TWI841701B - 評價移植用神經視網膜之品質之方法及移植用神經視網膜片 - Google Patents

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TWI841701B
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渡健治
松下恵三
山﨑優
万代道子
高橋政代
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Abstract

本發明之評價移植用神經視網膜之品質之方法包括：對包含來自多能性幹細胞之具有上皮結構之神經視網膜的細胞凝集體之一部分或全部進行取樣而作為品質評價用樣品；檢測品質評價用樣品中之神經視網膜系細胞相關基因及非神經視網膜系細胞相關基因之表現；及於見到神經視網膜系細胞相關基因之表現且未見到非神經視網膜系細胞相關基因之表現之情形時，判定為可使用(1)與包含作為一部分之品質評價用樣品之細胞凝集體相同之細胞凝集體中之神經視網膜(移植用神經視網膜)、(2)與包含作為一部分之品質評價用樣品之細胞凝集體為同一批次之細胞凝集體中之神經視網膜(移植用神經視網膜)、或(3)與作為全部之品質評價用樣品之細胞凝集體為同一批次之細胞凝集體中之神經視網膜(移植用神經視網膜)作為移植用神經視網膜；且非神經視網膜系細胞相關基因包含選自由腦脊髓組織標記基因及眼球相關組織標記基因所組成之群中之1種以上之基因。

Description

評價移植用神經視網膜之品質之方法及移植用神經視網膜片
本發明係關於一種評價移植用神經視網膜之品質之方法及移植用神經視網膜片，尤其是關於一種評價來自多能性幹細胞之移植用神經視網膜之品質之方法及來自多能性幹細胞之移植用神經視網膜片。
於活體之神經組織中，1種或複數種神經系統細胞形成層結構。神經組織之一的視網膜組織主要包含視細胞、雙極細胞、水平細胞、無軸突神經細胞、及神經節細胞之5種神經細胞與神經膠細胞，形成立體之層結構。作為對於神經疾病、例如對於視網膜變性疾病之治療法，業界提示使用神經組織之移植治療有效，但難以獲得反映人類之活體之神經組織之層結構與功能得以維持之組織，而難以作為治療法一般化。近年來，由多能性幹細胞分化誘導而製造神經組織(例如視網膜組織)成為可能(非專利文獻1、2、3及4)。
來自多能性幹細胞之視網膜組織包含多種視網膜層特異性神經細胞，並且形成層結構而構成，因此具有非常複雜之結構。於將此種具有非常複雜之結構之視網膜組織用作移植用之細胞醫藥時，特別要求嚴格管理其品質。作為神經視網膜之品質評價方法，存在對細胞凝集體中之連續上皮結構之有無進行分析之圖像分析方法等方法(專利文獻1)。 先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：WO2017/090741 非專利文獻
非專利文獻1：Eiraku M. et al., “Self-organized Formation of Polarized Cortical Tissues From ESCs and Its Active Manipulation by Extrinsic Signals”, Cell Stem Cell, 3(5), 519-32(2008) 非專利文獻2：Eiraku M. et al., “Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture”, Nature, 472, 51-56(2011) 非專利文獻3：Nakano T. et al., “Self-formation of Optic Cups and Storable Stratified Neural Retina From Human ESCs ” Cell Stem Cell, 10(6), 771-775(2012) 非專利文獻4：Kawahara A. et al., “ Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue” Nature Communications, 6, 6286(2015)
[發明所欲解決之問題]
因此，本發明鑒於上述情況，其目的在於提供一種評價移植用神經視網膜之品質之方法及藉由該方法篩選出之移植用神經視網膜片。 [解決問題之技術手段]
本發明者等人進行了銳意研究，結果發現，於包含來自多能性幹細胞之神經視網膜之細胞凝集體之製造過程中，一部分細胞凝集體存在除了視網膜層特異性神經細胞(目標細胞，神經視網膜系細胞(neural retina-related cell))以外，會副產視網膜層特異性神經細胞以外之細胞(目標外細胞，非神經視網膜系細胞(Non-neural retina-related cell))之可能性。此外，對複數個樣品綜合性地分析了基因表現等，結果判明有副產之可能性之目標外細胞係腦脊髓組織及眼球相關組織。進而，對腦脊髓組織及眼球相關組織進行了詳細分析，結果亦判明：作為腦脊髓組織，可能副產端腦(大腦)、間腦(包括下丘腦)、中腦、及脊髓；作為眼球相關組織，可能副產視網膜色素上皮(RPE)、睫狀體、晶狀體及optic stalk(視柄及視神經組織)。
本發明者等人根據該等新穎之見解，發現藉由對與目標細胞相關之基因之表現及與目標外細胞相關之基因之表現進行分析，而可評價是否為適於移植之神經視網膜，又，藉此可篩選出移植用神經視網膜，從而完成本發明。
即，本發明係關於以下。 [1] 一種評價移植用神經視網膜之品質之方法， 上述方法包括： 對包含來自多能性幹細胞之具有上皮結構之神經視網膜的細胞凝集體之一部分或全部進行取樣而作為品質評價用樣品； 檢測上述品質評價用樣品中之神經視網膜系細胞相關基因及非神經視網膜系細胞相關基因之表現；及 於見到上述神經視網膜系細胞相關基因之表現，且未見到上述非神經視網膜系細胞相關基因之表現之情形時，判定為可使用 (1)與包含作為上述一部分之品質評價用樣品之細胞凝集體相同之細胞凝集體中之上述神經視網膜(移植用神經視網膜)、 (2)與包含作為上述一部分之品質評價用樣品之細胞凝集體為同一批次之細胞凝集體中之上述神經視網膜(移植用神經視網膜)、或 (3)與作為上述全部之品質評價用樣品之細胞凝集體為同一批次之細胞凝集體中之上述神經視網膜(移植用神經視網膜) 作為移植用神經視網膜，且 上述非神經視網膜系細胞相關基因包含選自由腦脊髓組織標記基因及眼球相關組織標記基因所組成之群中之1種以上之基因。 [2] 如上述[1]所記載之方法，其中上述腦脊髓組織標記基因為選自由端腦標記基因、間腦/中腦標記基因、及脊髓標記基因所組成之群中之1種以上之基因， 上述眼球相關組織標記基因為選自由optic stalk標記基因、睫狀體標記基因、晶狀體標記基因及視網膜色素上皮標記基因所組成之群中之1種以上之基因。 [3] 如上述[2]所記載之方法，其中上述端腦標記基因包含選自由FoxG1、Emx2、Dlx2、Dlx1及Dlx5所組成之群中之1種以上之基因， 上述間腦/中腦標記基因包含選自由OTX1、OTX2、DMBX1、Rx、Nkx2.1、OTP、FGFR2、EFNA5及GAD1所組成之群中之1種以上之基因， 上述脊髓標記基因包含選自由HOXD4、HOXD3、HOXD1、HOXC5、HOXA5及HOXB2所組成之群中之1種以上之基因， 上述Optic Stalk標記基因包含選自由GREM1、GPR17、ACVR1C、CDH6、Pax2、Pax8、GAD2及SEMA5A所組成之群中之1種以上之基因， 上述睫狀體標記基因包含選自由Zic1、MAL、HNF1beta、FoxQ1、CLDN2、CLDN1、GPR177、AQP1及AQP4所組成之群中之1種以上之基因， 上述晶狀體標記基因包含選自由CRYAA及CRYBA1所組成之群中之1種以上之基因， 上述視網膜色素上皮標記基因包含選自由MITF、TTR及BEST1所組成之群中之1種以上之基因。 [4] 如上述[1]至[3]中任一項所記載之方法，其中上述非神經視網膜系細胞相關基因進而包含未分化多能性幹細胞標記基因。 [5] 如上述[4]所記載之方法，其中上述未分化多能性幹細胞標記基因包含選自由Oct3/4、Nanog及lin28所組成之群中之1種以上之基因。 [6] 如上述[1]至[5]中任一項所記載之方法，其中與上述品質評價用樣品之細胞凝集體為同一批次之細胞凝集體係於呈現出與上述移植用神經視網膜同等之基因表現圖譜之條件下所製造之細胞凝集體。 [6-1] 如上述[1]至[6]中任一項所記載之方法，其中上述移植用神經視網膜包含上皮組織之中心附近。 [6-2] 如上述[1]至[6]、[6-1]中任一項所記載之方法，其中上述移植用神經視網膜為連續上皮組織。 [7] 如上述[1]至[6]中任一項所記載之方法，其中上述品質評價用樣品為細胞凝集體之一部分， 於見到上述神經視網膜系細胞相關基因之表現，且未見到上述非神經視網膜系細胞相關基因之表現之情形時，判定為可使用如下之神經視網膜作為移植用神經視網膜：其至少一部分與和包含作為上述一部分之品質評價用樣品之細胞凝集體相同之細胞凝集體中的該一部分連續或接近。 [8] 如上述[7]所記載之方法，其中上述移植用神經視網膜與上述品質評價用樣品包含於同一上皮組織中。 [9] 如上述[8]所記載之方法，其中上述移植用神經視網膜包含上述同一上皮組織之中心附近。 [10] 如上述[9]所記載之方法，其中上述移植用神經視網膜為連續上皮組織。 [11] 如上述[7]至[10]中任一項所記載之方法，其中包含上述神經視網膜之細胞凝集體包含第一上皮組織、及第二上皮組織，上述第一上皮組織包含上述移植用神經視網膜，上述第二上皮組織具有與上述第一上皮組織之表面之切線斜率之連續性不同的表面之切線斜率之連續性，且包含非神經視網膜系細胞， 上述移植用神經視網膜包含距上述第二上皮組織最遠之第一上皮組織上之區域， 上述品質評價用樣品係存在於上述第二上皮組織與上述移植用神經視網膜之間之一部分。 [12] 如上述[11]所記載之方法，其中上述第二上皮組織係眼球相關組織及/或腦脊髓組織。 [13] 如上述[12]所記載之方法，其中上述眼球相關組織包含視網膜色素上皮細胞及睫狀體。 [14] 如上述[1]至[13]中任一項所記載之方法，其中上述神經視網膜系細胞相關基因及上述非神經視網膜系細胞相關基因之表現之檢測包括藉由定量PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈鎖反應)進行。 [15] 如上述[14]所記載之方法，其包括於滿足以下之基準1及基準2之情形時，判定為可用作移植用神經視網膜。 基準1：上述神經視網膜系細胞相關基因之閾值循環(Threshold Cycle)(Ct)值與內部標準基因之Ct值之差(ΔCt值)為10以下 基準2：上述非神經視網膜系細胞相關基因之Ct值與內部標準基因之Ct值之差(ΔCt值)為5以上 [16] 如上述[14]或[15]所記載之方法，其中上述定量PCR係藉由包括下述(1)～(5)之步驟之方法進行，藉此同時檢測2個以上之上述品質評價用樣品中各自之神經視網膜系細胞相關基因及非神經視網膜系細胞相關基因之表現量。 (1)準備流路板、由2個以上之上述品質評價用樣品獲得之含有核酸之溶液(樣品溶液)、含有1種或複數種對1種以上之上述神經視網膜系細胞相關基因或上述非神經視網膜系細胞相關基因具有特異性之引子之溶液(引子溶液)，該流路板具有1組包含8個以上800個以下之獨立之樣品孔的樣品孔組、1組以上包含8個以上800個以下之獨立之引子孔的引子孔組、及將樣品孔組中之獨立之樣品孔與各引子孔組中之獨立之引子孔相連之流路； (2)於樣品孔組中，以每個上述品質評價用樣品成為1種樣品溶液/1個樣品孔之方式添加上述樣品溶液； (3)於上述1組以上之引子孔組中，將上述引子溶液以成為不同之引子孔組之方式添加至1個以上之引子孔中； (4)經由上述流路，將上述引子分別混合於上述核酸中；及 (5)使用(4)中獲得之混合液進行定量PCR。 [17] 一種神經視網膜片，其特徵在於： (1)其源自多能性幹細胞： (2)其具有三維結構； (3)其包含神經視網膜層，該神經視網膜層具有包含視細胞層及內層之複數個層結構； (4)上述視細胞層包含選自由視細胞前驅細胞及視細胞所構成之群中之1種以上之細胞； (5)上述內層包含選自由視網膜前驅細胞、神經節細胞、無軸突神經細胞及雙極細胞所構成之群中之1種以上之細胞； (6)上述神經視網膜層之表面具有頂端面； (7)上述內層存在於沿上述頂端面而存在之視細胞層之內側； (8)相對於上述神經視網膜片之表面之總面積，上述神經視網膜層之面積為50%以上； (9)相對於上述神經視網膜層之頂端面之總面積，連續上皮結構之面積為80%以上； (10)見到上述神經視網膜片中之神經視網膜系細胞相關基因之表現，且未見非神經視網膜系細胞相關基因之表現，上述非神經視網膜系細胞相關基因包含選自由腦脊髓組織標記基因及眼球相關組織標記基因所組成之群中之1種以上之基因。 [18] 如上述[17]所記載之神經視網膜片，其長徑為600 μm～2500 μm、。 [19] 如上述[17]或[18]所記載之神經視網膜片，其短徑為200 μm～1500 μm。 [20] 如上述[17]至[19]中任一項所記載之神經視網膜片，其高度為100 μm～1000 μm。 [21] 如上述[17]至[20]中任一項所記載之神經視網膜片，其中上述神經視網膜片 (1)為自包含神經視網膜之細胞凝集體單離者， (2)包含該細胞凝集體中之連續上皮組織之中心附近之區域，且 (3)長徑為600 μm～2500 μm，短徑為200 μm～1500 μm，高度為100 μm～1000 μm。 [22] 如上述[17]至[21]中任一項所記載之神經視網膜片，其中上述神經視網膜片 (1)為自至少包含第一上皮組織及第二上皮組織之細胞凝集體單離者， 上述細胞凝集體中，上述第一上皮組織包含人類神經視網膜，上述第二上皮組織具有與上述第一上皮組織之表面之切線斜率之連續性不同的表面之切線斜率之連續性，且包含非神經視網膜系細胞， (2)包含距上述第二上皮組織最遠之上述第一上皮組織上之區域，且 (3)長徑為600 μm～2500 μm，短徑為200 μm～1500 μm，高度為100 μm～1000 μm， 上述第二上皮組織係選自由眼球相關組織、腦脊髓組織及其他與第一上皮組織之神經視網膜不同之組織所組成之群中之組織。 [23] 如上述[17]至[22]中任一項所記載之神經視網膜片，其中上述神經視網膜片中之Rx陽性細胞相對於總細胞數之比率為30%以上80%以下、40%以上70%以下、45%以上60%以下、或50%以上60%以下。 [24] 如上述[17]至[23]中任一項所記載之神經視網膜片，其中上述神經視網膜片中之Chx10陽性細胞相對於總細胞數之比率為10%以上80%以下、20%以上70%以下、30%以上60%以下、或40%以上50%以下。 [25] 如上述[17]至[24]中任一項所記載之神經視網膜片，其中上述神經視網膜片中之Pax6陽性細胞相對於總細胞數之比率為10%以上80%以下、20%以上70%以下、30%以上60%以下、或40%以上50%以下。 [26] 如上述[17]至[25]中任一項所記載之神經視網膜片，其中上述神經視網膜片中之Crx陽性細胞相對於總細胞數之比率為10%以上70%以下、10%以上60%以下、20%以上60%以下、30%以上60%以下、40%以上60%以下、或50%以上60%以下。 [27] 一種醫藥組合物，其包含如上述[17]至[26]中任一項所記載之神經視網膜片。 [28] 一種治療方法，其係基於神經視網膜系細胞或神經視網膜之障礙或者神經視網膜之損傷的疾病之治療方法，其包括對需要移植之對象移植如上述[17]至[26]中任一項所記載之神經視網膜片。 [29] 一種如上述[17]至[26]中任一項所記載之神經視網膜片之製造方法，其包括： 使用如上述[1]至[16]中任一項所記載之方法，對包含來自多能性幹細胞之具有上皮結構之神經視網膜的細胞凝集體進行評價，篩選出判定為可用作移植用神經視網膜之移植用神經視網膜；及 將上述篩選出之移植用神經視網膜單離。 [30] 一種神經視網膜片之製造方法，其包括： 自2個以上800個以下之包含來自多能性幹細胞之具有上皮結構之神經視網膜的細胞凝集體分別取樣作為該細胞凝集體之一部分之品質評價用樣品； 藉由如上述[1]至[16]中任一項所記載之方法對上述所取樣之2個以上800個以下之品質評價用樣品進行評價，篩選出判定為可用作移植用神經視網膜之移植用神經視網膜；及 將上述篩選出之移植用神經視網膜單離。 [31] 如上述[29]或[30]所記載之製造方法，其中上述細胞凝集體係將多能性幹細胞分化誘導而獲得的至少包含第一上皮組織及第二上皮組織者，上述第一上皮組織包含人類神經視網膜，上述第二上皮組織具有與上述第一上皮組織之表面之切線斜率之連續性不同的表面之切線斜率之連續性，且包含非神經視網膜系細胞， 上述移植用神經視網膜之單離係以上述移植用神經視網膜包含距上述第二上皮組織最遠之上述第一上皮組織上之區域之方式自上述細胞凝集體單離。 [發明之效果]
根據本發明，可提供一種評價移植用神經視網膜之品質之方法及藉由該方法篩選出之移植用神經視網膜片、及該移植用神經視網膜片之製造方法。
[定義] 「幹細胞」意指具有分化能力及增殖能力(尤其是自我複製能力)之未分化之細胞。幹細胞根據分化能力而包括多能性幹細胞(pluripotent stem cell)、複能性幹細胞(multipotent stem cell)、單能性幹細胞(unipotent stem cell)等亞群。多能性幹細胞係指可於活體外培養且具有可分化為屬於三胚層(外胚層、中胚層、內胚層)及/或胚外組織之全部細胞譜系之能力(分化多能性(pluripotency))之幹細胞。複能性幹細胞意指具有可分化為複數種而非全部種類之組織或細胞之能力之幹細胞。單能性幹細胞意指具有可分化為特定之組織或細胞之能力之幹細胞。
「多能性幹細胞」可自受精卵、複製胚、生殖幹細胞、組織內幹細胞、體細胞等誘導。作為多能性幹細胞，可列舉：胚胎幹細胞(ES細胞：Embryonic stem cell)、EG細胞(Embryonic germ cell，胚生殖幹細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞：induced pluripotent stem cell)等。由間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell，MSC)獲得之Muse細胞(Multi-lineage differentiating stress enduring cell，多系分化持續應激細胞)或由生殖細胞(例如睾丸)製作之GS細胞(germline stem cell，生殖幹細胞)亦包含於多能性幹細胞中。
於1998年建立人類胚胎幹細胞，亦正將其用於再生醫學。胚胎幹細胞可藉由在餵養細胞上或含有bFGF(basic fibroblast growth factor，鹼性纖維母細胞生長因子)之培養基中培養內部細胞凝集體而製造。胚胎幹細胞之製造方法例如於WO96/22362、WO02/101057、US5,843,780、US6,200,806、US6,280,718等中有所記載。胚胎幹細胞可自規定之機關獲得，又，亦可購入市售品。例如，作為人類胚胎幹細胞之KhES-1、KhES-2及KhES-3可自京都大學再生醫科學研究所獲得。作為人類胚胎幹細胞之Crx：：Venus株(源自KhES-1)可自國立研究開發法人理化學研究所獲得。
「人工多能性幹細胞」係藉由利用公知之方法等將體細胞初始化(reprogramming)而誘導出多能性之細胞。
人工多能性幹細胞係於2006年由山中等人於小鼠細胞中建立(Cell, 2006, 126(4), pp.663-676)。人工多能性幹細胞於2007年在人類纖維母細胞中亦有建立，與胚胎幹細胞同樣地具有多能性與自我複製能力(Cell, 2007, 131(5), pp.861-872；Science, 2007, 318(5858), pp.1917-1920；Nat. Biotechnol., 2008, 26(1), pp.101-106)。
具體而言，人工多能性幹細胞可列舉藉由選自包含Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc(c-Myc、N-Myc、L-Myc)、Glis1、Nanog、Sall4、lin28、Esrrb等之初始化基因群中之複數種基因的組合之任一者之表現將纖維母細胞或周邊血液單核細胞等分化而成之體細胞進行初始化而誘導出多分化能力之細胞。作為較佳之初始化因子之組合，可列舉：(1)Oct3/4、Sox2、Klf4、及Myc(c-Myc或L-Myc)；(2)Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28及L-Myc(Stem Cells, 2013; 31: 458-466)。
作為人工多能性幹細胞，除了藉由利用基因表現之直接初始化而製造之方法以外，亦可藉由化合物之添加等自體細胞誘導人工多能性幹細胞(Science, 2013, 341, pp.651-654)。
又，亦可獲得經株化之人工多能性幹細胞，例如，可自京都大學及iPS Academia Japan股份有限公司獲得於京都大學建立之201B7細胞、201B7-Ff細胞、253G1細胞、253G4細胞、1201C1細胞、1205D1細胞、1210B2細胞、1231A3細胞等人類人工多能性細胞株。作為經株化之人工多能性幹細胞，例如可自京都大學獲得於京都大學建立之Ff-I01細胞、Ff-I14細胞及QHJI01s04細胞。
於本說明書中，多能性幹細胞較佳為胚胎幹細胞或人工多能性幹細胞，更佳為人工多能性幹細胞。
於本說明書中，多能性幹細胞係人類之多能性幹細胞，較佳為人類人工多能性幹細胞(iPS細胞)或人類胚胎幹細胞(ES細胞)。
人類iPS細胞等多能性幹細胞可藉由業者所周知之方法進行維持培養及擴大培養。
「視網膜組織(Retinal tissue)」意指活體視網膜中構成各視網膜層之視網膜系細胞之一種或複數種依照一定之秩序存在之組織，「神經視網膜(Neural Retina)」係視網膜組織，意指下文所述之視網膜層中不包含視網膜色素上皮層之內側之包含神經視網膜層之組織。
「視網膜系細胞」意指活體視網膜中構成各視網膜層之細胞或其前驅細胞。視網膜系細胞包括視細胞(視桿細胞、視錐細胞)、水平細胞、無軸突神經細胞、中間神經細胞、視網膜神經節細胞(神經節細胞)、雙極細胞(視桿雙極細胞、視錐雙極細胞)、米勒細胞(Muller glial cell)、視網膜色素上皮(RPE)細胞、睫狀體、該等之前驅細胞(例如：視細胞前驅細胞、雙極細胞前驅細胞等)、視網膜前驅細胞等細胞，但不限定於該等。視網膜系細胞中，作為構成神經視網膜層之細胞(亦稱為神經視網膜細胞或神經視網膜系細胞(Neural retina-related cell))，具體而言，可列舉：視細胞(視桿細胞、視錐細胞)、水平細胞、無軸突神經細胞、中間神經細胞、視網膜神經節細胞(神經節細胞)、雙極細胞(視桿雙極細胞、視錐雙極細胞)、米勒細胞、及該等之前驅細胞(例如：視細胞前驅細胞、雙極細胞前驅細胞等)等細胞。即，神經視網膜系細胞不包含視網膜色素上皮細胞及睫狀體細胞。
「成熟之視網膜系細胞」意指人類成體之視網膜組織可包含之細胞，具體而言，意指視細胞(視桿細胞、視錐細胞)、水平細胞、無軸突神經細胞、中間神經細胞、視網膜神經節細胞(神經節細胞)、雙極細胞(視桿雙極細胞、視錐雙極細胞)、米勒細胞、視網膜色素上皮(RPE)細胞、睫狀體細胞等分化之細胞。「未成熟之視網膜系細胞」意指決定向成熟之視網膜系細胞之分化之前驅細胞(例如：視細胞前驅細胞、雙極細胞前驅細胞、視網膜前驅細胞等)。
視細胞前驅細胞、水平細胞前驅細胞、雙極細胞前驅細胞、無軸突神經細胞前驅細胞、視網膜神經節細胞前驅細胞、米勒細胞前驅細胞、視網膜色素上皮前驅細胞分別指決定向視細胞、水平細胞、雙極細胞、無軸突神經細胞、視網膜神經節細胞、米勒細胞、視網膜色素上皮細胞之分化之前驅細胞。
「視網膜前驅細胞」係可分化為視細胞前驅細胞、水平細胞前驅細胞、雙極細胞前驅細胞、無軸突神經細胞前驅細胞、視網膜神經節細胞前驅細胞、米勒細胞、視網膜色素上皮前驅細胞等任一未成熟之視網膜系細胞之前驅細胞，指最終可分化為視細胞、視桿細胞、視錐細胞、水平細胞、雙極細胞、無軸突神經細胞、視網膜神經節細胞、視網膜色素上皮細胞等任一成熟之視網膜系細胞之前驅細胞。
「視細胞(photoreceptor cell)」於活體中存在於視網膜之視細胞層，具有吸收光刺激並將其轉換為電信號之作用。視細胞有於亮處發揮功能之錐細胞(cone)與於暗處發揮功能之桿細胞(rod)2種(分別稱為視錐細胞、視桿細胞)。又，作為視錐細胞，可列舉表現S-視蛋白並接收藍色光之S視錐細胞、表現L-視蛋白並接收紅色光之L視錐細胞、及表現M-視蛋白並接收綠色光之M視錐細胞。視細胞係自視細胞前驅細胞分化而成熟。業者可藉由例如下文所述之細胞標記(於視細胞前驅細胞中表現之Crx及Blimp1、於視細胞中表現之Recoverin、於成熟視細胞中表現之視紫質、S-視蛋白及M/L-視蛋白等)之表現、外節結構之形成等而容易地確認細胞是否為視細胞或視細胞前驅細胞。於一態樣中，視細胞前驅細胞係Crx陽性細胞，視細胞係視紫質、S-視蛋白及M/L-視蛋白陽性細胞。於一態樣中，視桿細胞係NRL及視紫質陽性細胞。於一態樣中，S視錐細胞係S-視蛋白陽性細胞，L視錐細胞係L-視蛋白陽性細胞，及M視錐細胞係M-視蛋白陽性細胞。
神經視網膜系細胞之存在可藉由神經視網膜系細胞相關基因(以下有時稱為「神經視網膜系細胞標記」、或「神經視網膜標記」)之表現之有無進行確認。業者可容易地確認神經視網膜系細胞標記之表現之有無、或者細胞集群或組織中之神經視網膜系細胞標記陽性細胞之比率。例如，可列舉使用抗體之方法、使用核酸引子之方法、使用序列反應之方法。作為使用抗體之方法，例如可利用使用市售之抗體之流式細胞術、免疫染色等方法，藉由特定之神經視網膜系細胞標記陽性細胞之數除以總細胞數而確認神經視網膜系細胞標記之蛋白質之表現。作為使用核酸引子之方法，例如可藉由PCR法、半定量PCR法、定量PCR法(例如：即時PCR法)確認神經視網膜系細胞標記之RNA之表現。作為使用序列反應之方法，例如可使用核酸測序儀(例如：下一代測序儀)確認神經視網膜系細胞標記之RNA之表現。
作為神經視網膜系細胞標記，可列舉於視網膜前驅細胞中表現之Rx(亦稱為Rax)及PAX6、於神經視網膜前驅細胞中表現之Rx、PAX6及Chx10(亦稱為Vsx2)、於視細胞前驅細胞中表現之Crx及Blimp1等。又，可列舉於雙極細胞中強表現之Chx10、於雙極細胞中表現之PKCα、Goα、VSX1及L7、於視網膜神經節細胞中表現之TuJ1及Brn3、於無軸突神經細胞中表現之Calretinin及HPC-1、於水平細胞中表現之Calbindin、於視細胞及視細胞前驅細胞中表現之Recoverin、於桿細胞中表現之視紫質、於視桿細胞及視桿細胞前驅細胞中表現之Nrl、於視錐細胞中表現之S-視蛋白及LM-視蛋白、於錐細胞、視錐細胞前驅細胞及神經節細胞中表現之RXR-γ、於視錐細胞中在分化初期出現之視錐細胞或其前驅細胞中表現之TRβ2、OTX2及OC2、於水平細胞、無軸突神經細胞及神經節細胞中共通表現之Pax6等。
「陽性細胞」意指於細胞表面上或細胞內表現特定之標記之細胞。例如，「Chx10陽性細胞」意指表現Chx10蛋白質之細胞。
「視網膜色素上皮細胞」意指活體視網膜中存在於神經視網膜之外側之上皮細胞。業者可藉由例如細胞標記(RPE65、MITF、CRALBP、MERTK、BEST1、TTR等)之表現、或黑色素顆粒之存在(黑褐色)、細胞間之緊密連接、多邊形/石塊狀之特徵性之細胞形態等而容易地確認細胞是否為視網膜色素上皮細胞。可藉由VEGF(vascular endothelial growth factor，血管內皮生長因子)及PEDF(pigment epithelium-derived factor，色素上皮衍生因子)等細胞激素之分泌能力等而容易地確認細胞是否具有視網膜色素上皮細胞之功能。於一態樣中，視網膜色素上皮細胞係RPE65陽性細胞、MITF陽性細胞、或RPE65陽性且MITF陽性細胞。
「視網膜層」意指構成視網膜之各層，具體而言，可列舉：視網膜色素上皮層、視細胞層、外限膜、外核層、外叢狀層、內核層、內叢狀層、神經節細胞層、神經纖維層及內限膜。
「神經視網膜層」意指構成神經視網膜之各層，具體而言，可列舉：視細胞層、外限膜、外核層、外叢狀層、內核層、內叢狀層、神經節細胞層、神經纖維層及內限膜。「視細胞層」意指形成於神經視網膜之最外側且含有大量視細胞(視桿細胞、視錐細胞)、視細胞前驅細胞及視網膜前驅細胞之視網膜層。將視細胞層以外之各層稱為內層。可藉由公知之方法、例如細胞標記之表現之有無或表現之程度等而確認各細胞係構成何種視網膜層之細胞。
於視細胞或視細胞前驅細胞之出現比率較少之階段之視網膜組織之情形時，將包含增殖之神經視網膜前驅細胞之層稱為「神經母細胞層(neuroblastic layer)」，存在內神經母細胞層(inner neuroblatic layer)與外神經母細胞層(outer neuroblastic layer)。業者可藉由周知之方法進行判斷，例如可於亮視野顯微鏡下根據顏色之濃淡(外神經母細胞層較淡，內神經母細胞層較濃)進行判斷。
「睫狀體」包含產生過程及成體之「睫狀體」、「睫狀體周緣部」、「Ciliary body」。作為「睫狀體」之標記，可列舉：Zic1、MAL、HNF1beta、FoxQ1、CLDN2、CLDN1、GPR177、AQP1及AQP4。作為「睫狀體周緣部(ciliary marginal zone，CMZ)」，例如為活體視網膜中存在於神經視網膜與視網膜色素上皮之邊界區域之組織，且可列舉包含視網膜之組織幹細胞(視網膜幹細胞)之區域。睫狀體周緣部亦稱為睫狀體邊緣(ciliary margin)或視網膜邊緣(retinal margin)，睫狀體周緣部、睫狀體邊緣及視網膜邊緣係同等之組織。已知睫狀體周緣部在對視網膜組織供給視網膜前驅細胞、分化細胞，維持視網膜組織結構等方面發揮重要之作用。作為睫狀體周緣部之標記基因，例如可列舉：Rdh10基因(陽性)、Otx1基因(陽性)及Zic1(陽性)。「類睫狀體周緣部結構體」係與睫狀體周緣部類似之結構體。
「細胞凝集體」(Cell Aggregate)只要為複數個細胞彼此接著而形成立體結構者，則無特別限定，例如指於培養基等介質中分散之細胞集合所形成之塊、或經由細胞分裂所形成之細胞之塊等。細胞凝集體亦包含形成特定之組織之情形。
「球(sphere)狀細胞凝集體」意指具有近似球狀之立體形狀之細胞凝集體。近似球狀之立體形狀係具有三維結構之形狀，於投影至二維面時，例如可列舉呈現圓形或橢圓形之球形形狀、及複數個球形形狀融合所形成之形狀(例如於投影至二維之情形時，呈現2～4個圓形或橢圓形重疊所形成之形狀)。於一態樣中，凝集體之芯部具有如下特徵：其具有囊泡性層狀結構，於亮視野顯微鏡下觀察，中央部較暗，外緣部分較亮。
於一態樣中，上皮組織可極性化而形成「頂端面(apical surface)」與「基底膜」。「基底膜」係指含有大量層黏連蛋白及IV型膠原蛋白之50～100 nm的存在上皮細胞所產生之基底(basal)側之層(基底膜)的基底膜。「頂端面」係指形成於與「基底膜」相反之側之表面(表層面)。於一態樣中，「頂端面」係指於產生階段進行至見到視細胞或視細胞前驅細胞之程度之視網膜組織中形成外限膜且與存在視細胞、視細胞前驅細胞之視細胞層(外核層)相接之面。又，此種頂端面可使用針對頂端面之標記(例如：非典型PKC(Protein kinase C，蛋白激酶C)(以下簡稱為「aPKC」)、E-鈣黏附蛋白、N-鈣黏附蛋白)之抗體，藉由業者所周知之免疫染色法等進行鑑定。
「上皮組織」係藉由細胞無間隙地覆蓋體表面、內腔(消化道等)、體腔(心包腔等)等之表面所形成之組織。將形成上皮組織之細胞稱為上皮細胞。上皮細胞之細胞具有頂端(apical)-基底(basal)方向之極性。上皮細胞藉由接著連接(adherence junction)及/或緊密連接(tight junction)而上皮細胞彼此形成牢固之連接，從而可形成細胞之層。該細胞層以1至十數層重疊而成之組織為上皮組織。可形成上皮組織之組織亦包含胎兒期及/或成體之視網膜組織、腦脊髓組織、眼球組織、神經組織等。本說明書中之神經視網膜亦為上皮組織。「上皮結構」意指頂端面或基底膜等上皮組織特徵性地具有之結構。
「連續上皮組織」係具有連續上皮結構之組織。連續上皮結構係指上皮組織連續之狀態。上皮組織連續例如為沿相對於上皮組織之切線方向排列10個細胞～107 個細胞、較佳為沿切線方向排列30個細胞～107 個細胞、進而較佳為102 個細胞～107 個細胞之狀態。
例如，視網膜組織中所形成之連續上皮結構中視網膜組織具有上皮組織所特有之頂端面，頂端面與形成神經視網膜層之各層中之至少視細胞層(外核層)等大致平行且連續地形成於視網膜組織之表面。例如，於包含由多能性幹細胞製作之視網膜組織之細胞凝集體之情形時，於凝集體之表面形成頂端面，相對於表面而沿切線方向整齊而連續地排列10個細胞以上、較佳為30個細胞以上、更佳為100個細胞以上、進而較佳為400個細胞以上之視細胞或視細胞前驅細胞。
[移植用神經視網膜之品質之評價方法] 本發明之一態樣係評價移植用神經視網膜之品質之方法。
本發明之方法包括：對包含來自多能性幹細胞之具有上皮結構之神經視網膜的細胞凝集體之一部分或全部進行取樣而作為品質評價用樣品；檢測品質評價用樣品中之神經視網膜系細胞(目標細胞)相關基因及非神經視網膜系細胞(目標外細胞)相關基因之表現；及於見到神經視網膜系細胞相關基因(目標細胞相關基因)之表現且未見到非神經視網膜系細胞相關基因(目標外細胞相關基因)之表現之情形時，判定為可使用(1)與包含作為上述一部分之品質評價用樣品之細胞凝集體相同之細胞凝集體中之神經視網膜(移植用神經視網膜)、(2)與包含作為上述一部分之上述品質評價用樣品之細胞凝集體為同一批次之細胞凝集體中之神經視網膜(移植用神經視網膜)、或(3)與作為上述全部之上述品質評價用樣品之細胞凝集體為同一批次之細胞凝集體中之神經視網膜(移植用神經視網膜)作為移植用神經視網膜。於品質評價用樣品中，於見到神經視網膜系細胞相關基因(目標細胞相關基因)之表現且未見到非神經視網膜系細胞相關基因(目標外細胞相關基因)之表現之情形時，判斷該品質評價用樣品亦可用作移植用神經視網膜，但作為該移植用神經視網膜之品質評價用樣品因評價而被破壞，因此實際上無法用於移植。
＜包含神經視網膜之細胞凝集體＞ (細胞凝集體之製造方法) 本說明書中之包含神經視網膜之細胞凝集體具有上皮結構，可藉由分化誘導多能性幹細胞而獲得。作為一態樣，可列舉使用分化誘導因子之包含神經視網膜之細胞凝集體之製造方法。作為分化誘導因子，可列舉：基底膜樣品、BMP(Bone Morphogenetic Protein，骨形成蛋白)訊號傳遞路徑作用物質、Wnt訊號傳遞路徑抑制物質、IGF(Insulin-like Growth Factor，類胰島素生長因子)訊號傳遞路徑作用物質等。作為一態樣，可列舉利用自體組織化之包含神經視網膜之細胞凝集體之製造方法。自體組織化係指細胞之集群自主產生出複雜之結構之機制。例如，可藉由SFEB(Serum-free Floating culture of Embryoid Bodies-like aggregates，類胚胎體無血清懸浮培養)法(WO2005/12390)或SFEBq(Serum-free Floating culture of Embryoid Body-like aggregate with quick reaggregation，快速重組類胚胎體無血清懸浮培養)法(WO2009/148170)進行自體組織化。
作為具體之分化誘導方法，可列舉WO2011/055855、WO2013/077425、WO2015/025967、WO2016/063985、WO2016/063986、WO2017/183732、PLoS One. 2010 Jan 20; 5(1): e8763.、Stem Cells. 2011 Aug; 29(8): 1206-18.、Proc Natl Acad Sci USA. 2014 Jun 10; 111(23): 8518-23、或Nat Commun. 2014 Jun 10; 5: 4047所揭示之方法，但無特別限定。
作為具體之一態樣，可藉由包括下述步驟(A)、(B)及(C)之方法製備包含神經視網膜之細胞凝集體。 (A)於不存在餵養細胞之情況下在含有未分化維持因子之培養基中培養多能性幹細胞之步驟； (B)藉由懸浮培養步驟(A)中獲得之細胞而使其形成細胞凝集體之步驟；及 (C)將步驟(B)中獲得之細胞凝集體於含有BMP訊號傳遞路徑作用物質之培養基中進一步懸浮培養之步驟。 再者，步驟(A)可進而包含TGF(transforming growth factor，轉形生長因子)β家族訊號傳遞路徑抑制物質及/或音蝟因子(Sonic hedgehog)訊號傳遞路徑作用物質。 又，步驟(B)亦可如下文所述，包含音蝟因子訊號傳遞路徑作用物質、及/或Wnt訊號傳遞抑制物質。
本方法例如亦揭示於WO2015/025967、WO2016/063985、WO2017/183732中，更詳細而言，可參照WO2015/025967、WO2016/063985、WO2017/183732。
包含神經視網膜之細胞凝集體之製備所使用之培養基只要無特別記載，則可使用細胞增殖用基礎培養基(亦稱為基礎培養基)。細胞增殖用基礎培養基只要可培養細胞，則無特別限定，可適當使用作為細胞增殖用培養基所市售之基礎培養基。具體而言，例如可列舉：BME(Basal Medium Eagle，基礎伊格爾培養基)培養基、BGJb培養基、CMRL 1066培養基、Glasgow MEM(Minimum Essential Medium，最低必需培養基)(GMEM)培養基、改良MEM鋅可選(Improved MEM Zinc Option)培養基、IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)培養基、Medium 199培養基、MEM培養基、Eagle MEM培養基、αMEM培養基、DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium，達爾伯克改良伊格爾培養基)培養基、F-12培養基、DMEM/F12培養基、IMDM/F12培養基、哈姆氏培養基(Ham's Medium)、RPMI 1640培養基、Fischer's培養基、Leibovitz's L-15培養基或該等之混合培養基等可用於動物細胞之培養之培養基。又，亦可使用添加有作為輔助培養基之N2培養基之培養基。
TGFβ家族訊號傳遞路徑抑制物質表示對TGFβ家族訊號傳遞路徑、即由Smad家族傳遞之訊號傳遞路徑進行抑制之物質，具體而言，可列舉TGFβ訊號傳遞路徑抑制物質(例如：SB431542、LY-364947、SB505124、A-83-01等)、Nodal/活化素訊號傳遞路徑抑制物質(例如：SB431542、A-83-01等)及BMP訊號傳遞路徑抑制物質(例如：LDN193189、Dorsomorphin等)。該等物質有市售而可獲得。
音蝟因子(以下有時記作「Shh」)訊號傳遞路徑作用物質係可增強由Shh介導之訊號傳遞之物質。作為Shh訊號傳遞路徑作用物質，例如可列舉SHH、SHH之部分肽、PMA(Purmorphamine)、SAG(Smoothened Agonist)等。
TGFβ家族訊號傳遞路徑抑制物質及音蝟因子訊號傳遞路徑作用物質之濃度為可誘導向視網膜系細胞之分化之濃度即可。例如，SB431542通常以0.1～200 μM、較佳為2～50 μM之濃度使用。A-83-01通常以0.05～50 μM、較佳為0.5～5 μM之濃度使用。LDN193189通常以1～2000 nM、較佳為10～300 nM之濃度使用。SAG通常以1～2000 nM、較佳為10～700 nM之濃度使用。PMA通常以0.002～20 μM、較佳為0.02～2 μM之濃度使用。
未分化維持因子只要為具有抑制多能性幹細胞之分化之作用之物質，則無特別限定。作為業者通用之未分化維持因子，可列舉FGF訊號傳遞路徑作用物質、TGFβ家族訊號傳遞路徑作用物質、胰島素等。作為FGF訊號傳遞路徑作用物質，具體而言，可列舉纖維母細胞增殖因子(例如，bFGF、FGF4或FGF8)。又，作為TGFβ家族訊號傳遞路徑作用物質，可列舉TGFβ訊號傳遞路徑作用物質、Nodal/活化素訊號傳遞路徑作用物質。作為TGFβ訊號傳遞路徑作用物質，例如可列舉TGFβ1、TGFβ2。作為Nodal/活化素訊號傳遞路徑作用物質，例如可列舉Nodal、活化素A、活化素B。於培養人類多能性幹細胞(人類ES細胞、人類iPS細胞)之情形時，第一步驟中之培養基較佳為含有bFGF作為未分化維持因子。
第一步驟中所使用之培養基中之未分化維持因子濃度為可維持所培養之多能性幹細胞之未分化狀態之濃度，業者可適當設定。例如，具體而言，於在不存在餵養細胞之情況下使用bFGF作為未分化維持因子之情形時，其濃度通常為4 ng～500 ng/mL左右，較佳為10 ng～200 ng/mL左右，更佳為30 ng～150 ng/mL左右。
作為含有未分化維持因子、可用於培養多能性幹細胞之無餵養細胞培養基，開發、市售有較多合成培養基，例如可列舉Essential 8培養基(Life Technologies公司製造)。Essential 8培養基係於DMEM/F12培養基中含有作為添加劑之L-抗壞血酸-2-磷酸酯鎂(64 mg/L)、鈉硒(sodium selenium)(14 μg/L)、胰島素(19.4 mg/L)、NaHCO3(543 mg/L)、運鐵蛋白(10.7 mg/L)、bFGF(100 ng/mL)、及TGFβ家族訊號傳遞路徑作用物質(TGFβ1(2 ng/mL)或Nodal(100 ng/mL))(Nature Methods, 8, 424-429(2011))。除此以外，作為市售之無餵養細胞培養基，可列舉S-medium(DS Pharma Biomedical公司製造)、StemPro(Life Technologies公司製造)、hESF9(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008 Sep 9; 105(36): 13409-14)、mTeSR1(STEMCELL Technologies公司製造)、mTeSR2(STEMCELL Technologies公司製造)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies公司製造)、或StemFit(Ajinomoto公司製造)。藉由在上述第一步驟中使用該等，而可簡便地實施本發明。藉由使用該等培養基，而可進行無餵養細胞條件下之多能性幹細胞之培養。關於步驟(A)中所使用之培養基，作為一例，為未添加BMP訊號傳遞路徑作用物質、Wnt訊號傳遞路徑作用物質及Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之任一者之無血清培養基。
於步驟(A)中之無餵養細胞條件下之多能性幹細胞之培養中，為了向多能性幹細胞提供代替餵養細胞之支架，可使用合適之基質作為支架。作為可用作支架之基質，可列舉：層黏連蛋白(Nat Biotechnol 28, 611-615, (2010))、層黏連蛋白片段(Nat Commun 3, 1236, (2012))、基底膜樣品(Nat Biotechnol 19, 971-974, (2001))、明膠、膠原蛋白、硫酸乙醯肝素蛋白多糖、內動素、玻連蛋白(Vitronectin)等。
步驟(A)中之多能性幹細胞之培養時間於在TGFβ家族訊號傳遞路徑抑制物質及/或音蝟因子訊號傳遞路徑作用物質(例如：100 nM～700 nM)之存在下進行培養之情形時，於可達成提高步驟(B)中所形成之細胞凝集體之品質之效果的範圍內並無特別限定，通常為0.5～144小時。於一態樣中，較佳為2～96小時，更佳為6～48小時，進而較佳為12～48小時，進而更佳為18～28小時(例如24小時)。
步驟(B)中所使用之培養基可為含血清培養基或無血清培養基。就避免混入化學上未確定之成分之觀點而言，適宜使用無血清培養基。為了避免製備之繁雜，例如可列舉適量添加有市售之KSR(Knockout Serum Replacement，剔除血清替代物)等血清代替物之無血清培養基。作為KSR於無血清培養基中之添加量，通常為約1%至約30%，較佳為約2%至約20%。
於形成凝集體時，首先，藉由步驟(A)中獲得之細胞之分散操作，而製備經分散之細胞。藉由分散操作所獲得之「經分散之細胞」例如可列舉7成(較佳為8成以上)以上為單細胞且2～50個細胞之塊存在3成以下(較佳為2成以下)之狀態。經分散之細胞可列舉幾乎不存在細胞彼此之接著(例如面接著)之狀態。
將經分散之細胞之懸濁液接種至培養器中，於所分散之細胞對培養器無接著性之條件下進行培養，藉此使複數之細胞集合而形成凝集體。作為一態樣，於如96孔板之多孔板(U底、V底)之各孔中加入一定數量經分散之幹細胞並將其靜置培養，其後細胞迅速凝集，藉此各孔中形成1個凝集體(SFEBq法)。於使用96孔板懸浮培養細胞之情形時，將以每孔成為約1×103 至約1×105 個細胞(較佳為約3×103 至約5×104 個細胞、約4×103 至約2×104 個細胞)之方式製備之液添加至孔中，將板靜置而使其形成凝集體。
於一態樣中，步驟(B)中所使用之培養基含有音蝟因子訊號傳遞路徑作用物質。 即，作為具體之一態樣，可藉由包括下述步驟(A)、(B)及(C)之方法製備包含神經視網膜之細胞凝集體： (A)於不存在餵養細胞且可任意含有TGFβ家族訊號傳遞路徑抑制物質及/或音蝟因子訊號傳遞路徑作用物質之含有未分化維持因子之培養基中培養多能性幹細胞之步驟； (B)藉由將步驟(A)中獲得之細胞於含有音蝟因子訊號傳遞路徑作用物質之培養基中進行懸浮培養而形成細胞凝集體之步驟； (C)將步驟(B)中獲得之細胞凝集體於含有BMP訊號傳遞路徑作用物質之培養基中進一步懸浮培養之步驟。 作為步驟(B)中之音蝟因子訊號傳遞路徑作用物質，可以上述濃度(例如：10 nM～300 nM)使用上述者。音蝟因子訊號傳遞路徑作用物質較佳為自開始懸浮培養時含有於培養基中。亦可於培養基中添加ROCK抑制劑(例如Y-27632)。培養時間例如為12小時～6天。步驟(B)中所使用之培養基於一例中為未添加選自由BMP訊號傳遞路徑作用物質、Wnt訊號傳遞路徑作用物質、TGFβ家族訊號傳遞路徑抑制物質及TGFβ家族訊號傳遞路徑作用物質所組成之群中之1種以上(較佳為全部)之培養基。
BMP訊號傳遞路徑作用物質係可增強由BMP介導之訊號傳遞路徑之物質。作為BMP訊號傳遞路徑作用物質，例如可列舉：BMP2、BMP4或BMP7等BMP蛋白質、GDF7等GDF(Growth differentiation factor，生長分化因子)蛋白質、抗BMP受體抗體、或BMP部分肽等。BMP2蛋白質、BMP4蛋白質及BMP7蛋白質例如可自R&D Systems公司獲得，GDF7蛋白質例如可自和光純藥獲得。
步驟(C)中所使用之培養基例如可列舉添加有BMP訊號傳遞路徑作用物質之無血清培養基或血清培養基(較佳為無血清培養基)。無血清培養基、血清培養基可以上述方式準備。步驟(C)中所使用之培養基於一例中為未添加選自由Wnt訊號傳遞路徑作用物質、TGFβ家族訊號傳遞路徑抑制物質及TGFβ家族訊號傳遞路徑作用物質所組成之群中之1種以上(較佳為全部)之培養基。又，步驟(C)中所使用之培養基於一例中為未添加音蝟因子訊號傳遞路徑作用物質之培養基。又，步驟(C)中所使用之培養基為可添加Wnt訊號傳遞路徑作用物質之培養基。
BMP訊號傳遞路徑作用物質之濃度為可誘導向視網膜系細胞之分化之濃度即可。例如於人類BMP4蛋白質之情形時，以成為約0.01 nM～約1 μM、較佳為約0.1 nM～約100 nM、更佳為約1 nM～約10 nM、進而較佳為約1.5 nM(55 ng/mL)之濃度之方式添加至培養基中。
BMP訊號傳遞路徑作用物質於自步驟(A)之懸浮培養開始起約24小時以後添加即可，亦可於開始懸浮培養後數天以內(例如，15天以內)添加至培養基中。較佳為將BMP訊號傳遞路徑作用物質於開始懸浮培養後第1天～第15天之間、更佳為第1天～第9天之間、最佳為第3天添加至培養基中。
作為具體之態樣，例如可於開始步驟(B)之懸浮培養後第1～9天、較佳為第1～3天將培養基之一部分或全部更換為含有BMP4之培養基，將BMP4之最終濃度製備為約1～10 nM，於BMP4之存在下培養例如1～12天、較佳為2～9天、進而較佳為2～5天。此處，為了將BMP4之濃度維持為同一濃度，可以1次或2次左右將培養基之一部分或全部更換為含有BMP4之培養基。或者亦可階段性地減小BMP4之濃度。例如，可將BMP訊號傳遞路徑作用物質(BMP4)之濃度維持至開始步驟(B)之懸浮培養後第2～10天後，階段性地將BMP訊號傳遞路徑作用物質(BMP4)之濃度減小至開始步驟(B)之懸浮培養後第6～20天。
上述步驟(A)～步驟(C)中之培養溫度、CO2 濃度等培養條件可適當設定。培養溫度例如為約30℃～約40℃，較佳為約37℃。又，CO2 濃度例如為約1%～約10%，較佳為約5%。
藉由改變上述步驟(C)中之培養時間，可製造作為細胞凝集體所含之視網膜系細胞的各種分化階段之視網膜系細胞。即，可製造以各種比率含有未成熟之視網膜系細胞(例如：視網膜前驅細胞、視細胞前驅細胞)與成熟之視網膜系細胞(例如：視細胞)的細胞凝集體中之視網膜系細胞。藉由延長步驟(C)之培養時間，可增加成熟之視網膜系細胞之比率。
上述步驟(B)及/或步驟(C)亦可使用WO2017/183732所揭示之方法。即，於步驟(B)及/或步驟(C)中，可於進而含有Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之培養基中進行懸浮培養，從而形成細胞凝集體。
作為步驟(B)及/或步驟(C)中使用之Wnt訊號傳遞路徑抑制物質，只要可抑制由Wnt介導之訊號傳遞，則無特別限定，可為蛋白質、核酸、低分子化合物等之任一者。由Wnt介導之訊號係經由以Frizzled(Fz)及LRP5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6，低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6)之異型二聚物之形式存在之Wnt受體而傳遞。作為Wnt訊號傳遞路徑抑制物質，例如可列舉：直接作用於Wnt或Wnt受體之物質(抗Wnt中和抗體、抗Wnt受體中和抗體等)、抑制編碼Wnt或Wnt受體之基因之表現之物質(例如反義寡核苷酸、siRNA等)、抑制Wnt受體與Wnt結合之物質(可溶型Wnt受體、顯性負性Wnt受體等、Wnt拮抗劑、Dkk1、Cerberus蛋白質等)、對Wnt受體之訊號傳遞所引起之生理活性進行抑制之物質[CKI-7(N-(2-胺基乙基)-5-氯異喹啉-8-磺醯胺)、D4476(4-[4-(2,3-二氫-1,4-苯并戴奧辛-6-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲醯胺)、IWR-1-endo(IWR1e)(4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-六氫-1,3-二側氧基-4,7-甲橋-2H-異吲哚-2-基]-N-8-喹啉基-苯甲醯胺)、及IWP-2(N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[(3,4,6,7-四氫-4-側氧基-3-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫基]乙醯胺)等低分子化合物等]等，但不限定於該等。作為Wnt訊號傳遞路徑抑制物質，可含有該等之一種或二種以上。CKI-7、D4476、IWR-1-endo(IWR1e)、IWP-2等係公知之Wnt訊號傳遞路徑抑制物質，可適當地獲得市售品等。作為Wnt訊號傳遞路徑抑制物質，較佳可使用IWR1e。
步驟(B)中之Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之濃度為可誘導良好之細胞凝集體之形成之濃度即可。例如於IWR-1-endo之情形時，以成為約0.1 μM至約100 μM、較佳為約0.3 μM至約30 μM、更佳為約1 μM至約10 μM、進而較佳為約3 μM之濃度之方式添加至培養基中。於使用IWR-1-endo以外之Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之情形時，較理想的是以表現出與上述IWR-1-endo之濃度同等之Wnt訊號傳遞路徑抑制活性之濃度而使用。
於步驟(B)中，將Wnt訊號傳遞路徑抑制物質添加至培養基中之時機較佳為較早。Wnt訊號傳遞路徑抑制物質係於自步驟(B)中之懸浮培養之開始起通常6天以內、較佳為3天以內、更佳為1天以內、更佳為12小時以內、進而較佳為於步驟(B)中之懸浮培養之開始時，添加至培養基中。具體而言，例如可進行添加有Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之基礎培養基之添加、或者對該基礎培養基進行一部分或全部培養基之更換。於步驟(B)中，使步驟(A)中獲得之細胞作用於Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之時間並無特別限定，較佳為於開始步驟(B)中之懸浮培養時添加至培養基中之後，使其作用至步驟(B)結束時(添加BMP訊號傳遞路徑作用物質之前)為止。進而較佳為如下文所述那樣，於步驟(B)結束後(即步驟(C)之期間)亦繼續曝露於Wnt訊號傳遞路徑抑制物質中。作為一態樣，可如下文所述那樣，於步驟(B)結束後(即步驟(C)之期間)亦繼續作用於Wnt訊號傳遞路徑抑制物質，直至形成視網膜組織為止。
於步驟(C)中，作為Wnt訊號傳遞路徑抑制物質，可使用上文所述之Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之任一種，較佳為於步驟(C)中使用與步驟(B)中所使用之Wnt訊號傳遞路徑抑制物質為同一種類者。
步驟(C)中之Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之濃度為可誘導視網膜前驅細胞及視網膜組織之濃度即可。例如於IWR-1-endo之情形時，以成為約0.1 μM至約100 μM、較佳為約0.3 μM至約30 μM、更佳為約1 μM至約10 μM、進而較佳為約3 μM之濃度之方式添加至培養基中。於使用IWR-1-endo以外之Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之情形時，較理想的是以表現出與上述IWR-1-endo之濃度同等之Wnt訊號傳遞路徑抑制活性之濃度使用。步驟(C)之培養基中之Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之濃度於將步驟(B)之培養基中之Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之濃度設為100時，較佳為50～150，更佳為80～120，進而較佳為90～110，更佳為與第二步驟之培養基中之Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之濃度相同。
Wnt訊號傳遞路徑抑制物質向培養基中之添加時期於可達成包含視網膜系細胞或視網膜組織之凝集體形成之範圍內並無特別限定，越早越佳。較佳為於開始步驟(C)時將Wnt訊號傳遞路徑抑制物質添加至培養基中。更佳為於步驟(B)中添加Wnt訊號傳遞路徑抑制物質後，於步驟(C)中亦繼續(即自步驟(B)之開始時起)含於培養基中。進而較佳為於開始步驟(B)之懸浮培養時添加Wnt訊號傳遞路徑抑制物質後，於步驟(C)中亦繼續含於培養基中。例如，於步驟(B)中獲得之培養物(含有Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之培養基中之凝集體之懸濁液)中添加BMP訊號傳遞作用物質(例如BMP4)即可。
作用於Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之期間並無特別限定，較佳為於在開始步驟(B)中之懸浮培養時添加Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之情形時，以開始步驟(B)中之懸浮培養時為起點算為2天至30天，更佳為6天至20天、8天至18天、10天至18天、或10天至17天(例如，10天)。於其他態樣中，作用於Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之期間於在開始步驟(B)中之懸浮培養時添加Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之情形時，以開始步驟(B)中之懸浮培養時為起點算，較佳為3天至15天(例如，5天、6天、7天)，更佳為6天至10天(例如，6天)。
將藉由上述方法所獲得之細胞凝集體於含有Wnt訊號傳遞路徑作用物質、及/或FGF訊號傳遞路徑抑制物質之無血清培養基或血清培養基中培養2天至4天左右之期間(步驟(D))後，於不含Wnt訊號傳遞路徑作用物質及FGF訊號傳遞路徑抑制物質之無血清培養基或血清培養基中培養30天～200天左右(30天～150天、50天～120天、60天～90天)(步驟(E))，藉此亦可製造包含類睫狀體周緣部結構體之神經視網膜。
作為一態樣，可藉由上述步驟(D)及步驟(E)，由步驟(A)～(C)中獲得且開始步驟(B)之懸浮培養後第6～30天、第10～20天(第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天、第19天或第20天)之細胞凝集體製造包含類睫狀體周緣部結構體之神經視網膜。
作為Wnt訊號傳遞路徑作用物質，只要可增強由Wnt介導之訊號傳遞，則無特別限定。作為具體之Wnt訊號傳遞路徑作用物質，例如可列舉GSK3β抑制劑(例如，6-溴靛紅-3'-肟(BIO)、CHIR99021、肯帕羅酮(Kenpaullone))。例如於CHIR99021之情形時，可列舉約0.1 μM～約100 μM、較佳為約1 μM～約30 μM之範圍。
作為FGF訊號傳遞路徑抑制物質，只要可抑制由FGF介導之訊號傳遞，則無特別限定。作為FGF訊號傳遞路徑抑制物質，例如可列舉：SU-5402、AZD4547、BGJ398等。例如於SU-5402之情形時，以約0.1 μM～約100 μM、較佳為約1 μM～約30 μM、更佳為約5 μM之濃度添加。
步驟(D)中所使用之培養基於一例中為未添加選自由BMP訊號傳遞路徑作用物質、Wnt訊號傳遞路徑抑制物質、SHH訊號傳遞路徑作用物質、TGFβ家族訊號傳遞路徑抑制物質及TGFβ家族訊號傳遞路徑作用物質所組成之群中之1種以上(較佳為全部)之培養基。
上述步驟(E)之一部分或全部步驟可使用WO2019/017492所揭示之連續上皮組織維持用培養基進行培養。即，藉由使用連續上皮組織維持用培養基進行培養，可維持神經視網膜之連續上皮結構。作為一例，可列舉於Neurobasal培養基(例如：Thermo Fisher Scientific公司製造、21103049)中調配有B27補充品(例如：Thermo Fisher Scientific、12587010)之培養基作為連續上皮組織維持用培養基。
上述步驟(E)中之培養為了兼顧視網膜系細胞(尤其是視細胞)之分化及/或成熟化與連續上皮結構之維持，較佳為階段性地更換為連續上皮組織維持用培養基。例如，可為開始之10天～30天使用細胞增殖用基礎培養基(例如：於DMEM/F12培養基中添加有10%胎牛血清、1%N2補充品、及100 μM牛磺酸之培養基)進行培養，其後之10天～40天使用細胞增殖用基礎培養基與連續上皮組織維持用培養基之混合培養基(將於DMEM/F12培養基中添加有10%胎牛血清、1%N2補充品、及100 μM牛磺酸之培養基與於Neurobasal培養基中添加有10%胎牛血清、2%B27補充品、2 mM麩醯胺、及100 μM牛磺酸之培養基以1：3之比率混合而成之培養基)進行培養，其後之20天～140天使用連續上皮組織維持用培養基(例如：於Neurobasal培養基中添加有10%胎牛血清、2%B27補充品、2 mM麩醯胺、及100 μM牛磺酸之培養基)進行培養。
於上述步驟(E)之一部分或全部步驟中，於使用細胞增殖用基礎培養基、連續上皮組織維持用培養基或該等之混合培養基之任一培養基之情形時均可進而含有甲狀腺激素訊號傳遞路徑作用物質。藉由在含有甲狀腺激素訊號傳遞路徑作用物質之培養基中進行培養，可製造神經視網膜所含之雙極細胞、無軸突神經細胞、神經節細胞或水平細胞等之比率較低且包含視細胞前驅細胞之比率經增大之神經視網膜之細胞凝集體。
於本說明書中，甲狀腺激素訊號傳遞路徑作用物質係可增強由甲狀腺激素介導之訊號傳遞之物質，只要為可增強甲狀腺激素訊號傳遞路徑者，則無特別限定。作為甲狀腺激素訊號傳遞路徑作用物質，例如可列舉：三碘甲狀腺素(以下有時簡記為T3)、甲狀腺素(以下有時簡記為T4)、甲狀腺激素受體(較佳為TRβ受體)促效劑等。
又，作為業者所周知之甲狀腺激素受體促效劑，可列舉：國際公開第97/21993號說明書、國際公開第2004/066929號說明書、國際公開第2004/093799號、國際公開第2000/039077號說明書、國際公開第2001/098256號說明書、國際公開第2003/018515號說明書、國際公開第2003/084915號說明書、國際公開第2002/094319號說明書、國際公開第2003/064369號說明書、日本專利特開2002-053564號公報、日本專利特開2002-370978號公報、日本專利特開2000-256190號公報、國際公開第2007/132475號說明書、國際公開第2007/009913號說明書、國際公開第2003/094845號說明書、國際公開第2002/051805號說明書或國際公開第2010/122980號說明書所記載之二苯基甲烷衍生物、二芳基醚衍生物、嗒𠯤衍生物、吡啶衍生物或吲哚衍生物等化合物。
於使用T3作為甲狀腺激素訊號傳遞路徑作用物質之情形時，例如可以成為0.1～1000 nM之範圍之方式添加至培養基中。可列舉具有與較佳為1～500 nM、更佳為10～100 nM、進而較佳為30～90 nM、進而更佳為60 nM左右之濃度之T3相當的甲狀腺激素訊號傳遞亢進活性之濃度。於使用T4作為甲狀腺激素訊號傳遞路徑作用物質之情形時，例如可以成為1 nM～500 μM之範圍之方式添加至培養基中。較佳為50 nM～50 μM之範圍，更佳為500 nM～5 μM之範圍。於使用其他甲狀腺激素受體促效劑之情形時，為表現出與上述濃度之T3或T4所表現出之促效劑活性同等程度之活性之濃度即可。
步驟(E)中所使用之培養基可適當含有L-麩醯胺、牛磺酸、血清等。步驟(E)中所使用之培養基於一例中為未添加選自由BMP訊號傳遞路徑作用物質、FGF訊號傳遞路徑抑制物質、Wnt訊號傳遞路徑作用物質、Wnt訊號傳遞路徑抑制物質、SHH訊號傳遞路徑作用物質、TGFβ家族訊號傳遞路徑抑制物質及TGFβ家族訊號傳遞路徑作用物質所組成之群中之1種以上(較佳為全部)之培養基。
作為具體之一態樣，可藉由包括下述步驟(A)～(E)之方法製備包含神經視網膜之細胞凝集體： (A)於不存在餵養細胞、含有未分化維持因子且可任意含有TGFβ家族訊號傳遞路徑抑制物質及/或音蝟因子訊號傳遞路徑作用物質之培養基中培養多能性幹細胞之步驟； (B)藉由在可含有Wnt訊號傳遞路徑抑制物質及/或音蝟因子訊號傳遞路徑作用物質之培養基中懸浮培養步驟(A)中獲得之細胞而形成細胞凝集體之步驟； (C)將步驟(B)中獲得之細胞凝集體於含有BMP訊號傳遞路徑作用物質之培養基中進一步懸浮培養之步驟； (D)將步驟(C)中獲得之細胞凝集體於含有Wnt訊號傳遞路徑作用物質、及/或FGF訊號傳遞路徑抑制物質之無血清培養基或血清培養基中培養2天至4天左右之時間之步驟；及 (E)將步驟(D)中獲得之細胞凝集體於不含Wnt訊號傳遞路徑作用物質及FGF訊號傳遞路徑抑制物質且可含有甲狀腺激素訊號傳遞路徑作用物質之無血清培養基或血清培養基中培養30天～200天左右之步驟。
作為具體之一態樣，可藉由包括下述步驟(A)～(E)之方法製備包含神經視網膜之細胞凝集體： (A)於不存在餵養細胞、含有未分化維持因子且含有TGFβ家族訊號傳遞路徑抑制物質及/或音蝟因子訊號傳遞路徑作用物質之培養基中將多能性幹細胞培養12小時～48小時之步驟； (B)藉由將步驟(A)中獲得之細胞於含有Wnt訊號傳遞路徑抑制物質及/或音蝟因子訊號傳遞路徑作用物質之培養基中懸浮培養12小時～72天(24小時～48小時)而形成細胞凝集體之步驟； (C)將步驟(B)中獲得之細胞凝集體於含有BMP訊號傳遞路徑作用物質之培養基中進一步懸浮培養8天～15天(10天～13天)之步驟； (D)將步驟(C)中獲得之細胞凝集體於含有Wnt訊號傳遞路徑作用物質、及/或FGF訊號傳遞路徑抑制物質之無血清培養基或血清培養基中培養2天至4天之步驟；及 (E)將步驟(D)中獲得之細胞凝集體於不含Wnt訊號傳遞路徑作用物質及FGF訊號傳遞路徑抑制物質且可含有甲狀腺激素訊號傳遞路徑作用物質之無血清培養基或血清培養基中培養10天～200天左右之步驟。
此處，步驟(E)可包括如下步驟：於細胞增殖用基礎培養基中培養10天～30天，繼而於細胞增殖用基礎培養基與含有甲狀腺激素訊號傳遞作用物質之連續上皮組織維持用培養基之混合培養基中培養10天～40天，進而於含有甲狀腺激素訊號傳遞作用物質之連續上皮組織維持用培養基中培養20天～140天。 於一態樣中，步驟(E)包括於甲狀腺激素訊號傳遞路徑作用物質之存在下培養20天～60天(30天～50天)。 於一態樣中，步驟(B)～步驟(E)之培養時間為70天～100天(80天～90天)。
可藉由上述方法製造包含神經視網膜之細胞凝集體，但不限定於該等。作為一態樣，包含神經視網膜之細胞凝集體亦可以細胞凝集體之混合物之形式獲得。作為其他態樣，亦可於例如96孔板之1孔中製造1個細胞凝集體，亦可逐個獲得包含神經視網膜之細胞凝集體。於任一情形時均將於相同條件下製造之細胞凝集體設為同一批次之細胞凝集體。同一批次之細胞凝集體可由業者設定為任意之範圍。例如，亦可將上述細胞凝集體之混合物中包含之細胞凝集體、或同一細胞培養容器(例如：96孔板)中所含之細胞凝集體設定為同一批次之細胞凝集體。作為其他例，亦可將使用同時製備之同一干細胞或培養基等材料之範圍設定為同一批次之細胞凝集體。同一批次之細胞凝集體於細胞之組成、純度、形態方面具有多樣性。另一方面，於根據同一批次之細胞凝集體僅評價特定之組織(例如，神經視網膜)之情形時，通常呈現出同等之基因表現圖譜。
(包含神經視網膜之細胞凝集體) 包含神經視網膜之細胞凝集體只要包含神經視網膜即可，與細胞凝集體之結構無關。於一態樣中，包含神經視網膜之細胞凝集體係球狀細胞凝集體。於一態樣中，有時於包含神經視網膜之細胞凝集體中重疊存在複數個神經視網膜(例如：參照圖5中之概念圖(1)及(2)等)。於一態樣中，包含神經視網膜之細胞凝集體包含：第一上皮組織(目標上皮組織)，其包含移植用神經視網膜；及第二上皮組織(目標外上皮組織)，其具有與第一上皮組織之表面中之切線斜率之連續性不同之表面之切線斜率之連續性，且包含非神經視網膜系細胞。此處，第一上皮組織表示實質上不含非神經視網膜系細胞(目標外細胞)且可切出移植用神經視網膜之上皮組織。另一方面，第二上皮組織亦可包含神經視網膜，但由於含有目標外細胞，故而為不適合切出移植用神經視網膜之上皮組織。於其他態樣中，包含神經視網膜之細胞凝集體僅含有包含移植用神經視網膜之第一上皮組織(目標上皮組織)，不含目標外上皮組織。
移植用神經視網膜係適於人類移植用之人類神經視網膜，較佳為僅由神經視網膜構成。移植用神經視網膜至少包含視細胞層，視細胞層至少形成於細胞凝集體之最外側，又，於內側亦可存在視細胞或視細胞前驅細胞，或於內側亦可形成視細胞層。視細胞等沿細胞凝集體之表面之切線方向連續，即互相接著存在，藉由視細胞等沿細胞凝集體之表面之切線方向連續存在，而形成含有視細胞等之視細胞層。再者，切線方向係指相對於細胞凝集體之表面之切線方向、即視細胞層中之視細胞等排列之方向，相對於該神經視網膜為平行方向或側向。又，上皮組織之表面中之切線之斜率係指上皮組織中各個細胞沿一定方向排列之情形時之細胞排列之方向，指相對於上皮組織(或上皮片)為平行方向或側向。
細胞凝集體所含之第二上皮組織係神經視網膜以外之上皮組織、即包含目標外上皮組織之上皮組織，作為第二上皮組織，可列舉眼球相關組織及腦脊髓組織，眼球相關組織意指非視網膜之眼球組織周邊之組織，可列舉：視網膜色素上皮細胞、睫狀體(例如：睫狀體周緣部)、晶狀體。腦脊髓組織意指腦及脊髓之神經組織，可列舉：前腦、端腦、大腦、間腦、下丘腦、中腦、後腦、小腦、脊髓。第二上皮組織所含之細胞及表現基因如下文所述。
作為包含第一上皮組織及第二上皮組織之細胞凝集體之一例，可列舉圖4中之概念圖及圖5中之概念圖(3)及(5)等所示之細胞凝集體。圖4中之概念圖表示作為第一上皮組織之神經視網膜之一部分中存在作為第二上皮組織之眼球相關組織(視網膜色素上皮細胞、睫狀體)(圖4之黑色部分)之細胞凝集體之一例。圖5中之概念圖(3)表示重疊存在複數個神經視網膜之情形時(例如：圖5中之概念圖(1)及(2))進而存在作為第二上皮組織之眼球相關組織(視網膜色素上皮細胞、睫狀體)(圖5(3)之黑色部分)之細胞凝集體之一例。圖5中之概念圖(5)表示存在作為第二上皮組織之腦脊髓組織(大腦等)(圖5(5)之灰色部分)之細胞凝集體之一例。如圖5中之概念圖(4)所示，存在於包含移植用神經視網膜之細胞凝集體之內側包含目標外組織之情形。於該情形時，由於不符合「具有與第一上皮組織之表面中之切線斜率之連續性不同之表面之切線斜率之連續性」之定義，故而不符合第二上皮組織。移植用神經視網膜及品質評價用樣品較佳為自內側不含目標外組織之細胞凝集體中選擇。
＜取樣步驟＞ 本發明之評價移植用神經視網膜之品質之方法包括對包含來自多能性幹細胞之具有上皮結構之神經視網膜的細胞凝集體之一部分或全部進行取樣(sampling)作為品質評價用樣品(以下稱為「取樣步驟」)。取樣細胞凝集體之一部分作為品質評價用樣品意指自複數個細胞凝集體中選擇一部分細胞凝集體(1個或複數個)、或全部細胞凝集體，使用鑷子、剪刀及/或刀等單離出(例如：切出(dissect))所選擇之細胞凝集體中之一部分作為評價用樣品。取樣細胞凝集體之全部作為品質評價用樣品意指自複數個細胞凝集體中選擇一部分細胞凝集體(1個或複數個)之細胞凝集體，分別選取(pick up)所選擇之1個或複數個細胞凝集體之全部作為品質評價用樣品。於自複數個細胞凝集體中選擇1個或複數個細胞凝集體之情形時，較佳為隨機取樣。於本說明書中，將取樣細胞凝集體之一部分作為品質評價用樣品之情形時之細胞凝集體記載為「包含品質評價用樣品之細胞凝集體」，將取樣細胞凝集體之全部作為品質評價用樣品之情形時之細胞凝集體記載為「品質評價用樣品之細胞凝集體」。
(細胞凝集體之全部之取樣) 於一態樣中，品質評價用樣品係包含來自多能性幹細胞之具有上皮結構之神經視網膜的細胞凝集體之全部。為了進行同一批次之包含神經視網膜之細胞凝集體之品質評價，品質評價用樣品可為同一批次之該細胞凝集體中之1個或複數個細胞凝集體之全部。此處，同一批次之細胞凝集體之混合物包含例如2個以上10000個以下之細胞凝集體。
具體而言，於同一批次所包含之細胞凝集體之品質評價中，自同一批次選擇1個或複數個細胞凝集體，取樣所選擇之1個或複數個細胞凝集體之全部作為品質評價用樣品。於以所選擇之1個或複數個細胞凝集體之全部作為品質評價用樣品時，可將複數個細胞凝集體之全部合一取樣，亦可分別取樣複數個細胞凝集體之全部。品質評價所使用之品質評價用樣品之細胞凝集體不可用於移植。
作為進行使用品質評價樣品之判定之結果，於判定1個或複數個作為品質評價用樣品之細胞凝集體之全部可用作移植用神經視網膜之情形時，可判定為可使用於呈現出與該細胞凝集體所含之移植用神經視網膜同等之基因表現圖譜之條件下所製造之同一批次之品質評價用樣品以外的細胞凝集體中之神經視網膜作為移植用神經視網膜，可將包含該等其他細胞凝集體所含之神經視網膜之上皮組織用於移植(亦稱為同一批次評價)。因此，該取樣方法對有效率之品質評價而言有用。
作為進行使用品質評價樣品之判定之結果，於判斷複數個作為品質評價用樣品之細胞凝集體均無法用作移植用神經視網膜之情形時，判定無法使用同一批次之其他細胞凝集體中之神經視網膜作為移植用神經視網膜。因此，例如於同一批次中之樣品數較多且混入不合適之樣品之可能性較低之情形時，通常可使用該方法(同一批次評價)。然而，由於取樣細胞凝集體之全部作為評價用樣品，故而較佳為包含含有第二上皮組織之細胞凝集體之批次不使用該方法。於該情形時，下文所述之取樣細胞凝集體之一部分(神經視網膜)而非細胞凝集體之全部進行評價更合適。又，對於包含含有第二上皮組織之細胞凝集體之批次而言，相較於同一批次評價，較佳為使用下文所述之全數評價。
(細胞凝集體之一部分之取樣) 於一態樣中，品質評價用樣品係包含來自多能性幹細胞之具有上皮結構之神經視網膜的細胞凝集體之一部分。藉由取樣細胞凝集體之一部分作為品質評價用樣品，而有不會破壞全部細胞凝集體而可將剩餘部分所含之神經視網膜用於移植之優點。即，若對於作為細胞凝集體之一部分之品質評價用樣品，藉由下文所述之判定步驟而判定為合格，則認為可將包含該品質評價用樣品之細胞凝集體中具有上皮結構之神經視網膜用作移植用神經視網膜，而可用於移植。
作為一態樣，該取樣方法可用於對包含神經視網膜之細胞凝集體之品質進行個別地評價(亦稱為個別評價)。於該情形時，亦有可選擇全部欲評價之包含神經視網膜之細胞凝集體而對全部進行品質評價之優點(全數評價)。該評價方法(個別評價、全數評價)可個別地評價移植用神經視網膜之品質，因此可認為其為最準確之品質評價方法。另一方面，於樣品數較多之情形時，需要非常多之勞力與成本。再者，該評價方法之前提為於1個細胞凝集體中去除移植用神經視網膜之部位存在呈現出與該神經視網膜同等之基因表現圖譜之部位(品質評價用樣品)，且切出該品質評價用樣品。尤其是於包含第二上皮組織之細胞凝集體中，是否滿足該前提係較大之問題。本發明者等人藉由對大量樣品進行評價，始發現包含神經視網膜之細胞凝集體滿足該前提、及可使用該評價方法。
為了發揮上述優點，作為品質評價用樣品而取樣之細胞凝集體之一部分較佳為不含移植用神經視網膜或移植用神經視網膜之候補之一部分。又，品質評價用樣品較佳為呈現出與移植用神經視網膜或移植用神經視網膜之候補同等之基因表現圖譜之一部分。為了使品質評價用樣品呈現出與移植用神經視網膜同等之基因表現圖譜，品質評價用樣品較佳為至少一部分與移植用神經視網膜接近或連續，較佳為與移植用神經視網膜包含於同一上皮組織中。又，移植用神經視網膜較佳為包含同一上皮組織之中心附近作為細胞凝集體中最良好之(例如：包含神經視網膜且不含非神經視網膜，具有連續上皮結構之)部分，較佳為同一上皮組織之中心附近且為下文所述之[移植用神經視網膜片]所記載之大小。因此，品質評價用樣品較佳為不含同一上皮組織之中心附近。此處，同一上皮組織意指具有上皮組織之表面中之切線斜率之連續性的連續之上皮組織，同一上皮組織較佳為連續上皮組織。此處，上皮組織(連續上皮組織)之中心附近係同一上皮組織之表面中距兩端之距離相等之部位，業者可藉由利用顯微鏡之觀察而推定。又，品質評價用樣品較佳為與用作移植用神經視網膜之部位(例如：包含一個上皮組織之中心附近之移植所使用之部位)連續或接近之部分，且為於可進行品質評價之範圍內儘量窄之部分。例如，移植用神經視網膜為同一上皮組織之中心附近之部位，品質評價用樣品為該同一上皮組織中至少一部分與該移植用神經視網膜連續或接近之部分。
於個別評價及或全數評價之一態樣中，於包含移植用神經視網膜之細胞凝集體含有包含移植用神經視網膜之第一上皮組織、及具有與第一上皮組織之表面中之切線斜率之連續性不同之表面之切線斜率之連續性且包含目標外細胞之目標外上皮組織(第二上皮組織)之情形時，移植用神經視網膜較佳為包含距目標外上皮組織最遠之第一上皮組織上之區域，此時，品質評價用樣品可為存在於目標外上皮組織與移植用神經視網膜之間之一部分。例如於自目標外上皮組織之中心向第一上皮組織之外周作直線之情形時，距目標外上皮組織最遠之第一上皮組織上之區域係包含該長度最長之情形時之第一上皮組織之外周之點的區域。進而，品質評價用樣品較佳為與移植用神經視網膜(例如：包含一個上皮組織之中心附近之移植所使用之部位)接近或連續之部分，且為於可進行品質評價之範圍內儘量窄之部分。作為移植片及品質評價用樣品之一例，可列舉圖4之概念圖。
作為其他態樣，為了進行同一批次之包含神經視網膜之細胞凝集體之品質評價(同一批次評價)，亦可取樣同一批次之該細胞凝集體中之1個或複數個細胞凝集體之一部分代替同一批次之該細胞凝集體中之1個或複數個細胞凝集體之全部而作為品質評價用樣品。即，亦可自同一批次之細胞凝集體選擇1個或複數個細胞凝集體，而僅使用自所選擇之細胞凝集體切出之一部分作為品質評價用樣品。尤其是於如包含第二上皮組織之細胞凝集體般無法將全部用於品質評價且於效率良好地實施品質評價之情形時，該取樣方法有用。該情形時之品質評價用樣品較佳為使用移植用神經視網膜。此處用作品質評價用樣品之移植用神經視網膜係指於呈現出與移植用視網膜同等之基因表現圖譜之條件下所製造之細胞凝集體中之神經視網膜。藉由將若未作為品質評價用樣品而取樣則會用作移植用神經視網膜之部位用於品質評價，而可更準確地進行同一批次之其他包含移植用神經視網膜之細胞凝集體之品質評價。
可將細胞凝集體中形成連續之上皮結構且見到外神經母細胞層與內神經母細胞層分為2層之部位判定為神經視網膜。另一方面，由於作為第二上皮組織之眼球相關組織、尤其是視網膜色素上皮細胞於目視或顯微鏡下呈黑色，故而業者可容易地將其與神經視網膜加以區別。又，作為第二上皮組織之腦脊髓組織於目視或顯微鏡下，只要著眼於形態上之特徵即於細胞凝集體之表面上無法確認到連續之上皮結構、無法確認到神經視網膜特有之形態特徵、及/或色調看起來暗沉等，則業者可容易地將其與神經視網膜加以區別。因此，即便為包含第二上皮組織之細胞凝集體，業者亦可自包含神經視網膜之第一上皮組織單離出移植用神經視網膜及品質評價用樣品。
如上所述，於一態樣中，根據與移植用神經視網膜或移植用神經視網膜之候補之一定之位置關係設定品質評價用樣品並取樣。即，藉由設定移植用神經視網膜或其候補，可確定作為品質評價用樣品而切出之區域。此處，移植用神經視網膜(亦稱為移植片、帽(Cap))及其候補於一態樣中可藉由上述細胞凝集體中之位置(例如：為上皮組織(連續上皮組織)之中心附近，於具有第二上皮組織之情形時，進而為距第二上皮組織最遠之第一上皮組織上之區域)、及下文所述之[移植用神經視網膜片]中所記載之大小等而特定出。因此，業者可將具有該特徵之神經視網膜設定為移植用神經視網膜或其候補。
關於自同一細胞凝集體取樣移植用神經視網膜與品質評價用樣品之情形時之品質評價用樣品(亦稱為環(Ring))，業者可設定為至少一部分與以上述方式設定之移植用神經視網膜連續或接近之區域，且為於可進行品質評價之範圍內儘量窄之區域。關於取樣同一批次之該細胞凝集體中之1個或複數個細胞凝集體之一部分作為品質評價用樣品之情形時之品質評價用樣品，業者可取樣該細胞凝集體中之上述移植用神經視網膜或其候補之部分。該情形時作為品質評價用樣品所切出之大小可為下文所述之[移植用神經視網膜片]所記載之大小，亦可更小。因此，可藉由與移植用神經視網膜或其候補之位置之關係及上述大小，設定品質評價用樣品並取樣。
＜檢測步驟＞ 本發明之評價移植用神經視網膜之品質之方法包括對品質評價用樣品中之神經視網膜系細胞相關基因及非神經視網膜系細胞相關基因(目標外細胞相關基因)之表現進行檢測(檢測步驟)。該檢測步驟較佳為對上述基因之表現量進行定量檢測。目標外細胞相關基因包含選自由腦脊髓組織標記基因及眼球相關組織標記基因所組成之群中之1種以上之基因。
(神經視網膜系細胞相關基因) 神經視網膜系細胞相關基因(目標細胞相關基因)意指神經視網膜系細胞表現之基因。作為神經視網膜系細胞相關基因，較佳為與目標外細胞相比而於視細胞(視桿細胞、視錐細胞)、水平細胞、無軸突神經細胞、中間神經細胞、視網膜神經節細胞(神經節細胞)、雙極細胞(視桿雙極細胞、視錐雙極細胞)、米勒細胞、或該等細胞之前驅細胞、神經視網膜前驅細胞等中較高地表現之基因。作為神經視網膜系細胞相關基因，可列舉上述神經視網膜系細胞標記，較佳為RAX、Chx10、SIX3、SIX6、RCVRN、CRX、NRL及NESTIN。將神經視網膜系細胞標記之GenBank ID示於下述之表1。 [表1]
基因名 GenBank ID
RAX NM_013435.2
Chx10 NM_182894.2
SIX3 NM_005413.4
SIX6 NM_007374.2
RCVRN NM_002903.2
CRX NM_000554.6
NRL NM_006177.4
NESTIN NM_006617.2
神經視網膜系細胞相關基因較佳為表1所記載之基因，但不限定於該等。除此以外，作為神經視網膜系細胞相關基因，可列舉：Rax2、Vsx1、Blimp1、RXRG、S-視蛋白、M/L-視蛋白、視紫質、Brn3、L7等。
(非神經視網膜系細胞相關基因) 於製造包含神經視網膜之細胞凝集體作為醫藥品原材料之過程中作為副產物而被誘導之目標外細胞及為了評價醫藥品之品質而檢測該目標外細胞之方法係完全未知。本發明者等人於銳意研究持續生產滿足作為醫藥品原材料之基準之品質的神經視網膜之方法之過程中，發現具有作為副產物而製造之可能性之細胞或組織，對其進行有效率且有效地鑑定，而作為可用以實施神經視網膜之品質評價之基因，發現了非神經視網膜系細胞相關基因(目標外細胞相關基因)。
於一態樣中，非神經視網膜系細胞相關基因(目標外細胞相關基因)可列舉腦脊髓組織標記基因及眼球相關組織標記基因。於一態樣中，亦可包含未分化iPS細胞標記基因作為非神經視網膜系細胞相關基因。
於一態樣中，腦脊髓組織標記基因可為選自由端腦標記基因、間腦/中腦標記基因及脊髓標記基因所組成之群中之1種以上之基因。間腦/中腦標記基因可為選自由間腦標記基因、中腦標記基因、及與作為間腦之一部分之下丘腦相關之下丘腦標記基因所組成之群中之1種以上之基因。
於一態樣中，眼球相關組織標記基因可為選自由optic stalk標記基因、睫狀體標記基因、晶狀體標記基因及視網膜色素上皮標記基因所組成之群中之1種以上之基因。
端腦標記基因意指於端腦表現之基因。端腦標記基因可包含選自由FoxG1(別名Bf1)、Emx2、Dlx2、Dlx1及Dlx5所組成之群中之1種以上之基因。將端腦標記基因之GenBank ID示於下述之表2。 [表2]
基因名 GenBank ID
FOXG1 NM_005249.4
Emx2 NM_004098.4 NM_001165924.1
DLX2 NM_004405.4
DLX1 NM_178120.5 NM_001038493.1
DLX5 NM_005221.6 XM_005250185.3 XM_017011803.1
端腦標記基因較佳為表2所記載之基因，但不限定於該等。除此以外，作為端腦標記基因，可列舉：Emx1、LHX2、LHX6、LHX7、Gsh2等。
間腦/中腦標記基因意指於間腦及/或中腦表現之基因。間腦/中腦標記基因可包含選自由OTX1、OTX2及DMBX1所組成之群中之1種以上之基因。將間腦/中腦標記基因之GenBank ID示於下述之表3。間腦/中腦標記基因亦可包含與作為間腦之一區域之下丘腦相關而於下文所述之下丘腦標記。即，間腦/中腦標記基因可包含選自由OTX1、OTX2、OTX2、DMBX1、Rx、Nkx2.1、OTP、FGFR2、EFNA5及GAD1所組成之群中之1種以上之基因。 [表3]
基因名 GenBank ID
OTX1 NM_001199770.1 NM_014562.4
OTX2 NM_001270523.1 NM_001270524.1 NM_001270525.1 NM_021728.3 NM_172337.2
DMBX 1 NM_172225.1 NM_147192.2 XM_011540668.2 XM_017000289.1
下丘腦標記基因意指於下丘腦表現之基因。下丘腦標記基因亦可包含選自由Rx、Nkx2.1、Dmbx1、OTP、gad1、FGFR2及EFNA5所組成之群中之1種以上之基因。將下丘腦標記基因之GenBank ID示於下述之表4。 [表4]
基因名 GenBank ID
Rx NM_013435.2
Nkx2.1 NM_003317.3, NM_001079668.2
OTP NM_032109.2
gad1 NM_000817.3, NM_013445.3 XM_005246444.3, XM_011510922.1 XM_017003756.1, XM_017003758.2 XM_017003757.2, XM_024452783.1
FGFR2 NM_022970.3, NM_000141.4 NM_023029.2, NM_001144913.1 NM_001144914.1, NM_001144915.1 NM_001144916.1, NM_001144917.1 NM_001144918.1, NM_001144919.1 NM_001320654.1, NM_001320658.1 NR_073009.1, XM_006717708.3 XM_006717710.4, XM_017015920.2 XM_017015921.2, XM_017015924.2 XM_017015925.2, XM_024447888.1 XM_024447887.1, XM_024447890.1 XM_024447889.1, XM_024447892.1 XM_024447891.1
EFNA5 NM_001962.3, XM_006714565.3 XM_011543250.3, XM_011543251.2 XM_017009205.1
脊髓標記基因意指於脊髓表現之基因。脊髓標記基因可包含選自由HoxB2、HoxA5、HOXC5、HOXD1、HOXD3及HOXD4所組成之群中之1種以上之基因。將脊髓標記基因之GenBank ID示於下述之表5。 [表5]
基因名 GenBank ID
HOXB2 NM_002145.3 XM_005257275.4
HOXA5 NM_019102.4
HOXC5 NM_018953.3 NR_003084.2
HOXD1 NM_024501.3
HOXD3 NM_006898.4 XM_005246509.4 XM_005246511.4 XM_005246513.5 XM_011511065.3 XM_011511066.3
HOXD4 NM_014621.3 XM_005246514.4
脊髓標記基因較佳為表2所記載之基因，但不限定於該等。除此以外，作為脊髓標記基因，可列舉形成Hox基因簇之基因群等。
另一方面，於一態樣中，於製造步驟使用視黃酸之情形時，於製造良品之視網膜組織之情形時亦可觀察到HOX基因(例如，HOXC5、HOXA5及HOXB2)之表現。認為HOX基因之表現受到視黃酸訊號所控制，HOX基因表現以不會對視網膜組織之分化誘導造成影響之程度增加。認為該視黃酸訊號之效果係藉由促進沿前後軸之後側化而獲得。因此，於製造步驟使用視黃酸之情形時(尤其是於開始向視網膜之分化誘導時期以後使用視黃酸之情形時)，將HOX基因(例如，HOXC5、HOXA5及HOXB2)排除於品質評價對象基因外，或即便觀察到該等基因之表現亦可判斷移植用神經視網膜之品質為良品。
Optic Stalk標記基因意指於Optic Stalk表現之基因。Optic Stalk標記基因可包含選自由GREM1、GPR17、ACVR1C、CDH6、Pax2、Pax8、GAD2及SEMA5A所組成之群中之1種以上之基因。將Optic Stalk標記基因之GenBank ID示於下述之表6。 [表6]
基因名 GenBank ID
GREM1 NM_013372.7, NM_001191322.1 NM_001191323.1, NM_001368719.1 XM_017022077.1
GPR17 NM_001161417.1, NM_005291.2 NM_001161415.1, NM_001161416.1 XM_017003833.2
ACVR1C NM_145259.3, NM_001111031.1 NM_001111032.1, NM_001111033.1
CDH6 NM_004932.4, NM_001362435.1 XM_011513921.3, XM_017008910.2 XR_001741972.2
Pax2 NM_000278.4, NM_003987.4 NM_003988.4, NM_003989.4 NM_003990.4, NMJJ01304569.1
Pax8 NM_003466.4, NM_013952.3 NM_013953.3, NM_013992.3
GAD2 NM_001134366.2, NM_000818.2
SEMA5A NM_003966.3, XM_006714506.3 XM_006714507.3, XM_011514155.2 XM_011514156.2, XM_011514157.2 XM_011514158.2, XM_011514159.2 XM_017010016.2
晶狀體標記基因意指於晶狀體表現之基因。晶狀體標記基因可包含選自由CRYAA及CRYBA1所組成之群中之1種以上之基因。將晶狀體標記基因之GenBank ID示於下述之表7。 [表7]
基因名 GenBank ID
CRYAA NM_000394.3 NM_001363766.1
CRYBA1 NM_005208.4 XM_017024198.1
睫狀體標記基因意指於睫狀體、睫狀體周緣部、及或Ciliary body表現之基因。睫狀體標記基因可包含選自由Zic1、MAL、HNF1beta、FoxQ1、CLDN2、CLDN1、GPR177、AQP1及AQP4所組成之群中之1種以上之基因。將睫狀體標記基因之GenBank ID示於下述之表8。 [表8]
基因名 GenBank ID
Zic1 NM_003412.4
MAL NM_002371.4, NM_022438.2 NM_022439.2, NM_022440.2
HNF1beta NM_000458.4, NM_001165923.3 NM_001304286.1, XM_011525160.1 XM_011525161.1, XM_011525162.2 XM_011525163.2, XM_011525164.1
FoxQ1 NM_033260.4
CLDN2 NM_001171092.1, NM_020384.3 NM_001171095.1
CLDN1 NM_021101.5
GPR177 NM_024911J, NM_001002292.3 NM_001193334.1, XM_011542191.2 XM_011542192.3, XM_017002390.2
AQP1 NM_198098.3, NM_001329872.1
AQP4 NM_001650.7, NM_004028.4 NM_001317384.2, NM_001317387.2 NM_001364286.1, NM_001364287.1 NM_001364289.1, XM_011525942.3
視網膜色素上皮標記基因意指於視網膜色素上皮細胞表現之基因。視網膜色素上皮標記基因可列舉上述視網膜色素上皮標記，可包含選自由MITF、TTR及BEST1所組成之群中之1種以上之基因。將視網膜色素上皮標記基因之GenBank ID示於下述之表9。 [表9]
基因名 GenBank ID
MITF NM_000248.3, NM_006722.2 NM_198158.2, NM_198159.2 NM_198177.2, NM_198178.2 NM_001184967,1, NM_001184968.1 NM_001 354604.1, NM_001354605.1 NM_001354606.1, NM_001354607.1 NM_001354608.1
BEST1 NM_004183.4, NM_001139443.1 NM_001300786,1, NM_001300787.1 NM_001363591.1, NM_001363592.1 NM_001363593.1, NR_134580.1 XM_005274210.4, XM_005274215.4 XM_005274216.4, XM_005274219.4 XM_005274221.4, XM_011545229.3 XM_011545230.3, XM_011545233.3 XM_017018230.2, XR_001747952.2 XR_001747953.2, XR_001747954.2
TTR NM_000371.3
於一態樣中，目標外細胞相關基因可進而包含未分化多能性幹細胞標記基因。
未分化多能性幹細胞標記基因可包含選自由Oct3/4、Nanog及lin28所組成之群中之1種以上之基因。較佳為未分化多能性幹細胞標記基因係選自由Oct3/4 、Nanog及lin28所組成之群中之1種以上之基因。將未分化多能性幹細胞標記基因之GenBank ID示於下述之表10。 [表10]
基因名 GenBank ID
Oct3/4 (POU5F1) NM_002701.6, NM_203289.5 NM_001173531.2, NM_001285986.1 NM_001285987.1
Nanog NM_024865.4, NM_001297698.1
lin28 NM_024674.6, XM_011542148.2
SOX2 NM_003106.4
KLF4 NM_001314052.1, NM_004235.6
c-Myc NM_001354870.1, NM_002467.6
Glis1 NM_001367484.1, NM_147193.2 XM_017000409.1, XM_017000411.1 XM_017000408.1, XM_017000410.1 XM_017000412.1
Sall4 NM_001318031.1, NM_0520436.5 XM_011528921.2, XM_011528922.2 XM_005260467.4
Esrrb NM_004452.3, XM_011536553.2 XM_024449508.1, XM_011536547.2 XM_011536554.2, XM_011536550.2 XM_024449509.1, XM_017021085.1
(檢測方法) 於一態樣中，神經視網膜系細胞相關基因及非神經視網膜系目標外細胞相關基因之表現之檢測並無特別限定，可列舉西方墨點、免疫染色、流式細胞術分析/流式細胞計(FACS(註冊商標，BD公司製造)等)、北方墨點、電泳法、PCR(較佳為定量PCR(qPCR)及或即時PCR)、基因晶片分析、下一代定序儀等方法。其中，就定量性、檢測感度、結果之穩定性及速度之觀點而言，有用的是定量PCR。進而，藉由將為了進行單細胞之定量PCR所使用之裝置(例如，Biomark HD(Fluidigm公司製造)等)應用於通常之定量PCR，可於短時間內評價複數之品質評價用樣品。尤其是於實施全數評價之情形時，特別是於用於品質評價之樣品數及所評價之基因數較多之情形時，藉由使用該方法，可迅速地進行品質評價。
於一態樣中，亦可藉由定量PCR同時檢測2個以上之品質評價用樣品中之各神經視網膜系細胞相關基因及非神經視網膜系細胞相關基因之表現量。該定量PCR例如可藉由下述包括下述(1)～(5)之步驟的方法而進行。 (1)準備流路板、由2個以上之上述品質評價用樣品獲得之含有核酸之溶液(樣品溶液)、含有1種或複數種對1種以上之上述神經視網膜系細胞相關基因或上述非神經視網膜系細胞相關基因具有特異性之引子之溶液(引子溶液)，該流路板具有1組包含8個以上800個以下之獨立之樣品孔的樣品孔組、1組以上包含8個以上800個以下之獨立之引子孔的引子孔組、及將樣品孔組中之獨立之樣品孔與各引子孔組中之獨立之引子孔相連之流路； (2)於樣品孔組中，以每個上述品質評價用樣品成為1種樣品溶液/1個樣品孔之方式添加上述樣品溶液； (3)於上述1組以上之引子孔組中，將上述引子溶液以成為不同之引子孔組之方式添加至1個以上之引子孔中； (4)經由上述流路，將上述引子分別混合於上述核酸中；及 (5)使用(4)中獲得之混合液進行定量PCR。
由2個以上之品質評價用樣品獲得之含有核酸之溶液可藉由使自品質評價用樣品提取之RNA進行使用反轉錄酶及引子之反轉錄反應而準備。業者可使用周知之方法適當實施RNA提取或反轉錄反應。又，業者可根據需定量之基因而準備可擴增該基因之引子。
於一態樣中，上述含有核酸之溶液(樣品溶液)亦可為於添加至樣品孔組之各孔中之前便藉由PCR裝置，使用所需使用之全部引子而實施了多重PCR(multiplex-PCR)反應(Pre-Run)之溶液。藉由Pre-Run而一定程度地擴增核酸，藉此可有效地實施定量PCR。作為Pre-Run之條件，例如可列舉藉由所需使用之全部引子使含有核酸之溶液進行PCR反應10循環～15循環左右。
於一態樣中，定量PCR可使用上文所述之具有連結不同孔組之流路之流路板。流路板上具有：流路(例如積體流體迴路)、用以添加含有核酸之溶液之複數個孔、及用以添加引子之複數個孔，各孔可與1條或複數條流路(積體流體迴路)相連。將含有核酸之溶液及引子逐個添加至各孔中。作為一態樣，可使用周知之裝置(例如，IFC控制器HX、IFC控制器MX、IFC控制器RX，均為Fluidigm公司製造)對孔施加氣壓，藉此使添加至各孔中之含有核酸之溶液及引子流入至流路(積體流體迴路)中。流路(積體流體迴路)例如可為將樣品溶液與引子溶液1比1混合之結構。藉此，1次可製備樣品溶液與引子溶液之組合數量(例如，於使用樣品溶液與引子溶液各96個之情形時，組合數量為96×96＝9216)之樣品溶液與引子溶液之混合液。調整混合液後，利用定量PCR裝置(例如Biomark HD)使流路板進行定量PCR反應，藉此可同時測定各含有核酸之溶液中之各基因之表現量。
又，使用可檢測表現細胞之比率之流式細胞計的流式細胞術分析亦有用。近年來，檢測速度不斷改良，亦可利用具備高通量性之可評價大量檢體之流式細胞計(FACS(註冊商標)等)。因此，對於神經視網膜系細胞相關基因及非神經視網膜系目標外細胞相關基因之表現之檢測而言，高通量流式細胞計之利用亦有用。此種高通量流式細胞計可使用市售品(例如：MACSQuant(註冊商標) Analyzers：Miltenyi Biotec公司製造)。
＜判定步驟＞ 本發明之方法包括於見到神經視網膜系細胞相關基因之表現且未見到非神經視網膜系細胞相關基因之表現之情形時，判定為可使用如下者作為移植用神經視網膜(判定步驟)：包含作為上述一部分之品質評價用樣品之細胞凝集體中之包含神經視網膜之上皮組織(移植用神經視網膜)及與包含作為上述一部分之品質評價用樣品之細胞凝集體、或作為上述全部之上述品質評價用樣品之細胞凝集體為同一批次之細胞凝集體中之包含神經視網膜之上皮組織(移植用神經視網膜)。此處，可用作移植用神經視網膜意指為適合移植之神經視網膜，亦指具有作為移植用神經視網膜之適性、或作為移植用神經視網膜而合格。
見到神經視網膜系細胞相關基因之表現意指於基因之表現之檢測法中，可觀察到可藉由該檢測法實質檢測到之級別(例如，檢測下限值以上)之神經視網膜系細胞相關基因之表現。又，未見到非神經視網膜系細胞相關基因之表現意指於基因之表現之檢測法中，藉由該檢測法無法實質檢測到非神經視網膜系細胞相關基因之表現(例如，未達檢測下限值)。可實質檢測性係指超出無法認為該基因實質發揮功能之程度而檢測到該基因。業者可根據該基因及該檢測法而適當設定。例如，於具有定量性之基因表現之檢測法之情形時，以該基因表現之檢測下限值為基準，可判斷超過0%～10%以下、超過0%～5%以下之範圍不為可實質檢測之級別(即，無法檢測到該基因之表現)。
於一態樣中，較佳為於定量PCR法中，於滿足以下之基準1及基準2之情形時，判定為可用作移植用神經視網膜。 基準1：神經視網膜系細胞相關基因之閾值循環(Ct)值與內部標準基因之Ct值之差(ΔCt值)為10以下 基準2：非神經視網膜系細胞相關基因之Ct值與內部標準基因之Ct值之差(ΔCt值)為5以上
閾值循環(Ct)值意指於藉由PCR進行之基因之擴增依指數函數發生之區域內成為一定之擴增產物量之循環數。由於Ct值與基因之初始量為負相關，故而用於算出基因之初始複製數。於一態樣中，由於「2＾Ct值(2之Ct值次方)」與基因之初始量成反比例，故而用於算出基因之初始複製數。具體而言，包含2倍初始量之基因之樣品與擴增前僅包含一半複製數之基因之樣品相比，Ct值領先1循環。一定之擴增產物量只要為藉由PCR進行之基因之擴增依指數函數發生之區域內即可，業者可進行設定。
內部標準基因意指試樣間表現量之差較小之基因。作為內部標準基因，可適當使用業者所周知者，例如可列舉：18S核糖體RNA、β肌動蛋白、HPRT(Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase，次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶)、α微管蛋白、運鐵蛋白受體、泛蛋白、GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，甘油醛3-磷酸去氫酶)等，較佳為GAPDH。
由於Ct值與基因之初始量為負相關，故而依存於細胞內之基因之表現量。即，於含核酸溶液之濃度為一定之情形時，Ct值根據所使用之內部標準基因而不同，特定基因之Ct值與內部標準基因之Ct值之差(ΔCt值)受到所使用之內部標準基因之影響。本說明書中之ΔCt值於無特別記載之情形時，將使用GAPDH作為內部標準基因之情形時之值記載為基準。
於使用GAPDH以外之內部標準基因作為內部標準基因之情形時，可藉由將GAPDH與該GAPDH以外之內部標準基因之表現量加以比較，而修正上述基準1及基準2之ΔCt值。
於一態樣中，於使用β肌動蛋白作為內部標準基因之情形時，於本案製法中，GAPDH與β肌動蛋白中GAPDH之Ct值較β肌動蛋白之Ct值低大致1左右，即GAPDH之RNA之絕對量為β肌動蛋白之RNA之絕對量之2倍左右，因此設為： 基準1：神經視網膜系細胞相關基因之閾值循環(Ct)值與內部標準基因之Ct值之差(ΔCt值)為9以下 基準2：非神經視網膜系細胞相關基因之Ct值與內部標準基因之Ct值之差(ΔCt值)為4以上。
於一態樣中，於使用HPRT作為內部標準基因之情形時，於本案製法中，GAPDH與HPRT中GAPDH之Ct值較HPRT低7左右，即GAPDH之RNA之絕對量為HPRT之RNA之絕對量之2^7(2之7次方，128倍)左右，因此設為： 基準1：神經視網膜系細胞相關基因之閾值循環(Ct)值與內部標準基因之Ct值之差(ΔCt值)為3以下 基準2：非神經視網膜系細胞相關基因之Ct值與內部標準基因之Ct值之差(ΔCt值)為-2以上。
神經視網膜系細胞相關基因為上述基因即可。作為神經視網膜系細胞相關基因，存在複數種基因。即，即便於自同一神經視網膜系細胞提取之情形時，上述基準值1之Ct值亦可根據神經視網膜系細胞相關基因之種類而不同。業者可根據該神經視網膜系細胞相關基因之表現部位或表現量等公知資訊，對各基因設定可判斷神經視網膜系細胞相關基因表現之ΔCt值。
例如，關於Chx10基因，於以GAPDH作為內部標準之情形時，ΔCt值可為20以下，較佳為15以下，更佳為10以下。
例如，關於Recoverin基因，於以GAPDH作為內部標準之情形時，ΔCt值可為16以下，較佳為11以下，更佳為6以下。
通常，神經視網膜系細胞相關基因之Ct值與內部標準基因(例如：GAPDH)之Ct值之差(ΔCt值)例如可為25以下、20以下、15以下或10以下。神經視網膜系細胞相關基因之Ct值與內部標準基因之Ct值之差例如可為-10以上、-5以上、0以上或5以上。
非神經視網膜系細胞相關基因為上述基因即可。作為非神經視網膜系細胞相關基因，存在複數種基因。即，即便於自同一非視網膜系細胞提取之情形時，Ct值亦根據非神經視網膜系細胞相關基因而不同。業者可根據該非神經視網膜系細胞相關基因之表現部位或表現量等公知資訊，對各基因設定可判斷神經視網膜系細胞相關基因表現之ΔCt值。例如，關於PAX2基因，於以GAPDH作為內部標準之情形時，ΔCt值可為5以上。關於HOXB2基因，於以GAPDH作為內部標準之情形時，ΔCt值可為5以上。通常，非神經視網膜系細胞相關基因之Ct值與內部標準基因之Ct值之差可為30以下、25以下、20以下。又，非神經視網膜系細胞相關基因之Ct值與內部標準基因之Ct值之差例如可為0以上、3以上或5以上。
上述品質評價方法可作為醫藥品(移植用神經視網膜)之品質管理方法或醫藥品(移植用神經視網膜)之製造步驟中之品質管理方法使用。
[移植用神經視網膜片] 本發明之一態樣係一種移植用神經視網膜片，其特徵在於： (1)其源自多能性幹細胞： (2)其具有三維結構； (3)其包含神經視網膜層，該神經視網膜層具有包含視細胞層及內層之複數個層結構； (4)視細胞層包含選自由視細胞前驅細胞及視細胞所組成之群中之1種以上之細胞； (5)內層包含選自由視網膜前驅細胞、神經節細胞、無軸突神經細胞及雙極細胞所構成之群中之1種以上之細胞； (6)神經視網膜層之表面具有頂端面； (7)內層存在於沿頂端面而存在之視細胞層之內側； (8)相對於移植用神經視網膜片之表面之總面積，神經視網膜層之面積為50%以上； (9)相對於神經視網膜層之頂端面之總面積，連續上皮結構之面積為80%以上； (10)見到移植用神經視網膜片中之神經視網膜系細胞相關基因之表現，且未見到非神經視網膜系細胞相關基因之表現，非神經視網膜系細胞相關基因包含選自由腦脊髓組織標記基因及眼球相關組織標記基因所組成之群中之1種以上之基因。
作為一態樣，該移植用神經視網膜片係藉由上述品質評價方法切出之移植用神經視網膜。因此，下文所述之該移植用神經視網膜片之特徵亦符合藉由上述品質評價方法切出之移植用神經視網膜之特徵。
該移植用神經視網膜片係(3)包含神經視網膜層，該神經視網膜層具有包含視細胞層及內層之複數個層結構。如(6)及(7)所記載，視細胞層存在於該移植用神經視網膜片之外側(表面)，亦可於內層亦存在異位性之視細胞層。
該移植用神經視網膜片係(5)內層包含選自由視網膜前驅細胞、神經節細胞、無軸突神經細胞及雙極細胞所構成之群中之1種以上之細胞，亦可包含選自由異位性之視細胞前驅細胞及視細胞所組成之群中之1種以上之細胞。於一態樣中，亦提供如下移植用神經視網膜片：神經節細胞、無軸突神經細胞、水平細胞之含有率為總細胞數之30%以下之移植用神經視網膜片；神經節細胞、無軸突神經細胞、水平細胞及雙極細胞之含有率為總細胞數之30%以下之移植用神經視網膜片；及/或雙極性細胞之含有率為總細胞數之10%以下之移植用神經視網膜片。
該移植用神經視網膜片係(8)相對於移植用神經視網膜片之表面之總面積，神經視網膜層之面積為40%以上，較佳為50%以上，更佳為60%以上。該移植用神經視網膜片係(9)相對於神經視網膜層之頂端面之總面積，連續上皮結構之面積為60%以上，較佳為70%以上，更佳為80%以上。
神經視網膜系細胞相關基因及非神經視網膜系細胞相關基因(腦脊髓組織標記基因及眼球相關組織標記基因)係上述基因。
(10)見到移植用神經視網膜片中之神經視網膜系細胞相關基因之表現、且未見到非神經視網膜系細胞相關基因之表現可藉由取移植用神經視網膜片之一部分檢測基因之表現而判明。又，只要為自藉由上述移植用神經視網膜之品質評價方法而於品質評價用樣品中實質見到神經視網膜系細胞相關基因之表現、且實質未見到非神經視網膜系細胞相關基因之表現之細胞凝集體單離之移植用神經視網膜片，則無需移植用神經視網膜片本身之基因表現之檢測。實質見到該基因之表現或未見到表現係如上所述，由基因之表現之檢測法中是否為可藉由該檢測法實質檢測之級別所確定。
移植用神經視網膜片中之神經視網膜系細胞相關基因例如可為選自由Rx、Chx10、Pax6及Crx所組成之群中之1種以上。表現神經視網膜系細胞相關基因之細胞(陽性細胞)相對於總細胞數之比率根據神經視網膜之分化階段而有所不同。
於一態樣中，移植用神經視網膜片中之Rx陽性細胞相對於總細胞數之比率可為30%以上、40%以上、50%以上、或60%以上。於一態樣中，移植用神經視網膜片中之Chx10陽性細胞或Pax6陽性細胞相對於總細胞數之比率可為10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、或50%以上。於一態樣中，移植用神經視網膜片中之Crx陽性細胞相對於總細胞數之比率可為10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、或50%以上。
於一態樣中，移植用神經視網膜片中之Rx陽性細胞相對於總細胞數之比率可為30%以上80%以下、40%以上70%以下、45%以上60%以下、或50%以上60%以下。於一態樣中，移植用神經視網膜片中之Chx10陽性細胞或Pax6陽性細胞相對於總細胞數之比率可為10%以上80%以下、20%以上70%以下、30%以上60%以下、或40%以上50%以下。於一態樣中，移植用神經視網膜片中之Crx陽性細胞相對於總細胞數之比率為10%以上70%以下、10%以上60%以下、20%以上60%以下、30%以上60%以下、40%以上60%以下、或50%以上60%以下。
於一態樣中，移植用神經視網膜片中相對於總細胞數之(1)Chx10陽性且Pax6陽性細胞(神經視網膜前驅細胞)之比率可為10%以上50%以下或10%以上30%以下；(2)Chx10陽性且Pax6陰性細胞(偏向雙極細胞之前驅細胞)之比率可為10%以上25%以下或15%以上25%以下；(3)Chx10陰性且Pax6陽性細胞(神經節細胞及無軸突神經細胞)之比率可為10%以上25%以下或10%以上20%以下。
於其他態樣中，移植用神經視網膜片中相對於總細胞數之(1)Chx10陽性且Pax6陽性細胞(神經視網膜前驅細胞)之比率可為20%以上40%以下；(2)Chx10陽性且Pax6陰性細胞(偏向雙極細胞之前驅細胞)之比率可為5%以上20%以下；(3)Chx10陰性且Pax6陽性細胞(神經節細胞及無軸突神經細胞)之比率可為5%以上20%以下或5%以上15%以下。
於一態樣中，本發明之移植用神經視網膜片可為藉由上述移植用神經視網膜之品質評價方法判定為可用作移植用神經視網膜之移植用神經視網膜，且為經單離之片狀之移植用神經視網膜。
於一態樣中，本發明之移植用神經視網膜片可為自包含神經視網膜之細胞凝集體單離者，為包含該細胞凝集體中之連續上皮組織之中心附近之區域的移植用神經視網膜片。
於一態樣中，本發明之移植用神經視網膜片可為自至少包含第一上皮組織及第二上皮組織之細胞凝集體單離者，上述細胞凝集體中，上述第一上皮組織包含人類神經視網膜，上述第二上皮組織具有與上述第一上皮組織之表面之切線斜率之連續性不同的表面之切線斜率之連續性，且包含非神經視網膜系細胞，上述移植用神經視網膜片為包含距上述第二上皮組織最遠之上述第一上皮組織上之區域之移植用神經視網膜片。此處，第二上皮組織可為選自由眼球相關組織、端腦脊髓組織及與第一上皮組織之神經視網膜不同之組織所組成之群中之組織。
於一態樣中，本發明之移植用神經視網膜片可包含上述細胞凝集體中之連續上皮組織之中心附近之區域。
移植用神經視網膜片如上所述，可自包含神經視網膜之細胞凝集體單離。又，可藉由下文所述之移植用神經視網膜片之製造方法獲得。
於一態樣中，本發明之移植用神經視網膜片之長徑例如可為300 μm～3300 μm，較佳為600 μm～2500 μm，更佳為1100 μm～1700 μm。
於一態樣中，本發明之移植用神經視網膜片之短徑例如可為100 μm～2000 μm，較佳為200 μm～1500 μm，更佳為400 μm～1100 μm。
於一態樣中，本發明之移植用神經視網膜片之高度例如可為50 μm～1500 μm，較佳為100 μm～1000 μm，更佳為200 μm～700 μm。
於一態樣中，本發明之移植用神經視網膜片之體積例如可為0.001 mm3 ～4.0 mm3 ，較佳為0.01 mm3 ～1.5 mm3 ，更佳為0.07 mm3 ～0.57 mm3 。
測定移植用神經視網膜片之長徑、短徑及高度之方法並無特別限定，例如可根據顯微鏡下拍攝之圖像進行測定。例如，對於自細胞凝集體切出之移植用神經視網膜片，可利用立體顯微鏡對於將切斷面朝向物鏡側之狀態下拍攝之正面圖像、及於切斷面以自物鏡觀察為垂直之方式傾斜之狀態下拍攝之橫面圖像進行拍攝，根據所拍攝之圖像進行測定。此處，長徑意指正面圖像中連結該片剖面上之2個端點之線段中最長之線段及其長度。短徑意指正面圖像中連結該片剖面上之2個端點且與長徑正交之線段中最長之線段及其長度。高度意指與該片剖面正交且以與該片剖面之交點及視網膜片之頂點為端點之線段中最長之線段及其長度。該片之體積意指將移植片近似為以剖面通過長徑之方式切成兩半之橢球體後，依照以下之計算式所算出之體積。 體積=2/3×圓周率(π)×(長徑/2)×(短徑/2)×高度
[醫藥組合物、治療方法、治療藥及製造方法] 作為本發明之一態樣，可列舉包含移植用神經視網膜片之醫藥組合物。醫藥組合物包含本發明之移植用神經視網膜片，較佳為進而包含醫藥上所容許之載體。醫藥組合物可用於治療基於神經視網膜系細胞或神經視網膜之障礙或者神經視網膜之損傷之疾病。作為基於神經視網膜系細胞或神經視網膜之障礙之疾病，例如可列舉：視網膜變性疾病、黃斑變性症、老年性黃斑變性、視網膜色素變性、青光眼、角膜疾病、視網膜脫離、中心性漿液性脈絡視網膜病變、錐細胞失養症、錐桿細胞失養症等眼科疾病。作為神經視網膜之損傷狀態，例如可列舉視細胞變性死亡之狀態等。
作為醫藥上所容許之載體，可使用生理性之水性溶劑(生理鹽水、緩衝液、無血清培養基等)。亦可視需要於醫藥組合物中調配移植醫療中包含所移植之組織或細胞之醫藥所通常使用之保存劑、穩定劑、還原劑、等張劑等。
作為本發明之一態樣，提供一種包含本發明中所獲得之移植用神經視網膜片的基於神經視網膜之障礙之疾病之治療藥。又，作為本發明之一態樣，可列舉基於神經視網膜系細胞或神經視網膜之障礙或者神經視網膜之損傷的疾病之治療方法，其包括將本發明中所獲得之移植用神經視網膜片移植至需要移植之對象(例如，發生眼科疾病之眼之視網膜下)。作為基於神經視網膜之障礙之疾病之治療藥，或於該神經視網膜之損傷狀態下，為了修補符合之損傷部位，可使用本發明之移植用神經視網膜片。藉由對需要移植之患有基於神經視網膜系細胞或神經視網膜之障礙之疾病的患者、或神經視網膜之損傷狀態之患者移植本發明之移植用神經視網膜片，修補該神經視網膜系細胞或受損神經視網膜，而可治療基於神經視網膜系細胞或神經視網膜之障礙之疾病、或神經視網膜之損傷狀態。作為移植方法，例如可列舉藉由切開眼球等將移植用神經視網膜片移植至損傷部位之視網膜下之方法。作為移植之方法，例如可列舉使用細管注入之方法或以鑷子夾持移植之方法，作為細管，可列舉注射針等。
作為本發明之一態樣，可列舉本發明中所獲得之移植用神經視網膜片之製造方法。於一實施形態中，移植用神經視網膜片之製造方法包括：使用上述移植用神經視網膜之評價方法，對包含來自多能性幹細胞之具有上皮結構之神經視網膜的細胞凝集體進行評價，判定為可使用該神經視網膜作為移植用神經視網膜；及將經判定之移植用神經視網膜單離。
於其他實施形態中，移植用神經視網膜片之製造方法包括：自2個以上800個以下之包含來自多能性幹細胞之具有上皮結構之神經視網膜的細胞凝集體分別取樣作為該細胞凝集體之一部分之品質評價用樣品；藉由上述移植用神經視網膜之評價對上述所取樣之2個以上800個以下之品質評價用樣品進行評價，篩選出判定為可用作移植用神經視網膜之移植用神經視網膜；及將上述篩選出之移植用神經視網膜單離。
上述細胞凝集體較佳為將多能性幹細胞分化誘導所獲得之至少包含第一上皮組織及第二上皮組織之細胞凝集體。較佳為上述第一上皮組織包含人類神經視網膜，上述第二上皮組織具有與上述第一上皮組織之表面之切線斜率之連續性不同的表面之切線斜率之連續性，且包含非神經視網膜系細胞。上述移植用神經視網膜之單離較佳為以上述移植用神經視網膜包含距上述第二上皮組織最遠之上述第一上皮組織上之區域之方式自上述細胞凝集體單離上述移植用神經視網膜。單離係藉由利用上述方法切出而進行。
以本發明所揭示之包含上皮組織之細胞凝集體為原料，使用上皮組織之一部分作為移植用樣品，使用上皮組織之另一部分作為品質評價用樣品之品質評價方法於各細胞凝集體之形態、結構不同之情形時尤其有效。亦可應用包含多種上皮組織之細胞凝集體。 實施例
以下，列舉實施例詳細地說明本發明，但本發明不受該等任何限定。
＜實施例1 包含神經視網膜之細胞凝集體之製造＞ 人類iPS細胞(DSP-SQ株，由大日本住友製藥股份有限公司建立)係使用市售之仙台病毒載體(Oct3/4、Sox2、KLF4及c-Myc之4種因子，IDPharma公司製造之CytoTune套組)，基於Thermo Fisher Scientific公司之公開操作說明(iPS2.0 Sendai Reprogramming Kit, Publication Number MAN0009378, Revision 1.0)、及京都大學之公開操作說明(無餵養細胞下之人類iPS細胞之建立與維持培養，CiRA_Ff-iPSC_protocol_JP_v140310，http:// www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/ research/protocol.html)所記載之方法，使用StemFit培養基(AK03；Ajinomoto公司製造)、Laminin511-E8(Nippi公司製造)而建立。
依照Scientific Reports, 4, 3594(2014)所記載之方法對該人類iPS細胞(DSP-SQ株)進行無餵養細胞培養。作為無餵養細胞培養基，使用StemFit培養基(AK03N，Ajinomoto公司製造)，無餵養細胞支架使用Laminin511-E8(Nippi公司製造)。
作為具體之維持培養操作，首先，利用PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸鹽緩衝鹽水)將亞融合之人類iPS細胞(DSP-SQ株)洗淨後，使用TrypLE Select(Life Technologies公司製造)使其分散為單細胞。其後，將上述分散為單細胞之人類iPS細胞接種於以Laminin511-E8塗佈之塑膠培養皿中，於Y27632(ROCK抑制物質，10 μM)存在下於StemFit培養基中進行無餵養細胞培養。於使用6孔板(IWAKI公司製造，細胞培養用，培養面積9.4 cm2 )作為上述塑膠培養皿之情形時，上述分散為單細胞之人類iPS細胞之接種細胞數設為1.0×104 。接種1天後，更換為不含Y27632之StemFit培養基。其後每1天～2天以不含Y27632之StemFit培養基進行一次培養基更換。其後，培養至接種5天後為止。
作為分化誘導操作，使用StemFit培養基將人類iPS細胞(DSP-SQ株)進行無餵養細胞培養直至亞融合2天前(培養面積之3成被細胞覆蓋之程度)。於SAG(300 nM)存在下將該亞融合2天前之人類iPS細胞進行2天無餵養細胞培養(預處理)。
使用TrypLE Select(Life Technologies公司製造)將經預處理之人類iPS細胞進行細胞分散液處理，進而藉由移液操作使其分散為單細胞。其後，將上述分散為單細胞之人類iPS細胞以非細胞接著性之96孔培養板(PrimeSurface 96V底板，SUMITOMO BAKELITE公司製造)之每孔成為1.3×104 個細胞之方式懸浮於100 μl之無血清培養基中，於37℃、5%CO2下進行懸浮培養。此時之無血清培養基(gfCDM＋KSR)係使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加有10%KSR、450 μM 1-單硫代甘油、1×化學成分確定之脂質液體(Chemically defined lipid concentrate)之無血清培養基。於開始懸浮培養時(開始懸浮培養後第0天)，於無血清培養基中添加Y27632(最終濃度20 μM)及SAG(最終濃度10 nM)。於開始懸浮培養後第2天，利用不含Y27632及SAG且含有人類重組BMP4(R&D公司製造)之培養基以外來性之人類重組BMP4之最終濃度成為1.5 nM(55 ng/ml)之方式添加新的上述無血清培養基50 μl。
於其4天後(開始懸浮培養6天後)，利用不含Y27632、SAG及人類重組BMP4之上述無血清培養基進行培養基更換。作為培養基更換之操作，實施將培養器中之培養基廢棄60 μl並添加新的上述無血清培養基90 μl之操作，使培養基量合計成為180 μl。其後，每2～4天利用不含Y27632、SAG及人類重組BMP4之上述無血清培養基進行一次半量培養基更換。作為半量培養基更換操作，將培養器中之培養基廢棄體積之一半量即90 μl並添加新的上述無血清培養基90 μl，使培養基量合計成為180 μl。
將以上述方式獲得之開始懸浮培養後第13天之細胞塊於含有CHIR99021(3 μM)及SU5402(5 μM)之無血清培養基(於DMEM/F12培養基中添加有1%N2補充品之培養基)中培養3天，即培養至開始懸浮培養後第16天為止。
使用下述培養液如下述[1]、[2]及[3]所示之血清培養基，將所獲得之開始懸浮培養後第16天之細胞凝集體於5%CO2 條件下培養至開始懸浮培養後第75天。 [1]開始懸浮培養後第16天至第40天：於DMEM/F12培養基中添加有10%胎牛血清、1%N2補充品、及100 μM牛磺酸之培養基(以下稱為A培養基)。 [2]開始懸浮培養後第40天至第60天：將A培養基與於Neurobasal培養基中添加有10%胎牛血清、2%B27補充品、2 mM麩醯胺、60 nM之T3及100 μM牛磺酸之培養基(以下稱為B培養基)以1：3之比率混合而成之培養基。 [3]開始懸浮培養後第60天以後：B培養基。
利用倒置顯微鏡觀察開始懸浮培養後第75天之細胞塊，確認其形態。可知此時形成有神經上皮結構。
藉由4%多聚甲醛固定開始懸浮培養後第75天之細胞塊，製作冷凍切片。對於冷凍切片，進行關於作為神經視網膜標記之一的Chx10(抗Chx10抗體，Exalpha公司，羊)、及作為視細胞前驅細胞之標記之一的Crx(抗Crx抗體，Takara公司，兔)之免疫染色(圖1)。對於其他冷凍切片，進行關於作為神經視網膜標記之一的Rx(抗Rx抗體，Takara公司，天竺鼠)、及作為視細胞之標記之一的Recoverin(抗Recoverin抗體，Proteintech公司，兔)之免疫染色(圖2)。利用DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole，4',6-二脒基-2-苯基吲哚)將細胞核染色。
使用螢光顯微鏡(Keyence公司製造)觀察該等經染色之切片，獲得免疫染色圖像。將利用螢光顯微鏡觀察所製造之細胞所獲得之照片示於圖1及圖2。圖1及圖2之上段為利用低倍透鏡拍攝之圖像，下段為利用高倍透鏡拍攝之圖像。
根據圖1及圖2之DAPI之染色圖像可知，於細胞塊之表面形成密集地鋪滿細胞之神經組織，該神經組織形成連續上皮結構。對圖1之圖像進行分析，結果可知，於該神經組織中，於細胞塊之表面形成有厚度為2～5個細胞左右之Crx陽性層(視細胞層)，於Crx陽性層之內側形成有厚度為5～20個細胞左右之Chx10陽性層，進而於其內側形成有稀疏存在Crx陽性細胞之層(圖1)。可知該細胞塊之表面形態上為頂端面(apical surface)。進而，對圖2之圖像進行分析，結果可知，於該神經組織形成有Recoverin陽性層(視細胞層)，亦形成Rx陽性層。根據該等結果可知，該神經組織係於表面形成有包含Crx陽性細胞及Recoverin陽性細胞之視細胞層，於視細胞層之內側形成有包含Chx10陽性細胞之視網膜前驅細胞層，於視網膜前驅細胞之內側亦形成有細胞層。即，可知藉由該製法，可由人類iPS細胞製作包含視細胞層及視網膜前驅細胞層之神經視網膜，該神經視網膜具有連續上皮結構。
＜實施例2 目標外細胞(非神經視網膜系細胞)之鑑定與標記基因之探索＞ 於各種培養條件下將人類iPS細胞(QHJI-01-s04株，自京都大學iPS細胞研究所獲得)進行視網膜分化。具體而言，將藉由實施例1所記載之方法維持培養之人類iPS細胞進行無餵養細胞培養至亞融合2天前(培養面積之3成被細胞覆蓋之程度)或亞融合1天前(培養面積之5成被細胞覆蓋之程度)。將該亞融合2天前之人類iPS細胞於SAG(300 nM)存在下進行2天無餵養細胞培養，或將該亞融合1天前之人類iPS細胞於SAG(300 nM)及LDN(LDN193189，100 nM)存在下進行1天無餵養細胞培養(預處理)。
藉由實施例1所記載之方法將經預處理之人類iPS細胞進行懸浮培養。無血清培養基(gfCDM＋KSR)使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加有10%或5%KSR、450 μM 1-單硫代甘油、1×化學成分確定之脂質液體之無血清培養基。於開始懸浮培養時(開始懸浮培養後第0天)，於無血清培養基中添加Y27632(最終濃度20 μM)及IWR-1e(最終濃度3 μM)，或添加Y27632(最終濃度20 μM)、IWR-1e(最終濃度3 μM)及SAG(30 nM)。於開始懸浮培養後第3天，利用不含Y27632及SAG、含有人類重組BMP4(R&D公司製造)及IWR-1e之培養基以外來性之人類重組BMP4之最終濃度成為1.5 nM(55 ng/ml)、且IWR-1e之最終濃度成為3 μM之方式添加新的上述無血清培養基50 μl。
於其3天後(懸浮培養開始6天後)利用不含Y27632、SAG及人類重組BMP4、含有IWR-1e之上述無血清培養基進行培養基更換。作為培養基更換操作，將培養器中之培養基廢棄60 μl，添加新的上述無血清培養基90 μl，培養基量合計設為180 μl。於開始懸浮培養10～12天後，以外來性之IWR-1e之濃度與培養基更換前相比成為10%左右之方式，使用不含IWR1-e、Y27632、SAG及人類重組BMP4之上述無血清培養基進行2次67%培養基更換操作。其後，每2～4天利用不含IWR1-e、Y27632及人類重組BMP4之上述無血清培養基進行一次半量培養基更換。作為半量培養基更換操作，將培養器中之培養基廢棄體積之一半量即90 μl，並添加新的上述無血清培養基90 μl，培養基量合計設為180 μl。
將以上述方式獲得之開始懸浮培養後第19～20天之細胞塊於含有作為Wnt訊號傳遞路徑作用物質之CHIR99021(3 μM)及作為FGF訊號傳遞路徑抑制物質之SU5402(5 μM)之無血清培養基(於DMEM/F12培養基中添加有1%N2補充品之培養基)中培養3天，即培養至開始懸浮培養後第22～23天為止。
其後，使用實施例1所記載之[1]、[2]及[3]所示之血清培養基，或使用於DMEM/F12培養基中添加有10%胎牛血清、1%N2補充品、0.5 μM視黃酸、及100 μM牛磺酸之培養基(以下為視網膜培養基)，於5%CO2 條件下培養至開始懸浮培養後第89～97天為止。
對於以上述方式獲得之開始懸浮培養後第89～97天之細胞凝集體，藉由倒置顯微鏡(Nikon公司製造，ECLIPSE Ti)觀察亮視野圖像(相位差圖像)。特別是著眼於各個細胞之形態及細胞彼此之接著狀態之特徵進行觀察。然後，將細胞凝集體中形成連續之上皮結構且見到外神經母細胞層(包含視細胞層及神經視網膜前驅細胞層)與內神經母細胞層分為2層之部位判定為神經視網膜。又，將未見到連續之上皮結構之組織或雖然見到連續之上皮結構但外神經母細胞層與內神經母細胞層看起來為1層而無法區別之部位設為副產物(A、B、C、D、E及F)。其後，一面藉由立體顯微鏡進行觀察，一面於立體顯微鏡下使用尖細鑷子及剪刀自細胞凝集體切出神經視網膜或副產物而製作組織片。所切出之組織片為「神經視網膜#1～9」、「副產物A，#10～16」、「副產物B，#17～20」、「副產物C，#21、#22」、「副產物D，#23、#24」、「副產物E，#25～29」、「副產物F，#30～33」之合計33個樣品。
其後，藉由套組記載之方法利用離心管柱(QIAGEN公司製造，RNeasy Micro kit)對組織片提取總RNA，並進行微陣列(Affymetrix公司製造，Human Genome U133 Plus2.0)分析(圖3)。圖3係以熱圖(heatmap)表示，灰色對應於基因表現較高，黑色對應於基因表現較低(顏色更淡對應於基因表現更高)。
其結果可知，首先，「神經視網膜#1～9」之9個組織片中，視錐細胞前驅細胞標記RXRG、視桿細胞前驅細胞標記NRL、視細胞標記Recoverin(別名RCVRN)、視細胞前驅細胞標記Crx、神經視網膜標記Rax2及視細胞前驅細胞標記Blimp1(別名PRDM1)之表現量總體較高。即，可確認「神經視網膜#1～9」係包含神經視網膜系細胞之視網膜組織。
再者，「神經視網膜#1～3」中見到HOX基因(HOXC5、HOXA5及HOXB2)之表現。「神經視網膜#1～3」於製造過程中添加視黃酸，認為HOX基因之表現受視黃酸控制。但「神經視網膜#1～3」如上所述，為包含神經視網膜系細胞之視網膜組織之良品。因此，於在製造步驟中添加視黃酸之情形時，容許HOX基因(HOXC5、HOXA5及HOXB2)之表現。
對「副產物A，#10～16」進行分析。其結果可知，副產物A中神經視網膜系細胞標記之表現量總體較低。另一方面，對副產物A中高度表現之標記基因進行探索，結果可知，GREM1、GPR17、ACVR1C、CDH6、Pax2、Pax8、GAD2及SEMA5A表現。對與該標記相關之文獻資訊(Baumer N, et al. Development. 2003 Jul; 130(13): 2903-15、Pfeffer PL, et al. Development. 1998 Aug; 125(16): 3063-74)進行了詳查，結果可知，副產物A為Optic stalk(視柄)。即可知，於在活體外由多能性幹細胞製作神經視網膜之情形時，有副產作為副產物之Optic stalk之可能性。進而可知，作為用以區別該Optic stalk之標記基因，有用的是GREM1、GPR17、ACVR1C、CDH6、Pax2、Pax8、GAD2及SEMA5A。
對「副產物B，#17～20」進行分析。其結果可知，副產物B中神經視網膜系細胞標記之表現量總體較低。另一方面，對副產物B中高度表現之標記基因進行探索，結果可知，Zic1、MAL、HNF1beta、FoxQ1、CLDN2、CLDN1、CRYAA及CRYBA1表現。對與該標記相關之文獻資訊進行了詳查，結果可知，副產物B為睫狀體、晶狀體或睫狀體周緣部(以下記為睫狀體/晶狀體)。即可知，於在活體外由多能性幹細胞製作神經視網膜之情形時，有副產作為副產物之睫狀體/晶狀體之可能性。進而可知，作為用以區別該睫狀體/晶狀體之標記基因，有用的是Zic1、MAL、HNF1beta、FoxQ1、CLDN2、CLDN1、CRYAA及CRYBA1。
對「副產物C，#21、#22」進行分析。其結果可知，副產物C中神經視網膜系細胞標記之表現量總體較低。另一方面，對副產物C中高度表現之標記基因進行探索，結果可知，MITF、TTR及BEST1表現。對與該標記相關之文獻資訊進行了詳查，結果可知，副產物C為視網膜色素上皮(RPE)。即，於在活體外由多能性幹細胞製作神經視網膜之情形時，有副產作為副產物之RPE之可能性。進而可知，作為用以區別該RPE之標記基因，有用的是MITF、TTR及BEST1。
對「副產物D，#23、#24」進行分析。其結果可知，副產物D中神經視網膜系細胞標記之表現量總體較低。另一方面，對副產物D中高度表現之標記基因進行探索，結果可知，HOXD4、HOXD3、HOXD1、HOXC5、HOXA5及HOXB2表現。對與該標記相關之文獻資訊進行了詳查，結果可知，副產物D為脊髓組織。即，於在活體外由多能性幹細胞製作神經視網膜之情形時，有副產作為副產物之脊髓組織之可能性。進而可知，作為用以區別該脊髓組織之標記基因，有用的是HOXD4、HOXD3、HOXD1、HOXC5、HOXA5及HOXB2。
對「副產物E，#25～29」進行分析。其結果可知，副產物E中神經視網膜系細胞標記之表現量總體較低。另一方面，對副產物E中高度表現之標記基因進行探索，結果可知，Nkx2.1、OTP、FGFR2、EFNA5及GAD1表現。對與該標記相關之文獻資訊進行了詳查，結果可知，副產物E為間腦、中腦或下丘腦(以下記為間腦/中腦)。即，於在活體外由多能性幹細胞製作神經視網膜之情形時，有副產作為副產物之間腦/中腦之可能性。進而可知，作為用以區別該間腦/中腦之標記基因，有用的是Nkx2.1、OTP、FGFR2、EFNA5及GAD1。
對「副產物F，#30～33」進行分析。其結果可知，副產物F中神經視網膜系細胞標記之表現量總體較低。另一方面，對副產物F中高度表現之標記基因進行探索，結果可知，DLX2、DLX1、DLX5、FOXG1、EMX2、GPR177(Wls)、AQP4表現。對與該標記相關之文獻資訊進行詳查，可知由於DLX2、DLX1、DLX5、FOXG1及EMX2表現，故而副產物F為端腦。可知GPR177及AQP4作為副產物標記亦有用。即，於在活體外由多能性幹細胞製作神經視網膜之情形時，有副產作為副產物之端腦之可能性。進而可知，作為用以區別該端腦之標記基因，有用的是DLX2、DLX1、DLX5、FOXG1及EMX2。
根據以上結果可知，副產物中神經視網膜系細胞之標記基因之表現量較低，已知於Optic Stalk、睫狀體/晶狀體、RPE、脊髓、間腦/中腦及端腦之組織中表現之基因之表現量較高。根據以上可知，Optic Stalk、睫狀體/晶狀體、RPE、脊髓、間腦/中腦及端腦可於向立體視網膜之分化過程中副產。又，可知可檢測各組織之標記為表11所示之基因。
[表11]
組織 基因名
視網膜 RXRG、NRL、Recoverin、Crx、Rax2、Blimp1
Optic Stalk GREM1、GPR17、ACVR1C、CDH6、Pax2、Pax8、GAD2、SEMA5A
睫狀體、晶狀體 Zic1、MAL、HNFIbeta、FoxQ1、CLDN2、CLDN1、CRYAA、CRYBA1、GPR177、AQP4
RPE MITF、TTR、BEST1
脊髓 HOXD4、HOXD3、HOXD1、HOXC5、HOXA5、HOXB2
下丘腦 Nkx2.1、OTP、FGFR2、EFNA5、GAD1
端腦 DLX2、DLX1、DLX5、FOXG1、EMX2
＜實施例3 移植片之評價方法之研究＞ 由人類iPS細胞製得之立體視網膜包含具有細胞之組成、分佈具有連續性之神經上皮結構之神經視網膜。該具有神經上皮結構之神經視網膜具有包含視細胞層與內層之層結構，具有特徵性之外觀、形態(圖1)。
人類立體視網膜為1～2 mm左右之大小，各個形狀不同。又，根據使用自體組織化培養之製造方法之特性，可知雖然主產物為用於移植之神經視網膜，但會副產作為非神經視網膜之眼球相關組織(RPE、睫狀體等)或腦脊髓組織(端腦、脊髓等)(實施例2)。因此，切出不含非神經視網膜之神經視網膜之中心部而獲得視網膜片(移植片、Cap、帽)(圖4及圖5)。認為與視網膜片之組成或純度相關之品質評價較理想的是實施全數試驗，但無法進行視網膜片之全數之破壞試驗。因此，使用視網膜片(Cap)之周邊部作為品質評價用樣品(Ring、環)。並且，研究對Ring分析(較佳為定量PCR)全數，而僅使用與符合基準之Ring相對應之Cap作為移植用神經視網膜。
再者，圖4及圖5係典型之細胞凝集體之概念圖。以可觀察到見到視細胞層與內層分為2層之神經視網膜特有之神經上皮結構(較佳為連續上皮結構)之部位作為移植片(帽)，以帽之周邊部位中見到與帽相同之神經上皮結構(較佳為連續上皮結構)之部位作為品質評價用樣品(環)，將帽、環以外之部位稱為根(root)。
以下，研究自1個細胞凝集體所含之神經上皮結構單離帽與環之方法之有用性。
＜實施例4 移植片(帽)之形狀＞ 藉由以下方法製作移植片(帽)(圖6)。首先，利用倒置顯微鏡(Olympus公司製造)拍攝依照實施例1所記載之方法由人類iPS細胞(DSP-SQ株)製得之開始懸浮培養後第99天之細胞凝集體之亮視野圖像(相位差圖像)。確認細胞凝集體上有神經視網膜後，將細胞凝集體移至立體顯微鏡下，使用實施例2所記載之方法切出各種大小之神經視網膜作為移植片。又，對取決於移植片大小之移植用設備對移植操作之影響進行研究。
對於所切出之移植片，利用立體顯微鏡對於將切斷面朝向物鏡側之狀態下所拍攝之正面圖像、及於切斷面以自物鏡觀察為垂直之方式傾斜之狀態下拍攝之橫面圖像進行拍攝。其後，根據所拍攝之圖像測定移植片之長徑、短徑、及高度。於測定時，長徑係指正面圖像中連結視網膜片剖面上之2個端點之線段中最長之線段及其長度。短徑係指正面圖像中連結視網膜片剖面上之2個端點且與長徑正交之線段中最長之線段及其長度。高度係指橫面圖像中與視網膜片剖面正交且以與視網膜片剖面之交點及視網膜片之表面為端點之線段中最長之線段及其長度。進而，關於移植片之體積，將移植片近似為以剖面通過長徑之方式切成兩半之橢球體而依照以下之計算式算出。 體積＝2/3×圓周率π×(長徑/2)×(短徑/2)×高度
其結果可知，移植片於移植用設備中之設置、移植用設備中之移植片之穩定性及移植片自移植用設備之排出受到移植片大小之影響。又，表明尤其短徑為有用之參數。對於移植用設備之移植操作良好之11個移植片，分別計算長徑、短徑、高度及體積。對於各參數求出平均值、最大值及最小值，將所得之結果彙總於表12中。根據該結果可知，移植片(帽)至少長徑為0.8～1.7 mm，短徑為0.4～1.1 mm，高度為0.2～0.7 mm，表觀上之體積為0.07～0.57 mm3 左右。 [表12]
   長徑 [mm] 短徑 [mm] 高度 [mm] 體積 [mm3 ]
平均值 1.184 0.646 0.421 0.184
最大值 1.606 1.051 0.640 0.565
最小值 0.870 0.462 0.258 0.070
＜實施例5 移植片(帽)之細胞之組成＞ 藉由以下方法製作移植片(帽)(編號：18001MF、d89、H5)。首先，藉由實施例2及3所記載之方法自依照實施例1所記載之方法由人類iPS細胞(DSP-SQ株)製得之開始懸浮培養後第89天之細胞凝集體單離移植片(帽)。
藉由4%多聚甲醛固定移植片，製作冷凍切片。對於冷凍切片，進行關於作為神經視網膜標記之一的Chx10(抗Chx10抗體，Exalpha公司，羊)、及作為視細胞前驅細胞之標記之一的Crx(抗Crx抗體，Takara公司，兔)之免疫染色(圖7)。對於其他冷凍切片，進行關於作為神經視網膜標記之一的Rx(抗Rx抗體，Takara公司，天竺鼠)、及作為視細胞之標記之一的Recoverin(抗Recoverin抗體，Proteintech公司，兔)之免疫染色(圖7)。利用DAPI將細胞核染色。使用共聚聚焦雷射顯微鏡(Olympus公司製造)觀察該等經染色之切片，獲得免疫染色圖像。
根據染色圖像可知，於移植片(帽)之表面(圖中左側)形成密集地鋪滿細胞之神經組織，該神經組織形成神經上皮結構(尤其是連續上皮結構)(圖7)。進而可知，於該神經組織中，於細胞塊之表面形成有厚度為2～10個細胞左右之Crx陽性層(視細胞層，圖7)，於Crx陽性層之內側形成有厚度為5～20個細胞左右之Chx10陽性層，進而於其內側形成有存在Crx陽性細胞之層(圖7)。可知該移植片(帽)之表面形態上為頂面(apical surface)。進而可知，於該神經組織形成有Recoverin陽性層(視細胞層，圖7箭頭)，亦形成有Rx陽性層。根據該等結果可知，該神經組織係於表面形成有包含Crx陽性細胞及Recoverin陽性細胞之視細胞層，於視細胞層之內側形成有包含Chx10陽性細胞之視網膜前驅細胞層，於視網膜前驅細胞之內側亦形成有細胞層。即可知，移植片(帽)可製作包含視細胞層及視網膜前驅細胞層之神經視網膜，該神經視網膜具有連續上皮結構。
＜實施例6 帽與環之同等性之驗證＞ 為了將帽及環之基因表現進行比較，而藉由以下方法進行驗證。首先，依照實施例1所記載之方法，由人類iPS細胞(DSP-SQ株)製作開始懸浮培養後第99天之細胞凝集體，設為批次1。進而，依照實施例1所記載之方法，由人類iPS細胞(DSP-SQ株)製作開始懸浮培養後開始懸浮培養後第82天之細胞凝集體，設為批次2。對於該2個批次，藉由實施例2及實施例3所記載之方法，使用顯微鏡判定作為主產物之神經視網膜與副產物，並將神經視網膜之帽與副產物之帽分別單離。環係與移植片同樣地使用尖細鑷子及剪刀而於立體顯微鏡下切出並單離。藉由實施例2所記載之方法從自神經視網膜及副產物單離之帽及環提取總RNA。利用測定器(Nanodrop，Thermo scientific公司製造)測定總RNA之濃度後，使用反轉錄酶及引子(Reverse Transcription Master Mix Kit，Fluidigm公司製造)使其反轉錄為cDNA。使用驗證所使用之全部探針，並使用PCR裝置(Veriti 96孔熱循環儀，Applied Biosystems公司製造)，對cDNA實施多重PCR反應(Pre-Run)。其後，使用IFC控制器HX(Fluidigm公司製造)，將已完成Pre-Run之反應液注入附流路之多孔(96.96動態陣列IFC，Fluidigm公司製造)中，使用多檢體即時PCR系統(Biomark HD，Fluidigm公司製造)，藉由即時PCR測定神經視網膜及神經視網膜以外之副產物之標記基因之表現量。將驗證所使用之PCR用探針示於表13。
[表13]
分類 基因名 探針ID GenBank ID
內部標準 GAPDH Hs02758991_g1 NM_001256799.2, NM_001289745.2 NM_001289746.1, NM_001357943.1 NM_002046.7
ActinB Hs01060665_g1 NM_001101.5
神經視網膜 RAX Hs00429459_m1 NM_013435.2
Chx10 Hs01584047_m1 NM_182894.2
SIX3 Hs00193667_m1 NM_005413.4
SIX6 Hs00201310_m1 NM_007374.2
RCVRN Hs00610056_m1 NM_002903.2
CRX Hs00230899_m1 NM_000554.6
NRL Hs00172997_m1 NM_006177.4
NESTIN Hs04187831_g1 NM_006617.2
腦脊髓 FOXG1 Hs01850784_s1 NM_005249.4
Emx2 Hs00244574_m1 NM_004098.4, NM_001165924.1
Nkx2.1 Hs00968940_m1 NM_003317.3, NM_001079668.2
Dmbx1 Hs00542612_m1 NM_172225.1, NM_147192.2 XM_011540668.2, XM_017000289.1
HOXB2 Hs01911167_s1 NM_002145.3, XM_005257275.4
HoxA5 Hs00430330_m1 NM_019102.4
眼球 MITF Hs01117294_m1 NM_000248.3, NM_006722.2 NM_198158.2, NM_198159.2 NM_198177.2, NM_198178.2 NM_001184967.1, NM_001184968.1 NM_001354604.1, NM_001354605.1 NM_001354606.1, NM_001354607.1 NM_001354608.1
aqp1 Hs01028916_m1 NM_198098.3, NM_001329872.1
ZIC1 Hs00602749_m1 NM_003412.4
PAX2 Hs01057416_m1 NM_000278.4, NM_003987.4 NM_003988.4, NM_003989.4 NM_003990.4, NM_001304569.1
未分化iPSC POU5F1 Hs00999632_g1 NM_002701.6, NM_203289.5 NM_001173531.2, NM_001285986.1 NM_001285987.1
Nanog Hs04260366_g1 NM_024865.4. NM_001297698.1
以熱圖之形式將結果示於圖8。以根據目標基因之Ct值與用作內部標準之基因即GAPDH之Ct值之差所算出之ΔCt值評價基因表現量。ΔCt值越低，則基因表現量越高，ΔCt值越高，則基因表現量越低。灰色表示基因表現量較高，黑色表示基因表現量較低(顏色更淡表示基因表現更高)。研究各帽及環之基因表現，結果於批次1及批次2之任一批次中，於自神經視網膜單離之帽及環中神經視網膜標記基因群均有表現。另一方面，研究自副產物單離之帽及環中之基因表現，結果任一批次均與神經視網膜相反，神經視網膜標記基因群之表現量較低，副產物之標記基因群之表現量較高。由此可確認實施例2中發現之標記基因群可分別區別神經視網膜與副產物而檢測。進而，將自相同之細胞凝集體單離之帽與環中之基因表現加以比較，結果可知，自任一神經視網膜及副產物單離之帽與環中神經視網膜標記基因之表現量與副產物之標記基因之表現量均相等。
根據該等結果，可證實若環為神經視網膜，則帽亦為神經視網膜。又，可證實帽與環中基因表現同等。
＜實施例7 各種多能性幹細胞株中之帽與環之同等性之驗證＞ 為了研究自各種多能性幹細胞分化之細胞凝集體中帽與環之基因表現是否相等，而進行以下研究。
首先，藉由實施例1所記載之製法使Crx：：Venus敲入人類ES細胞(來自KhES-1；Nakano, T. et al. Cell Stem Cell 2012, 10(6), 771-785；自京都大學獲得，於理研CDB建立使用)、人類iPS細胞(QHJI-01-s04株)、及人類iPS細胞(DSP-SQ株)分化為視網膜。其後，藉由實施例6所記載之方法自開始懸浮培養後第70天以上之細胞凝集體切出神經視網膜及副產物之帽、環。其後，藉由實施例6所記載之方法提取總RNA。利用測定器(Nanodrop，Thermo scientific公司製造)測定總RNA之濃度後，使用反轉錄酶及引子(Reverse Transcription Master Mix Kit，Fluidigm公司製造)使其反轉錄為cDNA。使用驗證所使用之全部探針，並使用PCR裝置(Veriti 96孔熱循環儀，Applied Biosystems公司製造)，對cDNA實施多重PCR反應(Pre-Run)。其後，使用IFC控制器HX(Fluidigm公司製造)將已完成Pre-Run之反應液注入附流路之多孔(96.96動態陣列IFC，Fluidigm公司製造)中，使用多檢體即時PCR系統(Biomark HD，Fluidigm公司製造)，藉由即時PCR測定神經視網膜及神經視網膜以外之副產物之標記基因之表現量。驗證使用實施例6之表3所使用之PCR用探針。
將結果以圖9之熱圖表示。熱圖係依照實施例6所記載之方法而製作。對帽及環中之基因表現進行研究，結果來自任一細胞株之帽及環中，均為自神經視網膜單離者中神經視網膜標記基因之表現量較高，副產物之標記基因之表現量較低。另一方面，自副產物單離之帽及環中副產物之標記基因之表現量較高，神經視網膜標記基因之表現量較低。又，將自相同之細胞凝集體單離之帽及環之基因表現加以比較，結果可知，自任一細胞株單離之帽及環中神經視網膜及副產物之標記基因均相同程度地表現。
根據該等結果可證實，於來自任一多能性幹細胞株之細胞凝集體中，若環為神經視網膜，則帽亦為神經視網膜。又，可證實帽與環中基因表現同等。即，可知於切出表2之大小之帽之情形時，即便自細胞凝集體中之剩餘部分切出環，亦可切出具有與帽同等之基因表現之部分的環。
＜實施例8 移植片之移植結果＞ 可知實施例6及實施例7中帽與環之基因表現同等。又，可確認若環為神經視網膜，則帽亦為神經視網膜。因此，研究如下方法：於移植前分析環之基因表現，確認環為神經視網膜，而移植與環相對應之帽。為了證實該方法之有用性，於分析環之基因表現後將所對應之帽移植至視網膜變性裸大鼠，對移植後之移植存活圖像進行評價。
首先，依照實施例1所記載之方法，由人類iPS細胞(DSP-SQ株)製作細胞凝集體。其後，藉由實施例6所記載之方法自開始懸浮培養後第75天後之細胞凝集體單離帽及環。於實施環之基因分析期間，使用市售之保存液保存所單離之帽。利用實施例6所記載之方法，藉由使用Biomark HD(Fluidigm公司製造)之即時PCR法對所單離之環實施基因表現分析。根據基因表現分析之結果，選擇表現神經視網膜標記基因且不表現副產物之標記基因之環，選擇與該環相對應之帽製成移植片。移植片用緩衝液(Thermo Fisher Scientific公司製造)洗淨後，使用公知文獻(Shirai et al. PNAS 113, E81-E90)所記載之注入器移植至視網膜變性裸大鼠(視細胞變性模型，SD-Foxn1 Tg(S334ter)3LavRrrc nude rat)之視網膜下。
對相當於開始懸浮培養後230～240天齡之眼組織進行多聚甲醛固定(PFA固定)並進行蔗糖置換。使用低溫恆溫器將經固定之眼組織製作冷凍切片。對於該等冷凍切片，進行關於人核(抗HuNu抗體，Millipore公司，小鼠；或抗HNA抗體)、作為視細胞之標記之一的Recoverin(抗Recoverin抗體，Proteintech公司，兔)、作為雙極細胞之標記之一的PKCα(抗PKCα抗體，R&D systems公司，山羊)之免疫染色。
將彙總利用環之基因表現分析獲得之移植片之品質評價結果與移植結果所獲得之結果示於表14。ΔCt值之算出方法係使用實施例6所記載之方法。環之基因表現分析於作為神經視網膜標記基因之一的Recoverin之ΔCt值為10以下，作為副產物之標記基因之FOXG1、HOXB2、ZIC1及OCT3/4之ΔCt值分別為5以上之情形時，設為品質評價試驗(ring-PCR試驗)合格。關於移植結果，於視網膜下可檢測到人核陽性且Recoverin陽性之視細胞之情形時，評價為移植存活良好。又，若移植部位未增厚到大於合適之移植存活之尺寸，則判定為未檢測出肥大。
將代表性之移植存活圖像示於圖10。對移植前之品質評價試驗合格之14隻眼評價移植後之移植存活圖像，結果於全部14隻眼中檢測到Recoverin陽性之視細胞，可知良好地移植存活。該等細胞為HuNu陽性，因此可知Recoverin陽性之視細胞來自所移植之帽。又，全部14隻眼中均未檢測出肥大。
根據以上結果可證實，藉由在移植前研究環之基因表現分析中神經視網膜與副產物之標記基因之表現量，可篩選出於視網膜下良好地移植存活、即視細胞移植存活而不發生肥大之移植片。
[表14]
移植片 移植結果
株 品質評價試驗 視細胞之移植存活 肥大
DSP-SQ ring-PCR試驗 合格 14隻眼全部為移植存活良好 14隻眼中均未觀察到
＜實施例9 移植片之移植結果＞ 於實施例8中，環之基因表現分析使用Biomark HD(Fluidigm公司製造)。Biomark HD原本係為1個細胞分析設計之機械，實施例8中之使用方法並非通常之使用方法。因此，藉由通常使用之即時PCR裝置分析環之基因表現，驗證是否可與使用Biomark HD時同樣地選擇於視網膜下良好地移植存活之移植片。
人類iPS細胞(DSP-L株，由大日本住友製藥建立)係使用市售之仙台病毒載體(Oct3/4、Sox2、KLF4及c-Myc之4種因子，IDPharma公司製造之CytoTune套組)，基於Thermo Fisher Scientific公司之公開操作說明(iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit，Publication Number MAN0009378，Revision 1.0)、及京都大學之公開操作說明(無餵養細胞下之人類iPS細胞之建立與維持培養，CiRA_Ff-iPSC_protocol_JP_v140310，http:// www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/ research/protocol.html)所記載之方法，使用StemFit培養基(AK03；Ajinomoto公司製造)、Laminin511-E8(Nippi公司製造)而建立。
首先，依照實施例1所記載之方法，由人類iPS細胞(DSP-L株)製作細胞凝集體。其後，藉由實施例6所記載之方法自開始懸浮培養後第86天之細胞凝集體單離帽及環。於實施環之基因分析期間，使用市售之保存液保存所單離之帽。以如下方式實施所單離之環之基因表現分析。
首先，藉由實施例2所記載之方法提取總RNA。利用測定器(Nanodrop，Thermo scientific公司製造)測定總RNA之濃度後，使用反轉錄酶(QuantiTect Revese Transcription Kit(QIAGEN公司製造)及引子(RT primer mix，QIAGEN公司製造)使其反轉錄為cDNA。其後，對於cDNA，使用即時PCR酶(TaqMan Fast Advanced Master Mix，Applied Biosystems公司製造)，並使用StepOnePlus即時PCR系統(Applied Biosystems公司製造)，藉由即時PCR測定神經視網膜及視網膜以外之副產物之標記基因之表現量。將結果示於圖11。使用將未分化iPS細胞之cDNA與立體視網膜之cDNA混合而成之樣品作為陽性對照樣品。將陽性對照樣品進行階段稀釋，製作校準曲線樣品，並作校準曲線。使用gapdh作為內部標準，將基因表現標準化。
PCR分析之結果可知，樣品1及樣品2中神經視網膜標記之Chx10、Rx、Crx及Recoverin之表現量較高，副產物之標記基因之Oct3/4、FoxG1、Aqp1、Nkx2.1、Dlx6、CDH6、Emx2、Zic1、HoxA5、Pax2及Pax8之表現量較低。選擇表現神經視網膜標記基因而不表現副產物之標記基因之環，依照實施例8所記載之方法將與環相對應之帽移植於視網膜變性裸大鼠視網膜下。
對相當於開始懸浮培養後230～240天齡之眼組織進行多聚甲醛固定(PFA固定)，並進行蔗糖置換。使用低溫恆溫器，將經固定之眼組織製作冷凍切片。對於該等冷凍切片，進行關於人核(抗HuNu抗體，Millipore公司，小鼠)、作為視細胞之標記之一的Recoverin(抗Recoverin抗體，Proteintech公司，兔)、作為雙極細胞之標記之一的SCGN(抗SCGN抗體，BioVendor，羊)之免疫染色。
將移植有與上述環相對應之帽之大鼠眼中之移植存活圖像示於圖11。對移植後之移植存活圖像進行評價，結果見到Recoverin陽性之視細胞，表現出良好之移植存活。該等細胞為HuNu陽性，因此Recoverin陽性之視細胞係來自所移植之帽。又，未見到肥大。
根據以上結果可知，使用通常使用之即時PCR系統分析環之基因表現，亦可藉由在移植前研究神經視網膜與副產物之標記基因之表現量而選擇於視網膜下良好地移植存活之移植片。因此可知，藉由多檢體即時PCR系統可進行複數種基因之分析。
＜實施例10 環之移植結果＞ 於實施例8及9中，可知將藉由上述方法所製作之帽移植於視網膜變性裸大鼠之視網膜下後，視細胞移植存活。為了驗證環與帽之同等性，而進行將環同樣地移植於視網膜下之研究。
藉由實施例1所記載之製法使Crx：：Venus敲入人類ES細胞(來自KhES-1；Nakano, T. et al. Cell Stem Cell 2012, 10(6), 771-785；自京都大學獲得，於理研CDB建立使用)分化為視網膜。其後，藉由實施例6所記載之方法自開始懸浮培養後第74天之細胞凝集體切出神經視網膜及副產物之帽、環(圖12)。其後，使用公知文獻(Shirai et al. PNAS 113, E81-E90)注射器將環移植至作為視細胞變性模型之視網膜變性裸大鼠(SD-Foxn1 Tg(S334ter)3LavRrrc nude rat)之視網膜下。
移植後1年間使視網膜變性裸大鼠生育。其後，摘下移植有環之眼組織，藉由多聚甲醛固定(PFA固定)並進行蔗糖置換。使用低溫恆溫器由經固定之眼組織製作冷凍切片。對於該等冷凍切片，進行關於作為人類細胞質標記之Stem121(抗Stem121抗體，Cellartis公司，小鼠)、或作為視細胞之標記之一的Recoverin(抗Recoverin抗體，Proteintech公司，兔)之免疫染色。
將剛切出移植所使用之環後所拍攝之亮視野圖像、及對由自移植環後1年間生育之大鼠摘下之眼組織所製作之切片進行免疫染色之結果分別示於圖12。將圖12左所示之環移植於視網膜變性裸大鼠之視網膜下後，獲得圖12右所示之免疫染色之結果。根據免疫染色之結果可知，Stem121陽性之人類細胞移植存活。又可知，Recoverin陽性之視細胞移植存活。
根據以上結果可知，環與帽同樣，移植後視細胞亦移植存活。進而，該結果表明，只要為神經視網膜，則移植帽、環之任一者均可獲得同樣之移植結果。
＜實施例11 帽與環之同等性之驗證＞ 於實施例6及7中，使用PCR法證實帽與環基因表現於RNA級為同等。並且證實，藉由利用PCR法分析環之基因表現，可驗證帽為神經視網膜抑或副產物。繼而，對可藉由利用免疫染色法分析環之基因表現而驗證帽為神經視網膜抑或副產物。
首先，藉由實施例1所記載之製法使人類iPS細胞(DSP-SQ株)分化為視網膜。其後，藉由實施例6所記載之方法自開始懸浮培養後第120天之細胞凝集體單離神經視網膜之帽及環。其後，將帽及環洗淨後，藉由4%多聚甲醛固定(PFA固定)並進行蔗糖置換。使用低溫恆溫器將經固定之帽及環製作冷凍切片。對於該等冷凍切片，進行關於對核進行染色之DAPI、作為視細胞前驅細胞之標記之一的Crx(抗Crx抗體，Takara公司，兔)、作為神經視網膜標記之一的Chx10(抗Chx10抗體，Exalpha公司，羊)、作為視桿細胞前驅細胞標記之一的NRL(抗NRL抗體，Bio-Techne公司，山羊)、作為端腦標記之一的FOXG1(抗FOXG1抗體，TAKARA BIO公司，兔)、作為Optic Stalk標記之一的PAX2(抗PAX2抗體，Thermo Fisher Scientific公司，兔)、及作為未分化之多能性幹細胞標記之一的NANOG(抗NANOG抗體，Merck公司，小鼠)之免疫染色。
將免疫染色之結果示於圖13。對於自相同之細胞凝集體切出之帽與環，上段表示環之免疫染色結果，下段表示帽之免疫染色結果。根據該等結果可知，帽及環之任一者中Crx陽性之視細胞前驅細胞、Chx10陽性之神經視網膜、及NRL陽性之視桿細胞前驅細胞均連續以層狀表現。又可知，帽及環之任一者中均未檢測到FOXG1陽性之端腦、或PAX2陽性之Optic Stalk、及NANOG陽性之多能性幹細胞。進而可知，若將Crx、Chx10及NRL之染色圖像進行比較，則該等神經視網膜標記於帽與環中呈現出大致同等之分佈。
根據以上結果可證實，不僅基因表現分析中，而且免疫染色中帽與環亦為同等。又，根據該結果可證實，藉由利用免疫染色法分析環之基因表現，可驗證帽為神經視網膜抑或副產物。
＜實施例12 非神經視網膜中之帽與環之同等性之驗證＞ 於實施例6及7中，可知於神經視網膜及副產物之帽與環中，基因表現同等。因此，詳細分析自視網膜以外之組織單離之帽與環中，基因表現是否亦同等。
首先，藉由實施例1所記載之製法使人類iPS細胞(QHJI-01-s04株)、及人類iPS細胞(DSP-SQ株)分化為視網膜。其後，對開始懸浮培養後第80天以上之細胞凝集體進行顯微鏡檢查，結果觀察到存在上皮結構。對於上述開始懸浮培養後第80天以上之細胞凝集體，藉由實施例6所記載之方法切出神經視網膜及副產物之帽及環。其後，藉由實施例6所記載之方法提取RNA，使用Biomark HD(Fluidigm公司製造)，藉由即時PCR測定神經視網膜及視網膜以外之副產物之標記基因之表現量。
以熱圖之形式將結果示於圖14。熱圖係依照實施例6所記載之方法而製作。對帽及環中之基因表現進行研究，結果確認到於自神經視網膜切出之帽及環中，神經視網膜標記基因表現而副產物之標記基因未表現。另一方面，對自副產物切出之帽及環中之基因表現進行研究，結果確認到高度表現作為端腦標記之一的FOXG1之帽、環，或高度表現作為脊髓標記之HOXB2及HOXA5之帽及環，高度表現作為RPE標記之一的MITF之帽及環，以及高度表現作為Optic Stalk標記之一的PAX2之帽及環。因此，根據高度表現之標記基因，將該等副產物分別分類為端腦組織、脊髓組織、RPE及Stalk。對自該等副產物單離之帽及環之基因表現進行研究，結果於任一副產物中，帽與環均呈現出同等之基因表現。
根據以上結果可知：不僅於神經視網膜中，自端腦組織、脊髓組織、RPE及Optic Stalk單離之帽與環中，基因表現亦同等。又，根據該結果可知：藉由研究自端腦組織、脊髓組織、RPE、Optic Stalk等非神經視網膜單離之環中之基因表現，可判定帽是否為相同之組織。
＜實施例13 構成移植用神經視網膜片之視細胞前驅細胞及神經視網膜前驅細胞之比率＞ 藉由免疫染色法之一的免疫組織染色(Immunohistochemistry；IHC)對利用由多能性幹細胞分化而成之細胞凝集體所製作之移植用神經視網膜片之構成細胞中的視細胞前驅細胞及神經視網膜前驅細胞之比率進行分析、定量。
藉由實施例1所記載之製法使人類iPS細胞(DSP-SQ株)分化為視網膜。其後，藉由實施例6所記載之方法自開始懸浮培養後第84天、第92天、第93天之細胞凝集體單離帽及環。藉由實施例8所記載之方法實施所單離之環之基因表現分析。藉由實施例8所記載之方法，選擇表現神經視網膜標記基因而不表現副產物之標記基因之環，將與該環相對應之帽製成移植用神經視網膜片。以上述方式由開始懸浮培養後第84天之細胞凝集體製作1塊移植用神經視網膜片，由開始懸浮培養後第92天之細胞凝集體製作2塊移植用神經視網膜片，由開始懸浮培養後第93天之細胞凝集體製作1塊移植用神經視網膜片。即製作合計4塊之移植用神經視網膜片。
為了進行分析而將所獲得之移植用神經視網膜片於B培養基中培養7天。藉由4%多聚甲醛固定所培養之移植用神經視網膜片，製作冷凍切片。對於冷凍切片，進行關於作為神經視網膜前驅細胞標記之一的Chx10(抗Chx10抗體，Exalpha公司，羊)、及作為視細胞前驅細胞之標記之一的Crx(抗Crx抗體，Takara公司，兔)的免疫染色。對於其他冷凍切片，進行關於作為神經視網膜標記之一的Rx(抗Rx抗體，Takara公司，天竺鼠)、及作為視細胞之標記之一的Recoverin(抗Recoverin抗體，Proteintech公司，兔)的免疫染色。利用DAPI將細胞核染色。使用螢光顯微鏡(Keyence公司製造)觀察該等進行了染色之切片，獲得免疫染色圖像。將其一例(D3)示於圖15。
利用ImageJ (版本1.52a，NIH製造)分析免疫染色圖像，針對4塊移植用神經視網膜片，分別分析DAPI陽性細胞數、DAPI陽性且Chx10陽性細胞數、及DAPI陽性且Crx陽性細胞數。同樣地分析免疫染色圖像，並分析DAPI陽性細胞數、及DAPI陽性且Rx陽性細胞數。根據該等數值算出Chx10陽性細胞之比率、Crx陽性細胞之比率、及Rx陽性細胞之比率。將所獲得之結果記載於表15。 [表15]
Cap識別編號 開始懸浮培養後之天數(天) 陽性細胞之比率(%)
Chx10 Crx Rx
B3 84＋7 44.6 29.7 39.5
D2 92＋7 38.9 41.5 44.3
D3 92＋7 22.7 39.0 53.5
G3 93＋7 36.6 55.5 53.5
根據以上結果可知：移植用神經視網膜片所含之Chx10陽性細胞之比率為23～45%左右，Crx陽性細胞之比率為30～56%左右，Rx陽性細胞之比率為40～54%左右。
即，表明移植用神經視網膜片中包含Chx10陽性之神經視網膜前驅細胞約34%左右(23～45%左右)、Crx陽性之視細胞前驅細胞約40%(30～56%)、Rx陽性細胞約47%(40～54%)。
＜實施例14 構成移植用神經視網膜片之視細胞前驅細胞及神經視網膜前驅細胞之比率＞ 藉由免疫染色法之一的流式細胞術(亦稱為FACS)研究利用由各種多能性幹細胞分化而成之細胞凝集體所製作之移植用神經視網膜片之構成細胞之組成。
藉由實施例1所記載之製法使人類iPS細胞(QHJI-01-s04株)分化為視網膜。其後，藉由實施例6所記載之方法自開始懸浮培養後第88天之細胞凝集體單離帽及環。然後將帽製成移植用神經視網膜片。將移植用神經視網膜片於17℃下低溫保存2天。將5塊所獲得之移植用神經視網膜片彙總製成1個樣品，利用PBS進行洗淨，使用神經細胞分散液(WAKO公司製造，包含木瓜酶)於37℃下進行30分鐘左右之酶處理，藉由移液使其分散為單細胞，獲得單細胞懸濁液。使用固定液(BD公司製造，CytoFix)固定所獲得之單細胞懸濁液，獲得FACS用樣品。使用包含血清之Perm/Wash液(BD公司製造)液對FACS用樣品進行封閉及透過處理(細胞膜之開孔)。然後，藉由經螢光標記之以下抗體、抗Chx10抗體(Santa Cruz公司製造)及抗Pax6抗體(BD公司製造)、抗Crx抗體(Santa Cruz公司製造)進行免疫染色。然後，使用分析儀(BD公司製造)，利用流式細胞術進行分析。
其結果可知，Chx10陽性且Pax6陽性組分(神經視網膜前驅細胞組分)為11.5%，Chx10陽性且Pax6陰性組分(偏向雙極細胞之前驅細胞組分)為23.4%，Chx10陰性且Pax6陽性組分(神經節細胞及無軸突神經細胞組分)為10.7%，Crx陽性細胞組分(視細胞前驅細胞組分)為17.4%。
進而，藉由實施例1所記載之製法使人類iPS細胞(DSP-SQ株)分化為視網膜。其後，製作11個開始懸浮培養後第88天之細胞凝集體，藉由實施例6所記載之方法自11個細胞凝集體逐個單離帽及環。將11個帽彙總製成1個帽樣品。同樣地將11個環彙總製成1個環樣品。利用PBS將帽樣品與環樣品分別洗淨，使用神經細胞分散液(WAKO公司製造，包含木瓜酶)於37℃下進行30分鐘左右之酶處理，而獲得帽與環各自之單細胞懸濁液。使用固定液(BD公司製造，CytoFix)固定所獲得之帽與環各自之單細胞懸濁液，獲得FACS用樣品。使用包含血清之Perm/Wash液(BD公司製造)液對FACS用樣品進行封閉與開孔，藉由經螢光標記之以下抗體、抗Chx10抗體(Santa Cruz公司製造)、抗Crx抗體(Santa Cruz公司製造)、抗SSEA-4抗體進行免疫染色。使用同型對照組作為免疫染色之陰性對照。然後，使用分析儀(BD公司製造)，利用流式細胞術進行分析。利用各自與同型對照組之差量算出Chx10陽性細胞之比率、Crx陽性細胞、SSEA-4陽性細胞之比率。將其結果記載於表16。 [表16]
樣品 開始懸浮培養後之天數(天) 陽性細胞之比率(%)
Chx10 Crx SSEA-4
帽 88 29.4 15.8 ＜1
環 88 28.1 21.7 ＜1
帽樣品中作為神經視網膜前驅細胞標記之Chx10陽性細胞之比率為29.4%，作為視細胞前驅細胞標記之Crx陽性細胞之比率為21.7%，作為多能性幹細胞標記(目標外細胞)之SSEA-4陽性細胞之比率未達1%。環樣品中作為神經視網膜前驅細胞標記之Chx10陽性細胞之比率為28.1%，作為視細胞前驅細胞標記之Crx陽性細胞之比率為15.8%，作為多能性幹細胞標記(目標外細胞)之SSEA-4陽性細胞之比率未達1%。
根據該等結果可知，首先，該帽樣品及環樣品係包含Chx10陽性細胞與Crx陽性細胞之神經視網膜，實質上不含未分化iPS細胞。並且，可證實帽樣品所含之Chx10陽性細胞與Crx陽性細胞之比率與環樣品所含之Chx10陽性細胞與Crx陽性細胞之比率為同等。並且，可證實若環樣品為神經視網膜，則帽亦為神經視網膜。
並且可知，於使用該等帽或環(較佳為帽)作為移植用神經視網膜片之情形時，該移植用神經視網膜片所含之Chx10陽性(神經視網膜前驅細胞組分)約為30%左右(20～40%左右)，Crx陽性細胞組分(視細胞前驅細胞組分)約為17%左右(10～30%左右)。
於本案之方法中，作為品質評價之方法，已證實對多樣品、多基因進行評價之定量PCR法之有用性，但可知藉由免疫染色法之一的流式細胞術分析亦可實施品質評價。
根據以上結果可知，於包含具有上皮結構之上皮組織(較佳為神經上皮，更佳為神經視網膜)之細胞凝集體中，藉由自1個上皮結構單離帽與環，並檢查環之基因表現，而可確保帽之品質。可知檢查基因表現之方法中，定量PCR法或免疫染色法均有用。並且可知，具有上皮結構之上皮組織為神經視網膜之情形或為非神經視網膜之情形均可應用該品質檢查之方法論。 [產業上之可利用性]
根據本發明，可提供一種評價移植用神經視網膜之品質之方法及藉由該方法所選擇之移植用神經視網膜片。
圖1係表示實施例1中以Crx及Chx10對包含移植用神經視網膜之細胞凝集體進行免疫染色之結果之螢光顯微鏡圖像。 圖2係表示實施例1中以Rx及Recoverin對包含移植用神經視網膜之細胞凝集體進行免疫染色之結果之螢光顯微鏡圖像。 圖3表示實施例2中自神經視網膜及副產物A、B、C、D、E及F提取之RNA之微陣列分析結果。 圖4係由典型之細胞凝集體製作帽及環之概念圖。 圖5係由呈各種形狀之細胞凝集體製作帽及環之概念圖。黑色及灰色表示之部分意指目標外組織。 圖6表示典型之移植片之圖像及移植片之模式圖，並且表示實施例4中之移植片之高度、長徑及短徑。 圖7係表示實施例5中以Crx及Chx10對移植片進行免疫染色之結果之共聚聚焦螢光顯微鏡圖像。 圖8表示實施例6中藉由定量PCR對自帽及環提取之RNA中之基因表現進行分析所獲得之結果。 圖9表示實施例7中藉由定量PCR對自帽及環提取之RNA中之基因表現進行分析所獲得之結果。 圖10係表示實施例8中藉由定量PCR對自環提取之RNA進行分析後將移植片(帽)移植於大鼠視網膜下，並利用螢光顯微鏡觀察移植後之移植存活圖像所獲得之結果之圖像。 圖11係表示實施例9中藉由定量PCR對自環提取之RNA進行分析後將移植片(帽)移植於大鼠視網膜下，並利用螢光顯微鏡觀察移植後之移植存活圖像所獲得之結果之圖像。 圖12係實施例10中利用倒置顯微鏡觀察環所獲得之圖像、及表示將環移植於大鼠視網膜下並利用螢光顯微鏡觀察移植後之移植存活圖像所獲得之結果之圖像。 圖13係表示實施例11中對由一個細胞凝集體製作之帽及環進行免疫染色之結果之螢光顯微鏡圖像。 圖14表示實施例12中藉由定量PCR對自由神經視網膜及非神經視網膜(端腦組織、脊髓組織、RPE、Optic stalk)製作之帽及環提取之RNA中之基因表現進行分析所獲得之結果。 圖15表示實施例14中使用螢光顯微鏡(Keyence公司製造)觀察經染色之切片所獲得之免疫染色圖像。

Claims (21)

  1. 一種評價移植用神經視網膜之品質之方法，上述方法包括：對包含來自多能性幹細胞之具有上皮結構之神經視網膜的細胞凝集體之一部分或全部進行取樣而作為品質評價用樣品；檢測上述品質評價用樣品中之神經視網膜系細胞相關基因及非神經視網膜系細胞相關基因之表現；及於見到上述神經視網膜系細胞相關基因之表現，且未見到上述非神經視網膜系細胞相關基因之表現之情形時，判定為可使用下述作為移植用神經視網膜：(1)與包含作為上述一部分之品質評價用樣品之細胞凝集體相同之細胞凝集體中之上述神經視網膜(移植用神經視網膜)、(2)與包含作為上述一部分之上述品質評價用樣品之細胞凝集體為同一批次之細胞凝集體中之上述神經視網膜(移植用神經視網膜)、或(3)與作為上述全部之上述品質評價用樣品之細胞凝集體為同一批次之細胞凝集體中之上述神經視網膜(移植用神經視網膜)，且上述非神經視網膜系細胞相關基因包含選自由腦脊髓組織標記基因及眼球相關組織標記基因所組成之群中之1種以上之基因。
  2. 如請求項1之方法，其中上述神經視網膜系細胞相關基因為與非神經視網膜系細胞相比而於神經視網膜系細胞中較高地表現之基因。
  3. 如請求項1之方法，其中上述腦脊髓組織標記基因為選自由端腦標記基因、間腦/中腦標記基因、及脊髓標記基因所組成之群中之1種以上之基因，上述眼球相關組織標記基因為選自由optic stalk標記基因、睫狀體標記基因、晶狀體標記基因及視網膜色素上皮標記基因所組成之群中之1種以上之基因。
  4. 如請求項1之方法，其中上述非神經視網膜系細胞相關基因為選自脊髓標記基因中之1種以上之基因。
  5. 如請求項1之方法，其中上述非神經視網膜系細胞相關基因包含選自端腦標記基因中之1種以上之基因、選自脊髓標記基因中之1種以上之基因、選自optic stalk標記基因中之1種以上之基因、及選自睫狀體標記基因中之1種以上之基因。
  6. 如請求項3之方法，其中上述端腦標記基因包含選自由FoxG1、Emx2、Dlx2、Dlx1及Dlx5所組成之群中之1種以上之基因，上述間腦/中腦標記基因包含選自由OTX1、OTX2、DMBX1、Rx、Nkx2.1、OTP、FGFR2、EFNA5及GAD1所組成之群中之1種以上之基因，上述脊髓標記基因包含選自由HOXD4、HOXD3、HOXD1、HOXC5、HOXA5及HOXB2所組成之群中之1種以上之基因，上述Optic Stalk標記基因包含選自由GREM1、GPR17、ACVR1C、 CDH6、Pax2、Pax8、GAD2及SEMA5A所組成之群中之1種以上之基因，上述睫狀體標記基因包含選自由Zic1、MAL、HNF1beta、FoxQ1、CLDN2、CLDN1、GPR177、AQP1及AQP4所組成之群中之1種以上之基因，上述晶狀體標記基因包含選自由CRYAA及CRYBA1所組成之群中之1種以上之基因，上述視網膜色素上皮標記基因包含選自由MITF、TTR及BEST1所組成之群中之1種以上之基因。
  7. 如請求項1之方法，其中上述非神經視網膜系細胞相關基因進而包含未分化多能性幹細胞標記基因。
  8. 如請求項7之方法，其中上述未分化多能性幹細胞標記基因包含選自由Oct3/4、Nanog及lin28所組成之群中之1種以上之基因。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中與上述品質評價用樣品之細胞凝集體為同一批次之細胞凝集體係於呈現出與上述移植用神經視網膜同等之基因表現圖譜之條件下所製造之細胞凝集體。
  10. 如請求項1至8中任一項之方法，其中上述品質評價用樣品為細胞凝集體之一部分，於見到上述神經視網膜系細胞相關基因之表現，且未見到上述非神 經視網膜系細胞相關基因之表現之情形時，判定為可使用如下之神經視網膜作為移植用神經視網膜：其至少一部分與和包含作為上述一部分之品質評價用樣品之細胞凝集體相同之細胞凝集體中的該一部分連續。
  11. 如請求項10之方法，其中上述移植用神經視網膜與上述品質評價用樣品包含於同一上皮組織中。
  12. 如請求項11之方法，其中上述移植用神經視網膜包含上述同一上皮組織之中心附近。
  13. 如請求項12之方法，其中上述移植用神經視網膜為連續上皮組織。
  14. 如請求項10之方法，其中包含上述神經視網膜之細胞凝集體包含第一上皮組織、及第二上皮組織，上述第一上皮組織包含上述移植用神經視網膜，上述第二上皮組織具有與上述第一上皮組織之表面之切線斜率之連續性不同的表面之切線斜率之連續性，且包含非神經視網膜系細胞，上述移植用神經視網膜包含距上述第二上皮組織最遠之第一上皮組織上之區域，上述品質評價用樣品係存在於上述第二上皮組織與上述移植用神經視網膜之間之一部分。
  15. 如請求項14之方法，其中上述第二上皮組織係眼球相關組織及/或腦脊髓組織。
  16. 如請求項15之方法，其中上述眼球相關組織包含視網膜色素上皮細胞及睫狀體。
  17. 如請求項1至8中任一項之方法，其中上述神經視網膜系細胞相關基因及上述非神經視網膜系細胞相關基因之表現之檢測包括藉由定量PCR而進行。
  18. 如請求項17之方法，其包括於滿足以下之基準1及基準2之情形時，判定為可用作移植用神經視網膜：基準1：上述神經視網膜系細胞相關基因之閾值循環(Ct)值與內部標準基因之Ct值之差(△Ct值)為10以下、基準2：上述非神經視網膜系細胞相關基因之Ct值與內部標準基因之Ct值之差(△Ct值)為5以上。
  19. 如請求項17之方法，其中上述定量PCR係藉由包括下述(1)~(5)之步驟之方法而進行，藉此同時檢測2個以上之上述品質評價用樣品中各自之神經視網膜系細胞相關基因及非神經視網膜系細胞相關基因之表現量：(1)準備流路板、由2個以上之上述品質評價用樣品獲得之含有核酸之溶液(樣品溶液)、含有1種或複數種對1種以上之上述神經視網膜系細胞相關基因或上述非神經視網膜系細胞相關基因具有特異性之引子之溶液(引子溶液)，該流路板具有1組包含8個以上800個以下之獨立之樣品孔的樣品孔組、1組以上包含8個以上800個以下之獨立之引子孔的引子孔組、及將 樣品孔組中之獨立之樣品孔與各引子孔組中之獨立之引子孔相連之流路；(2)於樣品孔組中，以每個上述品質評價用樣品成為1種樣品溶液/1個樣品孔之方式添加上述樣品溶液；(3)於上述1組以上之引子孔組中，將上述引子溶液以成為不同之引子孔組之方式添加至1個以上之引子孔中；(4)經由上述流路，將上述引子分別混合於上述核酸中；及(5)使用(4)中獲得之混合液進行定量PCR。
  20. 一種神經視網膜片之製造方法，其包括：自2個以上800個以下之包含來自多能性幹細胞之具有上皮結構之神經視網膜的細胞凝集體分別取樣作為該細胞凝集體之一部分之品質評價用樣品；藉由如請求項1至19中任一項之方法對上述所取樣之2個以上800個以下之品質評價用樣品進行評價，篩選出判定為可用作移植用神經視網膜之移植用神經視網膜；及將上述篩選出之移植用神經視網膜單離。
  21. 如請求項20之製造方法，其中上述細胞凝集體係將多能性幹細胞分化誘導而獲得的至少包含第一上皮組織及第二上皮組織者，上述第一上皮組織包含人類神經視網膜，上述第二上皮組織具有與上述第一上皮組織之表面之切線斜率之連續性不同的表面之切線斜率之連續性，且包含非神經視網膜系細胞，上述移植用神經視網膜之單離係以上述移植用神經視網膜包含距上 述第二上皮組織最遠之上述第一上皮組織上之區域之方式，自上述細胞凝集體單離。
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