KR20210138639A - 이식용 신경 망막의 품질을 평가하는 방법 및 이식용 신경 망막 시트 - Google Patents

이식용 신경 망막의 품질을 평가하는 방법 및 이식용 신경 망막 시트 Download PDF

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KR20210138639A
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neural
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아츠시 구와하라
겐지 와타리
게이조 마츠시타
스구루 야마사키
미치코 만다이
마사요 다카하시
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다이니뽄 스미토모 세이야쿠 가부시키가이샤
고쿠리쓰 겐큐 가이하쓰 호징 리가가쿠 겐큐소
스미또모 가가꾸 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명의 이식용 신경 망막의 품질을 평가하는 방법은, 다능성 줄기 세포 유래의 상피 구조를 갖는 신경 망막을 포함하는 세포 응집체의 일부 또는 전부를 품질 평가용 샘플로서 추출하는 것과, 품질 평가용 샘플 중의 신경 망막계 세포 관련 유전자 및 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현을 검출하는 것과, 신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인되고, 또한 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인되지 않을 경우에, (1) 일부인 품질 평가용 샘플을 포함하는 세포 응집체와 동일한 세포 응집체에 있어서의 신경 망막(이식용 신경 망막), (2) 일부인 품질 평가용 샘플을 포함하는 세포 응집체와 동일 로트의 세포 응집체에 있어서의 신경 망막(이식용 신경 망막), 또는 (3) 전부인 품질 평가용 샘플의 세포 응집체와 동일 로트의 세포 응집체에 있어서의 신경 망막(이식용 신경 망막)을, 이식용 신경 망막으로서 사용 가능하다고 판정하는 것을 포함하고, 비신경 망막계 세포 관련 유전자가 뇌척수 조직 마커 유전자 및 안구 관련 조직 마커 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함한다.

Description

이식용 신경 망막의 품질을 평가하는 방법 및 이식용 신경 망막 시트
본 발명은, 이식용 신경 망막의 품질을 평가하는 방법 및 이식용 신경 망막 시트에 관한 것으로, 특히 다능성 줄기 세포 유래의 이식용 신경 망막의 품질을 평가하는 방법 및 다능성 줄기 세포 유래의 이식용 신경 망막 시트에 관한 것이다.
생체의 신경 조직에서는, 1종류 또는 복수 종류의 신경계 세포가 층 구조를 형성하고 있다. 신경 조직의 하나인 망막 조직은, 주로 시세포, 쌍극 세포, 수평 세포, 아마크린 세포 및 신경절 세포의 5종류의 신경 세포와 글리아 세포에 의해 구성되고, 입체적인 층 구조를 형성하고 있다. 신경 질환, 예를 들어 망막 변성 질환에 대한 치료법으로서, 신경 조직을 사용한 이식 치료가 유효한 것이 시사되어 왔지만, 인간의 생체의 신경 조직을 반영한 층 구조와 기능을 유지한 조직을 입수하는 것이 어려워, 치료법으로서 일반화하는 것이 어려웠다. 근년, 신경 조직(예를 들어 망막 조직)을 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도시켜 제조하는 것이 가능하게 되었다(비특허문헌 1, 2, 3 및 4).
다능성 줄기 세포에서 유래하는 망막 조직은, 다종의 망막층 특이적 신경 세포를 포함할 뿐 아니라, 층 구조를 이루어 구성되기 때문에, 매우 복잡한 구조를 갖고 있다. 이러한 매우 복잡한 구조를 갖는 망막 조직을 이식용의 세포 의약으로서 사용할 때에는, 특히 그 품질을 엄밀하게 관리할 것이 요구된다. 신경 망막의 품질의 평가 방법으로서, 세포 응집체 중의 연속 상피 구조의 유무를 해석하는 화상 해석 방법 등의 방법이 존재한다(특허문헌 1).
그래서, 본 발명은 상기 사정을 감안하여, 이식용 신경 망막의 품질을 평가하는 방법 및 당해 방법에 의해 선별된 이식용 신경 망막 시트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 예의 연구를 행한 결과, 다능성 줄기 세포에서 유래하는 신경 망막을 포함하는 세포 응집체의 제조 과정에 있어서, 일부의 세포 응집체에 있어서 망막층 특이적 신경 세포(목적 세포, 신경 망막계 세포(neural retina-related cell))에 더하여, 망막층 특이적 신경 세포 이외의 세포(목적외 세포, 비신경 망막계 세포(Non-neural retina-related cell))가 부생성될 가능성이 있는 것을 발견하였다. 그리고, 복수의 샘플에 대하여 유전자 발현 등을 망라적으로 해석한 결과, 부생성될 가능성이 있는 목적외 세포는, 뇌척수 조직 및 안구 관련 조직인 것이 판명되었다. 또한, 뇌척수 조직 및 안구 관련 조직을 상세하게 해석한 결과, 뇌척수 조직으로서는, 종뇌(대뇌), 간뇌(시상 하부를 포함함), 중뇌 및 척수가 부생할 수 있는 것, 안구 관련 조직으로서는, 망막 색소 상피(RPE), 모양체, 수정체 및 optic stalk(안포경 및 시신경 조직)이 부생할 수 있는 것도 판명되었다.
본 발명자들은 이들 신규의 지견으로부터, 목적 세포에 관련되는 유전자의 발현 및 목적외 세포에 관련되는 유전자의 발현을 해석함으로써, 이식에 적합한 신경 망막인지 여부를 평가할 수 있는 것, 또한 그것에 의해 이식용 신경 망막을 선별할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
[1]
이식용 신경 망막의 품질을 평가하는 방법이며,
상기 방법은,
다능성 줄기 세포 유래의 상피 구조를 갖는 신경 망막을 포함하는 세포 응집체의 일부 또는 전부를 품질 평가용 샘플로서 추출하는 것과,
상기 품질 평가용 샘플 중의 신경 망막계 세포 관련 유전자 및 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현을 검출하는 것과,
상기 신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인되고, 또한 상기 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인되지 않을 경우에,
(1) 상기 일부인 품질 평가용 샘플을 포함하는 세포 응집체와 동일한 세포 응집체에 있어서의 상기 신경 망막(이식용 신경 망막),
(2) 상기 일부인 품질 평가용 샘플을 포함하는 세포 응집체와 동일 로트의 세포 응집체에 있어서의 상기 신경 망막(이식용 신경 망막), 또는
(3) 상기 전부인 품질 평가용 샘플의 세포 응집체와 동일 로트의 세포 응집체에 있어서의 상기 신경 망막(이식용 신경 망막)
을, 이식용 신경 망막으로서 사용 가능하다고 판정하는 것을 포함하고,
상기 비신경 망막계 세포 관련 유전자가 뇌척수 조직 마커 유전자 및 안구 관련 조직 마커 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하는 방법.
[2]
상기 뇌척수 조직 마커 유전자가 종뇌 마커 유전자, 간뇌·중뇌 마커 유전자 및 척수 마커 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자이며,
상기 안구 관련 조직 마커 유전자가 optic stalk 마커 유전자, 모양체 마커 유전자, 수정체 마커 유전자 및 망막 색소 상피 마커 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자인, 상기 [1]에 기재된 방법.
[3]
상기 종뇌 마커 유전자가 FoxG1, Emx2, Dlx2, Dlx1 및 Dlx5로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하고,
상기 간뇌·중뇌 마커 유전자가 OTX1, OTX2, DMBX1, Rx, Nkx2.1, OTP, FGFR2, EFNA5 및 GAD1로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하고,
상기 척수 마커 유전자가 HOXD4, HOXD3, HOXD1, HOXC5, HOXA5 및 HOXB2로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하고,
상기 Optic Stalk 마커 유전자가 GREM1, GPR17, ACVR1C, CDH6, Pax2, Pax8, GAD2 및 SEMA5A로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하고,
상기 모양체 마커 유전자가 Zic1, MAL, HNF1beta, FoxQ1, CLDN2, CLDN1, GPR177, AQP1 및 AQP4로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하고,
상기 수정체 마커 유전자가 CRYAA 및 CRYBA1로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하고,
상기 망막 색소 상피 마커 유전자가 MITF, TTR 및 BEST1로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하는, 상기 [2]에 기재된 방법.
[4]
상기 비신경 망막계 세포 관련 유전자가 미분화 다능성 줄기 세포 마커 유전자를 더 포함하는, 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 것에 기재된 방법.
[5]
상기 미분화 다능성 줄기 세포 마커 유전자가 Oct3/4, Nanog 및 lin28로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하는, 상기 [4]에 기재된 방법.
[6]
상기 품질 평가용 샘플의 세포 응집체와 동일 로트의 세포 응집체가, 상기 이식용 신경 망막과 동등한 유전자 발현 프로파일을 나타내는 조건 하에서 제조된 세포 응집체인, 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 것에 기재된 방법.
[6-1]
상기 이식용 신경 망막이 상피 조직의 중심 부근을 포함하는, 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 것에 기재된 방법.
[6-2]
상기 이식용 신경 망막이 연속 상피 조직인, 상기 [1] 내지 [6], [6-1] 중 어느 것에 기재된 방법.
[7]
상기 품질 평가용 샘플이 세포 응집체의 일부이며,
상기 신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인되고, 또한 상기 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인되지 않을 경우에, 상기 일부인 품질 평가용 샘플을 포함하는 세포 응집체와 동일한 세포 응집체에 있어서의 해당 일부와 적어도 일부에 있어서 연속 또는 근접해있던 신경 망막을, 이식용 신경 망막으로서 사용 가능하다고 판정하는, 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 것에 기재된 방법.
[8]
상기 이식용 신경 망막이 상기 품질 평가용 샘플과 동일한 상피 조직에 포함되는, 상기 [7]에 기재된 방법.
[9]
상기 이식용 신경 망막이 상기 동일한 상피 조직의 중심 부근을 포함하는, 상기 [8]에 기재된 방법.
[10]
상기 이식용 신경 망막이 연속 상피 조직인, 상기 [9]에 기재된 방법.
[11]
상기 신경 망막을 포함하는 세포 응집체가, 상기 이식용 신경 망막을 포함하는 제1 상피 조직, 및 상기 제1 상피 조직의 표면에 있어서의 접선의 기울기의 연속성과 다른 표면의 접선의 기울기의 연속성을 가지며, 또한 비신경 망막계 세포를 포함하는 제2 상피 조직을 포함하고,
상기 이식용 신경 망막이 상기 제2 상피 조직으로부터 가장 떨어진 제1 상피 조직 상의 영역을 포함하고,
상기 품질 평가용 샘플이 상기 제2 상피 조직과 상기 이식용 신경 망막 사이에 존재하는 일부인, 상기 [7] 내지 [10] 중 어느 것에 기재된 방법.
[12]
상기 제2 상피 조직이 안구 관련 조직 및/또는 뇌척수 조직인, 상기 [11]에 기재된 방법.
[13]
상기 안구 관련 조직이 망막 색소 상피 세포 및 모양체를 포함하는, 상기 [12]에 기재된 방법.
[14]
상기 신경 망막계 세포 관련 유전자 및 상기 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현의 검출은, 정량 PCR에 의해 행하는 것을 포함하는, 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 것에 기재된 방법.
[15]
이하의 기준 1 및 기준 2를 충족하는 경우에, 이식용 신경 망막으로서 사용 가능하다고 판정하는 것을 포함하는, 상기 [14]에 기재된 방법.
기준 1: 상기 신경 망막계 세포 관련 유전자의 Threshold Cycle(임계 사이클)(Ct)값과 내부 표준 유전자의 Ct값의 차(ΔCt값)가 10 이하
기준 2: 상기 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 Ct값과 내부 표준 유전자의 Ct값의 차(ΔCt값)가 5 이상
[16]
상기 정량 PCR이 하기 (1) 내지 (5)의 공정을 포함하는 방법에 의해 행해지고, 그것에 의해, 2 이상의 상기 품질 평가용 샘플에 있어서의, 각각의 신경 망막계 세포 관련 유전자 및 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현량을 동시에 검출하는, 상기 [14] 또는 [15]에 기재된 방법.
(1) 1군의 8 이상 800 이하인 독립된 샘플 웰을 포함하는 샘플 웰군, 1군 이상의 8 이상 800 이하인 독립된 프라이머 웰을 포함하는 프라이머 웰군, 및 샘플 웰군에 있어서의 독립된 샘플 웰과 각각의 프라이머 웰군에 있어서의 독립된 프라이머 웰을 연결하는 유로를 갖는 유로 플레이트와, 2 이상의 상기 품질 평가용 샘플로부터 얻어진 핵산을 함유하는 용액(샘플 용액)과, 1 이상의 상기 신경 망막계 세포 관련 유전자 또는 상기 비신경 망막계 세포 관련 유전자에 특이적인 프라이머를 1 또는 복수 함유하는 용액(프라이머 용액)을 준비하는 것,
(2) 샘플 웰군에 있어서, 상기 샘플 용액을 상기 품질 평가용 샘플마다 1 샘플 용액/1 샘플 웰이 되도록 첨가하는 것,
(3) 상기 1 이상의 프라이머 웰군에 있어서, 상기 프라이머 용액을, 다른 프라이머 웰군이 되도록, 1 이상의 프라이머 웰에 첨가하는 것,
(4) 상기 유로를 통해, 상기 핵산에 대하여 상기 프라이머를 따로따로 혼합하는 것, 및
(5) (4)에서 얻어진 혼합액을 사용하여 정량 PCR을 행하는 것.
[17]
신경 망막 시트이며,
(1) 다능성 줄기 세포 유래이며,
(2) 3차원 구조를 갖고,
(3) 시세포층 및 내층을 포함하는 복수의 층 구조를 갖는 신경 망막층을 포함하고,
(4) 상기 시세포층이 시세포 전구 세포 및 시세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 세포를 포함하고,
(5) 상기 내층이 망막 전구 세포, 신경절 세포, 아마크린 세포 및 쌍극 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 세포를 포함하고,
(6) 상기 신경 망막층의 표면이 정상 단부면을 갖고,
(7) 상기 정상 단부면을 따라서 존재하는 시세포층의 내측에 상기 내층이 존재하고,
(8) 상기 신경 망막 시트의 표면의 총 면적에 대하여, 상기 신경 망막층의 면적이 50％ 이상이며,
(9) 상기 신경 망막층의 정상 단부면의 총 면적에 대하여, 연속 상피 구조의 면적이 80％ 이상이며,
(10) 상기 신경 망막 시트 중의 신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인되고, 또한 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인되지 않고, 상기 비신경 망막계 세포 관련 유전자가 뇌척수 조직 마커 유전자 및 안구 관련 조직 마커 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는
신경 망막 시트.
[18]
긴 직경이 600㎛ 내지 2500㎛인, 상기 [17]에 기재된 신경 망막 시트.
[19]
짧은 직경이 200㎛ 내지 1500㎛인, 상기 [17] 또는 [18]에 기재된 신경 망막 시트.
[20]
높이가 100㎛ 내지 1000㎛인, 상기 [17] 내지 [19] 중 어느 것에 기재된 신경 망막 시트.
[21]
상기 신경 망막 시트가,
(1) 신경 망막을 포함하는 세포 응집체로부터 단리된 것이며,
(2) 해당 세포 응집체에 있어서의 연속 상피 조직의 중심 부근의 영역을 포함하며, 또한
(3) 긴 직경이 600㎛ 내지 2500㎛, 짧은 직경이 200㎛ 내지 1500㎛ 및 높이가 100㎛ 내지 1000㎛인,
상기 [17] 내지 [20] 중 어느 것에 기재된 신경 망막 시트.
[22]
상기 신경 망막 시트가,
(1) 적어도 제1 상피 조직 및 제2 상피 조직을 포함하는 세포 응집체로부터 단리된 것이며,
상기 세포 응집체는, 상기 제1 상피 조직은 인간 신경 망막을 포함하고, 상기 제2 상피 조직은 상기 제1 상피 조직의 표면에 있어서의 접선의 기울기의 연속성과 다른 표면의 접선의 기울기의 연속성을 가지며, 또한 비신경 망막계 세포를 포함하고,
(2) 상기 제2 상피 조직으로부터 가장 떨어진 상기 제1 상피 조직 상의 영역을 포함하며, 또한
(3) 긴 직경이 600㎛ 내지 2500㎛이며, 짧은 직경이 200㎛ 내지 1500㎛이며, 높이가 100㎛ 내지 1000㎛이며,
상기 제2 상피 조직이 안구 관련 조직, 뇌척수 조직 및 그 밖의 제1 상피 조직의 신경 망막과는 다른 조직으로 이루어지는 군에서 선택되는 조직인, 상기 [17] 내지 [21] 중 어느 것에 기재된 신경 망막 시트.
[23]
상기 신경 망막 시트 중의 총 세포수에 대한 Rx 양성 세포의 비율이, 30％ 이상 80％ 이하, 40％ 이상 70％ 이하, 45％ 이상 60％ 이하, 또는 50％ 이상 60％ 이하인, 상기 [17] 내지 [22] 중 어느 것에 기재된 신경 망막 시트.
[24]
상기 신경 망막 시트 중의 총 세포수에 대한 Chx10 양성 세포의 비율이, 10％ 이상 80％ 이하, 20％ 이상 70％ 이하, 30％ 이상 60％ 이하, 또는 40％ 이상 50％ 이하인, 상기 [17] 내지 [23] 중 어느 것에 기재된 신경 망막 시트.
[25]
상기 신경 망막 시트 중의 총 세포수에 대한 Pax6 양성 세포의 비율이, 10％ 이상 80％ 이하, 20％ 이상 70％ 이하, 30％ 이상 60％ 이하, 또는 40％ 이상 50％ 이하인, 상기 [17] 내지 [24] 중 어느 것에 기재된 신경 망막 시트.
[26]
상기 신경 망막 시트 중의 총 세포수에 대한 Crx 양성 세포의 비율이, 10％ 이상 70％ 이하, 10％ 이상 60％ 이하, 20％ 이상 60％ 이하, 30％ 이상 60％ 이하, 40％ 이상 60％ 이하, 또는 50％ 이상 60％ 이하인, 상기 [17] 내지 [25] 중 어느 것에 기재된 신경 망막 시트.
[27]
상기 [17] 내지 [26] 중 어느 것에 기재된 신경 망막 시트를 포함하는, 의약 조성물.
[28]
상기 [17] 내지 [26] 중 어느 것에 기재된 신경 망막 시트를, 이식을 필요로 하는 대상에 이식하는 것을 포함하는, 신경 망막계 세포 혹은 신경 망막의 장애 또는 신경 망막의 손상에 기초하는 질환의 치료 방법.
[29]
상기 [1] 내지 [16] 중 어느 것에 기재된 방법을 사용하여, 다능성 줄기 세포 유래의 상피 구조를 갖는 신경 망막을 포함하는 세포 응집체를 평가하고, 이식용 신경 망막으로서 사용 가능하다고 판정된 이식용 신경 망막을 선별하는 것, 및
상기 선별된 이식용 신경 망막을 단리하는 것
을 포함하는, 상기 [17] 내지 [26] 중 어느 것에 기재된 신경 망막 시트의 제조 방법.
[30]
2개 이상 800개 이하의, 다능성 줄기 세포 유래의 상피 구조를 갖는 신경 망막을 포함하는 세포 응집체로부터, 당해 세포 응집체의 일부인 품질 평가용 샘플을 각각 추출하는 것,
상기 추출된 2개 이상 800개 이하의 품질 평가용 샘플을, 상기 [1] 내지 [16] 중 어느 것에 기재된 방법에 의해 평가하고, 이식용 신경 망막으로서 사용 가능하다고 판정된 이식용 신경 망막을 선별하는 것, 및
상기 선별된 이식용 신경 망막을 단리하는 것
을 포함하는 신경 망막 시트의 제조 방법.
[31]
상기 세포 응집체가 다능성 줄기 세포를 분화 유도하여 얻어진, 적어도 제1 상피 조직 및 제2 상피 조직을 포함하는 세포 응집체이며, 상기 제1 상피 조직은 인간 신경 망막을 포함하고, 상기 제2 상피 조직은 상기 제1 상피 조직의 표면에 있어서의 접선의 기울기의 연속성과 다른 표면의 접선의 기울기의 연속성을 가지며, 또한 비신경 망막계 세포를 포함하고,
상기 이식용 신경 망막의 단리는 상기 세포 응집체로부터, 상기 이식용 신경 망막이 상기 제2 상피 조직으로부터 가장 떨어진 상기 제1 상피 조직 상의 영역을 포함하도록 단리하는 것인,
상기 [29] 또는 [30]에 기재된 제조 방법.
본 발명에 따르면, 이식용 신경 망막의 품질을 평가하는 방법 및 당해 방법에 의해 선별된 이식용 신경 망막 시트, 및 당해 이식용 신경 망막 시트의 제조 방법을 제공하는 것이 가능해진다.
도 1은 실시예 1에 있어서의, 이식용 신경 망막을 포함하는 세포 응집체에 대하여 Crx 및 Chx10으로 면역 염색을 행한 결과를 나타내는 형광 현미경 화상이다.
도 2는 실시예 1에 있어서의, 이식용 신경 망막을 포함하는 세포 응집체에 대하여 Rx 및 Recoverin으로 면역 염색을 행한 결과를 나타내는 형광 현미경 화상이다.
도 3은 실시예 2에 있어서의, 신경 망막 및 부산물 A, B, C, D, E 및 F로부터 추출된 RNA의 마이크로어레이 해석 결과를 나타낸다.
도 4는 전형적인 세포 응집체로부터 캡 및 링을 제작하는 개념도이다.
도 5는 각종 형상을 한 세포 응집체로부터 캡 및 링을 제작하는 개념도이다. 흑색 및 회색으로 나타내어지는 부분은 목적외 조직을 의미한다.
도 6은 전형적인 이식편의 화상 및 이식편의 모식도와 함께, 실시예 4에 있어서의 이식편의 높이, 긴 직경 및 짧은 직경을 나타낸다.
도 7은 실시예 5에 있어서의, 이식편에 대하여 Crx 및 Chx10으로 면역 염색을 행한 결과를 나타내는 공초점 형광 현미경 화상이다.
도 8은 실시예 6에 있어서의, 캡 및 링으로부터 추출된 RNA에 있어서의 유전자 발현을 정량 PCR로 해석한 결과를 나타낸다.
도 9는 실시예 7에 있어서의, 캡 및 링으로부터 추출된 RNA에 있어서의 유전자 발현을 정량 PCR로 해석한 결과를 나타낸다.
도 10은 실시예 8에 있어서의, 링으로부터 추출한 RNA를 정량 PCR로 해석한 후에, 이식편(캡)을 래트 망막 아래에 이식하고, 이식 후의 생착상을 형광 현미경에 의한 관찰한 결과를 나타내는 화상이다.
도 11은 실시예 9에 있어서의, 링으로부터 추출한 RNA를 정량 PCR로 해석한 후에, 이식편(캡)을 래트 망막 아래에 이식하고, 이식 후의 생착상을 형광 현미경에 의한 관찰한 결과를 나타내는 화상이다.
도 12는 실시예 10에 있어서의, 링을 도립 현미경으로 관찰한 화상과, 링을 래트 망막 아래에 이식하고, 이식 후의 생착상을 형광 현미경에 의한 관찰한 결과를 나타내는 화상이다.
도 13은 실시예 11에 있어서의, 하나의 세포 응집체로 제작한 캡 및 링에 대하여 면역 염색을 행한 결과를 나타내는 형광 현미경 화상이다.
도 14는 실시예 12에 있어서의, 신경 망막 및 비신경 망막(종뇌 조직, 척수 조직, RPE, Optic stalk)으로 제작한 캡 및 링으로부터 추출된 RNA에 있어서의 유전자 발현을 정량 PCR로 해석한 결과를 나타낸다.
도 15는 실시예 14에 있어서의, 염색된 절편을, 형광 현미경(Keyence사제)을 사용하여 관찰한 면역 염색상을 나타낸다.
[정의]
「줄기 세포」란, 분화능 및 증식능(특히 자기 복제능)을 갖는 미분화하는 세포를 의미한다. 줄기 세포에는, 분화 능력에 따라서 다능성 줄기 세포(pluripotent stem cell), 복능성 줄기 세포(multipotent stem cell), 단능성 줄기 세포(unipotent stem cell) 등의 아집단이 포함된다. 다능성 줄기 세포란, 인비트로에 있어서 배양하는 것이 가능하고, 또한 3배엽(외배엽, 중배엽, 내배엽) 및/또는 배체외 조직에 속하는 세포 계보 모두로 분화될 수 있는 능력(분화 다능성(pluripotency))을 갖는 줄기 세포를 말한다. 복능성 줄기 세포란, 모든 종류는 아니지만, 복수종의 조직이나 세포로부터 분화될 수 있는 능력을 갖는 줄기 세포를 의미한다. 단능성 줄기 세포란, 특정한 조직이나 세포로부터 분화될 수 있는 능력을 갖는 줄기 세포를 의미한다.
「다능성 줄기 세포」는, 수정란, 클론배, 생식 줄기 세포, 조직내 줄기 세포, 체세포 등으로부터 유도할 수 있다. 다능성 줄기 세포로서는, 배아 줄기 세포(ES 세포: Embryonic stem cell), EG 세포(Embryonic germ cell), 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포: induced pluripotent stem cell) 등을 들 수 있다. 간엽계 줄기 세포(mesenchymal stem cell; MSC)로 얻어지는 Muse 세포(Multi-lineage differentiating stress enduring cell)나, 생식 세포(예를 들어 정소)로 제작된 GS 세포도 다능성 줄기 세포에 포함된다.
1998년에 인간 배아 줄기 세포가 수립되었으며, 재생 의학에도 이용되고 있다. 배아 줄기 세포는 내부 세포 응집체를 피더 세포 상 또는 bFGF를 포함하는 배지 중에서 배양함으로써 제조할 수 있다. 배아 줄기 세포의 제조 방법은, 예를 들어 WO96/22362, WO02/101057, US5,843,780, US6,200,806, US6,280,718 등에 기재되어 있다. 배아 줄기 세포는 소정의 기관으로부터 입수할 수 있고, 또한 시판품을 구입할 수도 있다. 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포인 KhES-1, KhES-2 및 KhES-3은 교토 대학 재생 의사 과학 연구소로부터 입수 가능하다. 인간 배아 줄기 세포인 Crx::Venus주(KhES-1 유래)는 국립 연구 개발 법인 이화학 연구소로부터 입수 가능하다.
「인공 다능성 줄기 세포」란, 체세포를 공지된 방법 등에 의해 초기화(reprogramming)함으로써, 다능성을 유도한 세포이다.
인공 다능성 줄기 세포는 2006년 야마무라 등에 의해 마우스 세포로 수립되었다(Cell, 2006, 126(4), pp.663-676). 인공 다능성 줄기 세포는 2007년에 인간 섬유아세포에서도 수립되고, 배아 줄기 세포와 마찬가지로 다능성과 자기 복제능을 갖는다(Cell, 2007, 131(5), pp.861-872; Science, 2007, 318(5858), pp.1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26(1), pp.101-106).
인공 다능성 줄기 세포는 구체적으로는 섬유아세포나 말초혈 단핵구 등분화된 체세포를 Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc(c-Myc, N-Myc, L-Myc), Glis1, Nanog, Sall4, lin28, Esrrb 등을 포함하는 초기화 유전자군에서 선택되는 복수의 유전자의 조합 중 어느 발현에 의해 초기화하여 다분화능을 유도한 세포를 들 수 있다. 바람직한 초기화 인자의 조합으로서는, (1) Oct3/4, Sox2, Klf4 및 Myc(c-Myc 또는 L-Myc), (2) Oct3/4, Sox2, Klf4, Lin28 및 L-Myc(Stem Cells, 2013; 31: 458-466)를 들 수 있다.
인공 다능성 줄기 세포로서, 유전자 발현에 의한 직접 초기화로 제조하는 방법 이외에도, 화합물의 첨가 등에 의해 체세포로부터 인공 다능성 줄기 세포를 유도할 수도 있다(Science, 2013, 341, pp.651-654).
또한, 주화된 인공 다능성 줄기 세포를 입수하는 것도 가능하며, 예를 들어 교토 대학에서 수립된 201B7 세포, 201B7-Ff 세포, 253G1 세포, 253G4 세포, 1201C1 세포, 1205D1 세포, 1210B2 세포, 1231A3 세포 등의 인간 인공 다능성 세포주가, 교토 대학 및 iPS 아카데미아 재팬 가부시키가이샤로부터 입수 가능하다. 주화된 인공 다능성 줄기 세포로서, 예를 들어 교토 대학에서 수립된 Ff-I01 세포, Ff-I14 세포 및 QHJI01s04 세포가, 교토 대학에서 입수 가능하다.
본 명세서에 있어서, 다능성 줄기 세포는 바람직하게는 배아 줄기 세포 또는 인공 다능성 줄기 세포이며, 보다 바람직하게는 인공 다능성 줄기 세포이다.
본 명세서에 있어서, 다능성 줄기 세포는 인간의 다능성 줄기 세포이며, 바람직하게는 인간 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포) 또는 인간 배아 줄기 세포(ES 세포)이다.
인간 iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포는, 당업자에게 주지된 방법으로 유지 배양 및 확대 배양에 부칠 수 있다.
「망막 조직(Retinal tissue)」이란, 생체 망막에 있어서 각 망막층을 구성하는 망막계 세포가 1종류 또는 복수 종류, 일정한 질서에 따라서 존재하는 조직을 의미하고, 「신경 망막(Neural Retina)」은 망막 조직이며, 후술하는 망막층 중 망막 색소 상피층을 포함하지 않는 내측의 신경 망막층을 포함하는 조직을 의미한다.
「망막계 세포」란, 생체 망막에 있어서 각 망막층을 구성하는 세포 또는 그 전구 세포를 의미한다. 망막계 세포에는, 시세포(간체(桿體) 시세포, 추체 시세포), 수평 세포, 아마크린 세포, 개재 신경 세포, 망막 신경절 세포(신경절 세포), 쌍극 세포(간체 쌍극 세포, 추체 쌍극 세포), 뮐러 글리아 세포, 망막 색소 상피(RPE) 세포, 모양체, 이들의 전구 세포(예: 시세포 전구 세포, 쌍극 세포 전구 세포 등), 망막 전구 세포 등의 세포가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 망막계 세포 중, 신경 망막층을 구성하는 세포(신경 망막 세포 또는 신경 망막계 세포(Neural retina-related cell)라고도 함)로서, 구체적으로는 시세포(간체 시세포, 추체 시세포), 수평 세포, 아마크린 세포, 개재 신경 세포, 망막 신경절 세포(신경절 세포), 쌍극 세포(간체 쌍극 세포, 추체 쌍극 세포), 뮐러 글리아 세포, 및 이들의 전구 세포(예: 시세포 전구 세포, 쌍극 세포 전구 세포 등) 등의 세포를 들 수 있다. 즉, 신경 망막계 세포에는 망막 색소 상피 세포 및 모양체 세포가 포함되지 않는다.
「성숙한 망막계 세포」란, 인간 성인의 망막 조직에 포함될 수 있는 세포를 의미하고, 구체적으로는 시세포(간체 시세포, 추체 시세포), 수평 세포, 아마크린 세포, 개재 신경 세포, 망막 신경절 세포(신경절 세포), 쌍극 세포(간체 쌍극 세포, 추체 쌍극 세포), 뮐러 글리아 세포, 망막 색소 상피(RPE) 세포, 모양체 세포 등이 분화된 세포를 의미한다. 「미성숙한 망막계 세포」란, 성숙한 망막계 세포로의 분화가 결정지어져 있는 전구 세포(예: 시세포 전구 세포, 쌍극 세포 전구 세포, 망막 전구 세포 등)를 의미한다.
시세포 전구 세포, 수평 세포 전구 세포, 쌍극 세포 전구 세포, 아마크린 세포 전구 세포, 망막 신경절 세포 전구 세포, 뮐러 글리아 전구 세포, 망막 색소 상피 전구 세포란, 각각, 시세포, 수평 세포, 쌍극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포, 뮐러 글리아 세포, 망막 색소 상피 세포로의 분화가 결정지어져 있는 전구 세포를 말한다.
「망막 전구 세포」란, 시세포 전구 세포, 수평 세포 전구 세포, 쌍극 세포 전구 세포, 아마크린 세포 전구 세포, 망막 신경절 세포 전구 세포, 뮐러 글리아 세포, 망막 색소 상피 전구 세포 등의 어느 것의 미성숙한 망막계 세포로도 분화될 수 있는 전구 세포이며, 최종적으로 시세포, 간체 시세포, 추체 시세포, 수평 세포, 쌍극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포, 망막 색소 상피 세포 등의 어느 성숙한 망막계 세포로도 분화될 수 있는 전구 세포를 말한다.
「시세포(photoreceptor cell)」란, 생체에 있어서는 망막의 시세포층에 존재하고, 광 자극을 흡수하여 전기 신호로 변환하는 역할을 갖는다. 시세포에는, 명소에서 기능하는 추체(cone)와 암소에서 기능하는 간체(杆體)(또는 간체, rod)의 2종류가 있다(각각 추체 시세포, 간체 시세포라고 함). 또한, 추체 시세포로서는, S-opsin을 발현하여 청색광을 수용하는 S 추체 시세포, L-opsin을 발현하여 적색광을 수용하는 L 추체 시세포, 및 M-opsin을 발현하여 녹색광을 수용하는 M 추체 시세포를 들 수 있다. 시세포는 시세포 전구 세포로부터 분화되고, 성숙한다. 세포가 시세포 혹은 시세포 전구 세포인지 여부는, 당업자라면 예를 들어 후술하는 세포 마커(시세포 전구 세포에서 발현하는 Crx 및 Blimp1, 시세포에서 발현하는 리커버린(Recoverin), 성숙 시세포에서 발현하는 로돕신, S-Opsin 및 M/L-Opsin 등)의 발현, 외절 구조의 형성 등에 의해 용이하게 확인할 수 있다. 일 양태에 있어서, 시세포 전구 세포는 Crx 양성 세포이며, 시세포는 로돕신, S-Opsin 및 M/L-Opsin 양성 세포이다. 일 양태에 있어서, 간체 시세포는 NRL 및 로돕신(Rhodopsin) 양성 세포이다. 일 양태에 있어서, S 추체 시세포는 S-opsin 양성 세포, L 추체 시세포는 L-opsin 양성 세포 및 M 추체 시세포는 M-opsin 양성 세포이다.
신경 망막계 세포의 존재는 신경 망막계 세포 관련 유전자(이하, 「신경 망막계 세포 마커」 또는 「신경 망막 마커」라고 하는 경우가 있음)의 발현의 유무에 의해 확인할 수 있다. 신경 망막계 세포 마커의 발현 유무, 또는 세포 집단 혹은 조직에 있어서의 신경 망막계 세포 마커 양성 세포의 비율은, 당업자라면 용이하게 확인할 수 있다. 예를 들어, 항체를 사용한 방법, 핵산 프라이머를 사용한 방법, 시퀀스 반응을 사용한 방법을 들 수 있다. 항체를 사용한 방법으로서는, 신경 망막계 세포 마커의 단백질의 발현을, 예를 들어 시판되는 항체를 사용한 플로우 사이토메트리, 면역 염색 등의 방법에 의해, 특정한 신경 망막계 세포 마커 양성 세포의 수를 전체 세포수로 나눔으로써 확인할 수 있다. 핵산 프라이머를 사용한 방법으로서는, 신경 망막계 세포 마커의 RNA의 발현을, 예를 들어 PCR법, 반정량 PCR법, 정량 PCR법(예: 리얼타임 PCR법)으로 확인할 수 있다. 시퀀스 반응을 사용한 방법으로서는, 신경 망막계 세포 마커의 RNA의 발현을, 예를 들어 핵산 시퀀서(예: 차세대 시퀀서)를 사용하여 확인할 수 있다.
신경 망막계 세포 마커로서는, 망막 전구 세포에서 발현하는 Rx(Rax라고도 함) 및 PAX6, 신경 망막 전구 세포에서 발현하는 Rx, PAX6 및 Chx10(Vsx2라고도 함), 시세포 전구 세포에서 발현하는 Crx 및 Blimp1 등을 들 수 있다. 또한, 쌍극 세포에서 강발현하는 Chx10, 쌍극 세포에서 발현하는 PKCα, Goα, VSX1 및 L7, 망막 신경절 세포에서 발현하는 TuJ1 및 Brn3, 아마크린 세포에서 발현하는 칼레티닌(Calretinin) 및 HPC-1, 수평 세포에서 발현하는 칼빈딘(Calbindin), 시세포 및 시세포 전구 세포에서 발현하는 Recoverin, 간체 세포에서 발현하는 로돕신, 간체 시세포 및 간체 시세포 전구 세포에서 발현하는 Nrl, 추체 시세포에서 발현하는 S-opsin 및 LM-opsin, 추체 세포, 추체 시세포 전구 세포 및 신경절 세포에서 발현하는 RXR-γ, 추체 시세포 중, 분화 초기에 출현하는 추체 시세포 또는 그 전구 세포에서 발현하는 TRβ2, OTX2 및 OC2, 수평 세포, 아마크린 세포 및 신경절 세포에서 공통적으로 발현하는 Pax6 등을 들 수 있다.
「양성 세포」란, 특정한 마커를 세포 표면 상 또는 세포 내에 발현하고 있는 세포를 의미한다. 예를 들어, 「Chx10 양성 세포」란, Chx10 단백질을 발현하고 있는 세포를 의미한다.
「망막 색소 상피 세포」란, 생체 망막에 있어서 신경 망막의 외측에 존재하는 상피 세포를 의미한다. 세포가 망막 색소 상피 세포인지 여부는, 당업자라면 예를 들어 세포 마커(RPE65, MITF, CRALBP, MERTK, BEST1, TTR 등)의 발현이나, 멜라닌 과립의 존재(흑갈색), 세포간의 타이트 정션, 다각형·포석상의 특징적인 세포 형태 등에 의해 용이하게 확인할 수 있다. 세포가 망막 색소 상피 세포의 기능을 갖는지 여부는, VEGF 및 PEDF 등의 사이토카인의 분비능 등에 의해 용이하게 확인할 수 있다. 일 양태에 있어서, 망막 색소 상피 세포는 RPE65 양성 세포, MITF 양성 세포, 또는 RPE65 양성 또한 MITF 양성 세포이다.
「망막층」이란, 망막을 구성하는 각 층을 의미하고, 구체적으로는 망막 색소 상피층, 시세포층, 외경계막, 외과립층, 외망상층, 내과립층, 내망상층, 신경절 세포층, 신경 섬유층 및 내경계막을 들 수 있다.
「신경 망막층」이란, 신경 망막을 구성하는 각 층을 의미하고, 구체적으로는 시세포층, 외경계막, 외과립층, 외망상층, 내과립층, 내망상층, 신경절 세포층, 신경 섬유층 및 내경계막을 들 수 있다. 「시세포층」이란, 신경 망막의 가장 외측에 형성되고, 시세포(간체 시세포, 추체 시세포), 시세포 전구 세포 및 망막 전구 세포를 많이 포함하는 망막층을 의미한다. 시세포층 이외의 각 층을 내층이라고 한다. 각각의 세포가 어느 망막층을 구성하는 세포인지는, 공지된 방법, 예를 들어 세포 마커의 발현 유무 또는 발현의 정도 등에 의해 확인할 수 있다.
시세포 또는 시세포 전구 세포의 출현 비율이 적은 단계의 망막 조직인 경우, 증식하는 신경 망막 전구 세포를 포함하는 층을 「뉴로블라스틱 레이어(neuroblastic layer)」라고 하고, inner(이너) neuroblatic layer와 outer(아우터) neuroblastic layer가 존재한다. 당업자라면 주지된 방법, 예를 들어 명시야 현미경 아래에서는, 색의 농담(outer neuroblastic layer가 엷고, inner neuroblatic layer가 진함)에 의해 판단할 수 있다.
「모양체」는 발생 과정 및 성체의 「모양체」, 「모양체 주연부」, 「섬모체(Ciliary body)」를 포함한다. 「모양체」의 마커로서는, Zic1, MAL, HNF1beta, FoxQ1, CLDN2, CLDN1, GPR177, AQP1 및 AQP4를 들 수 있다. 「모양체 주연부(ciliary marginal zone; CMZ)」로서는, 예를 들어 생체 망막에 있어서 신경 망막과 망막 색소 상피의 경계 영역에 존재하는 조직이며, 또한 망막의 조직 줄기 세포(망막 줄기 세포)를 포함하는 영역을 들 수 있다. 모양체 주연부는 모양체 테두리(ciliary margin) 또는 망막 테두리(retinal margin)라고도 불리고, 모양체 주연부, 모양체 테두리 및 망막 테두리는 동등한 조직이다. 모양체 주연부는 망막 조직에의 망막 전구 세포, 분화 세포의 공급, 망막 조직 구조의 유지 등에 중요한 역할을 하고 있는 것이 알려져 있다. 모양체 주연부의 마커 유전자로서는, 예를 들어 Rdh10 유전자(양성), Otx1 유전자(양성) 및 Zic1(양성)을 들 수 있다. 「모양체 주연부 유사 구조체」란, 모양체 주연부와 유사한 구조체이다.
「세포 응집체」(Cell Aggregate)란, 복수의 세포끼리가 접착되어 입체 구조를 형성하고 있는 것이면 특별히 한정은 없고, 예를 들어 배지 등의 매체 중에 분산되어 있던 세포가 집합하여 형성되는 덩어리, 또는 세포 분열을 거쳐서 형성되는 세포의 덩어리 등을 말한다. 세포 응집체에는, 특정한 조직을 형성하고 있는 경우도 포함된다.
「스페어(sphere)상 세포 응집체」는 구상에 가까운 입체적인 형을 갖는 세포 응집체를 의미한다. 구상에 가까운 입체적인 형이란, 삼차원 구조를 갖는 형이며, 이차원면에 투영하였을 때, 예를 들어 원형 또는 타원형을 나타내는 구상형, 및 구상형이 복수 융합하여 형성되는 형상(예를 들어 이차원으로 투영한 경우에 2 내지 4개의 원형 혹은 타원형이 겹쳐 형성되는 형을 나타냄)을 들 수 있다. 일 양태에 있어서, 응집체의 코어부는 소포성 층상 구조를 갖고, 명시야 현미경 아래에서는, 중앙부가 어둡게 외연 부분이 밝게 관찰된다는 특징을 갖는다.
일 양태에 있어서, 상피 조직은 극성화되어 「정상 단부면(apical surface)」과 「기저막」이 생긴다. 「기저막」이란, 라미닌 및 IV형 콜라겐을 많이 포함하는 50-100nm의, 상피 세포가 산생한 기저(basal)측의 층(기저막)이 존재하는 기저막을 말한다. 「정상 단부면」은 「기저막」과 반대측에 형성되는 표면(표층면)을 말한다. 일 양태에 있어서, 「정상 단부면」은 시세포 또는 시세포 전구 세포가 확인될 정도로 발생 단계가 진행된 망막 조직에 있어서는, 외경계막이 형성되고, 시세포, 시세포 전구 세포가 존재하는 시세포층(외과립층)에 접하는 면을 말한다. 또한, 이러한 정상 단부면은 정상 단부면의 마커(예: 비정형(atypical)-PKC(이하, 「aPKC」라고 약칭함), E-카데린(cadherin), N-카데린)에 대한 항체를 사용하여, 당업자에게 주지된 면역 염색법 등으로 동정할 수 있다.
「상피 조직」이란, 체표면, 관강(소화관 등), 체강(심막강 등) 등의 표면을 세포가 간극없이 덮음으로써 형성되는 조직이다. 상피 조직을 형성하고 있는 세포를 상피 세포라고 한다. 상피 세포는 세포가 정상 단부(apical)-기저(basal) 방향의 극성을 갖는다. 상피 세포는 접착 결합(adherence junction) 및/또는 밀착 결합(tight junction)에 의해 상피 세포끼리 견고한 결합을 만들어, 세포의 층을 형성할 수 있다. 이 세포층이 1 내지 수십층 겹쳐 생긴 조직이 상피 조직이다. 상피 조직을 형성할 수 있는 조직에는, 태아기 및/또는 성체의 망막 조직, 뇌척수 조직, 안구 조직, 신경 조직 등도 포함된다. 본 명세서에 있어서의 신경 망막도 상피 조직이다. 「상피 구조」란, 정상 단부면 또는 기저막 등의, 상피 조직이 특징적으로 갖는 구조를 의미한다.
「연속 상피 조직」이란, 연속 상피 구조를 갖는 조직이다. 연속 상피 구조란, 상피 조직이 연속되어 있는 상태이다. 상피 조직이 연속되어 있다는 것은, 예를 들어 상피 조직에 대한 접선 방향으로 10 세포 내지 107 세포, 바람직하게는 접선 방향으로 30 세포 내지 107 세포, 더욱 바람직하게는 102 세포 내지 107 세포, 배열되어 있는 상태이다.
예를 들어, 망막 조직에 있어서 형성되는 연속 상피 구조는, 망막 조직이 상피 조직에 특유한 정상 단부면을 갖고, 정상 단부면이 신경 망막층을 형성하는 각 층 중, 적어도 시세포층(외과립층) 등과 대략 평행하게, 또한 연속적으로 망막 조직의 표면에 형성된다. 예를 들어, 다능성 줄기 세포로 제작한 망막 조직을 포함하는 세포 응집체의 경우, 응집체의 표면에 정상 단부면이 형성되고, 표면에 대하여 접선 방향으로 10 세포 이상, 바람직하게는 30 세포 이상, 보다 바람직하게는 100 세포 이상, 더욱 바람직하게는 400 세포 이상의 시세포 또는 시세포 전구 세포가 규칙적으로 연속적으로 배열된다.
[이식용 신경 망막의 품질의 평가 방법]
본 발명의 일 양태는, 이식용 신경 망막의 품질을 평가하는 방법이다.
본 발명에 관한 방법은, 다능성 줄기 세포 유래의 상피 구조를 갖는 신경 망막을 포함하는 세포 응집체의 일부 또는 전부를 품질 평가용 샘플로서 추출하는 것과, 품질 평가용 샘플 중의 신경 망막계 세포(목적 세포) 관련 유전자 및 비신경 망막계 세포(목적외 세포) 관련 유전자의 발현을 검출하는 것과, 신경 망막계 세포 관련 유전자(목적 세포 관련 유전자)의 발현이 확인되고, 또한 비신경 망막계 세포 관련 유전자(목적외 세포 관련 유전자)의 발현이 확인되지 않을 경우에, (1) 상기 일부인 품질 평가용 샘플을 포함하는 세포 응집체와 동일한 세포 응집체에 있어서의 신경 망막(이식용 신경 망막), (2) 상기 일부인 상기 품질 평가용 샘플을 포함하는 세포 응집체와 동일 로트의 세포 응집체에 있어서의 신경 망막(이식용 신경 망막), 또는 (3) 상기 전부인 상기 품질 평가용 샘플의 세포 응집체와 동일 로트의 세포 응집체에 있어서의 신경 망막(이식용 신경 망막)을, 이식용 신경 망막으로서 사용 가능하다고 판정하는 것을 포함한다. 품질 평가용 샘플 중에 있어서, 신경 망막계 세포 관련 유전자(목적 세포 관련 유전자)의 발현이 확인되고, 또한 비신경 망막계 세포 관련 유전자(목적외 세포 관련 유전자)의 발현이 확인되지 않을 경우에, 해당 품질 평가용 샘플도 이식용 신경 망막으로서 사용 가능하다고 판단되지만, 해당 이식용 신경 망막인 품질 평가용 샘플이 평가를 위해 파괴되기 때문에, 실제로 이식에는 사용할 수 없다.
<신경 망막을 포함하는 세포 응집체>
(세포 응집체의 제조 방법)
본 명세서에 있어서의 신경 망막을 포함하는 세포 응집체는, 상피 구조를 갖고, 다능성 줄기 세포를 분화 유도함으로써 얻을 수 있다. 일 양태로서, 분화 유도 인자를 사용한 신경 망막을 포함하는 세포 응집체의 제조 방법을 들 수 있다. 분화 유도 인자로서, 기저막 표품, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질, IGF 시그널 전달 경로 작용 물질 등을 들 수 있다. 일 양태로서, 자기 조직화에 의한 신경 망막을 포함하는 세포 응집체의 제조 방법을 들 수 있다. 자기 조직화란, 세포의 집단이 자율적으로 복잡한 구조를 만들어내는 기서를 말한다. 예를 들어, SFEB(Serum-free Floating culture of Embryoid Bodies-like aggregates)법(WO2005/12390)이나 SFEBq법(WO2009/148170)에 의해 자기 조직화를 행할 수 있다.
구체적인 분화 유도 방법으로서, WO2011/055855, WO2013/077425, WO2015/025967, WO2016/063985, WO2016/063986, WO2017/183732, PLoS One. 2010 Jan 20; 5(1): e8763., Stem Cells. 2011 Aug; 29(8): 1206-18., Proc Natl Acad Sci USA. 2014 Jun 10; 111(23): 8518-23, 또는 Nat Commun. 2014 Jun 10; 5: 4047에 개시되어 있는 방법을 들 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다.
구체적인 일 양태로서, 하기 공정 (A), (B) 및 (C)를 포함하는 방법에 의해 신경 망막을 포함하는 세포 응집체를 조제할 수 있다.
(A) 다능성 줄기 세포를 피더 세포 비존재 하에서, 미분화 유지 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 공정,
(B) 공정 (A)에서 얻어진 세포를 부유 배양함으로써 세포 응집체를 형성시키는 공정,
(C) 공정 (B)에서 얻어진 세포 응집체를, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 또한 부유 배양하는 공정.
또한, 공정 (A)는 또한 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함해도 된다.
또한, 공정 (B)는 후술하는 바와 같이, 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, 및/또는 Wnt 시그널 전달 저해 물질을 포함하고 있어도 된다.
본 방법은, 예를 들어 WO2015/025967, WO2016/063985, WO2017/183732에도 개시되어 있으며, 보다 상세하게는 WO2015/025967, WO2016/063985, WO2017/183732를 참조하는 것이 가능하다.
신경 망막을 포함하는 세포 응집체의 조제에 사용하는 배지는, 특별한 기재가 없는 한, 세포 증식용 기초 배지(기초 배지라고도 칭함)를 사용할 수 있다. 세포 증식용 기초 배지는 세포의 배양이 가능한 한 특별히 한정은 없고, 적절히 세포 증식용 배지로서 시판되고 있는 기초 배지를 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow MEM(GMEM) 배지, 개선된(Improved) MEM 아연 선택(Zinc Option) 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, MEM 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, F-12 배지, DMEM/F12 배지, IMDM/F12 배지, 햄 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, Leibovitz's L-15 배지 또는 이들의 혼합 배지 등, 동물 세포의 배양에 사용할 수 있는 배지를 들 수 있다. 또한, 보조 배지인 N2 배지를 첨가한 배지를 사용해도 된다.
TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질이란, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로, 즉 Smad 패밀리에 의해 전달되는, 시그널 전달 경로를 저해하는 물질을 나타내고, 구체적으로는 TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질(예: SB431542, LY-364947, SB505124, A-83-01 등), 노달/액티빈 시그널 전달 경로 저해 물질(예: SB431542, A-83-01 등) 및 BMP 시그널 전달 경로 저해 물질(예: LDN193189, 도르소모르핀(Dorsomorphin) 등)을 들 수 있다. 이들 물질은 시판되고 있어 입수 가능하다.
소닉·헤지호그(이하, 「Shh」라 기재하는 경우가 있다.) 시그널 전달 경로 작용 물질이란, Shh에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강시킬 수 있는 물질이다. Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어 SHH, SHH의 부분 펩티드, PMA(푸르모르파민(Purmorphamine)), SAG(Smoothened Agonist) 등을 들 수 있다.
TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도는, 망막계 세포로의 분화를 유도 가능한 농도이면 된다. 예를 들어, SB431542는 통상 0.1 내지 200μM, 바람직하게는 2 내지 50μM의 농도로 사용된다. A-83-01은 통상 0.05 내지 50μM, 바람직하게는 0.5 내지 5μM의 농도로 사용된다. LDN193189는 통상 1 내지 2000nM, 바람직하게는 10 내지 300nM의 농도로 사용된다. SAG는 통상 1 내지 2000nM, 바람직하게는 10 내지 700nM의 농도로 사용된다. PMA는 통상 0.002 내지 20μM, 바람직하게는 0.02 내지 2μM의 농도로 사용된다.
미분화 유지 인자는 다능성 줄기 세포의 분화를 억제하는 작용을 갖는 물질이면 특별히 한정은 없는다. 당업자에게 범용되고 있는 미분화 유지 인자로서는, FGF 시그널 전달 경로 작용 물질, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 작용 물질, 인슐린 등을 들 수 있다. FGF 시그널 전달 경로 작용 물질로서 구체적으로는, 섬유아세포 증식 인자(예를 들어, bFGF, FGF4나 FGF8)를 들 수 있다. 또한, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, TGFβ 시그널 전달 경로 작용 물질, 노달/액티빈 시그널 전달 경로 작용 물질을 들 수 있다. TGFβ 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어 TGFβ1, TGFβ2를 들 수 있다. 노달/액티빈 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어 노달, 액티빈A, 액티빈B를 들 수 있다. 인간 다능성 줄기 세포(인간 ES 세포, 인간 iPS 세포)를 배양하는 경우, 제1 공정에서의 배지는, 바람직하게는 미분화 유지 인자로서, bFGF를 포함한다.
제1 공정에 있어서 사용되는 배지 중의 미분화 유지 인자 농도는, 배양하는 다능성 줄기 세포의 미분화 상태를 유지 가능한 농도이며, 당업자라면 적절히 설정할 수 있다. 예를 들어, 구체적으로는 피더 세포 비존재 하에서 미분화 유지 인자로서 bFGF를 사용하는 경우, 그 농도는 통상 4ng 내지 500ng/mL 정도, 바람직하게는 10ng 내지 200ng/mL 정도, 보다 바람직하게는 30ng 내지 150ng/mL 정도이다.
미분화 유지 인자를 포함하고, 다능성 줄기 세포를 배양하기 위해 사용 가능한 피더 프리 배지로서, 많은 합성 배양지가 개발·시판되고 있으며, 예를 들어 Essential 8 배지(Life Technologies사제)를 들 수 있다. Essential 8 배지는 DMEM/F12 배지에, 첨가제로서 L-아스코르브산-2-포스페이트마그네슘(L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium)(64mg/L), 소듐셀레늄(sodium selenium)(14μg/L), 인슐린(19.4mg/L), NaHCO3(543mg/L), 트란스페린(10.7mg/L), bFGF(100ng/mL) 및 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 작용 물질(TGFβ(2ng/mL) 또는 노달(100ng/mL))을 포함한다(Nature Methods, 8, 424-429(2011)). 기타 시판되는 피더 프리 배지로서는, S-medium(DS 파마바이오메디칼사제), StemPro(Life Technologies사제), hESF9(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008 Sep 9; 105(36): 13409-14), mTeSR1(STEMCELL Technologies사제), mTeSR2(STEMCELL Technologies사제), TeSR-E8(STEMCELL Technologies사제), 또는 StemFit(아지노모토사제)를 들 수 있다. 상기 제1 공정에서는 이들을 사용함으로써, 간편하게 본 발명을 실시할 수 있다. 이들 배지를 사용함으로써, 피더 프리 조건에서의 다능성 줄기 세포의 배양을 행하는 것이 가능하다. 공정 (A)에서 사용하는 배지는, 일례로서, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질 중 어느 것도 첨가되지 않은 무혈청 배지이다.
공정 (A)에 있어서의 피더 프리 조건에서의 다능성 줄기 세포의 배양에 있어서는, 피더 세포를 대신하는 발판을 다능성 줄기 세포에 제공하기 위해서, 적절한 매트릭스를 발판으로서 사용해도 된다. 발판으로서 사용할 수 있는 매트릭스로서는, 라미닌(Nat Biotechnol 28, 611-615, (2010)), 라미닌 단편(Nat Commun 3, 1236, (2012)), 기저막 표품(Nat Biotechnol 19, 971-974, (2001)), 젤라틴, 콜라겐, 헤파란황산프로테오글리칸, 엔탁틴, 비트로넥틴(Vitronectin) 등을 들 수 있다.
공정 (A)에 있어서의 다능성 줄기 세포의 배양 시간은, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질(예: 100nM 내지 700nM)의 존재 하에서 배양하는 경우, 공정 (B)에 있어서 형성되는 세포 응집체의 질을 향상시키는 효과가 달성 가능한 범위에서 특별히 한정되지 않지만, 통상 0.5 내지 144시간이다. 일 양태에 있어서, 바람직하게는 2 내지 96시간, 보다 바람직하게는 6 내지 48시간, 더욱 바람직하게는 12 내지 48시간, 보다 더 바람직하게는 18 내지 28시간(예, 24시간)이다.
공정 (B)에 있어서 사용되는 배지는 혈청 함유 배지 또는 무혈청 배지일 수 있다. 화학적으로 미결정 성분의 혼입을 회피하는 관점에서, 무혈청 배지가 적합하게 사용된다. 조제의 번잡함을 회피하기 위해서는, 예를 들어 시판되는 KSR 등의 혈청 대체물을 적량 첨가한 무혈청 배지를 들 수 있다. 무혈청 배지에의 KSR의 첨가량으로서는, 통상 약 1％로부터 약 30％이며, 바람직하게는 약 2％로부터 약 20％이다.
응집체의 형성 시에는 먼저, 공정 (A)에서 얻어진 세포의 분산 조작에 의해, 분산된 세포를 조제한다. 분산 조작에 의해 얻어진 「분산된 세포」란, 예를 들어 7할(바람직하게는 8할 이상) 이상이 단일 세포이며 2 내지 50 세포의 덩어리가 3할 이하(바람직하게는 2할 이하) 존재하는 상태를 들 수 있다. 분산된 세포란, 세포끼리의 접착(예를 들어 면 접착)이 거의 없어진 상태를 들 수 있다.
분산된 세포의 현탁액을 배양기 안에 뿌리고, 분산시킨 세포를, 배양기에 대하여 비접착성의 조건 하에서 배양함으로써, 복수의 세포를 집합시켜 응집체를 형성한다. 일 양태로서, 96웰 플레이트와 같은 멀티웰 플레이트(U 바닥, V 바닥)의 각 웰에 일정수가 분산된 줄기 세포를 넣고, 이것을 정치 배양하면, 세포가 신속히 응집됨으로써, 각 웰에 있어서 1개의 응집체가 형성된다(SFEBq법). 96웰 플레이트를 사용하여 세포를 부유 배양하는 경우, 1웰당 약 1×103으로부터 약 1×105 세포(바람직하게는 약 3×103으로부터 약 5×104 세포, 약 4×103으로부터 약 2×104 세포)가 되게 조제한 액을 웰에 첨가하고, 플레이트를 정치하여 응집체를 형성시킨다.
일 양태에 있어서, 공정 (B)에 있어서 사용되는 배지는, 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함한다.
즉, 구체적인 일 양태로서, 하기 공정 (A), (B) 및 (C)를 포함하는 방법에 의해 신경 망막을 포함하는 세포 응집체를 조제할 수 있다:
(A) 다능성 줄기 세포를 피더 세포 비존재 하에서, 또한 임의로 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함해도 되는, 미분화 유지 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 공정,
(B) 공정 (A)에서 얻어진 세포를, 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 부유 배양함으로써 세포 응집체를 형성시키는 공정,
(C) 공정 (B)에서 얻어진 세포 응집체를, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 또한 부유 배양하는 공정.
공정 (B)에 있어서의 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 상술한 것을 상술한 농도(예: 10nM 내지 300nM)로 사용할 수 있다. 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질은 바람직하게는 부유 배양 개시 시부터 배지에 포함된다. 배지에는, ROCK 저해제(예, Y-27632)를 첨가해도 된다. 배양 시간은 예를 들어, 12시간 내지 6일간이다. 공정 (B)에 있어서 사용되는 배지는, 일례에 있어서, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 작용 물질로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상(바람직하게는 전부)이 첨가되지 않은 배지이다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이란, BMP에 의해 매개되는 시그널 전달 경로를 증강시킬 수 있는 물질이다. BMP 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어 BMP2, BMP4 혹은 BMP7 등의 BMP 단백질, GDF7 등의 GDF 단백질, 항BMP 수용체 항체, 또는 BMP 부분 펩티드 등을 들 수 있다. BMP2 단백질, BMP4 단백질 및 BMP7 단백질은 예를 들어 R&D Systems사로부터, GDF7 단백질은 예를 들어 와코 쥰야쿠로부터 입수 가능하다.
공정 (C)에 있어서 사용되는 배지는, 예를 들어 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 첨가된 무혈청 배지 또는 혈청 배지(바람직하게는, 무혈청 배지)를 들 수 있다. 무혈청 배지, 혈청 배지는 상술한 바와 같이 준비할 수 있다. 공정 (C)에 있어서 사용되는 배지는, 일례에 있어서, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 작용 물질로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상(바람직하게는 전부)이 첨가되지 않은 배지이다. 또한, 공정 (C)에 있어서 사용되는 배지는, 일례에 있어서 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질이 첨가되지 않은 배지이다. 또한, 공정 (C)에 있어서 사용되는 배지는, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질이 첨가되어 있어도 되는 배지이다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도는, 망막계 세포로의 분화를 유도 가능한 농도이면 된다. 예를 들어 인간 BMP4 단백질인 경우에는, 약 0.01nM 내지 약 1μM, 바람직하게는 약 0.1nM 내지 약 100nM, 보다 바람직하게는 약 1nM 내지 약 10nM, 더욱 바람직하게는 약 1.5nM(55ng/mL)의 농도가 되도록 배지에 첨가한다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질은, 공정 (A)의 부유 배양 개시부터 약 24시간 후 이후에 첨가되어 있으면 되고, 부유 배양 개시 후 수일 이내(예를 들어, 15일 이내)에 배지에 첨가해도 된다. 바람직하게는 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질은 부유 배양 개시 후 1일째 내지 15일째까지의 사이, 보다 바람직하게는 1일째 내지 9일째까지의 사이, 가장 바람직하게는 3일째에 배지에 첨가한다.
구체적인 양태로서, 예를 들어 공정 (B)의 부유 배양 개시 후 1 내지 9일째, 바람직하게는 1 내지 3일째에, 배지의 일부 또는 전부를 BMP4를 포함하는 배지로 교환하고, BMP4의 최종 농도를 약 1 내지 10nM으로 조제하고, BMP4의 존재 하에서 예를 들어 1 내지 12일, 바람직하게는 2 내지 9일, 더욱 바람직하게는 2 내지 5일간 배양할 수 있다. 여기에 있어서, BMP4의 농도를, 동일 농도를 유지하기 위해, 1회 혹은 2회 정도 배지의 일부 또는 전부를 BMP4를 포함하는 배지로 교환할 수 있다. 또는 BMP4의 농도를 단계적으로 저감시킬 수도 있다. 예를 들어, 공정 (B)의 부유 배양 개시 후 2 내지 10일째까지 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질(BMP4)의 농도를 유지한 후, 공정 (B)의 부유 배양 개시 후 6 내지 20일째까지 단계적으로 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질(BMP4)의 농도를 저감시켜도 된다.
상기 공정 (A) 내지 공정 (C)에 있어서의 배양 온도, CO2 농도 등의 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. 또한 CO2 농도는, 예를 들어 약 1％ 내지 약 10％, 바람직하게는 약 5％이다.
상기 공정 (C)에 있어서의 배양 기간을 변동시킴으로써 세포 응집체에 포함되는 망막계 세포로서, 각종 분화 단계의 망막계 세포를 제조할 수 있다. 즉, 미성숙한 망막계 세포(예: 망막 전구 세포, 시세포 전구 세포)와 성숙한 망막계 세포(예: 시세포)를 다양한 비율로 포함하는, 세포 응집체 중의 망막계 세포를 제조할 수 있다. 공정 (C)의 배양 기간을 연장시킴으로써, 성숙한 망막계 세포의 비율을 증가시킬 수 있다.
상기 공정 (B) 및/또는 공정 (C)는 WO2017/183732에 개시된 방법을 사용할 수도 있다. 즉, 공정 (B) 및/또는 공정 (C)에 있어서, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 더 포함하는 배지에서 부유 배양하고, 세포 응집체를 형성할 수 있다.
공정 (B) 및/또는 공정 (C)에 사용하는, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질로서는, Wnt에 의해 매개되는 시그널 전달을 억제할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않고, 단백질, 핵산, 저분자 화합물 등 중 어느 것이어도 된다. Wnt에 의해 매개되는 시그널은, Frizzled(Fz) 및 LRP5/6(저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질(low-density lipoprotein receptor-related protein) 5/6)의 헤테로2량체로서 존재하는 Wnt 수용체를 통해 전달된다. Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질로서는, 예를 들어 Wnt 또는 Wnt 수용체에 직접 작용하는 물질(항Wnt 중화 항체, 항Wnt 수용체 중화 항체 등), Wnt 또는 Wnt 수용체를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 물질(예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등), Wnt 수용체와 Wnt의 결합을 저해하는 물질(가용형 Wnt 수용체, 도미넌트 네거티브 Wnt 수용체 등, Wnt 안타고니스트, Dkk1, Cerberus 단백질 등), Wnt 수용체에 의한 시그널 전달에서 기인하는 생리 활성을 저해하는 물질[CKI-7(N-(2-아미노에틸)-5-클로로이소퀴놀린-8-술폰아미드), D4476(4-[4-(2,3-디히드로-1,4-벤조디옥신-6-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드), IWR-1-endo(IWR1e)(4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-헥사히드로-1,3-디옥소-4,7-메타노-2H-이소인돌-2-일]-N-8-퀴놀리닐-벤즈아미드), 그리고 IWP-2(N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라히드로-4-옥소-3-페닐티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]아세트아미드) 등의 저분자 화합물 등] 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질로서, 이들을 1종 또는 2종 이상 포함하고 있어도 된다. CKI-7, D4476, IWR-1-endo(IWR1e), IWP-2 등은 공지된 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이며, 시판품 등을 적절히 입수 가능하다. Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질로서 바람직하게는 IWR1e가 사용된다.
공정 (B)에 있어서의 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질의 농도는, 양호한 세포 응집체의 형성을 유도 가능한 농도이면 된다. 예를 들어 IWR-1-endo의 경우에는, 약 0.1μM으로부터 약 100μM, 바람직하게는 약 0.3μM으로부터 약 30μM, 보다 바람직하게는 약 1μM으로부터 약 10μM, 더욱 바람직하게는 약 3μM의 농도가 되도록 배지에 첨가한다. IWR-1-endo 이외의 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 사용하는 경우에는, 상기 IWR-1-endo의 농도와 동등한 Wnt 시그널 전달 경로 저해 활성을 나타내는 농도로 사용되는 것이 바람직하다.
공정 (B)에 있어서, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 배지에 첨가하는 타이밍은, 빠른 것이 바람직하다. Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질은 공정 (B)에 있어서의 부유 배양 개시부터, 통상 6일 이내, 바람직하게는 3일 이내, 보다 바람직하게는 1일 이내, 보다 바람직하게는 12시간 이내, 더욱 바람직하게는 공정 (B)에 있어서의 부유 배양 개시 시에, 배지에 첨가된다. 구체적으로는, 예를 들어 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 첨가한 기초 배지의 첨가나, 해당 기초 배지에의 일부 혹은 전부의 배지 교환을 행할 수 있다. 공정 (A)에서 얻어진 세포를, 공정 (B)에 있어서 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질에 작용시키는 기간은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 공정 (B)에 있어서의 부유 배양 개시 시에 배지에 첨가한 후, 공정 (B) 종료 시(BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 첨가 직전)까지 작용시킨다. 더욱 바람직하게는, 후술하는 대로 공정 (B) 종료 후(즉 공정 (C)의 기간 중)에도, 이어서 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질에 폭로시킨다. 일 양태로서는, 후술하는 대로 공정 (B) 종료 후(즉 공정 (C)의 기간 중)에도, 이어서 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질에 작용시켜, 망막 조직이 형성될 때까지 작용시켜도 된다.
공정 (C)에 있어서, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질로서는, 전술한 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질 중 어느 것을 사용할 수 있지만, 바람직하게는 공정 (B)에서 사용한 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질과 동일한 종류의 것을 공정 (C)에 있어서 사용한다.
공정 (C)에 있어서의 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질의 농도는, 망막 전구 세포 및 망막 조직을 유도 가능한 농도이면 된다. 예를 들어 IWR-1-endo의 경우에는, 약 0.1μM으로부터 약 100μM, 바람직하게는 약 0.3μM으로부터 약 30μM, 보다 바람직하게는 약 1μM으로부터 약 10μM, 더욱 바람직하게는 약 3μM의 농도가 되도록 배지에 첨가한다. IWR-1-endo 이외의 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 사용하는 경우에는, 상기 IWR-1-endo의 농도와 동등한 Wnt 시그널 전달 경로 저해 활성을 나타내는 농도로 사용되는 것이 바람직하다. 공정 (C)의 배지 중의 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질의 농도는, 공정 (B)의 배지 중의 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질의 농도를 100으로 하였을 때, 바람직하게는 50 내지 150, 보다 바람직하게는 80 내지 120, 더욱 바람직하게는 90 내지 110이며, 제2 공정의 배지 중의 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질의 농도와 동등한 것이, 보다 바람직하다.
Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질의 배지에의 첨가 시기는, 망막계 세포 혹은 망막 조직을 포함하는 응집체 형성을 달성할 수 있는 범위에서 특별히 한정되지 않지만, 빠르면 빠른 것이 바람직하다. 바람직하게는 공정 (C) 개시 시에 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이 배지에 첨가된다. 보다 바람직하게는, 공정 (B)에 있어서 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이 첨가된 후, 공정 (C)에 있어서도 계속해서(즉, 공정 (B)의 개시 시부터) 배지 중에 포함된다. 더욱 바람직하게는, 공정 (B)의 부유 배양 개시 시에 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이 첨가된 후, 공정 (C)에 있어서도 계속해서 배지 중에 포함된다. 예를 들어, 공정 (B)에서 얻어진 배양물(Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하는 배지 중의 응집체의 현탁액)에 BMP 시그널 전달 작용 물질(예, BMP4)을 첨가하면 된다.
Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질에 작용시키는 기간은, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 공정 (B)에 있어서의 부유 배양 개시 시에 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이 첨가되는 경우에 있어서, 공정 (B)에 있어서의 부유 배양 개시 시를 기산점으로 하여, 2일간 내지 30일간, 보다 바람직하게는 6일간 내지 20일간, 8일간 내지 18일간, 10일간 내지 18일간, 또는 10일간 내지 17일간(예를 들어, 10일간)이다. 다른 양태에 있어서, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질에 작용시키는 기간은, 공정 (B)에 있어서의 부유 배양 개시 시에 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이 첨가되는 경우에 있어서, 공정 (B)에 있어서의 부유 배양 개시 시를 기산점으로 하여, 바람직하게는 3일간 내지 15일간(예를 들어, 5일간, 6일간, 7일간)이며, 보다 바람직하게는 6일간 내지 10일간(예를 들어, 6일간)이다.
상술한 방법에서 얻은 세포 응집체를 Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질, 및/또는 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서 2일간 내지 4일간 정도의 기간 배양(공정 (D)) 후, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서 30일간 내지 200일간 정도(30일간 내지 150일간, 50일간 내지 120일간, 60일간 내지 90일간) 배양함(공정 (E))으로써, 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 신경 망막을 제조할 수도 있다.
일 양태로서, 공정 (A) 내지 (C)에서 얻어진 세포 응집체이며, 공정 (B)의 부유 배양 개시 후 6 내지 30일째, 10 내지 20일째(10일째, 11일째, 12일째, 13일째, 14일째, 15일째, 16일째, 17일째, 18일째, 19일째 또는 20일째)의 세포 응집체로부터, 상기 공정 (D) 및 공정 (E)에 의해, 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 신경 망막을 제조할 수 있다.
Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, Wnt에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강시킬 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 구체적인 Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어 GSK3β 저해제(예를 들어, 6-브로모인디루빈-3'-옥심(6-Bromoindirubin-3'-oxime)(BIO), CHIR99021, 켄폴론(Kenpaullone))를 들 수 있다. 예를 들어 CHIR99021의 경우에는, 약 0.1μM 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 1μM 내지 약 30μM의 범위를 들 수 있다.
FGF 시그널 전달 경로 저해 물질로서는, FGF에 의해 매개되는 시그널 전달을 저해할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. FGF 시그널 전달 경로 저해 물질로서는, 예를 들어 SU-5402, AZD4547, BGJ398 등을 들 수 있다. 예를 들어 SU-5402의 경우, 약 0.1μM 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 1μM 내지 약 30μM, 보다 바람직하게는 약 5μM의 농도로 첨가한다.
공정 (D)에 있어서 사용되는 배지는, 일례에 있어서, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질, SHH 시그널 전달 경로 작용 물질, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 작용 물질로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상(바람직하게는 전부)이 첨가되지 않은 배지이다.
상기 공정 (E)의 일부 또는 전부의 공정은, WO2019/017492에 개시된 연속 상피 조직 유지용 배지를 사용하여 배양할 수 있다. 즉, 연속 상피 조직 유지용 배지를 사용하여 배양함으로써, 신경 망막의 연속 상피 구조를 유지할 수 있다. 일례로서, 뉴로바살 배지(예: 서모 피셔 사이언티픽사제, 21103049)에 B27 서플리먼트(예: 서모 피셔 사이언티픽, 12587010)를 배합한 배지를 연속 상피 조직 유지용 배지로서 들 수 있다.
상기 공정 (E)에 있어서의 배양은 망막계 세포(특히 시세포)의 분화 및/또는 성숙화와, 연속 상피 구조의 유지를 양립시키기 위해서, 단계적으로 연속 상피 조직 유지용 배지로 교환하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 처음의 10일간 내지 30일간을 세포 증식용 기초 배지(예: DMEM/F12 배지에 10％ 소태아 혈청, 1％ N2 서플리먼트 및 100μM 타우린이 첨가된 배지), 다음 10일간 내지 40일간을 세포 증식용 기초 배지와 연속 상피 조직 유지용 배지의 혼합 배지(DMEM/F12 배지에 10％ 소태아 혈청, 1％ N2 서플리먼트 및 100μM 타우린이 첨가된 배지와, 뉴로바살 배지에, 10％ 소태아 혈청, 2％ B27 서플리먼트, 2mM 글루타민 및 100μM 타우린이 첨가된 배지를 1: 3의 비율로 혼합한 배지), 다음 20일간 내지 140일간을 연속 상피 조직 유지용 배지(예: 뉴로바살 배지에, 10％ 소태아 혈청, 2％ B27 서플리먼트, 2mM 글루타민 및 100μM 타우린이 첨가된 배지)를 사용하여 배양할 수 있다.
상기 공정 (E)의 일부 또는 전부의 공정에 있어서, 세포 증식용 기초 배지, 연속 상피 조직 유지용 배지 또는 이들의 혼합 배지 중 어느 배지를 사용하고 있는 경우에도, 갑상선 호르몬 시그널 전달 경로 작용 물질을 더 포함해도 된다. 갑상선 호르몬 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 배지에서 배양함으로써, 신경 망막에 포함되는 쌍극 세포, 아마크린 세포, 신경절 세포 또는 수평 세포 등의 비율이 낮고, 또한 시세포 전구 세포의 비율을 증대시킨 신경 망막을 포함하는 세포 응집체의 제조가 가능해진다.
본 명세서에 있어서, 갑상선 호르몬 시그널 전달 경로 작용 물질이란, 갑상선 호르몬에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강시킬 수 있는 물질이며, 갑상선 호르몬 시그널 전달 경로를 증강시킬 수 있는 것이면 특별히 한정은 없는다. 갑상선 호르몬 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어 트리요오드사이로닌(이하, T3이라 약칭하는 경우가 있음), 사이록신(이하, T4라 약칭하는 경우가 있음), 갑상선 호르몬 수용체(바람직하게는 TRβ 수용체) 아고니스트 등을 들 수 있다.
또한, 당업자에게 주지된 갑상선 호르몬 수용체 아고니스트로서, 국제 공개 제97/21993호 팸플릿, 국제 공개 제2004/066929호 팸플릿, 국제 공개 제2004/093799호, 국제 공개 제2000/039077호 팸플릿, 국제 공개 제2001/098256호 팸플릿, 국제 공개 제2003/018515호 팸플릿, 국제 공개 제2003/084915호 팸플릿, 국제 공개 제2002/094319호 팸플릿, 국제 공개 제2003/064369호 팸플릿, 일본 특허 공개 제2002-053564호 공보, 일본 특허 공개 제2002-370978호 공보, 일본 특허 공개 제2000-256190호 공보, 국제 공개 제2007/132475호 팸플릿, 국제 공개 제2007/009913호 팸플릿, 국제 공개 제2003/094845호 팸플릿, 국제 공개 제2002/051805호 팸플릿 또는 국제 공개 제2010/122980호 팸플릿에 기재된 디페닐메탄 유도체, 디아릴에테르 유도체, 피리다진 유도체, 피리딘 유도체 혹은 인돌 유도체 등의 화합물을 들 수 있다.
갑상선 호르몬 시그널 전달 경로 작용 물질로서 T3을 사용하는 경우에는, 예를 들어 0.1 내지 1000nM의 범위가 되도록 배지에 첨가할 수 있다. 바람직하게는 1 내지 500nM; 보다 바람직하게는 10 내지 100nM; 더욱 바람직하게는 30 내지 90nM; 보다 더 바람직하게는 60nM 전후의 농도의 T3에 상당하는 갑상선 호르몬 시그널 전달 항진 활성을 갖는 농도를 들 수 있다. 갑상선 호르몬 시그널 전달 경로 작용 물질로서 T4를 사용하는 경우에는, 예를 들어 1nM 내지 500μM의 범위가 되도록 배지에 첨가할 수 있다. 바람직하게는 50nM 내지 50μM; 보다 바람직하게는 500nM 내지 5μM의 범위이다. 기타 갑상선 호르몬 수용체 아고니스트를 사용하는 경우, 상술한 농도의 T3 또는 T4가 나타내는 아고니스트 활성과 동일 정도의 활성을 나타내는 농도이면 된다.
공정 (E)에 있어서 사용되는 배지는, 적절히 L-글루타민, 타우린, 혈청 등을 포함하고 있어도 된다. 공정 (E)에 있어서 사용되는 배지는, 일례에 있어서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질, FGF 시그널 전달 경로 저해 물질, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질, SHH 시그널 전달 경로 작용 물질, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 작용 물질로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상(바람직하게는 전부)이 첨가되지 않은 배지이다.
구체적인 일 양태로서, 하기 공정 (A) 내지 (E)를 포함하는 방법에 의해 신경 망막을 포함하는 세포 응집체를 조제할 수 있다:
(A) 다능성 줄기 세포를 피더 세포 비존재 하에서, 미분화 유지 인자를 포함하며, 또한 임의로 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함해도 되는 배지에서 배양하는 공정,
(B) 공정 (A)에서 얻어진 세포를, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하고 있어도 되는 배지 중에서 부유 배양함으로써 세포 응집체를 형성시키는 공정,
(C) 공정 (B)에서 얻어진 세포 응집체를, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 또한 부유 배양하는 공정,
(D) 공정 (C)에서 얻어진 세포 응집체를, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질, 및/또는 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서 2일간 내지 4일간 정도의 기간 배양하는 공정, 및
(E) 공정 (D)에서 얻어진 세포 응집체를, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하지 않고, 갑상선 호르몬 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하고 있어도 되는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서 30일간 내지 200일간 정도 배양하는 공정.
구체적인 일 양태로서, 하기 공정 (A) 내지 (E)를 포함하는 방법에 의해 신경 망막을 포함하는 세포 응집체를 조제할 수 있다:
(A) 다능성 줄기 세포를 피더 세포 비존재 하에서, 미분화 유지 인자를 포함하며, 또한 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 배지에서 12시간 내지 48시간 배양하는 공정,
(B) 공정 (A)에서 얻어진 세포를, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서, 12시간 내지 72일간(24시간 내지 48시간) 부유 배양함으로써 세포 응집체를 형성시키는 공정,
(C) 공정 (B)에서 얻어진 세포 응집체를, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 또한 8일간 내지 15일간(10일간 내지 13일간) 부유 배양하는 공정,
(D) 공정 (C)에서 얻어진 세포 응집체를, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질, 및/또는 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서 2일간 내지 4일간 배양하는 공정, 및
(E) 공정 (D)에서 얻어진 세포 응집체를, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하지 않고, 갑상선 호르몬 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하고 있어도 되는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서 10일간 내지 200일간 정도 배양하는 공정.
여기서 공정 (E)는 10일간 내지 30일간 세포 증식용 기초 배지에서 배양하고, 이어서 10일간 내지 40일간 세포 증식용 기초 배지와 갑상선 호르몬 시그널 전달 작용 물질을 포함하는 연속 상피 조직 유지용 배지의 혼합 배지에서 배양하고, 또한 20일간 내지 140일간 갑상선 호르몬 시그널 전달 작용 물질을 포함하는 연속 상피 조직 유지용 배지에서 배양하는 공정을 포함하고 있어도 된다.
일 양태에 있어서, 공정 (E)는 갑상선 호르몬 시그널 전달 경로 작용 물질의 존재 하에 20일간 내지 60일간(30일간 내지 50일간) 배양하는 것을 포함한다.
일 양태에 있어서, 공정 (B) 내지 공정 (E)까지의 배양 기간은 70일간 내지 100일간(80일간 내지 90일간)이다.
상술한 방법에 의해, 신경 망막을 포함하는 세포 응집체를 제조할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 일 양태로서, 신경 망막을 포함하는 세포 응집체는, 세포 응집체의 혼합물로서 얻을 수도 있다. 다른 양태로서, 예를 들어 96웰 플레이트의 1웰에 1개의 세포 응집체를 제조할 수도 있고, 신경 망막을 포함하는 세포 응집체를 1개씩 얻을 수도 있다. 어느 경우에 있어서도, 동일한 조건 하에서 제조된 세포 응집체를 동일 로트의 세포 응집체로 한다. 동일 로트의 세포 응집체는 당업자라면 임의의 범위로 설정할 수 있다. 예를 들어, 상술한 세포 응집체의 혼합물 중에 포함되는 세포 응집체, 또는 동일한 세포 배양 용기(예: 96웰 플레이트) 중에 포함되는 세포 응집체를 동일 로트의 세포 응집체로서 설정해도 된다. 다른 예로서, 동시에 조제한 동일한 줄기 세포나 배지 등의 재료를 사용한 범위를 동일 로트의 세포 응집체로서 설정할 수도 있다. 동일 로트의 세포 응집체는 세포의 조성·순도·형태에 대하여는 다양성이 있다. 한편, 동일 로트의 세포 응집체로부터, 특정한 조직(예를 들어, 신경 망막)만을 평가한 경우, 통상 동등한 유전자 발현 프로파일을 나타낸다.
(신경 망막을 포함하는 세포 응집체)
신경 망막을 포함하는 세포 응집체는, 신경 망막을 포함하고 있으면 되고, 세포 응집체의 구조는 구애받지 않는다. 일 양태에 있어서, 신경 망막을 포함하는 세포 응집체는 스페어상 세포 응집체이다. 일 양태에 있어서, 신경 망막을 포함하는 세포 응집체 중에는, 복수의 신경 망막이 겹쳐서 존재하는 경우가 있다(예: 도 5에 있어서의 개념도 (1) 및 (2) 등을 참조). 일 양태에 있어서, 신경 망막을 포함하는 세포 응집체는, 이식용 신경 망막을 포함하는 제1 상피 조직(목적 상피 조직) 및 제1 상피 조직의 표면에 있어서의 접선의 기울기의 연속성과 다른 표면의 접선의 기울기의 연속성을 가지며, 또한 비신경 망막계 세포를 포함하는 제2 상피 조직(목적외 상피 조직)을 포함한다. 여기서, 제1 상피 조직은 실질적으로 비신경 망막계 세포(목적외 세포)를 포함하지 않고, 이식용 신경 망막을 잘라내는 것이 가능한 상피 조직을 나타낸다. 한편, 제2 상피 조직은 신경 망막을 포함하고 있어도 되지만, 목적외 세포를 포함하기 때문에 이식용 신경 망막을 잘라내기 위해서는 불적격의 상피 조직이다. 다른 양태에 있어서, 신경 망막을 포함하는 세포 응집체는, 이식용 신경 망막을 포함하는 제1 상피 조직(목적 상피 조직)만을 포함하고, 목적외 상피 조직을 포함하지 않는다.
이식용 신경 망막이란, 인간 이식용에 적합한 인간 신경 망막이며, 바람직하게는 신경 망막만을 포함한다. 이식용 신경 망막은 적어도 시세포층을 포함하고, 시세포층은 적어도 세포 응집체의 가장 외측에 형성되어 있고, 또한 내측에도 시세포 또는 시세포 전구 세포가 존재해도 되고, 또는 내측에도 시세포층이 형성되어 있어도 된다. 시세포 등은 세포 응집체의 표면의 접선 방향으로 연속되고, 즉 서로 접착되어 존재하고 있으며, 시세포 등이 세포 응집체의 표면의 접선 방향으로 연속해서 존재함으로써, 시세포 등을 포함하는 시세포층을 형성하고 있다. 또한, 접선 방향이란, 세포 응집체의 표면에 대한 접선 방향, 즉 시세포층에 있어서의 시세포 등이 배열되어 있는 방향을 말하고, 당해 신경 망막에 대하여 평행 방향 또는 가로 방향이다. 또한, 상피 조직의 표면에 있어서의 접선의 기울기란, 상피 조직에 있어서 하나하나의 세포가 일정 방향으로 배열되어 있는 경우의 세포가 배열되어 있는 방향을 말하고, 상피 조직(또는 상피 시트)에 대하여 평행 방향 또는 가로 방향을 말한다.
세포 응집체에 포함되는 제2 상피 조직은, 신경 망막 이외의 상피 조직, 즉 목적외 상피 조직을 포함하는 상피 조직이며, 제2 상피 조직으로서는, 안구 관련 조직 및 뇌척수 조직을 들 수 있고, 안구 관련 조직은 비망막의 안구 조직 주변의 조직을 의미하고, 망막 색소 상피 세포, 모양체(예: 모양체 주연부), 수정체를 들 수 있다. 뇌척수 조직은 뇌 및 척수의 신경 조직을 의미하고, 전뇌, 종뇌, 대뇌, 간뇌, 시상 하부, 중뇌, 후뇌, 소뇌, 척수를 들 수 있다. 제2 상피 조직에 포함되는 세포 및 발현 유전자는 후술한 대로이다.
제1 상피 조직 및 제2 상피 조직을 포함하는 세포 응집체의 일례로서는, 도 4에 있어서의 개념도 및 도 5에 있어서의 개념도 (3) 및 (5) 등이 나타내는 세포 응집체를 들 수 있다. 도 4에 있어서의 개념도는, 제1 상피 조직인 신경 망막의 일부에 있어서 제2 상피 조직으로서 안구 관련 조직(망막 색소 상피 세포, 모양체)(도 4의 흑색 부분)이 존재하는 세포 응집체의 일례를 나타내고 있다. 도 5에 있어서의 개념도 (3)은, 복수의 신경 망막이 겹쳐서 존재하는 경우(예: 도 5에 있어서의 개념도 (1) 및 (2))에 있어서, 또한 제2 상피 조직으로서 안구 관련 조직(망막 색소 상피 세포, 모양체)(도 5의 (3)의 흑색 부분)이 존재하는 세포 응집체의 일례를 나타내고 있다. 도 5에 있어서의 개념도 (5)는, 제2 상피 조직으로서 뇌척수 조직(대뇌 등)(도 5의 (5)의 회색 부분)이 존재하는 세포 응집체의 일례를 나타내고 있다. 도 5에 있어서의 개념도 (4)와 같이, 이식용 신경 망막을 포함하는 세포 응집체의 내측에 목적외 조직이 포함되는 경우가 있다. 이 경우에는, 「제1 상피 조직의 표면에 있어서의 접선의 기울기의 연속성과 다른 표면의 접선의 기울기의 연속성을 가지고,」라는 정의에 해당하지 않기 때문에, 제2 상피 조직에는 해당하지 않는다. 이식용 신경 망막 및 품질 평가용 샘플은, 내측에 목적외 조직을 포함하지 않는 세포 응집체로부터 선택하는 것이 바람직하다.
<추출 공정>
본 발명에 관한 이식용 신경 망막의 품질을 평가하는 방법은, 다능성 줄기 세포 유래의 상피 구조를 갖는 신경 망막을 포함하는 세포 응집체의 일부 또는 전부를 품질 평가용 샘플로서 추출(sampling)하는 것(이하, 「추출 공정」이라고 함)을 포함한다. 세포 응집체의 일부를 품질 평가용 샘플로서 추출한다는 것은, 복수의 세포 응집체 중으로부터 일부의 세포 응집체(1 혹은 복수), 또는 전부의 세포 응집체를 선택하고, 선택한 세포 응집체 중의 일부분을 핀셋, 가위 및/또는 나이프 등을 사용하여 평가용 샘플로서 단리하는(예: 잘라내는(dissect)) 것을 의미한다. 세포 응집체의 전부를 품질 평가용 샘플로서 추출한다는 것은, 복수의 세포 응집체 중으로부터 일부의 세포 응집체(1 혹은 복수)의 세포 응집체를 선택하고, 선택한 1 또는 복수의 세포 응집체의 전부를 품질 평가용 샘플로서 따로따로 취출하는(pick up) 것을 의미한다. 복수의 세포 응집체 중으로부터 1 또는 복수의 세포 응집체를 선택하는 경우에는, 랜덤하게 추출하는 것이 바람직하다. 본 명세서에 있어서, 세포 응집체의 일부를 품질 평가용 샘플로서 추출하는 경우의 세포 응집체를 「품질 평가용 샘플을 포함하는 세포 응집체」, 세포 응집체의 전부를 품질 평가용 샘플로서 추출하는 경우의 세포 응집체를 「품질 평가용 샘플의 세포 응집체」라 기재한다.
(세포 응집체의 전부의 추출)
일 양태에 있어서, 품질 평가용 샘플은 다능성 줄기 세포 유래의 상피 구조를 갖는 신경 망막을 포함하는 세포 응집체의 전부이다. 동일 로트의 신경 망막을 포함하는 세포 응집체의 품질 평가를 행하기 위해서, 품질 평가용 샘플은 동일 로트의 해당 세포 응집체 중의 1개 또는 복수의 세포 응집체의 전부이면 된다. 여기서, 동일 로트의 세포 응집체의 혼합물은, 예를 들어 2개 이상 10000개 이하의 세포 응집체를 포함한다.
구체적으로는, 동일 로트에 포함되는 세포 응집체의 품질 평가에 있어서는, 동일 로트로부터 1 또는 복수의 세포 응집체를 선택하고, 선택된 1 또는 복수의 세포 응집체의 전부를 품질 평가용 샘플로서 추출한다. 선택된 1 또는 복수의 세포 응집체의 전부를 품질 평가용 샘플로 할 때는, 복수의 세포 응집체의 전부를 합일하여 추출해도 되고, 복수의 세포 응집체의 전부를 따로따로 추출해도 된다. 품질 평가에 사용된 품질 평가용 샘플의 세포 응집체는 이식에 사용할 수 없게 된다.
품질 평가 샘플을 사용한 판정을 행한 결과로서, 1 또는 복수의 품질 평가용 샘플로서의 세포 응집체의 모두가 이식용 신경 망막으로서 사용 가능하다고 판정된 경우, 당해 세포 응집체에 포함되는 이식용 신경 망막과 동등한 유전자 발현 프로파일을 나타내는 조건 하에서 제조된, 동일 로트의 품질 평가용 샘플 이외의 세포 응집체에 있어서의 신경 망막을 이식용 신경 망막으로서 사용 가능하다고 판정할 수 있고, 이들 다른 세포 응집체에 포함되는 신경 망막을 포함하는 상피 조직을 이식에 사용할 수 있다(동일 로트 평가라고도 함). 따라서, 효율적인 품질 평가에 당해 추출 방법은 유용하다.
품질 평가 샘플을 사용한 판정을 행한 결과로서, 복수의 품질 평가용 샘플로서의 세포 응집체 중 1개라도 이식용 신경 망막으로서 사용 불가라고 판단된 경우, 동일 로트의 다른 세포 응집체에 있어서의 신경 망막을 이식용 신경 망막으로서 사용 불가라고 판정한다. 따라서, 예를 들어 동일 로트 중의 샘플수가 많고, 또한 부적합한 샘플이 혼입될 가능성이 낮은 경우에, 통상 당해 방법(동일 로트 평가)을 사용하면 된다. 그러나, 세포 응집체의 전부를 평가용 샘플로서 추출하기 위해서, 제2 상피 조직을 포함하는 세포 응집체를 포함하는 로트에는 당해 방법은 사용되지 않는 것이 바람직하다. 이 경우에는, 세포 응집체의 전부가 아니라, 후술하는 세포 응집체의 일부(신경 망막)를 추출하여 평가하는 것이 보다 적절하다. 또한, 제2 상피 조직을 포함하는 세포 응집체를 포함하는 로트에 대하여, 동일 로트 평가보다도, 후술하는 전수 평가가 바람직하게 사용된다.
(세포 응집체의 일부의 추출)
일 양태에 있어서, 품질 평가용 샘플은 다능성 줄기 세포 유래의 상피 구조를 갖는 신경 망막을 포함하는 세포 응집체의 일부이다. 세포 응집체의 일부를 품질 평가용 샘플로서 추출함으로써, 세포 응집체를 전부 파괴하지 않고, 나머지 부분에 포함되는 신경 망막을 이식에 사용된다는 이점이 있다. 즉, 세포 응집체의 일부인 품질 평가용 샘플에 대하여 후술하는 판정 공정에 의해 합격이라고 판정되면, 당해 품질 평가용 샘플을 포함하는 세포 응집체에 있어서의 상피 구조를 갖는 신경 망막을, 이식용 신경 망막으로서 사용 가능하다고 하고, 이식에 사용할 수 있다.
일 양태로서, 당해 추출 방법은, 신경 망막을 포함하는 세포 응집체의 품질을 개별로 평가하기 위해 사용할 수 있다(개별 평가라고도 함). 이 경우, 평가하고자 하는 신경 망막을 포함하는 세포 응집체를 전부 선택하여, 전부를 품질 평가할 수 있다는 이점도 있다(전수 평가). 당해 평가 방법(개별 평가·전수 평가)은 개별로 이식용 신경 망막의 품질을 평가할 수 있기 때문에, 가장 정확한 품질 평가 방법이라고 할 수 있다. 한편, 샘플수가 많은 경우에는, 매우 많은 노동력과 비용을 요한다. 또한, 하나의 세포 응집체 중의 이식용 신경 망막을 제외한 부위에, 당해 신경 망막과 동등한 유전자 발현 프로파일을 나타내는 부위(품질 평가용 샘플)가 존재하는 것, 및 당해 품질 평가용 샘플을 잘라낼 수 있는 것이 당해 평가 방법의 전제가 된다. 특히, 제2 상피 조직을 포함하는 세포 응집체에 있어서, 당해 전제를 충족하고 있는지 여부는 큰 문제가 된다. 본 발명자들이 대량의 샘플을 평가함으로써, 처음으로 신경 망막을 포함하는 세포 응집체가 당해 전제를 충족하고 있는 것, 및 당해 평가 방법을 사용할 수 있는 것을 발견하였다.
상기 이점을 살리기 위해서는, 품질 평가용 샘플로서 추출하는 세포 응집체의 일부는, 이식용 신경 망막 또는 이식용 신경 망막의 후보를 포함하지 않는 일부인 것이 바람직하다. 또한, 품질 평가용 샘플이, 이식용 신경 망막 또는 이식용 신경 망막의 후보와 동등한 유전자 발현 프로파일을 나타내는 일부인 것이 바람직하다. 이식용 신경 망막과 품질 평가용 샘플이 동등한 유전자 발현 프로파일을 나타내기 위해서는, 품질 평가용 샘플은, 이식용 신경 망막과 적어도 일부에 있어서 근접 또는 연속되어 있는 것이 바람직하고, 이식용 신경 망막과 동일한 상피 조직에 포함되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 이식용 신경 망막은, 세포 응집체 중의 가장 양호한(예: 신경 망막을 포함하고 비신경 망막을 포함하지 않고, 연속 상피 구조를 갖는) 부분으로서, 동일한 상피 조직의 중심 부근을 포함하는 것이 바람직하고, 동일한 상피 조직의 중심 부근이며, 후술하는 [이식용 신경 망막 시트]에 기재된 크기인 것이 바람직하다. 따라서, 품질 평가용 샘플은 동일한 상피 조직의 중심 부근을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 여기서, 동일한 상피 조직이란, 상피 조직의 표면에 있어서의 접선의 기울기의 연속성이 어떤 연속되어 있는 상피 조직을 의미하고, 동일한 상피 조직은 바람직하게는 연속 상피 조직이다. 여기서, 상피 조직(연속 상피 조직)의 중심 부근이란, 동일한 상피 조직의 표면에 있어서, 양단으로부터의 거리가 동등한 부위이며, 당업자라면 현미경에서의 관찰에 의해 추정할 수 있다. 또한, 품질 평가용 샘플은, 이식용 신경 망막으로서 사용하는 부위(예: 하나의 상피 조직의 중심 부근을 포함하는 이식에 사용하는 부위)와 연속 또는 근접한 부분이며, 품질 평가가 가능한 범위에서 가능한 한 좁은 부분인 것이 바람직하다. 예를 들어, 이식용 신경 망막이 동일한 상피 조직의 중심 부근의 부위이며, 품질 평가용 샘플이 당해 동일한 상피 조직에 있어서, 당해 이식용 신경 망막과 적어도 일부에 있어서 연속 또는 근접한 부분이다.
개별 평가 및 또는 전수 평가의 일 양태에 있어서, 이식용 신경 망막을 포함하는 세포 응집체가, 이식용 신경 망막을 포함하는 제1 상피 조직, 및 제1 상피 조직의 표면에 있어서의 접선의 기울기의 연속성과 다른 표면의 접선의 기울기의 연속성을 가지며, 또한 목적외 세포를 포함하는 목적외 상피 조직(제2 상피 조직)을 포함하는 경우, 이식용 신경 망막은, 목적외 상피 조직으로부터 가장 떨어진 제1 상피 조직 상의 영역을 포함하는 것이 바람직하고, 이 때, 품질 평가용 샘플은 목적외 상피 조직과 이식용 신경 망막의 사이에 존재하는 일부이면 된다. 목적외 상피 조직으로부터 가장 떨어진 제1 상피 조직 상의 영역이란, 예를 들어 목적외 상피 조직의 중심으로부터 제1 상피 조직의 외주를 향하여 직선을 그었을 경우에, 당해 길이가 가장 긴 경우의 제1 상피 조직의 외주점을 포함하는 영역이다. 또한, 품질 평가용 샘플은 이식용 신경 망막(예: 하나의 상피 조직의 중심 부근을 포함하는 이식에 사용하는 부위)과 근접 또는 연속된 부분이며, 품질 평가가 가능한 범위에서 가능한 한 좁은 부분인 것이 바람직하다. 이식편 및 품질 평가용 샘플의 일례로서 도 4의 개념도를 들 수 있다.
다른 양태로서, 동일 로트의 신경 망막을 포함하는 세포 응집체의 품질 평가(동일 로트 평가)를 행하기 위해서, 동일 로트의 해당 세포 응집체 중의 1 또는 복수의 세포 응집체의 전부 대신에, 동일 로트의 해당 세포 응집체 중의 1개 또는 복수의 세포 응집체의 일부를, 품질 평가용 샘플로서 추출할 수도 있다. 즉, 동일 로트의 세포 응집체로부터 1 또는 복수의 세포 응집체를 선택하고, 선택한 세포 응집체로부터 잘라낸 일부만을 품질 평가용 샘플로서 사용할 수도 있다. 특히, 제2 상피 조직을 포함하는 세포 응집체와 같이 전부를 품질 평가에 사용할 수 없는 경우이며, 효율적으로 품질 평가를 실시하고자 하는 경우에, 당해 추출 방법은 유용하다. 이 경우의 품질 평가용 샘플은, 이식용 신경 망막을 사용하는 것이 바람직하다. 여기에서 말하는 품질 평가용 샘플로서 사용하는 이식용 신경 망막이란, 이식용 망막과 동등한 유전자 발현 프로파일을 나타내는 조건 하에서 제조된 세포 응집체 중의 신경 망막을 말한다. 품질 평가용 샘플로서 추출되지 않으면 이식용 신경 망막으로서 사용되고 있던 부위를 품질 평가에 사용함으로써, 동일 로트의 다른 이식용 신경 망막을 포함하는 세포 응집체의 품질 평가를 보다 정확하게 행하는 것이 가능하다.
세포 응집체에 있어서, 연속된 상피 구조를 이루고 있고, outer neuroblastic layer와 inner neuroblatic layer가 2층으로 나뉘어 보이는 부위를, 신경 망막이라고 판정할 수 있다. 한편, 제2 상피 조직으로서의 안구 관련 조직, 특히 망막 색소 상피 세포는 눈으로 보거나 또는 현미경 하에 있어서 흑색을 나타내고 있는 점에서, 당업자라면 신경 망막과 용이하게 구별할 수 있다. 또한, 제2 상피 조직으로서의 뇌척수 조직은 눈으로 보거나 또는 현미경 하에 있어서, 형태적인 특징인, 세포 응집체의 표면 상에 연속된 상피 구조가 확인 가능하지 않은 것, 신경 망막 특유의 형태적 특징이 확인 가능하지 않은 것, 및/또는 색조가 수수하게 보이는 것 등에 착안하면, 당업자라면 신경 망막과 용이하게 구별할 수 있다. 따라서, 당업자라면 제2 상피 조직을 포함하는 세포 응집체여도, 신경 망막을 포함하는 제1 상피 조직으로부터 이식용 신경 망막 및 품질 평가용 샘플을 단리할 수 있다.
상술한 바와 같이, 일 양태에 있어서, 이식용 신경 망막 또는 이식용 신경 망막의 후보와의 일정한 위치 관계에 의해 품질 평가용 샘플이 설정되어, 추출된다. 즉, 이식용 신경 망막 또는 그 후보의 설정에 의해, 품질 평가용 샘플로서 잘라내는 영역을 확정할 수 있다. 여기서, 이식용 신경 망막(이식편, 캡(Cap)이라고도 함) 및 그 후보는, 일 양태에 있어서, 상술한 세포 응집체 중의 위치(예: 상피 조직(연속 상피 조직)의 중심 부근이며, 제2 상피 조직을 갖는 경우에는, 또한 제2 상피 조직으로부터 가장 떨어진 제1 상피 조직 상의 영역임), 및 후술하는 [이식용 신경 망막 시트]에 있어서 기재되는 크기 등에 의해 특정할 수 있다. 따라서, 당업자라면 당해 특징을 갖는 신경 망막을, 이식용 신경 망막 또는 그 후보로서 설정할 수 있다.
동일한 세포 응집체로부터 이식용 신경 망막과 품질 평가용 샘플을 추출하는 경우의 품질 평가용 샘플(링(Ring)이라고도 함)은, 당업자라면 상술한 바와 같이 설정한 이식용 신경 망막과 적어도 일부에 있어서 연속 또는 근접하는 영역이며, 품질 평가가 가능한 범위에서 가능한 한 좁은 영역으로서 설정할 수 있다. 동일 로트의 해당 세포 응집체 중의 1개 또는 복수의 세포 응집체의 일부를 품질 평가용 샘플로서 추출하는 경우의 품질 평가용 샘플은, 당업자라면 당해 세포 응집체에 있어서의 상술한 이식용 신경 망막 또는 그 후보의 부분을 추출할 수 있다. 이 경우의 품질 평가용 샘플로서 잘라내는 크기는, 후술하는 [이식용 신경 망막 시트]에 기재된 크기여도 되고, 또한 작아도 된다. 따라서, 이식용 신경 망막 또는 그 후보의 위치와의 관계 및 상기 크기에 의해, 품질 평가용 샘플을 설정하여 추출할 수 있다.
<검출 공정>
본 발명에 관한 이식용 신경 망막의 품질을 평가하는 방법은, 품질 평가용 샘플 중의 신경 망막계 세포 관련 유전자 및 비신경 망막계 세포 관련 유전자(목적외 세포 관련 유전자)의 발현을 검출하는 것(검출 공정)을 포함한다. 당해 검출 공정은 상기 유전자의 발현량을 정량적으로 검출하는 것이 바람직하다. 목적외 세포 관련 유전자는 뇌척수 조직 마커 유전자 및 안구 관련 조직 마커 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함한다.
(신경 망막계 세포 관련 유전자)
신경 망막계 세포 관련 유전자(목적 세포 관련 유전자)는 신경 망막계 세포가 발현하는 유전자를 의미한다. 신경 망막계 세포 관련 유전자로서는, 시세포(간체 시세포, 추체 시세포), 수평 세포, 아마크린 세포, 개재 신경 세포, 망막 신경절 세포(신경절 세포), 쌍극 세포(간체 쌍극 세포, 추체 쌍극 세포), 뮐러 글리아 세포, 혹은 이들 세포의 전구 세포, 신경 망막 전구 세포 등에서, 목적외 세포와 비교하여 높게 발현되고 있는 유전자가 바람직하다. 신경 망막계 세포 관련 유전자로서는, 상기 신경 망막계 세포 마커를 들 수 있고, RAX, Chx10, SIX3, SIX6, RCVRN, CRX, NRL 및 NESTIN이 바람직하다. 신경 망막계 세포 마커의 GenBank ID를 하기 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
신경 망막계 세포 관련 유전자는 표 1에 기재된 유전자가 바람직하지만, 이들에 한정되지 않는다. 이 외에도 신경 망막계 세포 관련 유전자로서, Rax2, Vsx1, Blimp1, RXRG, S-opsin, M/L-opsin, 로돕신, Brn3, L7 등을 들 수 있다.
(비신경 망막계 세포 관련 유전자)
신경 망막을 포함하는 세포 응집체를 의약품 원재료로서 제조하는 과정에서 부생성물로서 유도되는 목적외 세포 및 당해 목적외 세포를, 의약품의 품질 평가를 위해 검출하는 방법에 대하여는 전혀 알려져 있지 않았다. 본 발명자들은, 의약품 원재료로서의 기준을 충족하는 품질의 신경 망막을 계속적으로 생산하는 방법을 예의 검토하는 과정에서, 부산물로서 제조될 가능성이 있는 세포 또는 조직을 발견하고, 그것을 효율적이면서 효과적으로 동정하고, 신경 망막의 품질 평가를 실시하기 위해 사용할 수 있는 유전자로서, 비신경 망막계 세포 관련 유전자(목적외 세포 관련 유전자)를 발견한 것이다.
일 양태에 있어서, 비신경 망막계 세포 관련 유전자(목적외 세포 관련 유전자)는 뇌척수 조직 마커 유전자 및 안구 관련 조직 마커 유전자를 들 수 있다. 일 양태에 있어서, 비신경 망막계 세포 관련 유전자로서 미분화 iPS 세포 마커 유전자를 포함해도 된다.
일 양태에 있어서, 뇌척수 조직 마커 유전자는 종뇌 마커 유전자, 간뇌·중뇌 마커 유전자 및 척수 마커 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자이면 된다. 간뇌·중뇌 마커 유전자는 간뇌 마커 유전자, 중뇌 마커 유전자 및 간뇌의 일부인 시상 하부에 관한 시상 하부 마커 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자이면 된다.
일 양태에 있어서, 안구 관련 조직 마커 유전자는 optic stalk 마커 유전자, 모양체 마커 유전자, 수정체 마커 유전자 및 망막 색소 상피 마커 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자이면 된다.
종뇌 마커 유전자란, 종뇌에 발현되는 유전자를 의미한다. 종뇌 마커 유전자는 FoxG1(별명 Bf1), Emx2, Dlx2, Dlx1 및 Dlx5로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하고 있어도 된다. 종뇌 마커 유전자의 GenBank ID를 하기 표 2에 나타낸다.
Figure pct00002
종뇌 마커 유전자는 표 2에 기재된 유전자가 바람직하지만, 이들에 한정되지 않는다. 이 외에는 종뇌 마커 유전자로서는, Emx1, LHX2, LHX6, LHX7, Gsh2 등을 들 수 있다.
간뇌·중뇌 마커 유전이란, 간뇌 및/또는 중뇌에 발현되는 유전자를 의미한다. 간뇌·중뇌 마커 유전자는 OTX1, OTX2 및 DMBX1로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하고 있어도 된다. 간뇌·중뇌 마커 유전자의 GenBank ID를 하기 표 3에 나타낸다. 간뇌·중뇌 마커 유전자는 간뇌의 1 영역인 시상 하부에 대하여 후술하는 시상 하부 마커를 포함해도 된다. 즉, 간뇌·중뇌 마커 유전자는 OTX1, OTX2, OTX2, DMBX1, Rx, Nkx2.1, OTP, FGFR2, EFNA5 및 GAD1로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하고 있어도 된다.
Figure pct00003
시상 하부 마커 유전자는 시상 하부에 발현되는 유전자를 의미한다. 시상 하부 마커 유전자는 Rx, Nkx2.1, Dmbx1, OTP, gad1, FGFR2 및 EFNA5로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하고 있어도 된다. 시상 하부 마커 유전자의 GenBank ID를 하기 표 4에 나타낸다.
Figure pct00004
척수 마커 유전자는 척수에 발현되는 유전자를 의미한다. 척수 마커 유전자는 HoxB2, HoxA5, HOXC5, HOXD1, HOXD3 및 HOXD4로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하고 있어도 된다. 척수 마커 유전자의 GenBank ID를 하기 표 5에 나타낸다.
Figure pct00005
척수 마커 유전자는 표 2에 기재된 유전자가 바람직하지만, 이들에 한정되지 않는다. 이 외에는 척수 마커 유전자로서는, Hox 클러스터를 형성하는 유전자군 등을 들 수 있다.
한편, 일 양태에 있어서, 제조 공정에 레티노산을 사용하는 경우에는, 양품의 망막 조직이 제조되어 있는 경우에 있어서도, HOX 유전자(예를 들어, HOXC5, HOXA5 및 HOXB2)의 발현이 확인될 수 있다. HOX 유전자는 레티노산 시그널에 의해 발현이 제어되고 있다고 생각되고 있으며, 망막 조직의 분화 유도에 영향을 주지 않을 정도로 HOX 유전자 발현이 증가한다. 이 레티노산 시그널의 효과는 전후 축에 따른 후방화를 촉진시키는 것에 의한다고 생각된다. 따라서, 제조 공정에 레티노산을 사용하는 경우(특히 망막에의 분화 유도가 개시된 시기 이후에 레티노산을 사용하는 경우), HOX 유전자(예를 들어, HOXC5, HOXA5 및 HOXB2)를 품질 평가 대상 유전자로부터 제외하거나, 혹은 이들 유전자의 발현이 확인되어도 이식용 신경 망막의 품질을 양품이라고 판단할 수 있다.
Optic Stalk 마커 유전자는 Optic Stalk에 발현되는 유전자를 의미한다. Optic Stalk 마커 유전자는 GREM1, GPR17, ACVR1C, CDH6, Pax2, Pax8, GAD2 및 SEMA5A로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하고 있어도 된다. Optic Stalk 마커 유전자의 GenBank ID를 하기 표 6에 나타낸다.
Figure pct00006
수정체 마커 유전자는 수정체에 발현되는 유전자를 의미한다. 수정체 마커 유전자는 CRYAA 및 CRYBA1로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하고 있어도 된다. 수정체 마커 유전자의 GenBank ID를 하기 표 7에 나타낸다.
Figure pct00007
모양체 마커 유전자는 모양체, 모양체 주연부 및 또는 섬모체에 발현되는 유전자를 의미한다. 모양체 마커 유전자는 Zic1, MAL, HNF1beta, FoxQ1, CLDN2, CLDN1, GPR177, AQP1 및 AQP4로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하고 있어도 된다. 모양체 마커 유전자의 GenBank ID를 하기 표 8에 나타낸다.
Figure pct00008
망막 색소 상피 마커 유전자는 망막 색소 상피 세포에 발현되는 유전자를 의미한다. 망막 색소 상피 마커 유전자는 상기 망막 색소 상피 마커를 들 수 있고, MITF, TTR 및 BEST1로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하고 있어도 된다. 망막 색소 상피 마커 유전자의 GenBank ID를 하기 표 9에 나타낸다.
Figure pct00009
일 양태에 있어서, 목적외 세포 관련 유전자는 미분화 다능성 줄기 세포 마커 유전자를 더 포함하고 있어도 된다.
미분화 다능성 줄기 세포 마커 유전자는 Oct3/4, Nanog 및 lin28로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하고 있어도 된다. 바람직하게는 미분화 다능성 줄기 세포 마커 유전자는 Oct3/4, Nanog 및 lin28로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자이다. 미분화 다능성 줄기 세포 마커 유전자의 GenBank ID를 하기 표 10에 나타낸다.
Figure pct00010
(검출 방법)
일 양태에 있어서, 신경 망막계 세포 관련 유전자 및 비신경 망막계 목적외 세포 관련 유전자의 발현의 검출은, 특별히 한정되지 않지만, 웨스턴 블로팅, 면역 염색, 플로우 사이토메트리 해석/플로우 사이토미터(FACS(등록 상표, BD사제) 등), 노던 블로팅, 전기 영동법, PCR(바람직하게는, 정량 PCR(qPCR) 및 또는 리얼타임 PCR), 진칩 해석, 차세대 시퀀서 등의 방법을 들 수 있다. 이 중, 정량성, 검출 감도, 결과의 안정성 및 속도의 관점에서, 정량 PCR이 유용하다. 또한, 싱글 셀의 정량 PCR을 행하기 위해 사용되는 장치(예를 들어, Biomark HD(Fluidigm사제) 등)를 통상적인 정량 PCR에 응용함으로써, 복수의 품질 평가용 샘플을 단시간에 평가하는 것이 가능하다. 특히, 전수 평가를 실시하는 경우, 특히 품질 평가에 사용하는 샘플수 및 평가하는 유전자수가 많은 경우에는, 당해 방법을 사용함으로써 신속한 품질 평가가 가능하다.
일 양태에 있어서, 2 이상의 품질 평가용 샘플에 있어서의, 각각의 신경 망막계 세포 관련 유전자 및 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현량을, 정량 PCR에 의해 동시에 검출해도 된다. 해당 정량 PCR은, 예를 들어 하기 하기 (1) 내지 (5)의 공정을 포함하는 방법에 의해 행해져도 된다.
(1) 1군의 8 이상 800 이하인 독립된 샘플 웰을 포함하는 샘플 웰군, 1군 이상의 8 이상 800 이하인 독립된 프라이머 웰을 포함하는 프라이머 웰군, 및 샘플 웰군에 있어서의 독립된 샘플 웰과 각각의 프라이머 웰군에 있어서의 독립된 프라이머 웰을 연결하는 유로를 갖는 유로 플레이트와, 2 이상의 상기 품질 평가용 샘플로부터 얻어진 핵산을 함유하는 용액(샘플 용액)과, 1 이상의 상기 신경 망막계 세포 관련 유전자 또는 상기 비신경 망막계 세포 관련 유전자에 특이적인 프라이머를 1 또는 복수 함유하는 용액(프라이머 용액)을 준비하는 것,
(2) 샘플 웰군에 있어서, 상기 샘플 용액을 상기 품질 평가용 샘플마다 1 샘플 용액/1 샘플 웰이 되게 첨가하는 것,
(3) 상기 1 이상의 프라이머 웰군에 있어서, 상기 프라이머 용액을, 다른 프라이머 웰군이 되게, 1 이상의 프라이머 웰에 첨가하는 것,
(4) 상기 유로를 통해, 상기 핵산에 대하여 상기 프라이머를 따로따로 혼합하는 것, 및
(5) (4)에서 얻어진 혼합액을 사용하여 정량 PCR을 행하는 것.
2 이상의 품질 평가용 샘플로부터 얻어지는 핵산을 함유하는 용액은, 품질 평가용 샘플로부터 추출한 RNA를 역전사 효소 및 프라이머를 사용한 역전사 반응에 의해 준비할 수 있다. RNA 추출이나 역전사 반응은 당업자라면 주지된 방법을 사용하여 적절히 실시할 수 있다. 또한, 당업자라면 정량하고자 하는 유전자에 따라서, 당해 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 준비할 수 있다.
일 양태에 있어서, 상기 핵산을 함유하는 용액(샘플 용액)은, 샘플 웰군의 각 웰에 첨가하기 전에, PCR 장치에 의해, 사용하는 모든 프라이머를 사용하여 multiplex-PCR 반응(프리 런(Pre-Run))을 실시한 용액이어도 된다. 프리 런에 의해, 일정 정도 핵산을 증폭시킴으로써, 정량 PCR을 효과적으로 실시하는 것이 가능해진다. 프리 런의 조건으로서, 예를 들어 핵산을 함유하는 용액을 사용하는 모든 프라이머로 10 사이클 내지 15 사이클 정도 PCR 반응시키는 것을 들 수 있다.
일 양태에 있어서, 정량 PCR에는, 전술한 다른 웰군을 연결하는 유로를 갖는 유로 플레이트를 사용해도 된다. 유로 플레이트 상에는, 유로(예를 들어, 집적 유체 회로), 핵산을 함유하는 용액을 첨가하기 위한 복수의 웰, 및 프라이머를 첨가하기 위한 복수의 웰이 있고, 각각의 웰이 1 또는 복수의 유로(집적 유체 회로)에 연결되어도 된다. 핵산을 함유하는 용액 및 프라이머를 각 웰에 1개씩 첨가한다. 일 양태로서, 주지의 장치(예를 들어, IFC 컨트롤러 HX, IFC 컨트롤러 MX, IFC 컨트롤러 RX, 모두 Fluidigm사제)를 사용하여 웰에 공기압을 거는 것으로, 각 웰에 첨가한 핵산을 함유하는 용액 및 프라이머를 유로(집적 유체 회로) 내에 흐르게 할 수 있다. 유로(집적 유체 회로)는, 예를 들어 샘플 용액과 프라이머 용액이 일대일로 혼합되는 구조이면 된다. 이에 의해, 샘플 용액과 프라이머 용액의 조합의 수만큼(예를 들어, 샘플 용액과 프라이머 용액을 각각 96개 사용한 경우, 조합의 수는 96×96=9216이 됨), 샘플 용액과 프라이머 용액의 혼합액을 한번에 조제할 수 있다. 혼합액을 조정 후, 유로 플레이트를 정량 PCR 장치(예를 들어, Biomark HD)에서 정량 PCR 반응을 행함으로써, 각 핵산을 함유하는 용액 중에 있어서의 각 유전자의 발현량을 동시에 측정할 수 있다.
또한, 발현 세포의 비율을 검출 가능한 플로우 사이토미터를 사용한 플로우 사이토메트리 해석도 유용하다. 근년, 검출 속도의 개량이 진행되어, 고처리량성을 구비한 다수 검체를 평가 가능한 플로우 사이토미터(FACS(등록 상표) 등)도 이용 가능하다. 따라서, 신경 망막계 세포 관련 유전자 및 비신경 망막계 목적외 세포 관련 유전자의 발현의 검출에는, 고처리량 플로우 사이토미터의 이용도 유용하다. 이와 같은 고처리량 플로우 사이토미터는 시판품(예: MACSQuant(등록 상표) Analyzers: Miltenyi Biotec사제)을 사용하는 것이 가능하다.
<판정 공정>
본 발명에 관한 방법은, 신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인되고, 또한 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인되지 않을 경우에, 상기 일부인 품질 평가용 샘플을 포함하는 세포 응집체에 있어서의 신경 망막을 포함하는 상피 조직(이식용 신경 망막), 및 상기 일부인 품질 평가용 샘플을 포함하는 세포 응집체, 또는 상기 전부인 상기 품질 평가용 샘플의 세포 응집체와 동일 로트의 세포 응집체에 있어서의 신경 망막을 포함하는 상피 조직(이식용 신경 망막), 이식용 신경 망막으로서 사용 가능하다고 판정하는 것(판정 공정)을 포함한다. 여기서, 이식용 신경 망막으로서 사용 가능한 것이란, 이식에 적합한 신경 망막인 것을 의미하고, 이식용 신경 망막으로서의 적성이 있거나, 또는 이식용 신경 망막으로서 합격이라고도 한다.
신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인된다는 것은, 유전자의 발현의 검출법에 있어서, 당해 검출법에 의해 실질적으로 검출 가능한 레벨(예를 들어, 검출 하한값 이상)의 신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인되는 것을 의미한다. 또한, 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인되지 않는다는 것은, 유전자의 발현의 검출법에 있어서, 당해 검출법에 의해 실질적으로 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현을 검출할 수 없는(예를 들어, 검출 하한값 미만) 것을 의미한다. 실질적인 검출 가능성이란, 당해 유전자가 실질적으로 기능하고 있다고는 할 수 없는 정도를 초과하여, 당해 유전자가 검출되는 것을 말한다. 당업자라면 당해 유전자 및 당해 검출법에 따라서 적절히 설정 가능하다. 예를 들어, 정량성이 있는 유전자 발현의 검출법인 경우, 당해 유전자 발현의 검출 하한값을 기준으로 하여 0％ 초과 내지 10％ 이하, 0％ 초과 내지 5％ 이하의 범위를, 실질적으로 검출 가능한 레벨이 아니라고(즉, 당해 유전자의 발현을 검출할 수 없다고) 판단할 수 있다.
일 양태에 있어서, 정량 PCR법에 있어서, 이하의 기준 1 및 기준 2를 충족하는 경우에, 이식용 신경 망막으로서 사용 가능하다고 판정하는 것이 바람직하다.
기준 1: 신경 망막계 세포 관련 유전자의 Threshold Cycle(Ct)값과 내부 표준 유전자의 Ct값의 차(ΔCt값)가 10 이하
기준 2: 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 Ct값과 내부 표준 유전자의 Ct값의 차(ΔCt값)가 5 이상
Threshold Cycle(Ct)값이란, PCR에 의한 유전자의 증폭이 지수 함수적으로 일어나는 영역에서 일정한 증폭 산물량이 되는 사이클수를 의미한다. Ct값은 유전자의 초기량과 역상관이 되기 때문에, 유전자의 초기 카피수의 산출에 사용된다. 일 양태에 있어서, 「2^Ct값(2의 Ct값승)」은 유전자의 초기량과 반비례가 되기 때문에, 유전자의 초기 카피수의 산출에 사용된다. 구체적으로는, 2배의 초기량의 유전자를 포함하는 샘플은, 증폭 전에 절반의 카피수 유전자밖에 포함하지 않는 샘플보다도 Ct값이 1 사이클 빨라진다. 일정한 증폭 산물량은, PCR에 의한 유전자의 증폭이 지수 함수적으로 일어나는 영역 내이면 되고, 당업자라면 설정 가능하다.
내부 표준 유전자란, 시료간에 있어서 발현량의 차가 작은 유전자를 의미한다. 내부 표준 유전자로서는, 당업자에게 주지된 것을 적절히 사용할 수 있지만, 예를 들어, 18S 리보솜 RNA, β 액틴, HPRT, α 튜브인, 트란스페린 수용체, 유비키틴, GAPDH 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 GAPDH이다.
Ct값은 유전자의 초기량에 역상관되기 때문에, 세포 내에 있어서의 유전자의 발현량에 의존한다. 즉, 핵산 함유 용액의 농도가 일정한 경우, 사용하는 내부 표준 유전자에 의해 Ct값은 다르고, 특정 유전자의 Ct값과 내부 표준 유전자의 Ct값의 차(ΔCt값)은, 사용하는 내부 표준 유전자에 영향을 받는다. 본 명세서에 있어서의 ΔCt값은, 특별한 기재가 없는 경우에는, 내부 표준 유전자로서 GAPDH를 사용한 경우의 값을 기준으로 하여 기재한다.
내부 표준 유전자로서, GAPDH 이외의 내부 표준 유전자를 사용하는 경우, GAPDH와 당해 GAPDH 이외의 내부 표준 유전자의 발현량을 비교함으로써 상기 기준 1 및 기준 2의 ΔCt값을 보정할 수 있다.
일 양태에 있어서, 내부 표준 유전자로서 β 액틴을 사용하는 경우, 본원 제법에 있어서, GAPDH와 β 액틴에서는, GAPDH의 Ct값이 β 액틴의 Ct값보다, 약 1 정도 낮은, 즉 GAPDH의 RNA의 절대량이 β 액틴의 RNA의 절대량의 2배 정도인 점에서,
기준 1: 신경 망막계 세포 관련 유전자의 Threshold Cycle(Ct)값과 내부 표준 유전자의 Ct값의 차(ΔCt값)가 9 이하
기준 2: 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 Ct값과 내부 표준 유전자의 Ct값의 차(ΔCt값)가 4 이상
으로 할 수 있다.
일 양태에 있어서, 내부 표준 유전자로서 HPRT를 사용하는 경우, 본원 제법에 있어서, GAPDH와 HPRT에서는, GAPDH의 Ct값이 HPRT보다도 약 7 정도 낮은, 즉 GAPDH의 RNA의 절대량이 HPRT의 RNA의 절대량의 2^7(2의 7승, 128배) 정도인 점에서,
기준 1: 신경 망막계 세포 관련 유전자의 Threshold Cycle(Ct)값과 내부 표준 유전자의 Ct값의 차(ΔCt값)가 3 이하
기준 2: 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 Ct값과 내부 표준 유전자의 Ct값의 차(ΔCt값)가 -2 이상
으로 할 수 있다.
신경 망막계 세포 관련 유전자는 상술한 유전자이면 된다. 신경 망막계 세포 관련 유전자로서는, 복수의 유전자가 존재한다. 즉, 동일한 신경 망막계 세포로부터 추출한 경우에도, 신경 망막계 세포 관련 유전자의 종류에 의해 상기 기준값 1의 Ct값은 달라도 된다. 당업자라면, 당해 신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현 부위나 발현량 등의 공지 정보로부터, 유전자마다 신경 망막계 세포 관련 유전자가 발현되고 있다고 판단 가능한 ΔCt값을 설정할 수 있다.
예를 들어, Chx10 유전자에 대하여, GAPDH를 내부 표준으로 한 경우, ΔCt값은 20 이하여도 되고, 바람직하게는 15 이하, 보다 바람직하게는 10 이하여도 된다.
예를 들어, Recoverin 유전자에 대하여, GAPDH를 내부 표준으로 한 경우, ΔCt값은 16 이하, 바람직하게는 11 이하, 보다 바람직하게는 6 이하여도 된다.
일반적으로는, 신경 망막계 세포 관련 유전자의 Ct값과 내부 표준 유전자(예: GAPDH)의 Ct값의 차(ΔCt값)은, 예를 들어 25 이하, 20 이하, 15 이하 또는 10 이하여도 된다. 신경 망막계 세포 관련 유전자의 Ct값과 내부 표준 유전자의 Ct값의 차는, 예를 들어 -10 이상, -5 이상, 0 이상 또는 5 이상이어도 된다.
비신경 망막계 세포 관련 유전자는 상술한 유전자이면 된다. 비신경 망막계 세포 관련 유전자로서는, 복수의 유전자가 존재한다. 즉, 동일한 비망막계 세포로부터 추출한 경우에도, 비신경 망막계 세포 관련 유전자에 의해 Ct값은 다르다. 당업자라면 당해 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현 부위나 발현량 등의 공지 정보로부터, 유전자마다 신경 망막계 세포 관련 유전자가 발현되고 있다고 판단 가능한 ΔCt값을 설정할 수 있다. 예를 들어, PAX2 유전자에 대하여, GAPDH를 내부 표준으로 한 경우, ΔCt값은 5 이상이어도 된다. HOXB2 유전자에 대하여, GAPDH를 내부 표준으로 한 경우, ΔCt값은 5 이상이어도 된다. 일반적으로는, 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 Ct값과 내부 표준 유전자의 Ct값의 차는, 30 이하, 25 이하, 20 이하여도 된다. 또한, 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 Ct값과 내부 표준 유전자의 Ct값의 차는, 예를 들어 0 이상, 3 이상 또는 5 이상이어도 된다.
상술한 품질 평가 방법은 의약품(이식용 신경 망막)의 품질 관리 방법, 또는 의약품(이식용 신경 망막)의 제조 공정에 있어서의 품질 관리 방법으로서 사용할 수 있다.
[이식용 신경 망막 시트]
본 발명의 일 양태는 이식용 신경 망막 시트이며,
(1) 다능성 줄기 세포 유래이며,
(2) 3차원 구조를 갖고,
(3) 시세포층 및 내층을 포함하는 복수의 층 구조를 갖는 신경 망막층을 포함하고,
(4) 시세포층이 시세포 전구 세포 및 시세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 세포를 포함하고,
(5) 내층이 망막 전구 세포, 신경절 세포, 아마크린 세포 및 쌍극 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 세포를 포함하고,
(6) 신경 망막층의 표면이 정상 단부면을 갖고,
(7) 정상 단부면을 따라서 존재하는 시세포층의 내측에 내층이 존재하고,
(8) 이식용 신경 망막 시트의 표면의 총 면적에 대하여, 신경 망막층의 면적이 50％ 이상이며,
(9) 신경 망막층의 정상 단부면의 총 면적에 대하여, 연속 상피 구조의 면적이 80％ 이상이며,
(10) 이식용 신경 망막 시트 중의 신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인되고, 또한 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인되지 않고, 비신경 망막계 세포 관련 유전자가 뇌척수 조직 마커 유전자 및 안구 관련 조직 마커 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하는
것을 특징으로 하는 이식용 신경 망막 시트이다.
일 양태로서, 당해 이식용 신경 망막 시트는 상술한 품질 평가 방법에 의해 잘라낸 이식용 신경 망막이다. 따라서, 후술하는 당해 이식용 신경 망막 시트의 특징은, 상술한 품질 평가 방법에 의해 잘라낸 이식용 신경 망막의 특징으로서도 해당한다.
당해 이식용 신경 망막 시트는, (3) 시세포층 및 내층을 포함하는 복수의 층 구조를 갖는 신경 망막층을 포함한다. (6) 및 (7)에 기재된 바와 같이, 시세포층은 당해 이식용 신경 망막 시트의 외측(표면)에 존재하지만, 내층에도 이소성의 시세포층이 존재해도 된다.
당해 이식용 신경 망막 시트는, (5) 내층이 망막 전구 세포, 신경절 세포, 아마크린 세포 및 쌍극 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 세포를 포함하지만, 이소성의 시세포 전구 세포 및 시세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 세포를 포함해도 된다. 일 양태에 있어서, 신경절 세포, 아마크린 세포, 수평 세포의 함유율이 총 세포수의 30％ 이하인 이식용 신경 망막 시트, 신경절 세포, 아마크린 세포, 수평 세포 및 쌍극 세포의 함유율이 총 세포수의 30％ 이하인 이식용 신경 망막 시트, 및/또는 쌍극 성 세포의 함유율이 총 세포수의 10％ 이하인 이식용 신경 망막 시트도 제공된다.
당해 이식용 신경 망막 시트는, (8) 이식용 신경 망막 시트의 표면의 총 면적에 대하여, 신경 망막층의 면적이 40％ 이상이며, 바람직하게는 50％ 이상, 보다 바람직하게는 60％ 이상이다. 당해 이식용 신경 망막 시트는, (9) 신경 망막층의 정상 단부면의 총 면적에 대하여, 연속 상피 구조의 면적이 60％ 이상이며, 바람직하게는 70％ 이상, 보다 바람직하게는 80％ 이상이다.
신경 망막계 세포 관련 유전자 및 비신경 망막계 세포 관련 유전자(뇌척수 조직 마커 유전자 및 안구 관련 조직 마커 유전자)는 상술한 유전자이다.
(10) 이식용 신경 망막 시트 중의 신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인되고, 또한 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인되지 않는 것은, 이식용 신경 망막 시트의 일부를 취하여, 유전자의 발현을 검출함으로써 판명할 수 있다. 또한, 상술한 이식용 신경 망막의 품질 평가 방법에 의해, 품질 평가용 샘플에 있어서, 신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 실질적으로 확인되고, 또한 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 실질적으로 확인되지 않는 세포 응집체로부터 단리한 이식용 신경 망막 시트라면, 이식용 신경 망막 시트 자체의 유전자 발현의 검출은 불필요하다. 실질적으로 당해 유전자의 발현이 확인되거나 또는 발현이 확인되지 않는다는 것은, 상술한 바와 같이, 유전자의 발현의 검출법에 있어서, 당해 검출법에 의해 실질적으로 검출 가능한 레벨인지 여부로 결정된다.
이식용 신경 망막 시트 중의 신경 망막계 세포 관련 유전자는, 예를 들어 Rx, Chx10, Pax6 및 Crx로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상이어도 된다. 총 세포수에 대한 신경 망막계 세포 관련 유전자를 발현하는 세포(양성 세포)의 비율은, 신경 망막의 분화 단계에 따라서 다르다.
일 양태에 있어서, 이식용 신경 망막 시트 중의 총 세포수에 대한 Rx 양성 세포의 비율은, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상 또는 60％ 이상이어도 된다. 일 양태에 있어서, 이식용 신경 망막 시트 중의 총 세포수에 대한 Chx10 양성 세포 또는 Pax6 양성 세포의 비율은, 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상 또는 50％ 이상이어도 된다. 일 양태에 있어서, 이식용 신경 망막 시트 중의 총 세포수에 대한 Crx 양성 세포의 비율은, 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상 또는 50％ 이상이어도 된다.
일 양태에 있어서, 이식용 신경 망막 시트 중의 총 세포수에 대한 Rx 양성 세포의 비율은, 30％ 이상 80％ 이하, 40％ 이상 70％ 이하, 45％ 이상 60％ 이하, 또는 50％ 이상 60％ 이하여도 된다. 일 양태에 있어서, 이식용 신경 망막 시트 중의 총 세포수에 대한 Chx10 양성 세포 또는 Pax6 양성 세포의 비율은, 10％ 이상 80％ 이하, 20％ 이상 70％ 이하, 30％ 이상 60％ 이하, 또는 40％ 이상 50％ 이하여도 된다. 일 양태에 있어서, 이식용 신경 망막 시트 중의 총 세포수에 대한 Crx 양성 세포의 비율은, 10％ 이상 70％ 이하, 10％ 이상 60％ 이하, 20％ 이상 60％ 이하, 30％ 이상 60％ 이하, 40％ 이상 60％ 이하, 또는 50％ 이상 60％ 이하이다.
일 양태에 있어서, 이식용 신경 망막 시트 중의 총 세포수에 대한, (1) Chx10 양성 또한 Pax6 양성 세포(신경 망막 전구 세포)의 비율은, 10％ 이상 50％ 이하 또는 10％ 이상 30％ 이하, (2) Chx10 양성 또한 Pax6 음성 세포(쌍극 세포에 치우친 전구 세포)의 비율은, 10％ 이상 25％ 이하 또는 15％ 이상 25％ 이하, (3) Chx10 음성 또한 Pax6 양성 세포(신경절 세포 및 아마크린 세포)의 비율은, 10％ 이상 25％ 이하 또는 10％ 이상 20％ 이하여도 된다.
다른 양태에 있어서, 이식용 신경 망막 시트 중의 총 세포수에 대한, (1) Chx10 양성 또한 Pax6 양성 세포(신경 망막 전구 세포)의 비율은, 20％ 이상 40％ 이하, (2) Chx10 양성 또한 Pax6 음성 세포(쌍극 세포에 치우친 전구 세포)의 비율은 5％ 이상 20％ 이하, (3) Chx10 음성 또한 Pax6 양성 세포(신경절 세포 및 아마크린 세포)의 비율은, 5％ 이상 20％ 이하 또는 5％ 이상 15％ 이하여도 된다.
일 양태에 있어서, 본 발명에 관한 이식용 신경 망막 시트는 상기 이식용 신경 망막의 품질 평가 방법에 의해, 이식용 신경 망막으로서 사용 가능하다고 판정된 이식용 신경 망막이며, 단리된 시트상의 이식용 신경 망막이면 된다.
일 양태에 있어서, 본 발명에 관한 이식용 신경 망막 시트는 신경 망막을 포함하는 세포 응집체로부터 단리된 것이며, 해당 세포 응집체에 있어서의 연속 상피 조직의 중심 부근의 영역을 포함하는 이식용 신경 망막 시트이면 된다.
일 양태에 있어서, 본 발명에 관한 이식용 신경 망막 시트는, 적어도 제1 상피 조직 및 제2 상피 조직을 포함하는 세포 응집체로부터 단리된 것이며, 상기 세포 응집체는 상기 제1 상피 조직은 인간 신경 망막을 포함하고, 상기 제2 상피 조직은 상기 제1 상피 조직의 표면에 있어서의 접선의 기울기의 연속성과 다른 표면의 접선의 기울기의 연속성을 가지며, 또한 비신경 망막계 세포를 포함하고, 상기 이식용 신경 망막 시트가 상기 제2 상피 조직으로부터 가장 떨어진 상기 제1 상피 조직 상의 영역을 포함하는 이식용 신경 망막 시트이면 된다. 여기서, 제2 상피 조직은 안구 관련 조직, 종뇌척수 조직 및 제1 상피 조직의 신경 망막과는 다른 조직으로 이루어지는 군에서 선택되는 조직이면 된다.
일 양태에 있어서, 본 발명에 관한 이식용 신경 망막 시트는 상기 세포 응집체에 있어서의 연속 상피 조직의 중심 부근의 영역을 포함하고 있어도 된다.
이식용 신경 망막 시트는 상술한 바와 같이, 신경 망막을 포함하는 세포 응집체로부터 단리할 수 있다. 또한, 후술하는 이식용 신경 망막 시트의 제조 방법에 의해 얻을 수 있다.
일 양태에 있어서, 본 발명에 관한 이식용 신경 망막 시트의 긴 직경은, 예를 들어 300㎛ 내지 3300㎛이면 되고, 바람직하게는 600㎛ 내지 2500㎛, 보다 바람직하게는 1100㎛ 내지 1700㎛이다.
일 양태에 있어서, 본 발명에 관한 이식용 신경 망막 시트의 짧은 직경은, 예를 들어 100㎛ 내지 2000㎛이면 되고, 바람직하게는 200㎛ 내지 1500㎛, 보다 바람직하게는 400㎛ 내지 1100㎛이다.
일 양태에 있어서, 본 발명에 관한 이식용 신경 망막 시트의 높이는, 예를 들어 50㎛ 내지 1500㎛이면 되고, 바람직하게는 100㎛ 내지 1000㎛, 보다 바람직하게는 200㎛ 내지 700㎛이다.
일 양태에 있어서, 본 발명에 관한 이식용 신경 망막 시트의 체적은, 예를 들어 0.001mm3 내지 4.0mm3이면 되고, 바람직하게는 0.01mm3 내지 1.5mm3, 보다 바람직하게는 0.07mm3 내지 0.57mm3이다.
이식용 신경 망막 시트의 긴 직경, 짧은 직경 및 높이를 측정하는 방법은, 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 현미경 하에서 촬상한 화상으로부터 측정하면 된다. 예를 들어, 세포 응집체로부터 잘라낸 이식용 신경 망막 시트에 대하여, 절단면을 대물 렌즈측으로 향한 상태에서 촬상한 정면 화상과, 절단면이 대물 렌즈에서 보아 수직이 되도록 기울어진 상태에서 촬상한 옆면 화상을, 실체 현미경으로 촬상하고, 촬상한 화상으로부터 측정할 수 있다. 여기서, 긴 직경이란, 정면 화상에 있어서, 해당 시트 단면 상의 2개의 단부점을 연결하는 선분 중, 가장 긴 선분 및 그 길이를 의미한다. 짧은 직경이란, 정면 화상에 있어서, 해당 시트 단면 상의 2개의 단부점을 연결하는 선분에서 긴 직경과 직교하는 선분 중, 가장 긴 선분 및 그 길이를 의미한다. 높이란, 해당 시트 단면에 직교하는 선분에서, 해당 시트 단면과의 교점과 망막 시트의 정점을 단부점으로 하는 선분 중, 가장 긴 선분 및 그 길이를 의미한다. 해당 시트의 체적이란, 이식편이, 단면이 긴 직경을 통과하도록 반으로 분할한 타원체라고 근사한 다음, 이하의 계산식에 따라서 산출한 체적을 의미한다.
체적=2/3×원주율(π)×(긴 직경/2)×(짧은 직경/2)×높이
[의약 조성물, 치료 방법, 치료약 및 제조 방법]
본 발명의 일 양태로서, 이식용 신경 망막 시트를 포함하는 의약 조성물을 들 수 있다. 의약 조성물은 본 발명의 이식용 신경 망막 시트, 바람직하게는 또한 의약으로서 허용되는 담체를 포함한다. 의약 조성물은 신경 망막계 세포 혹은 신경 망막의 장애 또는 신경 망막의 손상에 기초하는 질환의 치료에 사용할 수 있다. 신경 망막계 세포 혹은 신경 망막의 장애에 기초하는 질환으로서는, 예를 들어 망막 변성 질환, 황반 변성증, 노인성 황반 변성, 망막 색소 변성, 녹내장, 각막 질환, 망막 박리, 중심성 장액성 망맥락막증, 추체 디스트로피, 추체 간체 디스트로피 등의 안과 질환을 들 수 있다. 신경 망막의 손상 상태로서는, 예를 들어, 시세포가 변성사되어 있는 상태 등을 들 수 있다.
의약으로서 허용되는 담체로서는, 생리적인 수성 용매(생리 식염수, 완충액, 무혈청 배지 등)를 사용할 수 있다. 필요에 따라서, 의약 조성물에는, 이식 의료에 있어서, 이식하는 조직 또는 세포를 포함하는 의약에, 통상 사용되는 보존제, 안정제, 환원제, 등장화제 등을 배합시켜도 된다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명에서 얻어지는 이식용 신경 망막 시트를 포함하는, 신경 망막의 장애에 기초하는 질환의 치료약을 제공한다. 또한, 본 발명의 일 양태로서, 본 발명에서 얻어지는 이식용 신경 망막 시트를, 이식을 필요로 하는 대상(예를 들어, 안과 질환이 일어나고 있는 눈의 망막 아래)에 이식하는 것을 포함하는, 신경 망막계 세포 혹은 신경 망막의 장애 또는 신경 망막의 손상에 기초하는 질환을 치료하는 방법을 들 수 있다. 신경 망막의 장애에 기초하는 질환의 치료약으로서, 또는 당해 신경 망막의 손상 상태에 있어서, 해당하는 손상 부위를 보충하기 위해서, 본 발명의 이식용 신경 망막 시트를 사용할 수 있다. 이식을 필요로 하는, 신경 망막계 세포 혹은 신경 망막의 장애에 기초하는 질환을 갖는 환자, 또는 신경 망막의 손상 상태의 환자에, 본 발명의 이식용 신경 망막 시트를 이식하고, 당해 신경 망막계 세포 또는, 장애를 받은 신경 망막을 보충함으로써, 신경 망막계 세포 혹은 신경 망막의 장애에 기초하는 질환, 또는 신경 망막의 손상 상태를 치료할 수 있다. 이식 방법으로서는, 예를 들어, 안구의 절개 등에 의해 손상 부위의 망막 아래에 이식용 신경 망막 시트를 이식하는 방법을 들 수 있다. 이식하는 방법으로서는, 예를 들어 미세한 관을 사용하여 주입하는 방법이나 핀셋에 끼워 이식하는 방법을 들 수 있고, 미세한 관으로서는 주사 바늘 등을 들 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명에서 얻어지는 이식용 신경 망막 시트의 제조 방법을 들 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 이식용 신경 망막 시트의 제조 방법은, 상기 이식용 신경 망막의 평가 방법을 사용하여, 다능성 줄기 세포 유래의 상피 구조를 갖는 신경 망막을 포함하는 세포 응집체를 평가하고, 당해 신경 망막을 이식용 신경 망막으로서 사용 가능하다고 판정하는 것, 및 판정된 이식용 신경 망막을 단리하는 것을 포함한다.
다른 실시 형태에 있어서, 이식용 신경 망막 시트의 제조 방법은, 2개 이상 800개 이하의, 다능성 줄기 세포 유래의 상피 구조를 갖는 신경 망막을 포함하는 세포 응집체로부터, 당해 세포 응집체의 일부인 품질 평가용 샘플을 각각 추출하는 것, 및 상기 추출된 2개 이상 800개 이하의 품질 평가용 샘플을, 상기 이식용 신경 망막의 평가에 의해 평가하고, 이식용 신경 망막으로서 사용 가능하다고 판정된 이식용 신경 망막을 선별하는 것, 상기 선별된 이식용 신경 망막을 단리하는 것을 포함한다.
상기 세포 응집체가 다능성 줄기 세포를 분화 유도하여 얻어진, 적어도 제1 상피 조직 및 제2 상피 조직을 포함하는 세포 응집체인 것이 바람직하다. 상기 제1 상피 조직은 인간 신경 망막을 포함하고, 상기 제2 상피 조직은 상기 제1 상피 조직의 표면에 있어서의 접선의 기울기의 연속성과 다른 표면의 접선의 기울기의 연속성을 가지며, 또한 비신경 망막계 세포를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 이식용 신경 망막의 단리는 상기 세포 응집체로부터, 상기 이식용 신경 망막이 상기 제2 상피 조직으로부터 가장 떨어진 상기 제1 상피 조직 상의 영역을 포함하도록, 상기 이식용 신경 망막을 단리하는 것이면 바람직하다. 단리는, 상술한 방법에 의해 잘라냄으로써 행한다.
본 발명에서 개시된 상피 조직을 포함하는 세포 응집체를 원료로, 상피 조직의 일부를 이식용 샘플로 하고, 상피 조직이 다른 일부를 품질 평가용 샘플로서 사용하는 품질 평가 방법은, 하나하나의 세포 응집체의 형태·구조가 다른 경우에 특히 유효하다. 각종 상피 조직을 포함하는 세포 응집체에도 응용 가능하다.
실시예
이하에 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들에 한정되는 것은 전혀 아니다.
<실시예 1 신경 망막을 포함하는 세포 응집체의 제조>
인간 iPS 세포(DSP-SQ주, 다이닛폰 스미토모 세이야꾸 가부시키가이샤에서 수립)는 시판되고 있는 센다이 바이러스 벡터(Oct3/4, Sox2, KLF4 및 c-Myc의 4 인자, IDPharma사제 사이토튠 키트)를 사용하여, Thermo Fisher Scientific사의 공개 프로토콜(iPS2.0 Sendai Reprogramming Kit, Publication Number MAN0009378, Revision 1.0), 및 교토 대학의 공개 프로토콜(피더 프리에서의 인간 iPS 세포의 수립·유지 배양, CiRA_Ff-iPSC_protocol_JP_v140310, http://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/protocol.html)에 기재된 방법을 기초로, StemFit 배지(AK03; 아지노모토사제), Laminin511-E8(닛삐사제)을 사용하여 수립하였다.
당해 인간 iPS 세포(DSP-SQ주)를 Scientific Reports, 4, 3594(2014)에 기재된 방법에 준하여 피더 프리 배양하였다. 피더 프리 배지로서는 StemFit 배지(AK03N, 아지노모토사제), 피더 프리 발판에는 Laminin511-E8(닛삐사제)을 사용하였다.
구체적인 유지 배양 조작으로서는, 먼저 서브컨플렌트로 된 인간 iPS 세포(DSP-SQ주)를, PBS로 세정 후, TrypLE Select(Life Technologies사제)를 사용하여 단일 세포로 분산시켰다. 그 후, 상기 단일 세포로 분산된 인간 iPS 세포를, Laminin511-E8로 코팅한 플라스틱 배양 디쉬에 파종하고, Y27632(ROCK 저해 물질, 10μM) 존재 하, StemFit 배지에서 피더 프리 배양하였다. 상기 플라스틱 배양 디쉬로서, 6웰 플레이트(이와키사제, 세포 배양용, 배양 면적 9.4cm2)를 사용한 경우, 상기 단일 세포로 분산된 인간 iPS 세포의 파종 세포수는 1.0×104로 하였다. 파종한 1일 후에, Y27632를 포함하지 않는 StemFit 배지로 교환하였다. 이후, 1일 내지 2일에 1회 Y27632를 포함하지 않는 StemFit 배지로 배지 교환하였다. 그 후, 파종한 5일 후까지 배양하였다.
분화 유도 조작으로서는, 인간 iPS 세포(DSP-SQ주)를, StemFit 배지를 사용하여, 서브컨플렌트 2일 전(배양 면적의 3할이 세포로 덮이는 정도)이 될 때까지 피더 프리 배양하였다. 당해 서브컨플렌트 2일 전의 인간 iPS 세포를, SAG(300nM) 존재 하에서 2일간 피더 프리 배양하였다(프리컨디션(Precondition) 처리).
프리컨디션 처리한 인간 iPS 세포를, TrypLE Select(Life Technologies사제)를 사용하여 세포 분산액 처리하고, 또한 피펫팅 조작에 의해 단일 세포로 분산시켰다. 그 후, 상기 단일 세포로 분산된 인간 iPS 세포를 비세포 접착성의 96 구멍 배양 플레이트(PrimeSurface 96V 바닥 플레이트, 스미토모 베이크라이트사제)의 1웰당 1.3×104 세포가 되게 100μl의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5％ CO2에서 부유 배양하였다. 그 때의 무혈청 배지(gfCDM+KSR)에는, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합액에 10％ KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1×Chemically defined lipid concentrate를 첨가한 무혈청 배지를 사용하였다. 부유 배양 개시 시(부유 배양 개시 후 0일째)에, 무혈청 배지에 Y27632(최종 농도 20μM) 및 SAG(최종 농도 10nM)를 첨가하였다. 부유 배양 개시 후 2일째에, Y27632 및 SAG를 포함하지 않고, 인간 재조합 BMP4(R&D사제)를 포함하는 배지에서, 외래성의 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5nM(55ng/ml)이 되게 새로운 상기 무혈청 배지를 50μl 첨가하였다.
그 4일 후(부유 배양 개시 6일 후)에, Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 배지 교환하였다. 배지 교환의 조작으로서는, 배양기 중의 배지를 60μl 폐기하고, 새로운 상기 무혈청 배지를 90μl 첨가하는 조작을 실시하고, 배지량은 합계 180μl가 되도록 하였다. 그 후, 2 내지 4일에 1회, Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 절반량 배지 교환하였다. 절반량 배지 교환 조작으로서는, 배양기 중의 배지를 체적의 절반량, 즉 90μl 폐기하고, 새로운 상기 무혈청 배지를 90μl 첨가하여, 배지량은 합계 180μl로 하였다.
이와 같이 하여 얻어진 부유 배양 개시 후 13일째의 세포괴를, CHIR99021(3μM) 및 SU5402(5μM)를 포함하는 무혈청 배지(DMEM/F12 배지에, 1％ N2 서플리먼트가 첨가된 배지)에서 3일간, 즉 부유 배양 개시 후 16일째까지 배양하였다.
얻어진 부유 배양 개시 후 16일째의 세포 응집체를, 하기 배양액에 대하여는 하기 [1], [2] 및 [3]에 나타낸 혈청 배지를 사용하고, 5％ CO2 조건 하에서 부유 배양 개시 후 75일째까지 배양하였다.
[1] 부유 배양 개시 후 16일째로부터 40일째까지: DMEM/F12 배지에, 10％ 소태아 혈청, 1％ N2 서플리먼트 및 100μM 타우린이 첨가된 배지(이하 A 배지라고 함).
[2] 부유 배양 개시 후 40일째로부터 60일째까지: A 배지와, 뉴로바살(Neurobasal) 배지에, 10％ 소태아 혈청, 2％ B27 서플리먼트, 2mM 글루타민, 60nM의 T3 및 100μM 타우린이 첨가된 배지(이하 B 배지라고 함)를 1:3의 비율로 혼합한 배지.
[3] 부유 배양 개시 후 60일째 이후: B 배지.
부유 배양 개시 후 75일째의 세포괴를 도립 현미경으로 관찰하고, 형태를 확인하였다. 이 때 신경 상피 구조가 형성되어 있는 것을 알았다.
부유 배양 개시 후 75일째의 세포괴를, 4％ 파라포름알데히드로 고정시키고, 동결 절편을 제작하였다. 동결 절편을, 신경 망막 마커의 하나인 Chx10(항Chx10 항체, Exalpha사, 양), 및 시세포 전구 세포의 마커의 하나인 Crx(항Crx 항체, Takara사, 토끼)에 대하여 면역 염색을 행하였다(도 1). 다른 동결 절편을, 신경 망막 마커의 하나인 Rx(항Rx 항체, Takara사, 기니피그), 및 시세포의 마커의 하나인 Recoverin(항Recoverin 항체, Proteintech사, 토끼)에 대하여 면역 염색을 행하였다(도 2). DAPI로 세포핵을 염색하였다.
이들 염색된 절편을, 형광 현미경(Keyence사제)을 사용하여 관찰하고, 면역 염색상을 취득하였다. 제조된 세포를 형광 현미경으로 관찰한 사진을 도 1 및 도 2에 나타낸다. 도 1 및 도 2는, 상단이 저배율 렌즈로 촬상한 화상이며, 하단이 고배율 렌즈로 촬상한 화상이다.
도 1 및 도 2의 DAPI의 염색상으로부터, 세포괴의 표면에, 세포가 조밀하게 채워진 신경 조직이 형성되고, 당해 신경 조직이 연속 상피 구조를 형성하고 있는 것을 알았다. 도 1의 화상을 해석한 결과, 이 신경 조직에는, 세포괴의 표면에, 2 내지 5 세포 정도의 두께의 Crx 양성층(시세포층)이 형성되고, Crx 양성층의 내측에 5 내지 20 세포 정도의 두께의 Chx10 양성층이 형성되고, 또한 그 내측에 Crx 양성 세포가 드문드문하게 존재하는 층이 형성되어 있는 것을 알았다(도 1). 이 세포괴의 표면은 형태적으로 정상 단부면(apical surface)인 것을 알았다. 또한, 도 2의 화상을 해석한 결과, 이 신경 조직에는, Recoverin 양성층(시세포층)이 형성되고, Rx 양성층도 형성되어 있는 것을 알았다. 이들 결과로부터, 이 신경 조직은, 표면에 Crx 양성 세포 및 Recoverin 양성 세포를 포함하는 시세포층이 형성되고, 시세포층의 내측에는 Chx10 양성 세포를 포함하는 망막 전구 세포층이 형성되고, 망막 전구 세포의 내측에도 세포층 형성되어 있는 것을 알았다. 즉, 이 제법으로, 인간 iPS 세포로부터 시세포층 및 망막 전구 세포층을 포함하는 신경 망막 제작할 수 있고, 이 신경 망막이 연속 상피 구조를 갖는 것을 알았다.
<실시예 2 목적외 세포(비신경 망막계 세포)의 동정과 마커 유전자의 탐색>
인간 iPS 세포(QHJI-01-s04주, 교토 대학 iPS 세포 연구소에서 입수)를 각종 배양 조건에서 망막 분화하였다. 구체적으로는, 실시예 1에 기재된 방법으로 유지 배양한 인간 iPS 세포를, 서브컨플렌트 2일 전(배양 면적의 3할이 세포로 덮이는 정도) 또는 서브컨플렌트 1일 전(배양 면적의 5할이 세포로 덮이는 정도)이 될 때까지 피더 프리 배양하였다. 당해 서브컨플렌트 2일 전의 인간 iPS 세포를, SAG(300nM) 존재 하에서 2일간, 또는 당해 서브컨플렌트 1일 전의 인간 iPS 세포를, SAG(300nM) 및 LDN(LDN193189, 100nM) 존재 하에서 1일간 피더 프리 배양하였다(프리컨디션 처리).
프리컨디션 처리한 인간 iPS 세포를, 실시예 1에 기재된 방법으로 부유 배양되게 하였다. 무혈청 배지(gfCDM+KSR)에는, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합액에 10％ 또는 5％ KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1×화학적으로 정의된 지질 농축물(Chemically defined lipid concentrate)을 첨가한 무혈청 배지를 사용하였다. 부유 배양 개시 시(부유 배양 개시 후 0일째)에, 무혈청 배지에 Y27632(최종 농도 20μM) 및 IWR-1e(최종 농도 3μM)를, 혹은 Y27632(최종 농도 20μM), IWR-1e(최종 농도 3μM) 및 SAG(30nM)를 첨가하였다. 부유 배양 개시 후 3일째에, Y27632 및 SAG를 포함하지 않고, 인간 재조합 BMP4(R&D사제) 및 IWR-1e를 포함하는 배지에서, 외래성의 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5nM(55ng/ml)이 되고, 또한 IWR-1e의 최종 농도가 3μM이 되게 새로운 상기 무혈청 배지를 50μl 첨가하였다.
그 3일 후(부유 배양 개시 6일 후)에, Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4를 포함하지 않고, IWR-1e를 포함하는 상기 무혈청 배지로 배지 교환하였다. 배지 교환 조작으로서는, 배양기 중의 배지를 60μl 폐기하고, 새로운 상기 무혈청 배지를 90μl 첨가하여, 배지량은 합계 180μl로 하였다. 부유 배양 개시 10 내지 12일 후에, 외래성의 IWR-1e의 농도가 배지 교환 전에 비해 10％ 정도가 되도록, IWR1-e, Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지를 사용하여 67％ 배지 교환 조작을 2회 행하였다. 그 후, 2 내지 4일에 1회, IWR1-e, Y27632 및 인간 재조합 BMP4를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 절반량 배지 교환하였다. 절반량 배지 교환 조작으로서는, 배양기 중의 배지를 체적의 절반량, 즉 90μl 폐기하고, 새로운 상기 무혈청 배지를 90μl 첨가하여, 배지량은 합계 180μl로 하였다.
이와 같이 하여 얻어진 부유 배양 개시 후 19 내지 20일째의 세포괴를, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질인 CHIR99021(3μM) 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질인 SU5402(5μM)를 포함하는 무혈청 배지(DMEM/F12 배지에, 1％ N2 서플리먼트가 첨가된 배지)에서 3일간, 즉 부유 배양 개시 후 22 내지 23일째까지 배양하였다.
그 후, 실시예 1에 기재한 [1], [2] 및 [3]에 나타낸 혈청 배지, 혹은 DMEM/F12 배지에, 10％ 소태아 혈청, 1％ N2 서플리먼트, 0.5μM 레티노산 및 100μM 타우린이 첨가된 배지(이하, 레티나(Retina) 배지)를 사용하고, 5％ CO2 조건 하에서 부유 배양 개시 후 89 내지 97일째까지 배양하였다.
이와 같이 하여 얻어진 부유 배양 개시 후 89 내지 97일째의 세포 응집체에 대하여, 도립 현미경(니콘사제, ECLIPSE Ti)에서 명시야상(위상차상)을 관찰하였다. 특히 하나하나의 세포의 형태 및 세포끼리의 접착 상태의 특징에 착안하여 관찰하였다. 그리고, 세포 응집체에 있어서, 연속된 상피 구조를 이루고 있고, outer neuroblastic layer(시세포층 및 신경 망막 전구 세포층을 포함함)와 inner neuroblastic layer가 2층으로 나뉘어 보이는 부위를 신경 망막이라고 판정하였다. 또한, 연속된 상피 구조가 확인되지 않는 조직이나, 연속된 상피 구조가 보이지만, outer neuroblastic layer와 inner neuroblastic layer를 구별할 수 없고 1층으로 보이는 부위를, 부산물(A, B, C, D, E 및 F)로 하였다. 그 후, 실체 현미경으로 관찰하면서, 세포 응집체로부터 신경 망막 또는 부산물을 끝이 가는 핀셋 및 가위를 사용하여 실체 현미경 하에서 잘라내어 조직편을 제작하였다. 잘라낸 조직편은 「신경 망막 #1 내지 9」 「부산물 A, #10 내지 16」 「부산물 B, #17 내지 20」 「부산물 C, #21, #22」 「부산물 D, #23, #24」 「부산물 E, #25 내지 29」 「부산물 F, #30 내지 33」의 합계 33 샘플이었다.
그 후, 조직편을 스핀 칼럼(QIAGEN사제, RNeasy Micro kit)에서 키트에 기재된 방법으로 total RNA 추출하고, 마이크로어레이(Affymetrix사제, Human Genome U133 Plus2.0) 해석하였다(도 3). 도 3은 히트 맵 표시이며, 회색은 유전자 발현이 높은 것과 대응하고, 흑색은 유전자 발현이 낮은 것과 대응한다(색이 보다 엷은 쪽이 유전자 발현이 보다 높은 것과 대응한다).
그 결과, 먼저 「신경 망막 #1 내지 9」의 9개의 조직편에서는, 추체 시세포 전구 세포 마커 RXRG, 간체 시세포 전구 세포 마커 NRL, 시세포 마커 Recoverin(별명 RCVRN), 시세포 전구 세포 마커 Crx, 신경 망막 마커 Rax2 및 시세포 전구 세포 마커 Blimp1(별명 PRDM1)의 발현량이 대체로 높은 것을 알았다. 즉, 「신경 망막 #1 내지 9」는 신경 망막계 세포를 포함하는 망막 조직인 것을 확인할 수 있었다.
또한, 「신경 망막 #1 내지 3」에 있어서는 HOX 유전자(HOXC5, HOXA5 및 HOXB2)의 발현이 확인된다. 「신경 망막 #1 내지 3」은 제조 과정에서 레티노산을 첨가하고 있으며, HOX 유전자는 레티노산에 의해 발현이 제어되고 있다고 생간된다. 그러나, 「신경 망막 #1 내지 3」은 상술한 바와 같이, 신경 망막계 세포를 포함하는 망막 조직의 양품이다. 따라서, 제조 공정에 레티노산을 첨가하는 경우에는, HOX 유전자(HOXC5, HOXA5 및 HOXB2)의 발현은 허용된다.
「부산물 A, #10 내지 16」을 해석하였다. 그 결과, 부산물 A는 신경 망막계 세포 마커의 발현량이 대체로 낮은 것을 알았다. 한편, 부산물 A에서 고발현되고 있는 마커 유전자를 탐색한 바, GREM1, GPR17, ACVR1C, CDH6, Pax2, Pax8, GAD2 및 SEMA5A가 발현되고 있는 것을 알았다. 당해 마커에 관한 문헌 정보(Baumer N, et al. Development. 2003 Jul; 130(13): 2903-15, Pfeffer PL, et al. Development. 1998 Aug; 125(16): 3063-74)를 정밀하게 조사한 결과, 부산물 A가 Optic stalk(안포경)인 것을 알았다. 즉, 인비트로에 있어서 다능성 줄기 세포로부터 신경 망막을 만들었을 경우, 부산물로서 Optic stalk가 부생할 가능성이 있는 것을 알았다. 또한 이 Optic stalk를 구별하기 위한 마커 유전자로서, GREM1, GPR17, ACVR1C, CDH6, Pax2, Pax8, GAD2 및 SEMA5A가 유용한 것을 알았다.
「부산물 B, #17 내지 20」을 해석하였다. 그 결과, 부산물 B는 신경 망막계 세포 마커의 발현량이 대체로 낮은 것을 알았다. 한편, 부산물 B에서 고발현되고 있는 마커 유전자를 탐색한 바, Zic1, MAL, HNF1beta, FoxQ1, CLDN2, CLDN1, CRYAA 및 CRYBA1이 발현되고 있는 것을 알았다. 당해 마커에 관한 문헌 정보를 정밀하게 조사한 결과, 부산물 B가 모양체·수정체·모양체 주연부(이하, 모양체·수정체라 기재함)인 것을 알았다. 즉, 인비트로에 있어서 다능성 줄기 세포로부터 신경 망막을 만들었을 경우의 부산물로서 모양체·수정체가 부생할 가능성이 있는 것을 알았다. 또한 이 모양체·수정체를 구별하기 위한 마커 유전자로서, Zic1, MAL, HNF1beta, FoxQ1, CLDN2, CLDN1, CRYAA 및 CRYBA1이 유용한 것을 알았다.
「부산물 C, #21, #22」를 해석하였다. 그 결과, 부산물 C는 신경 망막계 세포 마커의 발현량이 대체로 낮은 것을 알았다. 한편, 부산물 C에서 고발현되고 있는 마커 유전자를 탐색한 바, MITF, TTR 및 BEST1이 발현되고 있는 것을 알았다. 당해 마커에 관한 문헌 정보를 정밀하게 조사한 결과, 부산물 C가 망막 색소 상피(RPE)인 것을 알았다. 즉, 인비트로에 있어서 다능성 줄기 세포로부터 신경 망막을 만들었을 경우의 부산물로서, RPE가 부생할 가능성이 있는 것을 알았다. 또한 이 RPE를 구별하기 위한 마커 유전자로서, MITF, TTR 및 BEST1이 유용한 것을 알았다.
「부산물 D, #23, #24」를 해석하였다. 그 결과, 부산물 D는 신경 망막계 세포 마커의 발현량이 대체로 낮은 것을 알았다. 한편, 부산물 D에서 고발현되고 있는 마커 유전자를 탐색한 바, HOXD4, HOXD3, HOXD1, HOXC5, HOXA5 및 HOXB2가 발현되고 있는 것을 알았다. 당해 마커에 관한 문헌 정보를 정밀하게 조사한 결과, 부산물 D가 척수 조직인 것을 알았다. 즉, 인비트로에 있어서 다능성 줄기 세포로부터 신경 망막을 만들었을 경우의 부산물로서, 척수 조직이 부생할 가능성이 있는 것을 알았다. 또한 이 척수 조직을 구별하기 위한 마커 유전자로서, HOXD4, HOXD3, HOXD1, HOXC5, HOXA5 및 HOXB2가 유용한 것을 알았다.
「부산물 E, #25 내지 29」를 해석하였다. 그 결과, 부산물 E는 신경 망막계 세포 마커의 발현량이 대체로 낮은 것을 알았다. 한편, 부산물 E에서 고발현되고 있는 마커 유전자를 탐색한 바, Nkx2.1, OTP, FGFR2, EFNA5 및 GAD1이 발현되고 있는 것을 알았다. 당해 마커에 관한 문헌 정보를 정밀하게 조사한 결과, 부산물 E가 간뇌·중뇌·시상 하부(이하, 간뇌·중뇌라 기재함)인 것을 알았다. 즉, 인비트로에 있어서 다능성 줄기 세포로부터 신경 망막을 만들었을 경우의 부산물로서, 간뇌·중뇌가 부생할 가능성이 있는 것을 알았다. 또한 이 간뇌·중뇌를 구별하기 위한 마커 유전자로서, Nkx2.1, OTP, FGFR2, EFNA5 및 GAD1이 유용한 것을 알았다.
「부산물 F, #30 내지 33」을 해석하였다. 그 결과, 부산물 F는 신경 망막계 세포 마커의 발현량이 대체로 낮은 것을 알았다. 한편, 부산물 F에서 고발현되고 있는 마커 유전자를 탐색한 바, DLX2, DLX1, DLX5, FOXG1, EMX2, GPR177(Wls), AQP4가 발현되고 있는 것을 알았다. 당해 마커에 관한 문헌 정보를 정밀하게 조사하고, DLX2, DLX1, DLX5, FOXG1 및 EMX2가 발현되고 있는 점에서, 부산물 F가 종뇌인 것을 알았다. GPR177 및 AQP4도 부산물 마커로서 유용한 것을 알았다. 즉, 인비트로에 있어서 다능성 줄기 세포로부터 신경 망막을 만들었을 경우의 부산물로서, 종뇌가 부생할 가능성이 있는 것을 알았다. 또한 이 종뇌를 구별하기 위한 마커 유전자로서, DLX2, DLX1, DLX5, FOXG1 및 EMX2가 유용한 것을 알았다.
이상의 결과로부터, 부산물에 있어서는, 신경 망막계 세포의 마커 유전자의 발현량이 낮고, Optic Stalk, 모양체·수정체, RPE, 척수, 간뇌·중뇌 및 종뇌의 조직에서 발현하는 것이 알려져 있는 유전자의 발현량이 높은 것을 알았다. 이상으로부터, Optic Stalk, 모양체·수정체, RPE, 척수, 간뇌·중뇌 및 종뇌가, 입체 망막에의 분화의 과정에서 부생할 수 있는 것을 알았다. 또한, 각 조직을 검출 가능한 마커가, 표 11에 나타내는 유전자인 것을 알았다.
Figure pct00011
<실시예 3 이식편의 평가 방법의 고안>
인간 iPS 세포로 제작한 입체 망막은, 세포의 조성·분포에 연속성이 있는 신경 상피 구조를 갖는 신경 망막을 포함한다. 이 신경 상피 구조를 갖는 신경 망막은, 시세포층과 내층으로 구성되는 층 구조를 가지고, 특징적인 외관·형태를 갖는다(도 1).
인간 입체 망막은 1 내지 2mm 정도의 크기로 하나하나 형상이 다르다. 또한, 자기 조직화 배양을 사용하는 제조 방법의 특성에 의해, 이식에 사용하는 신경 망막이 주생성물이 되지만, 비신경 망막인 안구 관련 조직(RPE, 모양체 등)이나 뇌척수 조직(종뇌, 척수 등)이 부생하는 것을 알았다(실시예 2). 그래서, 비신경 망막을 포함하지 않는 신경 망막의 중심부를 잘라내어 망막편(이식편, Cap, 캡)을 얻는 것으로 하였다(도 4 및 도 5). 망막편의 조성이나 순도에 관한 품질 평가는, 전수 시험을 실시하는 것이 바람직하다고 생각하지만, 망막편의 전수의 파괴 시험은 할 수 없다. 그래서, 망막편(Cap)의 주변부를, 품질 평가용 샘플(Ring, 링)로서 사용하는 것으로 하였다. 그리고, 링에 대하여 전수를 분석(바람직하게는, 정량 PCR)하는 것으로 하고, 기준에 적합한 링에 대응한 캡만을 이식용 신경 망막으로서 사용하는 것을 검토하였다.
또한, 도 4 및 도 5는 전형적인 세포 응집체의 개념도이다. 시세포층과 내층이 2층으로 나뉘어 보이는 신경 망막 특유의 신경 상피 구조(바람직하게는 연속 상피 구조)가 확인되는 부위를 이식편(캡)으로 하고, 캡의 주변 부위에서, 캡과 마찬가지의 신경 상피 구조(바람직하게는 연속 상피 구조)가 보이는 부위를 품질 평가용 샘플(링)로 하고, 캡, 링 이외의 부위를 루트라 칭하는 것으로 하였다.
이하에서는, 1개의 세포 응집체에 포함되는 신경 상피 구조로부터, 캡과 링을 단리하는 방법의 유용성을 검토하였다.
<실시예 4 이식편(캡)의 형상>
이식편(캡)을 이하의 방법으로 제작하였다(도 6). 먼저, 실시예 1에 기재된 방법에 따라서 인간 iPS 세포(DSP-SQ주)로 제작한 부유 배양 개시 후 99일째의 세포 응집체의 명시야상(위상차상)을 도립 현미경(올림푸스사제)으로 촬상하였다. 세포 응집체 상에 신경 망막이 있는 것을 확인한 후에, 세포 응집체를 실체 현미경 아래로 옮기고, 실시예 2에 기재된 방법을 사용하여, 각종 크기의 신경 망막을 이식편으로서 잘라내었다. 또한, 이식편의 크기에 따른 이식용 디바이스에 의한 이식 조작에 대한 영향에 대하여 검토하였다.
잘라낸 이식편에 대하여, 절단면을 대물 렌즈측으로 향한 상태에서 촬상한 정면 화상과, 절단면이 대물 렌즈에서 보아 수직이 되도록 기울어진 상태에서 촬상한 옆면 화상을, 실체 현미경으로 촬상하였다. 그 후, 촬상한 화상으로부터, 이식편의 긴 직경, 짧은 직경 및 높이를 측정하였다. 측정 함에 있어서, 긴 직경이란, 정면 화상에 있어서, 망막 시트 단면 상의 2개의 단부점을 연결하는 선분 중, 가장 긴 선분 및 그 길이를 가리키는 것으로 하였다. 짧은 직경이란, 정면 화상에 있어서, 망막 시트 단면 상의 2개의 단부점을 연결하는 선분에서 긴 직경과 직교하는 선분 중, 가장 긴 선분 및 그 길이를 가리키는 것으로 하였다. 높이란, 옆면 화상에 있어서, 망막 시트 단면에 직교하는 선분에서, 망막 시트 단면과의 교점과 망막 시트의 표면을 단부점으로 하는 선분 중, 가장 긴 선분 및 그 길이를 가리키는 것으로 하였다. 또한, 이식편의 체적에 대하여, 이식편이, 단면이 긴 직경을 통과하도록 절반으로 분할한 타원체라고 근사하고, 이하의 계산식에 따라서 산출하였다.
체적=2/3×원주율 π×(긴 직경/2)×(짧은 직경/2)×높이
그 결과, 이식용 디바이스 중에의 이식편의 설치, 이식용 디바이스 중에서의 이식편의 안정성 및 이식용 디바이스로부터의 이식편의 토출은, 이식편의 크기에 의해 영향을 받는 것을 알았다. 또한, 특히 짧은 직경이 유용한 파라미터인 것이 시사되었다. 이식용 디바이스에 의한 이식 조작이 양호하였던 11개의 이식편에 대하여, 긴 직경, 짧은 직경, 높이 및 체적을 각각 계산하였다. 각각의 파라미터에 대하여, 평균값, 최댓값 및 최솟값을 구한 결과를, 표 12에 통합하였다. 이 결과로부터, 이식편(캡)은 적어도, 긴 직경이 0.8 내지 1.7mm, 짧은 직경이 0.4 내지 1.1mm, 높이가 0.2 내지 0.7mm, 외관 상의 체적이 0.07 내지 0.57mm3 정도인 것을 알았다.
Figure pct00012
<실시예 5 이식편(캡)의 세포의 조성>
이식편(캡)을 이하의 방법으로 제작하였다(번호: 18001MF, d89, H5). 먼저, 실시예 1에 기재된 방법에 따라서 인간 iPS 세포(DSP-SQ주)로 제작한 부유 배양 개시 후 89일째의 세포 응집체로부터, 실시예 2 및 3에 기재된 방법으로 이식편(캡)을 단리하였다.
이식편을 4％ 파라포름알데히드로 고정시키고, 동결 절편을 제작하였다. 동결 절편을, 신경 망막 마커의 하나인 Chx10(항Chx10 항체, Exalpha사, 양) 및 시세포 전구 세포의 마커의 하나인 Crx(항Crx 항체, Takara사, 토끼)에 대하여 면역 염색을 행하였다(도 7). 다른 동결 절편을, 신경 망막 마커의 하나인 Rx(항Rx 항체, Takara사, 기니피그) 및 시세포의 마커의 하나인 Recoverin(항Recoverin 항체, Proteintech사, 토끼)에 대하여 면역 염색을 행하였다(도 7). DAPI로 세포핵을 염색하였다. 이들 염색된 절편을, 공초점 레이저 현미경(Olympus사제)을 사용하여 관찰하고, 면역 염색상을 취득하였다.
염색상으로부터, 이식편(캡)의 표면에(도면 중 좌측), 세포가 조밀하게 채워진 신경 조직이 형성되고, 당해 신경 조직이 신경 상피 구조(특히 연속 상피 구조)를 형성하고 있는 것을 알았다(도 7). 또한 이 신경 조직에는, 세포괴의 표면에, 2 내지 10 세포 정도의 두께의 Crx 양성층(시세포층, 도 7)이 형성되고, Crx 양성층의 내측에 5 내지 20 세포 정도의 두께의 Chx10 양성층이 형성되고, 또한 그 내측에 Crx 양성 세포가 존재하는 층이 형성되어 있는 것을 알았다(도 7). 이 이식편(캡)의 표면은 형태적으로 헤드 정상면(apical surface; 頭頂面)인 것을 알았다. 또한, 이 신경 조직에는, Recoverin 양성층(시세포층, 도 7 화살표)이 형성되고, Rx 양성층도 형성되어 있는 것을 알았다. 이들 결과로부터, 이 신경 조직은, 표면에 Crx 양성 세포 및 Recoverin 양성 세포를 포함하는 시세포층이 형성되고, 시세포층의 내측에는 Chx10 양성 세포를 포함하는 망막 전구 세포층이 형성되고, 망막 전구 세포의 내측에도 세포층 형성되어 있는 것을 알았다. 즉, 이식편(캡)은 시세포층 및 망막 전구 세포층을 포함하는 신경 망막 제작할 수 있고, 이 신경 망막이 연속 상피 구조를 갖는 것을 알았다.
<실시예 6 캡과 링의 동등성의 검증>
캡 및 링의 유전자 발현을 비교하기 위해서, 이하의 방법으로 검증하였다. 먼저, 실시예 1에 기재된 방법에 따라서, 인간 iPS 세포(DSP-SQ주)에서 부유 배양 개시 후 99일째의 세포 응집체를 제작하여, 로트 1로 하였다. 또한, 실시예 1에 기재된 방법에 따라서, 인간 iPS 세포(DSP-SQ주)에서 부유 배양 개시 후 부유 배양 개시 후 82일째의 세포 응집체를 로트 2로 하였다. 이 2개의 로트에 대하여, 실시예 2 및 실시예 3에 기재된 방법으로, 현미경을 사용하여 주산물인 신경 망막과 부산물을 판정하고, 신경 망막의 캡과 부산물의 캡을 각각 단리하였다. 링은, 이식편과 마찬가지로 끝이 가는 핀셋 및 가위를 사용하여 실체 현미경 하에서 잘라내어 단리하였다. 신경 망막 및 부산물로부터 단리한 캡 및 링으로부터, 실시예 2에 기재된 방법으로 total RNA를 추출하였다. total RNA의 농도를 측정기(Nanodrop, Thermo scientific사제)로 측정한 후에, 역전사 효소 및 프라이머(Reverse Transcription Master Mix Kit, Fluidigm사제)를 사용하여 cDNA에 역전사하였다. cDNA를, 검증에 사용하는 전체 프로브를 사용하여, PCR 장치(Veriti 96 well thermal cycler, Applied Biosystems사제)를 사용하여, multiplex-PCR 반응(프리 런)을 실시하였다. 그 후, 프리 런 완료의 반응액을, IFC 컨트롤러 HX(Fluidigm사제)를 사용하여 유로 구비 멀티웰(96.96 Dynamic Array IFC, Fluidigm사제)에 주입하고, 다검체 리얼타임 PCR 시스템(Biomark HD, Fluidigm사제)을 사용하여 신경 망막 및 신경 망막 이외의 부산물의 마커 유전자의 발현량을 리얼타임 PCR로 측정하였다. 검증에 사용한 PCR용 프로브를 표 13에 나타내었다.
Figure pct00013
결과를 도 8에 히트 맵으로 나타낸다. 유전자 발현량은, 목적 유전자의 Ct값과 내부 표준으로서 사용한 유전자인 GAPDH의 Ct값의 차로부터 산출한 ΔCt값으로 평가하였다. ΔCt값이 낮을수록 유전자 발현량이 높고, ΔCt값이 높을수록 유전자 발현량이 낮다. 회색은 유전자 발현량이 높은 것을 나타내고, 흑색은 유전자 발현량이 낮은 것을 나타내고 있다(색이 보다 엷은 쪽이 유전자 발현이 보다 높은 것을 나타낸다). 각 캡 및 링의 유전자 발현을 조사한 바, 로트 1 및 로트 2의 어떤 경우에도, 신경 망막으로부터 단리한 캡 및 링에 있어서, 신경 망막 마커 유전자군이 발현되고 있었다. 한편, 부산물로부터 단리한 캡 및 링에 있어서의 유전자 발현을 조사한 바, 어느 로트에 있어서도, 신경 망막과는 반대로, 신경 망막 마커 유전자군의 발현량은 낮고, 부산물의 마커 유전자군의 발현량이 높았다. 이로부터, 실시예 2에서 발견한 마커 유전자군이 신경 망막과 부산물을 각각 구별하여 검출할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 동일한 세포 응집체로부터 단리한 캡과 링에 있어서의 유전자 발현을 비교한 바, 어느 신경 망막 및 부산물로부터 단리한 캡과 링에 있어서도, 신경 망막 마커 유전자의 발현량과 부산물의 마커 유전자의 발현량이 동등한 것을 알았다.
이들 결과로부터, 링이 신경 망막이면, 캡도 신경 망막인 것을 실증할 수 있었다. 또한, 캡과 링에서 유전자 발현이 동등한 것을 실증할 수 있었다.
<실시예 7 각종 다능성 줄기 세포주에서의 캡과 링의 동등성의 검증>
각종 다능성 줄기 세포로부터 분화된 세포 응집체에 있어서도 캡과 링의 유전자 발현이 동등한지를 조사하기 위해서, 이하를 검토하였다.
먼저, Crx::Venus 노크인 인간 ES 세포(KhES-1 유래; Nakano, T. et al. Cell Stem Cell 2012, 10(6), 771-785; 교토 대학에서 입수, 리켄 CDB에서 수립하여 사용), 인간 iPS 세포(QHJI-01-s04주), 및 인간 iPS 세포(DSP-SQ주)를 실시예 1에 기재된 제법으로 망막에 분화시켰다. 그 후, 부유 배양 개시 후 70일째 이상의 세포 응집체로부터, 실시예 6에 기재된 방법으로 신경 망막 및 부산물의 캡, 링을 잘라내었다. 그 후, 실시예 6에 기재된 방법으로 total RNA를 추출하였다. total RNA의 농도를 측정기(Nanodrop, Thermo scientific사제)로 측정한 후에, 역전사 효소 및 프라이머(Reverse Transcription Master Mix Kit, Fluidigm사제)를 사용하여 cDNA에 역전사하였다. cDNA를, 검증에 사용하는 전체 프로브를 사용하고, PCR 장치(Veriti 96 well thermal cycler, Applied Biosystems사제)를 사용하여, multiplex-PCR 반응(프리 런)을 실시하였다. 그 후, 프리 런 완료의 반응액을, IFC 컨트롤러 HX(Fluidigm사제)를 사용하여 유로 구비 멀티웰(96.96 Dynamic Array IFC, Fluidigm사제)에 주입하고, 다검체 리얼타임 PCR 시스템(Biomark HD, Fluidigm사제)을 사용하여 신경 망막 및 신경 망막 이외의 부산물의 마커 유전자의 발현량을 리얼타임 PCR로 측정하였다. 실시예 6의 표 3에 나타낸 PCR용 프로브를 검증에 사용하였다.
결과를 도 9의 히트 맵으로 나타내었다. 히트 맵은 실시예 6에 기재된 방법에 따라서 제작하였다. 캡 및 링에 있어서의 유전자 발현을 조사한 바, 어느 세포주 유래의 캡 및 링에 있어서도, 신경 망막으로부터 단리한 것에서는, 신경 망막 마커 유전자의 발현량이 높고, 부산물의 마커 유전자의 발현량이 낮았다. 한편, 부산물로부터 단리한 캡 및 링에 있어서는, 부산물의 마커 유전자의 발현량이 높고, 신경 망막 마커 유전자의 발현량이 낮았다. 또한, 동일한 세포 응집체로부터 단리한 캡 및 링의 유전자 발현을 비교한 바, 어느 세포주로부터 단리한 캡 및 링에 있어서도, 신경 망막 및 부산물의 마커 유전자가 동일 정도로 발현되고 있는 것을 알았다.
이들 결과로부터, 어느 다능성 줄기 세포주 유래의 세포 응집체에 있어서도, 링이 신경 망막이면, 캡도 신경 망막인 것을 실증할 수 있었다. 또한, 캡과 링에서 유전자 발현이 동등한 것을 실증할 수 있었다. 즉, 표 2의 크기 캡을 잘라낸 경우에도, 세포 응집체 중의 나머지 부분으로부터 링을 잘라내어도, 캡과 동등한 유전자 발현을 갖는 부분인 링을 잘라낼 수 있는 것을 알았다.
<실시예 8 이식편의 이식 결과>
실시예 6 및 실시예 7에서 캡과 링의 유전자 발현이 동등한 것을 알았다. 또한, 링이 신경 망막이면, 캡도 신경 망막인 것을 확인할 수 있었다. 그래서, 링의 유전자 발현을 이식 전에 해석하여 링이 신경 망막인 것을 확인하고, 링에 대응하는 캡을 이식하는 방법을 고안하였다. 이 방법의 유용성을 실증할 목적으로, 링의 유전자 발현을 해석한 후에 대응하는 캡을 망막 변성 누드 래트에 이식하고, 이식 후의 생착상을 평가하였다.
먼저, 실시예 1에 기재된 방법에 따라서 인간 iPS 세포(DSP-SQ주)에서 세포 응집체를 제작하였다. 그 후, 부유 배양 개시 후 75일째 이후의 세포 응집체로부터, 실시예 6에 기재된 방법으로 캡 및 링을 단리하였다. 단리한 캡은, 링의 유전자 해석을 실시하는 동안, 시판되고 있는 보존액을 사용하여 보존하였다. 단리한 링은, 실시예 6에 기재된 방법으로 Biomark HD(Fluidigm사제)를 사용한 리얼타임 PCR법으로 유전자 발현 해석을 실시하였다. 유전자 발현 해석의 결과로부터, 신경 망막 마커 유전자를 발현하고, 부산물의 마커 유전자를 발현하지 않는 링을 선택하고, 이 링에 대응하는 캡을 이식편으로서 선택하였다. 이식편은 완충액(Thermo Fisher Scientific사제)으로 세정한 후, 공지 문헌(Shirai et al. PNAS 113, E81-E90)에 기재된 주입기를 사용하여 망막 변성 누드 래트(시세포 변성 모델, SD-Foxn1 Tg(S334ter) 3LavRrrc nude rat)의 망막 아래에 이식하였다.
부유 배양 개시 후 230 내지 240일 상당 령의 눈 조직을 파라포름알데히드 고정(PFA 고정)하여 수크로오스 치환하였다. 고정된 눈 조직을 크라이오스탯을 사용하여, 동결 절편을 제작하였다. 이들 동결 절편을, 인간 핵(항HuNu 항체, Millipore사, 마우스, 또는 항HNA 항체), 시세포의 마커의 하나인 Recoverin(항Recoverin 항체, Proteintech사, 토끼), 쌍극 세포의 마커의 하나인 PKCα(항PKCα 항체, R&D systems사, 염소)에 대하여 면역 염색을 행하였다.
링의 유전자 발현 해석에 의한 이식편의 품질 평가 결과와 이식 결과를 통합한 결과를 표 14에 나타낸다. ΔCt값의 산출 방법은 실시예 6에 기재된 방법을 사용하였다. 링의 유전자 발현 해석은, 신경 망막 마커 유전자의 하나인 Recoverin의 ΔCt값이 10 이하이고, 부산물의 마커 유전자인 FOXG1, HOXB2, ZIC1 및 OCT3/4의 ΔCt값이 각각 5 이상인 경우, 품질 평가 시험(링-PCR 시험) 합격으로 하였다. 이식 결과에 대하여는, 망막 아래에 인간 핵 양성 또한 Recoverin 양성의 시세포를 검출할 수 있는 경우, 생착 양호라고 평가하였다. 또한, 이식 개소가 적정한 생착의 사이즈를 크게 웃돌아 두껍게 되어 있지 않으면, 비대는 검출되지 않았다고 판정하였다.
대표적인 생착상을 도 10에 나타낸다. 이식 전의 품질 평가 시험을 합격한 14눈에 대하여 이식 후의 생착상을 평가한 바, 14눈 모두에 있어서, Recoverin 양성의 시세포가 검출되어, 양호하게 생착되는 것을 알았다. 이들 세포는 HuNu 양성이었던 점에서, Recoverin 양성인 시세포는, 이식한 캡 유래인 것을 알았다. 또한, 14눈 모두에 있어서, 비대는 검출되지 않았다.
이상의 결과로부터, 링의 유전자 발현 해석에서 신경 망막과 부산물의 마커 유전자의 발현량을 이식 전에 조사함으로써, 망막 아래에 양호하게 생착되는, 즉 시세포가 생착되어 비대가 일어나지 않는, 이식편을 선별할 수 있는 것을 실증할 수 있었다.
Figure pct00014
<실시예 9 이식편의 이식 결과>
실시예 8에서는, 링의 유전자 발현 해석에 Biomark HD(Fluidigm사제)를 사용하였다. Biomark HD는 원래 1 세포 해석을 위해 설계된 기계이며, 실시예 8에서의 사용 방법은 일반적이지 않다. 그래서, 일반적으로 사용되고 있는 리얼타임 PCR 장치로 링의 유전자 발현을 해석하고, Biomark HD를 사용하였을 때와 마찬가지로, 망막 아래에 양호하게 생착되는 이식편을 선택할 수 없는지, 검증하였다.
인간 iPS 세포(DSP-L주, 다이닛폰 스미토모 세이야꾸에서 수립)는 시판되고 있는 센다이 바이러스 벡터(Oct3/4, Sox2, KLF4 및 c-Myc의 4 인자, IDPharma사제 사이토튠 키트)를 사용하여, Thermo Fisher Scientific사의 공개 프로토콜(iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit, Publication Number MAN0009378, Revision 1.0), 및 교토 대학의 공개 프로토콜(피더 프리에서의 인간 iPS 세포의 수립·유지 배양, CiRA_Ff-iPSC_protocol_JP_v140310, http://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/protocol.html)에 기재된 방법을 기초로, StemFit 배지(AK03; 아지노모토사제), Laminin511-E8(닛삐사제)을 사용하여 수립하였다.
먼저, 실시예 1에 기재된 방법에 따라서 인간 iPS 세포(DSP-L주)에서 세포 응집체를 제작하였다. 그 후, 부유 배양 개시 후 86일째의 세포 응집체로부터, 실시예 6에 기재된 방법으로 캡 및 링을 단리하였다. 단리한 캡은, 링의 유전자 해석을 실시하는 동안, 시판되고 있는 보존액을 사용하여 보존하였다. 단리한 링의 유전자 발현 해석을 이하와 같이 실시하였다.
먼저, total RNA는 실시예 2에 기재된 방법으로 추출하였다. total RNA의 농도를 측정기(Nanodrop, Thermo scientific사제)로 측정한 후에, 역전사 효소(QuantiTect Revese Transcription Kit(QIAGEN사제) 및 프라이머(RT primer mix, QIAGEN사제)를 사용하여 cDNA에 역전사하였다. 그 후, cDNA를, 리얼타임 PCR 효소(TaqMan Fast Advanced Master Mix, Applied Biosystems사제)를 사용하여, StepOnePlus 리얼타임 PCR 시스템(Applied Biosystems사제)을 사용하여, 신경 망막 및 망막 이외의 부산물의 마커 유전자의 발현량을 리얼타임 PCR로 측정하였다. 결과를 도 11에 나타낸다. 양성 대조 샘플로서 미분화 iPS 세포의 cDNA와 입체 망막의 cDNA를 섞은 샘플을 사용하였다. 양성 대조 샘플을 단계 희석하여 검량선 샘플을 만들고, 검량선을 그었다. 내부 표준으로서 gapdh를 사용하여 유전자 발현을 노말라이즈하였다.
PCR 해석의 결과, Sample1 및 Sample2가, 신경 망막 마커의 Chx10, Rx, Crx 및 Recoverin의 발현량이 높고, 부산물의 마커 유전자의 Oct3/4, FoxG1, Aqp1, Nkx2.1, Dlx6, CDH6, Emx2, Zic1, HoxA5, Pax2 및 Pax8의 발현량이 낮은 것을 알았다. 신경 망막 마커 유전자를 발현하고, 부산물의 마커 유전자를 발현하지 않는 링을 선택하고, 링에 대응하는 캡을, 실시예 8에 기재된 방법에 따라서 망막 변성 누드 래트 망막 아래에 이식하였다.
부유 배양 개시 후 230 내지 240일 상당 령의 눈 조직을 파라포름알데히드 고정(PFA 고정)하여 수크로오스 치환하였다. 고정된 눈 조직을 크라이오스탯을 사용하여, 동결 절편을 제작하였다. 이들 동결 절편을 인간 핵(항HuNu 항체, Millipore사, 마우스), 시세포의 마커의 하나인 Recoverin(항Recoverin 항체, Proteintech사, 토끼), 쌍극 세포의 마커의 하나인 SCGN(항SCGN 항체, BioVendor, 양)에 대하여 면역 염색을 행하였다.
상기 링에 대응하는 캡을 이식한 래트 눈에 있어서의 생착상을 도 11에 나타낸다. 이식 후의 생착상을 평가한 바, Recoverin 양성의 시세포가 확인되고, 양호한 생착을 나타내고 있었다. 이들 세포는 HuNu 양성이었던 점에서, Recoverin 양성인 시세포는 이식한 캡 유래였다. 또한, 비대는 확인되지 않았다.
이상의 결과로부터, 일반적으로 사용되고 있는 리얼타임 PCR 시스템을 사용하여 링의 유전자 발현을 해석해도, 신경 망막과 부산물의 마커 유전자의 발현량을 이식 전에 조사함으로써, 망막 아래에 양호하게 생착되는 이식편을 선택할 수 있는 것을 알았다. 따라서, 다검체 리얼타임 PCR 시스템에 의해, 복수의 유전자의 해석이 가능한 것을 알았다.
<실시예 10 링의 이식 결과>.
실시예 8 및 9에 있어서, 상기 수법으로 제작한 캡을 망막 변성 누드 래트의 망막 아래에 이식하면, 시세포가 생착되는 것을 알았다. 링과 캡의 동등성을 검증할 목적으로, 링을 마찬가지로 망막 아래에 이식하는 검토를 행하였다.
Crx::Venus 노크인 인간 ES 세포(KhES-1 유래; Nakano, T. et al. Cell Stem Cell 2012, 10(6), 771-785; 교토 대학에서 입수, 리켄 CDB에서 수립하여 사용)를 실시예 1에 기재된 제법으로 망막에 분화시켰다. 그 후, 부유 배양 개시 후 74일째의 세포 응집체로부터, 실시예 6에 기재된 방법으로 신경 망막 및 부산물의 캡, 링을 잘라내었다(도 12). 그 후, 링을 공지 문헌(Shirai et al. PNAS 113, E81-E90) 주사기를 사용하여 시세포 변성 모델인 망막 변성 누드 래트(SD-Foxn1 Tg(S334ter) 3LavRrrc nude rat)의 망막 아래에 이식하였다.
이식 후 1년간, 망막 변성 누드 래트를 생육시켰다. 그 후, 링을 이식한 눈 조직을 적출하고, 파라포름알데히드 고정(PFA 고정)하여 수크로오스 치환하였다. 고정된 눈 조직으로부터, 크라이오스탯을 사용하여 동결 절편을 제작하였다. 이들 동결 절편을, 인간 세포질 마커인 Stem121(항Stem121 항체, Cellartis사, 마우스), 혹은 시세포의 마커의 하나인 Recoverin(항Recoverin 항체, Proteintech사, 토끼)에 대하여 면역 염색을 행하였다.
이식에 사용한 링을 잘라낸 직후에 촬상한 명시야상, 및 링을 이식한 후 1년간 생육시킨 래트로부터 적출한 눈 조직으로 제작한 절편을 면역 염색한 결과를, 각각 도 12에 나타낸다. 도 12의 좌측에 나타내는 링을 망막 변성 누드 래트의 망막 아래에 이식한 바, 도 12의 우측에 나타내는 면역 염색의 결과가 얻어졌다. 면역 염색의 결과로부터, Stem121 양성인 인간 세포가 생착되어 있는 것을 알았다. 또한, Recoverin 양성의 시세포가 생착되는 것을 알았다.
이상의 결과로부터 링이라도, 캡과 마찬가지로, 이식하면 시세포가 생착되는 것을 알았다. 또한, 이 결과는 신경 망막이면, 캡, 링 중 어느 쪽을 이식해도 마찬가지의 이식 결과가 얻어지는 것이 시사되었다.
<실시예 11 캡과 링의 동등성의 검증>.
실시예 6 및 7에 있어서, 캡과 링 유전자 발현이, RNA 레벨에서 동등한 것을 PCR법을 사용하여 실증하였다. 그리고, 링의 유전자 발현을 PCR법으로 해석함으로써, 캡이 신경 망막이나 부산물인지를 검증할 수 있는 것을 실증하였다. 이어서, 링의 유전자 발현을 면역 염색법으로 해석함으로써, 캡이 신경 망막이나 부산물인지를 검증할 수 있는 것을 검토하였다.
먼저, 인간 iPS 세포(DSP-SQ주)를 실시예 1에 기재된 제법으로 망막에 분화시켰다. 그 후, 부유 배양 개시 후 120일째의 세포 응집체로부터, 실시예 6에 기재된 방법으로 신경 망막의 캡 및 링을 단리하였다. 그 후, 캡 및 링을 세정한 후에, 4％ 파라포름알데히드 고정(PFA 고정)하여 수크로오스 치환하였다. 고정된 캡 및 링을, 크라이오스탯을 사용하여, 동결 절편을 제작하였다. 이들 동결 절편을, 핵을 염색하는 DAPI, 시세포 전구 세포의 마커의 하나인 Crx(항Crx 항체, Takara사, 토끼), 신경 망막 마커의 하나인 Chx10(항Chx10 항체, Exalpha사, 양), 간체 시세포 전구 세포 마커의 하나인 NRL(항NRL 항체, Bio-Techne사, 염소), 종뇌 마커의 하나인 FOXG1(항FOXG1 항체, 다카라 바이오사, 토끼), Optic Stalk 마커의 하나인 PAX2(항PAX2 항체, Thermo Fisher Scientific사, 토끼), 그리고 미분화하는 다능성 줄기 세포 마커의 하나인 NANOG(항NANOG 항체, 머크사, 마우스)에 대하여 면역 염색을 행하였다.
면역 염색한 결과를 도 13에 나타내었다. 동일한 세포 응집체로부터 잘라낸 캡과 링에 대하여, 링의 면역 염색 결과를 상단에, 캡의 면역 염색 결과를 하단에 나타낸다. 이들 결과로부터, 캡 및 링의 어떤 경우에도, Crx 양성인 시세포 전구 세포, Chx10 양성인 신경 망막 및 NRL 양성인 간체 시세포 전구 세포가, 연속해서 층상으로 발현되고 있는 것을 알았다. 또한, 캡 및 링의 어떤 경우에도, FOXG1 양성인 종뇌나, PAX2 양성인 Optic Stalk, 및 NANOG 양성인 다능성 줄기 세포는 검출되지 않았다. 또한, Crx, Chx10 및 NRL의 염색상을 비교하면, 이들 신경 망막 마커가 캡과 링에서 거의 동등한 분포를 나타내고 있는 것을 알았다.
이상의 결과로부터, 유전자 발현 해석뿐만 아니라, 면역 염색에서도 캡과 링이 동등한 것을 실증할 수 있었다. 또한, 이 결과로부터, 링의 유전자 발현을 면역 염색법으로 해석함으로써, 캡이 신경 망막이나 부산물인지를 검증할 수 있는 것을 실증할 수 있었다.
<실시예 12 비신경 망막에서의 캡과 링의 동등성의 검증>
실시예 6 및 7에 있어서, 신경 망막 및 부산물의 캡과 링에서 유전자 발현이 동등한 것을 알았다. 그래서, 망막 이외의 조직으로부터 단리한 캡과 링에서도 유전자 발현이 동등한지, 상세하게 해석하기로 하였다.
먼저, 인간 iPS 세포(QHJI-01-s04주) 및 인간 iPS 세포(DSP-SQ주)를 실시예 1에 기재된 제법으로 망막에 분화시켰다. 그 후, 부유 배양 개시 후 80일째 이상의 세포 응집체를 현미경 검사한 바, 상피 구조가 있는 것이 관찰되었다. 상기 부유 배양 개시 후 80일째 이상의 세포 응집체를, 실시예 6에 기재된 방법으로 신경 망막 및 부산물의 캡 및 링을 잘라내었다. 그 후, 실시예 6에 기재된 방법으로 RNA를 추출하고, Biomark HD(Fluidigm사제)를 사용하여 신경 망막 및 망막 이외의 부산물의 마커 유전자의 발현량을 리얼타임 PCR로 측정하였다.
결과를 도 14에 히트 맵으로 나타낸다. 히트 맵은 실시예 6에 기재된 방법에 따라서 제작하였다. 캡 및 링에 있어서의 유전자 발현을 조사한 바, 신경 망막으로부터 잘라낸 캡 및 링에서는, 신경 망막 마커 유전자가 발현되고, 부생물의 마커 유전자가 발현되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 부산물로부터 잘라낸 캡 및 링에 있어서의 유전자 발현을 조사한 바, 종뇌 마커의 하나인 FOXG1을 고발현하고 있는 캡, 링이나, 척수 마커인 HOXB2 및 HOXA5를 고발현하고 있는 캡 및 링, RPE 마커의 하나인 MITF를 고발현하고 있는 캡 및 링, 그리고 Optic Stalk 마커의 하나인 PAX2가 고발현되고 있는 캡 및 링이 확인되었다. 그래서, 고발현되고 있던 마커 유전자로부터, 이들 부산물을 각각 종뇌 조직, 척수 조직, RPE 및 Stalk로 분류하였다. 이들 부산물로부터 단리한 캡 및 링의 유전자 발현을 조사한 바, 어느 부산물에 있어서도, 캡과 링에서 동등한 유전자 발현을 나타내고 있었다.
이상의 결과로부터, 신경 망막뿐만 아니라, 종뇌 조직, 척수 조직, RPE 및 Optic Stalk로부터 단리한 캡과 링에 있어서도, 유전자 발현이 동등한 것을 알았다. 또한, 이 결과로부터, 종뇌 조직, 척수 조직, RPE, Optic Stalk 등의 비신경 망막으로부터 단리한 링에 있어서의 유전자 발현을 조사함으로써, 캡이 동일한 조직인지 판정할 수 있는 것을 알았다.
<실시예 13 이식용 신경 망막 시트를 구성하는 시세포 전구 세포 및 신경 망막 전구 세포의 비율>
다능성 줄기 세포로부터 분화된 세포 응집체로 제작한 이식용 신경 망막 시트의 구성 세포 중, 시세포 전구 세포 및 신경 망막 전구 세포의 비율을, 면역 염색법의 하나인 면역 조직 염색(Immunohistochemistry; IHC)으로 해석·정량하였다.
인간 iPS 세포(DSP-SQ주)를 실시예 1에 기재된 제법으로 망막에 분화시켰다. 그 후, 부유 배양 개시 후 84일째, 92일째, 93일째의 세포 응집체로부터, 실시예 6에 기재된 방법으로 캡 및 링을 단리하였다. 실시예 8에 기재된 방법으로, 단리한 링의 유전자 발현 해석을 실시하였다. 실시예 8에 기재된 방법으로, 신경 망막 마커 유전자를 발현하고, 부산물의 마커 유전자를 발현하지 있는 링을 선택하고, 이 링에 대응하는 캡을 이식용 신경 망막 시트로 하였다. 이와 같이 하여, 부유 배양 개시 후 84일째의 세포 응집체로부터 이식용 신경 망막 시트를 하나, 부유 배양 개시 후 92일째의 세포 응집체로부터 이식용 신경 망막 시트를 2개, 부유 배양 개시 후 93일째의 세포 응집체로부터 이식용 신경 망막 시트를 하나 제작하였다. 즉 합계 4매의 이식용 신경 망막 시트를 제작하였다.
얻어진 이식용 신경 망막 시트를, 해석을 위해 B 배지에서 7일간 배양하였다. 배양한 이식용 신경 망막 시트를 4％ 파라포름알데히드로 고정시키고, 동결 절편을 제작하였다. 동결 절편을, 신경 망막 전구 세포 마커의 하나인 Chx10(항Chx10 항체, Exalpha사, 양) 및 시세포 전구 세포의 마커의 하나인 Crx(항Crx 항체, Takara사, 토끼)에 대하여 면역 염색을 행하였다. 다른 동결 절편을, 신경 망막 마커의 하나인 Rx(항Rx 항체, Takara사, 기니피그) 및 시세포의 마커의 하나인 Recoverin(항Recoverin 항체, Proteintech사, 토끼)에 대하여 면역 염색을 행하였다. DAPI로 세포핵을 염색하였다. 이들 염색된 절편을, 형광 현미경(Keyence사제)을 사용하여 관찰하고, 면역 염색상을 취득하였다. 그 일례(D3)를 도 15에 나타낸다.
면역 염색상을 ImageJ(version 1.52a, NIH제)로 해석하고, 4매의 이식용 신경 망막 시트 각각에 대하여, DAPI 양성 세포수, DAPI 양성 또한 Chx10 양성 세포수, 및 DAPI 양성 또한 Crx 양성 세포수를 해석하였다. 마찬가지로 면역 염색상을 해석하고, DAPI 양성 세포수, 및 DAPI 양성 또한 Rx 양성 세포수를 해석하였다. 이들 수치로부터, Chx10 양성 세포의 비율, Crx 양성 세포의 비율 및 Rx 양성 세포의 비율을 산출하였다. 얻어진 결과를 표 15에 기재하였다.
Figure pct00015
이상의 결과로부터, 이식용 신경 망막 시트에 포함되는 Chx10 양성 세포의 비율이 23 내지 45％ 정도, Crx 양성 세포의 비율이 30 내지 56％ 정도, Rx 양성 세포의 비율이 40 내지 54％ 정도인 것을 알았다.
즉, 이식용 신경 망막 시트에는, Chx10 양성의 신경 망막 전구 세포가 약 34％ 정도(23 내지 45％ 정도), Crx 양성의 시세포 전구 세포가 약 40％(30 내지 56％), Rx 양성 세포가 약 47％(40 내지 54％) 포함되어 있는 것이 시사되었다.
<실시예 14 이식용 신경 망막 시트를 구성하는 시세포 전구 세포 및 신경 망막 전구 세포의 비율>
각종 다능성 줄기 세포로부터 분화된 세포 응집체로 제작한 이식용 신경 망막 시트의 구성 세포의 조성을, 면역 염색법의 하나인 플로우 사이토메트리법(FACS라고도 함)에 의해 조사하였다.
인간 iPS 세포(QHJI-01-s04주)를 실시예 1에 기재된 제법으로 망막에 분화시켰다. 그 후, 부유 배양 개시 후 88일째의 세포 응집체로부터, 실시예 6에 기재된 방법으로 캡 및 링을 단리하였다. 그리고, 캡을 이식용 신경 망막 시트로 하였다. 이식용 신경 망막 시트를 2일간, 17℃에서 저온 보존하였다. 얻어진 이식용 신경 망막 시트를, 5매 합하여 하나의 샘플로 하여, PBS로 세정하고, 신경 세포 분산액(WAKO사제, 파파인을 포함함)을 사용하여 37℃에서 30분간 정도 효소 처리하고, 피펫팅에 의해 단일 세포로 분산시켜, 단일 세포 현탁액을 얻었다. 얻어진 단일 세포 현탁액을, 고정액(BD사제, CytoFix)을 사용하여 고정하고, FACS용 샘플을 얻었다. FACS용 샘플을, 혈청을 포함하는 Perm/Wash액(BD사제)액을 사용하여 블로킹 및 투과 처리(세포막의 펀칭)를 행하였다. 그리고, 형광 표지한 이하의 항체, 항Chx10 항체(Santa Cruz사제) 및 항Pax6 항체(BD사제), 항Crx 항체(Santa Cruz사제)로 면역 염색을 행하였다. 그리고 애널라이저(BD사제)를 사용하여, 플로우 사이토메트리로 해석하였다.
그 결과, Chx10 양성 또한 Pax6 양성 분획(신경 망막 전구 세포 분획)은 11.5％, Chx10 양성 또한 Pax6 음성 분획(쌍극 세포에 편중된 전구 세포 분획)은 23.4％, Chx10 음성 또한 Pax6 양성 분획(신경절 세포 및 아마크린 세포 분획)은 10.7％, Crx 양성 세포 분획(시세포 전구 세포 분획)은 17.4％인 것을 알았다.
또한, 인간 iPS 세포(DSP-SQ주)를 실시예 1에 기재된 제법으로 망막에 분화시켰다. 그 후, 부유 배양 개시 후 88일째의 세포 응집체를 11개 제작하고, 각각의 세포 응집체로부터, 실시예 6에 기재된 방법으로 11개씩의 캡 및 링을 단리하였다. 11개의 캡을 합하여 하나의 캡 샘플로 하였다. 마찬가지로, 11개의 링을 합하여 하나의 링 샘플로 하였다. 캡 샘플과 링 샘플을 각각 PBS로 세정하고, 신경 세포 분산액(WAKO사제, 파파인을 포함함)을 사용하여 37℃에서 30분간 정도 효소 처리하여, 캡과 링 각각의 단일 세포 현탁액을 얻었다. 얻어진 캡과 링 각각의 단일 세포 현탁액을, 고정액(BD사제, CytoFix)을 사용하여 고정하고, FACS용 샘플을 얻었다. FACS용 샘플을, 혈청을 포함하는 Perm/Wash액(BD사제)액을 사용하여 블로킹과 펀칭을 행하고, 형광 표지한 이하의 항체, 항Chx10 항체(Santa Cruz사제), 항Crx 항체(Santa Cruz사제), 항SSEA-4 항체로 면역 염색을 행하였다. 면역 염색의 음성 대조로서 이소타입 컨트롤(Isotype control)을 사용하였다. 그리고 애널라이저(BD사제)를 사용하여, 플로우 사이토메트리로 해석하였다. Chx10 양성 세포의 비율, Crx 양성 세포, SSEA-4 양성 세포의 비율을, 각각의 이소타입 컨트롤과의 차분으로 산출하였다. 그 결과를 표 16에 기재하였다.
Figure pct00016
캡 샘플에서는, 신경 망막 전구 세포 마커인 Chx10 양성 세포의 비율이 29.4％, 시세포 전구 세포 마커인 Crx 양성 세포의 비율이 21.7％, 다능성 줄기 세포 마커(목적외 세포)인 SSEA-4 양성 세포의 비율이 1％ 미만이었다. 링 샘플에서는, 신경 망막 전구 세포 마커인 Chx10 양성 세포의 비율이 28.1％, 시세포 전구 세포 마커인 Crx 양성 세포의 비율이 15.8％, 다능성 줄기 세포 마커(목적외 세포)인 SSEA-4 양성 세포의 비율이 1％ 미만이었다.
이들 결과로부터, 먼저 이 캡 샘플 및 링 샘플은, Chx10 양성 세포와 Crx 양성 세포를 포함하는 신경 망막이며, 미분화 iPS 세포를 실질적으로 포함하지 않는 것을 알았다. 그리고, 캡 샘플에 포함되는 Chx10 양성 세포와 Crx 양성 세포의 비율이, 링 샘플에 포함되는 Chx10 양성 세포와 Crx 양성 세포의 비율과 동등한 것을 실증할 수 있었다. 그리고, 링 샘플이 신경 망막이면, 캡도 신경 망막인 것을 실증할 수 있었다.
그리고, 이들 캡이나 링(바람직하게는 캡)을 이식용 신경 망막 시트로서 사용하는 경우, 이 이식용 신경 망막 시트에 포함되는 Chx10 양성(신경 망막 전구 세포 분획)은 약 30％ 정도(20 내지 40％ 정도), Crx 양성 세포 분획(시세포 전구 세포 분획)은 약 17％ 정도(10 내지 30％ 정도)인 것을 알았다.
본원의 방법에서는, 품질 평가의 방법으로서 다샘플·다유전자를 평가하는 정량 PCR법의 유용성을 실증해왔지만, 면역 염색법 중 하나인 플로우 사이토메트리 해석으로도 품질 평가를 실시할 수 있는 것을 알았다.
이상의 결과로부터, 상피 구조를 갖는 상피 조직(바람직하게는 신경 상피, 보다 바람직하게는 신경 망막)을 포함하는 세포 응집체에 있어서, 하나의 상피 구조로부터 캡과 링을 단리하고, 링의 유전자 발현을 검사함으로써, 캡의 품질을 담보할 수 있는 것을 알았다. 유전자 발현을 검사하는 방법은, 정량 PCR법이어도, 면역 염색법이어도 유용한 것을 알았다. 그리고 이 품질 검사의 방법론을, 상피 구조를 갖는 상피 조직이 신경 망막인 경우에도, 비신경 망막인 경우에도 적용할 수 있는 것을 알았다.
본 발명에 따르면, 이식용 신경 망막의 품질을 평가하는 방법 및 당해 방법에 의해 선택된 이식용 신경 망막 시트를 제공하는 것이 가능해진다.

Claims (27)

  1. 이식용 신경 망막의 품질을 평가하는 방법이며,
    상기 방법은,
    다능성 줄기 세포 유래의 상피 구조를 갖는 신경 망막을 포함하는 세포 응집체의 일부 또는 전부를 품질 평가용 샘플로서 추출하는 것과,
    상기 품질 평가용 샘플 중의 신경 망막계 세포 관련 유전자 및 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현을 검출하는 것과,
    상기 신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인되고, 또한 상기 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인되지 않을 경우에,
    (1) 상기 일부인 품질 평가용 샘플을 포함하는 세포 응집체와 동일한 세포 응집체에 있어서의 상기 신경 망막(이식용 신경 망막),
    (2) 상기 일부인 상기 품질 평가용 샘플을 포함하는 세포 응집체와 동일 로트의 세포 응집체에 있어서의 상기 신경 망막(이식용 신경 망막), 또는
    (3) 상기 전부인 상기 품질 평가용 샘플의 세포 응집체와 동일 로트의 세포 응집체에 있어서의 상기 신경 망막(이식용 신경 망막)
    을, 이식용 신경 망막으로서 사용 가능하다고 판정하는 것을 포함하고,
    상기 비신경 망막계 세포 관련 유전자가 뇌척수 조직 마커 유전자 및 안구 관련 조직 마커 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 뇌척수 조직 마커 유전자가 종뇌 마커 유전자, 간뇌·중뇌 마커 유전자 및 척수 마커 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자이며,
    상기 안구 관련 조직 마커 유전자가 optic stalk 마커 유전자, 모양체 마커 유전자, 수정체 마커 유전자 및 망막 색소 상피 마커 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 종뇌 마커 유전자가 FoxG1, Emx2, Dlx2, Dlx1 및 Dlx5로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하고,
    상기 간뇌·중뇌 마커 유전자가 OTX1, OTX2, DMBX1, Rx, Nkx2.1, OTP, FGFR2, EFNA5 및 GAD1로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하고,
    상기 척수 마커 유전자가 HOXD4, HOXD3, HOXD1, HOXC5, HOXA5 및 HOXB2로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하고,
    상기 Optic Stalk 마커 유전자가 GREM1, GPR17, ACVR1C, CDH6, Pax2, Pax8, GAD2 및 SEMA5A로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하고,
    상기 모양체 마커 유전자가 Zic1, MAL, HNF1beta, FoxQ1, CLDN2, CLDN1, GPR177, AQP1 및 AQP4로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하고,
    상기 수정체 마커 유전자가 CRYAA 및 CRYBA1로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하고,
    상기 망막 색소 상피 마커 유전자가 MITF, TTR 및 BEST1로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비신경 망막계 세포 관련 유전자가 미분화 다능성 줄기 세포 마커 유전자를 더 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 미분화 다능성 줄기 세포 마커 유전자가 Oct3/4, Nanog 및 lin28로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 품질 평가용 샘플의 세포 응집체와 동일 로트의 세포 응집체가, 상기 이식용 신경 망막과 동등한 유전자 발현 프로파일을 나타내는 조건 하에서 제조된 세포 응집체인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 품질 평가용 샘플이 세포 응집체의 일부이며,
    상기 신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인되고, 또한 상기 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인되지 않을 경우에, 상기 일부인 품질 평가용 샘플을 포함하는 세포 응집체와 동일한 세포 응집체에 있어서의 해당 일부와 적어도 일부에 있어서 연속 또는 근접해있던 신경 망막을, 이식용 신경 망막으로서 사용 가능하다고 판정하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 이식용 신경 망막이 상기 품질 평가용 샘플과 동일한 상피 조직에 포함되는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 이식용 신경 망막이 상기 동일한 상피 조직의 중심 부근을 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 이식용 신경 망막이 연속 상피 조직인 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 망막을 포함하는 세포 응집체가, 상기 이식용 신경 망막을 포함하는 제1 상피 조직, 및 상기 제1 상피 조직의 표면에 있어서의 접선의 기울기의 연속성과 다른 표면의 접선의 기울기의 연속성을 가지며, 또한 비신경 망막계 세포를 포함하는 제2 상피 조직을 포함하고,
    상기 이식용 신경 망막이 상기 제2 상피 조직으로부터 가장 떨어진 제1 상피 조직 상의 영역을 포함하고,
    상기 품질 평가용 샘플이 상기 제2 상피 조직과 상기 이식용 신경 망막 사이에 존재하는 일부인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제2 상피 조직이 안구 관련 조직 및/또는 뇌척수 조직인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 안구 관련 조직이 망막 색소 상피 세포 및 모양체를 포함하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 망막계 세포 관련 유전자 및 상기 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현의 검출은, 정량 PCR에 의해 행하는 것을 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 이하의 기준 1 및 기준 2를 충족하는 경우에, 이식용 신경 망막으로서 사용 가능하다고 판정하는 것을 포함하는 방법.
    기준 1: 상기 신경 망막계 세포 관련 유전자의 Threshold Cycle(임계 사이클)(Ct)값과 내부 표준 유전자의 Ct값의 차(ΔCt값)가 10 이하
    기준 2: 상기 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 Ct값과 내부 표준 유전자의 Ct값의 차(ΔCt값)가 5 이상
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 정량 PCR이 하기 (1) 내지 (4)의 공정을 포함하는 방법에 의해 행해지고, 그것에 의해, 2 이상의 상기 품질 평가용 샘플에 있어서의, 각각의 신경 망막계 세포 관련 유전자 및 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현량을 동시에 검출하는 방법.
    (1) 1군의 8 이상 800 이하인 독립된 샘플 웰을 포함하는 샘플 웰군, 1군 이상의 8 이상 800 이하인 독립된 프라이머 웰을 포함하는 프라이머 웰군, 및 샘플 웰군에 있어서의 독립된 샘플 웰과 각각의 프라이머 웰군에 있어서의 독립된 프라이머 웰을 연결하는 유로를 갖는 유로 플레이트와, 2 이상의 상기 품질 평가용 샘플로부터 얻어진 핵산을 함유하는 용액(샘플 용액)과, 1 이상의 상기 신경 망막계 세포 관련 유전자 또는 상기 비신경 망막계 세포 관련 유전자에 특이적인 프라이머를 1 또는 복수 함유하는 용액(프라이머 용액)을 준비하는 것,
    (2) 샘플 웰군에 있어서, 상기 샘플 용액을 상기 품질 평가용 샘플마다 1 샘플 용액/1 샘플 웰이 되도록 첨가하는 것,
    (3) 상기 1 이상의 프라이머 웰군에 있어서, 상기 프라이머 용액을, 다른 프라이머 웰군이 되도록, 1 이상의 프라이머 웰에 첨가하는 것,
    (4) 상기 유로를 통해, 상기 핵산에 대하여 상기 프라이머를 따로따로 혼합하는 것, 및
    (5) (4)에서 얻어진 혼합액을 사용하여 정량 PCR을 행하는 것.
  17. 신경 망막 시트이며,
    (1) 다능성 줄기 세포 유래이며,
    (2) 3차원 구조를 갖고,
    (3) 시세포층 및 내층을 포함하는 복수의 층 구조를 갖는 신경 망막층을 포함하고,
    (4) 상기 시세포층이 시세포 전구 세포 및 시세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 세포를 포함하고,
    (5) 상기 내층이 망막 전구 세포, 신경절 세포, 아마크린 세포 및 쌍극 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 세포를 포함하고,
    (6) 상기 신경 망막층의 표면이 정상 단부면을 갖고,
    (7) 상기 정상 단부면을 따라서 존재하는 시세포층의 내측에 상기 내층이 존재하고,
    (8) 상기 신경 망막 시트의 표면의 총 면적에 대하여, 상기 신경 망막층의 면적이 50％ 이상이며,
    (9) 상기 신경 망막층의 정상 단부면의 총 면적에 대하여, 연속 상피 구조의 면적이 80％ 이상이며,
    (10) 상기 신경 망막 시트 중의 신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인되고, 또한 비신경 망막계 세포 관련 유전자의 발현이 확인되지 않고, 상기 비신경 망막계 세포 관련 유전자가 뇌척수 조직 마커 유전자 및 안구 관련 조직 마커 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는
    신경 망막 시트.
  18. 제17항에 있어서, 긴 직경이 600㎛ 내지 2500㎛인 신경 망막 시트.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 짧은 직경이 200㎛ 내지 1500㎛인 신경 망막 시트.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 높이가 100㎛ 내지 1000㎛인 신경 망막 시트.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 망막 시트가,
    (1) 신경 망막을 포함하는 세포 응집체로부터 단리된 것이며,
    (2) 해당 세포 응집체에 있어서의 연속 상피 조직의 중심 부근의 영역을 포함하며, 또한
    (3) 긴 직경이 600㎛ 내지 2500㎛, 짧은 직경이 200㎛ 내지 1500㎛ 및 높이가 100㎛ 내지 1000㎛인
    신경 망막 시트.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 망막 시트가,
    (1) 적어도 제1 상피 조직 및 제2 상피 조직을 포함하는 세포 응집체로부터 단리된 것이며,
    상기 세포 응집체는, 상기 제1 상피 조직은 인간 신경 망막을 포함하고, 상기 제2 상피 조직은 상기 제1 상피 조직의 표면에 있어서의 접선의 기울기의 연속성과 다른 표면의 접선의 기울기의 연속성을 가지며, 또한 비신경 망막계 세포를 포함하고,
    (2) 상기 제2 상피 조직으로부터 가장 떨어진 상기 제1 상피 조직 상의 영역을 포함하며, 또한
    (3) 긴 직경이 600㎛ 내지 2500㎛이며, 짧은 직경이 200㎛ 내지 1500㎛이며, 높이가 100㎛ 내지 1000㎛이며,
    상기 제2 상피 조직이 안구 관련 조직, 뇌척수 조직 및 그 밖의 제1 상피 조직의 신경 망막과는 다른 조직으로 이루어지는 군에서 선택되는 조직인 신경 망막 시트.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재된 신경 망막 시트를 포함하는 의약 조성물.
  24. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재된 신경 망막 시트를, 이식을 필요로 하는 대상에 이식하는 것을 포함하는, 신경 망막계 세포 혹은 신경 망막의 장애 또는 신경 망막의 손상에 기초하는 질환의 치료 방법.
  25. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 사용하여, 다능성 줄기 세포 유래의 상피 구조를 갖는 신경 망막을 포함하는 세포 응집체를 평가하고, 이식용 신경 망막으로서 사용 가능하다고 판정된 이식용 신경 망막을 선별하는 것, 및
    상기 선별된 이식용 신경 망막을 단리하는 것
    을 포함하는, 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재된 신경 망막 시트의 제조 방법.
  26. 2개 이상 800개 이하의, 다능성 줄기 세포 유래의 상피 구조를 갖는 신경 망막을 포함하는 세포 응집체로부터, 당해 세포 응집체의 일부인 품질 평가용 샘플을 각각 추출하는 것,
    상기 추출된 2개 이상 800개 이하의 품질 평가용 샘플을, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 평가하고, 이식용 신경 망막으로서 사용 가능하다고 판정된 이식용 신경 망막을 선별하는 것, 및
    상기 선별된 이식용 신경 망막을 단리하는 것
    을 포함하는 신경 망막 시트의 제조 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 세포 응집체가 다능성 줄기 세포를 분화 유도하여 얻어진, 적어도 제1 상피 조직 및 제2 상피 조직을 포함하는 세포 응집체이며, 상기 제1 상피 조직은 인간 신경 망막을 포함하고, 상기 제2 상피 조직은 상기 제1 상피 조직의 표면에 있어서의 접선의 기울기의 연속성과 다른 표면의 접선의 기울기의 연속성을 가지며, 또한 비신경 망막계 세포를 포함하고,
    상기 이식용 신경 망막의 단리는 상기 세포 응집체로부터, 상기 이식용 신경 망막이 상기 제2 상피 조직으로부터 가장 떨어진 상기 제1 상피 조직 상의 영역을 포함하도록 단리하는 것인
    제조 방법.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2018308976A1 (en) * 2017-07-31 2020-02-20 Biotime, Inc. Compositions and methods for restoring or preventing loss of vision caused by disease or traumatic injury
WO2022138803A1 (ja) * 2020-12-24 2022-06-30 国立研究開発法人理化学研究所 視細胞を含む層状の網膜組織の促成製造方法
WO2024085251A1 (ja) * 2022-10-21 2024-04-25 住友ファーマ株式会社 網膜移植物の品質を評価する方法
WO2024143436A1 (ja) * 2022-12-28 2024-07-04 株式会社VC Cell Therapy 網膜シートの製造方法
CN117551612B (zh) * 2024-01-12 2024-03-08 苏州艾凯利元生物科技有限公司 一种视网膜类器官及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017090741A1 (ja) 2015-11-25 2017-06-01 国立研究開発法人理化学研究所 細胞塊に関する領域検出方法及び領域検出装置

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
EP0873361B1 (en) 1995-12-13 2006-11-02 The Regents Of The University Of California Crystals of the ligand-binding domain of the thyroid hormone receptor complexed to a ligand
GB9828442D0 (en) 1998-12-24 1999-02-17 Karobio Ab Novel thyroid receptor ligands and method II
US6344481B1 (en) 1999-03-01 2002-02-05 Pfizer Inc. Thyromimetic antiobesity agents
US6280718B1 (en) 1999-11-08 2001-08-28 Wisconsin Alumni Reasearch Foundation Hematopoietic differentiation of human pluripotent embryonic stem cells
EP1148054B1 (en) 2000-04-21 2005-11-23 Pfizer Products Inc. Thyroid receptor ligands
GB0015205D0 (en) 2000-06-21 2000-08-09 Karobio Ab Bioisosteric thyroid receptor ligands and method
WO2002051805A1 (de) 2000-12-27 2002-07-04 Bayer Aktiengesellschaft Indol-derivate
JP4225791B2 (ja) 2001-05-18 2009-02-18 キッセイ薬品工業株式会社 肝癌の予防または再発抑制剤
DK1262177T3 (da) 2001-05-31 2006-11-20 Pfizer Prod Inc Medicinsk brug af thyromimetiske forbindelser til behandling af hårtab og kompositioner
WO2002101057A1 (fr) 2001-06-08 2002-12-19 Dnavec Research Inc. Transfert genique dans des cellules souches embryonnaires de primate a l'aide d'un virus de l'immunodeficience simienne de pseudo type vsv-g utilise comme vecteur
US7279593B2 (en) 2001-08-24 2007-10-09 Karo Bio Ab Prime ring substituted thyroid receptor antagonists for the treatment of cardiac and metabolic disorders
US7230031B2 (en) 2002-01-30 2007-06-12 Kissei Pharmaceutical Co., Ltd. Thyroid hormone receptor ligand, medicinal compositions containing the same and use thereof
GB0208384D0 (en) 2002-04-11 2002-05-22 Karobio Ab Novel compounds
AU2003225305A1 (en) 2002-05-08 2003-11-11 Bristol-Myers Squibb Company Pyridine-based thyroid receptor ligands
JP2006516620A (ja) 2003-01-24 2006-07-06 ブリストル−マイヤーズ　スクイブ　カンパニー 甲状腺受容体におけるシクロアルキル含有アニリドリガンド
US7557143B2 (en) 2003-04-18 2009-07-07 Bristol-Myers Squibb Company Thyroid receptor ligands
US7220815B2 (en) 2003-07-31 2007-05-22 E.I. Du Pont De Nemours And Company Sulfonated aliphatic-aromatic copolyesters and shaped articles produced therefrom
PT1919878E (pt) 2005-07-21 2010-11-02 Hoffmann La Roche Derivados de piridazinona como agonistas do receptor da hormona da tiróide
WO2007132475A1 (en) 2006-05-15 2007-11-22 Cadila Healthcare Limited Selective tr-beta 1 agonist
EP2314671B1 (en) 2008-06-06 2022-08-03 Riken Method for culture of stem cell
KR101829182B1 (ko) * 2009-04-02 2018-03-29 플루이다임 코포레이션 표적 핵산의 바코딩을 위한 멀티 프라이머 증폭 방법
AU2010240200B2 (en) 2009-04-20 2014-03-13 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Novel thyroid hormone beta receptor agonist
CN102712900B (zh) * 2009-10-06 2015-07-01 首尔大学校产学协力团 干细胞分化成为视网膜细胞的方法
US10793830B2 (en) * 2009-11-05 2020-10-06 Riken Method for producing retinal tissue in vitro
ES2733956T3 (es) 2011-11-25 2019-12-03 Sumitomo Chemical Co Métodos para producir tejido retiniano y células relacionadas con la retina
CN111607557A (zh) * 2012-06-08 2020-09-01 住友化学株式会社 用于产生睫状边缘带样结构的方法
EP2796545A1 (en) * 2013-04-26 2014-10-29 Université Pierre et Marie Curie (Paris 6) Methods for obtaining retinal progenitors, retinal pigmented epithelial cells and neural retinal cells
CN105683366B (zh) 2013-08-23 2020-11-06 住友化学株式会社 用于制备视网膜组织和视网膜相关细胞的方法
JP6495830B2 (ja) * 2013-12-11 2019-04-03 住友化学株式会社 毛様体周縁部様構造体の製造法
CA2965609A1 (en) 2014-10-24 2016-04-28 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. Production method for retinal tissue
WO2016063985A1 (ja) 2014-10-24 2016-04-28 大日本住友製薬株式会社 神経組織の製造方法
CA3019357A1 (en) * 2016-04-04 2017-10-12 Biotime, Inc. Pluripotent stem cell-derived 3d retinal tissue and uses thereof
KR102388863B1 (ko) * 2016-04-22 2022-04-22 다이닛본 스미토모 세이야꾸 가부시끼가이샤 망막 조직의 제조 방법
CA3070215A1 (en) 2017-07-20 2019-01-24 Riken Method for maturation of retinal tissue containing continuous epithelium
CA3070212A1 (en) * 2017-07-20 2019-01-24 Riken Method for preserving neural tissue

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017090741A1 (ja) 2015-11-25 2017-06-01 国立研究開発法人理化学研究所 細胞塊に関する領域検出方法及び領域検出装置

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Eiraku M. et al., "Self-organized Formation of Polarized Cortical Tissues From ESCs and Its Active Manipulation by Extrinsic Signals", Cell Stem Cell, 3(5), 519-32(2008)
Eiraku M. et al., "Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture", Nature, 472, 51-56(2011)
Kawahara A. et al., "Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue" Nature Communications, 6, 6286(2015)
Nakano T. et al., "Self-formation of Optic Cups and Storable Stratified Neural Retina From Human ESCs" Cell Stem Cell, 10(6), 771-775(2012)

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Publication number Publication date
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