JPWO2016063985A1 - 神経組織の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
これら製造法の出発材料である多能性幹細胞は、特に霊長類多能性幹細胞の場合、フィーダー細胞存在下・未分化維持因子添加条件で未分化維持培養されていた。近年、未分化維持培養の改良が進み、霊長類多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下(フィーダーフリー)・未分化維持因子添加条件にて培養する手法が報告されている(非特許文献7、8及び9)。当該手法でフィーダーフリー培養された多能性幹細胞を出発材料として、神経系細胞又は神経組織を安定的に製造する方法が切望されていた。
すなわち、本発明は以下に関する。
(1)多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1)TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び/又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに2)未分化維持因子を含む培地で培養する第一工程、
(2)第一工程で得られた細胞を浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第二工程、及び
(3)第二工程で得られた凝集体を、分化誘導因子の存在下もしくは非存在下に浮遊培養し、神経系細胞もしくは神経組織を含む凝集体を得る第三工程。
[2]第二工程において、第一工程で得られた細胞を分散し、当該分散した細胞を浮遊培養する、[1]に記載の製造方法。
[3]未分化維持因子が、FGFシグナル伝達経路作用物質である、[1]又は[2]に記載の製造方法。
[4]FGFシグナル伝達経路作用物質が、bFGFである、[3]に記載の製造方法。
[5]第二工程において、細胞を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地中で浮遊培養することを特徴とする、[1]〜[4]のいずれかに記載の製造方法。
[6]第三工程において、凝集体を分化誘導因子の存在下に浮遊培養することを特徴とする、[1]〜[5]のいずれかに記載の製造方法。
[7]TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質が、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質、TGFβシグナル伝達経路阻害物質、又はBMPシグナル伝達経路阻害物質である、[1]〜[6]のいずれかに記載の製造方法。
[8]TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質が、Lefty、SB431542、A-83-01又はLDN193189である、[1]〜[7]のいずれかに記載の製造方法。
[9]ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質がShh、SAG又はPurmorphamineである、[1]〜[8]のいずれかに記載の製造方法。
[10]第三工程における分化誘導因子が、BMPシグナル伝達経路作用物質である、[1]〜[9]のいずれかに記載の製造方法。
[11]BMPシグナル伝達経路作用物質が、BMP2、BMP4、BMP7及びGDF7からなる群から選ばれる1以上の蛋白質である、[10]に記載の製造方法。
[12]BMPシグナル伝達経路作用物質が、BMP4である、[10]に記載の製造方法。
[13]第三工程において得られる凝集体が、網膜組織を含む凝集体である、[1]〜[12]のいずれかに記載の製造方法。
[14]第三工程において得られる凝集体が、網膜前駆細胞、神経網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞、視細胞、桿体視細胞、錐体視細胞、水平細胞、アマクリン細胞、介在神経細胞、神経節細胞、網膜色素上皮細胞、及び毛様体周縁部細胞からなる群から選択される1又は複数の細胞を含む凝集体である、[1]〜[13]のいずれかに記載の製造方法。
[15]第三工程における分化誘導因子がBMPシグナル伝達経路作用物質であり、且つ第二工程における培地がソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む、[13]又は[14]に記載の製造方法。
[16]多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞であり、第二工程における培地中のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質濃度がSAG10nM〜700nMのソニック・ヘッジホッグシグナル伝達作用に相当する濃度であり、網膜組織がヒト網膜組織である、[15]に記載の製造方法。
[17]第三工程において、第二工程の開始後1日目から9日目の間にBMPシグナル伝達経路作用物質が培地に添加される、[15]又は[16]に記載の製造方法。
[18]第三工程において、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の濃度がSAG700nMのソニック・ヘッジホッグシグナル伝達作用に相当する濃度以下である培地で凝集体を培養する、[13]又は[14]に記載の製造方法。
[19]第三工程における分化誘導因子が、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び/又はWntシグナル伝達経路阻害物質である、[1]〜[9]のいずれかに記載の製造方法。
[20]TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質が、Lefty、SB431542、A-83-01又はLDN193189である、[19]に記載の製造方法。
[21]Wntシグナル伝達経路阻害物質が、IWR-1-endoである、[19]又は[20]に記載の製造方法。
[22]第三工程において得られる凝集体が、大脳組織を含む凝集体である、[1]〜[9]又は[19]〜[21]のいずれかに記載の製造方法。
[23]第一工程の培養時間が0.5時間〜144時間である、[1]〜[22]のいずれかに記載の製造方法。
[24]第一工程が接着培養法で行われる、[1]〜[23]のいずれかに記載の製造方法。
[25]第三工程において、第二工程開始後3日目から6日目の間に分化誘導剤が培地に添加される、[1]〜[24]のいずれかに記載の製造方法。
[26]多能性幹細胞が霊長類多能性幹細胞である、[1]〜[15]及び[17]〜[25]のいずれかに記載の製造方法。
[27]多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、[1]〜[26]のいずれかに記載の製造方法。
[28]多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、[1]〜[27]のいずれかに記載の製造方法。
[29]第二工程において、均一な凝集体を形成する、[1]〜[28]のいずれかに記載の製造方法。
[30]浮遊培養が、基底膜標品非存在下で行われる、[1]〜[29]のいずれかに記載の製造方法。
[31][1]〜[30]のいずれかに記載の方法により製造される神経系細胞又は神経組織を含有してなる、被験物質の毒性・薬効評価用試薬。
[32][1]〜[30]のいずれかに記載の方法により製造される神経系細胞または神経組織に被験物質を接触させ、該物質が該細胞又は該組織に及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法。
[33][1]〜[30]のいずれかに記載の方法により製造される神経系細胞又は神経組織を含有してなる、神経系細胞又は神経組織の障害に基づく疾患の治療薬。
[34]神経系細胞又は神経組織が、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞、網膜組織、大脳神経系前駆細胞、大脳層特異的神経細胞、又は大脳組織である、[33]に記載の治療薬。
[35][1]〜[30]のいずれかに記載の方法により製造される神経系細胞又は神経組織の有効量を、移植を必要とする対象に移植することを含む、神経系細胞又は神経組織の障害に基づく疾患の治療方法。
[36]神経系細胞又は神経組織の障害に基づく疾患の治療における使用のための、[1]〜[30]のいずれかに記載の方法により製造される神経系細胞又は神経組織。
[37][1]〜[30]のいずれかに記載の方法により製造される神経系細胞又は神経組織を有効成分として含有する、医薬組成物。
本発明において、「幹細胞」とは、分化能及び分化能を維持した増殖能(特に自己複製能)を有する未分化な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞(pluripotent stem cell)、複能性幹細胞(multipotent stem cell)、単能性幹細胞(unipotent stem cell)等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、三胚葉(外胚葉、中胚葉、内胚葉)及び/又は胚体外組織に属する細胞系譜すべてに分化しうる能力(分化多能性(pluripotency))を有する幹細胞をいう。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。
人工多能性幹細胞は、2006年、山中らによりマウス細胞で樹立された(Cell, 2006, 126(4), pp.663-676)。人工多能性幹細胞は、2007年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する(Cell, 2007, 131(5), pp.861-872;Science, 2007, 318(5858), pp.1917-1920;Nat. Biotechnol., 2008, 26(1), pp.101-106)。
人工多能性幹細胞として、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加などにより体細胞より人工多能性幹細胞を誘導することもできる(Science, 2013, 341, pp. 651-654)。
また、株化された人工多能性幹細胞を入手する事も可能であり、例えば、京都大学で樹立された201B7細胞、201B7-Ff細胞、253G1細胞、253G4細胞、1201C1細胞、1205D1細胞、1210B2細胞又は、1231A3細胞等のヒト人工多能性細胞株が、京都大学及びiPSアカデミアジャパン株式会社より入手可能である。株化された人工多能性幹細胞として、例えば、京都大学で樹立されたFf-I01細胞及びFf-I14細胞は、京都大学より入手可能である。
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーション法やPCR法等があげられる。
本発明における「大脳神経系前駆細胞」は、第一層ニューロン、第二層ニューロン、第三層ニューロン、第四層ニューロン、第五層ニューロン、第六層ニューロン、アストロサイト、及び、オリゴデンドロサイトのうちの少なくとも複数の分化系譜への分化能(多分化能)をもつ複能性幹細胞(複能性神経幹細胞、multi-potent neural stem cell)を含む。
本発明の製造方法1は、下記工程(1)〜(3)を含む、神経系細胞又は神経組織の製造方法である:
(1)多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1)TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び/又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに2)未分化維持因子を含む培地で培養する第一工程、
(2)第一工程で得られた細胞を浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第二工程、及び
(3)第二工程で得られた凝集体を、分化誘導因子の存在下もしくは非存在下に浮遊培養し、神経系細胞もしくは神経組織を含む凝集体を得る第三工程。
本発明の製造方法2は、下記工程(1)〜(3)を含む、網膜組織の製造方法である:
(1)多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1)TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び/又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに2)未分化維持因子を含む培地で培養する第一工程、
(2)第一工程で得られた細胞を浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第二工程、及び
(3)第二工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、網膜組織を含む凝集体を得る第三工程。
TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(例えば、TGFβシグナル伝達経路阻害物質(例、Lefty 、SB431542、A-83-01)、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質(例、Lefty、SB431542、A-83-01)、BMPシグナル伝達経路阻害物質(例、LDN193189)、又はこの組み合わせ(例、SB431542及びLDN193189)等);
ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(例、Shhタンパク質、SAG、PMA);又は
TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(例、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189)とソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(例、Shhタンパク質、SAG、PMA)との組み合わせ;並びに
bFGFを含有する無血清培地で、接着培養し、
工程(2)にて、工程(1)で得られた細胞を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(例、SAG、PMA、Shhタンパク質)を含む無血清培地中で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させ、
工程(3)にて、凝集体をBMPシグナル伝達経路作用物質(例えばBMP4)を含有する無血清培地で浮遊培養し、網膜前駆細胞、網膜細胞又は網膜組織を含む凝集体を得る。
工程(2)の培地は、好ましくは、ROCK阻害物質(例、Y-27632)を含む。
Activinシグナル伝達経路作用物質は、工程(D)の開始から例えば18日以内、好ましくは6日目に添加する。
本発明の製造方法3は、下記工程(1)〜(3)を含む、大脳組織の製造方法である:
(1)多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1)TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び/又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに2)未分化維持因子を含む培地で培養する第一工程、
(2)第一工程で得られた細胞を浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第二工程、及び
(3)第二工程で得られた凝集体を、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び/又はWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、大脳組織を含む凝集体を得る第三工程。
TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(例えば、TGFβシグナル伝達経路阻害物質(例、SB431542、A-83-01)、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質(例、Lefty)、BMPシグナル伝達経路阻害物質(例、LDN193189)、又はこの組み合わせ(例、SB431542及びLDN193189)等);
ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(例、Shhタンパク質、SAG、PMA);又は
TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(例、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189)とソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(例、Shhタンパク質、SAG、PMA)との組み合わせ;並びに
bFGF、を含有する無血清培地で、接着培養し、
工程(2)にて、工程(1)で得られた細胞を、
TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(例えば、TGFβシグナル伝達経路阻害物質(例、SB431542、A-83-01)、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質(例、Lefty)、BMPシグナル伝達経路阻害物質(例、LDN193189)、又はこの組み合わせ(例、SB431542及びLDN193189)等);及び
Wntシグナル伝達経路阻害物質(IWR-1-endo)、を含む無血清培地中で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させ、
工程(3)にて、工程(2)で得られた凝集体を
TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(例えば、TGFβシグナル伝達経路阻害物質(例、SB431542、A-83-01)、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質(例、Lefty)、BMPシグナル伝達経路阻害物質(例、LDN193189)、又はこの組み合わせ(例、SB431542及びLDN193189)等);及び
Wntシグナル伝達経路阻害物質(IWR-1-endo)、を含む無血清培地中で浮遊培養し、大脳神経系前駆細胞、大脳細胞又は大脳組織を含む凝集体を得る。
工程(2)の培地は、好ましくは、ROCK阻害物質(例、Y-27632)を含む。
TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(例えば、TGFβシグナル伝達経路阻害物質(例、SB431542、A-83-01)、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質(例、Lefty);
Wntシグナル伝達経路阻害物質(IWR-1-endo);及び
ROCK阻害物質(例、Y-27632)、を含む無血清培地中で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させ、
工程(3)にて、工程(2)で得られた凝集体を
TGFβシグナル伝達経路阻害物質(例、SB431542、A-83-01)又はNodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質(例、Lefty);及び
Wntシグナル伝達経路阻害物質(IWR-1-endo)、を含む無血清培地中で浮遊培養し、大脳神経系前駆細胞、大脳細胞又は大脳組織を含む凝集体を得る。
本発明の製造方法1、2又は3により製造された、神経組織又は神経系細胞(例、網膜組織、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞、大脳組織、大脳神経系前駆細胞、大脳層特異的神経細胞)は、神経組織又は神経系細胞の障害に基づく疾患の治療薬のスクリーニングや、毒性評価における、疾患研究材料、創薬材料として有用であるので、被験物質の毒性・薬効評価用試薬とすることができる。例えば、神経組織(例、網膜組織、大脳組織)の障害に基づく疾患、特に遺伝性の障害に基づく疾患のヒト患者から、iPS細胞を作製し、このiPS細胞を用いて本発明の方法により、神経組織又は神経系細胞(例、網膜組織、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞、大脳組織、大脳神経系前駆細胞、大脳層特異的神経細胞)を製造する。神経組織又は神経系細胞は、その患者が患っている疾患の原因となる神経組織の障害をインビトロで再現し得る。そこで、本発明は、本発明の製造方法1、2又は3により製造される神経組織又は神経系細胞(例、網膜組織、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞、大脳組織、大脳神経系前駆細胞、大脳層特異的神経細胞)に被験物質を接触させ、該物質が該細胞又は該組織に及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法を提供する。
(工程1)本発明の製造方法1、2又は3により製造された神経組織又は神経系細胞を、生存可能な培養条件で、一定時間、被検物質の存在下で培養した後、細胞の傷害の程度を測定する工程、
(工程2)本発明の製造方法1、2又は3により製造された神経組織又は神経系細胞を、生存可能な培養条件で、一定時間、被検物質の非存在下又はポジティブコントロールの存在下で培養した後、細胞の傷害の程度を測定する工程、
(工程3)(工程1)及び(工程2)において測定した結果の差異に基づき、工程1における被検物質が有する毒性を評価する工程。
ここで、「被検物質の非存在下」とは、被検物質の代わりに培養液、被検物質を溶解している溶媒のみを添加することを包含する。また、「ポジティブコントロール」とは、毒性を有する既知化合物を意味する。細胞の傷害の程度を測定する方法としては、生存する細胞数を計測する方法、例えば細胞内ATP量を測定する方法、又は、細胞染色(例えば細胞核染色)と形態観察により生細胞数を計測する方法等が挙げられる。
本発明は、本発明の製造方法1、2又は3により製造される神経組織又は神経系細胞(例、網膜組織、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞、大脳組織、大脳神経系前駆細胞、大脳層特異的神経細胞)の有効量を含む医薬組成物を提供する。
本発明の製造方法1、2又は3により製造される神経組織又は神経系細胞(例、網膜組織、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞、大脳組織、大脳神経系前駆細胞、大脳層特異的神経細胞)は、当該神経組織又は神経系細胞の障害に基づく疾患の移植医療に有用である。そこで、本発明は、本発明の製造方法1、2又は3により製造される神経組織又は神経系細胞(例、網膜組織、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞、大脳組織、大脳神経系前駆細胞、大脳層特異的神経細胞)を含む、当該神経組織又は神経系細胞の障害に基づく疾患の治療薬を提供する。当該神経組織又は神経系細胞の障害に基づく疾患の治療薬として、或いは、当該神経組織の損傷状態において、該当する損傷部位を補充するために、本発明の製造方法1、2又は3により製造された神経組織又は神経系細胞(例、網膜組織、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞、大脳組織、大脳神経系前駆細胞、大脳層特異的神経細胞)を用いることが出来る。移植を必要とする、神経組織又は神経系細胞の障害に基づく疾患、又は神経組織の損傷状態の患者に、本発明の製造方法1、2又は3により製造された神経組織又は神経系細胞を移植し、当該神経系細胞や、障害を受けた神経組織自体を補充することにより、神経組織又は神経系細胞の障害に基づく疾患、又は神経組織の損傷状態を治療することが出来る。例えば、神経組織又は神経関連細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、神経変性疾患(例えば、脳虚血障害、脳梗塞、パーキンソン氏病、脊髄損傷、脳血管障害・脳/脊髄外傷性障害(例、脳梗塞、頭部外傷・脳挫傷(TBI)・脊髄損傷多系統萎縮症)、典型的な神経変性疾患(筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン氏病(PD)、パーキンソン症候群 、アルツハイマー型痴呆 、 進行性核上性麻痺(PSP)、ハンチントン病 、多系統萎縮症(MSA)、脊髄小脳変性症(SCD))、脱髄疾患・神経筋疾患(多発性硬化症(MS)、急性散在性脳脊髄炎(ADEM) 、炎症性広汎性硬化症(Schilder病)、亜急性硬化症全脳炎、進行性多巣性白質脳症、低酸素脳症、橋中心髄鞘破壊症、Binswanger病、ギラン・バレー症候群、フィッシャー症候群、慢性炎症性脱髄性多発根神経炎、脊髄空洞症、脊髄小脳変性症、黒質線条体変性症(SND)、オリーブ橋小脳萎縮症(OPCA)、シャイ・ドレーガー症候群(Shy-Drager症候群))、眼科疾患(黄斑変性症、加齢黄斑変性、網膜色素変性、白内障、緑内障、角膜疾患、網膜症)、難治性てんかん、進行性核上性麻痺、脊髄空洞症、脊髄性筋萎縮症(SMA)、球脊髄性筋萎縮症(SBMA)、原発性側索硬化症(PLS)、進行性核上性麻痺(PSP)、大脳皮質基底核変性症(CBD)、ハンチントン病(HD)、有棘赤血球舞踏病、脊髄空洞症、前頭側頭葉変性症、Charcot-Marie-Tooth disease病、ジストニア、Pantothenate kinase-associated neurodegeneration、家族性認知症、パーキンソン症候群、老人性失認症、痙性対麻痺、レビー小体型認知症等が挙げられる。例えば、大脳組織又は大脳関連細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、神経変性疾患(例えば、脳虚血障害、脳梗塞、運動ニューロン病、ALS、アルツハイマー病、ポリグルタミン病、大脳皮質基底核変性症)が挙げられる。網膜組織又は網膜関連細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、網膜変性症、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、有機水銀中毒、クロロキン網膜症、緑内障、糖尿病性網膜症、新生児網膜症、などが挙げられる。さらに、神経組織の損傷状態としては、神経組織摘出後の患者、神経組織内腫瘍への放射線照射後の患者、外傷が挙げられる。
ヒトiPS細胞(1231A3株、京都大学より入手)を、「Scientific Reports, 4, 3594 (2014)」に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地(AK03、味の素社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(ニッピ社製)を用いた。
実施例1記載の方法にて、ヒトiPS細胞(1231A3株)をStemFit培地を用いて、サブコンフレント1日前までフィーダーフリー培養した。当該サブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、SB431542(TGFβR阻害剤、5μM)、LDN193189(BMPR阻害剤、100 nM)、SAG(Shh作用物質、300 nM)、又はTGFβR阻害剤及びBMPR阻害剤(SB431542を5μM、及び、LDN193189を100 nM)の存在下(工程1:Precondition処理)あるいは非存在下(工程1:Preconditionしない)で、1日間フィーダーフリー培養した。得られた細胞をそれぞれ4%パラホルムアルデヒドで固定し、多能性幹細胞マーカーの1つであるOct3/4の免疫染色を行った。得られた免疫染色した細胞を、倒立型蛍光顕微鏡(BIOREVO, キーエンス社)を用いて明視野観察及び蛍光像の観察を行った。免疫染色解析において、前記マーカーが陽性であるかどうか判定する際、バックグラウンドと比較して、輝度値が2倍以上高ければ陽性とした。その結果、いずれの化合物でPrecondition処理した細胞も、Preconditionしていない細胞と同様に、Oct3/4陽性であることがわかった(図2)。すなわち、これらの条件でPreconditionした細胞は、多能性様状態を維持していたことがわかった。
実施例1記載の方法にて、ヒトiPS細胞(1231A3株)をStemFit培地を用いて、サブコンフレント1日前までフィーダーフリー培養した。当該サブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、SB431542 (TGFβR阻害剤、5μM)の存在下(工程1、Precondition: TGFβRi処理)あるいは非存在下(工程1:Preconditionしない)で、1日間フィーダーフリー培養した。
実施例1記載の方法にて、ヒトiPS細胞(1231A3株)をStemFit培地を用いて、サブコンフレント1日前までフィーダーフリー培養した。当該サブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、SB431542(TGFβR阻害剤、5μM)の存在下(工程1、Precondition: TGFβRi処理)あるいは非存在下(工程1:Preconditionしない)で、1日間フィーダーフリー培養した。
実施例1記載の方法にて、ヒトiPS細胞(1231A3株)をStemFit培地を用いて、サブコンフレント1日前までフィーダーフリー培養した。当該サブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、SB431542(TGFβR阻害剤、5μM)、又はLDN193189(BMPR阻害剤、100 nM)の存在下(工程1:Precondition処理)あるいは非存在下(工程1:Preconditionしない)で、1日間フィーダーフリー培養した。
実施例1記載の方法にて、ヒトiPS細胞(1231A3株)をStemFit培地を用いて、サブコンフレント1日前までフィーダーフリー培養した。当該サブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、LDN193189(BMPR阻害剤、100 nM)の存在下(工程1:Precondition処理)あるいは非存在下(工程1:Preconditionしない)で、1日間フィーダーフリー培養した。
実施例1記載の方法にて、ヒトiPS細胞(1231A3株)をStemFit培地を用いて、サブコンフレント1日前までフィーダーフリー培養した。当該サブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、LDN193189(BMPR阻害剤、100 nM)の存在下(工程1:Precondition処理)、1日間フィーダーフリー培養した。
実施例1記載の方法にて、ヒトiPS細胞(1231A3株)をStemFit培地を用いて、サブコンフレント1日前までフィーダーフリー培養した。当該サブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、SB431542(TGFβR阻害剤、5μM)、LDN193189(BMPR阻害剤、100 nM)又はSAG(Shhシグナル伝達経路作用物質、300 nM)の存在下(Precondition処理)あるいは非存在下(工程1:Preconditionしない)で、1日間フィーダーフリー培養した。
実施例8記載の方法で、フィーダーフリー培地としてStemFit培地を用いたヒトiPS細胞をスタート原料として、工程1でTGFβR阻害物質(SB431542)又はBMPR阻害物質(LDN193189)を用い、工程2でShhシグナル伝達経路作用物質を用い、工程3にてBMPシグナル伝達経路作用物質を添加した条件又は添加しなかった条件にて、細胞凝集体を調製した。これら全ての条件で形成された浮遊培養開始後23日目の細胞凝集体では、神経組織が形成されていた。前記細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10(抗Chx10抗体、Exalpha社, ヒツジ)、又は、網膜組織マーカーの1つであるRx(抗Rx抗体、Takara社、ギニアピッグ)について免疫染色を行い、蛍光顕微鏡にて観察した。その結果、工程1にてTGFβR阻害剤(SB431542)又はBMPR阻害剤(LDN193189)にてPreconditionし、工程2でShhシグナル伝達経路作用物質を添加し、工程3にてBMP4を添加しなかった条件から作製した細胞凝集体では、全細胞中のRx陽性細胞の割合が10%未満(Rx強陽性(網膜に対応)は3%未満、Rx弱陽性(網膜以外の神経組織に対応)は7%未満)、かつChx10陽性細胞の割合も3%未満であることがわかった(図9A,C,E,G)。一方、工程1にてTGFβR阻害剤(SB431542)にてPreconditionし、工程2でShhシグナル伝達経路作用物質を添加し、工程3にてBMP4を添加した条件から作製した細胞凝集体では、全細胞中のRx陽性細胞の割合が80%以上、全細胞中のChx10陽性細胞の割合も70%以上であることがわかった(図9B,F)。また、工程1にてBMPR阻害剤(LDN193189)にてPreconditionし、工程2でShhシグナル伝達経路作用物質を添加し、工程3にてBMP4を添加した条件から作製した細胞凝集体では、全細胞中のRx陽性細胞の割合が50%以上、全細胞中のChx10陽性細胞の割合も40%以上であることがわかった(図9D,H)。さらに、連続切片の解析から、Chx10も陽性細胞の割合が高い(95%以上)の神経組織において、Rx強陽性であることがわかった(図9B,D,F,H)。
ヒトiPS細胞(1231A3株、京都大学より入手)を、「Scientific Reports, 4, 3594 (2014)」に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した。フィーダーフリー培地としてはEssential 8培地(Life technologies社製、Nature Methods, 8, 424-429 (2011))、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(ニッピ社製)を用いた。
実施例10記載の方法で、フィーダーフリー培養としてEssential 8培地を用いたヒトiPS細胞をスタート原料として、工程1でTGFβR阻害物質(SB431542)を用い、工程2でShhシグナル伝達経路作用物質を用いた細胞凝集体を調製した。浮遊培養開始後18日目の前記細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、神経組織マーカー(神経系前駆細胞)の1つであるNestin(抗Nestin抗体、Millipore社、マウス)、神経組織マーカー(ニューロン)の1つであるTuJ1(抗βIII-tubulin抗体、Promega社、マウス)、又は、神経組織マーカーの1つであるPSA-NCAM(抗PSA-NCAM抗体、Millipore社、マウスIgM)について免疫染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、前記細胞凝集体では、全細胞中のNestin陽性細胞の割合が30%程度、全細胞中のTuJ1陽性細胞の割合も70%程度、そしてPSA-NCAM陽性細胞の割合が70%程度であることがわかった(図11)。さらに、連続切片の解析から、明視野像での形態観察にて神経組織と判別できる領域はNestin陽性、TuJ1陽性、及びPSA-NCAM陽性であることが確認できた(図11)。すなわち、工程1にてTGFβR阻害物質にてPreconditionし、工程2にてSAGを添加した条件で作製された細胞凝集体では、神経組織が効率よく形成されることがわかった。
実施例10記載の方法で、フィーダーフリー培養としてEssential 8培地を用いたヒトiPS細胞をスタート原料として、工程1でTGFβR阻害物質(SB431542)を用い、工程2でShhシグナル伝達経路作用物質を用い、工程3にてBMPシグナル伝達経路作用物質を添加した条件又は添加しなかった条件で、細胞凝集体を調製した。浮遊培養開始後18日目の前記細胞凝集体を、それぞれ4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10(抗Chx10抗体、Exalpha社, ヒツジ)、又は、網膜組織マーカーの1つであるRx(抗Rx抗体、Takara社、ギニアピッグ)について免疫染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、工程1にてTGFβR阻害剤(SB431542) にてPreconditionし、工程2でShhシグナル伝達経路作用物質を添加し、工程3にてBMP4を添加しなかった条件から作製した細胞凝集体では、全細胞中のRx陽性細胞の割合が10%未満(Rx強陽性(網膜に対応)は3%未満、Rx弱陽性(網膜以外の神経組織に対応)は7%未満)、かつChx10陽性細胞の割合も3%未満であることがわかった(図12)。一方、工程1にてTGFβR阻害剤(SB431542) にてPreconditionし、工程2でShhシグナル伝達経路作用物質を添加し、工程3にてBMP4を添加した条件から作製した細胞凝集体では、全細胞中のRx強陽性細胞の割合が30%以上、全細胞中のChx10陽性細胞の割合も20%以上であることがわかった(図12)。さらに、連続切片の解析から、Chx10も陽性細胞の割合が高い(95%以上)の神経組織において、Rx強陽性であることがわかった。この結果から、フィーダーフリー培養としてEssential 8培地を用いたヒトiPS細胞をスタート原料として、工程1でTGFβR阻害物質を用い、工程2でShhシグナル伝達経路作用物質を用い、工程3にてBMPシグナル伝達経路作用物質を添加した条件で、網膜組織が製造できることが分かった。
実施例1記載の方法にて、ヒトiPS細胞(1231A3株)をStemFit培地を用いてサブコンフレント1日前になるまでフィーダーフリー培養した。当該サブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、SB431542(TGFβR阻害剤、5μM)及びSAG(Shhシグナル伝達経路作用物質、300 nM)の存在下で、1日間フィーダーフリー培養した(工程1、Precondition: TGFβRi+SAG処理)。
条件2.浮遊培養開始後3日目に、Y27632及びSAGを含まず、ヒト組換えBMP4を終濃度1.5 nMになるような無血清培地を加えた。浮遊培養開始後6日目以降、3日に一回、Y27632、SAG及びBMP作用物質を含まない前記無血清培地にて、半量培地交換(体積の半分量、すなわち75μlを廃棄し、Y27632、SAG及びBMPシグナル伝達経路作用物質を含まない前記無血清培地を75μl加えた)した。
条件3.浮遊培養開始後3日目に、Y27632、SAG及びBMPシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地を50μl加えた。浮遊培養開始後6日目に、Y27632及びSAGを含まず、ヒト組換えBMP4を終濃度1.5 nMになるような無血清培地を加えた。浮遊培養開始後6日目以降、3日に一回、Y27632、SAG及びBMP作用物質を含まない前記無血清培地にて、半量培地交換(体積の半分量、すなわち75μlを廃棄し、Y27632、SAG及びBMPシグナル伝達経路作用物質を含まない前記無血清培地を75μl加えた)した。
実施例1記載の方法にて、ヒトiPS細胞(1231A3株)をStemFit培地を用いてサブコンフレント1日前までフィーダーフリー培養した。当該サブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、SB431542(TGFβR阻害剤、5μM)及びSAG(Shhシグナル伝達経路作用物質、300 nM)の存在下で、1日間フィーダーフリー培養した(工程1、Precondition: TGFβRi+SAG処理)。
ヒトiPS細胞(1231A3株、京都大学より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した。フィーダーフリー培地としてはStem Fit培地(AK03;味の素社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(ニッピ社製)を用いた。
・条件1.ヒト組み換えLefty-A(Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質、R&D社製、Lefty-A C-terminus、20μg/ml)
・条件2.ヒト組み換えLefty-A(Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質、R&D社製 Lefty-A C-terminus, 20μg/ml)及びSAG(Shhシグナル伝達経路作用物質、300 nM)
・条件3.外来性のTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びShhシグナル伝達経路作用物質非存在下(Preconditionしない条件)
ヒトiPS細胞(1231A3株、京都大学より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した。フィーダーフリー培地としてはStem Fit培地(AK03;味の素社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(ニッピ社製)を用いた。
これらの結果から、工程1にてTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質としてTGFβR阻害剤であるA83-01にてPreconditionし、工程2にてShhシグナル伝達経路作用物質を添加した条件では、網膜組織を製造できることがわかった。
ヒトiPS細胞(1231A3株、京都大学より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した。フィーダーフリー培地としてはStem Fit培地(AK03;味の素社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(ニッピ社製)を用いた。
・条件1.A83-01(Wako社製、TGFβR阻害剤、0.5μM)
・条件2.A83-01(Wako社製、TGFβR阻害剤、0.5μM)及びSAG(Enzo社製、Shhシグナル伝達経路作用物質、300 nM)
・条件3.A83-01(Wako社製、TGFβR阻害剤、0.5μM)及びPurmorphamine (Wako社製、 Shhシグナル伝達経路作用物質、0.2μM)
・条件4.A83-01(Wako社製、TGFβR阻害剤、0.5μM)及びヒト組み換えShh(R&D社製、Shhシグナル伝達経路作用物質、50ng/ml)
・条件5.A83-01(Wako社製、TGFβR阻害剤0.5μM)及びヒト組み換えShh(R&D社製、Shhシグナル伝達経路作用物質、300ng/ml)
・条件6.外来性のTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びShhシグナル伝達経路作用物質非存在下(Preconditionしない条件)
これらの結果から、工程1にて、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(A83-01)、又はTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(A83-01)及びShhシグナル伝達経路作用物質(SAG、PMA、ヒト組み換えShhのいずれか)を用いてPreconditionした条件で、フィーダーフリーで培養したヒトiPS細胞から効率よく神経組織が製造できることが分かった。
ヒトiPS細胞(1231A3株、京都大学より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した。フィーダーフリー培地としてはStem Fit培地(AK03;味の素社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(ニッピ社製)を用いた。
・条件1.SAG(Enzo社製、Shhシグナル伝達経路作用物質、30 nM)を添加した。
・条件2.Purmorphamine (Wako社製、Shhシグナル伝達経路作用物質、0.2μM)を添加した。
・条件3.ヒト組み換えShh (R&D社製、Shhシグナル伝達経路作用物質、300ng/ml)を添加した。
・条件4.浮遊培養開始時に外来性のShhシグナル伝達経路作用物質は添加しなかった
ヒトiPS細胞(1231A3株、京都大学より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した。フィーダーフリー培地としてはStem Fit培地(AK03;味の素社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(ニッピ社製)を用いた。
ヒトiPS細胞(1231A3株、京都大学より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した。フィーダーフリー培地としてはStem Fit培地(AK03;味の素社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(ニッピ社製)を用いた。
・条件1.SAG(Enzo社製、Shhシグナル伝達経路作用物質、300 nM)を48時間
・条件2.SAG(Enzo社製、Shhシグナル伝達経路作用物質、300 nM)を72時間
・条件3.A83-01(Wako社製、TGFβR阻害剤、0.5μM)及びSAG(Enzo社製、Shhシグナル伝達経路作用物質、300 nM)を24時間
・条件4. A83-01(Wako社製、TGFβR阻害剤、0.5μM)及びSAG(Enzo社製、Shhシグナル伝達経路作用物質、300 nM)を48時間
・条件5.A83-01(Wako社製、TGFβR阻害剤、0.5μM)及びSAG(Enzo社製、Shhシグナル伝達経路作用物質、300 nM)を72時間
・条件6.外来性のTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びShhシグナル伝達経路作用物質非存在下(Preconditionしない条件)
ヒトiPS細胞(1231A3株、京都大学より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した。フィーダーフリー培地としてはStem Fit培地(AK03;味の素社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(ニッピ社製)を用いた。
ヒトiPS細胞(Ff-I01株、京都大学より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した。フィーダーフリー培地としてはStem Fit培地(AK03;味の素社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(ニッピ社製)を用いた。
・条件1.(+BMP4 1回添加) 浮遊培養3日目に、外来性のヒト組み換えBMP4の終濃度が1.5 nM(55 ng/ml)になるように、Y27632及びSAGを含まず、ヒト組み換えBMP4(R&D社製)を含む培地を50μl加えた。浮遊培養開始6日目以降、Y27632、SAG及びヒト組み換えBMP4を含まない無血清培地にて、半量培地交換した。
・条件2.(+BMP4 2回添加) 浮遊培養3日目に、外来性のヒト組み換えBMP4の終濃度が1.5 nM(55 ng/ml)になるように、Y27632、SAGを含まず、ヒト組み換えBMP4(R&D社製)を含む培地を50μl加えた。浮遊培養開始6日目に培地を50μl抜き、外来性のヒト組み換えBMP4の終濃度を1.5 nM(55 ng/ml)に維持できるように、Y27632及びSAGを含まず、ヒト組み換えBMP4(R&D社製)を含む培地を50μl加えた。浮遊培養開始9日目以降、Y27632、SAG及びヒト組み換えBMP4を含まない無血清培地にて、半量培地交換した。
・条件3.(+BMP4 3回添加) 浮遊培養3日目に、外来性のヒト組み換えBMP4の終濃度が1.5 nM(55 ng/ml)になるように、Y27632及びSAGを含まず、ヒト組み換えBMP4(R&D社製)を含む培地を50μl加えた。浮遊培養開始6日目及び9日目に培地を50μl抜き、外来性のヒト組み換えBMP4の終濃度を1.5 nM(55 ng/ml)に維持できるように、Y27632及びSAGを含まず、ヒト組み換えBMP4(R&D社製)を含む培地を50μl加えた。浮遊培養開始12日目以降、Y27632、SAG及びヒト組み換えBMP4を含まない無血清培地にて、半量培地交換した。
その後、2〜4日に一回、Y27632、SAG及びヒト組み換えBMP4を含まない前記無血清培地にて、半量培地交換した。
ヒトiPS細胞(Ff-I01株、京都大学より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した。フィーダーフリー培地としてはStem Fit培地(AK03; 味の素社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(ニッピ社製)を用いた。
ヒトiPS細胞(Ff-I01株、京都大学より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した。フィーダーフリー培地としてはStem Fit培地(AK03;味の素社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(ニッピ社製)を用いた。
ヒトiPS細胞(Ff-I01株、京都大学より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した。フィーダーフリー培地としてはStem Fit培地(AK03;味の素社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(ニッピ社製)を用いた。
ヒトiPS細胞(DSPC-3株、大日本住友製薬にて樹立)は、市販されているセンダイウイルスベクター(Oct3/4、Sox2、KLF4、c-Mycの4因子、DNAVEC社(現、ID Pharma社)製サイトチューンキット)を用いて、Life Technologies社の公開プロトコル(iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit、Publication Number MAN0009378、Revision 1.0)、及び、京都大学の公開プロトコル(ヒトiPS細胞の樹立・維持培養、CiRA_Ff-iPSC_protocol_JP_v140310、http://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/protocol.html)記載の方法をもとに、StemFit培地 (AK03;味の素社製)、Laminin511-E8(ニッピ社製)を用いて樹立した。
・条件1.SB431542(TGFβR阻害剤、5μM)及びSAG(Shhシグナル伝達経路作用物質、300 nM)(図26、B,C,F,G)
・条件2.LDN193189(BMPシグナル伝達経路阻害物質、100 nM)及びSAG(Shhシグナル伝達経路作用物質、300 nM)(図26、D,E,H,I)
・条件3.外来性のTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びShhシグナル伝達経路作用物質非存在下(図26、A)
Rx::GFPノックインヒトES細胞(KhES-1株由来;Cell Stem Cell, 2012, 10(6) 771-785)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した(図27、A)。フィーダーフリー培地としてはStem Fit培地(AK03;味の素社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(ニッピ社製)を用いた。
・条件1.SB431542(TGFβR阻害剤、5μM)及びSAG(Shhシグナル伝達経路作用物質、30 nM)(図27、C,E)
・条件2.LDN193189(BMPR阻害剤、100 nM)及びSAG(Shhシグナル伝達経路作用物質、30 nM)(図27、D,F)
・条件3.外来性のTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びShhシグナル伝達経路作用物質非存在下(図27、B)
実施例1記載の方法にて、ヒトiPS細胞(1231A3株)をStemFit培地を用いて、サブコンフレント1日前までフィーダーフリー培養した。当該サブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、TGFβR阻害剤(SB431542、5μM)及びShhシグナル伝達経路作用物質(SAG、300 nM)にて1日間フィーダーフリー培養した(Precondition)。
浮遊培養開始後、3日目にY27632及びSAGを含まず、ヒト組み換えBMP4(R&D社製)を含む前記無血清培地を用いて、外来性のヒト組み換えBMP4を終濃度1.5 nMになるように培地交換した。浮遊培養開始後3日目以降、2〜4日に一回、Y27632、SAG、及び、ヒト組み換えBMP4を含まない前記無血清培地にて、半量培地交換した。浮遊培養開始後17日目には、細胞凝集体が成長し、神経上皮が形成された。
実施例28記載の方法で、フィーダーフリー培地としてStemFit培地を用いたヒトiPS細胞(1231A3株)をスタート原料として、工程1でTGFβR阻害剤(SB431542、5μM)及びShhシグナル伝達経路作用物質(SAG、300 nM)にて1日間Preconditionし、工程2でShhシグナル伝達経路作用物質(SAG、30 nM)を用い、工程3にてBMPシグナル伝達経路作用物質(BMP4、終濃度1.5 nM)を添加した条件にて、細胞凝集体を調製した。浮遊培養開始後18日目には、神経上皮が形成された。
実施例29記載の方法で、フィーダーフリー培地としてStemFit培地を用いたヒトiPS細胞(1231A3株)をスタート原料として、工程1でTGFβR阻害剤(SB431542、5μM)及びShhシグナル伝達経路作用物質(SAG、300 nM)にて1日間Preconditionし、工程2でShhシグナル伝達経路作用物質(SAG、30 nM)を用い、工程3にてBMPシグナル伝達経路作用物質(BMP4、終濃度1.5 nM)を添加した条件にて、細胞凝集体を調製した。浮遊培養開始後18日目には、神経上皮が形成された。
実施例1記載の方法で、ヒトiPS細胞(1231A3株)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した。フィーダーフリー培地としてはStem Fit培地(AK03;味の素社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(ニッピ社製)を用いた。
・条件1.SB431542(TGFβR阻害剤、5μM)及びSAG(Shhシグナル伝達経路作用物質、300 nM)
・条件2.LDN193189(BMPR阻害剤、100 nM)及びSAG(Shhシグナル伝達経路作用物質、300 nM)
・条件3.外来性のTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びShhシグナル伝達経路作用物質非存在下(Preconditionしない条件)
実施例31記載の方法で調製された浮遊培養開始後27日目の細胞凝集体を、90 mmの低接着培養皿(住友ベークライト社製)に移し、DMEM/F12培地(Life Technologies社製)に、1% N2 supplement(Life Technologies社製)を加えた無血清培地にて、37℃、5%CO2で、浮遊培養した。この時、一枚の90 mmの低接着培養皿あたり、30個程度の凝集体を、10 mlの無血清培地で浮遊培養した。その後、浮遊培養開始後40日目まで、2〜4日に一回、DMEM/F12培地(Life Technologies社製)に1% N2 supplement(Life Technologies社製)を加えた無血清培地にて半量培地交換した。
さらに、工程1にて条件1又は条件2で培養し、工程2にてSAGを含む条件(条件(A))又はSAGを含まない条件(条件(B))のいずれの4条件でも、浮遊培養開始後60日目の細胞凝集体で、FoxG1陽性の大脳の細胞が存在することがわかった。
実施例8記載の方法で、フィーダーフリー培養したサブコンフレント1日前のヒトiPS細胞(1231A3株)を下記2条件で、1日間フィーダーフリー培養した。
・条件1.SB431542(TGFβR阻害剤、5μM)
・条件2.LDN193189(BMPR阻害剤、100 nM)
・条件3.外来性のTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びShhシグナル伝達経路作用物質非存在下(Preconditionしない条件)
・条件(A).前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を非細胞接着性のU底の96穴培養プレート(スミロン スフェロイド U底プレートPrimeSurface 96U底プレート,住友ベークライト社)の1ウェルあたり1.2 x 104細胞になるように100μlの前記無血清培地に浮遊させ、37℃、5%CO2で浮遊培養した。
・条件(B).前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を非細胞接着性の60mmの平底の細胞培養皿(浮遊培養用シャーレ,住友ベークライト社)の1培養皿あたり2.4 x 105細胞になるように4mlの前記無血清培地に浮遊させ、37℃、5%CO2で浮遊培養した。
ヒトiPS細胞(Ff-I01株、京都大学より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した。フィーダーフリー培地としてはStem Fit培地(AK03N; 味の素社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(ニッピ社製)を用いた。
ヒトiPS細胞(Ff-I01株、京都大学より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した。フィーダーフリー培地としてはStem Fit培地(AK03N; 味の素社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(ニッピ社製)を用いた。
・条件1.サブコンフレントの24時間前のヒトiPS細胞を、SAG(Shhシグナル伝達経路作用物質、300 nM)を添加したStem Fit培地(AK03N)で、24時間、フィーダーフリー培養した。
・条件2.サブコンフレントの48時間前のヒトiPS細胞を、SAG(Shhシグナル伝達経路作用物質、300 nM)を添加したStem Fit培地(AK03N)で、48時間、フィーダーフリー培養した。
・条件3.サブコンフレントの72時間前のヒトiPS細胞を、SAG(Shhシグナル伝達経路作用物質、300 nM)を添加したStem Fit培地(AK03N)で、72時間、フィーダーフリー培養した。
・条件4.サブコンフレントの96時間前のヒトiPS細胞を、SAG(Shhシグナル伝達経路作用物質、300 nM)を添加したStem Fit培地(AK03N)で、96時間、フィーダーフリー培養した。
ヒトiPS細胞(1231A3株、京都大学より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した。フィーダーフリー培地としてはStem Fit培地(AK03;味の素社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(ニッピ社製)を用いた。
・条件1.サブコンフレント直前のヒトiPS細胞を、LDN193189(BMPR阻害剤、100 nM)及びSAG(Shhシグナル伝達経路作用物質、300 nM)を添加したStem Fit培地(AK03)で、30分間、フィーダーフリー培養した。
・条件2.サブコンフレント直前のヒトiPS細胞を、LDN193189(BMPR阻害剤、100 nM)及びSAG(Shhシグナル伝達経路作用物質、300 nM)を添加したStem Fit培地(AK03)で、6時間、フィーダーフリー培養した。
・条件3.サブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、LDN193189(BMPR阻害剤、100 nM)及びSAG(Shhシグナル伝達経路作用物質、300 nM)を添加したStem Fit培地(AK03)で、24時間、フィーダーフリー培養した。
・条件4.サブコンフレント2日前のヒトiPS細胞を、LDN193189(BMPR阻害剤、100 nM)及びSAG(Shhシグナル伝達経路作用物質、300 nM)を添加したStem Fit培地(AK03)で、48時間、フィーダーフリー培養した。
・条件5.TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び/又はShhシグナル伝達経路作用物質を添加しない条件でフィーダーフリー培養したサブコンフレントのヒトiPS細胞。
Claims (37)
- 下記工程(1)〜(3)を含む、神経系細胞又は神経組織の製造方法;
(1)多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1)TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び/又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに2)未分化維持因子を含む培地で培養する第一工程、
(2)第一工程で得られた細胞を浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第二工程、及び
(3)第二工程で得られた凝集体を、分化誘導因子の存在下もしくは非存在下に浮遊培養し、神経系細胞もしくは神経組織を含む凝集体を得る第三工程。 - 第二工程において、第一工程で得られた細胞を分散し、当該分散した細胞を浮遊培養する、請求項1に記載の製造方法。
- 未分化維持因子が、FGFシグナル伝達経路作用物質である、請求項1又は2に記載の製造方法。
- FGFシグナル伝達経路作用物質が、bFGFである、請求項3に記載の製造方法。
- 第二工程において、細胞を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地中で浮遊培養することを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の製造方法。
- 第三工程において、凝集体を分化誘導因子の存在下に浮遊培養することを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の製造方法。
- TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質が、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質、TGFβシグナル伝達経路阻害物質、又はBMPシグナル伝達経路阻害物質である、請求項1〜6のいずれかに記載の製造方法。
- TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質が、Lefty、SB431542、A-83-01又はLDN193189である、請求項1〜7のいずれかに記載の製造方法。
- ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質がShh、SAG又はPurmorphamineである、請求項1〜8のいずれかに記載の製造方法。
- 第三工程における分化誘導因子が、BMPシグナル伝達経路作用物質である、請求項1〜9のいずれかに記載の製造方法。
- BMPシグナル伝達経路作用物質が、BMP2、BMP4、BMP7及びGDF7からなる群から選ばれる1以上の蛋白質である、請求項10に記載の製造方法。
- BMPシグナル伝達経路作用物質が、BMP4である、請求項10に記載の製造方法。
- 第三工程において得られる凝集体が、網膜組織を含む凝集体である、請求項1〜12のいずれかに記載の製造方法。
- 第三工程において得られる凝集体が、網膜前駆細胞、神経網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞、視細胞、桿体視細胞、錐体視細胞、水平細胞、アマクリン細胞、介在神経細胞、神経節細胞、網膜色素上皮細胞、及び毛様体周縁部細胞からなる群から選択される1又は複数の細胞を含む凝集体である、請求項1〜13のいずれかに記載の製造方法。
- 第三工程における分化誘導因子がBMPシグナル伝達経路作用物質であり、且つ第二工程における培地がソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む、請求項13又は14に記載の製造方法。
- 多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞であり、第二工程における培地中のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質濃度がSAG10nM〜700nMのソニック・ヘッジホッグシグナル伝達作用に相当する濃度であり、網膜組織がヒト網膜組織である、請求項15に記載の製造方法。
- 第三工程において、第二工程の開始後1日目から9日目の間にBMPシグナル伝達経路作用物質が培地に添加される、請求項15又は16に記載の製造方法。
- 第三工程において、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の濃度がSAG700nMのソニック・ヘッジホッグシグナル伝達作用に相当する濃度以下である培地で凝集体を培養する、請求項13又は14に記載の製造方法。
- 第三工程における分化誘導因子が、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び/又はWntシグナル伝達経路阻害物質である、請求項1〜9のいずれかに記載の製造方法。
- TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質が、Lefty、SB431542、A-83-01又はLDN193189である、請求項19に記載の製造方法。
- Wntシグナル伝達経路阻害物質が、IWR-1-endoである、請求項19又は20に記載の製造方法。
- 第三工程において得られる凝集体が、大脳組織を含む凝集体である、請求項1〜9又は19〜21のいずれかに記載の製造方法。
- 第一工程の培養時間が0.5時間〜144時間である、請求項1〜22のいずれかに記載の製造方法。
- 第一工程が接着培養法で行われる、請求項1〜23のいずれかに記載の製造方法。
- 第三工程において、第二工程開始後3日目から6日目の間に分化誘導剤が培地に添加される、請求項1〜24のいずれかに記載の製造方法。
- 多能性幹細胞が霊長類多能性幹細胞である、請求項1〜15及び17〜25のいずれかに記載の製造方法。
- 多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、請求項1〜26のいずれかに記載の製造方法。
- 多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項1〜27のいずれかに記載の製造方法。
- 第二工程において、均一な凝集体を形成する、請求項1〜28のいずれかに記載の製造方法。
- 浮遊培養が、基底膜標品非存在下で行われる、請求項1〜29のいずれかに記載の製造方法。
- 請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法により製造される神経系細胞又は神経組織を含有してなる、被験物質の毒性・薬効評価用試薬。
- 請求項1〜30のいずれかに記載の方法により製造される神経系細胞または神経組織に被験物質を接触させ、該物質が該細胞又は該組織に及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法。
- 請求項1〜30のいずれかに記載の方法により製造される神経系細胞又は神経組織を含有してなる、神経系細胞又は神経組織の障害に基づく疾患の治療薬。
- 神経系細胞又は神経組織が、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞、網膜組織、大脳神経系前駆細胞、大脳層特異的神経細胞、又は大脳組織である、請求項33に記載の治療薬。
- 請求項1〜30のいずれかに記載の方法により製造される神経系細胞又は神経組織の有効量を、移植を必要とする対象に移植することを含む、神経系細胞又は神経組織の障害に基づく疾患の治療方法。
- 神経系細胞又は神経組織の障害に基づく疾患の治療における使用のための請求項1〜30のいずれかに記載の方法により製造される神経系細胞又は神経組織。
- 請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法により製造される神経系細胞又は神経組織を有効成分として含有する、医薬組成物。
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