KR102630672B1 - 기저 전뇌 콜린성 뉴런(bfcn)을 생성하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

기저 전뇌 콜린성 뉴런(bfcn)을 생성하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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마이태인 오리츠-비룸브랠리스
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일야 크루글리코브
미셸레 얼리치
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뉴욕 스템 셀 파운데이션, 인코포레이티드
이칸 스쿨 오브 메디슨 엣 마운트 시나이
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Abstract

본 발명은 줄기세포로부터 기저 전뇌 콜린성 뉴런(BFCN), 특히, PSEN2에서의 하나 이상의 돌연변이에 관한 수선된 전기생리학적 결함을 갖는 BFCN을 발생시키기 위한 방법 및 조성물, 및 알츠하이머병을 치료하기 위한 세포-기반 요법에서의 이러한 BFCN의 용도에 관한 것이다.

Description

기저 전뇌 콜린성 뉴런(BFCN)을 생성하기 위한 방법 및 조성물
관련 출원(들)에 대한 상호 참조
본 출원은 미국 특허법(35 U.S.C. §119(e)) 하에서 2017년 5월 25일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/511,271호, 2017년 10월 12일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/571,741호, 2017년 10월 19일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/574,639호, 및 2017년 11월 15일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/586,571호의 우선권의 유익을 주장하며, 이들 각각의 전문은 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 편입된다.
정부 지원의 언급
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health: NIH)에 의해 부여된 등록번호 R21AG042965, U01AG046170, U01AG046170, NS049442 및 U01AG046170 하에 부분적으로 정부 지원에 의해 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해 소정의 권리를 가진다.
서열목록의 편입
수반하는 서열목록의 물질은 본 출원에 대해 본 명세서에 참고로 편입된다. 파일명이 NYSC1390_4WO_Sequence_Listing.txt인 수반하는 서열목록의 텍스트 파일은 2018년 5월 24일자로 생성되었고, 53kb이다. 파일은 윈도우 OS를 이용하는 컴퓨터에서 마이크로소프트 워드를 이용하여 액세스될 수 있다.
본 발명의 기술분야
본 출원은 의학 분야, 더 구체적으로는 줄기 세포로부터 기저 전뇌 콜린성 뉴런(basal forebrain cholinergic neuron: BFCN), 특히, 프레세닐린 2 유전자(presenilin 2 gene: PSEN2)에서의 하나 이상의 돌연변이에 관해 수선된 전기생리학적 결함을 포함하는 BFCN을 발생시키기 위한 방법 및 조성물, 및 알츠하이머병을 치료하기 위한 세포-기반 요법에서의 이러한 BFCN의 용도에 관한 것이다.
알츠하이머병(Alzheimer's disease: AD)은 노인성 치매를 야기하는 진행성 질환이다. 일반적으로 말해서, 상기 질환은 두 가지 범주로 나뉜다: 노년기(65+세)에 생기는 후발성, 및 노화기, 즉, 35 내지 60세 전에 잘 생기는 초로기성. 질환 유형 둘 다에서, 병리학은 동일하지만, 더 어린 연령에서 시작하는 경우에 이상은 더 중증이며 광범위한 경향이 있다. 상기 질환은 뇌, 노인성반 및 신경섬유매듭에서 적어도 2가지 유형의 병변을 특징으로 한다. 노인성반은 뇌 조직 절편의 현미경 분석에 의해 보이는 중심의 세포외 아밀로이드 침착과 함께 150㎛까지로 걸쳐 있는 잘못된 신경망 부위이다. 신경섬유매듭은 서로에 관해 쌍으로 꼬여있는 2개의 필라멘트로 이루어진 미세소관 결합 타우 단백질(tau protein)의 세포내 침착이다.
플라크의 원칙적 구성성분은 Aβ 또는 β 아밀로이드 펩타이드로 칭해지는 펩타이드이다. Aβ 펩타이드는 아밀로이드 전구체 단백질(아밀로이드 precursor protein: APP)로 칭해지는 전구체 단백질의 39 내지 43개의 아미노산의 내부 단편이다. APP 단백질 내의 몇몇 돌연변이는 알츠하이머병의 존재와 상관관계가 있었다. 이러한 돌연변이는 APP의 Aβ로의 증가된 또는 변경된 가공, 특히 APP의 증가된 양의 긴 형태의 Aβ(즉, Aβ1-42 및 Aβ1-43)로의 가공에 의해 알츠하이머병을 야기하는 것으로 생각된다. 다른 유전자, 예컨대, 프레세닐린 유전자, PSEN1 및 PSEN2에서의 돌연변이는 증가된 양의 긴 형태의 Aβ를 생성하는 APP의 가공에 간접적으로 영향을 미치는 것으로 생각된다. 이들 관찰은 Aβ 및 특히 그의 긴 형태가 알츠하이머병의 유발 요소라는 것을 시사한다.
미국에서 현재 5백만명의 사람들이 알츠하이머병에 걸려 있으며, 알츠하이머 협회에 따르면, 이 수는 2050년까지 1천 6백만명으로 증가될 것이다. 불행하게도, 본 발명자들은 이들 환자 중 3 내지 5%를 차지하는 유전적 원인에 대한 직접 증거만을 가진다. 이 백분율은 γ-세크래타제 장치를 구성하는 APP 또는 PSEN1, PSEN2의 유전성의 완전 침투성 상염색체 우성 돌연변이에 의해 야기되는 상염색체 우성 조기 개시 가족성 알츠하이머병(early onset familial Alzheimer's disease: EOFAD) 변이체를 포함하고[87], 이들 기능의 변화는 Aβ42 올리고머의 생성 및/또는 아밀로이드 플라크의 침착을 증가시킨다.
인간 뇌에서의 이 질환의 병리생리학을 완전히 개괄하지 않는 AD의 뮤린 모델을 연구하고 수십년 후에[5, 57, 58], 정해진 인자를 이용하여 성인 인간 조직의 iPSC로의 재프로그래밍 및 이들의 특정 뇌세포 유형으로의 후속적 시험관내 분화를 허용함으로써 브레이크스루(breakthrough)에 대한 시험관내 AD 모델링의 상보적 신개념이 나타났다[81].
BFCN은 가장 취약한 뉴런 집단 중 하나이며, 이의 악화는, 부분적으로, AD 환자에서의 인지력 감퇴를 설명한다. BFCN 부전 및 위축에 대한 증거 외에, 다른 연구들은 AD 마우스 모델에 이식된 인간 배아 줄기 세포-유래 BFCN이 이식 마우스의 학습 거동 개선과 연관될 수 있다는 것을 나타내었다[94]. 이들 발견은 조기 임상 지표로서뿐만 아니라 AD에 대한 아형-특이적 세포-기반 요법에 대한 잠재적 전략으로서 iPSC- 및 ESC-유래 BFCN의 적절성을 강조한다[39]. 앞으로 이런 세포-기반 치료 전략을 움직이기 위해, 인간 ESC- 및/또는 iPSC-유래 BFCN을 생성하기 위한 정제된 분화 프로토콜에 대한 긴급한 필요가 있었다.
본 발명은 배아 줄기 세포(embryonic stem cell: ESC) 및 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)를 포함하는, 만능 줄기 세포(pluripotent stem cell: PSC)로부터의 BFCN을 효율적으로 유도하기 위한 고도로 재현 가능한 프로토콜을 제공한다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 BFCN의 생성 방법을 제공한다. 상기 방법은 신경외배엽 분화를 유도하기 위해 형질전환 성장인자 베타(TGF-β) 신호전달의 저해제 및 음향고슴도치(sonic hedgehog: Shh) 신호전달의 활성체를 포함하는 기저 배지에서 PSC를 배양시키는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 기저 배지는 기저 섬유아세포 성장 인자 bFGF), TGF-β, 염화리튬(Li-Cl), GABA 및 피페콜산을 비롯한, 다능성을 지지하는 인자를 결여하는 변형된 mTeSR1 제형이다. 일부 양상에서, 배양시키는 단계는 평활화 단백질, 예컨대, 평활화 작용제(smoothened agonist: SAG) 및 퍼모프아민(purmorphamine) 중 1종 이상의 작용제와 함께 이중 SMAD 저해제, 예컨대, SB431542 및 LDN193189의 존재 하에 수행된다. 배양시키고 약 9, 10, 11 또는 12일 후에, CD271+ 세포가 뉴런 기저 배지, 예컨대, 브레인피스(Brainphys)(상표명)에서 선택되어 뉴런 배상체(neuronal embryoid body: NEB)를 생성한다. 뉴런 기저 배지는 B27 보충물, 로-결합 단백질 키나제(rho-associated protein kinase: ROCK)의 저해제, 신경성장인자(nerve growth factor: NGF) 및 뇌 유래 신경 성장인자(BDNF) 중 한 가지 이상으로 선택적으로 보충된다. CD271+ 세포를 배양시키고 약 7, 8, 9 또는 10일 후에, 형성된 NEB가 채취되고, 해리되며, 단일층 배양물로서 플레이팅되고, B27 보충물, NGF 및 BDNF로 선택적으로 보충된 뉴런 기저 배지에서 추가로 배양된다. BFCN으로의 분화를 보장하기 위해, 배양된 세포는 Tuj1, MAP2, BF1, Nkx2.1 및 p75의 양성 발현에 대해 분석된다.
다른 실시형태에서, 상기 방법은 하나 이상의 돌연변이, 예컨대, 프레세닐린 1(PSEN1) 또는 프레세닐린 2(PSEN2)의 돌연변이를 수선하기 위해 유전자 편집 시스템으로 처리될 수 있는 iPSC를 이용한다. 일 양상에서, 상기 돌연변이는 PSEN2N141I이며, 이의 수선은 BFCN의 뉴런 흥분성을 회복시킨다.
따라서, 다른 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상체에게 본 명세서에 기재된 배양 방법을 이용하여 생성된 BFCN을 투여하는 단계를 포함한다. 소정의 양상에서, 상기 질환 또는 장애는 아밀로이드 형성 질환, 예컨대, 전신 아밀로이드증, 알츠하이머병, 성숙기 개시 당뇨병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 전측두엽 치매 및 프리온-관련 전염성 해면상뇌증이다. 실시형태에서, 뉴런 흥분성을 손상시키는 돌연변이, 예컨대, PSEN2N141I를 갖는 BFCN은 대상체로부터 얻을 수 있고, iPSC를 생성하는 데 사용되는데, 이는 결국 돌연변이를 수선하기 위해 유전자 편집 시스템으로 처리될 수 있다. 이어서, 유전자 편집된 iPSC는 본 명세서에 기재된 바와 같이 배양되어 뉴런 흥분성이 회복된 BFCN을 생성하는데, 이는 질환 또는 장애를 치료하기 위해 대상체에게 투여된다. 소정의 양상에서, 상기 질환 또는 장애는 AD이다.
관련된 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서의 BFCN의 뉴런 흥분성을 회복시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 a) 상기 대상체로부터 BFCN을 단리시키는 단계로서, 상기 BFCN은 상기 BFCN의 손상된 뉴런 흥분성을 초래하는 PSEN2에서의 돌연변이를 갖는, 상기 단리시키는 단계; b) (a)의 상기 BFCN을 이용하여 iPSC를 생성하는 단계; c) 상기 iPSC에서 상기 PSEN2 돌연변이를 수선하는 단계; d) 본 명세서에 기재된 분화 프로토콜을 이용하여 (c)의 상기 iPSC를 배양시켜 상기 수선된 돌연변이를 갖는 BFCN을 생성하는 단계; 및 e) 상기 대상체에게 (d)의 상기 iPSC를 투여하여 상기 대상체에서의 BFCN의 뉴런 흥분성을 회복시키는 단계를 포함한다.
또한 BFCN의 감소된 뉴런 흥분성과 연관된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 화합물을 동정하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 a) 본 명세서에 기재된 분화 프로토콜을 이용하여 생성된 BFCN 또는 뉴런 배상체(NEB)를 후보 화합물과 접촉시키는 단계로서, 상기 BFCN은 상기 BFCN의 손상된 뉴런 흥분성을 초래하는 PSEN2에서의 돌연변이를 포함하는, 상기 접촉시키는 단계; 및 b) 상기 후보 화합물과의 접촉 후에 상기 BFCN의 뉴런 흥분성을 검출하는 단계를 포함한다. 후보 화합물과의 접촉 후에 BFCN의 뉴런 흥분성의 증가는 상기 화합물을 BFCN의 뉴런 흥분성을 잠재적으로 회복시킬 수 있는 화합물로서 동정한다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 분화 프로토콜을 이용하여 생성된 BFCN을 제공한다. BFCN은 PSEN2의 유전자 편집된 수선뿐만 아니라 BFCN 게놈에 재조합적으로 도입된 검출 가능한 마커를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 BFCN을 생성하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 TGF-β 신호전달의 저해제 및 Shh 신호전달의 활성체를 갖는 배양 배지를 포함한다. 실시형태에서, 배양 배지는 bFGF, TGF-β, 염화리튬(Li-Cl), GABA 및 피페콜산을 비롯한, 다능성을 지지하는 인자를 결여하는 변형된 mTeSR1 제형이다. 실시형태에서, 배양 배지는 평활화 단백질, 예컨대, 평활화 작용제(SAG) 및 퍼모프아민 중 1종 이상의 작용제와 함께 이중 SMAD 저해제, 예컨대, SB431542 및 LDN193189를 포함한다. 상기 키트는 또한 B27 보충물, ROCK의 저해제, NGF 및 BDNF 중 한 가지 이상으로 선택적으로 보충된 뉴런 기저 배지, 예컨대, 브레인피스(Brainphys)(상표명)를 포함할 수 있다. 실시형태에서, 상기 키트는 CD271+ 세포뿐만 아니라 Tuj1, MAP2, BF1, Nkx2.1 및 p75를 양성으로 발현시키는 세포의 검출을 위한 시약을 포함한다.
도 1A 내지 도 1E. 기저 콜린성 분화 프로토콜의 개략도를 도시한 도면. (A) 이중 SMAD 저해의 개시 전에 세포를 플레이팅시키고, 100% 컨플루언시(confluency)에 도달하도록 하고(제0일), 후속적으로 배측화제(ventralizing agent)를 도입함(제2일). 제10일에, 단일층을 해리시키고 나서, p75+ 세포에 대해 분류하고, 제19일까지 NEB로서 유지한다. 이어서, 배양물을 다시 단일층으로 해리시킨다(더 상세한 설명에 대해 상기 방법 참조). (B) 좌측 패널은 SHH + 퍼모프아민 또는 SAG + 퍼모프아민 처리 시 NKx2.1-EGFP hESC에서 Nkx2.1 유도에 의해 지속적 EGFP 발현을 나타내고, 제8일의 처리 제거 후에 제14일에 유지된다. 우측 패널은 표시된 배측화제의 존재 하에 NKx2.1-EGFP 세포주에서 qPCR에 의해 측정된 GAPDH에 대한 Nkx2.1, Lhx8 및 BF1 상대적 유전자 발현을 나타내거나, 또는 제12일에 비패턴화(unpatterned: UNP))됨. n = 3, 기술적 3회 중복. (C) 전형적 신경 로젯(neural rosette)을 나타내는 제11일의 f대조군(fControl) 및 대조군 계통에서의 Nestin, Sox2 및 DRAQ5, 또는 우측 패널에서의 Tuj1, Nkx2.1 우측 및 DRAQ5의 공초점 현미경 영상. 3회의 독립적 실험을 나타내는 영상. (D) 면역염색 NEB 동결절편, 또는 BFCN 마커 Nkx2.1/Tuj1/p75/BF1/MAP2/ChAT에 의해 단일층으로 해리된 NEB의 형광 현미경 영상. (E) 제50일에 MAP2, ChAT 및 훽스트(Hoescht)에 의한 단일층 면역염색으로 해리된 NEB. 형광 현미경은 SAG + 퍼모프아민 처리 단독에 대한 NGF 첨가 효과를 영상화한다. 영상은 적어도 3회의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 2A 내지 도 2F. PSEN2 N141I 신경전구체에서의 기저 콜린성 마커. (A) 사용한 세포주를 나타내는 표. 섬유아세포로부터 재프로그래밍한 4가지의 iPS 계통을 사용하였다; PSEN2 N141I 돌연변이도 ￡4 대립유전자도 운반하지 않는 2가지의 대조군(f대조군 및 대조군으로서 표지하는, 949 및 050643); 및 돌연변이와 ￡4 대립유전자를 운반하는 2명의 AD 환자(AD1 및 AD2로서 각각 표지하는 948 및 950). 4가지 iPS 계통 중 셋은 가족 관련이다(f대조군, AD1 및 AD2). (B) PSEN2의 엑손 5의 단편을 나타내는 대표적인 생어(Sanger) 서열분석 크로마토그램. 미스센스 점 돌연변이 Chr1:227,073,304 A > T의 화살표 마크 부위. (C) 조기 뉴런 및 기저 전뇌 마커에 대한 면역세포화학 및 RT-PCR. n = 3, 기술적 3회 중복으로 3회의 독립적 실험. (D) TUJ1 및 BF1에 대한 RTPCR 배수 변화. n = 3, 기술적 3회 중복으로 3회의 독립적 실험. (E) P75 염색을 위한 대표적인 히스토그램. n > 6. (F) Aβ40 및 Aβ42 ELISA 정량화. n = 3, 기술적 3회 중복으로 3회의 독립적 실험. ***, p < 0.001. *, p < 0.05.
도 3A 내지 도 3B. 면역세포화학에 의한 뉴런 및 기저 콜린성 마커를 도시한 도면. (A) DIV 21 상에서 TrkA에 대한 면역염색. (B) DIV65에서 상이한 배율로 ChAT 및 vAChT에 대한 면역염색; 및 Tuj1 및 MAP2. 영상은 적어도 3회의 독립적 실험을 나타낸다.
도 4A 내지 도 4D. PSEN2 N141I iPS 계통의 CRISPR/Cas9-매개 보정을 도시한 도면. (A) CRISPR/Cas9의 표적화에서 사용되는 가이드 RNA뿐만 아니라 야생형 유전자형을 도입하기 위해 이용되는 공여자 ssODN을 나타내는 개략도. 상부로부터 하부까지의 서열 식별자: 서열번호 26 내지 31. (B) 좌측 2 패널은 가이드 RNA 발현에 의한 Cas9 시스템을 나타내는 GFP 양성 HEK293T 세포를 나타내고, NT는 비형질감염(non-transfected)을 지칭하며; 우측 2 패널은 pCas9-gN141I-GFP 벡터로 리포펙션 후 GFP 양성 iPSC의 샘플을 나타낸다. (C) N141I 돌연변이에서의 보정을 나타내는 iPSC 계통으로부터의 생어 서열분석(Sanger sequencing) 결과. (D) 돌연변이체, 대조군 또는 Cispr-Cas9 보정된 BFCN으로부터의 72시간 조건화 배지에서 ELISA에 의해 검출된 Aβ 42/40 비(DIV 34). n = 4, 기술적 3회 중복으로 4회의 독립적 실험. *, p < 0.05; **, p < 0.01 스튜던트 T-검정.
도 5A 내지 도 5B. 다양한 PSEN 돌연변이를 운반하는 BFCN은 Aβ42 올리고머 독성에 대해 일관되게 더 민감하지 않다는 것을 도시한 도면. (A) Aβ42 올리고머(5μM)에 대한 72시간 노출에 반응한 세포사를 시각화하기 위해 프로피듐 아이오딘화물로 처리한 표시된 유전자형으로부터의 BFCN의 샘플 영상. (B) 72시간 노출 후 수집한 배지로부터 기록된 LDH 방출%. n = 3, 기술적 3회 중복으로 3회의 독립적 실험. *, p < 0.05; **, p < 0.01, 2원 ANOVA 본페로니 사후검정에 의해 검출.
도 6A 내지 도 6F. NLRP2 인플라마솜 mRNA 수준은 일부 PSEN2 N141I 세포에서 과발현되지만, 돌연변이에 의해 유도되지 않음을 도시한 도면. 콜린성 신경전구체에서 (A) NLRP2, (B) NLRP3, 및 (C) ASB9의 RT-PCR 발현. (D) NLRP2, PSEN2 및 β-액틴을 나타내는 웨스턴 블롯. 신경전구체(E) 및 BFCN(F)에서 NLRP2의 RT-PCR 발현. 모든 패널에 대해, n = 3, 기술적 3회 중복으로 3회의 독립적 실험. ***, p < 0.001.
도 7A 내지 도 7B. BFCN의 전기생리학적 및 형태적 특징을 도시한 도면. (A) 상부행 - 하부행에 나타낸 전압 프로토콜에 의해 생성된 화합물 나트륨 및 칼륨 전류. 적색으로 나타낸 -20㎷까지의 전압 단계에 의해 생성된 전류 추적. 삽도는 -20㎷까지의 전압 단계에 의해 생성된 전류의 처음 25㎳를 나타낸다(스케일 바 200 pA, 5㎳). (B) (A)에 기록된 패치 BFCN의 차등 간섭 대비 영상. 94개의 뉴런(22개의 야생형 대조군, 21개의 가족성 대조군, 18개의 AD1, 28개의 AD2 및 5개의 iAD1_대조군). 스케일 바는 30㎛이다.
도 8A 내지 도 8C. AD 계통으로부터의 BFCN의 전기생리학적 결손. (A) 콜린성 마커 ChAT 및 VAChT에 의한 바이오시틴(biocytin)-표지 뉴런의 공동 국소화. 화살표는 기록된 뉴런 세포체의 위치를 나타내고, 스케일바는 50㎛이다. (B) 1초의 음성 및 양성 정격전류 주입에 의해 생성된 BFCN의 대표적인 발화 패턴(firing pattern)이 도시된다. 총 94개의 개개 뉴런을 전기생리학적으로 연구하였다: 22개의 야생형 대조군 뉴런, 21개의 가족성 대조군 뉴런, 18개의 AD1 뉴런, 28개의 AD2 뉴런, 및 5 iAD1_(CRISPR-보정) 뉴런. 94개의 뉴런에 대한 실험은 며칠 내지 몇 주가 필요하였다. 각각의 실험일에, 각각의 유전자형으로부터의 대표가 포함되며, 각각의 유전자형으로부터 적어도 3개의 샘플을 매일 연구하였다. (C) 모든 조건에 걸쳐, 뉴런이 지속적일 수 있는 활동전위의 최대 수(좌측) 및 기전류에서의 단일 활동전위의 높이(우측)에 대한 데이터 요약. 개개 데이터 지점을 원으로서 나타내며, 그룹 평균을 막대로 나타낸다. **, p < 0.01 터키 HSD 검정.
도 9A 내지 도 9D. BFCN의 고유한 전기생리학적 특성. 5개 그룹으로부터의 모든 기록된 BFCN에 대한 데이터 요약. 94개의 뉴런(22개의 야생형 대조군, 21개의 가족성 대조군, 18개의 AD1, 28개의 AD2 및 5개의 iAD1_대조군). 히스토그램은 각각의 뉴런으로부터의 개개 값(원) 및 막 저항(A), 전기용량(B), 휴지전위(C) 및 기전류(D)에 대한 그룹 평균(막대). ANOVA 및 터키 사후검정 비교로 통계학적 유의도를 검증하였다.
도 10A 내지 도 10B. iPSC 계통의 품질 관리. (A) 면역형광은 다능성 마커 SSEA4, Nanog, Tra160의 발현 그리고 7889(S)B iPSC 계통에서의 발현을 나타낸다. (B) 7889(S)B iPSC 계통에 의해 생성된 기형종으로부터의 3개 배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽).
도 11A 내지 도 11B. 성숙 BFCN에서의 아밀로이드 β 수준. (A) BFCN에 대한 Aβ40 수준(DIV 34). *, 일원 ANOVA 본페로니 사후검정에 따른 연구에서 다른 계통에 대한 P < 0.01. (B) BFCN에 대한 Aβ42 수준(DIV 34). n = 3, 기술적 3회 중복으로 3회의 독립적 실험. *, 스튜던트 T-검정에 기반하여 P < 0.01.
본 발명은 화학적으로 한정된 배지를 이용하여 PSC로부터 BFCN을 생성하기 위한 강하고, 빠르며, 재현 가능한 분화 프로토콜의 발견에 기반한다.
다음은 본 발명을 실행함에 있어서 당업자에게 도움을 주기 위해 제공된 본 발명의 상세한 설명이다. 당업자는 본 발명의 정신 또는 범주로부터 벗어나는 일 없이 본 명세서에 기재된 실시형태의 변형 및 변화를 만들 수 있다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에서 본 발명의 설명에 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 제한인 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 도면 및 다른 참고문헌은 그들의 전문이 분명하게 참고로 편입된다.
본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이해 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용되는 것과 관련하여 방법 및/또는 물질을 개시하고 기재하기 위해 본 명세서에 참고로 편입된다.
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 전체 개시내용이 본 명세서에 참고로 편입되는 다음의 참고문헌은 (본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한) 본 발명에서 사용되는 다수의 용어의 일반적 정의를 당업자에게 제공한다: 문헌[Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 및 Hale & Marham, the Harper Collins Dictionary of Biology (1991)]. 일반적으로, 본 명세서에 기재되거나 또는 고유한 분자 생물학 절차는 당업계에서 사용되는 통상적인 방법이다. 이러한 표준 기법은 참고 매뉴얼, 예컨대, 문헌[Sambrook et al., (2000, Molecular Cloning--A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratories); 및 Ausubel et al., (1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New-York)]에서 찾을 수 있다.
본 설명에서 사용되는 용어는 특정 실시형태만을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하는 것으로 의도하지 않는다. 다양한 값이 제공되는 경우에, 달리 분명하게 나타나지 않는 한, 하한 단위의 1/10까지 각각의 사이의 값(예컨대, 다수의 탄소 원자를 함유하는 기의 경우 범위 내에 속하는 각각의 탄소 원자 수가 제공된 경우에), 해당 범위의 상한과 하한 사이 및 언급된 범위 내 임의의 다른 언급되거나 또는 개재된 값이 본 발명 내에 포함된다는 것이 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 또한 본 발명 내에 포함되며 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 제외된 한계로 처리되는 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있다. 언급된 범위가 제한 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우에, 포함된 제한 중 하나 또는 둘 다를 제외하는 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
다음의 용어는 본 발명을 기재하기 위해 사용된다. 본 명세서에서 구체적으로 정의되지 않은 예에서, 해당 용어는 본 발명을 기재함에 있어서 그의 용도와 관련하여 해당 용어를 적용하는 당업자에 의해 당업계에 인식된 의미로 제공된다.
본 명세서에서 그리고 첨부하는 청구범위에서 사용되는 단수의 항목은 달리 명확하게 표시되지 않는 한 항목의 문법적 대상 중 하나 이상(즉, 적어도 하나)를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
본 명세서에서 그리고 청구범위에서 사용되는 어구 "및/또는"은 이렇게 결합된 요소 중 "하나 또는 둘 다", 즉, 일부 경우에 공동으로 존재하며 다른 경우에 별개로 존재하는 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"과 함께 열거된 다중 요소는 동일한 방식으로, 즉, 이렇게 결합된 요소 중 "하나 이상"으로 해석되어야 한다. 구체적으로 확인된 해당 요소와 관련이 있든 또는 관련이 없든, 선택적으로 "및/또는"라는 조항에 의해 구체적으로 확인된 요소 이외의 다른 요소가 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적 예로서, 제약을 두지 않은 언어, 예컨대, "포함하는"과 함께 사용될 때 "A 및/또는 B"에 대한 언급은, 일 실시형태에서, A 단독(선택적으로 B 이외의 요소를 포함); 다른 실시형태에서, B 단독(선택적으로 A 이외의 요소를 포함); 또 다른 실시형태에서, A와 B 둘 다(선택적으로 다른 요소를 포함)를 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 그리고 청구범위에서 사용될 때, "또는"은 상기 정의한 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리시킬 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적, 즉, 적어도 하나의 포함뿐만 아니라 하나 초과, 다수의 요소, 요소의 목록, 및 선택적으로 추가적인 비열거 항목을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 반대로 분명히 표시되는 용어만, 예컨대, "중 단지 하나" 또는 "중 정확히 하나" 또는 청구범위에서 사용될 때, "이루어진"은 다수의 요소 또는 요소의 목록 중 정확히 하나의 요소의 포함을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 용어 "또는"은 배타적 용어, 예컨대, "중 하나", "의 하나", "중 단지 하나" 또는 "중 정확히 하나"에 선행할 때, 배타적 대안(즉, "하나 또는 나머지이지만, 둘 다는 아님"을 나타내는 것으로만 해석되어야 할 것이다.
하나 이상의 요소 목록과 관련하여 본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같은 어구 "적어도 하나"는 요소 목록에서 요소 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 하지만, 요소 목록 내에 구체적으로 열거된 각각의 그리고 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함하지는 않으며 요소 목록 내 요소의 임의의 요소를 제외하지 않는다. 본 정의는 또한 요소가 구체적으로 확인된 해당 요소와 관련되든 또는 관련되지 않든 어구 "적어도 하나"가 지칭하는 요소 목록 내에서 구체적으로 확인된 요소 이외에 선택적으로 존재할 수 있다는 것을 허용한다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는 동등하게, "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는, 일 실시형태에서, 적어도 하나, 선택적으로 하나 초과의 A(B는 존재하지 않음)를 포함하는 것(및 선택적으로 B 이외의 요소를 포함); 다른 실시형태에서, 적어도 하나, 선택적으로 하나 초과의 B(A는 존재하지 않음)를 포함하는 것(및 선택적으로 A 이외의 요소를 포함); 또 다른 실시형태에서, 선택적으로 하나 초과의 A를 포함하는 적어도 하나, 및 선택적으로 하나 초과의 B를 포함하는 것(및 선택적으로 다른 요소를 포함)을 지칭할 수 있다.
또한 하나 초과의 단계 또는 작용을 포함하는 본 명세서에 기재된 소정의 방법에서, 상기 방법의 단계 또는 작용 순서는 문맥에서 달리 표시되지 않는 한 상기 방법의 단계들 또는 작용들이 열거되는 순서로 반드시 제한되지는 않는다는 것이 이해되어야 한다.
용어 "PSEN2 유전자"는 본 명세서에서 PSEN2 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 지칭한다. PSEN2 유전자는 NCBI 기준 서열: NC_000001.11(서열번호 1)뿐만 아니라 공지된 오솔로그로 나타낸다. 상기 용어는 "PSEN2 폴리펩타이드"는 본 명세서에서 NCBI 기준 서열: NP_000438.2(서열번호 2)뿐만 아니라 공지된 오솔로그로 나타내는 폴리펩타이드를 지칭한다.
용어 "아밀로이드 형성 질환"은 불용성 아밀로이드 피브릴의 형성 또는 침착과 관련된(또는 이에 의해 야기되는) 임의의 질환을 포함한다. 예시적인 아밀로이드 형성 질환은 전신 아밀로이드증, 알츠하이머병, 성숙기 개시 당뇨병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 전측두엽 치매, 및 프리온-관련 전염성 해면상뇌증(각각 인간에서의 쿠루병 및 크로이츠펠트 야콥병 및 양과 소에서의 스크래피 및 BSE)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 상이한 아밀로이드 형성 질환은 침착된 피브릴의 폴리펩타이드 성분의 특성에 의해 정해지거나 또는 특성규명된다. 예를 들어, 알츠하이머병을 가진 대상체 또는 환자에서, β-아밀로이드 단백질(예를 들어, 야생형, 변이체 또는 절단된 β-아밀로이드 단백질)은 아밀로이드 침착의 특징적 폴리펩타이드 성분이다. 따라서, 알츠하이머병은, 예를 들어, 대상체 또는 환자의 뇌에서 "Aβ의 침착을 특징으로 하는 질환" 또는 "Aβ의 침착과 관련된 질환"의 예이다. 용어 "β-아밀로이드 단백질", "β-아밀로이드 펩타이드", "β-아밀로이드", "Aβ" 및 "Aβ 펩타이드"는 본 명세서에서 상호 호환 가능하게 사용된다.
용어 "환자" 또는 "대상체"는 본 개시내용에 따른 조성물과 함께 예방적 치료를 포함하는 치료가 제공되는 동물, 바람직하게는, 인간 또는 가축 동물을 기재하기 위해 본 명세서 전체적으로 사용된다. 특정 동물, 예컨대, 인간 환자에 특이적인 병태 또는 질환 상태의 치료를 위해, 용어 환자는 가축 동물을 비롯한 특정 동물, 예컨대, 개 또는 고양이 또는 농장 동물, 예컨대, 말, 소, 양 등을 지칭한다. 일반적으로, 본 개시내용에서, 용어 환자는 상기 용어가 사용되는 문맥으로부터 달리 언급되거나 또는 나타나지 않는 한, 인간 환자를 지칭한다.
용어 "β-아밀로이드 단백질", "β-아밀로이드 펩타이드", "β-아밀로이드", "Aβ" 및 "Aβ 펩타이드"는 본 명세서에서 상호 호환 가능하게 사용된다. Aβ 펩타이드(예를 들어, Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 및 Aβ43)은 APP의 39 내지 43개의 아미노산의 약 4-kDa 내부 단편이다. Aβ40은, 예를 들어, APP의 잔기 672 내지 711로 이루어지고, Aβ42는 APP의 잔기 672 내지 713으로 이루어진다. Aβ 펩타이드는 APP의 세크레타제 절단으로부터 초래되는 펩타이드 및 절단 산물과 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 서열을 갖는 합성 펩타이드를 포함한다. Aβ 펩타이드는 다양한 공급원, 예를 들어, 조직, 세포주 또는 체액(예를 들어, 혈청 또는 뇌척수액)으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, Aβ는, 예를 들어, 문헌[Walsh et al., (2002), Nature, 416, pp 535-539 ]에 기재된 바와 같이 APP717V F로 안정하게 형질감염된 APP-발현 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포로부터 유래될 수 있다. Aβ 제제는 앞서 기재한 방법을 이용하여 조직 공급원으로부터 유래될 수 있다(예를 들어, 문헌[Johnson-Wood et al., (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1550] 참조). 대안적으로, Aβ 펩타이드는 당업자에게 잘 공지된 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Fields et al., Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W.H. Freeman & Co., New York, N.Y., 1992, p 77)] 참조. 따라서, 펩타이드는, 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템즈 펩타이드 신시사이저 모델(Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model) 430A 또는 431에 대해 측쇄 보호 아미노산을 이용하여 t-Boc 또는 F-moc 화학 중 하나로 보호된 알파-아미노기에 의한 고체상 합성의 자동화된 메리필드(Merrifield) 기법을 이용하여 합성될 수 있다. 더 긴 펩타이드 항원은 잘 공지된 재조합 DNA 기법을 이용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 또는 융합 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 합성되거나 또는 분자적으로 클로닝되고, 적합한 숙주 세포에 의해 형질감염 및 이종성 발현을 위해 적합한 발현 벡터에 삽입될 수 있다. Aβ 펩타이드는 또한 정상 유전자의 Aβ 영역에서의 돌연변이로부터 초래되는 관련된 Aβ 서열을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 어구 "실질적으로 순수한"은 세포 집단을 지칭하되, 세포의 적어도 95%는 열거된 표현형을 가진다. "실질적으로 순수한" 세포 집단을 지칭하는 모든 실시형태에서, 세포 집단이 더 낮은 또는 더 높은 순도를 갖는 대안의 실시형태가 또한 상정된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, "실질적으로 순수한" 주어진 세포 집단 대신에, 세포 집단은 세포의 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 또는 세포의 100%가 열거된 표현형을 갖는 것일 수 있다.
용어 "공동-투여", "공동 투여된" 및 "공동 투여하는" 또는 병용 요법은 제제가 동시에 일정한 정도로, 바람직하게는 유효량으로 치료될 영역에 존재한다면, 병행 투여(동시에 2 이상의 제제의 투여)와 시간 변화된 투여(추가적인 제제 또는 제제들의 투여와 상이한 시간에 1종 이상의 제제의 투여)를 둘 다 지칭한다.
용어 "치료적 유효량"은 치료적 효과를 달성하는 데 필요한 양을 의미한다. 치료적 효과는 예방, 증상 개선, 증상 치료로부터 질환 종결 또는 치유, 예를 들어, 알츠하이머병 또는 연관된 병태의 치료까지의 범위에 있는 임의의 치료 효과일 수 있었다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "투여하는"은 대상체 신체 내에서 조성물이 존재하도록 야기하는 방식으로 대상체에게 조성물을 제공하는 수단을 지칭하는 것을 의미한다. 이러한 투여는 피하, 진피내, 정맥내, 동맥내, 복강내 및 근육내를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 경로에 의할 수 있다.
용어 "유효한"은 의도된 용도의 문맥에서 사용될 때, 의도된 결과를 달성하는 화합물, 조성물 또는 성분의 양을 기재하기 위해 사용된다. 용어 유효한은 본 출원에서 달리 기재되거나 또는 사용되는 모든 다른 유효량 또는 유효 농도 용어를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 인용된 요소를 포함하지만, 다른 요소를 제외하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 조성물 및 방법을 정하기 위해 사용될 때 "본질적으로 이루어진"은 조합에 대해 임의의 본질적 유의성의 다른 요소를 제외하는 것을 의미할 것이다. 따라서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 요소로 본질적으로 이루어진 조성물은 단리 및 정제 방법으로부터의 미량의 오염물질 및 약제학적으로 허용 가능한 담체, 예컨대, 인산염 완충 식염수, 보존제 등을 제외하지 않을 것이다. "이루어진"은 본 발명의 조성물을 투여하기 위한 실질적인 방법 단계들 및 다른 성분의 미량 초과의 요소를 제외하는 것을 의미할 것이다. 이들 이행 용어 각각에 의해 정해지는 실시형태는 본 발명의 범주 내이다.
본 명세서에서 제공되는 범위는 범위 내의 모든 값에 대해 대해 약칭되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 및 50으로 이루어진 군으로부터의 임의의 수, 수들의 조합 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서 사용되는 "키트"는 본 발명의 적어도 비-표준 실험실용 시약 및 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 1종 이상의 비표준 실험실용 시약을 함유하는 것으로 이해된다.
용어 "얻는"은 제조하거나, 구입하거나 또는 달리 소유하는 것으로 본 명세서에서 이해된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료되는", "치료하는" 또는 "치료"는 치료 중인 상태, 장애 또는 질환과 연관되거나 또는 이에 의해 야기되는 적어도 하나의 증상의 감소 또는 완화를 포함한다. 치료된 대상체는 증상(예를 들어, 알츠하이머병 또는 연관된 병태)의 부분적 또는 전체적 완화를 나타낼 수 있거나 또는 증상은 본 발명에 따른 치료 후에 정적으로 남아있을 수 있다. 용어 "치료"는 예방, 요법 및 치유를 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서의 용어 "대조군"은 실험 샘플과의 비료를 위해 사용되는 샘플 또는 표준을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 대조군은 건강한 환자로부터 얻은 샘플이다. 다른 실시형태에서, 대조군은 이력의 대조군 또는 표준 기준 값 또는 값의 범위(예컨대, 이전에 검사한 샘플, 대상체, 또는 샘플 또는 대상체의 그룹)이다.
방법
BFCN은 AD의 모든 형태에 영향을 미칠 제1 세포 유형 중 하나인 것으로 여겨지며, 그들의 기능장애는 손상된 단기 기억 형성 및 회수와 임상적으로 상관관계가 있다. 본 개시내용의 실시형태에서 상술하는 바와 같이, 본 발명자들은 PSEN2 돌연변이 운반체 및 대조군으로부터의 세포주를 이용하여 iPSC로부터 인간 BFCN을 생성하기 위한 최적화된 시험관내 프로토콜을 제공한다. PSEN2 N141I 돌연변이를 보유하는 세포주는 iPSC-유래 BFCN에서 Aβ42/40의 증가를 나타내었다. PSEN2 N141I 계통으로부터 유래된 뉴런은 정격 탈분극 전류 주입에 반응하여 더 소수의 스파이크의 최대값 수를 생성하였다. 기전류 주입 시 제1 활동전위의 높이는 또한 PSEN2 N141I BFCN에서 유의하게 감소되었다. PSEN2 점 돌연변이의 CRISPR/Cas9 보정은 전기생리학적 결손을 없애서, 스파이크의 최대값 수와 스파이크 높이를 둘 다 대조군에 기록된 수준까지 회복시킨다. 증가된 Aβ42/40은 또한 PSEN2 N141I 돌연변이의 CRISPR/Cas-매개 보정 후에 정규화되었다. 본 명세서에 제시된 게놈 편집 데이터는 Aβ42/40 비의 돌연변이-관련 변화의 강한 일관성을 확인하는 한편, 또한 전기생리학에서의 PSEN2-돌연변이-관련 변경을 나타낸다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 BFCN을 생성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 PSC 콜로니를 제조하는 단계를 처음에 포함할 수 있다. PSC는 저밀도로 파종(플레이팅)되고, 약 1 내지 2일 동안 부착 배양물에서 성장된다. "저밀도"는 약 8,000 내지 약 11,000개의 세포/㎠를 의미한다. 세포는 바람직하게는 약 9,500 내지 약 10,500개의 세포/㎠, 더 바람직하게는 약 10,000개의 세포/㎠로 파종된다. 약 1 내지 2일(또는 그 이상, 즉, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 이상) 후에, PSC는 콜로니를 형성하는데, 이는 바람직하게는 직경이 약 75㎛ 내지 약 300㎛, 더 바람직하게는 직경이 약 100㎛ 내지 약 250㎛이다.
용어 "PSC"는 당업계에서 그의 보통의 의미(즉, 내배엽, 외배엽 및 중배엽 세포로 발생하는 능력을 갖는 자기-복제 세포)를 가진다. 바람직하게는, PSC는 hPSC이다. PSC는 ESC 및 iPSC, 바람직하게는 hESC 및 hiPSC를 포함한다. PSC는 기질, 예컨대, 겔 또는 기저막 기질을 포함하는 표면 상에 파종될 수 있다. 바람직한 기질은 매트리겔(MATRIGEL)(등록상표), 쿨트렉스(CULTREX)(등록상표) 및 겔트렉스(GELTREX)(등록상표)를 포함하는 상표명 하에 시판되는 엔젤브레스-홀-스웜(Engelbreth-Holm-Swarm)(EHS) 마우스 육종 세포에 의해 분비되는 단백질 혼합물이다. 다른 적합한 기질은 콜라겐, 피브로넥틴, 젤라틴, 라미닌, 폴리-라이신, 비트로넥틴 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포를 유지하는 데 사용하기에 적합한 배지가 사용된다. 실시형태에서, 이러한 배지는 스템 셀 테크놀로지즈(Stem Cell Technologies)로부터의 mTeSR1 배지이다. 그러나, 당업자는 만능 줄기 세포를 유지하는 데 사용하기 위한 그들의 적합성에 관해 mTeSR 배지와 동등한 몇몇 다른 유형의 배지가 있으며, 이중 어떤 것이 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 전형적으로, 이러한 배지는 다능성 상태에서 세포의 유지를 용이하게 하기 위한 하나 이상의 다능성 인자를 함유할 것이다. mTeSR1 배지의 조성물은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Ludwig et al., 2006 (Nat Methods. 2006 Aug;3(8):637-46; "Feeder-Independent Culture of Human Embryonic Stem Cells")]에 기재되어 있고, 이의 내용은 본 명세서에 참고로 편입된다.
본 발명의 방법에서 사용되는 만능 줄기 세포는 임의의 적합한 유형의 만능 줄기 세포일 수 있다. iPSC가 사용되는 경우에, 이러한 세포는 변형된 RNA-기반 방법, 센다이(Sendai) 바이러스 기반 방법 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 적합한 수단을 이용하여 비다능성 상태로부터 다능성 상태로 "재프로그래밍"될 수 있다. 더 나아가, 이러한 세포는 당업계에 공지된 재프로그래밍 인자의 임의의 적합한 칵테일을 이용하여 다능성 상태로 재프로그래밍될 수 있다.
일 실시형태에서, PSC가 제조되고, 예를 들어 mTeSR1 배지에서 컨플루언스(confluence)까지 성장한 후에, 상기 방법은 신경외배엽 분화를 유도하기 위해 형질전환 성장인자 베타(TGF-β) 신호전달의 저해제 및 음향고슴도치(Shh) 신호전달의 활성체를 포함하는 기저 배지에서 PSC를 배양시키는 단계를 포함한다. 이용되는 기저 배지는 변형된 mTeSR1 배지인데, 이는 염화리튬, GABA, 피페콜산, bFGF 또는 TGFβ1을 포함하지 않는 mTeSR1 배지(때때로 본 명세서에서 "mTeSR1 커스텀" 배지로서 지칭됨)의 변이체이다. TGFβ 신호전달의 저해제는, 예를 들어, SB431542, GW788388, LDN193189, LY2109761, LY2157299 및 LY364947 중 하나 이상을 포함한다. Shh 신호전달의 활성체는 평활화 작용제, 예컨대, 평활화 작용제(SAG; 3-클로로-N-[(1r,4r)-4-(메틸아미노)사이클로헥실]-N-[3-(피리딘-4-일)벤질]벤조[b]티오펜-2-카복사마이드) 및 퍼모프아민을 포함한다.
약 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12일(또는 초과, 즉, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30일 이상)의 배양 후에, CD271+ 세포가 선택되고, 뉴런 기저 배지, 예컨대, 브레인피스(상표명)에서 배양되어 뉴런 배상체(NEB)를 생성한다. 뉴런 기저 배지는 선택적으로 B27 보충물, 로-결합 단백질 키나제(ROCK)의 저해제, 신경성장인자(NGF) 및 뇌 유래 신경 성장인자(BDNF) 중 1종 이상으로 보충된다. ROCK의 저해제는, 예를 들어, GSK269962, GSK429286, H-1152, HA-1077, RKI-1447, 티아조비빈, Y-27632 또는 이들의 유도체를 포함한다.
CD271+ 세포를 선택하기 위해, 오버컨플루언스 세포는 배양물 표면으로부터 리프팅되고, FACS에 의해 정제되고 나서, 재플레이팅된다. 이 공정은 본 명세서에서 NEB로도 지칭되는 세포 응집물 또는 구체의 형성을 가능하게 한다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "NEB", "응집물" 및 "구체"는 상호 호환 가능하게 사용되고, 다세포 3차원 구조, 바람직하게는, 반드시는 아니지만, 적어도 약 100개의 세포를 지칭한다.
리프팅은 셀 스크래퍼(cell scraper)를 이용하여 기계적으로 또는 다른 적합한 실행으로 또는 화학적으로 수행될 수 있다. 화학적 리프팅은 단백질 분해 효소, 예를 들어, 콜라게나제, 트립신, 트립신-유사 프로테이나제, 재조합 효소, 예컨대, 상표명 트리플(TRYPLE)(상표명) 하에 시판되는 것, 천연 유래 효소, 예컨대, 상표명 아쿠타제(ACCUTASE)(상표명) 하에 시판되는 것, 및 이들의 조합물을 이용하여 달성될 수 있다. 화학적 리프팅은 또한 킬레이터, 예컨대, EDTA, 또는 화합물, 예컨대, 유레아를 이용하여 행해질 수 있다. 기계적 리프팅 또는 탈착은 최소 세포사의 이점을 제공하지만, 그러나, 이는 가변적 크기의 응집물을 생성하고, 따라서 적합한 구체는 수동 선별 공정을 통해 선택될 필요가 있다. 보다 진한 코어와 함께, 그리고 직경이 약 300㎛ 내지 약 800㎛인 둥근 형상, 금색/갈색을 갖는 구체를 양호한 구체로 정한다. 화학적 방법, 예컨대, 효소 분해를 이용하여 세포를 탈착시키는 것은 추가 배양에 적절한 구체를 우세하게 생산한다. 따라서 구체의 수동 선별은 필요하지 않으며, 탈착 단계는 자동화에 적합하며, 고속 대량 연구(high throughput study)에서 사용될 수 있다. 그러나, 효소 분해는 세포사를 증가시켜 더 적은 수의 고체를 초래한다.
선택된 CD271+ 세포의 약 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일(또는 초과, 즉, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30일 이상)의 배양 후에, 형성된 NEB는 채취되고, 해리되고 나서, 단일층 배양물로서 플레이팅되고, 추가로, 선택적으로 B27 보충물, NGF 및 BDNF로 보충된 뉴런 기저 배지, 예컨대, 브레인피스(상표명)에서 추가로 배양된다. 세포가 플레이팅되고 배양된 표면은 세포외 기질 단백질(예를 들어, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌) 및/또는 양으로 하전된 폴리-아미노산(예를 들어, 폴리-알기닌, 폴리-라이신, 폴리-오르니틴)을 포함할 수 있다. 바람직하게는 표면은 라미닌 및/또는 폴리-오르니틴을 포함한다.
BFCN으로의 분화를 보장하기 위해, 배양된 세포는 Tuj1, MAP2, BF1, Nkx2.1 및 p75의 양성 발현에 대해 분석된다.
본 발명의 다수의 실시형태는 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 사용될(또는 이로부터 제외될) 소정의 인자, 예를 들어, 배지 보충물을 수반한다. 이들은 bFGF, GABA, 피페콜산, 염화리튬, TGF-β, NGF 및 BDNF를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이들 인자 각각은 두문자어 또는 다른 약어가 사용되는 경우에 이들 인자 각각의 전체 명칭을 포함하여, 당업계에 잘 공지되어 있다. 더 나아가, 이들 인자 모두는 상업적 공급원을 비롯한, 다중 공급원으로부터 공중에 대해 이용 가능하다. 본 발명의 방법 및 조성물에서 이들 인자 각각의 사용을 위한 예시적인 양/농도는 본 개시내용의 실시예 부문에 제공된다. 구체화된 양이 언급된 모든 실시형태에 대해, "약" 구체화된 양의 양이 또한 의도된다. 더 나아가, 당업자는 일부 상황에서 구체화된 양으로부터의 추가 편차가 사용될 수 있고, 사용되는 양이 언급된 효과, 예를 들어, 언급된 부화 효과를 여전히 달성한다면, 예를 들어, 구체화된 양을 감소시키거나 또는 증가시키기 위해 일상적인 검사, 최적화, 용량-반응 연구 등을 수행함으로써 얼마나 많은 각각의 인자를 사용할 지를 결정할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 구체화된 제제의 구체화된 양은 언급된 양의 10%, 또는 20%, 또는 30%, 또는 40%, 또는 50%, 또는 60%, 또는 70%, 또는 80%, 또는 90%로 감소될 수 있다. 유사하게, 일부 실시형태에서 구체화된 제제의 구체화된 양은 언급된 양의 10% 만큼, 20% 만큼, 30% 만큼, 40% 만큼, 50% 만큼, 60% 만큼, 70% 만큼, 80% 만큼, 90% 만큼, 100% 만큼, 150% 만큼, 200% 만큼, 300% 만큼, 400% 만큼, 또는 500% 만큼 증가될 수 있다. 유사하게, 구체화된 인자가 언급되는 경우에, 당업자는 유사체, 변이체 또는 유도체가 구체화된 인자와 동일한 일반적 기능/활성을 가진다면, 이러한 인자의 유사체, 변이체 또는 유도체가 또한 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본 명세서에서 논의하는 바와 같이, 본 발명자들은 PSEN2의 돌연변이가 BFCN의 손상된 뉴런 흥분성을 초래한다는 것을 발견하였다. 본 명세서의 실시예에 논의하는 바와 같이, 본 발명자들은 뉴런 흥분성을 회복한 PSEN2 N141I 돌연변이 수선을 통해 BFCN의 흥분성의 상당한 돌연변이-관련, 편집-가변적 차이를 관찰하였다. 따라서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 돌연변이, 예컨대, 프레세닐린 1(PSEN1) 또는 프레세닐린 2(PSEN2)의 돌연변이를 수선하기 위해 유전자 편집 시스템으로 처리될 수 있는 iPSC를 이용할 수 있다. 일 실시형태에서, 돌연변이는 PSEN2 N141I 이며, 이의 수선은 BFCN의 뉴런 흥분성을 회복시킨다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자 편집" 또는 "게놈 편집"은 하나 이상의 뉴클레아제 및/또는 틈내기효소를 이용하여 DNA가 삽입되거나, 대체되거나 또는 표적 DNA, 예를 들어, 세포 게놈으로부터 제거된 유전자 조작 유형을 지칭한다. 뉴클레아제는 게놈 내 목적하는 위치에서 특정 이중-가닥 파손(DSB)을 생성하고, 상동 직접 수선(homology-directed repair: HDR)(예를 들어, 상동 재조합)에 의해 또는 비상동성 말단 결합(nonhomologous end joining: NHEJ)에 의해 유도된 파손을 수선하기 위한 세포의 내인성 메커니즘을 이용한다. 틈내기효소는 게놈 내 목적하는 위치에서 특정 단일-가닥 파손을 생성한다. 하나의 비제한적 예에서, 두 틈내기효소를 사용하여 표적 DNA의 마주보는 가닥 상에 2개의 단일-가닥 파손을 생성함으로써, 평활 말단 또는 점착성 말단을 생성할 수 있다. 임의의 적합한 뉴클레아제는 CRISPR-결합 단백질(CRISPR-associated protein: Cas) 뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease: ZFN), 전사 활성체-유사 효과기 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease: TALEN), 메가뉴클레아제, 다른 엔도- 또는 엑소-뉴클레아제, 이들의 변이체, 이들의 단편, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 표적 DNA 서열의 게놈 편집을 유도하기 위해 세포에 도입될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상동 직접 수선(HDR)(예를 들어, 상동 재조합)에 의한 표적 DNA 서열(예를 들어, 안전한 보유 유전자)의 뉴클레아제-매개 게놈 편집은 본 명세서에 기재된 방법에 따라 유전자 변형된 인간 신경 줄기 세포를 생성하는 데 사용된다.
용어 "DNA 뉴클레아제"는 DNA의 뉴클레오타이드 소단위 사이의 포스포다이에스터 결합을 절단할 수 있는 효소를 지칭하며, 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제일 수 있다. 본 발명에 따르면, DNA 뉴클레아제는 표적 DNA 서열, 예컨대, 안전한 보유 유전자의 게놈 편집을 유도하기 위해 사용될 수 있는 조작된(예를 들어, 프로그램 가능한 또는 표적화 가능한) DNA 뉴클레아제일 수 있다. CRISPR-결합 단백질(Cas) 뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성체-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 메가뉴클레아제, 다른 엔도- 또는 엑소-뉴클레아제, 이들의 변이체, 이들의 단편 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 적합한 DNA 뉴클레아제가 사용될 수 있다.
본 발명의 다양한 실시형태에서, 유전자 편집 시스템은 유전자를 편집하고 돌연변이를 수선하기 위해 DNA 뉴클레아제를 이용한다. 구체적 실시형태에서, 돌연변이는 다음의 유전자 편집 시스템 중 하나 이상을 이용하여 수선된다: CRISPR/Cas 시스템, Cre/Lox 시스템, TALEN 시스템 및 상동 재조합.
본 발명의 분화 프로토콜은 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위해 이용될 수 있다. 상기 방법은 대상체에게 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 생성된 BFCN을 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 질환 또는 장애는 아밀로이드 형성 질환, 예컨대, 전신 아밀로이드증, 알츠하이머병, 성숙기 개시 당뇨병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 전측두엽 치매 및 프리온-관련 전염성 해면상뇌증이다. 실시형태에서, 뉴런 흥분성을 손상시키는 돌연변이, 예컨대, PSEN2 N141I 을 갖는 BFCN은 대상체로부터 얻을 수 있고, iPSC를 생성하는 데 사용될 수 있는데, 이는 결국 돌연변이를 수선하기 위해 유전자 편집 시스템으로 처리될 수 있다. 이어서, 유전자 편집된 iPSC는 질환 또는 장애를 치료하기 위해 대상체에게 투여되는 회복된 뉴런 흥분성을 갖는 BFCN을 생성하기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같이 배양된다.
관련된 방식에서, 대상체에서의 BFCN의 뉴런 흥분성이 회복될 수 있다. 이 방법은 a) 상기 대상체로부터 BFCN을 단리시키는 단계로서, 상기 BFCN은 상기 BFCN의 손상된 뉴런 흥분성을 초래하는 유전자 돌연변이를 갖는, 상기 단리시키는 단계; b) (a)의 상기 BFCN을 이용하여 iPSC를 생성하는 단계; c) 상기 iPSC에서 상기 돌연변이를 수선하는 단계; d) 본 명세서에 기재된 분화 프로토콜을 이용하여 (c)의 상기 iPSC를 배양시켜 상기 수선된 돌연변이를 갖는 BFCN을 생성하는 단계; 및 e) 상기 대상체에게 (d)의 상기 iPSC를 투여하여 상기 대상체에서의 BFCN의 뉴런 흥분성을 회복시키는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 돌연변이는 PSEN1 또는 PSEN2, 예컨대, PSEN2 N141I 를 가진다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 분화 프로토콜을 이용하여 생성된 BFCN을 포함한다. BFCN은 PSEN2의 유전자 편집된 수선뿐만 아니라 BFCN 게놈에 재조합적으로 도입된 검출 가능한 마커를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, BFCN은 PSC로부터 분화되고, 이러한 실시형태에서, PSC는 iPSC일 수 있다. iPSC는 대상체의 체세포로부터 유래될 수 있다. 일 양상에서, 대상체는 아밀로이드 형성 질환 또는 장애를 가진다.
자가 세포 이식을 위한 그의 가능성과 함께, iPSC 기술은 신약 개발 및 질환 발병에 대한 통찰 획득을 위한 도구로서 나타난다. 문헌[Han, S.S.W. et al., Neuron. 70:626-644 (2011)]. 본 발명의 방법 및 세포는 뉴런 흥분성의 회복을 촉진시키는 화합물에 대한 시험관내 선별의 고속대량(high-throughput) 개발에 도움을 줄 수 있다. 이를 위하여, 본 개시내용은 BFCN의 감소된 뉴런 흥분성과 관련된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 a) 본 명세서에 기재된 분화 프로토콜을 이용하여 생성된 BFCN 또는 뉴런 배상체(NEB)를 후보 화합물과 접촉시키는 단계로서, 상기 BFCN은 상기 BFCN의 손상된 뉴런 흥분성을 초래하는 PSEN2에서의 돌연변이를 포함하는, 상기 접촉시키는 단계; 및 b) 상기 후보 화합물과의 접촉 후에 상기 BFCN의 뉴런 흥분성을 검출하는 단계를 포함한다. 뉴런 흥분성에 대한 유리한 효과는 뉴런 흥분성의 부분적 또는 완전한 회복에서 분명하며, 이에 의해 BFCN의 감소된 뉴런 흥분성과 관련된 질환 또는 장애, 예컨대, 아밀로이드 형성 질환 또는 장애를 치료하기 위한 후보 치료제를 나타낸다. 바람직하게는, 상기 방법은 고속대량 형식으로 수행된다.
본 발명은 또한 신경학적 질환, 바람직하게는 BFCN의 감소된 뉴런 흥분성과 관련된 질환 또는 장애, 예컨대, 아밀로이드 형성 질환 또는 장애에 대한 모델 시스템을 제공한다. 일 양상에서, 모델 시스템은 BFCN의 감소된 뉴런 흥분성과 관련된 질환 또는 장애, 예컨대, 아밀로이드 형성 질환 또는 장애를 갖는 대상체로부터 유래된 iPSC로부터 분화된 BFCN을 포함한다. 모델 시스템은 미엘린-생성 세포가 이식된 비인간 포유류를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 비인간 포유류는 마우스 또는 래트이다. 본 발명에 의해 제공되는 모델 시스템은 근본 메커니즘을 이해하고, 치료적 표적을 정하는 것을 비롯한, 질환 또는 장애의 연구를 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 다양한 방법을 수행하는 데 유용한 조직 배양 배지, 조직 배양 배지 보충물 및 다양한 키트를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 분화 프로토콜을 통해 BFCN을 생성하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 TGF-β 신호전달의 저해제 및 Shh 신호전달의 활성체를 갖는 배양 배지를 포함한다. 실시형태에서, 배양 배지는 bFGF, TGF-β, 염화리튬(Li-Cl), GABA 및 피페콜산을 포함하는 다능성을 지지하는 인자를 결여하는 변형된 mTeSR1 제형이다. 실시형태에서, 배양 배지는 평활화 단백질, 예컨대, 평활화 작용제(SAG) 및 퍼모프아민 중 하나 이상의 작용제와 함께 이중 SMAD 저해제, 예컨대, SB431542 및 LDN193189를 포함한다.
키트는 또한 B27 보충물, ROCK의 저해제, NGF 및 BDNF 중 하나 이상으로 선택적으로 보충된 추가적인 뉴런 기저 배지, 예컨대, 브레인피스(상표명)를 포함한다.
키트는 또한 FACS를 통한 CD271+ 세포의 검출 및 단리뿐만 아니라 Tuj1, MAP2, BF1, Nkx2.1 및 p75의 발현 검출을 위한 시약을 포함할 수 있다.
키트는 선택적으로 사용을 위한 설명서, 하나 이상의 용기, 하나 이상의 항체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 표지는 전형적으로 키트를 수반하며, 임의의 기재 또는 기록 매체를 포함하는데, 이는 키트 내용물의 사용을 위한 설명서 또는 다른 정보를 제공하는 전자적 또는 컴퓨터 판독 가능한 형태(예를 들어, 디스크, 광학 디스크, 메모리 칩 또는 테이프)일 수 있다.
다음의 실시예는 본 발명의 이점 및 특징을 추가로 예시하기 위해 제공되지만, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 실시예는 사용될 수 있는 것을 대표하지만, 당업자에게 공지된 다른 절차, 방법 또는 기술이 대안적으로 사용될 수 있다.
실시예 I
iPSC-유래 알츠하이머의 PSEN2 N141I 돌연변이에서 CRISPR / Cas9 -보정 가능한 돌연변이-관련 분자 및 생리학적 표현형
기저 전뇌 콜린성 뉴런(BFCN)은 모든 형태의 AD에 영향 받을 수 있는 첫 번째 세포 유형 중 하나인 것으로 여겨지며, 그들의 기능장애는 손상된 단기 기억 형성 및 회수와 임상적으로 상관관계가 있다. 본 발명자들은 프레세닐린 2(PSEN2) 돌연변이 운반체 및 대조군으로부터의 세포주를 이용하여 iPSC로부터 인간 BFCN을 생성하기 위한 최적화된 시험관내 프로토콜을 제공한다. 예상한 바와 같이, PSEN2 N141I 돌연변이를 보유하는 세포주는 iPSC-유래 BFCN에서 Aβ42/40의 증가를 나타내었다. PSEN2 N141I 계통으로부터 유래된 뉴런은 정격 탈분극 전류 주입에 반응하여 더 소수의 스파이크의 최대값 수를 생성하였다. 기전류 주입 시 제1 활동전위의 높이는 또한 PSEN2 N141I BFCN에서 유의하게 감소되었다. PSEN2 점 돌연변이의 CRISPR/Cas9 보정은 전기생리학적 결손을 없애서, 스파이크의 최대값 수와 스파이크 높이를 둘 다 대조군에 기록된 수준까지 회복시킨다. 증가된 Aβ42/40은 또한 PSEN2 N141I 돌연변이의 CRISPR/Cas-매개 보정 후에 정규화되었다. 게놈 편집 데이터는 Aβ42/40 비의 돌연변이-관련 변화의 강한 일관성을 확인하는 한편, 또한 전기생리학에서의 PSEN2-돌연변이-관련 변경을 나타낸다.
"아밀로이드 가설"은 알츠하이머병(AD)의 발병에 대한 가장 대중적인 공식 중 하나이다. 임상병리학적 그리고/또는 임상방사선학적 분리의 최근 연구는 신경병리학적 AD가 치매와 항상 연관되지 않는 이유[24], 및 임상 AD를 갖는 환자의 약 1/3이 음성 아밀로이드 뇌 스캔을 갖는 이유[40]를 각각 설명하기 위해 대안의 모델의 고려사항을 유도하였다. 임상적 AD가 아밀로이드증, 타우병증, 신경염증 및 신경퇴행을 연결하는 몇몇 "피드-포워드(feed-forward)" 시나리오 중 하나에 의해 야기될 수 있다는 것을 제안하였다[22]. 프레세닐린 2(PSEN2)를 암호화하는 유전자 내 돌연변이는 상염색체 우성 조기 개시 가족성 알츠하이머병(EOFAD)과 연관된다. EOFAD에 연결된 인간 염색체 1q31-42 상의 좌위 연결은 문헌[Volga German kindreds in 1995]에서 PSEN2 N141I 점 돌연변이의 동정으로 이어졌다[43]. 이 돌연변이는 Aβ42-43/40 비의 상승을 야기하여, Aβ 올리고머와 피브릴의 조립을 촉진시킨다[83].
AD의 진행을 고려함에 있어서, 인간 기저 전뇌 콜린성 뉴런(BFCN)은, 기능장애가 모든 형태의 AD에서의 단기 기억 회상 조기 상실의 기저를 이루는 제1 세포 유형 중 하나이다. "AD의 콜린성 가설"은 1970년대 중반에 제형화되고[6, 20, 61], 마이네르트(Meynert)의 기저핵의 뉴런으로부터의 감소된 아세틸콜린 방출의 발견은 AD 환자의 기저 전뇌에서 시냅스전 콜린성 결손 존재를 확인하였다[1, 71]. 상기 관찰에 기반하여, 아세틸콜린에스터라제 저해제를 개발하였고, AD에 대해 가장 널리 사용되는 증상관련 치료로서 계속하였다[21, 28, 33, 82]. 종국적으로, 질환의 상이한 병기에 사후 검토 뇌 생화학적 그리고 용적 측정 연구는 또한 AD 과정에서 조기에 영향받은 뇌의 몇몇 다른 영역을 확인하였다[63]. 이들 연구는 전통적으로 해마 및 피질에 중점을 두었지만, 더 최근에, 관심이 다시 기저 전뇌로 이동하고 선조체와 같은 다른 영역을 추가로 주목하기 시작하였다[27, 62]. 마지막 분석은 콜린성 기저 전뇌 용적 측정이 이전의 표준, 해마 용적보다 MCI로부터 AD까지의 이행의 더 양호한 예측자일 수 있다는 것을 시사한다[10].
본 발명자들은 PSEN1 A246E 및 PSEN1 M146L 돌연변이를 보유하는 대상체로부터 저장된 섬유아세포로부터의 iPSC-유도된 뉴런의 생성을 이전에 보고하였다[77]. iPSC-유래 뉴런으로부터의 유전자 발현 프로파일을 특성규명함에 있어서, 본 발명자들은 비분화 PSEN1 돌연변이체 iPSC 및 그들의 그리고 뉴런으로 분화된 자손에서 인플라마솜 유전자 NLRP2의 상승된 발현의 예상치 못한 연관을 관찰하였다[77]. 이는 본 발명자들이 본 발명자들의 PSEN2 돌연변이체 계통에서 NLRP2 발현을 시험하도록 유도하였고, 인플라마솜의 활성화가 PSEN2에서의 병원성 돌연변이와 밀접하게 연결되었는지의 여부를 연구하기 위해 CRISPR/Cas9[15]를 사용한다. 본 발명자들은 유전자-보정 PSEN2 계통에서 NLRP2의 변경된 발현을 발견하지 못 하였지만, 본 발명자들은 BFCN의 흥분성에서 상당한 돌연변이-관련, 편집-가역적 차이를 관찰하였다.
물질 및 방법
iPSC 계통의 생성 및 유지
[60]으로부터의 가이드라인에 따른 NYSCF 보고를 통해 7889(s)B, 050643(대조군), 948(AD1), 949(f대조군) 및 950(AD2) iPSC 계통을 얻었다. Nkx2.1-GFP ESC 계통의 유래 및 특성규명은 앞서 공개되었다[30]. ES 및 iPS 세포주를 확장시키고, 무 혈청 mTeSR1(상표명) 배지(줄기 세포 테크놀로지즈(Stem Cell Technologies))에서 유지하였다. 세포를 스트렘프로(StremPro)(상표명) 어쿠타제(써모피셔)를 이용하여 리프팅시켰고, 배지를 세포 계대 동안 10μM ROCK 저해제(Y27632, 스템젠트(Stemgent))로 보충하였다.
본 논문에서의 모든 연구를 위해, 세포주는 iPSC 단계로부터 성숙 뉴런 단계까지 적어도 3회의 독립적 분화를 겪엇다. 데이터를 이들 독립적으로 유래된 유전자형-동일 뉴런(또는 일부 경우에 뉴런 전구체)에 걸쳐 일상적으로 비교하였고, 독립적으로 동일 유전자형 유래 세포에 대해 비슷한 결과를 얻었다면, 그들은 그들의 유전자형의 자격있는 대표인 것으로 고려하고, 따라서 유전자형-특이적 실험으로 진행시켰다.
Aβ42 올리고머 제제
Aβ42 올리고머는 이전에 보고되었다[23, 78]. 간략하게, 본 발명자들은 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올(HFIP)(시그마(Sigma)에 1㎎의 Aβ42(어메리칸 펩타이드 컴퍼니(American Peptide Company))를 용해시켰다. 이 제제를 분취시키고 나서, 스피드백(SpeedVac)(상표명) 원심분리기를 이용하여 건조시켰다. 이어서, 펠릿을 DMSO에서 재현탁시켜 5mM 용액을 얻었고, 이를 10분 동안 수욕에서 초음파 처리하였다. 이로부터의 분취액을 -20℃에서 저장하고 나서, 올리고머화를 진행시키기 위해 100㎕의 PBS로 희석시킴으로써 그리고 12시간 동안 4℃에서 방치하여 2주 내에 사용하였다. 연구를 위해 최종 용액을 세포 배지에서 1:16으로 희석시키고, 세포가 5μM Aβ42 올리고머에 노출되도록 허용하였다. 대조군 웰을 1:16 PBS로 희석시켰다. 세포를 3일의 기간 동안 배지 변화 없이 올리고머 또는 PBS에 노출시켰다.
세포사 분석
세포를 96웰 플레이트 형식으로 분석하였다. 올리고머 또는 비히클 용액을 배지에 첨가하고 나서, 3일의 기간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 젖산 탈수소효소 독성 분석(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))을 이용하여 수집하고 분석하였다. 50㎕의 배지 및 동일한 양의 반응 혼합물 완충제를 30분의 기간 동안 인큐베이션시켰다. 모든 세포를 용해시키기 위해 실험마다 웰의 추가적인 세트를 5분 동안 2% 트리톤(Triton)(상표명) X-100으로 처리하고 나서, 이들 웰로부터의 배지를 또한 수집하고, 기재한 바와 같이 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 흡광도를 490㎚ 및 680㎚, 신호 및 배경 흡광도 각각에서 기록하였다. 신호값을 배경으로부터 차감하고 나서, 값을 트리톤 X-100 처리 웰에 의해 결정하여 총 LDH 함량에 적합화시켰다. 프로피듐 아이오딘화물(써모 피셔 사이언티픽)을 1μM 최종 농도를 위해 세포 배지에 첨가하고 나서, 5분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 배지로 2회 세척하고 나서, 영상화하였다. 셀리고(CELIGO)(상표명) 영상 세포계산기 및 수반하는 소프트웨어(넥셀롬 바이오사이언스(Nexcelom Bioscience))를 이용하여 영상을 캡처하였다. 각각의 생물학적 변수를 각각 표기된 "실험" 내에서 기술적 3회 중복으로 평가하였고, 각각의 표기된 "실험"을 적어도 3회의 완전한 "시작부터 종료까지"의 반복으로 수행하였다.
iPS 및 ES 세포로부터의 기저 전뇌 콜린성 뉴런의 분화
6-웰 플레이트 또는 페트리 접시에서 웰 당 4 내지 8×105개의 세포의 밀도로 쿨-트렉스(Cul-trex)(상표명)(트레비젠(Trevigen)) 코팅 플레이트에 아쿠타제(Accutase)(상표명)(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))를 이용하는 화학적 해리 후에 인간 ES 또는 iPSC를 단일 세포로서 플레이팅시키고, 세포 수를 적합화시켰다. 완전한 컨플루언시에 도달할 때까지 세포를 초기에 mTeSR1(상표명) 배지(줄기 세포 테크놀로지즈(Stem Cell Technologies))에서 유지시켰다. "제0일"의 분화 시, 배지를, 다능성을 촉진시키는 인자, 즉, bFGF, TGF-β, Li-Cl, GABA 및 피페콜산을 결여하는 커스텀 mTeSR1(Custom mTeSR1)(상표명) 배지(스템 셀 테크놀로지즈(Stem Cell Technologies))로 대체하였다. 제0일에 이중 SMAD 저해제(SB431542 10μM + LDN193189 250nM, 셀렉켐(Selleckchem))의 첨가는 세포를 신경외배엽 선별화로 유도한다. 분화 제2일에, 배지를 이중 SMAD 저해제 + 2종의 배측화제(500nM로 SGA(알앤디) 및 2μM(스템젠트(Stemgent))(상표명)로 퍼모프아민)을 함유하는 커스텀 mTeSR1로 대체하였다. 배지를 B27(라이프 테크놀로지즈)로 보충한 브레인피스(상표명)(스템셀 테크놀로지즈)로 점진적으로 전환시켰을 때, 세포를 제9일까지 2일마다 이 배지에 공급하였다[3]. 신경 전구체를 아쿠타제를 이용하여 제11일에 채취하였고, p75+(CD271) NPC를 FACS에 의해 정제하고 나서, 10μM ROCK 저해제(Y27632, 스템젠트), 신경성장인자, NGF(알라몬 랩스(Alamone labs), 50ng/㎖) 및 뇌 유래 신경 성장인자, BDNF(알앤디, 50ng/㎖)로 보충한 브레인피스(상표명) + B27에서 비접착 96웰 V자 바닥 플레이트에 웰 당 80,000개의 세포 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 응집시키고 나서, 뉴런 배상체(NEB)를 형성하고, 제19일까지 격일로 공급하였다. 제19일에 어쿠타제(시그마-알드리치)를 이용하여 NEB를 해리시키고 나서, BDNF 및 NGF가 있는 브레인피스(상표명) 배지 + B27 보충물에서 분지된 폴리에틴일이민(0.1%, 시그마-알드리치) 및 라미닌(10㎎/㎖, 라이프 테크놀로지)으로 코팅한 플레이트 상에서 단일층 배양물로서 플레이팅하였다. 분석까지 2일마다 배지를 바꾸었다. 대안으로서, 3D NEB를 확장을 위해 3 내지 4조각으로 손으로 나누고 나서, 추가로 성장시키거나 또는 동결보존시켰다. 프로토콜의 초기 형태는 브레인피스(상표명) 대신 기저 배지로서 뉴로베이셜(Neurobasal)(상표명)을 사용하였다.
게놈 DNA 단리 및 서열분석
제조업자의 설명서에 따라 하이 퓨어(High Pure)(상표명) PCR 주형 제조 키트(로슈)를 이용하여 PSEN2 돌연변이체 또는 대조군 iPSC 계통으로부터 게놈 DNA를 단리시켰다. 증폭 전에 RNAse(퀴아젠(QIAGEN))으로 게놈 샘플을 처리하였다. 유전자형과 상관없이, 173bp 단편을 생성하는, 다음의 프라이머를 이용하여 PSEN2N141I 돌연변이를 함유하는 PSEN2의 엑손 5로부터의 단편을 증폭시켰다: 정방향 5'-CATCAGCCCTTTGCCTTCT-3'(서열번호 3), 역방향: 5'-CTCACCTTGTAGCAGCGGTA-3'(서열번호 4). ApoE 대립유전자 변이체의 검출을 위해, 프라이머(정방향: 5' ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3'(서열번호 5), 역방향: 5'-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3' (서열번호 6))를 이용하는 서열분석 전에 244bp의 단편을 증폭시켰다. PCR을 둘 다 다음의 설정으로 수행하였다: 10분 94℃, 40 주기(30초 94℃, 20초 62℃, 10초 72℃) 7분 72℃. 증폭된 단편의 크기를 확인하기 위해 2% 아기로스겔에서 PCR 산물을 실행하였다. 증폭 후에, 엑소삽-잇(EXOSAP-it)(상표명)(써모 피셔 사이언티픽)을 이용하여 샘플을 세정하고, 이어서, 다음의 프라이머를 이용하여 서열분석하였다: [53]으로부터의 PSEN2(정방향: 5'-TCAGCATCTACACGCCATTC-3'(서열번호 7), 역방향: 5'-AGCACCACCAAGAAGATGGT-3')(서열번호 8); [36]으로부터의 ApoE(정방향: 5'- TTCGCCCCGGCCTGGTACAC GCCA-3'(서열번호 9), 역방향: 5'-TGTCCAAGGAGCTGC GGCGGCGCAG-3'(서열번호 10)).
CRISPR/Cas9 유전자 보정
iAD1 대조군 및 iAD2 대조군 계통은 PSEN2 WT/WT 에 대한 PSEN2 N141I/WT 이형접합 점 돌연변이의 CRISPR/Cas9-매개 보정에 의해 948(AD1) 및 950(AD2) iPSC 계통으로부터 유래되었다. g1N141I 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458) 벡터로 클로닝시켜, pSpCas9-g1N141I-GFP 벡터를 생성하고 Volga 돌연변이가 위치된 PSEN2의 엑손 5 내 서열에 대한 유전자 편집을 지시한다. 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드(ssODN)는 CRISPR/Cas9 보정을 위한 효율적인 주형이다[13, 66]. ssODN#A-N141I(이하에 상술하는 서열)를 유전자 보정을 위한 공여자 서열로서 사용하였다. 본 발명자들은 91bp의 긴 상동성 아암, 및 36bp의 짧은 상동성 아암을 갖는 비대칭 ssODN 서열을 설계하였는데, 비대칭적 ssODN은 CRISPR/Cas9를 이용하여 상동 직접 수선의 더 높은 효율을 나타내었다[68].
서열 명칭 염기 서열 서열번호
g1N141I 가이드 RNA F 25 /5Phos/CACCGCATCATGATCAGCGTCATCG 11
g1N141I 가이드 RNA R 25 /5Phos/AAACCGATGACGCTGATCATGATGC 12
공여자 ssODN#A N141I 127 GAGAGAAGCGTGGCTGGAGGGCAGGGC
CAGGGCCTCACCTTGTAGCAGCGGTACT
TGTAGAGCACCACCAAGAAGATGGTCA
TAACCACGATGACGCTGATCATGATGA
GGGTG T TCAGCACGGAGT		 13
밑줄 = 점 돌연변이를 보정하는 ssODN의 염기.
공여자 서열 및 pSpCas9-g1N141I-GFP 벡터를 AD1 및 AD2 iPSC 계통에 도입하고 나서, 아막사 휴먼 스템 셀 뉴클레오펙터(Amaxa Human Stem Cell Nucleofector)(상표명) 키트(론자 VPH-5002)를 이용하여 50 내지 70% 컨플루언시에서 플레이팅하고 회수를 위해 재플레이팅하였다. BD FACSAria IIu 세포 분류기(BD FACSAria IIu Cell Sorter)(상표명)에서 GFP+ 세포를 분류하고, 단일 클론을 검출하고 선별하기 위한 96-웰 형식에서 웰마다 30 내지 50개의 세포로 파종하였다. 양성 클론을 확장시키고 나서, qDNA를 추출하고, 성공적인 HDR에 대해 분석하고 나서, Chr1:227,073,304 A > T에 위치된 SNP(dbSNP ID: rs63750215)에 특이적인 프로브를 이용하는 맞춤 설계된 택맨(TaqMan)(상표명) 유전자형 분석을 이용하여 결정하였다. 생어 서열분석에 의해 선택된 클론을 분석하여 Chr1:227,073,304 위치의 보정을 확인하고, 주변 영역에서 가능한 삽입 또는 결실을 버렸다.
형광-활성화 세포 분류(FACS)
분화의 제12일에 신경 전구체를 37℃에서 5분 동안 아쿠타제(시그마-알드리치)로 해리시키고, 신경기저 배지에서 비활성화시켰다. 세포를 1000rpm에서 4분 동안 교반시키고 나서, 펠릿을 FACS 완충제(DPBS, 0.5% BSA Fraction V-Solution, 100U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신, 0.5%. EDTA 및 20mM 글루코스)에서 1:100으로 p75 또는 NGFR로서 알려진 PE 마우스 항-인간 CD271 항체(클론 C40-1457, BD)로 재현탁시키고 나서, 암실에서 실온으로 20분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 시간 후에, 세포를 FACS 완충제로 세척하고 나서, 펠릿을 10μM ROCK 저해제(Y27632, 스템젠트)와 함께 2㎖의 FACS 완충제에서 재현탁시켰다. p75 양성 세포를 FACSAria IIu 셀 분류기(상표명), 데이터를 플로우조(FlowJo)(상표명) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
실시간 정량적 중합효소 연쇄반응(RT- qPCR)
PSEN2 돌연변이체 또는 대조군 환자로부터의 인간 iPSC를 단일층에서 성장시키고, RLT 완충제로 세포 배양물 웰에서 직접 용해시켰다. 총 RNA 정제를 RNeasy(상표명) 마이크로 키트(퀴아젠)로 수행하고 나서, 제조업자의 설명서에 따라 수행하였다. 슈퍼스크립트(SuperScript)(상표명) III 역전사효소(RT)(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen))를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이하의 표 2에 열거된 프라이머를 이용하여 스텝원플러스(StepOnePlus)(상표명) 실시간 PCR 시스템(캘리포니아주 포스터 시티에 소재한 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)) 상에서 반정량적 실시간 PCR을 수행하였다. 본 발명자들은 발현 수준을 GAPDH에 대해 정규화시켰다. PCR 순환 매개변수는: 50℃ 2분 동안, 95℃ 10분 동안 다음에, 95℃ 15초 및 60℃ 1분의 40주기였다. 각각의 생물학적 변수를 각각 표기된 "실험" 내에서 기술적 3회 중복으로 평가하였고, 각각의 표기된 "실험"을 적어도 3회의 완전한 "시작부터 종료까지"의 반복으로 수행하였다. 발현 수준을 대조군 계통에 대해 정규화시키고 나서, 결과를 AVG ±SEM으로서 표현하였다.
유전자 정방향 프라이머 5' - 3' 서열번호 역방향 프라이머 5' - 3' 서열번호
BDNF TAACGGCGGCAGACAAAAAGA 14 GAAGTATTGCTTCAGTTGGCCT 15
BF1 AGAAGAACGGCAAGTACGAGA 16 TGTTGAGGGACAGATTGTGGC 17
Nkx2.1 TAACGGCGGCAGACAAAAAGA 18 GAAGTATTGCTTCAGTTGGCCT 19
NLRP2, ASB9 [77]로부터 20 [77]로부터 21
NLRP3 ACGAATCTCCGACCACCACT 22 CCATGGCCACAACAACTGAC 23
Tuj1 GAAGTGTCCCAGGACATGATAA 24 CTCTTGAGTAGCTGGGATTGAG 25
Aβ 분석
이중 SMAD 저해의 8일 후에 세포를 3일 동안 조건화시켜, 시험관내 신경 전구체에 의한 A3의 분비를 측정하였다. 인간/래트 3 아밀로이드 40 ELISA 키트 및 3 아밀로이드 42 ELISA 키트 고 민감(와코(Wako))을 이용하여 A3 수준을 정량화하였다. 각각의 생물학적 변수를 각각 표기된 "실험" 내에서 기술적 3회 중복을 이용하여 평가하고, 각각의 표기된 "실험"을 적어도 3회의 완전한 "시작부터 종료까지"의 반복으로 수행하였다.
면역염색/ICC
세포를 20분 동안 12, 48 또는 96 웰 플레이트의 웰 상에서 직접적으로 PFA 4%로 고정시키고 나서, DPBS 1×(써모피셔)로 3회 세척하였다. 염색을 위해, 세포를 실온에서 2시간 동안 차단 용액(0.1% 트리톤(상표명) X-100 + 5% 당나귀 혈청으로 DPBS 1×)에서 인큐베이션시켰다. 대응하는 1차 항체를 차단 용액 중에서 적합한 농도로 희석시키고 나서, 밤새 4℃에서 인큐베이션시켰다. 사용한 1차 항체를 이하의 표에 나타낸다. 세포를 DPBST(DPBS 1× + 0.1% 트리톤(상표명) X-100)로 3회 세척하고 나서, 적합한 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 차단 용액에 첨가하였다. 이어서, 세포를 DPBST로 3회 세척하고 나서, 핵 대비염색을 위해 DRAQ5 또는 훽스트 33,342(1㎍/㎖, DPBS 1× 중에서 희석)와 함께 10분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 도립 형광 현미경(올림푸스(Olympus)(상표명) IX71 현미경) 또는 공초점 현미경(제이스(Zeiss)(상표명) LSM5 파스칼(Pascal) 현미경)을 이용하여 10×, 20× 또는 63× 배율 하에 세포를 시각화시켰다.
웨스턴 블롯
PSEN2 돌연변이체 또는 대조군 환자로부터의 인간 iPSC를 단일층에서 성장시켰고, 프로테아제 및 포스파타제 저해제가 있는 RIPA 완충제(써모 사이언티픽)로 세포 배양물에서 직접 용해시킨다. BCA 단백질 분석 키트(써모 사이언티픽)를 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 추정 후에, 20㎍의 세포 용해물을 4 내지 12% 비스-트리스(Bis-Tris) 겔(볼트(Bolt)(상표명) 단백질 겔) 상에서 SDS-PAGE 전기영동법에 의해 분리시켰고, 전기영동법 블롯팅에 의해 나이트로셀룰로스 막에 옮겼다. 막을 실온에서 1시간 동안 교반시키면서 차단 완충제 1X TBST(트리스-완충 식염수 +0.1% 트윈) + 5% 탈지분유로 차단시키고, TBST로 3회 세척하였다. 세척 후에, 막을 NLRP2(1:1000), PSEN2(1:200) 또는 3-액틴(1:1000)에 대한 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 교반시키면서 인큐베이션시켰다. 세정 후에, 막을 겨자무 과산화효소(HRP)-접합된 적합한 2차 항체와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 최종적으로, 단백질 비드를 제조업자의 설명서에 따라 화학발광 시약으로 시각화시켰다. 3-액틴을 부하 대조군으로서 사용하였다.
전기 생리학
분화 38일과 55일 사이에 단일 뉴런으로부터 전체 세포 패치-클램프 기록을 얻었다. 세포를 저밀도로 플라스틱 커버슬립에 파종하였는데, 이를 관류 기반의 동봉 기록 챔버에 넣었다. 하마마쭈 오르카(Hamamatsu Orca)(상표명) R2 CCD 카메라를 구비한 올림푸스 BX61WI 현미경 하에 차등 간섭 대비 광학기기를 이용하여 뉴런을 국소화시켰다. 멀티캠프(MultiClamp)(상표명) 700B 증폭기(미국 캘리포니아주 서니베일에 소재한 몰레큘러 디바이시즈(Molecular Devices))를 이용하여 실온에서 기록을 수행하였다. 10㎑에서 신호를 샘플링하고 나서, 디지털 컨버터(몰레큘러 디바이시즈)에 디지다타(Digidata)(상표명) 1440A 유사체를 이용하여 6㎑에서 필터링한다. pClamp(상표명) 10.0 소프트웨어(몰레큘러 디바이시즈)를 이용하여 증폭기 제어 및 데이터 획득을 행하였다.
기록하는 동안 산소화된 브레인피스(상표명) 배지(스템셀 테크놀로지즈 인코포레이티드)로 관류시켰다. 중간 저항 기록 피펫(4 내지 6 MΩ)을 (mM로) 130 K-글루콘산염, 10 KCl, 2 Mg-ATP, 0.2 Na-GTP, 0.6 CaCl2, 2 MgCl2, 0.6 EGTA 및 pH 7.1로 적정한 5 HEPES 및 310 mOsm의 삼투압으로 이루어진 세포 내 용액으로 채웠다. 일부 실험에서, 세포내 용액은 또한 개개 뉴런의 사후 동정을 위해 4㎎/㎖ 바이오시틴(시그마-알드리치)을 함유하였고, 이를 다른 곳에 기재한 바와 같이 스트렙타비딘-접합 알렉사 488(라이프 사이언시즈)로 시각화하였다[42]. 처음 브레이크-인(break-in) 후에, 액세스 저항(Rs)을 지속적으로 모니터링하고, Rs가 20MΩ을 초과하거나 30% 초과로 변한다면, 폐기하였다. 화합물 Na+ 및 K+ 전류 특성규명에 대한 전압 프로토콜은 다음과 같다: 세포를 -80㎷ 전위에서 유지한 후에, 0.1 Hz 주파수에서 10㎷ 증분으로 -100㎷로부터 30㎷까지 500㎳ 단계가 이어졌다. 전류-클램프 방식으로 전환 후에, 휴지막 전위를 기록하고 나서, 흥분성 측정의 일관성을 보장하기 위해 -70㎷로 음성 DC 전류 주입에 의해 세포를 과분극시켰다. 1pA 단계로 -10pA로부터 40pA까지 정격 1s 전류 단계로 활동전위를 유발하였다.
ClampFit(상표명) 소프트웨어(몰레큘러 디바이시즈, 미국 캘리포니아주 써니베일에 소재)를 이용하여 전기생리학적 기록을 분석하였고, 평균의 터키 사후 비교와 함께 ANOVA 검정을 이용하여 결과의 통계학적 유의도를 측정하였다. 염 및 다른 시약을 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(미국 미주리주 세인트 루이스에 소재)로부터 구입하였다.
통계학적 분석
스튜던트 t-검정을 이용하여 qPCR 유전자 발현 실험 및 Aβ42/40 ELISA를 통계학적 유의도에 대해 분석하였다. 2원 ANOVA 본페로니 사후 검정에 의해 LDH 방출 분석을 분석하였다. 전기생리학 결과 분석을 위해 터키 사후 비교와 함께 ANOVA 검정을 사용하였다. 전기생리학 분석에 대해 기록한 94개 뉴런 각각을 연구하는 데 필요한 실험은 며칠 내지 몇 주가 필요하다. 각각의 실험일에, 각각의 유전자형으로부터의 대표를 포함시켰고, 각각의 유전자형으로부터의 적어도 3개의 샘플을 매일 연구하였다. *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001.
결과
BFCN 분화에 대한 프토코톨의 최적화
BFCN 분화의 개략도를 도 1A에 기재한다. 대조군 대상체 또는 AD 환자로부터의 iPSC를 지지세포가 없는(feeder-free) 조건에서 플레이팅되고, mTeSR1 기저 배지를 이용하여 분화 전에 100% 컨플루언시에 도달하도록 허용된다. "제0일"에 신경외배엽 운명을 유도하기 위해 TGF-β 신호전달의 분지는 둘 다 저해되었다(이중 SMAD 저해)[12]. 분화(제2일 내지 제10일)는 다능성을 지지하는 인자(bFGF, TGF-β, Li-Cl, GABA 및 피페콜산)를 결여하는, 변형된 mTeSR1 제형을 이용하여 수행된다. 기저 전뇌 콜린성 뉴런에 대해 이들 세포를 특정 위하여, 내부 신경절 돌기(MGE) 유도를 위해 배측화(ventralization)가 필요하다[19, 85, 91]. 이렇게 해서 세포를 2일 내지 8일에 500nM로 음향고슴도치(Shh) 유사체(SAG)로 그리고 2μM로 퍼모프아민으로 처리하였다. ChAT+ 운동 뉴런 및 글루타민산염 개재뉴런의 분화 동안에 입증된 바와 같이 SAG는 Shh 신호전달을 활성화시키기 위한 적합한 치환체이며[91], 재조합 Shh보다 더 저비용이고 Shh 그 자체 이상으로 뉴런 생존 특성에서 일부 이점을 가진다[7, 35]. 본 발명자들은 유도된 Nkx2.1 기저 전뇌 전구체로부터 BFCN의 선별화에 더 유리한 배측화제의 조합, 투약량 및 시간을 조절하기 위한 도구로서 Nkx2.1-GFP 배아 줄기 세포(ESC) 리포터 계통을 사용하였다.
그러나, 다중 뉴런 아형, 예컨대, TH+ 및 GABA+ 시상하부 뉴런을 생성하기 위한 Nkx2.1 중간체 신경 전구체의 전위를 고려하면, 본 발명자들은 상이한 선별화 조건 하에 GABAergic 개재뉴런 특이적 전사 인자 Lhx6 [26]의 발현 이상으로 하류의 콜린성 선별화 인자 Lhx8의 발현을 분석하였다(도 1B). 이들 데이터는 Shh + 퍼모프아민의 효과 미만인 효과에도 불구하고 Nkx2.1 유도에 대해 SAG 및 퍼모프아민의 상승적 효과의 존재를 뒷받침하는 것에 동의한다[50](도 1B). 제8일에 SAG + 퍼모프아민의 회수 후조차 Nkx2.1-유도 GFP 수준은 제14일까지 유지되었다(도 1B). 본 발명자들은 SAG 단독, 또는 심지어 Shh + 퍼모프아민보다 SAG + 퍼모프아민 치료 시 더 높은 Lhx8 유도를 관찰하였다(도 1B). 흥미롭게도, SAG + 퍼모프아민에 의해 유도된 중간체 Nkx2.1 수준은 Lhx8 및 BF1 유전자 발현의 더 높은 유도와 상관관계가 있다(도 1B). 제2일에 시작하는 SHH 경로-유도 배측화의 본 발명자들의 선택은 다른 MGE-유래 집단이 이중 smad 저해 프로토콜과 관련하여 더 조기(예를 들어, 시상하부 뉴런) 또는 이후의(예를 들어, GABAergic 개재뉴런)에 의해 생성되다는 것을 보여주는 보고에 기반하였다.
패턴화 단계 후에, 본 발명자들은 뉴런 생존 및 성장을 지지하기 위한 B-27 보충물에 의해 커스텀 mTESR1(상표명) 배지로부터 브레인피스(상표명) 배지로 점진적으로 전환되었다[3]. 제11일에, 본 발명자들은 Nestin 및 Sox2 마커에 대해 양성인 신경 로젯을 관찰하였고(도 1C); 또한, 본 발명자들은 제11일에 Tuj1+ 신경돌기를 관찰하였다(도 1C). 더 높은 순도의 콜린성 집단을 얻기 위해, 본 발명자들은 BFCN이 성인 뇌에서의 비-병원성 조건 하에 P75의 강한 수준을 발현시키기 위한 유일한 CNS 뉴런 유형이라는 사실에 기인하여 콜린성 뉴런에 특이적인 전구체를 단리시키기 위한 P75+ FACS 전략을 개발하였다). 이 전략에 대한 근거는 배아 뮤린 격막으로부터 고 발현성 P75+ 세포를 단리시키기 위해 FACS를 이용하는 이전에 공개된 프로토콜을 포함한다[65]. 이 집단은 콜린성-관련 마커의 최상의 발현과 상관관계가 있었다.
제11일/제12일에, 본 발명자들은 화학적 해리(어쿠타제)를 이용하여 세포를 리프팅하였고, 제11일/제12일에 p75+(CD271) 신경 전구체를 정제하고 나서, V자 바닥 96 웰 플레이트에서 신경 전구체를 스핀다운함으로써 3D 뉴런 배상체(NEB)를 생성하였다. 제19일에 NEB를 해리시키고 나서, 분지된 폴리에틸렌이민(알드리치(Aldrich) 카탈로그 번호 408727) 및 라미닌으로 코팅한 플레이트 상에서 단일층으로서 재플레이팅시켰다. 배양물에 더 이상 첨가된 DAPT가 없을 때, 제26일까지 성장 인자 BDNF, NGF 및 DAPT의 첨가로 단일층 배양물을 유지시켰다. 몇몇 대조군 iPSC 및 H9 hESC 계통으로부터의 NEB의 화학적 해리로부터 초래된 NEB 구조와 고정된 단일층의 동결절편 둘 다의 면역염색은 분화 프로토콜의 최종 단계에서 BFCN 계통 마커 Tuj1, MAP2, BF1, Nkx2.1 및 p75의 발현을 입증하였다(도 1D). 뉴런 배양물에 대한 NGF 첨가는 성숙, 신경돌기 증식물 및 ChAT의 존재에 대한 유리한 효과를 나타내었다(도 1E).
PSEN2N141I iPSC 계통의 생성 및 QC
PSEN2 N141I 돌연변이체 iPSC 및 대조군 계통을 신선한 피부 생검으로부터 생성하였다. 프레세닐린 2 볼가(Volga) 가족성 AD 돌연변이(PSEN2 N141I ) 및 하나의 영향받지 않은 구성원에 대한 동류의 2가지 담체에 의해 주어진 피부 생검으로부터 확립된 섬유아세포 계통을 성장시켰다. 추가적으로, 본 발명자들은 비-가족 관련 대조군을 포함하였다. 야마나카(Yamanaka) 인자(Oct4, KLF4, SOX2 및 c-Myc)를 도입하기 위해 변형된 RNA 방법을 이용하여 섬유아세포를 재프로그래밍하였고, [60]에 의해 개발된 자동화된 iPSC 재프로그래밍 및 QC 방법에 따라 얻어진 iPSC 계통에 알칼리성-포스파타제(AP) 효소 활성, 유전자 발현 분석 및 다능성 마커에 대한 면역염색뿐만 아니라 염색체 이상의 검출에 대한 핵형 분석(karyotyping)을 포함하는, 강한 세포 재생 및 다능성을 보장하기 위하여 몇몇 품질 관리 공정을 실시하였다. 연구에 포함시킨 대상체의 유전자형, 성별 및 연령의 요약을 도 2A에 나타낸다. 두 PSEN2 N141I iPSC 계통은 또한 APOE ε4(ε3/ε4)에 대한 이형접합인 반면, 대조군 iPSC 계통은 동형접합 ε3/ε3이었다. iPSC 계통, 다능성 마커의 발현 및 품질 관리 결과의 특성규명을 도 10에 나타낸다. 간략하게, 선택한 모든 iPSC 클론은 배상체 형성 및 3개의 배아층으로의 분화에 의한 다능성을 입증하였다(도 10A), 본 명세서에 참고로 편입됨). 최종적으로, 그들이 모 섬유아세포 계통에 매칭되는 것을 보장하기 위해, 계통을 핑거-프린팅하였다(셀 라인 제네틱스(Cell Line Genetics))(데이터 미제시). 모든 모 섬유아세포 계통 및 iPSC 계통에 PSEN2 및 APOE 유전자형을 결정하기 위한 생어 서열분석(Sanger sequencing)을 실시하였다. PSEN2 N141I 점 돌연변이가 위치되는(Chr1:227,073,304 A > T) 면적을 둘러싸는 PSEN2의 엑손 5로부터의 173 bp 단편을 PCR로 증폭시켰고, [53]에 공개된 프라이머를 이용하여 서열분석하고 나서; 유사하게 3개의 대립유전자 변이체를 결정하는 2개의 SNP를 함유하는 APOE 좌위로부터의 244bp의 단편을 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 증폭시키고 나서, 후속적으로, [36]으로부터의 프라이머를 이용하여 ε2/ε3/ε4 변이체 간의 구별을 위해 서열분석하였다. PSEN2N141I 점 돌연변이의 존재를 나타내는 샘플 크로마토그램을 도 2B에 나타내고, 모든 유전자형을 도 2A에 요약한다.
PSEN2N141I 신경 전구체의 특성규명
콜린성 뉴런 분화의 조기에 PSEN2 N141I 돌연변이의 효과를 연구하기 위하여, 본 발명자들은 BFCN 분화 프로토콜에 따라 DIV 11-16에서 얻은 신경 전구체(NPC)를 분석하였다. 이 중간체 미숙 집단의 분석은 본 발명자들이 말기에 분화된 콜린성 뉴런에서 달리 검출되지 않는 BFCN의 생성에서의 가능한 조기 변경을 검출하도록 허용한다. 이러한 결함은 성숙 뉴런에서 잠재적으로 어떤 역할을 하며, AD의 병리 생리학에 기여한다. 본 발명자들은 유전자 발현 및 면역형광 방법에 의해 PSEN2 N141I 돌연변이체 및 대조군 NPC에서의 조기 뉴런 마커의 발현을 분석하였다. 본 발명자들은 분화의 제11일에 돌연변이체 NPC에서 일반적 뉴런 마커인 Tuj1(βIII-튜불린)의 더 낮은 RNA 발현을 발견하였지만, 본 발명자들은 제16일 내지 제21일경에 면역세포화학에 의해 정량 가능한 차이를 검출하지 못하였다(도 2C 및 도 2D). 제11일에 NPC 단일층 배양물을 또한 전형적인 NPC 마커(Sox2 및 Pax6)에 대해 면역염색하였고; Pax6 수준은 Nkx2.1 유도(도시하지 않음)와 함께 예상한 바와 같이 하락하였다. 본 발명자들은 제11일에 PSEN2 N141I 배양물에서 Sox2 및 Nestin의 비슷한 발현을 관찰하였다(도 2C, 상부 패널). 제21일에, 돌연변이체 NPC는 비슷한 수준의 Nkx2.1(MGE 마커)을 발현시켰지만, qPCR에 의해 감소된 수준의 BF1(전뇌 마커)를 발현시켰지만; 그러나, BF1 단백질 발현은 이 분화 단계에서 면역염색에 의해 영향받는 것으로 보이지 않았다(도 2C 하부 패널, 및 D). 본 발명자들은 양성 세포의 백분율 또는 형광 평균 피크 값에 관해 DIV11-12 PSEN2 N141I 세포에서 NGFR (p75/CD271)의 표면 발현 차이를 관찰하지 못 하였다(도 2E).
[59, 73]에 의해 앞서 공개한 바와 같이, 돌연변이체 PSEN2 N141I 의 발현은 이식유전자 마우스의 뇌에서 Aβ42/40 비의 증가를 야기하고; 추가적으로, 이 향상된 Aβ42 생성은 돌연변이체 PSEN2 N141I 단백질의 유도된 과발현 시 신경 세포주에서[83] 그리고 PSEN2 N141I 돌연변이체 환자에서 유래된 iPSC에서 관찰되었다[93]. 일관되게, 본 발명자들은 Aβ42/40 비의 2배 증가, 분비된 Aβ40 양의 50% 증가 및 DIV 11에서 PSEN2N141' 신경 전구체로부터 조건화된 배지에서 Aβ42의 2.5배 증가를 관찰하였다(***p < 0.001)(도 2e). Coriell 저장소로부터의 섬유아세포로부터 유래된 FAD1/PS2 iPSC 계통에 적용된 상이한 뉴런 분화 방법을 이용하여, 본 발명자들의 연구에서 관찰된 분비된 Aβ40 및 42 수준 및 [93]에서 발견된 수준은 절대수와 배수-증가가 둘 다 매우 유사하다.
PSEN2N141I iPSC 계통 및 대조군으로부터의 성숙 BFCN의 특성규명
BFCN의 분화, 유전자 발현, 기능 및 통신에 대한 PSEN2 N141I 성숙의 영향을 결정하기 위한 목적으로, 본 발명자들은 마커에 대해 이후의 시점에 세포를 특성규명하였고; 본 발명자들의 목적은 PSEN2 N141I iPSC가 BFCN 성숙 과정을 완료할 수 있었는지 여부 및 그렇다면 BFCN 분화 의 이후 단계를 따라서 임의의 이상이 EOFAD의 병리 생리학을 설명할 수 있는지의 여부를 연구하는 것이다(도 3). 프로-NGF에 우선적으로 결합하는 p75에 추가로, 본 발명자들은 1차 성숙 NGF 수용체인 TrkA의 발현이 또한 PSEN2 N141I BFCN 및 대조군에서 발현되었다는 것을 분석하였다(도 3A). 이는 PSEN2 N141I BFCN인 예상되는 바와 같이 NGF 생존전 및 분화신호를 받는 것에 민감하며 이것이 유리하다는 것을 시사하며, 추가로 그들의 적절한 동일성을 확인한다. 본 발명자들은 PSEN2 N141I BFCN 및 대조군에서 추가적인 콜린성 뉴런 특이적 마커 콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT)와 소포 아세틸콜린 수송체(vAChT)의 비슷한 발현을 관찰하였다(도 3B). 다른 일반적인 뉴런 마커, 예컨대, Tuj1, 및 성숙 마커 미세소관 결합 단백질 2(MAP2)는 면역형광에 의해 분명한 차이를 나타내지 않았다(도 3B).
Aβ42/40 비에 대한 PSEN2N141I 돌연변이 및 효과 CRISPR/Cas9-매개 보정
PSEN1 돌연변이체에서 앞서 관찰한 바와 같이 APP의 가공 및 절단 및/또는 NLRP2 인플라마솜의 과장된 활성화에서의 분자 변형이[77] PSEN2 N141I 돌연변이 단독에 기인할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 CRISPR/Cas9 기술을 사용하는 본 발명자들의 iPSC 계통에서 PSEN2 좌위를 변형시켰다. 본 발명자들은 두 PSEN2 돌연변이체 iPSC 계통(AD1, AD2)에서 PSEN2 N141I 점 돌연변이를 보정함으로써 이를 수행하였다. 이 목적을 위해, 온라인 툴(tools.genome-engineering.org)을 이용하여 구체적 가이드 RNA(g1N141I)를 설계하여 PSEN2 N141I 돌연변이(Chr1:227,073,304 A > T 상류의 23 bp)를 둘러싸는 PSEN2 엑손 5의 영역으로 Cas9를 보냈다. g1N141I를 pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458) 벡터에 클로닝시켰다. HEK293T에서 pSpCas9-g1N141I-GFP의 형질감염 시 GFP 형광에 의해 발현을 평가하였다(도 4A).
돌연변이를 보정하기 위해, 본 발명자들은 91bp의 긴 상동성 아암 및 36bp의 짧은 상동성 아암을 갖는 ssODN#A-N141I인 비대칭 ssODN HDR(상동 직접 수선) 주형을 설계하였는데, PAM 측에 더 가까운 면적으로 배향된 더 짧은 아암을 갖는 비대칭 공여자 서열은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하는 상동 직접 수선의 우수한 효율을 입증하였다[13]. 이어서, 본 발명자들은 아막사(Amaxa)(상표명) 뉴클레오펙션을 이용하여 iPSC 계통에 pSpCas9-g1N141I-GFP 및 ssODN#A-N141I를 형질도입하도록 진행하였다(도 4A). 뉴클레오펙션 48시간 후에 세포를 해리시키고 나서, FACS에 의해 GFP+ 집단을 정제하고, 단일 유전자-보정 클론의 단리를 위해 지지 세포 없이 저밀도에서 재플레이팅하였다(도 4B). 후속적으로, 클론을 성장시키고, 확장 후에 gDNA를 추출하였다. 성공적인 HDR을 입증한 양성 클론의 선별은 성공적인 HDR이 Chr1:227,073,304 A > T에 위치된 SNP(dbSNP ID: rs63750215)에 특이적인 프로브로 맞춤 설계된 택맨(상표명) 유전자형 분석을 이용하여 qPCR에 의해 결정되었다는 것을 입증하였다. 본 발명자들은 이 방법에 의해 동형접합 PSEN2 N141I , 이형접합 PSEN2 N141I 과 본래의 iPSC 계통으로부터 유래된 PSEN2 WT 단일 클론 간을 구별할 수 있었고, 사전 선택된 클론에 생어 서열분석을 실시하여 Chr1:227,073,304 위치를 확인하고 주변 면적에서의 CRISPR/Cas9 변형에 의해 도입되는 가능한 삽입, 결실 또는 미스매치를 검출하고, 성공적인 HDR을 확증하였다(도 4c).
성공적으로 보정된 클론을 확장시키고, 본 연구에서 사용한 다른 4가지 계통과 동시에 BFCN 분화 프로토콜을 실시하였다. 본 발명자들은 BFCN(DIV 34)로부터의 배지를 수집하고 나서, 아밀로이드 베타 생성을 재시험하였다. DIV11-12에서의 NPC에서 본 발명자들의 이전의 발견의 근거에서(도 2f), 본 발명자들은 성숙 BFCN이 Aβ42/40 비(도 4d) 및 전반적 A3 생산(도 11)의 유의한 증가를 나타낸다는 것을 관찰하였다. 중요하게는, 이들 결과는 또한 보정된 계통(iAD1 대조군 및 iAD2 대조군은 각각 AD1 및 AD2의 보정된 클론임)에서 대조군 수준에 대한 Aβ42/40의 정규화를 나타내었다(도 4d). 이들 결과는 또한 프레세닐린이 γ-세크레타제의 촉매 부위를 함유하는 비정상적 APP 가공 및 강화에 SEN2 N141I 돌연변이를 연결하는 이전의 발견을 강화시킨다[90].
iPSC-유래된 PSEN2N141I 뉴런에서 Aβ42 올리고머 독성에 대한 민감성 평가
이전의 보고는 FAD 돌연변이를 운반하는 iPSC 계통이 비독성 자극, 예컨대, 고농도의 Aβ42 올리고머에 대해 향상된 민감성을 나타낼 수 있다는 것을 나타내었다[2]. 따라서 본 발명자들은 배지에서 PSEN2N141I 돌연변이체로부터의 본 발명자들의 BFCN이 Aβ42 올리고머에 대해 향상된 독성을 나타내는지의 여부를 시험하였다(도 5). 본 발명자들은 사멸 세포에 의해 방출된 젖산 탈수소효소(LDH)의 백분율을 측정함으로써 신경독성을 평가하였고, 따라서 독성에 대한 간접 측정을 제공한다. 2원 ANOVA에 의해 이 방법을 이용하여, 본 발명자들은 72시간의 노출 후에 배양 배지에 대한 5μM Aβ42 올리고머 참가에 의해 유도된 독성의 유의한 효과를 검출하였다(***, p < 0.01). 본페로니 사후 검정 분석은 AD2 계통과 그의 보정된 동질유전자 대조군(iAD2 대조군) 사이의 유의한 차이를 나타내었다. 그러나, Aβ42 올리고머 독성에 대한 이런 분명한 향상된 민감성은 AD1 계통 및 그의 대응하는 대조군에서 관찰되지 않았다. 이들 결과는 Aβ42에 대한 민감성 차이가 돌연변이체 PSEN2 유전자형에 배타적으로 연관되지 않는다는 것과, AD1과 AD2 대상체 간의 추가적인 유전자 인자 차이가 이 스트레스에 대한 민감성에 영향을 미칠 가능성이 있으며, 추가로 다중 동질유전자 모델의 중요성을 강조한다는 것을 나타낸다.
iPSC-유래된 PSEN2N141I 뉴런에서 NLRP2 mRNA의 평가
본 발명자들은 NLRP2 mRNA가 PSEN1 돌연변이체 iPSC 및 NPC에서 상승되었는데, [77] 이는 또한 PSEN1 돌연변이체 피질 뉴런(공개되지 않은 관찰)에 대한 경우라는 것을 보고하였다. 따라서, 본 발명자들은 PSEN2N141I 돌연변이와 관련하여 인플라마솜 성분의 상태를 분석하기를 원하였다. 본 발명자들이 DIV12에서 NPC 내 NLRP2의 mRNA 수준을 qPCR에 의해 분석하였을 때, 본 발명자들은 대조군에 비해 AD1 및 AD2 계통에서 100배 초과의 증가를 관찰하였다(도 6A). 이는 제11일의 PSEN2 돌연변이체로부터의 전체 세포 용해물에서 SDS-PAGE에 의해 관찰한 바와 같이 NLRP2 단백질에서의 현저한 증가와 상관관계가 있었다(도 6D). 그러나, 주목할만하게, AD2 계통 용해물에서의 면역블롯에 의해 NLRP2에 대한 밴드를 검출하지 않았다. 추가로, 본 발명자들은 PSEN1 돌연변이체 iPS 신경 전구체, 예컨대, 분해를 위해 미토콘드리아 크레아틴 키나제를 보내는 E3 리가제를 암호화하는 상승된 ASB9에서 이전에 보인 일부 다른 전사 사건을 확증할 수 없었다. 대신에, 본 발명자들은 20 내지 30%까지 PSEN2 돌연변이 운반체의 감소 수준에 대한 경향을 관찰하였다.
iPSC-유래된 PSEN2N141I BFCN의 흥분성 평가
BFCN 분화 프로토콜을 이용하여, 본 발명자들은 제35일의 분화로부터 시작해서 2명의 PSEN2 N141I 돌연변이체 AD 환자, 야생형 및 가족성 대조군으로부터의 접시에서 전기생리학적 활성 콜린성 뉴런을 생성할 수 있었다. 본 발명자들은 초기에 이 단계에서 신경기저 배지에서 성장된 BFCN으로부터의 성숙 활동전위 파형을 얻을 수 없었지만, 브레인피스(상표명) 배지에 대한 전환은 배양 뉴런의 전기생리학적 특성을 상당히 개선시켰다[3]. 이들 발견은 배지 둘 다와 비교하기 위해 사용한 다른 iPSC 생성 뉴런의 전기생리학적 특성규명과 일치된다[3]. ChAT 및 VAChT의 비슷한 종말점 발현뿐만 아니라 전기생리학적 반응을 갖는 2가지의 추가적인 세포주(H9 배아 줄기 세포주를 포함)에서 브레인피스(상표명) 배지를 함유하는 프로토콜의 이점을 반복하였다. BFCN의 전기생리학적 특성을 연구하기 위해, 본 발명자들은 전세포 패치-클램프 방법을 이용하여 총 94개 뉴런(22개의 야생형 대조군, 21개의 가족성 대조군, 18개의 AD1, 28개의 AD2 및 5개의 iAD1_대조군)으로부터 기록하였다. 모든 실험군에서, 기록된 뉴런은 활동전위를 생성하는 능력인 나트륨 및 칼륨 이온 통로를 통한 전압-활성화 전류를 나타내었고, 고전적 뉴런 형태를 나타내었다(도 7). 실험의 서브세트에서, 기록된 뉴런을 패치 피펫을 통해 바이오시틴으로 표지하였는데, 이는 사후 검정 세포 식별 및 ICH 특성규명을 허용하였다. 본 발명자들은 모든 바이오시틴-표지된 세포가 ChAT 및 VAChT에 대해 면역-양성이었다는 것을 발견하였다(n = 12, 도 8A).
뉴런막 저항과 전기용량에 관해 그룹 간의 유의한 차이는 관찰되지 않았고, 단일 활동전위의 생성을 위해 막 휴지전위 및 최소 전류가 필요하였다(도 9). 그러나, BFCN의 흥분성에서 유의한 돌연변이-관련, 편집-가역착 차이가 있다는 것을 관찰하였다.
AD1 및 AD2 계통으로부터의 뉴런은 (WT 및 가족성 대조군에 비해) 정격 탈분극 전류 주입에 반응하여 더 소수의 최대값 수를 생성할 수 있었다(터키 사후 검정과 함께 ANOVA 검정, 도 8B, 도 8C). 기전류 주입 시 제1 활동전위의 높이는 또한 AD1 및 AD2 BFCN에서 유의하게 감소되었다(도 1C). 중요하게는, AD1 돌연변이체 iPSC 계통에서 PSEN2 점 돌연변이의 CRISPR/Cas9 보정은 전기생리학적 결손을 없애서, 스파이크의 최대값 수와 스파이크 높이를 둘 다 야생형과 가족성 대조군에 기록된 수준까지 회복시킨다(터키 사후 검정과 함께 ANOVA 검정, 도 8).
논의
알츠하이머 협회에 따르면 미국에서 현재 알츠하이머병에 걸린 5백만명의 사람이 있으며, 이 수는 2050년까지 1천 6백만명까지 증가할 것이다. 불행하게도, 본 발명자들은 이들 환자의 3 내지 5%를 차지하는 유전적 원인에 대한 직접적인 증거만을 가진다. 이 백분율은 γ-세크레타제 장치를 구성하는 아밀로이드 단백질 전구체(APP), 또는 PSEN1, PSEN2에서의 유전되는 완전 침투성 상염색체 우성 돌연변이에 의해 야기되는 EOFAD 변이체를 포함하고[87], 그들 기능의 변화는 아밀로이드 플라크의 Aβ42 올리고머 및/또는 침착 생성을 증가시킨다.
인간 뇌에서 이 질환의 병리생리학의 계요를 완전히 설명하지 못하는 AD의 뮤린 모델을 연구하고 수십년 후에[5, 57, 58], 정해진 인자를 이용하여 성인 인간 조직의 iPSC로의 분화 및 그들의 특정 뇌 세포 유형으로의 후속적인 시험관내 분화를 허용함으로써, 브레이크스루에 대한 시험관내 AD 모델링의 상보적 신개념이 나타났다[81].
BFCN은 가장 취약한 뉴런 집단 중 하나이며, 이의 악화는, 부분적으로, AD 환자에서의 인지력 감퇴를 설명한다. BFCN 부전 및 위축에 대한 증거 외에, 다른 연구들은 AD 마우스 모델에 이식된 인간 배아 줄기 세포-유래 BFCN이 이식 마우스의 학습 거동 개선과 연관될 수 있다는 것을 나타내었다[94]. 이들 발견은 조기 임상 지표로서뿐만 아니라 AD에 대한 아형-특이적 세포-기반 요법에 대한 잠재적 전략으로서 iPSC- 및 ESC-유래 BFCN의 적절성을 강조한다[39]. 앞으로 이런 세포-기반 치료 전략을 움직이기 위해, 인간 ESC- 및/또는 iPSC-유래 BFCN를 생성하기 위한 정제된 분화 프로토콜에 대한 긴급한 필요가 있었다.
본 발명자들의 첫 번째 목표는 BFCN 및 중간체 신경 전구체(NPC)의 생성을 위한 개선된 프로토콜, 다음에 대조군 대상체와 PSEN2 N141I 돌연변이를 보유하는 것 둘 다로부터 세포주를 분화할 때 이들 방법의 용도를 개발하는 것이다. 3개의 딸세포(돌연변이에 대해 제3의 야생형과 함께 PSEN2 돌연변이를 운반하고 인지력 감퇴를 나타내는 2개)로부터 단리된 섬유아세포를 이용하여, iPSC를 발생시켰다[60]. 병원성 돌연변이에 대한 다양한 표현형의 결합 신뢰도의 정밀 분석에 대한 접근을 위해, 본 발명자들은 단일층 내 뉴런 집단을 보기 위해 이후에 해리될 수 있는 3D 배측 신경 배상체(ventralized neural embryoid body: vNEB)를 생성하기 위해 형광 활성화 세포 분류(Fluorescence Activated Cell Sorting: FACS)에 의한 중간체 CD271+(p75) 전뇌 집단의 정제를 포함하는 공개된 BFCN 프로토콜[4, 17, 46, 50, 89]을 최적화함으로써 시작하였다.
이들 세포주에서 BFCN 분화의 유도 후에, 본 발명자들은 (1) 시험관내 Tuj1 +/BF1+/ChAT+ 뉴런을 생성하는 능력; (2) 뉴런 분화 또는 염증과 관련된 관심 대상의 유전자/단백질의 발현; (3) 가용성 및 올리고머 Aβ40 및 42의 생성; (4) 전기생리학적(ePhys) 특성; 및 (5) 해당 세포 내에서 또는 근접하여 하나 이상의 선천적 또는 미세환경 인자에 대한 BFCN의 선택적 취약성을 분석하였다.
마우스 모델에서의 몇몇 연구는 AD 병리의 후기 병기와 관련된 전기생리학적 결함을 강조한다. 해마에서의 시냅스 기능은 APP23 마우스 모델에서 감소되었다[70]. 유사하게, TgCRND8 마우스의 전전두엽 피질로부터의 콜린성 뉴런은 대조군 마우스에 비해 콜린성 흥분을 지속시킬 수 없다[64]. 본 명세서에서 본 발명자들은 시험관내 PSEN2 N141I iPSC-유래된 BFCN에서 결함이 있는 전기생리학적 특성을 보고한다. 특히, 이런 점 돌연변이의 보정은 뉴런 흥분성을 대조군 iPSC-유래 뉴런 수준으로 재확립하였다.
본 발명자들은 재현 가능하고 빠른 방법으로 전기생리학적으로 활성인 ChAT+/VAChT+ 뉴런의 균질한 집단을 생성하는 데 중점을 둔 인간 iPSC로부터의 시험관내 BFCN 분화 프로토콜을 최적화하였다. 프로토콜에 도입된 혁신은 이전에 공개된 프로토콜에서[38]; 한정된 무혈청 배지 조건에서 콜린성 운명에 연루된 인자의 과발현을 강요하지 않고 제20일에 비해, 제8일만큼 빨리 그리고 제11일만큼 매우 강하게 MGE 아구(subregion)에 대한 전사 마커인 Nkx2.1의 균질한 발현을 부여하였다. 본 발명자들은 콜린성 특이적 마커의 공동발현을 수반하는 배양물에서 제38일로부터의 뉴런에서 성숙 활동전위를 기록할 수 있었는데, 이는 ES 또는 iPSC를 이용하는 다른 기존의 프로토콜에 비해 더 조기의 시점이다[4, 17, 46, 50, 89]. 따라서, 본 발명자들의 프로토콜은 균질한 콜린성 배양물에서 고속대량 약물 선별에 대한 잠재적 적용을 가진다. 추가로, 해리되지 않은 오가노이드(organoid) 형태가 남아있다면 NEB 그 자체의 3D 구조는 또한 더 생리적인 상황에서 기계적 분석을 허용한다.
PSEN2 N141I 돌연변이체 iPSC 계통에 이런 최적화된 프로토콜을 적용한 후에, 본 발명자들은 조건화된 배지에서 Aβ42/40 비의 증가를 발견하였다. 본 발명자들은 뉴런 분화 과정 및 BFCN 마커의 발현에서 임의의 분명한 결함을 관찰하지 못하였다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 보고에 기재된 결과와 유사하게 PSEN2 N141I NPC에서 BDNF 유전자 발현의 감소를 관찰하되[18] BDNF 변화는 동형접합 및 이형접합 APP swe/ PSEN1 M146V 마우스에서 관찰되었다. 두 돌연변이체 계통은 또한 하나의 APOE ε4 대립유전자의 담체이다. 이 대립유전자 변이체의 존재, LOAD에 대해 가장 통상적이고 잘 특성규명된 위험 인자 다형성[16]은 개시 연령 및 표현형의 중증도를 조절할 수 있다[49]. 따라서, EOFAD PSEN2 Volga 돌연변이(또는 보정된 CRISPR/Cas9)와 APOE E4 대립유전자를 둘 다 조합하는 이들 iPSC 계통은, 특히 apoE-분비 iPSC-유래 성상세포가 또한 존재할 때, 시험관내 초기 개시 AD의 병리 생리학을 연구하기 위한 엄청나게 유용한 도구를 구성한다.
상승된 β-아밀로이드 생성의 원인 또는 결과일 수 있는 인접한 메커니즘 또는 사건을 연구하여, 연구자들은 AD 돌연변이와 연관된 과활성화된 염증 및 전기생리학적 결함을 발견하였다. β-아밀로이드 침착과 독립적인 이들 결함의 개념 및 EOFAD 돌연변이를 보정하기 위해 CRISPR/Cas9 기법을 이용하는 이들의 입증은 β-아밀로이드 플라크 표적화(Gandy et al., in press)뿐만 아니라 염증 과정 또는 흥분독성/결함성 뉴런 발화와 동시에 극복하기 위한 병용 AD 치료의 필요에 대한 논란을 펼쳤다.
NLRP는 병원성 및 독성 자극에 반응하여 성숙 전염증 사이토카인 IL-13의 분비를 유도하는 인플라마솜의 성분이다[11, 41]. 알츠하이머병과 관련하여서뿐만 아니라 다른 신경학적 질환 유사 파킨슨병에서 NLRP2는 성상세포에서[45, 51] 하향조절되는 것으로 나타나며, NLRP3는 미세아교세포에서 하향조절되는 것으로 나타나고[34][14, 32]; 추가적으로, NLRP2/3은 AD: 비만, 2형 당뇨병과의 동시이환을 나타내는 병리에서 변경된다. 본 발명자들은 이전에 PSEN1A246E 및 PSEN1M146L 돌연변이를 보유하는 대상체로부터 저장된 섬유아세포로부터의 iPSC-유래 뉴런에서 인플라마솜 유전자 NLRP2의 상승된 발현의 예상치 못한 연관을 보고하였다[77]. 이 연관은 본 발명자들에게 프레세닐린 1, 니카스트린(nicastrin), APH-1 및 PEN-2에서 돌연변이를 갖는 염증성 피부 질환 전위여드름(acne inversa: AI)의 연관을 상기시켰는데, 일부 γ-세크레타제 성분 돌연변이가 프로아밀로이드 작용뿐만 아니라 전염증 메커니즘과 관련될 수 있는지 여부의 질문을 본 발명자들의 마음에 상기시킨다.
PSEN2N141I 돌연변이체 세포가 대조군에 비해 NLRP2를 상승시켰다는 본 발명자들의 관찰에도 불구하고, 본 발명자들은 가족성 PSEN2 돌연변이에 대한 이런 상향조절에 기여할 수 없는데, 이는 유전자 보정이 NLRP2 수준을 유의하게 감소시키지 않았기 때문이다. 본 발명자들의 결과는 인플라마솜 조절장애가 EOFAD 환자의 뇌에서 일어날 수 있지만, 재프로그래밍된 PSEN2 돌연변이체 세포주에서 반영된 인플라마솜 생물학에 대한 PSEN의 임의의 효과와 별개로 이 사건을 촉발시키는 인자가 있을 수 있다는 것을 시사한다. 이런 PSEN2-독립적 NLRP2 상향조절에 대한 일부 가능한 설명은 PSEN2대상체(대상체에서 미리 결정되지 않음)에 존재하는 apoE4 대립유전자의 효과 또는 재프로그래밍 과정을 통해 유지되는 EOFAD 대상체로부터 수집된 섬유아세포에 대한 후성적 효과를 포함한다.
뉴런에서의 전기생리학적 결함은 PSEN1 및 PSEN2 돌연변이와 연관되었다. 이들 결함 중 일부는 잠재적으로 PS/γ-세크레타제 장치에 의해 매개된 통로 성분의 절단을 통한 전압 의존성 K+ 통로의 변경된 기능에 기인한다[44, 72]. 프레세닐린 돌연변이는 또한 칼슘의 변경된 유입보다는 사이토졸 내로 방출된 증가된 자극-유도를 초래하는 소포체에 저장된 칼슘 수준을 증가시킴으로써 칼슘 신호전달을 붕괴시킨다. 뉴런 칼슘 조절장애 이후의 메커니즘 중 하나는 소포체로부터의 칼슘 유출을 조절하는, 이노시톨 삼인산염(IP3)[79]; 및 더 직접적으로는, 비가공 PSEN1 및 PSEN2 그 체에 의한 이중 기능 단백질-이온 통로의 형성에 의해 매개되는 PSEN1M146V 마우스로부터의 피질 뉴런에서 설명되었다[29, 55, 80, 84]. 칼륨 및 칼슘 유동 및 뉴런 흥분성에 대한 프레세닐린의 중요한 역할을 고려하면, PSEN1 및 PSEN2에서의 돌연변이는 감소된 뉴런 흥분성 및 신경독성을 야기할 수 있다. APP의 돌연변이체 형태를 운반하는 마우스는 플라크 부하가 상당한 후에만 칼륨 전류의 변경 없이 나트륨 전류의 감소와 관련된 비정상 활동전위를 나타내었다[9]. APP 과발현이 마우스 피질 뉴런에서 과흥분성을 야기한다는 증거가 있다[75, 86, 92].
문헌[Mucke and Selkoe][52]은 시냅스 및 그물망 기능장애를 초래하는 A3의 독성 효과를 강조하였다. 섬유아세포 및 신경 세포주에서, PS1의 돌연변이체 형태가 발현되었을 때 미토콘드리아 Ca2+의 A3-매개 축적은 상승되었다[31]. 마우스 해마 뉴런에서 뉴런 발화 패턴은 A3에 대한 노출에 의해 변경되었다[67, 69]. A3 노출은 또한 피라미드 뉴런에서의 변경된 K+ 통로 전도도와 연관되었다[54]. 아밀로이드 플라크 침착의 부재 하에 푸르키네(Purkinje) 세포에서의 감소된 스파이크 활성을 분명하게 야기하는 소뇌에서의 변경된 Ca2+ 미토콘드리아 통로와 PSEN1 돌연변이가 연관되는 것을 관찰하였다[74]. Aβ42는 추가적인 전압-의존성 이온 통로의 조절에 의한 Ca2+ 항상성에 존재하는 결함을 강조할 수 있다[8, 25, 76, 88].
마우스 데이터 및 불멸 뉴런 세포주와 별개로, A3에 대한 노출 시 iPSC-유래된 뉴런에서의 전기생리학적 결함은 하기를 나타내었다: hiPSC-유래된 피질 피라미드 뉴런 및 GABAergic 개재뉴런은 A3에 대한 노출 시 결함이 있는 활동전위를 가지며[56], PS1A426E 돌연변이를 보유하는 hiPSC와 구별된 뉴런은 또한 결함이 있는 발화 패턴을 나타내었다[47]. 그러나, PSEN2 돌연변이체 iPSC-유래된 BFCN의 전기생리학적 특성의 특성규명에 대한 이전에 공개된 데이터는 없다.
발화 빈도에서의 과- 또는 저흥분성 효과 및 차이는 유전자 돌연변이에 따라 다르며, 뉴런 아형에 고도로 의존한다[37, 48]. 모든 이들 사건은 AD의 발병에 존재하는 진행성 신경퇴행에 기여할 수 있고, 본 발명자들은 EOFAD 인간 발명의 조기 단계와 관련된 뉴런 결함을 설명할 수 있는 사건을 구체적으로 기록한다. 본 명세서에서 구체적으로 PSEN2N141I 가족성 돌연변이와 연관된 iPSC-유래된 BFCN에서의 결함 있는 전기생리학적 특성을 보고한다. 흥미롭게도, 이전의 연구 중 일부는 AD 마우스의 뇌에서 플라크의 구성에 대한 뉴런 활성에서의 이런 손상의 결과로 보지만, 본 발명자들은 아밀로이드 플라크의 부재 하에, 단지 배양 배지 내 별개의 과량의 Aβ42 올리고머의 존재 하에서 유도 활동전위의 실질적인 장애를 발견하였는데, 이는 다른 보고와 일치된다[18]. 이런 점 돌연변이의 보정은 발화 패턴을 야생형 iPSC-유래된 뉴런의 패턴으로 재확립하였다.
뉴런에서 칼륨 통로의 조절자는 AD 마우스 모델에서 기억 개선의 효능을 증명하였다[44]. Ca2 + 통로 및 흥분독성의 조절은 AD 약물의 새로운 파장을 펼칠 수 있다. PSEN2 돌연변이가 뉴런 집단의 상이한 소집단에서 전기생리학적 활성에 영향을 미치는 메커니즘을 이해하고 PSEN2 사이의 연결을 푸는 데 있어서, 조기에 투여된다면, 다른 유전자 조절 인자 및 염증은 대안의 증상 치료뿐만 아니라 ROS에 대한 Ca2 +-매개 취약성을 감소시키고 잠재적으로 뉴런 상실 및 질환의 진행을 중단시키는 신규한 약물을 잠재적으로 야기한다.
돌연변이체 프레세닐린이 A3 플라크의 형성 전 조차 뉴런 흥분성을 변경시킨다는 것은 분명하다[18, 74]. 한 가지 타당한 가설은 APP 및 프레세닐린이 A3의 생물속생설에서 그들의 역할과 별개로 작용하는 현재 인식되지 않는 메커니즘을 통해 뉴런 흥분성을 조절하는 효과를 발휘할 수 있다는 것이다. A3의 축적은 AD를 야기하는 경로에서 변경된 전기생리학적 메커니즘을 보강할 것이다. AD에 연루된 중용한 메커니즘으로서 뉴런 흥분독성을 뒷받침하는 풍족한 데이터를 이용하여, 생리적 또는 병리적 사건에서 PSEN 및/또는 A3의 가능한 역할(들)을 분명히 하는 것에 중점을 둔 추가적인 연구를 보증한다.
결론
본 발명자들은 프레세닐린 2(PSEN2 ) 돌연변이 운반체 및 대조군으로부터의 iPSC로부터 인간 BFCN을 생성하는 시험관내 프로토콜을 최적화하였다. 예상한 바와 같이, PSEN2 N141I 은 iPSC-유래된 BFCN에서 Aβ42/40의 증가와 연관되며, 이는 CRISPR/Cas9-매개 유전자 편집에 의해 반전되었다. 예상치 못하게, PSEN2 N141I 운반체로부터의 iPSC-유래된 BFCN 또는 피질 뉴런은 스파이크 주파수와 스파이크 진폭의 감소에 의해 정량화되는 바와 같이 감소된 기저 흥분성을 나타내었다. CRISPR/Cas9 보정 후에 이런 전기생리학적 표현형은 또한 PSEN2 N141I 돌연변이를 없앴다. 유전자 편집 데이터는 모든 세포로부터의 모든 예상된 발견 및 유전자형을 특성규명한 돌연변이-관련 변화의 강한 일관성이 있다는 것을 확인한다.
약어
AD: 알츠하이머병;
ApoE: 아포지질단백질 E;
APP: 아밀로이드 단백질 전구체;
AVG: 평균; A3: 아밀로이드 베타;
BDNF: 뇌 유래 신경 성장인자;
BF1: 뇌 인자 1;
BFCN: 기저 전뇌 콜린성 뉴런;
ChAT: 아세틸콜린 트랜스퍼라제;
DAPT: (N-[N-(3,5-다이플루오로펜아세틸)-L-알라닐]-S-페닐글라이신 t-뷰틸 에스터);
DIV: 시험관내 일수;
DNA: 데옥시리보핵산;
DPBS: 둘베코 인산염-완충 식염수;
DPBST: 둘베코 인산염-완충 식염수 + 0.1% 트리톤 X-100;
EGTA: 에틸렌-비스(옥시에틸렌나이트릴로)테트라아세트산;
EOFAD: 조기 개시 가족성 알츠하이머병;
ESC: 배아 줄기 세포;
FACS: 형광-활성화 세포 분류;
GAPDH: 글리세르알데하이드-3-인산 탈수소효소;
GFP: 녹색 형광 단백질;
HDR: 상동 직접 수선;
HFIP: 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올;
HRP: 겨자무 과산화효소;
IPSCs: 유도 만능 줄기 세포;
LDH: 젖산 탈수소효소;
MAP2: 미세소관 결합 단백질 2;
MGE: 내부 신경절 돌기;
NEB: 뉴런 배상체;
NGF: 신경성장인자;
NLRP2: NLR 패밀리 피린 도메인 함유 2;
NPC: 신경 전구 세포;
PFA: 파라폼알데하이드;
PSEN: 프레세닐린;
RNA: 리보핵산;
Rock: 로-결합, 또꼬인나선 함유 단백질 키나제;
RT: 역전사효소;
RT-qPCR: 실시간 정량적 중합효소 연쇄반응;
SAG: 평활화 작용제;
SDS-PAGE: 도데실황산나트륨 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동;
SEM: 평균의 표준오차;
sgRNA: 단일 가이드 RNA;
Shh: 음향고슴도치;
SNP: 단일 뉴클레오타이드 다형성;
ssODN: 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드;
TBST: 트리스-완충 식염수 + 0.1% 트윈;
VACht: 소포 아세틸콜린 수송체;
WT: 야생형
본 발명은 본 명세서의 실시예를 참고로 하여 기재되었지만, 본 발명의 정신과 범주 내에 변형 및 변화가 포함된다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 다음의 청구범위에 의해서만 제한된다.
SEQUENCE LISTING <110> NEW YORK STEM CELL FOUNDATION, INC. ICAHN SCHOOL OF MEDICINE AT MOUNT SINAI <120> METHOD AND COMPOSITION FOR GENERATING BASAL FOREBRAIN CHOLINERGIC NEURONS (BFCNS) <130> WO/2018/218193 <140> PCT/US2018/034725 <141> 2018-05-25 <150> US 62/511,271 <151> 2017-05-25 <150> US 62/571,741 <151> 2017-10-12 <150> US 62/574,639 <151> 2017-10-19 <150> US 62/586,571 <151> 2017-11-15 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 33258 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> chromosome 1, GRCh38.p12 Primary Assembly <400> 1 ggggcctggg ccggcgccgg gtccggccgg gcgctcagcc agctgcgtaa actccgctgg 60 agcgcggcgg cagagcaggt gagcgggcgg tgccgggggg tgcccaggcc agggccctgt 120 cgcctgcggc gctgagggcc cggggtgggg ctgcgccctg agggccctgc cctgccctcc 180 gcacgcctct ggccacggtc ccttccccgg ctgtgggtct gcggcccctg cgtgcgcagc 240 gctcctggcc tctgcggcca gcgcgggggc ggagagagga gagtgcccgg caggcggcgg 300 ctgggccggc ccggaactgg gtcgtggaag gatcgcgggg agcggccctc aggccttcgg 360 cctcactgcg tccccacttc cctgcgcccg cctgccgccg agccccggct gggggtgggc 420 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acttggtgtc atcagacttt tcatcttgtc 27960 tgattggatg ggtgtcattt cctttaggtt ttataattat cttttcatat gtgtattggc 28020 tgtacaaggt tccttctctg ttcattatta ttaatttttt tagacagagt ctcgcgctgt 28080 cgcccaggct ggagtgcagc agcgtgatct tggctcactg caagctccgc ctcccgggtt 28140 catgccattc tcctgcctca gcctcctgag tagctgggat tacaggtgcc tgccatcacg 28200 cccggctagt ttttttgtat tttgagtaga gatggggttt caccgtgtta gccaggaggg 28260 tctcgatctc ctgacctcgt gatccacccg cctcggcctc ccaaagtgct gggattacag 28320 gtgtgagtca ctgcgcccag cccaagtttc cttctctgtt acttgttcat atcctctgcc 28380 catttttcac ttggattttt tgtcttacgg atatttaagc ctcttaaaat atatattctg 28440 gagagatgct aatctttgat taattatatg cattgcaaat gtctggtaca ttgtggcttg 28500 cctctcttcc ctgcctttag gagtgttttg ctggacccaa gtaattttta aatgttaatg 28560 ttattaaatc tatcagtttt ttgcttgtat ggcttatgcc attgaatctt gttttaagag 28620 atccttccct accctcaagg ttttctaaat ttttattttc ataataagat ttttagttca 28680 tctgaaatgt atttttatga ttgtatttag tagggaccta attttgtttt tctttgtaac 28740 caggtgtccc agcactgttt actgaacagt ctctcctttc tcgctggtct gtagaactct 28800 cctgacatat accaagtttc cataagtggg tggatgggtt cctgagctct ctactgttaa 28860 tagaacttgc tctctcgcag gccaatgcct caccaggtga ttgaagcaga gaaacttagg 28920 tggtgaaagg agaagatggg gcctgtcctg agagtttctg ttcctgagat gctagaggca 28980 gagggtatgt aaatctgaag ttacactgga tctcctaaaa cagtataaag ctacagaagt 29040 ataatagtgt ggaatggtgg tgggagtcag taagggttag gtcactgcag tggtttaaac 29100 aagatgggct agaatccttt cacaggcaca ggcagcttgg agagggtgca atagtgcatg 29160 gtatcagggg tcagatgcct ctttttcctt tgagatcagt aagtggcttt cacctcatga 29220 cctaggctgg ctgctgtgtg ctagccgtca agtcacactc catccagcat gaaaggaggt 29280 tagaaaaggg tgcatttcct cttcttaaaa acatgtctca aagttgcaca cagcactttt 29340 gcctatattc aattggccat tagtcccacg gccatacctg tctgagactg agagactggg 29400 aaatgtcttt atttcaagtg gccatatatc cacctaaaca agataaggga tacgtggtta 29460 tggcgtgtct tttggtttac caatgcagat aatgaagtta ccaaaacaat gagaaaatgg 29520 ggtcgtgagg gatcatgtga atcacaagct gatgtcttca aagacggtgg aaatgggccc 29580 cgggaggcag cagatgacag cagtggggat taaggtagac ctccatcctg gggttaaaat 29640 gaggggaagg tgatggagct ggaccagcag tcagaatggt cagtggttag gagaccctct 29700 gccccccacc gctgccacca ttggctctct acagaatgcc tgcgagtggc ttagagtgac 29760 caaggatgag gtgcagatcc atgtgcaccc ccctgccccc tctgtggaca attttcatgc 29820 ctgacagcac agtctatgtg gattgcaagc cgatgaaact atgcaaagta gaagcatgcc 29880 tgcagtttgt gattcggtga tgtgttttat gcttatgtga gtcgaatggg gcggcagggt 29940 cctgtggtca cccgctgaga aggaagggtc ctgtaaccac tgcctttctt tcagctactt 30000 gagaaaggtg ttgtgaggga ccgtggattt tgggacagct ttgaatggtg gtagggagga 30060 agggtccggt ctgagtgaat ggccagaaag ctgtggggaa gcttttagga cattggccaa 30120 gagctccctg aaggcagcca gggagatact tgtcagtaca tgtgactaat ggccaactga 30180 atataagcag aagtgctgtg ttgctgtgtg caacactgga caccttagga aggacctcga 30240 gacagtggtt gtggactctg tagagagtaa cagtgacagt agcaaaccct tacccagtgc 30300 caaccttgtg ctaggctcgc actaaatgag tttaccttca attctcgtaa caataggagg 30360 taactactat tctaatttcc attttataga tgaggaaact aaggcacaga gatcactgac 30420 ttgcccaaaa tcaagcaggg agtagttagt atataagccc acggtatgtg gtttgtagaa 30480 taggtgctct tgactagcag aaataggtcc tccctgcagt gtgtaattga taacaagcat 30540 gggctgccat cttcctgtcg aggccactca aaacacccaa caggctacgc acggtggctc 30600 acacctgtaa tcccagcact gtgggaggcc gaggtgggcg ggtcacctga ggtcaggagt 30660 tcgagaccag cctggccgac atggtgaaac tccgtctcta ctaacagtac aaaaattagc 30720 tgggcgtggt ggcgggcacc tgtaatccca gctactcagg aggctgagac agaagaatca 30780 cttgaaccag ggaggcagag gttgcagtga gacaagatca cgccattgca ctccagcctg 30840 tgtgacaaaa gcgaaactgt ctcaaaaaaa aaaaaaaaaa aagtatgatt ttataatccc 30900 agcaccttgg gaggctgagt cgtgagaatc acttgagccc aggagtttaa gaccaatcta 30960 ggcaacatgg caagacccca tctctgccaa aaataaaaaa tagtctaatt ttagctattc 31020 atgtgtgtgt gaagtggtgt ctcttcgtgg ctttgatctg catttcccta atgctgacta 31080 atgacgttgg gcacctgttc atgtgcttac tggtcagata tctttctttt gttacatttt 31140 attaagtttt aaaatttaaa gtcaaagatt tccctatgag aatgactttt aaaatgacca 31200 aaaaggggaa gataacatta attcttgaag agaaggcctc tgagaaaaat acagttgtag 31260 caagctgcta ctttgcaaat gacccatgca ttttaatttt cccctaagga aggccaagga 31320 agagtcttat cacctcaggg caggagatgt agggacttgg gtcatttaat aagagtggta 31380 ggtttgaaaa ctcaaaccca gaagactcct tagagtttct cccaggaggt agggaagggg 31440 ccgcatccat ggagagagga ggatgtgact tagagcagtg gtccccaatc tttagggacc 31500 agggactggt gtcatggtag acagtttttc cacagatagg ggttgggggg atgatttgga 31560 gctgaaactg ctccacctca ggtcatcagg cattagattc tcatgtggag tgtgccactt 31620 agatccttgg cgtgcacagt tcacaatggg gttcgaggtc ctatgagaat ccgatgccac 31680 tgatttgaca ggaggcggag ctcaggtggt aatgctcatc tccaccgctt accacctgct 31740 gtgcagcctg gttcctaata ggctatagac tggtactggt ccatggcctg ggggttgggg 31800 acccctgatt tagaggaagt aagggcatgg cttaccgtgg gccctggggt gttctgggaa 31860 tggggaggat ggagagaaga gaggaggtag ggaagacctc cccttgctcc ccatttggga 31920 tttggggaga aagtcaggtc tcaggctcaa cagtacctga tcctgtacca tcttccaaag 31980 ggaagtcagt ggggttggaa ggtaggcagg ggttatcttc tctgagccac ggcacaagac 32040 agaagtttcc caccattcct gagggggcag gtggtaggtc cccaagcaga gagccagcag 32100 tccctctctg aggcctgcaa tggaatgggg tggggtgtcc actgagccaa gggtctgtca 32160 gtgagagctg gggaggctgg gctggcttgc aagcacctgt tataaccaaa ccaggaaatc 32220 aggttccgag tcttgccagc aagggcctac agctgccagc agagatggac agccaggaga 32280 ccccaattgg ccacccagag ccaccctcct ctgcctaccc caccctccag tactccagag 32340 cctactcgga ggggaacaga aacctgagag gctgaacaca cacacatgga gaaacaaacg 32400 tagtaaaata tttggggaat caggaagaat tatttgtact attcctgcaa cctttctata 32460 ggcttgaaat tatcaaaata aatttttaaa aattgtaata acattctcat actaaaacac 32520 tgagtttttt tctttcattt tttgattttt tctttttgac tccagcatga cttactctaa 32580 caatgggtgg tctcgatttt gaaatacttt cttctccaag cctttcatga caccctgtct 32640 ctgttggttc tgaaaatgtt ggattttgtc tcagcccttg cttctggaaa cagccaaggt 32700 taagaaaacc ccccatgctt tgtgttctag cagacagctt cctgcaaaga gccatcttcc 32760 cagagcactt aggcctctta gatgtctccc ttgtttaatt atgacaagag cacacacaca 32820 gaccctccaa attcccattc ttagtcttct aaatgattag ctgagctgct tttccccact 32880 gattaatcgg aataaaatgc tcattaacca aacttccctc ctttccccag gtccctaaac 32940 tttcctgagt cggcagacat cccctctgga gaagaggttg gccccagagt cgaacatcct 33000 ctgatctacc tgatcctgct gcccttccat tccacttccc cacatctgtt ctttctggtc 33060 gtgtttactc ccctattaaa aaaacaaaac cagaaaacgt gtttgcctag atcttgagac 33120 tctggaagat cttaacagtc agaggttccc cctatttgca atgatctcct ttcctgcccc 33180 ttcctatcct tgcaataatc cttttgaata aagtctctcc ttactaaatc cagttcctaa 33240 aaattaattt ttttagag 33258 <210> 2 <211> 448 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> presenilin-2 isoform 1 <400> 2 Met Leu Thr Phe Met Ala Ser Asp Ser Glu Glu Glu Val Cys Asp Glu 1 5 10 15 Arg Thr Ser Leu Met Ser Ala Glu Ser Pro Thr Pro Arg Ser Cys Gln 20 25 30 Glu Gly Arg Gln Gly Pro Glu Asp Gly Glu Asn Thr Ala Gln Trp Arg 35 40 45 Ser Gln Glu Asn Glu Glu Asp Gly Glu Glu Asp Pro Asp Arg Tyr Val 50 55 60 Cys Ser Gly Val Pro Gly Arg Pro Pro Gly Leu Glu Glu Glu Leu Thr 65 70 75 80 Leu Lys Tyr Gly Ala Lys His Val Ile Met Leu Phe Val Pro Val Thr 85 90 95 Leu Cys Met Ile Val Val Val Ala Thr Ile Lys Ser Val Arg Phe Tyr 100 105 110 Thr Glu Lys Asn Gly Gln Leu Ile Tyr Thr Pro Phe Thr Glu Asp Thr 115 120 125 Pro Ser Val Gly Gln Arg Leu Leu Asn Ser Val Leu Asn Thr Leu Ile 130 135 140 Met Ile Ser Val Ile Val Val Met Thr Ile Phe Leu Val Val Leu Tyr 145 150 155 160 Lys Tyr Arg Cys Tyr Lys Phe Ile His Gly Trp Leu Ile Met Ser Ser 165 170 175 Leu Met Leu Leu Phe Leu Phe Thr Tyr Ile Tyr Leu Gly Glu Val Leu 180 185 190 Lys Thr Tyr Asn Val Ala Met Asp Tyr Pro Thr Leu Leu Leu Thr Val 195 200 205 Trp Asn Phe Gly Ala Val Gly Met Val Cys Ile His Trp Lys Gly Pro 210 215 220 Leu Val Leu Gln Gln Ala Tyr Leu Ile Met Ile Ser Ala Leu Met Ala 225 230 235 240 Leu Val Phe Ile Lys Tyr Leu Pro Glu Trp Ser Ala Trp Val Ile Leu 245 250 255 Gly Ala Ile Ser Val Tyr Asp Leu Val Ala Val Leu Cys Pro Lys Gly 260 265 270 Pro Leu Arg Met Leu Val Glu Thr Ala Gln Glu Arg Asn Glu Pro Ile 275 280 285 Phe Pro Ala Leu Ile Tyr Ser Ser Ala Met Val Trp Thr Val Gly Met 290 295 300 Ala Lys Leu Asp Pro Ser Ser Gln Gly Ala Leu Gln Leu Pro Tyr Asp 305 310 315 320 Pro Glu Met Glu Glu Asp Ser Tyr Asp Ser Phe Gly Glu Pro Ser Tyr 325 330 335 Pro Glu Val Phe Glu Pro Pro Leu Thr Gly Tyr Pro Gly Glu Glu Leu 340 345 350 Glu Glu Glu Glu Glu Arg Gly Val Lys Leu Gly Leu Gly Asp Phe Ile 355 360 365 Phe Tyr Ser Val Leu Val Gly Lys Ala Ala Ala Thr Gly Ser Gly Asp 370 375 380 Trp Asn Thr Thr Leu Ala Cys Phe Val Ala Ile Leu Ile Gly Leu Cys 385 390 395 400 Leu Thr Leu Leu Leu Leu Ala Val Phe Lys Lys Ala Leu Pro Ala Leu 405 410 415 Pro Ile Ser Ile Thr Phe Gly Leu Ile Phe Tyr Phe Ser Thr Asp Asn 420 425 430 Leu Val Arg Pro Phe Met Asp Thr Leu Ala Ser His Gln Leu Tyr Ile 435 440 445 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Forward 5'-3' Primer <400> 3 catcagccct ttgccttct 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Reverse 3'-5' Primer <400> 4 ctcaccttgt agcagcggta 20 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Forward 5'-3' Primer <400> 5 acagaattcg ccccggcctg gtacac 26 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Reverse 3'-5' Primer <400> 6 taagcttggc acggctgtcc aagga 25 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Forward 5'-3' Primer <400> 7 tcagcatcta cacgccattc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Reverse 3'-5' Primer <400> 8 agcaccacca agaagatggt 20 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Forwad 5'-3' Primer <400> 9 attcgccccg gcctggtaca ctgcca 26 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Reverse 3'-5' Primer <400> 10 ctgtccaagg agctgcaggc ggcgcag 27 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> g1N141I guide RNA F <400> 11 caccgcatca tgatcagcgt catcg 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> g1N141I guide RNA R <400> 12 aaaccgatga cgctgatcat gatgc 25 <210> 13 <211> 100 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Donor ssODN#A N141I <400> 13 gagagaagcg tggctggagg gcagggccag ggcctcacct tgtagcagcg gtacttgtag 60 agcaccacca agaagatggt cagggtgttc agcacggagt 100 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Forward 5' Primer <400> 14 taacggcggc agacaaaaag a 21 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Reverse 5'-3' Primer <400> 15 gaagtattgc ttcagttggc ct 22 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Forward 5' Primer <400> 16 agaagaacgg caagtacgag a 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Reverse 5'-3' Primer <400> 17 tgttgaggga cagattgtgg c 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Forward 5' Primer <400> 18 taacggcggc agacaaaaag a 21 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Reverse 5'-3' Primer <400> 19 gaagtattgc ttcagttggc ct 22 <210> 20 <400> 20 000 <210> 21 <400> 21 000 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Forward 5' Primer <400> 22 acgaatctcc gaccaccact 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Reverse 5'-3' Primer <400> 23 ccatggccac aacaactgac 20 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Forward 5' Primer <400> 24 gaagtgtccc aggacatgat aa 22 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Reverse 5'-3' Primer <400> 25 ctcttgagta gctgggattg ag 22 <210> 26 <211> 46 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Forward 5'-3' Primer <400> 26 ctccgtgctg atcaccctca tcatgatcag cgtcatcggt tatgac 46 <210> 27 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Reverse 3'-5' Primer <400> 27 gaggcacgac tagtgggagt agtactagtc gcagtagcac caatactg 48 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Forward 5'-3' Primer <400> 28 catcatgatc agcgtcatcg 20 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> g1N2411 guide RNA F <400> 29 caccgcatca tgatcagcgt catcg 25 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> g1N2411 guide RNA R <400> 30 aaaccgatga cgctgatcat gatgc 25 <210> 31 <211> 118 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Donor ssODN#A N141I <400> 31 gagagaagcg tggctggagg gcagggccag ggcctcacct tgtagcagcg gtacttgtag 60 agcaccacca agaagatggt cataaccacg atgacgctga tcatgatgag ggtgttca 118

Claims (49)

  1. 기저 전뇌 콜린성 뉴런(basal forebrain cholinergic neuron: BFCN)을 생성하는 방법으로서, 신경외배엽 분화를 유도하기 위해 형질전환 성장인자 베타(TGF-β) 신호전달의 저해제 및 음향 고슴도치(sonic hedgehog: Shh) 신호전달의 활성체(activator)를 포함하는 기저 배지에서 만능 줄기 세포(pluripotent stem cell: PSC)를 배양시킴으로써, BFCN을 생성하는 단계를 포함하되, 상기 TGF-β 신호전달의 저해제가 SB431542 및 LDN193189이고, Shh 신호전달의 활성체가 평활화 작용제(smoothened agonist, SAG) 및 퍼모프아민(purmorphamine)이며, 상기 기저 배지가 기저 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor: bFGF), TGF-β, 염화리튬(Li-Cl), GABA 및 피페콜산이 결여된 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 배양이 4일 내지 9일의 지속기간 동안 수행되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, CD271+ 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, PSC를 상기 활성체 또는 저해제와 접촉시키기 전에 mTeSR1 기저 배지에서 상기 PSC를 컨플루언스(confluence)까지 배양시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, PSC가 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, iPSC가 알츠하이머병(Alzheimer's disease: AD) 진단을 받았거나 이를 가질 위험이 있는 대상체로부터 유래하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 배양된 세포가 제8일 배양까지 Nkx2.1의 균질한 발현을 나타내는, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 배양된 세포가 제8일 배양까지 기록가능한 활동 전위를 나타내는, 방법.
  9. 제3항에 있어서, CD271+ 세포를 배양하여 뉴런 배상체(neuronal embryoid body: NEB)를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, CD271+ 세포가 7일간 배양되어 NEB를 생성하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    a) NEB를 수확하는 단계; 및
    b) NEB의 세포를 해리하고 해리된 세포를 단일층으로 재-플레이팅하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 재-플레이팅된 세포가 상기 세포의 생존을 유지하도록 성장 인자를 갖는 배양 배지에서 추가 기간 동안 배양되고, 여기서 세포가 Tuj1, MAP2, BF1, Nkx2.1, 및 p75를 발현하는, 방법.
  13. 제5항에 있어서, iPSC가 프레세닐린 2(PSEN2)에 돌연변이를 갖는 대상체로부터 유래하는, 방법.
  14. 기저 전뇌 콜린성 뉴런(BFCN)의 감소된 뉴런 흥분성과 관련된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 화합물을 동정하는 방법으로서,
    a) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 BFCN 또는 뉴런 배상체(NEB)를 후보 화합물과 접촉시키는 단계로서, 상기 BFCN이 BFCN의 손상된 뉴런 흥분성을 초래하는 프레세닐린 2(PSEN2)에서의 돌연변이를 포함하는 것인, 단계; 및
    b) 후보 화합물과의 접촉 후에 BFCN의 뉴런 흥분성을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 기저 전뇌 콜린성 뉴런(BFCN)을 생성하기 위한 키트로서, 형질전환 성장인자 베타(TGF-β) 신호전달의 저해제 및 음향 고슴도치(Shh) 신호전달의 활성체를 갖는 기저 배지를 포함하되, 상기 기저 배지가 기저 섬유아세포 성장인자(bFGF), TGF-β, 염화리튬(Li-Cl), GABA 및 피페콜산이 결여되고, 상기 저해제가 SB431542 및 LDN193189를 포함하고, 상기 활성체가 평활화 작용제(SAG) 및 퍼모프아민을 포함하는 것인, 키트.
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