용도 및 변형 및 등가물로 확장된다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
많은 변화 및 대안적 요소가 본 발명의 구현예에 개시되어 있다. 또한 추가의 변화 및 대체 요소는 당업자에게 명백할 것이다. 이들 변화 중에는, 제한 없이, 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)와 관련된 조성물 및 방법, 신경 전구 세포를 포함하는 분화된 iPSC, 상기 언급된 세포의 조작에 사용되는 벡터, 상기 언급된 조성물의 사용과 관련된 방법 및 조성물, 여기에서 사용된 용액의 기술 및 조성물 및 용도, 및 본 발명의 교시를 통해 창출된 생성물의 특정 용도가 있다. 본 발명의 다양한 구현예는 임의의 이들 변화 또는 요소를 특정적으로 포함하거나 배제할 수 있다.
본원에 개시된 본 발명의 대안적 요소 또는 구현예의 그룹화는 제한으로서 해석되어서는 안 된다. 각 그룹 구성원은 개별적으로 또는 그룹의 다른 구성원 또는 본원에서 나타나는 다른 요소와 임의의 조합으로 참조 및 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원은 편의 및/또는 특허성을 이유로 그룹에 포함되거나 그룹으로부터 삭제될 수 있다. 임의의 이러한 포함 또는 삭제가 나타나는 경우, 명세서는 변형된 그룹을 함유하는 것으로 본원에서 간주되고 그에 따라 첨부된 청구범위에서 사용된 모든 마쿠쉬(Markush) 그룹의 서면 기재를 충족한다.
본 발명을 수행하기 위한 본 발명자에게 공지된 최선의 모드를 포함하여, 본 발명의 바람직한 구현예가 본원에 기재되어 있다. 이들 바람직한 구현예에 대한 변화는 상기 설명을 읽음에 따라 당업자에게 명백해질 것이다. 당업자는 이러한 변화를 적절하게 사용할 수 있고, 본 발명은 본원에 구체적으로 기재된 것과 다르게 실시될 수 있음이 고려된다. 따라서, 본 발명의 많은 구현예는 적용가능한 법률이 허용하는 바에 따라 본원에 첨부된 청구범위에서 언급된 주제의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 또한, 본원에 달리 표시되지 않는 한 또는 달리 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 모든 가능한 변화에서의 상기에 기재된 요소의 임의의 조합이 본 발명에 포함된다.
또한, 본 명세서 전반에 걸쳐 특허 및 인쇄된 공개물에 대한 수많은 참조가 이루어졌다. 상기 인용된 참조문헌 및 인쇄된 공개물 각각은 그 전체가 개별적으로 본원에 참조로 포함된다.
본원에 개시된 본 발명의 구현예는 본 발명의 원리를 예시하는 것임을 이해하여야 한다. 사용될 수 있는 다른 변형도 본 발명의 범위 내에 있을 수 있다. 따라서, 제한이 아닌 예로서, 본 발명의 대안적 구성이 본원의 교시에 따라 활용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 구현예는 정확하게 나타내고 기재된 것으로 제한되지 않는다.
제한적인 것으로 해석되어서는 안 되는 하기 실시예에 의해 본 발명을 추가로 설명한다.
실시예
청구된 발명의 비-제한적 예가 본원에 기재된다.
실시예 1: 테트라사이클린 유도성 프로모터 하에 GDNF를 생산하도록 조작된 마스터 iPSC 라인의 생성을 통한 iNPC-GDNF
dox
세포 생성물의 개발.
유도-만능 줄기 세포 (iPSC)는 요망되는 신경 전구 세포로 분화될 수 있는 세포 요법 생성물에 대한 안전하고 재생가능하며 스케일링가능한 공급원을 제시한다. iPSC는 클론 확장될 수 있기 때문에, 유도성 프로모터 하에, AAVS1과 같은 안전한 게놈 유전자좌에 삽입된 GDNF 이식유전자의 단일 카피를 함유하는 마스터 iPSC 라인을 생성할 수 있다. 이어서, 유래된 iNPC-GDNF 세포는 테트라사이클린과 함께 제공될 때 GDNF를 균일하게 발현할 수 있으며 추가 시험 및 임상 사용에 충분한 스케일로 쉽게 확장가능할 수 있다.
이 연구에서, 테트라사이클린 조절 프로모터 하에 GDNF를 생산하도록 조작된 iPSC 마스터 세포 라인을 생성하였다. 최적화된 분화 프로토콜 및 제어된 GDNF 발현을 위한 조작된 라인으로, iNPC-GDNFdox의 전임상 세포 로트를 확장하고 효능 및 안전성 연구를 위해 뱅킹할 수 있다.
CNS10-NPC-GDNF에서 사용되는 것과 같은 렌티바이러스 형질도입은 이종 카피 수 및 랜덤 게놈 삽입을 초래한다. iPSC는 단일 클론으로부터 확장될 수 있기 때문에, AAVS1 안전 착지 부위에 삽입된 단일 GDNF 작제물로 유전자 편집 라인의 확립이 가능하다.
유전자-편집 iPSC 라인은 분화시 조작된 작제물을 침묵시키는 것으로 유명하다36,37. AAVS1 부위가 열린 염색질 영역에 남아 있기 때문에, 여기에 삽입된 작제물은 분화된 자손에서 발현을 더 잘 보유할 수 있다38,39. 구체적으로, AAVS1 유전자좌는, 삽입이 내인성 세포 과정의 최소 붕괴를 초래하기 때문에, 조작된 작제물의 삽입에 있어 안전하다40. CNS10-NPC-GDNF는 운동 뉴런을 보호할 수 있는 GDNF를 분비하지만, 이 발현은 구성적이고, 따라서 GDNF의 시기 및 용량이 조절될 수 없다. 이 연구에서, 본 발명자들은 공동 연구에서 사용된 것과 같이 조절가능한 GDNF를 발현하도록 iPSC 라인을 조작하였다27.
GDNF (V1)를 구동하는 테트라사이클린 유도성 프로모터, 또는 구성적 프로모터로 2개의 작제물을 생성하였다 (도 6a). 이들 작제물을 이전에 확립된 TALEN 및 상동 재조합 접근법을 사용하여 AAVS1 유전자좌로의 삽입을 위해 표적화하였다 (도 7). 각 작제물을 보유하는 iPSC 라인을 iNPC로 분화시키고, 이어서 배지로의 GDNF 분비를 검출하기 위해 ELISA를 사용하여 시험관내에서 시험하였다. 24시간에, 형질도입되지 않은 iNPC는 GDNF를 생산하지 않았지만, 구성적 GDNF 작제물을 보유하는 iNPC는 렌티바이러스 형질도입된 iNPC 및 CNS10-NPC-GDNF 세포 둘 다에 대해 유사한 수준의 GDNF를 생산하였다 (도 6b). 0.6 μM 독시사이클린 (dox; 테트라사이클린 유사체)으로 처리된 V1 유도성 작제물을 갖는 iNPC는 GDNF의 발현을 나타내었다. 유도성 작제물은 dox 회수 후 72시간까지 GDNF 생산의 감쇠를 가지며 엄격하게 조절되었다 (도 6c). 중요하게, dox 처리 없이, 형질도입된 iNPC로부터의 GDNF 수준은 형질도입되지 않은 수준으로 유지되었다.
시험관내 데이터로부터의 유망한 결과에도 불구하고, V1 테트라사이클린-유도성 작제물은 이식된 세포에서 기능하지 않았다 (도 6d). 추가로, 초기 작제물은 10.7 kb로 크고, 치료적 응용에 적합하지 않은 많은 요소를 함유하였다27. 따라서, 본 발명자들은 CloneTech™로부터 입수가능한 청정 벡터 백본으로부터 단순화된 작제물을 설계하였다 (도 6a, V2). 이 새로운 테트라사이클린 유도성 시스템 (V2)은 5.7 kb로 훨씬 더 작으며, GDNF 이식유전자의 보다 청정하고 보다 효율적인 발현을 제공할 수 있다.
유도성 프로모터의 제어 하에 발현된 GDNF의 단일 카피로 iPSC 라인을 조작하기 위해, TALEN 방법론을 사용하여 새로운 V2 작제물을 AAVS1 유전자좌로 표적화할 수 있다. 또한, iNPC가 아닌 iPSC로의 GDNF 작제물의 혼입은 배양에서 나중에 해리/렌티바이러스 형질도입 단계에 대한 필요성을 제거하고, 그에 따라 확장 가능성이 더욱 증가한다.
이 접근법을 사용한 AAVS1 유전자좌로의 표적화된 작제물의 효율적인 통합이 입증되었다41. 동일한 TALEN 작제물을 사용하여 이전에 iNPC 프로토콜의 평가에 사용된 iPSC 라인에 V2 유도성 GDNF 이식유전자를 삽입할 수 있다. 현탁액 중의 iPSC를 우측 및 좌측 TALEN 작제물 및 유도성 GDNF 작제물로 전기천공할 수 있다. 세포를 저밀도로 플레이팅하고 클론 라인을 확립하기 위해 선택할 수 있다. 요망되는 작제물을 발현하는 클론을 일시적인 GFP 발현을 기반으로 선택할 수 있으며, AAVS1 부위로의 통합은 Sanger 시퀀싱을 통해 확인할 수 있다. 확인 후, 이들 iPSC 클론은 유도성 iNPC 생성물 (iNPC-GDNFdox)을 도출하기 위한 물질의 역할을 할 수 있다.
V2 유도성 GDNF 작제물을 보유하는 iPSC 라인이 확립되면, 예를 들어, 확립된 NPC 유전자 (네스틴, VIM, TUBB3, MAP2, APQ4, S100β 및 GFAP)에 대한 qPCR, 플레이트-다운 및 면역세포화학 (ICC)에 의해, 세포를 분화시키고 특성화하여 NPC가 성상세포를 생성하는 능력을 확립할 뿐만 아니라 GDNF에 대한 ICC 및 ELISA에 의해 GDNF 생산의 시험관내 수준 및 테트라사이클린 조절의 역학을 특성화할 수 있다.
iNPC-GNDFdox의 배치가 분화되고 특성화되면, 세포를 확장하고 뱅킹할 수 있다. 이와 병행하여, 동일한 과정을 사용하여 GDNF iNPC를 구성적으로 발현하는 뱅크를 개발할 수 있다 (iNPC-GDNFCONST). 현재 iNPC 분화로의 이전 작업은 iNPC가 스케일링가능한 배양 방법에 따를 수 있음을 보여주었으며, 이는 세포 치료제로의 하류 개발에 있어 중요하다.
상기에서 논의된 iPSC 라인에 추가로, 구성적 GDNF iPSC 라인을 생성하였고, 뿐만 아니라 iNPC-GDNFCONST 세포를 분화시키고 뱅킹하였다. 이들 iNPC-GDNFCONST 세포는 하기에 기재되는 바와 같이 효능 및 안전성에 대해 사용될 수 있다. 기재된 세포 생성물은 하기에 기재되는 바와 같이 생산의 스케일링이 가능하다.
효능 및 안전성 시험: 안전성 시험을 수행하기 위해, 대략 2억개의 iNPC의 배치를 생성할 수 있다. 스케일링 생물반응기의 사용 및 새로운 패시징 방법을 통해, 이 배치 크기를 쉽게 달성할 수 있다. 전통적으로, 신경 전구 세포는 단층 또는 응집체 배양으로서 현탁액 중에서 확장된다. 두 배양 양식의 단일 세포 패시징은 이상적이 아니며, 이 패시지 방법은 확장 가능성을 제한하는 조기 세포 노화로 이어질 수 있거나 세포가 분화하도록 유도할 수 있기 때문이다13,42,43. 기계적 세단은 태아 및 iPSC-유래 신경 전구 세포 둘 다를 초기 단계 임상 시험에 적합한 스케일로 확장하는 데 성공적으로 사용되었다. 그러나, 이 방법은 시간-소모적이고, 노동-집약적이고, 보다 큰 스케일로 실행하기가 어렵다. 본원에 기재된 세포 생성물의 하류 제조를 보조하기 위해 200 μm 정사각형 공간을 갖는 초미세 텅스텐 와이어로부터 제조된 컷팅 메쉬를 삽입함으로써 기계적 패시징하는 방법이 개발되었다. 메쉬가 98% 열려 있기 때문에, 유체 유동이 최소한으로 방해를 받아 큰 부피의 배지 및 세포가 유동 통과할 수 있으며, 이에 따라 대형 구는 메쉬를 통과할 때 컷팅된다. 생성된 구 섹션은 전통적 기계적 세단 방법으로부터의 것들과 유사한 대략 200 μm 정사각형 세그먼트이다. 현저히 적은 시간이 소모되고 오퍼레이터 조작이 훨씬 더 적게 요구되는 것 외에도, 이 새로운 세단 방법은 인라인으로 실행될 수 있어, 세포의 외부 취급의 필요성이 전적으로 제거된다. 이는, 플라스크의 수가 각 패시지마다 증가하는 CNS10-NPC-GNDF 세포 생성에 사용되는 스케일-아웃 배양 방법과 달리, 배양 부피가 각 패시지마다 증가될 수 있는 스케일링 생물반응기 배양의 사용을 가능하게 한다. 심지어 작은 생물반응기 배양 및 이 새로운 기계적 패시징 기술을 사용하여, 모든 하류 검정을 위한 충분한 양의 iNPC-GDNFdox/CONST를 빠르게 생산할 수 있다 (도 11).
실시예 2: SOD1G93A ALS 형질전환 래트의 요추 척수 및 운동 피질에 이식된 iNPC-GDNF
dox
의 효능
SOD1G93A 래트는 ALS의 잘 특성화된 모델이며44,45 세포 이식 연구를 위해8,12, 뿐만 아니라 태아-유래 CNS10-NPC-GDNF 세포에 대한 IND 파일링을 위한 전임상 연구에서 광범위하게 사용되었다. 인간 병리와 마찬가지로, 질환 발병의 위치는 이 모델에서 예측불가능하며, 명시적인 부전마비가 뒷다리 및/또는 앞다리에서 완전한 마비로 진행된다. 몸통 및 목 근육의 위축이 또한 일부 동물에서 관찰될 수 있다. 이 느린 악화 및 질환 진행은 체중 및 BBB(Basso, Beattie, 및 Bresnahan) 스케일과 같은 행동 측정을 사용하여 평가될 수 있다. 이들 래트의 조직학적 분석은 피질척수 운동 뉴런 및 척수 운동 뉴런 손실, 및 신경근 접합부의 퇴행을 나타낸다14,46. 따라서, 이 모델은 ALS에 민감한 뉴런을 보호하는 데 있어 iNPC-GDNFdox의 투여량 및 효능을 결정하기 위해 특히 적합하다. 이 목표는 iNPC-GDNFdox 생성물이 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 동안 ALS 설치류 모델에서 보호 이점을 제공할 수 있는지 여부에 중점을 둔다.
dox 투여 체제: 이전 연구에서, 마우스 피질에서 iPSC-유래 신경 전구세포 이식의 조절은 경구 위관영양을 통해 3 - 4일마다 15 μg dox/그램을 전달함으로써 달성되었다27. 루시페라제 검정에 의해 결정된 바와 같이, dox 투여량의 효과는 투여 1주 이내에 나타났다. iNPC-GDNFdox의 효능이 이 연구의 주요 목표이기 때문에, "on dox" 또는 "off dox"의 단순한 전달만 평가하면 된다. GDNF 발현의 생체내 역학 뿐만 아니라 펄스 발현 및 감쇠와 같은 보다 복잡한 투여 계획이 평가될 수 있다. 여기서는, 야생형 (WT) 래트가 사용될 수 있다. 각 동물은 요추 척수로의 iNPC-GDNFdox 이식을 편측성으로 수용할 수 있어, 각 척수 섹션의 반대측과의 비교가 가능하다. 각 동물은 1 mm 간격으로 이격된 부위에서의 10K 세포의 3회 주사를 수용할 수 있다. V1 작제물을 보유하는 iNPC로부터의 시험관내 GDNF ELISA를 기반으로 하여, dox 처리된 세포와 처리되지 않은 세포 사이에 4.91의 효과 크기가 나타났으며, 이는 3마리 동물의 그룹 크기를 사용하여 효과의 차이를 검출하기 위한 99% 검정력을 가능하게 한다. 이식 및 수술로부터의 회복 후, dox는 두 가지 방법 중 하나로 래트에게 투여될 수 있으며, 각 그룹은 총 18마리의 동물로 3가지 상이한 농도를 평가한다 (표 3). 제1 그룹은 하기 농도로 경구 위관영양을 사용하여 dox를 수용할 수 있다: 용량 당 15 μg, 20 μg 및 30 μg. 제2 그룹은 하기 농도로 식수에서 dox를 수용할 수 있다: 0.2 mg/mL, 2 mg/mL 및 5 mg/mL. 식수 중에서 전달시 dox의 효능을 평가하는 연구는 dox가 동물 물병에서 최대 14일 동안 안정적인 것으로 나타났고47, 따라서 여기서 dox-물은 1주에 2회 신선한 혼합물로 대체될 수 있다. 3-4일마다의 위관영양 또는 dox-물에 대한 지속적 접근의 4주 후, 동물을 희생시키고 척수 조직 상에서 면역조직화학 (IHC)을 사용하여 GDNF 발현 및 이식편 생존에 대해 평가할 수 있다. 치료 동안, 수술 후 척수 손상의 회복 및 부족을 보장하기 위해 행동 측정 (체중 및 관찰)을 사용하여 동물을 관찰할 수 있다. 식수의 정확한 부피는 각 래트에 의해 소비되는 양을 추정하기 위해 각 교체시 측정될 수 있다. 래트는 수술 3일 전부터 시작하여, 이식편 거부를 피하기 위한 면역억제를 위해 매일 10 mg/kg 시클로스포린의 교대 복강내 주사 (IP)를 수용할 수 있다. 각 dox 투여 방법 및 농도는 척수 섹션에서 검출된 GDNF의 양에 따라 점수화될 수 있으며, 이는 이식편 생존을 나타내는 DAPI와 공동-국소화되는 인간 핵 또는 세포질 마커의 백분율과 비교될 수 있다.
표 3. 야생형 (WT) 동물에서 iNPC-GDNFdox에 대한 최적 dox 전달을 위한 실험군.
ALS의 SOD1 G92A 래트 모델에서 뉴런을 보호하는 데 있어 iNPC-GDNF의 효능: ALS 및 노화에서 CNS10-NPC-GDNF 요법을 요추 척수에 이식한 후 척추 운동 뉴런의 신경보호가 나타났다8,12,26. 추가 작업은 또한 SOD1G93A 래트 모델의 운동 피질에서의 돌연변이 SOD1의 바이러스 녹다운이 질환 발병을 지연시키고 생존을 연장시킴을 보여주었다14. 이 ALS 모델에서 운동 피질로의 CNS10-NPC-GDNF의 이식은 또한 상부 및 하부 운동 뉴런을 보호하고 질환 병리를 지연시키고 ALS 래트의 생존을 연장시켰다15. 두 연구 모두, 상부 운동 뉴런 및 피질의 기능장애가 뇌 및 척수에서의 운동 뉴런 사망 및 결과적으로 ALS의 마비로 이어지는 이벤트에 현저히 기여할 수 있음을 시사하였다. 특정 이론에 얽매이지 않고, SOD1G93A 래트 모델의 (a) 요추 척수, (b) 운동 피질, 및 (c) 두 부위 모두에 이식된 iNPC-GDNFdox 세포는 CNS10-NPC-GDNF 생성물로 관찰된 것과 유사한 신경보호를 제공할 수 있다.
SOD1G93A 래트 모델에서의 이전 경험을 기반으로 하여, 이들 효능 연구에서 모든 동물은 70 +/- 5일령에 iNPC-GDNFdox 세포의 이식을 수용할 수 있다. 상기에서 논의된, dox 투여 방법 및 최소-유효 농도를, 수술-후 회복을 위해 동물에게 1주를 제공한 후에 사용할 수 있다.
요추 척수 내로의 iNPC-GDNFdox 이식: 이전 연구에서, GDNF를 발현하도록 렌티바이러스로 형질도입된 iNPC는 이식 50일 후 SOD1G93A ALS 래트의 요추 척수에서 신경보호를 나타내었다. 이들 동물에서, 부위 당 10K 세포의 이식 용량은 숙주 ChAT+ 운동 뉴런을 보존하는 데 효과적이었지만, 부위 당 50K 세포의 용량은 과밀도 이식편으로부터 숙주 뉴런의 신경보호 및 치환을 제공하지 않았다 (도 8a-8b).
iNPC-GDNFdox 세포의 유효 용량의 결정에서, 수컷 SOD1G93A 래트가 사용될 수 있다. 각 코호트에서 사용될 동물의 통계적 정당성은 CNS10-GDNF 세포로의 이전에 공개된 및 미공개된 데이터를 기반으로 한다8,12,14,15,48. 큰 ChAT+ 운동 뉴런 (>700 μm2)의 평균 350 ± 33 (평균의 표준 오차, SEM)이 질환 발병시 비히클 처리된 SOD1G93A 래트의 척수에 남아 있을 것으로 예상된다. 따라서, 0.58의 예상 효과 크기로, 반복 측정 분석 (동측 대 반대측 측정)에서 80% 검정력을 달성하기 위해 비히클 그룹 당 10마리 동물 및 처리군 당 15마리 동물의 샘플 크기가 사용된다. 처리군은, 10,000개 (D1)로부터 최대 30,000개 세포 (D3)까지, 부위 당 이식될 3개의 점진적으로 증가하는 농도의 세포를 포함하며, 각 부위는 2 μL의 부피를 수용한다 (표 4). 부위 당 최고 용량의 세포를 수용하는 그룹 D3은 이식 후 dox 투여를 수용하지 않을 추가의 10마리 동물을 포함한다 (총 25마리 동물). 요추 척수의 부위는, 총 5개 부위로, 1 mm 간격으로 이격될 수 있다. 이식은 편측성일 수 있으며 (척수 당 모두 동일 측면에 있음), 반대측 측면은 각 동물에 대한 내부 대조군 역할을 한다. 이식의 측면은 수술시 랜덤 선택될 수 있으며, 조직의 조직학적 분석 및 데이터의 완전한 맹검해제의 완료 후까지 연구 직원으로부터 맹검 상태로 유지될 수 있다. SOD1G93A 래트는 이식편 거부를 피하기 위한 면역억제를 위해 10 mg/kg 시클로스포린의 교대 IP를 매일 수용할 것이다. 이식 후, 동물은 체중, 뒷다리의 운동 기능, 이환율 및 사망률을 포함한 상세한 임상 검사를 위해 관찰될 수 있다. 이들 관찰은 치료군에 대해 완전 맹검될 수 있다. 모든 동물은 추가 분석을 위해 뒷다리 또는 앞다리에서 15 이하의 연속 BBB 점수화에 의해 결정된 질환 발병시 희생될 수 있다.
표 4. 요추 척수 이식 iNPC-GDNFdox에 대한 실험군.
*이식 대조군으로서 10마리의 동물에게는 dox가 제공되지 않음
척수를 또한 각 동물로부터 수집하고 IHC에 의한 분석을 위해 연속적으로 분할할 수 있다. 운동 뉴런 수, 생착 정도 (검출된 인간 핵 및 세포질의 백분율에 의해 결정), 및 GDNF의 발현은 각각에 대한 항체 및 입체학을 사용하여 평가될 수 있다. 이 목표의 두 번째 목적은 질환 환경에서 생체내 세포 운명을 평가하는 것이다. 이를 위해, 척수의 그래프팅된 섹션을 또한 IHC를 사용하여 평가하여 세포 유형, 예컨대 성상교세포 또는 신경 전구세포 발현, 및 그래프팅된 세포의 통합 또는 이동 정도를 평가할 것이다. iNPC-GDNFdox의 효능은 비히클 대조군과 비교하여 남아 있는 운동 뉴런의 백분율, 및 처리군의 동일한 섹션의 반대측 영역, 및 행동 데이터에 대한 효과 없음 또는 개선된 효과에 의해 점수화될 수 있다.
운동 피질 내로의 iNPC-GDNFdox 이식: CNS10-NPC-GDNF를 SOD1G93A 래트의 운동 피질 내로 이식하는 이전 경험을 기반으로 하여, 동물 당 20개 부위 (반구 당 10개)에 2 μl 주사를 이식한다. 동물은 하기와 같이 Bregma 유전자좌로부터의 운동 피질을 포함하는 측면 x 전방/후방 정위 좌표에서 1.45 mm의 깊이로 투여된 양측 주사를 수용한다: (1) 2 mm × 2 mm, (2) 2 mm × 1 mm, (3) 2 mm × 0 mm, (4) 2 mm × -1 mm, (5) 2 mm × -2 mm, (6) 3 mm × 2 mm (7) 3 mm × 1 mm, (8) 3 mm × 0 mm, (9) 3 mm × -1 mm, (10) 3 mm × -2 mm. 동물은 4개 그룹으로 분리될 수 있으며, 여기서 10마리의 래트는 비히클 제어 이식 (CTRL)을 수용하고 15마리의 래트의 3개 그룹은 동물 당 400K 세포 내지 2M 세포 범위의 점차적으로 증가하는 세포 용량을 각각 수용한다 (표 5). 최고 용량 처리군 D3은 이식 후 dox를 수용하지 않는 추가 10마리의 동물을 가지며, 총 25마리를 갖는다. 모든 래트는 교대 측면 상에 IP 주사를 통해 이식 거부를 피하기 위해 매일 면역억제를 수용한다. 이식 후, 동물은 체중, 뒷다리의 운동 및 감각 기능, 이환율 및 사망률을 포함한 상세한 임상 검사를 위해 관찰될 수 있다. 이들 관찰은 치료군 (CTRL, D1, D2 또는 D3) 및 동물이 dox 치료를 수용하고 있는지의 여부 (즉, D3 그룹은 dox가 투여되지 않은 10마리의 동물을 포함함)에 대해 완전 맹검될 수 있다. 모든 동물은 추가 분석을 위해 뒷다리 또는 앞다리에서 15 이하의 연속 BBB 점수에 의해 결정된 질환 발병시 희생될 수 있다.
표 5. 운동 피질 이식 iNPC-GDNFdox에 대한 실험군.
*이식 대조군으로서 10마리의 동물에게는 dox가 제공되지 않음
iNPC-GDNFdox 세포의 이식이 피질의 제5층에서 피질척수 운동 뉴런을 보호하는지의 여부, 또한 척수의 경추, 흉추 및 요추 영역에서 척수 운동 뉴런의 가능한 보호를 결정하기 위해, 뇌 및 척수 둘 다를 각 동물로부터 수확할 수 있다. 관심 생착 영역의 연속 섹션을 IHC를 사용하여 평가할 수 있다. 피질에서, BCL11B 또는 SATB2의 발현으로 표시되는 제5층 피라미드 뉴런은, 생착에 대해 근위 및 원위 영역에서 정량화될 수 있다. SATB2는 ALS에서 영향받는 표적 피질척수 운동 뉴런에 의해 발현되지 않지만, 이는 피질척수 운동 뉴런 외에 이웃하는 세포 유형에 대한 iNPC-GDNFdox 이식의 상대적 효과에 대한 정보를 제공할 수 있다. 척수의 ChAT+ 운동 뉴런은 상기에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다.
iNPC-GDNFdox의 이중 부위 이식: 환자에서 최종 생성물은 가장 효과적인 치료가 되도록 피질 및 요추 운동 뉴런 둘 다의 퇴행을 늦춰야 할 것이다. 따라서, 척수 및 운동 피질 둘 다로의 세포 전달이 최적 요법을 제공하는 운동 뉴런의 두 풀(pool)을 모두 보호하는지 여부를 결정할 수 있다. 이 목표에서, 25마리의 SOD1G93A 래트의 세트에 각 개별 부위로부터 결정된 가장 효과적인 용량으로 두 부위 모두에 세포를 이식할 수 있다. 이들 동물 중 10마리는 이식 대조군으로서 작용하도록 dox를 제공받지 않을 것이다. 이어서, CNS10-NPC-GDNF를 100K 세포/부위 (CNS10-NPC-GDNF IND 용량 범위 연구로부터 중간 용량)로 요추 척수에 이식할 수 있고, 양성 대조군으로서 15마리의 동물의 운동 피질에 20K 세포/부위로 이식할 수 있다. 이중 이식 동물의 부담을 덜어주기 위해, 요추 척수 이식 전에 2주 회복 기간을 두고 피질 이식이 먼저 일어날 수 있다. 치료를 수용하지 않은 10마리의 SOD1G93A 한배 새끼를 모델 대조군으로서 이식된 동물과 함께 평가할 수 있다. 요추 이식으로부터 회복되면, 모든 동물은 체중, 뒷다리 및 앞다리의 운동 및 감각 기능, 이환율 및 사망률을 포함한 상세한 임상 검사를 위해 관찰될 수 있다. 이들 관찰은 완전 맹검될 수 있다. 모든 래트는 이전에 기재된 바와 같이 매일 면역억제를 수용할 수 있고, 동물은 이전에 기재된 행동 자격요건에 의해 결정된 질환 발병시 희생될 수 있다. 기재된 바와 같이 IHC를 사용하여 뇌 및 척수 조직의 평가를 수행할 수 있으며, 행동 관찰과 함께 피질척수 운동 뉴런 및 척수 운동 뉴런 보호의 정도를 점수화할 수 있다. 상기에서 논의된 바와 같이 평가된 개별 부위와 비교한 이 이중 부위 모델에서의 생착 백분율 및 보호 이득이 특히 중요할 수 있다.
iNPC-GDNFdox 요법은 SOD1G93A 래트에서 척수의 ChAT+ 세포의 보호 및 운동 피질의 BCL11B+ 세포의 보호를 제공할 수 있다. GDNF 발현이 없고/거나 세포의 생착이 관찰되지 않는 경우, 더 높은 용량을 사용하여 야생형 래트에서 dox 치료의 효능을 결정할 수 있다. 경구 위관영양 및 식수를 통한 투여 둘 다 이들 동물에서 GDNF 발현 활성화에 효과적인 것으로 입증되면, 식수를 통한 투여를 사용할 수 있고, 이는 이 방법이 환자의 경구 전달로 가장 잘 해석될 수 있기 때문이다. 이들 작제물이 요약된 전달 메커니즘을 사용하여 활성화가능하지 않은 경우, SOD1G93A 래트의 3개 부위 모델에서 효능 시험을 위해 실시예 1에 기재된 구성적 생성물 iNPC-GDNFCONST가 활용될 수 있다. 불량한 생착 생존 및/또는 숙주 뉴런 보호가 관찰되는 경우, 야생형 래트로 이식된 유도성 세포로 대안적 투여 계획이 달성될 수 있다.
실시예 3: 누드 래트에서 배양 및 장기간 이식에서의 iNPC-GDNFdox 안전성.
이 연구에서는, 면역 억제가 없는 건강한 동물에서 iNPC-GDNFdox/CONST의 안전성 및 용인성을 평가한다. iPSC-유래 조직의 유효한 우려는 만능 줄기 세포 기원으로 인한 런-어웨이 증식의 위험이다. 첫째, 세포의 게놈 무결성은 전체 게놈 시퀀싱을 통해 확인될 수 있고, 만능 세포의 부재는 임상적으로 허용되는 측정을 사용하여 검증될 수 있다. 허용가능한 세포 배치가 생산되면, 누드 래트의 척수에서 iNPC-GDNFdox 요법의 장기간 안전성 및 종양발생이 평가될 것이다. 특정 이론에 얽매이지 않으면서, 만능 유전자 발현이 결여된 분화되고 게놈적으로 온전한 세포가 면역-손상 래트에서 안전한 것으로 입증될 것이라고 가정되었다.
만능 유전자 검출 및 게놈 안정성 검증: 잠재적인 기형종 형성이 iPSC 유래 생성물에 대해 우려되기 때문에, 또한 FDA 및 ISSCR 지침에 따라, iNPC-GDNFdox 세포의 뱅킹된 로트를 만능 인자 OCT-4에 대한 간단한 qPCR 스크린을 통해 검증할 수 있다. 이 검출 검정의 한계는 iPSC와 비교하여 iNPC-GDNFdox의 분화된 배치에서 만능 전사체의 수를 평가할 수 있으며, 다른 임상 물질의 GMP 생산에 대해 검증되었다. 세포 생성물은 원래의 iPSC에서 검출된 OCT-4 전사체의 < 0.1%를 함유하는 경우, 통과된 것으로 고려된다.
유전자 편집 기술 및 연장된 세포 배양 조작은 게놈 및 핵형 이상을 생성할 가능성을 갖고, 따라서 iNPC-GDNF 생성물도 유전자 수준에서 안정적인 것으로 확인되어야 한다. 이에 따라, OCT-4의 검출을 통과하는 로트가 전체 게놈 시퀀싱 및 G-밴드 핵형 분석 둘 다를 위해 제출될 것이다. 많은 iNPC-GDNFdox에 대한 허용가능한 점수는, AAVS1 유전자좌에 올바른 GDNF 작제물을 함유하는 것으로 확인되고, 원래의 iPSC의 OCT-4 전사체의 < 0.1%를 발현하고, 정상적인 핵형을 갖는 것으로서 정의된다.
종양발생 및 생체내 안전성: FDA 지침에 따라, 건강한 동물은 전통적인 독성 연구를 수행하는 데 사용되는 표준 모델 시스템을 나타낸다50,51. 원래의 iNPC 프로토콜로부터 렌티바이러스 형질도입된 세포의 100K 세포/부위를 이식하는 예비 연구는, 이들 세포가 누드 래트 척수에 효율적으로 생착되고 최대 9개월 동안 생존할 수 있음을 보여준다. 인간 핵 마커 및 증식 마커 Ki67에 대한 조직학은, 이들 이식편이 이 지속기간 동안 이들의 증식 거동을 잃음을 보여준다 (도 9a-9b). Ki67 염색의 부재는 iNPC-GDNF 이식에서 제어되지 않은 증식의 위험이 거의 없음을 시사한다.
iNPC-GDNFdox의 장기간 이식과 관련된 잠재적 위험을 평가하기 위해, 면역손상 무흉선 누드 래트의 요추 척수 또는 운동 피질 내로의 이식으로 이들 세포의 독성 및 종양발생 가능성을 평가할 수 있다. 그룹 당 15마리의 동물이 사용될 수 있다. 목표 2에서 결정된 바와 같이, 각 위치에서 숙주 뉴런을 보호하는 데 있어 최고 유효 용량을 사용하여 생착에 대한 임의의 원치 않는 효과 또는 반응을 형성할 기회를 최대화할 수 있다. 요추 척수 이식을 수용하는 동물은 요추 척수를 따라 1 mm 간격으로 이격된 6개 부위 (3개 부위/측면)에 부위 당 2 μl의 부피로 양측 주사를 수용할 수 있다. 운동 피질 내로의 이식을 수용하는 동물은, 목표 2.2B에 나열된 것과 동일한 Bregma 위치에 전달되는, 부위 당 2 μl의 부피의 양측 주사를 수용할 수 있다. 목표 2.1에서 결정된 바와 같은 dox 투여 및 투여량은, 수술-후 1주에 시작하여 연구 지속기간에 걸쳐 계속될 수 있다. 이 목표의 목적은 세포 자체 및 신경영양 인자 GDNF의 분비 둘 다에 의해 유발되는 효과의 정도를 결정하는 것이기 때문에, 모든 동물이 dox를 수용할 수 있다. 척추 및 피질 연구 둘 다로부터의 동물은 이식-후 30일 (3마리 동물/연구) 및 180일 (12마리 동물/연구)에 평가될 수 있다. iNPC 생성물의 안전성을 결정하기 위해, 동물 체중 및 총 생리학을 기형종 형성 또는 운동 활동 손상의 징후에 대해 모니터링할 수 있다. 각 시점에, 각 생착 조직을 수집하고, 연속적으로 분할하고, 이어서 면역조직화학을 사용하여 검정할 수 있다. 이식 생존 (인간 핵 및 세포질 단백질의 검출), 증식 (인간 마커와 공동-국소화된 Ki67의 검출), 숙주 뉴런 건강 (신경섬유, ChAT, BCL11B, SATB2 및 TUNEL 염색의 검출), 및 숙주 조직 반응성 (활성화된 교세포에 의한 GFAP 발현 또는 기타 단백질의 상향조절)의 정량화. 생착된 조직 섹션 및 전체 기관에 대한 종양발생 분석을 또한 수행할 수 있다.
iPSC-유래 조직을 안전한20 세포 치료제로서 사용하는 다른 연구의 성공을 감안하여, iNPC-GDNF 생성물에서 게놈 안정성 및 만능 마커의 부재를 검출할 수 있다. iNPC-GDNFdox의 장기간 생착 및 종양발생의 평가는 치료적 생성물로서의 사용에서의 안전성을 결정할 수 있으며, 원래의 iNPC-GDNF 생성물을 사용하는 연구에서 생착의 양 및 증식성 세포의 부족을 감안하여, 세포가 피질 및 척추 이식에서 안전한 것으로 입증되어야 한다. 운동 행동을 손상시키거나 동물에게 통증을 유발하는 것으로 보이는 명백한 성장이 검출되는 경우, 이에 따라 세포의 다음 최고 용량이 평가될 수 있다. 어느 정도의 이동, Ki67 염색 또는 반응성이 치료 진전을 위해 허용가능한 범위 내에 있는지를 비교하여 결정하기 위해 CNS10-NPC-GDNF 양성 대조군이 사용될 수 있다. CNS10-NPC-GDNF 동물의 관찰과 20% 초과의 차이가 있는 값은 허용불가능한 것으로 고려될 수 있다 (즉, 20% 더 많은 Ki67+ 인간 세포가 검출됨). 가능성은 낮지만, iNPC-GDNFdox가 Ki67 발현을 지나치게 높은 수준으로 발현하는 경우, 대안적 방법은 배양에서의 세포를 증식을 감소시키는 γ-세크레타제 억제제로 처리하는 것일 수 있고52,53, 이어서 이들 세포는 무흉선 래트의 작은 코호트에서 해리되고 시험될 수 있다.
상기에 기재된 다양한 방법 및 기술은 본 발명을 수행하기 위한 많은 방식을 제공한다. 물론, 기재된 모든 목적 또는 이점이 반드시 본원에 기재된 임의의 특정 구현예에 따라 달성될 수 있는 것은 아님을 이해하여야 한다. 따라서, 예를 들어, 당업자는, 본원에 교시되거나 제안될 수 있는 다른 목적 또는 이점을 반드시 달성하지는 않으면서, 본원에 교시된 바와 같은 하나의 이점 또는 이점의 그룹을 달성하거나 최적화하는 방식으로 방법이 수행될 수 있음을 인식할 것이다. 다양한 유리한 및 불리한 대안이 본원에서 언급된다. 일부 바람직한 구현예는 하나, 또 다른 하나, 또는 여러 유리한 특징을 특정적으로 포함하면서, 다른 구현예는 하나, 또 다른 하나, 또는 여러 불리한 특징을 특정적으로 배제하면서, 또한 다른 구현예는 하나, 또 다른 하나, 또는 여러 유리한 특징의 포함에 의해 현재의 불리한 특징을 특정적으로 완화함을 이해하여야 한다.
또한, 당업자는 상이한 구현예로부터 다양한 특징의 응용가능성을 인식할 것이다. 유사하게, 상기에서 논의된 다양한 요소, 특징 및 단계, 뿐만 아니라 각각의 이러한 요소, 특징 또는 단계에 대한 다른 공지된 등가물이 본원에 기재된 원리에 따라 방법을 수행하기 위해 당업자에 의해 혼합 및 매칭될 수 있다. 다양한 요소, 특징, 및 단계 중, 다양한 구현예에서 일부는 특정적으로 포함되고 다른 것들은 특정적으로 배제될 것이다.
본 발명이 특정 구현예 및 예의 맥락에서 개시되었지만, 본 발명의 구현예가 구체적으로 개시된 구현예를 넘어 다른 대안적 구현예 및/또는 그의 용도 및 변형 및 등가물로 확장된다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
많은 변화 및 대안적 요소가 본 발명의 구현예에 개시되어 있다. 또한 추가의 변화 및 대체 요소는 당업자에게 명백할 것이다. 이들 변화 중에는, 제한 없이, 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)와 관련된 조성물 및 방법, 신경 전구 세포를 포함하는 분화된 iPSC, 상기 언급된 세포의 조작에 사용되는 벡터, 상기 언급된 조성물의 사용과 관련된 방법 및 조성물, 여기에서 사용된 용액의 기술 및 조성물 및 용도, 및 본 발명의 교시를 통해 창출된 생성물의 특정 용도가 있다. 본 발명의 다양한 구현예는 임의의 이들 변화 또는 요소를 특정적으로 포함하거나 배제할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 특정 구현예를 설명하고 청구하는 데 사용되는 성분의 양, 농도, 반응 조건 등과 같은 특성을 표현하는 숫자는 일부 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 서면 설명 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 파라미터는 특정 구현예에 의해 얻고자 하는 요망되는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 일부 구현예에서, 수치 파라미터는 보고된 유효 숫자의 수에 비추어, 또한 통상적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다. 본 발명의 일부 구현예의 광범위한 범위를 기재하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 구체적 예에 기재된 수치는 가능한 한 정확하게 보고된다. 본 발명의 일부 구현예에 제공된 수치는 그의 각각의 시험 측정에서 나타난 표준 편차로부터 필수적으로 발생하는 특정 오류를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 본 발명의 특정 구현예를 설명하는 맥락에서 (특히 하기 청구범위의 특정 맥락에서) 사용되는 유사한 참조는 단수 및 복수 둘 다를 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 본원에서 값의 범위를 언급하는 것은, 단지, 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하는 속기 방법으로서 역할을 하도록 의도된다. 본원에 달리 표시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 본원에서 개별적으로 언급된 것처럼 명세서에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법은, 본원에 달리 표시되지 않는 한 또는 달리 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 특정 구현예와 관련하여 제공된 임의의 모든 예, 또는 예시적 언어 (예: "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하도록 의도되며 달리 청구된 본 발명의 범위에 대한 제한을 부여하지 않는다. 명세서의 어떠한 언어도 본 발명의 실행에 필수적인 임의의 비-청구 요소를 나타내는 것으로 해석되어선 안 된다.
본원에 개시된 본 발명의 대안적 요소 또는 구현예의 그룹화는 제한으로서 해석되어서는 안 된다. 각 그룹 구성원은 개별적으로 또는 그룹의 다른 구성원 또는 본원에서 나타나는 다른 요소와 임의의 조합으로 참조 및 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원은 편의 및/또는 특허성을 이유로 그룹에 포함되거나 그룹으로부터 삭제될 수 있다. 임의의 이러한 포함 또는 삭제가 나타나는 경우, 명세서는 변형된 그룹을 함유하는 것으로 본원에서 간주되고 그에 따라 첨부된 청구범위에서 사용된 모든 마쿠쉬 그룹의 서면 기재를 충족한다.
본 발명을 수행하기 위한 본 발명자에게 공지된 최선의 모드를 포함하여, 본 발명의 바람직한 구현예가 본원에 기재되어 있다. 이들 바람직한 구현예에 대한 변화는 상기 설명을 읽음에 따라 당업자에게 명백해질 것이다. 당업자는 이러한 변화를 적절하게 사용할 수 있고, 본 발명은 본원에 구체적으로 기재된 것과 다르게 실시될 수 있음이 고려된다. 따라서, 본 발명의 많은 구현예는 적용가능한 법률이 허용하는 바에 따라 본원에 첨부된 청구범위에서 언급된 주제의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 또한, 본원에 달리 표시되지 않는 한 또는 달리 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 모든 가능한 변화에서의 상기에 기재된 요소의 임의의 조합이 본 발명에 포함된다.
또한, 본 명세서 전반에 걸쳐 특허 및 인쇄된 공개물에 대한 수많은 참조가 이루어졌다. 상기 인용된 참조문헌 및 인쇄된 공개물 각각은 그 전체가 개별적으로 본원에 참조로 포함된다.
마지막으로, 본원에 개시된 본 발명의 구현예는 본 발명의 원리를 예시하는 것임을 이해하여야 한다. 사용될 수 있는 다른 변형도 본 발명의 범위 내에 있을 수 있다. 따라서, 제한이 아닌 예로서, 본 발명의 대안적 구성이 본원의 교시에 따라 활용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 구현예는 정확하게 나타내고 기재된 것으로 제한되지 않는다.
서열
서열 번호: 1-
pB-RTP-Tet-GDNF/memClover-FLuc
서열 번호: 2- GDNF 유전자 참조 서열
NCBI 참조 서열: NC_000005.10:c37840044-37812677
서열 번호: 3- GDNF mRNA 전사체 서열
NCBI 참조 서열: NM_000514.4
호모 사피엔스 신경교 세포 유래 신경영양 인자 (GDNF), 전사체 변이형 1, mRNA
서열 번호: 4- GDNF 아미노산 서열
NCBI 참조 서열: NP_000505.1
신경교 세포 라인-유래 신경영양 인자 이소형 1 프리프로프로테인 [호모 사피엔스]
서열 번호: 5- AAVS1-Tet-On-3G-GDNF
SEQUENCE LISTING
<110> CEDARS-SINAI MEDICAL CENTER
LAPERLE, Alexander
FULTON, Aaron
SVENDSEN, Clive N.
<120> CORTICAL NEURAL PROGENITOR CELLS FROM IPSCS
<130> 065472-000787WO00
<150> 62/924,523
<151> 2019-10-22
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12962
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gtcgacttaa ccctagaaag ataatcatat tgtgacgtac gttaaagata atcatgcgta 60
aaattgacgc atgtgtttta tcgatctgta tatcgaggtt tatttattaa tttgaataga 120
tattaagttt tattatattt acacttacat actaataata aattcaacaa acaatttatt 180
tatgtttatt tatttattaa aaaaaaacaa aaactcaaaa tttcttctat aaagtaacaa 240
aacttttact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat 300
ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc 360
ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca 420
ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta 480
tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta 540
tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat 600
cgctattacc atgggtcgag gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc atctcccccc 660
cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca gcgatggggg 720
cggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg 780
aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg 840
gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc gggagtcgct 900
gcgttgcctt cgccccgtgc cccgctccgc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga 960
ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat 1020
tagcgcttgg tttaatgacg gctcgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttaaaggg 1080
ctccgggagg gccctttgtg cgggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg tgtgtgtgtg 1140
cgtggggagc gccgcgtgcg gcccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg cgggcgcggc 1200
gcggggcttt gtgcgctccg cgtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1260
ggtgcggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg tgggggggtg 1320
agcagggggt gtgggcgcgg cggtcgggct gtaacccccc cctgcacccc cctccccgag 1380
ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtgc ggggcgtggc gcggggctcg 1440
ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1500
ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1560
cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1620
tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1680
gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1740
cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1800
gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1860
gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1920
tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattcgg taccgcatgc atcgatgcta 1980
gcgcgccgcc accatgtcta gactggacaa gagcaaagtc ataaactctg ctctggaatt 2040
actcaatgga gtcggtatcg aaggcctgac gacaaggaaa ctcgctcaaa agctgggagt 2100
tgagcagcct accctgtact ggcacgtgaa gaacaagcgg gccctgctcg atgccctgcc 2160
aatcgagatg ctggacaggc atcataccca ctcctgcccc ctggaaggcg agtcatggca 2220
agactttctg cggaacaacg ccaagtcata ccgctgtgct ctcctctcac atcgcgacgg 2280
ggctaaagtg catctcggca cccgcccaac agagaaacag tacgaaaccc tggaaaatca 2340
gctcgcgttc ctgtgtcagc aaggcttctc cctggagaac gcactgtacg ctctgtccgc 2400
cgtgggccac tttacactgg gctgcgtatt ggaggaacag gagcatcaag tagcaaaaga 2460
ggaaagagag acacctacca ccgattctat gcccccactt ctgaaacaag caattgagct 2520
gttcgaccgg cagggagccg aacctgcctt ccttttcggc ctggaactaa tcatatgtgg 2580
cctggagaaa cagctaaagt gcgaaagcgg cgggccgacc gacgcccttg acgattttga 2640
cttagacatg ctcccagccg atgcccttga cgactttgac cttgatatgc tgcctgctga 2700
cgctcttgac gattttgacc ttgacatgct ccccggggga tccggaggat ccggagccac 2760
gaacttctct ctgttaaagc aagcaggaga cgtggaagaa aaccccggtc ctatgagcga 2820
gctgattaag gagaacatgc acatgaagct gtacatggag ggcaccgtgg acaaccatca 2880
cttcaagtgc acatccgagg gcgaaggcaa gccctacgag ggcacccaga ccatgagaat 2940
caaggtggtc gagggcggcc ctctcccctt cgccttcgac atcctggcta ctagcttcct 3000
ctacggcagc aagaccttca tcaaccacac ccagggcatc cccgacttct tcaagcagtc 3060
cttccctgag ggcttcacat gggagagagt caccacatac gaagacgggg gcgtgctgac 3120
cgctacccag gacaccagcc tccaggacgg ctgcctcatc tacaacgtca agatcagagg 3180
ggtgaacttc acatccaacg gccctgtgat gcagaagaaa acactcggct gggaggcctt 3240
caccgagacg ctgtaccccg ctgacggcgg cctggaaggc agaaacgaca tggccctgaa 3300
gctcgtgggc gggagccatc tgatcgcaaa cgccaagacc acatatagat ccaagaaacc 3360
cgctaagaac ctcaagatgc ctggcgtcta ctatgtggac tacagactgg aaagaatcaa 3420
ggaggccaac aacgagacct acgtcgagca gcacgaggtg gcagtggcca gatactgcga 3480
cctccctagc aaactggggc acaagcttaa ttccggactc ggcaagccta tccctaaccc 3540
tctgctgggc ctggacagca ccgatccaaa aaagaagaga aaggtagacc ctaagaagaa 3600
gaggaaggtg gaccccaaga agaagagaaa ggtgtgaggc agtggaggga gtggagcaac 3660
caatttttca ctcctgaagc aagctgggga tgtagaggag aatcctgggc ctatggacta 3720
caaagacgat gacgacaagc ttggcactag tggctttgcg aatgaattgg gacctaggtt 3780
gatgggcaag ctttctagtc aactcgagat gaccgagtac aagcccacgg tgcgcctcgc 3840
cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg ccgactaccc 3900
cgccacgcgc cacaccgtcg atccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg agctgcaaga 3960
actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg acgacggcgc 4020
cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt tcgccgagat 4080
cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac agatggaagg 4140
cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg tcggcgtctc 4200
gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag tggaggcggc 4260
cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc tccccttcta 4320
cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac cgcgcacctg 4380
gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgagc ggccgcactc ctcaggtgca ggctgcctat 4440
cagaaggtgg tggctggtgt ggccaatgcc ctggctcaca aataccactg agatcttttt 4500
ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg agcatctgac ttctggctaa 4560
taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgga 4620
aggacatatg ggagggcaaa tcatttaaaa catcagaatg agtatttggt ttagagtttg 4680
gcaacatatg cccatatgct ggctgccatg aacaaaggtt ggctataaag aggtcatcag 4740
tatatgaaac agccccctgc tgtccattcc ttattccata gaaaagcctt gacttgaggt 4800
tagatttttt ttatattttg ttttgtgtta tttttttctt taacatccct aaaattttcc 4860
ttacatgttt tactagccag atttttcctc ctctcctgac tactcccagt catagctgtc 4920
cctcttctct tatggagatc cctcgacctg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 4980
ttgtaaaacg acggccagtg ccaagcttgc atgcctgcag taagatacat tgatgagttt 5040
ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct 5100
attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt 5160
cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc 5220
tacaaatgtg gtaggtacca ccggtcctgc aggttagacg ttgatcctgg cgctggcgca 5280
agcagcaggg tgtctatcca tgccgctctc ctgggcgcag ctcatgggca gggtgccggc 5340
ggcctgctcc tccacctcgg gagggaagcc gtgagaattc acggcgatct tgccgccctt 5400
cttggcctta atgagaatct cgcggatctt gcgggcgtcc aacttgccgg tcagtccttt 5460
aggcacctcg tccacgaaca caacaccacc gcgcagcttc ttggcggttg taacctggct 5520
ggccacatag tccacgatct ccttctcggt catggtttta ccgtgttcca gcacgacgac 5580
tgcggcgggc agctcgccgg catcgtcgtc gggcaggccg gcgaccccgg cgtcgaagat 5640
gttggggtgt tgcagcagga tgctctccag ttcggctggg gctacctggt agcccttgta 5700
tttgatcagg ctcttcagcc ggtccacgat gaagaagtgc tcgtcctcgt cccagtaggc 5760
gatgtcgccg ctgtgcagcc agccgtcctt gtcgatgaga gcgtttgtag cctcggggtt 5820
gttaacgtag ccgctcatga tcatggggcc acggacgcac agctcgccgc gctggttcac 5880
acccagtgtc ttaccggtgt ccaagtccac caccttagcc tcgaagaagg gcaccacctt 5940
gcctactgcg ccaggcttgt cgtccccttc gggggtgatc agaatggcgc tggttgtttc 6000
tgtcaggccg tagccctggc ggatgcctgg taggtggaag cgtttggcca cggcctcacc 6060
tacctccttg ctgagcggcg ccccgccgct ggcgatctcg tgcaagttgc ttaggtcgta 6120
cttgtcgatg agagtgctct tagcgaagaa gctaaatagt gtgggcacca gcagggcaga 6180
ttgaatctta tagtcttgca agctgcgcaa gaatagctcc tcctcgaagc ggtacatgag 6240
cacgacccga aagccgcaga tcaagtagcc cagcgtggtg aacatgccga agccgtggtg 6300
aaatggcacc acgctgagga tagcggtgtc ggggatgatc tggttgccga agatggggtc 6360
gcgggcatga ctgaatcgga cacaagcggt gcggtgcggt agggctacgc ccttgggcaa 6420
tccggtactg ccactactgt tcatgatcag ggcgatggtt ttgtcccggt cgaagctctc 6480
gggcacgaag tcgtactcgt tgaagccggg tggcaaatgg gaagtcacga aggtgtacat 6540
gctttggaag ccctggtagt cggtcttgct atccatgatg atgatctttt gtatgatcgg 6600
tagcttcttt tgcacgttga ggatcttttg cagccctttc ttgctcacga atacgacggt 6660
gggctggctg atgcccatgc tgttcagcag ctcgcgctcg ttgtagatgt cgttagctgg 6720
ggccacagcc acaccgatga acagggcacc caacacgggc atgaagaact gcaagctatt 6780
ctcgctgcac accacgatcc gatggtttgt attcagccca tagcgcttca tagcttctgc 6840
cagccgaacg ctcatctcga agtactcggc gtaggtaatg tccacctcga tatgtgcgtc 6900
ggtaaaggcg atggtgccgg gcaccagggc gtagcgcttc atggctttgt gcagctgctc 6960
gccggcggtc ccgtcttcga gtgggtagaa tggcgctggg cccttcttaa tgtttttggc 7020
atcttccata ggaccggggt tttcttccac gtctcctgct tgctttaaca gagagaagtt 7080
cgtggctccg gatccggcgg cggttacgaa ctccagcagg accatgtgat cgcgcttctc 7140
gttggggtct ttgctcaggg cggactgatg gctcaggtag tggttgtcgg gcagcagcac 7200
ggggccgtcg ccgatggggg tgttctgctg gtagtggtcg gcgagctgca cgctgccgtc 7260
ctcaacgttg tggcggatct tgaagttagc cttgatgccg ttcttctgct tgtcggccgt 7320
gatatagacg ttgtggctgt tgaagttgta ctccagcttg tgccccagga tgttgccgtc 7380
ctccttgaag tcgatgccct tcagctcgat gcggttcacc agggtgtcgc cctcgaactt 7440
cacctcggcg cgggtcttgt aggtaccgtc gtccttgaaa gagatggtgc gctcctggac 7500
gtagccttcg ggcatggcgg acttgaagaa gtcgtgctgc ttcatgtggt cggggtagcg 7560
gctgaagcag gccacgccgt agccgaaggt ggtcacgagg gtgggccagg gcacgggcag 7620
cttgccggtg gtgcagatga acttcagggt cagcttgccg ttggtggcat cgccctcgcc 7680
ctcgccgcgg acgctgaact tgtggccgtt tacgtcgccg tccagctcga ccaggatggg 7740
caccaccccg gtgaacagct cctcgccctt gctcaccatg tccacgccgt cgtcgttcag 7800
gttgtccttg cgcttgctct tgatgcagcc catggtggcg gcggtcacca cgcgtccgcg 7860
atctgacggt tcactaaacg agctctgctt atataggcct cccaccgtac acgccacctc 7920
gacatactcg agtttactcc ctatcagtga tagagaacgt atgaagagtt tactccctat 7980
cagtgataga gaacgtatgc agactttact ccctatcagt gatagagaac gtataaggag 8040
tttactccct atcagtgata gagaacgtat gaccagttta ctccctatca gtgatagaga 8100
acgtatctac agtttactcc ctatcagtga tagagaacgt atatccagtt tactccctat 8160
cagtgataga gaacgtataa gctttaggcg tgtacggtgg gcgcctataa aagcagagct 8220
cgtttagtga accgtcagat cgcctggagc aattccacaa cacttttgtc ttataccaac 8280
tttccgtacc acttcctacc ctcgtaaaca gctggccgcc accatgaagt tatgggatgt 8340
cgtggctgtc tgcctggtgc tgctccacac cgcgtccgcc ttcccgctgc ccgccggtaa 8400
gaggcctccc gaggcgcccg ccgaagaccg ctccctcggc cgccgccgcg cgcccttcgc 8460
gctgagcagt gactcaaata tgccagagga ttatcctgat cagttcgatg atgtcatgga 8520
ttttattcaa gccaccatta aaagactgaa aaggtcacca gataaacaaa tggcagtgct 8580
tcctagaaga gagcggaatc ggcaggctgc agctgccaac ccagagaatt ccagaggaaa 8640
aggtcggaga ggccagaggg gcaaaaaccg gggttgtgtc ttaactgcaa tacatttaaa 8700
tgtcactgac ttgggtctgg gctatgaaac caaggaggaa ctgattttta ggtactgcag 8760
cggctcttgc gatgcagctg agacaacgta cgacaaaata ttgaaaaact tatccagaaa 8820
tagaaggctg gtgagtgaca aagtagggca ggcatgttgc agacccatcg cctttgatga 8880
tgacctgtcg tttttagatg ataacctggt ttaccatatt ctaagaaagc attccgctaa 8940
aaggtgtgga tgtatctgat tcgaaagccg cactcctcat aatcaacctc tggattacaa 9000
aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata 9060
cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc 9120
cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg 9180
tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac 9240
ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat 9300
cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt 9360
ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg ccacctggat 9420
tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc 9480
ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag 9540
tcggatctcc ctttgggccg cctccccgca ggccgcacac ctcaggtgca ggctcgaaat 9600
ttaaatcctc gagggccgca ctcctcaggt gcaggctgcc tatcagaagg tggtggctgg 9660
tgtggccaat gccctggctc acaaatacca ctgagatctt tttccctctg ccaaaaatta 9720
tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc taataaagga aatttatttt 9780
cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc ggaaggacat atgggagggc 9840
aaatcattta aaacatcaga atgagtattt ggtttagagt ttggcaacat atgccatatg 9900
ctggctgcca tgaacaaagg tggctataaa gaggtcatca gtatatgaaa cagccccctg 9960
ctgtccattc cttattccat agaaaagcct tgacttgagg ttagattttt tttatatttt 10020
gttttgtgtt atttttttct ttaacatccc taaaattttc cttacatgtt ttactagcca 10080
gatttttcct cctctcctga ctactcccag tcatagctgt ccctcttctc ctgcagatat 10140
ctataacaag aaaatatata tataataagt tatcacgtaa gtagaacatg aaataacaat 10200
ataattatcg tatgagttaa atcttaaaag tcacgtaaaa gataatcatg cgtcattttg 10260
actcacgcgg tcgttatagt tcaaaatcag tgacacttac cgcattgaca agcacgcctc 10320
acgggagctc caagcggcga ctgagatgtc ctaaatgcac agcgacggat tcgcgctatt 10380
tagaaagaga gagcaatatt tcaagaatgc atgcgtcaat tttacgcaga ctatctttct 10440
agggttaagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct 10500
cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg 10560
agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct 10620
gtcgtgccag cggatccgca tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg 10680
cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt 10740
ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca gaagtagtga 10800
ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagctaa cttgtttatt gcagcttata 10860
atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 10920
attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atccgctgca 10980
ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc 11040
ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 11100
aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 11160
aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 11220
gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 11280
gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 11340
tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 11400
ttctcaatgc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 11460
ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 11520
tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 11580
tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 11640
ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 11700
aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 11760
ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 11820
tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 11880
atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 11940
aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat 12000
ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac 12060
tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg 12120
ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag 12180
tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt 12240
aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt 12300
gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt 12360
tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt 12420
cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct 12480
tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt 12540
ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac 12600
cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa 12660
actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa 12720
ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca 12780
aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct 12840
ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 12900
atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc 12960
tg 12962
<210> 2
<211> 27368
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
accagcctgc gctcctggcg ccctcatgtc ttcacgggac tccccgcgcc ggttgacgtg 60
gtgtctcgtt cggatctcca ggcaagacct cagctccggc agcagcatca gacaaaccag 120
tctcgtgctc ccaggcagtg cgcccagagg aggcgcagag cgcggcagct gccgctgagc 180
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gccgccgcct ccagcgcgcc cttgctgccc cgcgcgaccc caggattgcg aactcttgcc 420
cctgacctgt tgggcggggc tccgcgctcc agccatcagc ccggatgggt ctcctggctg 480
ggacttgggg cacctggagt taatgtccaa cctagggtct gcggagaccc gatccgaggt 540
aagtgaggga gcgggccggg gagcagggag cgggtggtgc ctgcgtcgcg ggtgggtgcg 600
gccggctgaa gggcgcccta gtcagagggg tgcgtctgga ccccagagca aacggtgaga 660
gtagaaagtg gaaagactag agggaaccta agctatgcga ggagagagaa aagtagaacc 720
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ccgccgtcga aatgtgtcct ctctggacgt gcagagatac tatcattgcc aagagtgcaa 960
cttactattg agcttgtttt gatctgtgcc aaggaaaagc gcaggccggg ggaggggctg 1020
ctgcaaaggt gctgagaacc taaaaatgga gggctcacct cctccgggcg aggtctggca 1080
aagctacatt cctcacccgg ttgcctgcac gttcctaacg ccctccaccc caactaacca 1140
tccccgtcga ggttaggaga ggggctttct tgccagtcct ggattcaaat ctctgtctcg 1200
aacgtattct tgagactcca ctaggccatt gaggttatta ttttaatgac ccctttttct 1260
cctgtactct gtgccgcctt ccaaaaacac cccaccacca ctgccactac tttacaccac 1320
ctcgaggcta attccgcact ggtggtttgt ttcctgcccc aacgaagaaa aacgaaccct 1380
cttcgggctg gaaacggact ttcgcgggtt cccgccagct tcctggggcc cagctagttt 1440
cggctttggt agaatccgcc gccaggaccc atgtgcgcgc ccccgggggg cttacccatc 1500
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ttcaaggaag agatgtttct tccaacctca ttcacgcacc cagtcccgca aagccgtcaa 1680
agccggcctc gaccaaactc gtactgtttc gctgcgcctt cgctttgtca gggaaggtgg 1740
cgccttttca acaagtaaca agtgtccgat ctctgggaag tccgccgtgt ccctagccct 1800
ttcccgctag caattcgggt gctctcgggc ctggaacctg gccctttaaa cagaccgctt 1860
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cagttatggg gggttgaggg gagaataagt cctctgtcag tcaaggacac gaagcatagt 1980
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aaaaaaaaaa ccgagtttat agcaaacccg tctccccgcc ccaccgcctc ctttttctct 2100
ctctgagacc tggatcttga aggcaaagcc caaacaaacc tcccagcctg ccaggcacaa 2160
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gagacgaacc ctgggattag gaaggcactg gataacactg caccccaaga tgcctcggtt 4020
cttccccgtc tcctcattgg ttggaactcg cccccaaatt tacagcccct ttttctaacc 4080
cacccccagc tgcgtggccc tcctttgtag gggtgtgagg attgagaagc caaacagagc 4140
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gccaaaagtc tccaagtccc tgctaacttc ttgctctcgc aacagaatac ctatttaggt 4620
gggaagaatg aggtgtgggc ggcaggctgg gtgagtggtg cccccgagcc tgccctcgac 4680
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tgatcccctt cccccaaaat acccaaattc ttcatggttc tgcccttctc tgtcctttct 26820
gctccccttg ctcgcctggg aaatggagga aaggccttcc ctctcacact gtcttgggat 26880
cttgctgaga attcagactg ctcgaaacag tgacaaaccc cagccatcca gtcattcgtg 26940
gagcacaatt tggatgtggc cccaggggca tctgtcccat tcagagaacc ttggcagtgc 27000
gatggccact gttcccaggc ttcaacctca gtgacccccc ccaacaactc cccatggaga 27060
gtccctgccc aaaaaagctg taggatccaa ggggtgtcaa tagctcgttc ccggcatcac 27120
ctacacacca caagcaggtt ttaatggaag caagttgctc caccaaatcc acaaaagggt 27180
aaagtttgtg atttttcttt atcattgcga tcaccatctg ataccgtaag gagtgcactt 27240
gtttggaagt tctgacttct ctgatctgtc ttggtcgttt gtgttataaa accaaagttc 27300
tctacagact ttatttttgt acaatatcat tttgtaactt tttacaaata aaaactcatt 27360
tctattgc 27368
<210> 3
<211> 4171
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
agcctgcgct cctggcgccc tcatgtcttc acgggactcc ccgcgccggt tgacgtggtg 60
tctcgttcgg atctccaggc aagacctcag ctccggcagc agcatcagac aaaccagtct 120
cgtgctccca ggcagtgcgc ccagaggagg cgcagagcgc ggcagctgcc gctgagccgc 180
ccgcagcgcc ccgggcccgc gcagccccag ccaagagcgc gacgcgcgca gccctgtcag 240
ccccccaccc aaagcagcgg cggctgctcg gacctcggct tctgggggtg cgggggcccg 300
gcgggagagt tgccggcagc cctcgccctg ttggcggcgg cggcggcggg agtcttggcc 360
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gacctgttgg gcggggctcc gcgctccagc catcagcccg gatgggtctc ctggctggga 480
cttggggcac ctggagttaa tgtccaacct agggtctgcg gagacccgat ccgaggtgcc 540
gccgccggac gggactttaa gatgaagtta tgggatgtcg tggctgtctg cctggtgctg 600
ctccacaccg cgtccgcctt cccgctgccc gccggtaaga ggcctcccga ggcgcccgcc 660
gaagaccgct ccctcggccg ccgccgcgcg cccttcgcgc tgagcagtga ctcaaatatg 720
ccagaggatt atcctgatca gttcgatgat gtcatggatt ttattcaagc caccattaaa 780
agactgaaaa ggtcaccaga taaacaaatg gcagtgcttc ctagaagaga gcggaatcgg 840
caggctgcag ctgccaaccc agagaattcc agaggaaaag gtcggagagg ccagaggggc 900
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tatgaaacca aggaggaact gatttttagg tactgcagcg gctcttgcga tgcagctgag 1020
acaacgtacg acaaaatatt gaaaaactta tccagaaata gaaggctggt gagtgacaaa 1080
gtagggcagg catgttgcag acccatcgcc tttgatgatg acctgtcgtt tttagatgat 1140
aacctggttt accatattct aagaaagcat tccgctaaaa ggtgtggatg tatctgactc 1200
cggctccaga gactgctgtg tattgcattc ctgctacagt gcaaagaaag ggaccaaggt 1260
tcccaggaaa tgtttgccca gaatggaaga tgaggaccaa ggaggcggag gaggaggaag 1320
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ttgccaccat ttcagctgat acagtccacc atcactgatt accggcgcgg ttgcggtgga 1560
tgcacttgaa ccaaaccagt gtatctcctg tgatttgttt tcatgtgtcc gaagacacca 1620
gggaaacaga gatcctggtg ttgttccttg ttattacgtt ttactgctga aagtaagagg 1680
tttatttttc tgtcactcag tggagacata ccctggaaag gagaggggaa aaaaaaagca 1740
aagatacaag agataatcac ctttgcattt gaaagttgag gcccgaggtt tactacaacc 1800
agcatttttg ccaacggttg gtgattgatt tccatcacgg tgtgtggggt gggaagaagt 1860
tggctaggaa ccaaaaaggc tgtgctcatg attaaacaca aacctgaagg tatttccttt 1920
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gagacagatg ttacataacc agctccgttg atgcgtggtc accagtgacc agagaagcta 2100
ctcgatgcaa tgcatctgtt tcagatacag aaatatagag aagatattta ttgaaattta 2160
agttattgtt atttattacc gttcactaat gaatttctct tttttccctt atttattaaa 2220
gtttcttttc aaaggtgcca aagtatatgt gctcgcaaaa tgcaaagaaa ggtgacaaaa 2280
ggaaatttga attgggaaca agggtccatg cttttcaaag tattaaaaag ttttttgcca 2340
ggcaaaaatc acttacttta cctttttaag aaaatttgtc attaattttc cccagatttc 2400
agcatttttc ccaattttta tttgtggagc atctcaggca agcccccttt cctggagcag 2460
cgtgcagaga ccactggcac ttgactttat ttcttccttg ctccattgct gaacagaaat 2520
gtcgtgggct ccacttcctg ttgtctttaa gctcttagtc ccctccacgt atacctatct 2580
gtactatgca taaccatatg tagaaaaggt tcagttcctt ttagtaggta gtcctggatt 2640
taatgctgac ctaaaagtaa tgtcgacaat gctgtcaggt agctgccgtt ctaccgactc 2700
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caccgggggt caacagctgc tgctcctata tacccaaaca cctgacagct ccctggggag 2880
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cttgagtcca gaaggtcgag gctgcagtga gctgtgatca tgccactgca ctccagccta 3240
agtgacagtg cggtaccctg tctcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaagag gttggagcag 3300
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actatgacag atttagcaat taaatgaaat actggcctcc atcaaataat catagtaaca 3540
agaagcagca gttaccagac atctgatccc cttcccccaa aatacccaaa ttcttcatgg 3600
ttctgccctt ctctgtcctt tctgctcccc ttgctcgcct gggaaatgga ggaaaggcct 3660
tccctctcac actgtcttgg gatcttgctg agaattcaga ctgctcgaaa cagtgacaaa 3720
ccccagccat ccagtcattc gtggagcaca atttggatgt ggccccaggg gcatctgtcc 3780
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cccccaacaa ctccccatgg agagtccctg cccaaaaaag ctgtaggatc caaggggtgt 3900
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ctgataccgt aaggagtgca cttgtttgga agttctgact tctctgatct gtcttggtcg 4080
tttgtgttat aaaaccaaag ttctctacag actttatttt tgtacaatat cattttgtaa 4140
ctttttacaa ataaaaactc atttctattg c 4171
<210> 4
<211> 211
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr
1 5 10 15
Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Pro Pro Glu Ala Pro
20 25 30
Ala Glu Asp Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Ala Pro Phe Ala Leu Ser
35 40 45
Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val
50 55 60
Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser Pro Asp
65 70 75 80
Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala
85 90 95
Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg
100 105 110
Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr
115 120 125
Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr
130 135 140
Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu
145 150 155 160
Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln
165 170 175
Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp
180 185 190
Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys
195 200 205
Gly Cys Ile
210
<210> 5
<211> 11360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
cagtactaag ctttactagg gacaggattg gtgacagaaa agccccatcc ttaggcctcc 60
tccttcctag tctcctgata ttgggtctaa cccccacctc ctgttaggca gattccttat 120
ctggtgacac acccccattt cctggagcca tctctctcct tgccagaacc tctaaggttt 180
gcttacgatg gagccagaga ggatcctggg agggagagct tggcaggggg tgggagggaa 240
gggggggatg cgtgacctgc ccggttctca gtggccaccc tgcgctaccc tctcccagaa 300
cctgagctgc tctgacgcgg ctgtctggtg cgtttcactg atcctggtgc tgcagcttcc 360
ttacacttcc caagaggaga agcagtttgg aaaaacaaaa tcagaataag ttggtcctga 420
gttctaactt tggctcttca cctttctagt ccccaattta tattgttcct ccgtgcgtca 480
gttttacctg tgagataagg ccagtagcca gccccgtcct ggcagggctg tggtgaggag 540
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tcgtggccgc ctctactccc tttctctttc tccatccttc tttccttaaa gagtccccag 660
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tgggcttctg ggtttgagtc cttggcaagc ccaggagagg cgctcaggct tccctgtccc 780
ccttcctcgt ccaccatctc atgcccctgg ctctcctgcc ccttccctac aggggttcct 840
ggctctgctc taagggcaag ggcgaattcg cggccgctaa attcaattcg ccctatagtg 900
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aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct atacgtacgg cagtttaagg 1080
tttacaccta taaaagagag agccgttatc gtctgtttgt ggatgtacag agtgatatta 1140
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accgcgaaaa tgacatcaaa aacgccatta acctgatgtt ctggggaata taaatgtcag 1380
gcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt cacgtagaaa gccagtccgc 1440
agaaacggtg ctgaccccgg atgaatgtca gctactgggc tatctggaca agggaaaacg 1500
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caggccggtg atggtcttct tcatcacggg gccgtcgttg gggaagttgc ggcccttgta 6420
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gttcaccacg ccctccaggt tcaccttgaa gctcatgatc tcctgcaggc cggtgttctt 6780
caggatctgc ttgctcacca tggtgctagc aaccggtacc cggggatcct ctagagtcga 6840
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gcgttggccg ccttggggtg ctgggcccgg gggctggggg cgcgcgccgt ggcccccgcg 8040
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agatctaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaggcaatag catcacaaat 8220
ttcacaaata aggcattttt ttcactgcat tctagttttg gtttgtccaa actcatcaat 8280
gtatcttatc atgtctggat cttacccggg gagcatgtca aggtcaaaat cgtcaagagc 8340
gtcagcaggc agcatatcaa ggtcaaagtc gtcaagggca tcggctggga gcatgtctaa 8400
gtcaaaatcg tcaagggcgt cggtcggccc gccgctttcg cactttagct gtttctccag 8460
gccacatatg attagttcca ggccgaaaag gaaggcaggt tcggctccct gccggtcgaa 8520
cagctcaatt gcttgtttca gaagtggggg catagaatcg gtggtaggtg tctctctttc 8580
ctcttttgct acttgatgct cctgttcctc caatacgcag cccagtgtaa agtggcccac 8640
ggcggacaga gcgtacagtg cgttctccag ggagaagcct tgctgacaca ggaacgcgag 8700
ctgattttcc agggtttcgt actgtttctc tgttgggcgg gtgccgagat gcactttagc 8760
cccgtcgcga tgtgagagga gagcacagcg gtatgacttg gcgttgttcc gcagaaagtc 8820
ttgccatgac tcgccttcca gggggcagga gtgggtatga tgcctgtcca gcatctcgat 8880
tggcagggca tcgagcaggg cccgcttgtt cttcacgtgc cagtacaggg taggctgctc 8940
aactcccagc ttttgagcga gtttccttgt cgtcaggcct tcgataccga ctccattgag 9000
taattccaga gcagagttta tgactttgct cttgtccagt ctagacatgg taattcgatg 9060
atccccctgg ggagagaggt cggtgattcg gtcaacgagg gagccgactg ccgacgtgcg 9120
ctccggaggc ttgcagaatg cggaacaccg cgcgggcagg aacagggccc acactaccgc 9180
cccacacccc gcctcccgca ccgccccttc ccggccgctg ctctcggcgc gccctgctga 9240
gcagccgcta ttggccacag cccatcgcgg tcggcgcgct gccattgctc cctggcgctg 9300
tccgtctgcg agggtactag tgagacgtgc ggcttccgtt tgtcacgtcc ggcacgccgc 9360
gaaccgcaag gaaccttccc gacttagggg cggagcagga agcgtcgccg gggggcccac 9420
aagggtagcg gcgaagatcc gggtgacgct gcgaacggac gtgaagaatg tgcgagaccc 9480
agggtcggcg ccgctgcgtt tcccggaacc acgcccagag cagccgcgtc cctgcgcaaa 9540
cccagggctg ccttggaaaa ggcgcaaccc caaccccgtg gaattatcac ctcgagaata 9600
aaatatcttt attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg atagtactaa 9660
catacgctct ccatcaaaac aaaacgaaac aaaacaaact agcaaaatag gctgtcccca 9720
gtgcaagtgc aggtgccaga acatttctct ctcgagttta ctccctatca gtgatagaga 9780
acgtatgaag agtttactcc ctatcagtga tagagaacgt atgcagactt tactccctat 9840
cagtgataga gaacgtataa ggagtttact ccctatcagt gatagagaac gtatgaccag 9900
tttactccct atcagtgata gagaacgtat ctacagttta ctccctatca gtgatagaga 9960
acgtatatcc agtttactcc ctatcagtga tagagaacgt ataagctttg cttatgtaaa 10020
ccagggcgcc tataaaagag tgctgatttt ttgagtaaac ttcaattcca caacactttt 10080
gtcttatacc aactttccgt accacttcct accctcgtaa agaattcgga tcccgtcgag 10140
aattagcttc gccaccatga agttatggga tgtcgtggct gtctgcctgg tgctgctcca 10200
caccgcgtcc gccttcccgc tgcccgccgg taagaggcct cccgaggcgc ccgccgaaga 10260
ccgctccctc ggccgccgcc gcgcgccctt cgcgctgagc agtgactcaa atatgccaga 10320
ggattatcct gatcagttcg atgatgtcat ggattttatt caagccacca ttaaaagact 10380
gaaaaggtca ccagataaac aaatggcagt gcttcctaga agagagcgga atcggcaggc 10440
tgcagctgcc aacccagaga attccagagg aaaaggtcgg agaggccaga ggggcaaaaa 10500
ccggggttgt gtcttaactg caatacattt aaatgtcact gacttgggtc tgggctatga 10560
aaccaaggag gaactgattt ttaggtactg cagcggctct tgcgatgcag ctgagacaac 10620
gtacgacaaa atattgaaaa acttatccag aaatagaagg ctggtgagtg acaaagtagg 10680
gcaggcatgt tgcagaccca tcgcctttga tgatgacctg tcgtttttag atgataacct 10740
ggtttaccat attctaagaa agcattccgc taaaaggtgt ggatgtatct gaggatcaat 10800
tcacgcgtgg tacctctaga gtcgaccccc ctcgagggaa ttccgataat caacctctgg 10860
attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat 10920
gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt 10980
tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca 11040
ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg 11100
ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg 11160
aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca 11220
attccgtggt gttgtcgggg aagctgacgt cctttccatg gctgctcgcc tgtgttgcca 11280
cctggattct gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc 11340
ttccttcccg cggcgtcgac 11360
Claims (33)
- 일정량의 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 제공하는 단계;
RHO 키나제 억제제의 존재 하에 iPSC를 배양하는 단계;
단층을 생성하는 단계;
LDN 및 SB의 존재 하에 추가로 배양하는 단계;
추가로 FGF, EGF 및 LIF의 존재 하에 배양하여 iPSC-유래 신경 전구 세포 (NPC)를 생성하는 하는 단계
을 포함하는, 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 NPC를 생성하는 방법. - 제1항에 있어서, 일정량의 iPSC를 제공하는 단계는 현탁액 중의 iPSC를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단층의 생성하는 단계는 배양된 iPSC를 진탕시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, LDN 및 SB의 존재 하에서의 추가로 배양하는 단계는 7-13일 동안 수행되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, FGF, EGF, 및 LIF의 존재 하에서의 추가 배양하는 단계는 신경 전구 세포를 생성하는 것인 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 iPSC-유래 NPC가 신경구로서 응집되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 iPSC-유래 NPC가 생착 iPSC-유래 NPC인 방법.
- 제1항의 방법에 의해 제조된 일정량의 iPSC-유래 NPC를 제공하는 단계;
적어도 2개의 벡터를 iPSC-유래 NPC에 도입하는 단계
를 포함하는 방법. - 제8항에 있어서, 적어도 2개의 벡터를 도입하는 단계는 뉴클레오펙션, 트랜스펙션 및 전기천공 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 적어도 2개의 벡터가 piggyBac 벡터 및 pBase 벡터를 포함하는 것인 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 piggyBac 벡터가
구성적 프로모터,
tet 반응성 요소를 포함하는 유도성, 양방향 폴리시스트론 프로모터, 및
단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 서열
을 포함하는 발현 카세트,
상기 발현 카세트를 플랭킹하는 2개의 트랜스포존 요소,
적어도 하나의 상동 재조합 서열
을 포함하는 것인 방법. - 제11항에 있어서, 상기 단백질 또는 펩티드가 신경영양 인자를 포함하는 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 신경영양 인자가 신경교 유래 신경영양 인자 (GDNF)를 포함하는 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 상동 재조합 서열이 게놈 세이프 하버를 표적화할 수 있는 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 게놈 세이프 하버가 아데노-연관 바이러스 부위 1 (AAVS1), 케모카인 (C-C 모티프) 수용체 5 (CCR5) 유전자, 마우스 Rosa26 유전자좌의 인간 이종상동체 중 하나인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 신경 전구 세포가 생착 신경 전구 세포인 방법.
- 제1항의 방법에 의해 제조된 일정량의 세포.
- 제17항에 있어서, 상기 세포는 게놈적으로 통합된 발현 카세트를 발현하는 일정량의 세포.
- 제18항에 있어서, 상기 게놈적으로 통합된 발현 카세트가 게놈 세이프 하버에 있는 것인, 일정량의 세포.
- 제1항의 방법에 의해 제조된 일정량의 iPSC-유래 NPC를 제공하는 단계;
적어도 하나의 벡터를 iPSC-유래 NPC에 도입하는 단계
를 포함하는 방법. - 제20항에 있어서, 적어도 하나의 벡터를 도입하는 단계는 뉴클레오펙션, 트랜스펙션 및 전기천공 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 적어도 하나의 벡터가
단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 구성적 또는 유도성 프로모터
를 포함하는 발현 카세트;
적어도 하나의 상동 재조합 서열
을 포함하는 것인 방법. - 제22항에 있어서, 상기 단백질 또는 펩티드가 신경영양 인자를 포함하는 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 신경영양 인자가 신경교 유래 신경영양 인자 (GDNF)를 포함하는 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 구성적 프로모터가 3-포스포글리세레이트 키나제 (PGK 프로모터)인 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 상동 재조합 서열이 게놈 세이프 하버를 표적화할 수 있는 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 게놈 세이프 하버가 아데노-연관 바이러스 부위 1 (AAVS1), 케모카인 (C-C 모티프) 수용체 5 (CCR5) 유전자, 마우스 Rosa26 유전자좌의 인간 이종상동체 중 하나인 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 유도성 프로모터가 테트라사이클린-계열 항생제에 의해 조절되는 프로모터를 포함하는 것인 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 테트라사이클린-계열 항생제가 독시사이클린을 포함하는 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 유도성 프로모터가 역 테트라사이클린-제어된 전사활성화제 (rtTA) 또는 tet-On 고급 전사활성화제 (rtTA2S-M2)에 의해 조절되는 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 iPSC-유래 NPC가 생착 iPSC-유래 NPC인 방법.
- 상기 iPSC-유래 NPC가 게놈적으로 통합된 발현 카세트를 발현하는 것인, 제20항의 방법에 의해 제조된 일정량의 세포.
- 제32항에 있어서, 상기 게놈적으로 통합된 발현 카세트가 게놈 세이프 하버에 있는 것인 일정량의 세포.
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