CN111867617A - 用于神经营养因子的诱导型表达的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)的递送已向帕金森病患者提供了益处，并且目前正在针对ALS患者的1/2a期临床试验中进行测试。然而，长期的营养因子递送在副作用的事件中关闭或阻止剂量调整。为了解决这一点，本发明人设计了稳定整合的、第三代强力霉素调节的载体，允许治疗分子的诱导型的和可逆的表达。将源自人iPSC的神经祖细胞用该载体稳定转染，扩增并移植到成年小鼠脑中。本发明人观察到，强力霉素的添加和去除引起GDNF表达可被诱导和逆转多次，表明强力霉素可穿透移植物并在体内调节转基因表达。本发明人的发现提供了基因和干细胞疗法相组合以有效调节移植的细胞中的异位蛋白表达的构思的证明。

Description

用于神经营养因子的诱导型表达的组合物和方法
关于联邦资助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的CA202900的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本文描述的是经工程化以诱导方式表达异位蛋白的细胞。该请求保护的发明涉及再生医学和包括神经退行性病变在内的退行性疾病的技术领域。
背景技术
肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是快速发展的疾病，因此，无需考虑连续给药的任何长期影响，组成型营养因子释放可能就足够。相比之下，许多其它的具有较长的存在期限的神经系统疾病可能不需要持续的生长因子分泌，或者长期的递送可能是不利的。确实，对在尾壳核中仅临时接受GDNF的帕金森病患者进行的事后分析显示了持续的神经元发芽，其可能解释了GDNF递送停止后的维持作用。此外，在禁忌症的情况下，组成型生长因子的释放不允许停止。例如，试验报告了接受GDNF的一些患者出现了Lhermitte氏症状。此外，持续的GDNF表达可引起靶向的神经元的异常发芽和脱敏。重要的是，GDNF停止后这些作用会逆转。总体而言，在这些类型的临床应用中对于生长因子调节存在明确的理由，并且在本领域中强烈需要实现这些目的的组合物和技术。
组合的细胞和基因治疗方法既可以使细胞生态位恢复活力，又可以为患病的宿主细胞提供治疗性分子，是用于神经紊乱的有前途的新的治疗方法。本发明人的小组已广泛使用经遗传学工程化以稳定产生GDNF的人神经祖细胞，并示出其存活、迁移、释放GDNF并保护退化的神经元。关键的是，这些细胞已被证实是安全的，并且是非致瘤性的，因此正被用于FDA批准的第一个细胞和基因疗法的1/2a期临床试验中，以保护ALS患者的运动神经元。
米非司酮、雷帕霉素或四环素(Tet及其类似物强力霉素，dox)等外部因素可用于调节基因表达。通过啮齿动物中的直接的基因转移而递送的神经营养因子(例如GDNF)已经得到调节，但对于经工程化以释放神经营养因子(例如GDNF)的植入的人神经细胞而言尚未实现。最后，可能需要重复的开关灵活性的需求，但该领域中的当前标准是在单个周期内仅诱导或抑制基因。
本文描述的是用于诱导和逆转移植到成年小鼠脑中的源自人诱导多能干细胞(iPSC)的神经祖细胞(iNPC)中的GDNF表达的dox介导的方法。本发明人示出了dox给予可在体内诱导性地和可逆地调节GDNF的分泌。如此，本发明人证明了可将离体细胞工程化、基因调节和iPSC的强大技术组合起来作为治疗紊乱的独特方法，在该紊乱中可能期望经调节的蛋白递送。
发明内容
本文描述的是一种治疗方法，包括向患有疾病或病症的受试者给予一批量(aquantity of)的细胞，其中，所述细胞表达治疗蛋白或肽，并且进一步地，其中，所述细胞、治疗蛋白或肽、或者两者能够治疗疾病或病症。在其它实施方式中，细胞为神经谱系细胞。在其它实施方式中，神经谱系细胞为神经祖细胞。在其它实施方式中，神经祖细胞源自诱导多能干细胞(iPSC)。在其它实施方式中，细胞表达来自一种或多种载体的表达盒。在其它实施方式中，表达来自一种或多种载体的表达盒的细胞已被核转染、转染或电穿孔。在其它实施方式中，所述一种或多种载体包括piggyBac载体、pBase载体或两者。在其它实施方式中，piggyBac载体包含至少两个启动子，其中，至少一个启动子为诱导型的。在其它实施方式中，至少一个诱导型的启动子为多顺反子的。在其它实施方式中，至少一个诱导型的多顺反子启动子为双向的。在其它实施方式中，表达盒为基因组学上整合的。在其它实施方式中，表达盒编码治疗蛋白或肽。在其它实施方式中，治疗蛋白或肽包括神经营养因子。
在其它实施方式中，神经营养因子包括胶质源性神经营养因子(GDNF)。在其它实施方式中，该疾病或病症为神经退行性疾病。在其它实施方式中，神经退行性疾病为肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。在其它实施方式中，给予一批量的细胞包括注射。在其它实施方式中，该方法包括给予四环素、其类似物或衍生物，包括例如强力霉素。
还在本文描述的是一种方法，包括提供一批量的源自诱导多能干细胞(iPSC)的细胞，以及将至少两种载体引入源自iPSC的细胞中。在其它实施方式中，源自iPSC的细胞为神经祖细胞。在其它实施方式中，引入至少两种载体包括核转染、转染和电穿孔中的一种或多种。在其它实施方式中，至少两种载体包括piggyBac载体和pBase载体。在其它实施方式中，piggyBac载体包括表达盒(其包括组成型启动子、包含tet应答元件的诱导型的启动子和编码蛋白或肽的序列)、两个转座子元件，其中两个转座子元件侧接于所述表达盒。在各种实施方式中，诱导型的启动子为双向多顺反子启动子。在其它实施方式中，蛋白或肽包括神经营养因子。在其它实施方式中，神经营养因子包括胶质源性神经营养因子(GDNF)。本文进一步描述的是通过前述方法制备的一批量的细胞，其中，源自iPSC的细胞表达基因组学上整合的表达盒。
本文描述的是一种方法，包括向患有神经退行性疾病的受试者给予一批量的源自诱导多能干细胞的神经祖细胞(iNPC)，其中，所述细胞诱导性地表达能够治疗该疾病的神经营养因子。在其它实施方式中，iNPC表达通过核转染引入的基因组学上整合的表达盒，所述表达盒包括组成型启动子、包含tet应答元件的诱导型的启动子以及编码胶质源性神经营养因子(GDNF)的序列。在各种实施方式中，诱导型启动子为双向多顺反子启动子。在其它实施方式中，该方法包括给予四环素、其类似物或衍生物，包括例如强力霉素。
还在本文描述的是能够诱导表达胶质源性神经营养因子(GDNF)的一批量的神经祖细胞，该神经祖细胞包括一批量的源自诱导多能干细胞的神经祖细胞(iNPC)，其中，iNPC表达基因组学上整合的表达盒，所述表达盒包括组成型启动子、包含tet应答元件的诱导型的启动子和编码GDNF的序列。在各种实施方式中，诱导型的启动子是双向多顺反子启动子。本文进一步描述的是使用上述的细胞治疗肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的方法。在各种实施方式中，基因组学上整合的表达盒缺少处于基因组学上整合的表达盒的10kb内的源自转座子的序列。在各种实施方式中，基因组学上整合的表达盒缺少处于基因组学上整合的表达盒的1kb内的源自转座子的序列。在各种实施方式中，基因组学上整合的表达盒缺少处于基因组学上整合的表达盒的10kb内的源自病毒的序列。在各种实施方式中，基因组学上整合的表达盒缺少处于在基因组学上整合的表达盒的1kb内的源自病毒的序列。
还在本文描述的是一种增加患有神经退行性紊乱的个体的中枢神经系统中的胶质源性神经营养因子(GDNF)水平的方法，该方法包括向该个体给予：一批量的源自诱导多能干细胞的神经祖细胞(iNPC)，其中，所述iNPC表达基因组学上整合的表达盒，所述表达盒包含组成型启动子、包含tet应答元件的诱导型的双向多顺反子启动子、以及编码GDNF的序列。在各种实施方式中，神经退行性疾病选自肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、帕金森氏病、亨廷顿氏病和阿尔茨海默氏病。在各种实施方式中，神经退行性紊乱为肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。在各种实施方式中，神经退行性紊乱为帕金森氏病。在各种实施方式中，神经退行性紊乱为阿尔茨海默氏病。在各种实施方式中，中枢神经系统包括大脑的区域。在各种实施方式中，大脑的区域包括黑质。在各种实施方式中，大脑的区域包括运动皮层。在各种实施方式中，大脑的区域包括内嗅皮层和/或海马体。在各种实施方式中，所述个体为人。在各种实施方式中，所述基因组学上整合的表达盒被整合在所述基因组的区域，伴随着包含所述基因组学上整合的表达盒的细胞的降低的致癌转化的可能性。在各种实施方式中，所述基因组学上整合的表达盒被整合在选自如下的基因组的区域：腺相关病毒位点1(AAVS1)、趋化因子(C-C基序)受体5(CCR5)基因、以及小鼠Rosa26基因座的人直系同源物。在各种实施方式中，基因组学上整合的表达盒被整合在腺相关病毒位点1(AAVS1)处。在各种实施方式中，基因组学上整合的表达盒被整合在趋化因子(C-C基序)受体5(CCR5)基因处。在各种实施方式中，基因组学上整合的表达盒通过同源重组进行整合。在各种实施方式中，基因组学上整合的表达盒缺少源自转座元件的序列。在各种实施方式中，基因组学上整合的表达盒通过转座子进行整合。在各种实施方式中，该方法进一步包括向个体给予四环素类抗生素，其中，四环素类抗生素在一批量的源自诱导多能干细胞的神经祖细胞中诱导GDNF mRNA的转录。在各种实施方式中，基因组学上整合的表达盒被整合为单拷贝。
还在本文描述的是一批量的源自诱导多能干细胞的神经祖细胞(iNPC)在增加患有神经退行性紊乱的个体的中枢神经系统中的胶质源性神经营养因子(GDNF)水平的方法中的用途，其中，iNPC表达基因组学上整合的表达盒，所述表达盒包括组成型启动子、包含tet应答元件的诱导型的双向多顺反子启动子、以及编码GDNF的序列。在各种实施方式中，神经退行性紊乱选自肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、帕金森氏病、亨廷顿氏病和阿尔茨海默氏病。在各种实施方式中，神经退行性紊乱为肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。在各种实施方式中，神经退行性紊乱为帕金森氏病。在各种实施方式中，神经退行性紊乱为阿尔茨海默氏病。在各种实施方式中，中枢神经系统包括大脑的区域。在各种实施方式中，大脑的区域包括黑质。在各种实施方式中，大脑的区域包括运动皮层。在各种实施方式中，大脑的区域包括内嗅皮层和/或海马体。在各种实施方式中，所述个体为人。在各种实施方式中，所述基因组学上整合的表达盒被整合在所述基因组的区域，伴随着包含所述基因组学上整合的表达盒的细胞的降低的致癌转化的可能性。在各种实施方式中，所述基因组学上整合的表达盒被整合在选自如下的基因组的区域：腺相关病毒位点1(AAVS1)、趋化因子(C-C基序)受体5(CCR5)基因、以及小鼠Rosa26基因座的人直系同源物。在各种实施方式中，基因组学上整合的表达盒被整合在腺相关病毒位点1(AAVS1)处。在各种实施方式中，基因组学上整合的表达盒被整合在趋化因子(C-C基序)受体5(CCR5)基因处。在各种实施方式中，基因组学上整合的表达盒通过同源重组进行整合。在各种实施方式中，基因组学上整合的表达盒缺少源自转座元件的序列。在各种实施方式中，基因组学上整合的表达盒通过转座子进行整合。在各种实施方式中，基因组学上整合的表达盒被整合为单拷贝。
附图说明
图1.pB-RTP-Tet-GDNF/memClover-FLuc载体的描述。
(A)pB-RTP-Tet-GDNF/memClover-FLuc质粒，其被设计用于在与pBase质粒组合转染时稳定整合到基因组中。
(B)pBase质粒
(C)组成型表达或仅在强力霉素存在下表达的转基因。
(D)用pB-RTP-Tet-GDNF/memClover-FLuc进行核感染并作为神经球生长的人iNPC的实时未染色荧光成像。
(E)将萤火虫荧光素酶活性归一化为iNPC中的海肾荧光素酶。N＝每个条件4次生物学重复。
(F)iNPC的活的培养物中的实时萤火虫荧光素酶活性。N＝每个条件3次生物学重复。误差棒代表平均值±SEM。
图2.强力霉素调节来自pB-RTP-Tet-GDNF/memClover-FLuc核转染的源自iPSC的NPC的GDNF表达。
在(A)不存在dox或(B)存在dox时生长的经核转染的iNPC
(C)在添加和去除dox后，在不存在dox时生长的经核转染的iNPC
(D)来自(A-C)中以及GDNF蛋白积聚7天的培养物中的细胞的经24小时孵育的培养基的ELISA。N＝每个条件3次生物学重复。误差棒代表平均值±SEM。**p<0.01，***p<0.001
图3.在源自iPSC的NPC移植物中，报告基因的转基因表达为诱导型的和可逆的。
(A)核转染、扩增、FACS、移植、治疗和事后分析的实验设计。
(B)在7周的体内实验期内，每组的一只动物(A组的#9动物和B组的#3动物)的每周生物发光成像。开/关按钮指示在成像之前的一周内动物是否接受了dox。
(C)所有动物的每周的生物发光活动的总结(N＝14)。由于观察到异常高的生物发光信号并且通过事后免疫组织化学未观察到诱导型的转基因信号，因此将一只动物(#13)从该分析中排除。误差棒代表平均值±SEM。
图4.强力霉素的给予介导了经移植的源自iPSC的NPC中的GDNF表达。
(A)在实验终点的#1动物[以关闭开始→打开→关闭→以打开终止]和(B)在实验终点的#7动物[以打开开始→关闭→打开→以关闭终止]的纹状体区域。
(C)(A)中的正方形区域的高放大倍数图像。粉色箭头表示在远离TagBFP+细胞的区域中的GDNF表达，表明宿主细胞摄取分泌的GDNF。
(D)(B)中的正方形区域的高放大倍数图像。注意：Clover信号和GDNF信号可能是背景给予重叠(B2/B3和D2/D3)。
图5.用pB-RTP-Tet-GDNF/memClover-FLuc核转染的源自IPSC的NPCs保留了其在添加dox后被诱导的能力。向细胞(核转染后在培养基中生长6个月)添加dox后24小时，83％的BFP+细胞也是GFP+(P5门)。注意：细胞还暴露至两个冷冻/解冻循环，并在此期间总共冷冻10个月。
图6.动物的GDNF DAB染色显示出以打开dox(on dox)终止试验的动物中的增高的信号。与图4相关。
图7.研究中使用的所有动物的纹状体/胼胝体区域的GDNF、SC121(人细胞质)和SC101(人细胞核)染色显示出，以打开dox终止试验的动物中的增高的GDNF信号。这些数据用于表2中所示的GDNF信号的盲分级(blinded grading)。(RH＝右半球；LH＝左半球)。
图8.AAVS1-teton-hGDNF的载体图谱。示出的是HA-L和HA-R臂，其为可用于靶向基因组安全港(如AAVS)的同源重组序列。
图9.诱导型GDNF表达的评估的方案。
图10.pDonor-Teton3g-2a-TagBFP-V5-nls-p2a-puroR WPRE_Insulatedmpclover-2a-luc2pest-2a-gdnf wpre的载体图谱。
图11.(A)人PPP1R12C基因的外显子1和2之间的内源性基因座的AAVS1靶向的示意图。最初，由报告基因/筛选盒(用于荧光和抗生素筛选的TagBFP2和PuroR)和组成型CAG启动子组成的接受者的“着陆位点”被稳定地整合；所述报告基因/筛选盒由与上游PPP1R12C连接的剪接受体驱动；所述组成型CAG启动子驱动侧接有LoxP和FRT位点的td-番茄红荧光顺反子。随后，在这些报道基因的稳定筛选后，将这些细胞用表达FlpO和Cre的质粒、将含有侧接筛选/报道基因盒的LoxP和FRT的供体质粒、以及含有dox诱导型的mpClover/Luc2p/GDNF顺反子的质粒进行脂质体转染。(B)在不存在和存在强力霉素时，细胞的透射光和绿色荧光成像证明了添加dox后24小时的mpClover的可诱导性和在不存在dox时的GFP“渗漏”的存在。此外，分选后约1周(以富集经转染的细胞)和转染后2周(以使mpClover群为稳定的转染)检查这些细胞。
具体实施方式
本文引用的所有参考文献以引用的方式将其整体并入本文，如同完全阐述一样。除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等，Dictionary of Microbiology and MolecularBiology，第三版，修订版，J.Wiley&Sons(纽约，NY 2006)；以及Sambrook和Russel，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第四版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(Cold Spring Harbor，NY，2012)向本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的一般指导。
本领域的技术人员将认识到可在本发明的实践中使用的与本文描述的那些相似或等同的许多方法和材料。实际上，本发明不以任何方式限于所描述的方法和材料。
术语“控制元件”统指启动子区域、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节结构域、复制起点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子等，其共同地提供受体细胞中的编码序列的复制、转录和翻译。只要所选择的编码序列能够在适当的宿主细胞中复制、转录和翻译，并非总是需要所有这些控制元件存在。
术语“启动子区域”在本文中以其通常的意义使用，是指包括DNA调节序列的核苷酸区域，其中，所述调节序列源自能够结合RNA聚合酶并启动下游(3'-方向)编码序列的基因。
“可操作地连接”是指元件的安排，其中，如此描述的组件被配置为执行其通常的功能。因此，可操作地连接至编码序列的控制元件能够实现编码序列的表达。控制元件不必与编码序列邻接，只要它们起到指导其表达的功能即可。因此，例如，可在启动子序列和编码序列之间存在中间的未翻译但被转录的序列，并且仍然可认为该启动子序列与编码序列“可操作地连接”。
使用源自干细胞的神经祖细胞向大脑递送营养因子是绕过血脑屏障的有效方式。在肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和帕金森氏病、亨廷顿氏病和阿尔茨海默氏病的疾病模型中，使用离体的遗传学上修饰的细胞将各种生长因子递送至受损部位已显示出支持宿主神经元。同时，胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)的递送为帕金森病患者带来了益处，并且目前正在针对ALS患者的1/2a期临床试验中进行测试。为了充分利用营养因子的益处并避开通过细胞递送的营养因子的不需要的有害作用，调节生长因子的分泌是多种神经退行性疾病的有希望的途径。由于基因表达和下游信号激活是紧密相连的过程，因此在副作用事件中，长期的营养因子递送会关闭或阻止剂量调整。缺乏对基因表达的时机和量级的控制可限制治疗的功效并引入非计划的细胞效应。
为此目的，在各种方法学中，四环素(Tet)调节系统已用于在时间和空间上调节基因表达。这包括细菌Tet反式激活因子(tTA)，以在存在强力霉素(dox)(Tet类似物)时沉默Tet调控的启动子下游的基因表达。除了此“Tet-Off”系统外，“Tet-On”系统还使用反向tTA(rtTA)以在存在dox时激活转基因表达。尚未探索在神经干细胞群中的tTA和rtTA变体的使用。
本文描述的是稳定整合的第三代强力霉素调节的载体，其允许治疗分子的诱导型的和可逆的表达。将源自人iPSC的神经祖细胞用该载体稳定转染，扩增并移植到成年小鼠脑中。我们观察到，强力霉素的添加和去除引起GDNF的表达可被诱导和逆转多次，表明强力霉素可穿透移植物并在体内调节转基因表达。我们的发现提供了基因和干细胞疗法相组合以有效调节移植的细胞中的异位蛋白表达的构思的证明。
本文描述的是一种治疗方法，包括向患有疾病或病症的受试者给予一批量的细胞，其中，所述细胞表达治疗蛋白或肽，并且进一步地，其中，所述细胞、治疗蛋白或肽、或者两者能够治疗疾病或症状。在其它实施方式中，细胞为神经谱系细胞。在其它实施方式中，神经谱系细胞为神经祖细胞。在其它实施方式中，神经祖细胞源自诱导多能干细胞(iPSC)。在各种实施方式中，通过在含有高浓度的EGF和FGF-2的神经干细胞培养基中培养，从iPSC克隆产生神经祖细胞。可使用保持细胞-细胞接触的切碎(chopping)方法长时间扩增细胞聚集体(称为EZ球体)。在各种实施方式中，从EGF/FGF中取出EZ球体，在神经诱导中与视黄酸RA一起培养。Sareen等，“Human neural progenitor cells generated from inducedpluripotent stem cells can survive,migrate,and integrate in the rodent spinalcord”，J Comp Neurol.，2014年8月15日，522(12)：2707-2728和Ebert等，“EZ spheres:astable and expandable culture system for the generation of pre-rosettemultipotent stem cells from human ESCs and iPSCs”，Stem Cell Res.，2013年5月；10(3)：417-427中描述了与源自iPSC的神经祖细胞相关的技术，以引用的方式将其全部并入本文。在其它实施方式中，iPSC包括根据美国公开No.2017/0362574中描述的方法重编程的体细胞(例如成纤维细胞和血细胞)，以引用的方式将其全部并入本文。
在其它实施方式中，所述细胞表达来自一种或多种载体的表达盒。在其它实施方式中，表达来自一种或多种载体的表达盒的细胞已进行核转染、转染或电穿孔或本领域已知的其它基因递送技术。在其它实施方式中，所述一种或多种载体包括piggyBac载体、pBase载体或两者。在其它实施方式中，piggyBac载体包含至少两个启动子，其中至少一个启动子为诱导型的。在其它实施方式中，至少一个诱导型的启动子为多顺反子的。在其它实施方式中，至少一个诱导型的多顺反子启动子为双向的。在其它实施方式中，表达盒为基因组学上整合的。在其它实施方式中，表达盒编码治疗蛋白或肽。在其它实施方式中，治疗蛋白或肽包括神经营养因子。
在各种实施方式中，所述一种或多种载体包括具有侧接有两个转座子元件的基因表达盒的载体。在各种实施方式中，两个转座子元件包括piggyBac末端重复(PB TR)。在各种实施方式中，载体包括含有CMV/鸡β-肌动蛋白(又名CAG)启动子的组成型启动子。在各种实施方式中，载体包括含有TRE-Bi启动子的诱导型的双向启动子。在各种实施方式中，组成型启动子与tet应答元件可操作地连接。在各种实施方式中，“tet-on”元件包括例如rTA。在其它实施方式中，rTA包括rtTA-V10。在各种实施方式中，组成型启动子可操作地连接至筛选因子，包括例如新霉素或嘌呤霉素。在各种实施方式中，诱导型的双向启动子为多顺反子的。在各种实施方式中，诱导型的双向启动子可操作地连接至第一、第二或第三或更多的顺反子中的元件。在各种实施方式中，第一、第二或第三或更多的顺反子包括转基因。在各种实施方式中，转基因后随着一个或多个转录后元件。在各种实施方式中，一个或多个转录后元件包括土拨鼠肝炎病毒转录后元件(WPRE)。在各种实施方式中，转基因后随着一个或多个聚腺苷酸尾。其中包括，例如兔β-珠蛋白聚腺苷酸。在各种实施方式中，转基因为神经营养因子。在各种实施方式中，神经营养因子包括胶质源性神经营养因子(GDNF)。更多的信息见于PCT Pub.No.WO 2017/131926和Akhtar等，“A Transposon-Mediated System forFlexible Control of Transgene Expression in Stem and Progenitor-DerivedLineages”，Stem Cell Reports，2015年3月10日；4(3)：323-331，通过引用将其全部并入本文。
在其它实施方式中，所述一种或多种载体包括编码重组酶的载体，所述重组酶包括VCre(Vlox及其衍生物)、SCre(Slox及其衍生物)、Dre(Rox及其衍生物)和phiC31(attb)或本领域已知的其它重组酶。
在其它实施方式中，神经营养因子包括胶质源性神经营养因子(GDNF)。在其它实施方式中，所述疾病或病症为神经退行性疾病。在其它实施方式中，神经退行性疾病为肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。在其它实施方式中，给予一批量的细胞包括注射。在其它实施方式中，所述方法包括给予四环素、其类似物或衍生物，包括例如强力霉素。
在各种实施方式中，载体包括至少一条同源重组序列。在其它实施方式中，同源重组序列包括能够靶向基因组安全港(safe harbor)的序列。在其它实施方式中，基因组安全港是以下中的一种：腺相关病毒位点1(AAVS1)、趋化因子(C-C基序)受体5(CCR5)基因、小鼠Rosa26基因座的人直系同源物。上述载体之一的示例性序列为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
本文描述的是一种方法，包括提供一批量的源自诱导多能干细胞(iPSC)的细胞，以及将至少两种载体引入源自iPSC的细胞中。在其它实施方式中，源自iPSC的细胞为神经祖细胞。在其它实施方式中，引入至少两种载体包括核转染、转染和电穿孔中的一种或多种。在其它实施例中，至少两种载体包括piggyBac载体和pBase载体。在其它实施方式中，piggyBac载体包括表达盒(包括组成型启动子、包含tet应答元件的诱导型的双向多顺反子启动子、以及编码蛋白或肽的序列)、两个转座子元件，其中，两个转座子元件侧接于表达盒。在其它实施方式中，所述蛋白或肽包括神经营养因子。在其它实施方式中，神经营养因子包括胶质源性神经营养因子(GDNF)。在各种实施方式中，所述载体包括至少一条同源重组序列。在各种实施方式中，载体和/或包含载体的细胞缺少处于表达盒的500bp、1kb、2kb、5kb或10kb内的转座元件和/或源自转座子的序列。在各种实施方式中，载体和/或包含载体的细胞缺少处于表达盒的500bp、1kb、2kb、5kb或10kb内的源自病毒的序列。在各种实施方式中，所述细胞包括基因组学上整合的载体的1个或2个拷贝。在各种实施方式中，细胞包括基因组学上整合为单拷贝的载体。
还在本文描述的是通过前述方法制备的一批量的细胞，其中，源自iPSC的细胞表达基因组学上整合的表达盒。例如，通过包括以下的方法制备一批量的能够诱导表达胶质源性神经营养因子(GDNF)的神经祖细胞：提供一批量的源自诱导多能干细胞的神经祖细胞(iNPC)，以及将piggyBac载体和pBase载体引入源自iNPCs的细胞中，其中，piggyBac载体包括组成型启动子、包含tet应答元件的诱导型的双向多顺反子启动子、以及编码GDNF的序列。在各种实施方式中，载体包括至少一条同源重组序列。
本文进一步描述的是使用上述细胞治疗退行性疾病和/或病症(包括诸如肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的神经退行性疾病)的方法。
本文描述的是一种方法，包括向患有神经退行性疾病的受试者给予一批量的源自诱导多能干细胞的神经祖细胞(iNPC)，其中，所述细胞诱导性地表达能够治疗该疾病的神经营养因子。在其它实施方式中，iNPC表达通过核转染引入的基因组学上整合的表达盒，所述表达盒包括组成型启动子、包含tet应答元件的诱导型的双向多顺反子启动子、以及编码胶质源性神经营养因子(GDNF)的序列。在各种实施方式中，载体包括至少一条同源重组序列。在其它实施方式中，所述方法包括给予四环素、其类似物或衍生物。
还在本文描述的是能够诱导表达胶质源性神经营养因子(GDNF)的一批量的神经祖细胞，其中，神经祖细胞包括基因组学上整合的表达盒，所述表达盒包括包含tet应答元件的双向多顺反子启动子、以及编码GDNF的序列。本文进一步描述的是使用上述的细胞治疗退行性疾病和/或病症(包括诸如肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的神经退行性疾病)的方法。
本文描述的是包含基因表达盒的载体，所述基因表达盒包括组成型启动子、包含tet应答元件的诱导型的双向启动子以及编码蛋白或肽的序列。在各种实施方式中，基因表达盒侧接有两个转座子元件。在各种实施方式中，两个转座子元件包括piggyBac末端重复(PB TR)。在各种实施方式中，两个转座子元件包括loxP和翻转酶(flippase)识别靶标、或本领域已知的其它转座子元件。在各种实施方式中，组成型启动子包括CMV/鸡β-肌动蛋白(又名CAG)启动子。在各种实施方式中，诱导型的双向启动子包括TRE-Bi启动子。在各种实施方式中，组成型启动子与tet应答元件可操作地连接。在各种实施方式中，tet应答元件为包括例如tTA的“tet-off”元件、或包括例如rTA的“tet-on”元件。在其它实施方式中，rTA包括rtTA-V10。在各种实施方式中，组成型启动子可操作地连接至筛选因子，包括例如新霉素或嘌呤霉素。在各种实施方式中，诱导型的双向启动子为多顺反子的。在各种实施方式中，诱导型的双向启动子与第一、第二或第三或更多的顺反子中的元件可操作地连接。在各种实施方式中，第一、第二或第三或更多的顺反子包括转基因。在各种实施方式中，转基因后随着一个或多个转录后元件。在各种实施方式中，一个或多个转录后元件包括土拨鼠肝炎病毒转录后元件(WPRE)。在各种实施方式中，转基因后随着一个或多个聚腺苷酸尾。其中包括，例如兔β-珠蛋白聚腺苷酸。在各种实施方式中，转基因为神经营养因子。在各种实施方式中，神经营养因子包括胶质源性神经营养因子(GDNF)。在各种实施方式中，载体包括促进安全着陆点(包括AAVS1)的靶向的一种或多种元件。在各种元件中，诱导盒周围的一个或多个绝缘子元件在细胞分化期间减弱潜在的沉默。在各种实施方式中，表达盒包括一个或多个子盒，其中各子盒包括：1)启动子，2)转基因和3)聚腺苷酸转录终止元件。在各种实施方式中，包括一个或多个子盒的表达盒包括组成型子盒和诱导型子盒。例如，组成型子盒包括表达rTA反式激活因子的组成型启动子，并且诱导型子盒包括表达神经营养因子(如GDNF)和任选的一种或多种报告蛋白的诱导型启动子。
前述载体的实例包括在图1A中描述的“pB-RTP-Tet-GDNF/memClover-FLuc”[piggyBac-反向反式激活因子/TagBFP2nls/PacR-Tet诱导型-GDNF/膜Clover-萤火虫荧光素酶](SEQ ID NO：1)。在此，载体包括两个启动子：组成型活性CMV/鸡β-肌动蛋白(又名CAG)启动子和诱导型的双向TRE-Bi启动子。CAG启动子驱动rtTA-V10(又名tet-ON)反式激活因子、TagBFP2-V5nls(具有V5标签和核定位序列的增强的蓝色荧光蛋白)和嘌呤霉素抗性基因的组成型表达。串联的转基因通过自切割肽接头(P2A)分开。在此，添加四环素类似物或衍生物(强力霉素)引起rtTA-V10反式激活因子与TRE-Bi启动子结合并催化下游转基因的转录。TRE-Bi启动子的第一顺反子带有豆蔻酰化和棕榈酰化(MyrPalm)的clover报告基因(mpClover)，后随着不稳定的萤火虫荧光素酶(Luc2P)。诱导型TRE-Bi启动子下游的第二顺反子可编码神经营养因子(例如GDNF)，然后编码土拨鼠肝炎病毒转录后元件(WPRE)以增加基因表达。将兔β-珠蛋白聚腺苷酸置于各自的元件的下游，以终止转录并防止假的转基因表达。可将pB-RTP-Tet-GDNF/memClover-FLuc载体随着pBase质粒转染，以促进稳定的基因组整合。前述载体的另一实例包括图10中示出的pDonor-Teton3g-2a-TagBFP-V5-nls-p2a-puroR WPRE_Insulated mpclover-2a-luc2pest-2a-gdnf wpre。
在各种实施方式中，载体包括至少一条同源重组序列。在其它实施方式中，同源重组序列包括能够靶向基因组安全港的序列。在其它实施方式中，基因组安全港为以下中的一种：腺相关病毒位点1(AAVS1)、趋化因子(C-C基序)受体5(CCR5)基因、小鼠Rosa26基因座的人直系同源物。上述载体之一的示例性序列为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
本文描述的是一种治疗方法，包括：向患有疾病或病症的受试者给予一批量的细胞，其中，所述细胞表达治疗蛋白或肽，并且进一步地，其中，所述细胞、治疗蛋白或肽、或者两者能够治疗疾病或症状。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，细胞为神经谱系细胞。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，神经谱系细胞为神经祖细胞。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，神经祖细胞源自诱导多能干细胞(iPSC)。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，细胞表达来自一种或多种载体的表达盒。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，表达来自一种或多种载体的表达盒的细胞已被核转染、转染或电穿孔。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，一种或多种载体包括piggyBac载体、pBase载体或两者。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，piggyBac载体包括至少两个启动子，其中至少一个启动子为诱导型的。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，至少一个诱导型的启动子为多顺反子的。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，至少一个诱导型的多顺反子启动子为双向的。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，表达盒为基因组学上整合的。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，表达盒编码治疗蛋白或肽。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，治疗蛋白或肽包括神经营养因子。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，神经营养因子包括胶质源性神经营养因子(GDNF)。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，疾病或病症为神经退行性疾病。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，神经退行性疾病为肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，给予一批量的细胞包括注射。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，该方法包括给予四环素、其类似物或衍生物。
本文描述的是如下的方法，包括：提供一批量的源自诱导多能干细胞(iPSC)的细胞；以及将至少两种载体引入源自iPSC的细胞中。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，源自iPSC的细胞为神经祖细胞。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，引入至少两种载体包括核转染、转染和电穿孔中的一种或多种。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，至少两种载体包括piggyBac载体和pBase载体。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，piggyBac载体包括：表达盒(其包括组成型启动子、包含tet应答元件的诱导型的双向多顺反子启动子、以及编码蛋白质或肽的序列)、两个转座子元件，其中，两个转座子元件侧接于所述表达盒。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，蛋白或肽包括神经营养因子。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，神经营养因子包括胶质源性神经营养因子(GDNF)。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，piggyBac载体包括同源重组序列。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，同源重组序列包括能够靶向基因组安全港的序列。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，基因组安全港是以下的一种：腺相关病毒位点1(AAVS1)、趋化因子(C-C基序)受体5(CCR5)基因、小鼠Rosa26基因组的人直系同源物。
这进一步包括通过该方法的各个和所有的前述实施方式制备的一批量的细胞，其中，源自iPSC的细胞表达基因组学上整合的表达盒。
还在本文描述的是一种方法，包括向患有神经退行性疾病的受试者给予一批量的源自诱导多能干细胞的神经祖细胞(iNPC)，其中，所述细胞诱导性地表达能够治疗该疾病的神经营养因子。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，iNPC表达通过核转染引入的基因组学上整合的表达盒，所述表达盒包括组成型启动子、包含tet应答元件的诱导型的双向多顺反子启动子、以及编码胶质源性神经营养因子(GDNF)的序列。在该方法的各个和所有的上述实施方式中，该方法包括给予四环素、其类似物或衍生物。
实施例
本文描述的是所要求保护的发明的非限制性实例。
实施例1
向细胞培养物或向动物、iPSC和iNPC添加Dox
在所有实验中，将dox溶液保持在避光和4℃下。对于细胞培养，将dox(Clontech631311)以100ng/ml添加到培养基。对于体内工作，使用连接到1毫升注射器(BD 309659；Franklin Lakes，NJ)的软头饲喂针(Instech FTP-20-30；Plymouth Meeting，PA)，通过口服管饲每3-4天向动物给予dox(15μg dox/g体重)(例如，对于20g的动物为60μl)。
先前在包括例如Sareen等，“Human neural progenitor cells generated frominduced pluripotent stem cells can survive,migrate,and integrate in therodent spinal cord”，J Comp Neurol.，2014年8月15日；522(12)：2707-2728中已经描述了体细胞的重编程以产生iPSC以及随后的iNPC的产生，通过引用将其全部并入本文中。
简而言之，对于重编程和iPSC生成，使用Amaxa Human Dermal FibroblastNucleofector Kit将细胞(例如成纤维细胞)重编程为无病毒iPSC系，以表达具有如下6个因子的附加体质粒：OCT4、SOX2、KLF4、L-MYC、LIN28和p53 shRNA(Addgene)。外源引入的基因不整合，而是以瞬时方式以附加体表达。简而言之，收获成纤维细胞(每次核转染0.8×106个细胞)，在200g下离心5分钟，小心重悬于
Figure BDA0002684553500000161
Solution(VPD-1001，Lonza)中，并施用U-023程序。在重编程期间，将所有培养物保持在标准氧气条件下(5％O2)，这进一步提高了iPSC生成的效率。培养基保持48小时，并逐渐更换为化学上定义的含有小分子的
Figure BDA0002684553500000162
1培养基，以提高重编程效率。所使用的小分子为：1)丁酸钠(0.5mM)，2)Wnt/β-catenin信号通路的糖原合酶激酶3β抑制剂(CHIR99021，3μM)，3)MEK通路抑制剂(PD0325901，0.5μM)，4)TGF-βI型受体ALK5激酶、I型激活素/淋巴结受体ALK4和I型淋巴结受体ALK7的选择性抑制剂(A 83-01，0.5μM)。25-31天后出现具有ES/iPSC样形态的集落。随后，将具有最佳形态的集落转移至无饲养层的6BD MatrigelTM基质上，并保持在
Figure BDA0002684553500000163
1培养基中。将iPSC克隆进一步扩增并冷冻保存。
从iPSC产生的EZ球体可分化为悬液中的具有星形胶质的倾向的神经祖细胞(iNPCsSU)的培养物。去除EGF/FGF2/肝素后，在神经诱导培养基(NIM)(DMEM/F12、1％NEAA、1％N2、肝素2μg/ml，Sigma)中，使用视黄酸RA(0.5μM)尾化(caudalized)EZ球体。此后11天每2天更换一次培养基，然后将稳定的iNPCsSU群重新引入StemHi E/F/H中，以通过每周切碎进行扩增(类似于EZ球体)。iNPCsSU在26-30次传代中保持了其增殖潜能和星形胶质细胞生成的倾向，并且可有效地冷冻保存。另外，通过EZ球体的accutase解离产生了作为贴附培养物生长的iNPC的贴附形式的并称为iNPCsAD，用于在StemHi E/F/H中以10,000个细胞/cm2的密度铺在生长因子降低的基质胶(Corning)上，并使用TrypLE(Life Technologies)每周进行传代。为了分化为星形胶质细胞，用accutase(BD Biosciences)将iNPCsSU解离为单细胞，或将用TrypLE收获的iNPCsAD在NIM中以25000个细胞/cm2铺在经聚-1-鸟氨酸/基质胶包被的玻璃盖玻片上7-21天。额外的信息可见于Ebert等“EZ spheres:a stable andexpandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stemcells from human ESCs and iPSCs”Stem Cell Res.，2013年5月；10(3)：417-427中找到。
实施例2
移植
将经历了两轮针对BFP的FACS的核转染的iNPC移植到6月龄的NOD-SCID小鼠(Nod.cb17-Prkdcscid/J，Jackson Lab#1303；Bar Harbor，ME)的纹状体中(以100,000个细胞/μl向每个半球注入2μl细胞)。移植前三天，用dox处理细胞子集。对于移植，将细胞解离并在条件培养基中稀释至终浓度为100,000个细胞/μl，并保持在冰上。将动物用异氟烷麻醉，并放置于立体定位仪中。在0.7mm嘴侧和+/-2.0mm侧向处相对于前囟双侧地注射细胞。将回装有PBS的5μl Hamilton微注射器用2μl细胞溶液装载，插入至深度为-4.00mm。然后将微注射器推高至-3.50mm，并以1μl/min注入细胞溶液。细胞注射后，将微注射器推高至-3.00mm，保持2分钟，然后缓慢抽出。每天检查动物。
实施例3
用于提供报告基因和GDNF的经调节的表达的新载体
Tet-ON系统依赖于rtTA-V10反式激活因子和dox应答的TRE-Bi(Tet-双向应答元件)启动子的组成型表达。本发明人观察到，如果反式激活因子和诱导型的启动子在不同的质粒中表达并共转染到细胞中，则细胞在扩增过程中漂移并针对双重转基因群体进行选择，产生非诱导型细胞(数据未显示)。将这些元件以及报告基因并入单一系统中需要大的载体，这通过本发明人新创建的名为“pB-RTP-Tet-GDNF/memClover-FLuc”[piggyBac-Reverse transactivator/TagBFP2nls/PacR-Tet inducible GDNF/membrane Clover-Firefly Luciferase的载体完成(图1A)。该载体侧接有piggyBac末端重复(PB TR)(图1A1)，当pBase酶瞬时表达时，该载体允许其稳定的基因组整合。
载体具有两个启动子：组成型活性CMV/鸡β-肌动蛋白(又名CAG)启动子和诱导型双向TRE-Bi启动子。CAG启动子(图1A2)驱动rtTA-V10(又名tet-ON)反式激活因子(图1A3)、TagBFP2-V5nls(具有V5标签和核定位序列的增强型蓝色荧光蛋白)(图1A4)、以及嘌呤霉素抗性基因(图1A5)的组成型表达。串联的转基因通过自切割肽接头(P2A)分开。向系统添加dox(图1A6)引起rtTA-V10反式激活因子经历构象变化(图1A7)，使其能够与TRE-Bi启动子(图1A8)结合并催化下游转基因的转录；而dox的去除逆转诱导的基因表达。TRE-Bi启动子的第一顺反子带有肉豆蔻酰化和棕榈酰化(MyrPalm)的clover报告基因(mpClover)(图1A9)，后随着不稳定的萤火虫荧光素酶(Luc2P)(图1A10)。Clover是一种绿色荧光蛋白，MyrPalm序列定位至细胞膜。选择膜荧光报告基因以避免与核周GDNF定位的视觉重叠。不稳定的萤火虫荧光素酶(Luc2P)的半衰期比野生型荧光素酶短数倍，用于分析随时间变化的活体动物的基因表达。诱导型TRE-Bi启动子下游的第二顺反子带有GDNF(图1A11)，后随着土拨鼠肝炎病毒转录后元件(WPRE)以增加基因表达(图1A12)。将良好表征的兔β-珠蛋白聚腺苷酸置于各自的元件的下游，以终止转录并防止假的转基因表达。将pB-RTP-Tet-GDNF/memClover-FLuc载体设计为随着pBase质粒(图1B)转染，以促进稳定的基因组整合(图1B1)。总而言之，dox的存在或不存在决定了诱导型转基因的表达(Clover、荧光素酶和GDNF)，而rtTA-v10反式激活因子、TagBFP-v5-nls和嘌呤霉素抗性基因则组成型表达(图1C)。额外的信息见于PCT公开No.WO 2017/131926和Akhtar等，“A Transposon-MediatedSystem for Flexible Control of Transgene Expression in Stem and Progenitor-Derived Lineages”，Stem Cell Reports，2015年3月10日；4(3)：323-331，以引用的方式将其全部并入本文。
实施例4
源自核转染的iPSC的NPC的免疫细胞化学
为了促进细胞贴附，用聚鸟氨酸(Sigma，P4638)涂覆玻璃盖玻片，并随后在37℃下用25μl层粘连蛋白(50μg/ml，Sigma-Aldrich L2020)处理1小时。然后去除涂层。在TrypLE中孵育5分钟，将核转染的细胞从6孔板中移出。加入等体积的培养基以中和酶促反应，然后对解离的细胞进行计数，在150rcf下成球团，以1,000个细胞/μl重悬于培养基中，并将25μl细胞吸取到盖玻片的层粘连蛋白涂覆的区域上。在37℃下孵育4-6小时以使细胞贴附后，向孔轻轻注入500μl生长培养基。每24小时更换一半体积的培养基。
如前所述进行免疫细胞化学。简而言之，将细胞在4％多聚甲醛(PFA)中固定12分钟。然后除去PFA溶液，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3次，每次孵育5分钟。然后将细胞在用具有0.3％Triton(PBS-T)和3％正常驴血清(NDS)的PBS稀释的一抗(表1中列出了浓度)中于4℃下在温和的摇床上孵育至少12小时，然后在室温下进行三次5分钟的PBS洗涤。将二抗(与Alexa405、FITC、Alexa488、Dylight488、Alexa555、Dylight549、Alexa647或Dylight649偶联；Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)以1:1000稀释度在PBS-T中稀释，并在室温下在温和的摇床上孵育1小时。然后将盖玻片在PBS中洗涤，并用抗荧光淬灭封片凝胶介质(Invitrogen ProLong Gold，P10144)封装在载玻片上。
表1.本研究中使用的抗体。
制造商 宿主类别 抗原 稀释度
Abcam 13970 鸡 EGFP 1:2500
Abcam 95038 山羊 V5 1:1000
Invitrogen 46-0705 小鼠 V5 1:1000
Abcam 9113 鸡 V5 1:250
KeraFast EMU108 豚鼠 mKate(BFP visualization) 1:500
R&D BAF212 山羊 GDNF 1:250
Abcam ab21176 兔 荧光素酶 1:500
Cellartis Y40400 小鼠 Stem 101(人细胞核) 1:1000
Cellartis Y40410 小鼠 Stem 121(人细胞质) 1:2000
实施例5
ELISA
用于ELISA的培养基不含EGF和FGF，并且由补充有1％的抗生素-抗真菌素和2％的不含维生素A的B27的DMEM:F12(70:30)组成。在加入培养基用于24小时或7天的孵育期之前，吸出旧培养基，并用无菌PBS洗涤孔两次。将收集的培养基储存在-80℃。按照制造商的说明(R&D Systems DY212；Minneapolis,MN)进行GDNF ELISA。
实施例6
成像
免疫细胞化学和免疫组织化学荧光染色后，在Nikon A1R倒置激光扫描共聚焦显微镜上收集共聚焦图像，所述显微镜具有适当设置以连续反映颜色并避免信号串扰。利用曝光和饱和度测量来捕获最大动态范围。通常，在设置曝光后，相同的设置将再次用于组中的后续样品。ND2图像文件最初导入到ImageJ中，用于操作共聚焦Z-stacks或将单个通道与单个z切片(z-slices)分隔开，用于随后以Adobe Photoshop CS6进行编辑。以PhotoshopCS6调整图像曲线的动态范围和曝光的一致性，将其裁剪，然后导入Adobe IllustratorCS6中以制备最终图像。
实施例7
移植组织的GDNF评分
使用Leica DM200 LED显微镜拍摄免疫染色的切片。基于DAB GDNF染色的染色强度，由对实验条件不知情的观察者对图像进行评分(dox vs无dox)。
实施例8
报告蛋白的产生在体外可逆地调节
为了评估治疗上相关的细胞中的dox调节系统，将人iNPC用pB-RTP-Tet-GDNF/memClover-FLuc和pBase载体进行核转染。经核转染的细胞生长为易于维护和快速扩增的自由浮动球体(称为EZ球体)。在不存在dox时，球体组成型地表达BFP+，并且在添加dox的24小时内，球体表达BFP+和GFP+两者，表明TRE-Bi启动子对dox有应答(图1D)。
为了定量评估来自TRE-Bi启动子的报告基因表达，将iNPCs与组成型地表达海肾荧光素酶的Ef1-海肾质粒一起进行核转染，以用于蛋白归一化。双荧光素酶测定表明，在24小时的dox处理后，细胞在萤火虫荧光素酶活性(归一化至海肾)方面的表达增加约1300倍，并且在去除dox后恢复到接近基础水平(图1E)。为了评估TRE-Bi诱导型的启动子的动力学，在存在甲虫荧光素时生长的经核转染的iNPC的活的培养物中，对萤火虫荧光素酶活性进行了定量(图1F)。结果显示出，萤火虫的生物发光在时间0时添加dox后迅速增加，而在去除dox之后(在48小时时)缓慢降低。为了评估TRE-Bi启动子是否可被可逆地诱导，使用IncuCyte S3活细胞分析系统来拍摄核转染的iNPC的每小时的图像。结果显示出，通过向培养物中添加、去除和重新添加dox，可以诱导、逆转和重新诱导clover的表达。由于需要扩增和存储临床上相关的细胞产物，因此本发明人评估了TRE-Bi启动子是否会保持对广泛的细胞扩增和冻结的功能应答。流式分析表明83％的BFP+组成型细胞被诱导表达GFP(图5)，表明TRE-Bi启动子保留了功能。
实施例9
GDNF的产生在体外可逆地调节
为了确保本发明人的系统可调节与治疗上相关的分子，接下来在核转染的iNPC中评估了GDNF的产生。免疫荧光表明，在不存在dox时，GDNF在细胞中不可见，这证实了本发明人先前的报道，即野生型细胞不产生GDNF。在不存在dox时，也不会产生报告蛋白Clover和荧光素酶，而BFP在组成型启动子下产生(图2A)。在存在dox时，检测到GDNF以及Clover和荧光素酶，并维持了BFP的产生(图2B)。当随后去除dox时，GDNF和报告基因的产生全部停止，而BFP得以维持(图2C)。
为了量化GDNF的调节，针对在存在dox(打开)、不存在dox(关闭)、先存在然后不存在dox(打开→关闭)以及在较长的时间段内存在dox(打开→打开)时生长的细胞，使用了ELISA，其中，培养基未更换(图2D)。再次，在不存在dox时，细胞未产生可观水平的GDNF。相比之下，在存在dox时，仅在24小时后，细胞就产生了稳健水平的GDNF，并且这在连续的dox处理的7天中积累。关键的是，GDNF可根据存在或不存在dox可逆地打开并返回到基线水平。用GDNF阳性细胞的体视学计数对ELISA结果进行归一化表明，经dox处理的培养物每小时每个GDNF阳性细胞分泌7.34×10-4pg GDNF。总的来说，蛋白可在体外成功诱导和逆转的证实为移植后的细胞中的蛋白的调控奠定了基础。
实施例10
报告转基因表达在成年大脑的iNPC移植物中是可诱导和可逆的
为了研究该系统在体内调节蛋白表达的能力，将核转染的iNPCs扩增并移植到成年的NOD-SCID小鼠脑中(图3A)。在体外扩增过程中，细胞经历了两轮针对核BFP的FACS。亲代细胞群包含15.6％BFP+，其随后作为神经球扩增7周，并第二次进行BFP分选，其产生了32.4％BFP+细胞。第二次分选后三周，将细胞分为两组，其中一个细胞组在移植前三天在培养物中接受dox，而另一细胞组不接受dox。对6月龄的NOD-SCID小鼠(n＝14)用200,000个iNPC移植到各纹状体半球中，其中10只动物接受dox预处理的细胞和4只动物接受未经处理的细胞。移植前，动物未接受过dox。
移植后一天，用经dox处理的细胞移植的全部10只动物都发出了高于背景的荧光素酶信号，该信号根据来自动物的远离中枢神经系统的后部区域的信号而计算得出(图3B-图3C，第0周)。为了确定随后是否可通过dox给予和去除而多次将移植细胞“打开”和“关闭”，将动物分为两组，然后按打开→关闭→打开→关闭→打开(A组)或关闭→打开→关闭→打开(B组)改变。每周的生物发光成像表明，在以打开dox开始试验并以关闭dox终止以及以关闭dox开始并以打开dox终止的代表性动物中，dox均能有效地在体内调节荧光素酶蛋白(图3B)。在每周成像期间对荧光素酶活性的定量证实了经dox处理的动物中的荧光素酶活性的增加以及基因表达随时间的诱导性(图3C)。总的来说，这为dox诱导型的基因表达提供了体内原理验证。
实施例11
GDNF表达在iNPC移植物中是可诱导和可逆的
为了确认移植细胞中的经调节的GDNF表达，在最终成像期之后对动物实施安乐死，并通过荧光免疫组织化学评估GDNF、Clover和BFP的产生(图4)。在以打开dox终止试验的动物(图4A)和以关闭dox终止试验的其同窝动物(图4B)中的移植物在纹状体区域中显示BFP+细胞，而Clover和GDNF仅在dox动物中检测到。高放大倍数显示出，在经dox处理的动物中，邻近移植部位的宿主细胞可能正在吸收GDNF(图4C，粉色箭头)，而在关闭dox的动物中未观察到这一点(图4D)。总的来说，这些数据表明在移植后数月，在iNPCs中可诱导和逆转GDNF的分泌。
最后，DAB染色提供蛋白检测的高灵敏度并有效地跟踪表达人GDNF的NPC移植物，用于确定GDNF表达的水平和定位(图6显示了来自图4的同窝动物的DAB染色)。盲法分析表明，所有以打开dox终止试验的动物(除一只动物#8外)均显示出增加的GDNF信号，并且所有以关闭dox终止试验的动物均未显示出GDNF信号(表2)。
表2.盲法事后分析GDNF评分。
Figure BDA0002684553500000231
(-)无阳性染色；(+)轻微染色；(++)中度染色；(+++)广泛染色。Str＝纹状体。CC＝胼胝体
该分析还表明生物发光强度的变化可能是移植物位置变化的结果。具体而言，表现出显著高的生物发光信号的一些动物在脑膜中具有经移植的细胞，这很可能是由于退针过程中细胞回流到注射道中引起(图7)。总的来说，对所有研究动物的广泛分析证实了生物发光信号与GDNF表达之间的强的相关性。
实施例12
讨论
该报告提供了通过经工程化的人神经祖细胞产生的GDNF可在体内跨过多个周期受到严格调节的理论验证。该技术可应用于其它生长因子，提供保护不同疾病中的受损的神经元的宝贵手段。使用pB-RTP-Tet-GDNF/memClover-FLuc，本发明人观察到dox穿透实质移植部分达到允许从诱导型TRE-Bi启动子激活转基因的水平。本发明人还报告了转基因活性可被诱导并逆转多个周期。因此，如果患者在疾病进展过程中出现副作用、脱敏或其它与转基因相关的现象，则可以减弱或停止GDNF的给予。或者，可改变药物方案以允许宿主受体和信号传导通路的再致敏。这与具有组成型基因表达的离体基因治疗形成鲜明对比。重要的是，基因控制所需的dox浓度的量(15μg dox/g重量)低于抗菌剂量，并且不会增加抗dox细菌的存在或对肠道菌群产生负面影响。
有趣的是，与用于当前的ALS临床试验的人NPC的慢病毒转导相比，新的dox催化的系统提供了高近两倍的GDNF分泌。这种增加可能是由于piggyBac转座比起慢病毒转导可介导更多的质粒基因组插入的拷贝。此外，用先前的慢病毒实验进行的GDNF转录取决于通过内源转录因子激活的PGK启动子。在本研究中，GDNF转录通过将tet-ON反式激活因子与TRE-Bi启动子结合而启动，TRE-Bi启动子通过由dox给予引发的构象变化而催化。因此，转录不受天然存在的转录因子的限制，而是受存在的反式激活因子和dox的量限制。重要的是要注意，与通过pB-RTP-Tet-GDNF/memClover-Flu的病毒转导进行的宿主细胞的直接遗传操作相比，如本研究中进行的经离体的遗传学上工程化的神经祖细胞的移植增加了一定水平的安全性。具体而言，直接病毒转导至大脑不仅可以靶向邻近病变细胞的健康细胞，还可以进一步损害病变宿主细胞。另外，简单地引入健康的神经祖细胞/干细胞本身可能对处于各种疾病的患病宿主环境具有有益的影响。因此，细胞和诱导型基因疗法的协同作用可能会超过单独的基因治疗。尤其是当神经细胞源自人iPSC来源时，至关重要地提供了自体移植的希望。
根据脑部检查，没有动物表现出异常行为或对移植的纹状体的任何明显损害。重要的是，在这项研究或本发明人以前的iPSC移植研究中，在任何移植动物中均未观察到肿瘤或异位生长。但是，将此疗法转移至临床将需要进一步的安全性和功效测试。首先，必须测试组成型反式激活因子(rtTA-V10)的长期功效、毒性和潜在的抗原性。其次，由于其易于使用，将本发明人的研究中的PBase用作稳定整合pB-RTP-Tet-GDNF/memClover-FLuc的手段。尽管pBase介导了随机整合，但本发明人尚未在使用pBase的500多只小鼠中观察到肿瘤。但是，临床级产品可能需要单拷贝位点特异性整合。为此目的，靶向AAVS1安全着陆可能允许转基因的抗甲基化表达和长期稳定整合。重要的是，本发明人已经使用与本研究中使用的相同的TRE-Bi启动子在单拷贝水平上观察到了明显的dox介导的转基因表达。
总之，该原理验证研究为组合的诱导型基因和细胞疗法奠定了基础，这些疗法起到了为神经退行性疾病的治疗提供保护的作用。
实施例13
来自人iPSC细胞系中的AAVS1“安全着陆点”的人GDNF的诱导型表达
将上述构建体应用于治疗环境将极大受益于“安全”整合以避免有害作用。这包括开发DNA载体以产生人GDNF(任选地包括可控的表达)，其可被靶向以用于整合入人AAVS1基因座中。
作为起始点，利用来自CSMC的Breunig实验室的上述的产生人GDNF的质粒pB-RTP-Tet-GDNF/memClover-FLuc。AAVS1 SA-2A-puro-pA供体质粒是来自Rudolf Jaenisch的馈赠(Addgene质粒#22075；http：//n2t.net/addgene:22075；RRID：Addgene_22075)。可修饰AAVS1SA-2A-puro-pA供体质粒以包含SfiI限制性位点，从而促进在AAVS1同源序列之间克隆pB-RTP-Tet-GDNF/memClover-FLuc。这个新的中间载体被命名为AAVS1-AVPT。
用限制酶SalI和SfiI消化中间载体AAVS1-AVPT和pB-RTP-Tet-GDNF/memClover-FLuc。将适当的片段分离并通过DNA连接来接合。通过DNA测序确认所得的构建体，并临时命名为AAVS1-teton-hGDNF(SEQ ID NO：2)，如图8所示。将AAVS1-teton-hGDNF构建体通过电穿孔导入人iPSC系CS0002iCTR-n11中。通过包含质粒hAAVS1 1R TALEN和hAAVS1 1L TALEN(hAAVS1 1R TALEN来自Feng Zhang的馈赠(Addgene质粒#35432；http://n2t.net/addgene:35432；RRID：Addgene_35432)；hAAVS1 1L TALEN是来自Feng Zhang的馈赠(Addgene质粒#35431；http://n2t.net/addgene:35431；RRID：Addgene_35431))来实现靶向整合到AAVS1位点中。
实施例14
GDNF在iPSC细胞中的表达
在四环素类似物强力霉素的存在下维持培养物，以促进基于荧光蛋白Clover的表达来鉴定包含AAVS1-teton-hGDNF的细胞。在荧光显微镜下挑选“绿色”克隆用于扩增。一旦产生足够数量的细胞，就通过FACS分选进一步纯化克隆。同时，从这些克隆中收集培养基以通过ELISA测定确认GDNF的产生。
实施例15
GDNF表达质粒的经克隆的单拷贝变体(TREBi和TRB3诱导型启动子)
前述的另一实例包括表达GDNF的质粒的单拷贝变体。使用TREBi和TRB3诱导型启动子，此类载体可以包括报告基因，例如eGFP和Luc2。实例包括如图10所示的pDonor-Teton3g-2a-TagBFP-V5-nls-p2a-puroR WPRE_Insulated mpclover-2a-luc2pest-2a-gdnf wpre(SEQ ID NO：3)。这种载体包括同源重组序列。在此，内源基因座的AAVS1靶向位于人PPP1R12C基因的外显子1和2之间。接受者的“着陆位点”包括报告基因/筛选盒(用于荧光和抗生素筛选的TagBFP2和PuroR)和组成型CAG启动子；所述报告基因/筛选盒由与上游PPP1R12C连接的剪接受体驱动；所述组成型CAG启动子驱动侧接有稳定整合的LoxP和FRT位点的td-番茄红(td-Tomato red)荧光顺反子。随后，在稳定筛选这些报告基因后，将这些细胞用如下进行脂质体转染：表达FlpO和Cre的质粒、以及含有侧接有LoxP和FRT的筛选/报告基因盒的供体质粒、以及含有dox诱导型mpClover/Luc2p/GDNF顺反子的质粒。
在不存在和存在强力霉素时，细胞的透射光和绿色荧光成像表明添加dox后24小时的mpClover的诱导性以及在不存在dox时的GFP“渗漏”的不存在。需注意的是，尚未在Puro上筛选此群，因此它不是纯的群(因此，阴性细胞不含供体元件)。此外，分选后约1周(以富集经转染的细胞)和转染后2周(以使mpClover群为稳定的转染)检查这些细胞。在不存在整合时，Dox诱导性将不起作用。
上述各种方法和技术提供了实施本发明的多种方式。当然，将理解的是，根据本文所述的任何特定实施方式，不一定可以实现所描述的所有目的或优点。因此，例如，本领域技术人员将认识到，可以以实现或优化本文教导的一个优点或一组优点的方式而不必实现本文可能教导或建议的其它目的或优点来施行方法。本文提到了多种有利和不利的替代方案。将理解的是，一些优选的实施方式特定地包括一个、另一个或多个有利特征，而另一些特定地排除一个、另一个或多个不利特征，而另一些通过包含一个、另一个或多个有利的特征而特定地减轻当前的不利特征。
此外，技术人员将认识到来自不同实施方式的各种特征的适用性。类似地，可通过本领域普通技术人员来混合和匹配上面讨论的各种要素、特征和步骤以及每个此类要素、特征或步骤的其它的已知等同物，以施行根据本文所述原理的方法。在各种实施方式中，各种要素、特征和步骤中的一些将被特定地包括，而其它的将被特定地排除。
尽管已经在某些实施方式和实施例的上下文中公开了本发明，但本领域技术人员将理解的是，本发明的实施方式超出了具体公开的实施方式，扩展到其它替代实施方式和/或用途和修改及其等同物。
在本发明的实施方式中已经公开了许多变化和替代要素。对于本领域技术人员而言，进一步的变化和替代要素将是显而易见的。在这些变化中，但不限于与诱导多能干细胞(iPSC)、分化的iPSC(包括神经祖细胞)有关的组合物和方法，用于操作上述细胞的载体，与上述组合物的使用有关的方法和组合物，本文中使用溶液的用途和组合物和技术，以及通过本发明的教导产生的产品的特定用途。本发明的各种实施方式可特定地包括或排除这些变化或要素中的任何一个。
在一些实施方式中，用于描述和要求保护本发明的某些实施方式的表示成分的量、性质(例如浓度)、反应条件等的数字应理解为在某些情况下被术语“约”修饰。因此，在一些实施方式中，在书写的说明书和所附的权利要求中阐明的数字参数为近似值，其可根据特定实施方式试图获得的期望特性而变化。在一些实施方式中，应根据所报告的有效位数的数目并通过应用普通的舍入技术来解读数字参数。尽管阐明本发明的一些实施方式的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实例中阐明的数值被尽可能精确地报告。在本发明的一些实施方式中呈现的数值可包含某些误差，这些误差由于在其各自的测试测量中发现的标准偏差而不可避免地产生。
在一些实施方式中，在描述本发明的特定实施方式的上下文中使用的术语“一”、“一个/一种”和“该/所述”以及类似的指代物(尤其是在所附的权利要求中的某些的上下文中)可被解释为覆盖单数和复数两者。本文中的数值范围的列举仅旨在用作分别指代落入该范围内的每个单独的值的简写法。除非本文另外指出，否则每个单独的值都被并入说明书中，如同其在本文中被单独引用。除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序施行。相对于本文中的某些实施方式提供的任何和所有的示例的或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，而不会对另外要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明对实施本发明必不可少的任何未要求保护的要素。
本文公开的本发明的替代要素或实施方式的分组不应被解释为限制性的。各组成员可被单独提及或要求保护，或可与该组的其它成员或本文可见的其它要素组合而被提及或要求保护。出于方便和/或专利性的原因，组中的一个或多个成员可包括在组中或从组中删除。当发生任何此类包括或删除时，申请文件在本文中被认为含有经修饰的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
本文描述的是本发明的优选实施方式，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳方式。当阅读前面的描述后，那些优选实施方式的变型对于本领域普通技术人员将变得显而易见。在考虑之列的是，技术人员可视情况采用此类变型，并且可以以本文中没有具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明的许多实施方式包括适用的法律允许的所附的权利要求中记载的主题的所有修改和等同物。而且，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素在其所有可能的变化中的任何组合。
此外，在整个说明书中，已经对专利和印刷出版物进行了大量参考。上面引用的参考文献和印刷出版物中的每一个均以引用的方法将其整体各自地并入本文。
最后，将理解的是，本文公开的本发明的实施方式是对本发明原理的说明。可采用的其它修改可在本发明的范围内。因此，作为实例而非限制，可根据本文的教导来利用本发明的替代构造。因此，本发明的实施方式不限于精确地如所示出和描述的那样。
序列表
<110> 西达-赛奈医疗中心(CEDARS-SINAI MEDICAL CENTER)
<120> 用于神经营养因子的诱导型表达的组合物和方法
<130> 065472-000730WO00
<150> 62/644,332
<151> 2018-03-16
<150> 62/773,752
<151> 2018-11-30
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12962
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pB-RTP-Tet-GDNF/memClover-Fluc
<400> 1
gtcgacttaa ccctagaaag ataatcatat tgtgacgtac gttaaagata atcatgcgta 60
aaattgacgc atgtgtttta tcgatctgta tatcgaggtt tatttattaa tttgaataga 120
tattaagttt tattatattt acacttacat actaataata aattcaacaa acaatttatt 180
tatgtttatt tatttattaa aaaaaaacaa aaactcaaaa tttcttctat aaagtaacaa 240
aacttttact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat 300
ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc 360
ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca 420
ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta 480
tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta 540
tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat 600
cgctattacc atgggtcgag gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc atctcccccc 660
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cggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg 780
aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg 840
gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc gggagtcgct 900
gcgttgcctt cgccccgtgc cccgctccgc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga 960
ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat 1020
tagcgcttgg tttaatgacg gctcgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttaaaggg 1080
ctccgggagg gccctttgtg cgggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg tgtgtgtgtg 1140
cgtggggagc gccgcgtgcg gcccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg cgggcgcggc 1200
gcggggcttt gtgcgctccg cgtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1260
ggtgcggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg tgggggggtg 1320
agcagggggt gtgggcgcgg cggtcgggct gtaacccccc cctgcacccc cctccccgag 1380
ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtgc ggggcgtggc gcggggctcg 1440
ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1500
ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1560
cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1620
tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1680
gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1740
cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1800
gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1860
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tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattcgg taccgcatgc atcgatgcta 1980
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tgagcagcct accctgtact ggcacgtgaa gaacaagcgg gccctgctcg atgccctgcc 2160
aatcgagatg ctggacaggc atcataccca ctcctgcccc ctggaaggcg agtcatggca 2220
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ggctaaagtg catctcggca cccgcccaac agagaaacag tacgaaaccc tggaaaatca 2340
gctcgcgttc ctgtgtcagc aaggcttctc cctggagaac gcactgtacg ctctgtccgc 2400
cgtgggccac tttacactgg gctgcgtatt ggaggaacag gagcatcaag tagcaaaaga 2460
ggaaagagag acacctacca ccgattctat gcccccactt ctgaaacaag caattgagct 2520
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cctggagaaa cagctaaagt gcgaaagcgg cgggccgacc gacgcccttg acgattttga 2640
cttagacatg ctcccagccg atgcccttga cgactttgac cttgatatgc tgcctgctga 2700
cgctcttgac gattttgacc ttgacatgct ccccggggga tccggaggat ccggagccac 2760
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gctgattaag gagaacatgc acatgaagct gtacatggag ggcaccgtgg acaaccatca 2880
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cgctaagaac ctcaagatgc ctggcgtcta ctatgtggac tacagactgg aaagaatcaa 3420
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cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt tcgccgagat 4080
cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac agatggaagg 4140
cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg tcggcgtctc 4200
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cagaaggtgg tggctggtgt ggccaatgcc ctggctcaca aataccactg agatcttttt 4500
ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg agcatctgac ttctggctaa 4560
taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgga 4620
aggacatatg ggagggcaaa tcatttaaaa catcagaatg agtatttggt ttagagtttg 4680
gcaacatatg cccatatgct ggctgccatg aacaaaggtt ggctataaag aggtcatcag 4740
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tagatttttt ttatattttg ttttgtgtta tttttttctt taacatccct aaaattttcc 4860
ttacatgttt tactagccag atttttcctc ctctcctgac tactcccagt catagctgtc 4920
cctcttctct tatggagatc cctcgacctg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 4980
ttgtaaaacg acggccagtg ccaagcttgc atgcctgcag taagatacat tgatgagttt 5040
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attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt 5160
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tgtcaggccg tagccctggc ggatgcctgg taggtggaag cgtttggcca cggcctcacc 6060
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tagcttcttt tgcacgttga ggatcttttg cagccctttc ttgctcacga atacgacggt 6660
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cagtgataga gaacgtataa gctttaggcg tgtacggtgg gcgcctataa aagcagagct 8220
cgtttagtga accgtcagat cgcctggagc aattccacaa cacttttgtc ttataccaac 8280
tttccgtacc acttcctacc ctcgtaaaca gctggccgcc accatgaagt tatgggatgt 8340
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tgacctgtcg tttttagatg ataacctggt ttaccatatt ctaagaaagc attccgctaa 8940
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aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata 9060
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ctggctgcca tgaacaaagg tggctataaa gaggtcatca gtatatgaaa cagccccctg 9960
ctgtccattc cttattccat agaaaagcct tgacttgagg ttagattttt tttatatttt 10020
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ctataacaag aaaatatata tataataagt tatcacgtaa gtagaacatg aaataacaat 10200
ataattatcg tatgagttaa atcttaaaag tcacgtaaaa gataatcatg cgtcattttg 10260
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cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg 10560
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ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 12900
atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc 12960
tg 12962
<210> 2
<211> 16438
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AAVS1-teton-Hgdnf
<400> 2
gtcgacttaa ccctagaaag ataatcatat tgtgacgtac gttaaagata atcatgcgta 60
aaattgacgc atgtgtttta tcgatctgta tatcgaggtt tatttattaa tttgaataga 120
tattaagttt tattatattt acacttacat actaataata aattcaacaa acaatttatt 180
tatgtttatt tatttattaa aaaaaaacaa aaactcaaaa tttcttctat aaagtaacaa 240
aacttttact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat 300
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ctccgggagg gccctttgtg cgggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg tgtgtgtgtg 1140
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gcggggcttt gtgcgctccg cgtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1260
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cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1800
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agactttctg cggaacaacg ccaagtcata ccgctgtgct ctcctctcac atcgcgacgg 2280
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gctcgcgttc ctgtgtcagc aaggcttctc cctggagaac gcactgtacg ctctgtccgc 2400
cgtgggccac tttacactgg gctgcgtatt ggaggaacag gagcatcaag tagcaaaaga 2460
ggaaagagag acacctacca ccgattctat gcccccactt ctgaaacaag caattgagct 2520
gttcgaccgg cagggagccg aacctgcctt ccttttcggc ctggaactaa tcatatgtgg 2580
cctggagaaa cagctaaagt gcgaaagcgg cgggccgacc gacgcccttg acgattttga 2640
cttagacatg ctcccagccg atgcccttga cgactttgac cttgatatgc tgcctgctga 2700
cgctcttgac gattttgacc ttgacatgct ccccggggga tccggaggat ccggagccac 2760
gaacttctct ctgttaaagc aagcaggaga cgtggaagaa aaccccggtc ctatgagcga 2820
gctgattaag gagaacatgc acatgaagct gtacatggag ggcaccgtgg acaaccatca 2880
cttcaagtgc acatccgagg gcgaaggcaa gccctacgag ggcacccaga ccatgagaat 2940
caaggtggtc gagggcggcc ctctcccctt cgccttcgac atcctggcta ctagcttcct 3000
ctacggcagc aagaccttca tcaaccacac ccagggcatc cccgacttct tcaagcagtc 3060
cttccctgag ggcttcacat gggagagagt caccacatac gaagacgggg gcgtgctgac 3120
cgctacccag gacaccagcc tccaggacgg ctgcctcatc tacaacgtca agatcagagg 3180
ggtgaacttc acatccaacg gccctgtgat gcagaagaaa acactcggct gggaggcctt 3240
caccgagacg ctgtaccccg ctgacggcgg cctggaaggc agaaacgaca tggccctgaa 3300
gctcgtgggc gggagccatc tgatcgcaaa cgccaagacc acatatagat ccaagaaacc 3360
cgctaagaac ctcaagatgc ctggcgtcta ctatgtggac tacagactgg aaagaatcaa 3420
ggaggccaac aacgagacct acgtcgagca gcacgaggtg gcagtggcca gatactgcga 3480
cctccctagc aaactggggc acaagcttaa ttccggactc ggcaagccta tccctaaccc 3540
tctgctgggc ctggacagca ccgatccaaa aaagaagaga aaggtagacc ctaagaagaa 3600
gaggaaggtg gaccccaaga agaagagaaa ggtgtgaggc agtggaggga gtggagcaac 3660
caatttttca ctcctgaagc aagctgggga tgtagaggag aatcctgggc ctatggacta 3720
caaagacgat gacgacaagc ttggcactag tggctttgcg aatgaattgg gacctaggtt 3780
gatgggcaag ctttctagtc aactcgagat gaccgagtac aagcccacgg tgcgcctcgc 3840
cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg ccgactaccc 3900
cgccacgcgc cacaccgtcg atccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg agctgcaaga 3960
actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg acgacggcgc 4020
cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt tcgccgagat 4080
cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac agatggaagg 4140
cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg tcggcgtctc 4200
gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag tggaggcggc 4260
cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc tccccttcta 4320
cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac cgcgcacctg 4380
gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgagc ggccgcactc ctcaggtgca ggctgcctat 4440
cagaaggtgg tggctggtgt ggccaatgcc ctggctcaca aataccactg agatcttttt 4500
ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg agcatctgac ttctggctaa 4560
taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgga 4620
aggacatatg ggagggcaaa tcatttaaaa catcagaatg agtatttggt ttagagtttg 4680
gcaacatatg cccatatgct ggctgccatg aacaaaggtt ggctataaag aggtcatcag 4740
tatatgaaac agccccctgc tgtccattcc ttattccata gaaaagcctt gacttgaggt 4800
tagatttttt ttatattttg ttttgtgtta tttttttctt taacatccct aaaattttcc 4860
ttacatgttt tactagccag atttttcctc ctctcctgac tactcccagt catagctgtc 4920
cctcttctct tatggagatc cctcgacctg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 4980
ttgtaaaacg acggccagtg ccaagcttgc atgcctgcag taagatacat tgatgagttt 5040
ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct 5100
attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt 5160
cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc 5220
tacaaatgtg gtaggtacca ccggtcctgc aggttagacg ttgatcctgg cgctggcgca 5280
agcagcaggg tgtctatcca tgccgctctc ctgggcgcag ctcatgggca gggtgccggc 5340
ggcctgctcc tccacctcgg gagggaagcc gtgagaattc acggcgatct tgccgccctt 5400
cttggcctta atgagaatct cgcggatctt gcgggcgtcc aacttgccgg tcagtccttt 5460
aggcacctcg tccacgaaca caacaccacc gcgcagcttc ttggcggttg taacctggct 5520
ggccacatag tccacgatct ccttctcggt catggtttta ccgtgttcca gcacgacgac 5580
tgcggcgggc agctcgccgg catcgtcgtc gggcaggccg gcgaccccgg cgtcgaagat 5640
gttggggtgt tgcagcagga tgctctccag ttcggctggg gctacctggt agcccttgta 5700
tttgatcagg ctcttcagcc ggtccacgat gaagaagtgc tcgtcctcgt cccagtaggc 5760
gatgtcgccg ctgtgcagcc agccgtcctt gtcgatgaga gcgtttgtag cctcggggtt 5820
gttaacgtag ccgctcatga tcatggggcc acggacgcac agctcgccgc gctggttcac 5880
acccagtgtc ttaccggtgt ccaagtccac caccttagcc tcgaagaagg gcaccacctt 5940
gcctactgcg ccaggcttgt cgtccccttc gggggtgatc agaatggcgc tggttgtttc 6000
tgtcaggccg tagccctggc ggatgcctgg taggtggaag cgtttggcca cggcctcacc 6060
tacctccttg ctgagcggcg ccccgccgct ggcgatctcg tgcaagttgc ttaggtcgta 6120
cttgtcgatg agagtgctct tagcgaagaa gctaaatagt gtgggcacca gcagggcaga 6180
ttgaatctta tagtcttgca agctgcgcaa gaatagctcc tcctcgaagc ggtacatgag 6240
cacgacccga aagccgcaga tcaagtagcc cagcgtggtg aacatgccga agccgtggtg 6300
aaatggcacc acgctgagga tagcggtgtc ggggatgatc tggttgccga agatggggtc 6360
gcgggcatga ctgaatcgga cacaagcggt gcggtgcggt agggctacgc ccttgggcaa 6420
tccggtactg ccactactgt tcatgatcag ggcgatggtt ttgtcccggt cgaagctctc 6480
gggcacgaag tcgtactcgt tgaagccggg tggcaaatgg gaagtcacga aggtgtacat 6540
gctttggaag ccctggtagt cggtcttgct atccatgatg atgatctttt gtatgatcgg 6600
tagcttcttt tgcacgttga ggatcttttg cagccctttc ttgctcacga atacgacggt 6660
gggctggctg atgcccatgc tgttcagcag ctcgcgctcg ttgtagatgt cgttagctgg 6720
ggccacagcc acaccgatga acagggcacc caacacgggc atgaagaact gcaagctatt 6780
ctcgctgcac accacgatcc gatggtttgt attcagccca tagcgcttca tagcttctgc 6840
cagccgaacg ctcatctcga agtactcggc gtaggtaatg tccacctcga tatgtgcgtc 6900
ggtaaaggcg atggtgccgg gcaccagggc gtagcgcttc atggctttgt gcagctgctc 6960
gccggcggtc ccgtcttcga gtgggtagaa tggcgctggg cccttcttaa tgtttttggc 7020
atcttccata ggaccggggt tttcttccac gtctcctgct tgctttaaca gagagaagtt 7080
cgtggctccg gatccggcgg cggttacgaa ctccagcagg accatgtgat cgcgcttctc 7140
gttggggtct ttgctcaggg cggactgatg gctcaggtag tggttgtcgg gcagcagcac 7200
ggggccgtcg ccgatggggg tgttctgctg gtagtggtcg gcgagctgca cgctgccgtc 7260
ctcaacgttg tggcggatct tgaagttagc cttgatgccg ttcttctgct tgtcggccgt 7320
gatatagacg ttgtggctgt tgaagttgta ctccagcttg tgccccagga tgttgccgtc 7380
ctccttgaag tcgatgccct tcagctcgat gcggttcacc agggtgtcgc cctcgaactt 7440
cacctcggcg cgggtcttgt aggtaccgtc gtccttgaaa gagatggtgc gctcctggac 7500
gtagccttcg ggcatggcgg acttgaagaa gtcgtgctgc ttcatgtggt cggggtagcg 7560
gctgaagcag gccacgccgt agccgaaggt ggtcacgagg gtgggccagg gcacgggcag 7620
cttgccggtg gtgcagatga acttcagggt cagcttgccg ttggtggcat cgccctcgcc 7680
ctcgccgcgg acgctgaact tgtggccgtt tacgtcgccg tccagctcga ccaggatggg 7740
caccaccccg gtgaacagct cctcgccctt gctcaccatg tccacgccgt cgtcgttcag 7800
gttgtccttg cgcttgctct tgatgcagcc catggtggcg gcggtcacca cgcgtccgcg 7860
atctgacggt tcactaaacg agctctgctt atataggcct cccaccgtac acgccacctc 7920
gacatactcg agtttactcc ctatcagtga tagagaacgt atgaagagtt tactccctat 7980
cagtgataga gaacgtatgc agactttact ccctatcagt gatagagaac gtataaggag 8040
tttactccct atcagtgata gagaacgtat gaccagttta ctccctatca gtgatagaga 8100
acgtatctac agtttactcc ctatcagtga tagagaacgt atatccagtt tactccctat 8160
cagtgataga gaacgtataa gctttaggcg tgtacggtgg gcgcctataa aagcagagct 8220
cgtttagtga accgtcagat cgcctggagc aattccacaa cacttttgtc ttataccaac 8280
tttccgtacc acttcctacc ctcgtaaaca gctggccgcc accatgaagt tatgggatgt 8340
cgtggctgtc tgcctggtgc tgctccacac cgcgtccgcc ttcccgctgc ccgccggtaa 8400
gaggcctccc gaggcgcccg ccgaagaccg ctccctcggc cgccgccgcg cgcccttcgc 8460
gctgagcagt gactcaaata tgccagagga ttatcctgat cagttcgatg atgtcatgga 8520
ttttattcaa gccaccatta aaagactgaa aaggtcacca gataaacaaa tggcagtgct 8580
tcctagaaga gagcggaatc ggcaggctgc agctgccaac ccagagaatt ccagaggaaa 8640
aggtcggaga ggccagaggg gcaaaaaccg gggttgtgtc ttaactgcaa tacatttaaa 8700
tgtcactgac ttgggtctgg gctatgaaac caaggaggaa ctgattttta ggtactgcag 8760
cggctcttgc gatgcagctg agacaacgta cgacaaaata ttgaaaaact tatccagaaa 8820
tagaaggctg gtgagtgaca aagtagggca ggcatgttgc agacccatcg cctttgatga 8880
tgacctgtcg tttttagatg ataacctggt ttaccatatt ctaagaaagc attccgctaa 8940
aaggtgtgga tgtatctgat tcgaaagccg cactcctcat aatcaacctc tggattacaa 9000
aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata 9060
cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc 9120
cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg 9180
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ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg ccacctggat 9420
tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc 9480
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ttaaatcctc gagggccgca ctcctcaggt gcaggctgcc tatcagaagg tggtggctgg 9660
tgtggccaat gccctggctc acaaatacca ctgagatctt tttccctctg ccaaaaatta 9720
tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc taataaagga aatttatttt 9780
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aaatcattta aaacatcaga atgagtattt ggtttagagt ttggcaacat atgccatatg 9900
ctggctgcca tgaacaaagg tggctataaa gaggtcatca gtatatgaaa cagccccctg 9960
ctgtccattc cttattccat agaaaagcct tgacttgagg ttagattttt tttatatttt 10020
gttttgtgtt atttttttct ttaacatccc taaaattttc cttacatgtt ttactagcca 10080
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ctataacaag aaaatatata tataataagt tatcacgtaa gtagaacatg aaataacaat 10200
ataattatcg tatgagttaa atcttaaaag tcacgtaaaa gataatcatg cgtcattttg 10260
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cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg 10560
agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct 10620
gtcgtgccag cggatccgca tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg 10680
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ggatccctgg aggcagcaaa catgctgtcc tgaagtggac ataggggccc gggttggagg 10980
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tagcacagac tagagaggta aggggggtag gggagctgcc caaatgaaag gagtgagagg 11100
tgacccgaat ccacaggaga acggggtgtc caggcaaaga aagcaagagg atggagaggt 11160
ggctaaagcc agggagacgg ggtactttgg ggttgtccag aaaaacggtg atgatgcagg 11220
cctacaagaa ggggaggcgg gacgcaaggg agacatccgt cggagaaggc catcctaaga 11280
aacgagagat ggcacaggcc ccagaaggag aaggaaaagg gaacccagcg agtgaagacg 11340
gcatggggtt gggtgaggga ggagagatgc ccggagagga cccagacacg gggaggatcc 11400
gctcagagga catcacgtgg tgcagcgccg agaaggaagt gctccggaaa gagcatcctt 11460
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atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 12060
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cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 12180
taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 12240
ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 12300
tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 12360
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aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 12540
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cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 12720
gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagaca ataaccctga 12780
taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc 12840
cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg 12900
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cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 13500
gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 13560
ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 13620
cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 13680
aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 13740
tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 13800
ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 13860
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 13920
ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 13980
agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 14040
atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 14100
cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 14160
ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 14220
ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 14280
agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 14340
agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 14400
gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 14460
cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 14520
gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 14580
tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 14640
tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 14700
aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 14760
cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 14820
cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 14880
aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 14940
ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 15000
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 15060
ccacctg 15067

Claims (51)

1.一种增加患有神经退行性紊乱的个体的中枢神经系统中的胶质源性神经营养因子(GDNF)水平的方法，所述方法包括向所述个体给予：
一批量的源自诱导多能干细胞的神经祖细胞(iNPC)，其中，所述iNPC表达基因组学上整合的表达盒，所述表达盒包括：
组成型启动子，
包含tet应答元件的诱导型双向多顺反子启动子，以及
编码GDNF的序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述神经退行性紊乱选自肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、帕金森氏病、亨廷顿氏病和阿尔茨海默氏病。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述神经退行性紊乱为肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述神经退行性紊乱为帕金森氏病。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述神经退行性紊乱为阿尔茨海默氏病。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述中枢神经系统包括大脑的区域。
7.如权利要求2所述的方法，其中，所述大脑的区域包括黑质。
8.如权利要求2所述的方法，其中，所述大脑的区域包括运动皮层。
9.如权利要求2所述的方法，其中，所述大脑的区域包括内嗅皮层和/或海马体。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述个体为人。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述基因组学上整合的表达盒被整合在所述基因组的区域，伴随着包含所述基因组学上整合的表达盒的细胞的降低的致癌转化的可能性。
12.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述基因组学上整合的表达盒被整合在选自如下的基因组的区域：腺相关病毒位点1(AAVS1)、趋化因子(C-C基序)受体5(CCR5)基因、以及小鼠Rosa26基因座的人直系同源物。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述基因组学上整合的表达盒被整合在腺相关病毒位点1(AAVS1)处。
14.如权利要求12所述的方法，其中，所述基因组学上整合的表达盒被整合在趋化因子(C-C基序)受体5(CCR5)基因处。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述基因组学上整合的表达盒通过同源重组进行整合。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，所述基因组学上整合的表达盒被整合为单拷贝。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述个体给予四环素类抗生素，其中，所述四环素类抗生素在所述一批量的源自诱导多能干细胞的神经祖细胞中诱导GDNF mRNA的转录。
18.一种治疗方法，所述方法包括：
向患有疾病或病症的受试者给予一批量的细胞，其中，所述细胞表达治疗蛋白或肽，并且进一步地，其中，所述细胞、治疗蛋白或肽、或两者能够治疗所述疾病或病症。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述细胞为神经谱系细胞。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述神经谱系细胞为神经祖细胞。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述神经祖细胞源自诱导多能干细胞(iPSC)。
22.如权利要求18所述的方法，其中，所述细胞表达来自一种或多种载体的表达盒。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述表达来自一种或多种载体的表达盒的细胞已被核转染、转染或电穿孔。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述一种或多种载体包括piggyBac载体、pBase载体或两者。
25.如权利要求24所述的方法，其中，所述piggyBac载体包含至少两个启动子，其中，至少一个启动子为诱导型的。
26.如权利要求25所述的方法，其中，所述至少一个诱导型的启动子为多顺反子的。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述至少一个诱导型的多顺反子启动子为双向的。
28.如权利要求22所述的方法，其中，所述表达盒为基因组学上整合的。
29.如权利要求28所述的方法，其中，所述表达盒编码所述治疗蛋白或肽。
30.如权利要求29所述的方法，其中，所述治疗蛋白或肽包括神经营养因子。
31.如权利要求30所述的方法，其中，所述神经营养因子包括胶质源性神经营养因子(GDNF)。
32.如权利要求18所述的方法，其中，所述疾病或病症为神经退行性疾病。
33.如权利要求32所述的方法，其中，所述神经退行性疾病为肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。
34.如权利要求18所述的方法，其中，给予一批量的细胞包括注射。
35.如权利要求18所述的方法，所述方法包括给予四环素、其类似物或衍生物。
36.一种方法，所述方法包括：
提供一批量的源自诱导多能干细胞(iPSC)的细胞；以及
将至少两种载体引入源自iPSC的细胞中。
37.如权利要求36所述的方法，其中，所述源自iPSC的细胞为神经祖细胞。
38.如权利要求36所述的方法，其中，引入至少两种载体包括核转染、转染和电穿孔中的一种或多种。
39.如权利要求36所述的方法，其中，所述至少两种载体包括piggyBac载体和pBase载体。
40.如权利要求39所述的方法，其中，所述piggyBac载体包括：
表达盒，所述表达盒包括：
组成型启动子，
包含tet应答元件的诱导型的双向多顺反子启动子，以及
编码蛋白或肽的序列；
两个转座子元件，其中，所述两个转座子元件侧接于所述表达盒。
41.如权利要求40所述的方法，其中，所述蛋白或肽包括神经营养因子。
42.如权利要求41所述的方法，其中，所述神经营养因子包括胶质源性神经营养因子(GDNF)。
43.如权利要求40所述的方法，其中，所述piggyBac载体包含同源重组序列。
44.如权利要求43所述的方法，其中，所述同源重组序列包括能够靶向基因组安全港的序列。
45.如权利要求44所述的方法，其中，所述基因组安全港为以下中的一种：腺相关病毒位点1(AAVS1)、趋化因子(C-C基序)受体5(CCR5)基因、小鼠Rosa26基因座的人直系同源物。
46.通过权利要求36所述的方法制备的一批量的细胞，其中，源自iPSC的细胞表达基因组学上整合的表达盒。
47.一种方法，所述方法包括：
向患有神经退行性疾病的受试者给予一批量的源自诱导多能干细胞的神经祖细胞(iNPC)，其中，所述细胞诱导性地表达能够治疗所述疾病的神经营养因子。
48.如权利要求47所述的方法，其中，所述iNPC表达通过核转染引入的基因组学上整合的表达盒，所述表达盒包括：
组成型启动子，
包含tet应答元件的诱导型的双向多顺反子启动子，以及
编码胶质源性神经营养因子(GDNF)的序列。
49.如权利要求47所述的方法，所述方法包括给予四环素、其类似物或衍生物。
50.一批量的能够诱导表达胶质源性神经营养因子(GDNF)的神经祖细胞，所述神经祖细胞包括：
一批量的源自诱导多能干细胞的神经祖细胞(iNPC)，其中，所述iNPC表达基因组学上整合的表达盒，所述表达盒包括：
组成型启动子，
包含tet应答元件的诱导型的双向多顺反子启动子，以及
编码GDNF的序列。
51.一种使用权利要求50所述的细胞治疗肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的方法。
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