CN112322659B - 一种从非神经细胞转化制备保留年龄特征的基底前脑胆碱能神经元的方法 - Google Patents

一种从非神经细胞转化制备保留年龄特征的基底前脑胆碱能神经元的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种从非神经细胞转化制备保留年龄特征的基底前脑胆碱能神经元的方法。本发明的制备方法优化了关键的细胞直接转分化基因组合及调控表达水平的启动子，包装可以高效感染各种年龄供体源细胞的病毒，并采用合适的包被基质促进供体源细胞及转化后的神经元细胞贴壁生长，并利用含有可以促进转分化的小分子化合物与生长因子的诱导分化培养液，在10‑14天内经过若干次更换分化培养液后转分化得到大量的基底前脑胆碱能神经元，最后经过分离纯化获得高纯度的基底前脑胆碱能神经元。

Description

一种从非神经细胞转化制备保留年龄特征的基底前脑胆碱能 神经元的方法
技术领域
本发明涉及阿尔茨海默病的研究和治疗领域，更具体地，本发明涉及与之相关的一种从非神经细胞转化制备保留年龄特征的基底前脑胆碱能神经元的方法。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种以进行性认知障碍为主要临床表现的神经退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。一般65岁以前发病者，称早老性痴呆；65岁以后发病者称老年性痴呆。随着世界人口进入老龄化，AD的发病率快速上升，几乎每7秒钟就有一人患病，预测到2050年将增加到9000万人。AD已成为医疗保健系统的主要负担，给社会、患者和家属带来了沉痛的精神和经济压力，是一种十分严重的“公共健康危机”。
AD病因及发病机制极其复杂，而胆碱能神经元损伤是一种较早被公认的AD发病机制。胆碱能学说认为，在AD病理过程中，基底前脑胆碱能神经元(Basal forebraincholinergic neurons，BFCN)丢失以及神经递质胆碱乙酰转移酶活性下降，会导致乙酰胆碱的合成、释放和摄取减少，从而造成学习和记忆力衰退。在此基础上，采用基底前脑胆碱能神经元作为细胞病理模型对深入研究AD发病机制、筛选研发有效的治疗药物以及开发基因疗法等具有非常重要的意义以及极为可观的市场需求。
对于上述神经细胞的获取而言，动物神经细胞体外分离培养技术相对成熟，但当前主要限于胚胎或初生鼠类细胞，存在年龄不匹配、种属不匹配等问题，而且难以分离获得纯度较高的胆碱能神经元；此外，通过常规技术方法难以分离制备及培养人源性神经细胞，且其往往涉及伦理与法律问题。
由2012年诺贝尔医学或生理学奖得主山中伸弥等人提出的诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)技术虽然解决了无法获得人源性亚神经细胞的难题，但iPSC诱导技术方法较为复杂，获得细胞的时间较长(6-7个月)，而且在制备过程中细胞被重设至胚龄特征，从而失去了AD病理模型细胞所迫切需要的疾病年龄及关键病理特征。虽然iPSC诱导亚型神经细胞在AD等神经退行疾病的治疗领域应用前景较大，但由于现代技术的限制以及神经细胞的修复特征，在短时期内将其用于修复神经退行性疾病损伤还有诸多无法解决的问题。而在机制研究及新药筛选领域，iPSC诱导的神经细胞由于失去了发病年龄以及关键的病理特征，其实际应用效果也有待深入评估验证。基于iPSC技术制备基底前脑胆碱能神经元的相关专利可参见例如，US20120237484A1、US20120040393A1、US20190002826A1、CN103305458A等，上述专利的全部内容通过参照整体并入本文。
直接转分化技术(直接细胞重编程技术)是在iPSC技术基础上快速发展崛起的一种新兴生物技术，即，在特定的培养条件下，利用特定的基因组合等促使不同细胞类型之间互相直接转换。目前利用这一技术已可从多种体细胞直接转分化得到若干特化亚型神经元，包括多巴胺能神经元、运动神经元以及抑制性中间神经元等。该技术的独特优势在于所生成的患者功能性神经细胞保留了母细胞的年龄相关特征以及患者脑中同类神经细胞受到疾病影响的关键病理特征，因此在AD等年龄相关疾病的病理机制研究、新药筛选、药物研发及基因疗法开发方面具有引人瞩目的应用前景。相应地，由此生成的正常人功能性神经细胞则保留了母细胞的年龄特征及正常的生理功能特征，可以用于药物的毒性分析测试等。然而，所述技术的普遍缺点在于转化效率低、分离纯化收率低、难以获得大量高纯度的亚型神经元，这也在很大程度上影响其实际商业应用。
已发表的论文(Small Molecules Enable Neurogenin 2 to EfficientlyConvert Human Fibroblasts to Cholinergic Neurons，Nat Commun.2013；4：2183)中曾公开了采用Neurogenin 2(NGN2)基因作为核心基因将人成纤维细胞直接转分化为胆碱能神经元的方法。然而，该方法得到的胆碱能神经元为脊髓胆碱能神经元(类运动神经元)而非基底前脑胆碱能神经元：一方面，已有很多研究文献表明在神经系统发育期产生基底前脑胆碱能神经元的关键调控基因并非NGN2；另一方面，基于NGN2诱导生成的脊髓胆碱能神经元不能表达ISL1、GBX1、GBX2、及LHX8等重要的基底前脑胆碱能神经元的特征蛋白质。鉴于这些已知的重要因素，重复该论文公开的制备方法并不能选择性地得到基底前脑胆碱能神经元。同时，由于不同胆碱能神经元在分布位置、形态特征、基因表达以及生理功能等方面存在诸多差异，脊髓胆碱能神经元并不参与AD的病理过程，因此也难以用作AD的细胞病理模型。
综上所述，AD是典型的年龄相关疾病，其致病基因的表达以及病原蛋白质的堆积等与年龄特征密切相关，因此，具有年龄特征以及病理特征的基底前脑胆碱能神经元将是研究AD的理想细胞模型。尽管需求极大，但市场上仍无制备正常人或AD患者发病阶段基底前脑胆碱能神经元的相关技术与产品。因此本领域中迫切需要研发一种从非神经细胞直接转化制备保留年龄特征的基底前脑胆碱能神经元的方法。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明旨在采用直接转分化技术将各种年龄的AD患者或正常人的皮肤成纤维细胞等非神经细胞高效转化为高纯度的、保留相应年龄/病理特征的基底前脑胆碱能神经元(BFCN)。上述通过直接转分化技术获取的功能细胞不仅可保留供体源细胞的年龄特征，还可保留AD患者受影响功能细胞的关键病理特征(当供体源细胞来源于AD患者时)，因而在疾病机理研究与新药筛选研发方面具有独特的应用前景。
基于上述目的，在第一方面中，本发明提供了一种制备保留年龄特征的基底前脑胆碱能神经元的方法，其包括如下步骤：
1)构建含有细胞转分化基因组合的病毒载体，并通过转染细胞进行病毒包装；
2)培养供体源细胞，并用经包装的病毒感染经培养的供体源细胞；
3)在诱导分化培养液中诱导所述供体源细胞直接转分化为基底前脑胆碱能神经元；以及
4)分离纯化所得的基底前脑胆碱能神经元，
其中，所述细胞转分化基因组合包含以下基因的组合：(1)ASCL1；(2)选自LHX8、GBX1和GBX2中的至少两种基因；以及任选的(3)选自SOX4和SOX11中的至少一种基因。
在进一步的实施方式中，所述基因为来源于人或小鼠等其它任何种属的同源基因。
在进一步的实施方式中，所述病毒载体可选自逆转录病毒载体、慢病毒载体或AAV病毒载体，且各载体中调控表达水平的启动子可选自CMV、CAG、EF1α、PGK、TRE Tight、TRE3G中的任何一种或多种。优选地，所述启动子选自CMV。
在进一步的实施方式中，在病毒载体的构建过程中可以通过不同来源的2A序列(例如，T2A、E2A、P2A、F2A等)或IRES序列来连接上述基因，并可任选地进一步引入绿色或红色荧光报告基因，以便于确定病毒包装质量和滴度、观察细胞形态的变化、测定细胞纯度以及用于后续各种具体应用分析等。
在进一步的实施方式中，所述供体源细胞可以是任何年龄的正常人或患者的皮肤成纤维细胞或其它非神经细胞，如各种干细胞、肺成纤维细胞、包皮成纤维细胞、胶质细胞等。优选地，所述供体源细胞为正常人或患者的皮肤成纤维细胞。
在进一步的实施方式中，在培养供体源细胞的过程中采用合适的包被基质对培养皿等培养容器进行预包被，所述合适的包被基质可选自层粘连蛋白(laminin)、明胶(gelatin)、纤连蛋白(fibronectin)、Matrigel中的至少一种。优选地，所述包被基质为Matrigel。
在进一步的实施方式中，所述诱导分化培养液含有特定的促进转分化的小分子化合物以及生长因子的组合，所述促进转分化的小分子化合物包含佛司可林(FSK)、cAMP、双丁酰环腺苷酸(DB-cAMP)、RA、LDN-193189(LDN)、SB431542、CHIR99021中的一种以上，优选两种以上；所述生长因子包含bFGF2、NGF、BDNF中的一种以上。优选地，所述小分子化合物为佛司可林和/或LDN-193189。优选地，所述生长因子为bFGF2。
在进一步的实施方式中，所述分离纯化是采用本领域常用的消化方法(如胰蛋白酶法等)将转分化后的细胞消化并重悬为单细胞悬浮液，用细胞滤器(例如20μm细胞滤器)、流式细胞仪或在明胶包被的培养皿上差异性贴壁等方法分离得到高纯度的基底前脑胆碱能神经元。
在第二方面中，本发明提供了采用第一方面所述的制备方法制备得到的保留年龄特征的基底前脑胆碱能神经元。
在第三方面中，本发明提供了在二方面中所述的保留年龄特征的基底前脑胆碱能神经元在建立用于筛选AD治疗药物的方法中的用途。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言将是显而易见的。
此外，应当理解，在本发明的范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间均可互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1.为病毒包装时，293T细胞共转染包装质粒以及携带绿色荧光蛋白和目标基因的表达质粒后的转染效率示意图。在293T细胞中质粒转染40小时左右后，几乎所有细胞均表达较高水平的绿色荧光报告基因，转染效率高于90％。图中显示比例尺为50μm。缩写含义(下同)：GFP：绿色荧光蛋白；BF：明场图像；Merge：合并后图像。
图2.为人皮肤成纤维细胞感染病毒前后的显微示意图。绿色荧光显示病毒感染率高达70％以上。在66岁正常人的皮肤成纤维细胞中，病毒感染72小时以后，大部分细胞均显示较强的绿色荧光，表明GFP阳性细胞中转化基因表达水平较高，有利于后续高效地转分化为目标神经元。图中白色箭头显示少数未感染病毒或GFP弱表达的皮肤成纤维细胞。图中显示比例尺为50μm。
图3.为人皮肤成纤维细胞感染病毒并在诱导分化培养液中培养共8天后细胞形态变化示意图。感染了选定基因组合的GFP阳性的皮肤成纤维细胞在特定的诱导分化培养液中逐渐发生形态变化，在感染病毒后第3天左右胞体开始缩小、隆圆，第8天左右长出神经突起(如红色箭头所示)，形成明显的神经元形态，转化效率达90％以上。白色箭头显示少数未感染病毒或GFP弱表达的未能转化的皮肤成纤维细胞。图中显示比例尺为50μm。
图4.为诱导生成的人基底前脑胆碱能神经元经分离纯化以后的示意图。在感染病毒后第10-14天期间，大部分GFP阳性细胞完全转化为神经元，未转化的皮肤细胞经过分离去除后，神经元的纯度达到99％。图中显示比例尺为50μm。
图5.为分析包被基质对转化效率影响的示意图。选择4种包被基质，即，层粘连蛋白(L)、明胶(G)、纤连蛋白(F)、Matrigel(M)，按不同的组合分别加入培养皿中包被过夜，在转分化第10天用荧光显微镜每组分别随机选取5-10个20x视野，统计各视野中GFP阳性的神经细胞数目，然后计算相对于数目最多组的相对转化率以进行对比分析。由图可见，不含包被基质的实验组(-LGFM)几乎没有胆碱能神经元生成，而以上4种基质单独包被或以≥2种的组合包被均可以获得不同程度的转化率。
图6.为分析小分子化合物及生长因子的组合对转化效率影响的示意图。选择FSK、RA、LDN、SB431542(SB)、CHIR99021(CHIR)等小分子化合物以及bFGF2、NGF、BDNF等生长因子，按不同组合加入诱导分化培养液中，在第10天用荧光显微镜每组分别随机选取5-10个20x视野，统计各视野中GFP阳性的神经细胞数目，然后计算相对于数目最多组的相对转化率以进行对比分析。由图可见，在诱导分化培养液中加入以上各种成分时转化效率最高，去掉FSK、LDN或bFGF2后对转化效率的影响最大。
图7.为诱导生成的人基底前脑胆碱能神经元表达一般神经元特征蛋白质Tuj1及MAP2的示意图。其中：A)转化生成的人基底前脑胆碱能神经元特异性地表达Tuj1；B)转化生成的人基底前脑胆碱能神经元特异性地表达MAP2。GFP阳性细胞为转化生成的人胆碱能神经元。GFP阴性、HST阳性的共培养的小鼠胶质细胞中Tuj1或MAP2染色均为阴性，表明抗体特异性强。图中显示比例尺为50μm。
图8.为诱导生成的人基底前脑胆碱能神经元表达神经元突触蛋白SYN1的示意图。GFP阳性细胞为转化生成的人基底前脑胆碱能神经元，其明显表达了神经突触蛋白SYN1。GFP阴性、HST阳性的共培养的小鼠胶质细胞中SYN1染色为阴性，表明抗体特异性强。图中显示比例尺为50μm。
图9.为诱导生成的人基底前脑胆碱能神经元表达胆碱能神经元特征性蛋白质ISL1及ChAT示意图。其中：A)转化生成的人基底前脑胆碱能神经元特异性地表达ISL1；B)转化生成的人基底前脑胆碱能神经元特异性地表达ChAT。GFP阳性细胞为转化生成的人基底前脑胆碱能神经元。GFP阴性、HST阳性的共培养的小鼠胶质细胞中ISL1或ChAT染色均为阴性，表明抗体特异性强。图中显示比例尺为50μm。
图10.为诱导生成的人基底前脑胆碱能神经元表达胆碱能神经元特征性蛋白质p75NTR的示意图。GFP阳性细胞为转化生成的人基底前脑胆碱能神经元，其明显表达了胆碱能神经元所必需的神经生长因子NGF的受体p75NTR。部分GFP阴性、HST阳性的共培养的小鼠胶质细胞中p75NTR染色为弱阳性，这是因为一些胶质细胞中也能微量表达p75NTR。图中显示比例尺为50μm。
图11.为人ASCL1基因及蛋白质序列。小鼠或其它种属的ASCL1同源基因在本发明直接转分化制备方法中也有与之类似的效果。
图12.为人SOX4基因及蛋白质序列。小鼠或其它种属的SOX4同源基因在本发明直接转分化制备方法中也有与之类似的效果。
图13.为人SOX11基因及蛋白质序列。小鼠或其它种属的SOX11同源基因在本发明直接转分化制备方法中也有与之类似的效果。
图14.为人LHX8基因及蛋白质序列。小鼠或其它种属的LHX8同源基因在本发明直接转分化制备方法中也有与之类似的效果。
图15.为人GBX1基因及蛋白质序列。小鼠或其它种属的GBX1同源基因在本发明直接转分化制备方法中也有与之类似的效果。
图16.为人GBX2基因及蛋白质序列。小鼠或其它种属的GBX2同源基因在本发明直接转分化制备方法中也有与之类似的效果。
具体实施方式
为制备保留年龄特征的基底前脑胆碱能神经元，本发明根据直接转分化的技术原理，在供体源细胞中通过病毒导入能够决定神经细胞命运及其亚型的关键基因组合，并在适当的转化培养条件下诱导转化生成功能性的特定亚型胆碱能神经元。
具体地，本发明提出了一种制备保留年龄特征的基底前脑胆碱能神经元的方法，其包括如下步骤：
1)构建含有细胞转分化基因组合的病毒载体，并通过转染细胞进行病毒包装；
2)培养供体源细胞，并用经包装的病毒感染经培养的供体源细胞；
3)在诱导分化培养液中诱导所述供体源细胞直接转分化为基底前脑胆碱能神经元；以及
4)分离纯化所得的基底前脑胆碱能神经元，
其中，所述细胞转分化基因组合包含以下基因的组合：(1)ASCL1；(2)选自LHX8、GBX1和GBX2中的至少两种基因；以及任选的(3)选自SOX4和SOX11中的至少一种基因。
其中，核心转化基因ASCL1在SOX4或SOX11的协同作用下对于神经系统发育过程中不同类型神经细胞的分化起决定性的作用，而LHX8、GBX1、GBX2三种基因对特定亚型胆碱能神经元的特化起决定性的作用。上述基因的各种有效组合可以诱导产生本发明所述的基底前脑胆碱能神经元。所述基因及其蛋白质序列可参见说明书核苷酸和氨基酸序列表以及附图图11-16。
对于上述制备方法，在实际制备应用中可具体包含如下步骤：
a.将上述基因分别构建入商售或自有的逆转录病毒载体、慢病毒载体或AAV病毒载体中，各载体中调控表达水平的启动子可以是CMV，CAG，EF1α，PGK，TRE Tight，TRE3G中的任何一种或多种。同时也可以通过不同来源的2A序列(例如，T2A、E2A、P2A、F2A等)或IRES序列来连接上述基因，并可任选地进一步引入绿色或红色荧光报告基因，以便于确定病毒包装质量和滴度，观察细胞形态的变化，测定细胞纯度以及用于后续各种具体应用分析。
b.通过细胞转染将上述基因载体分别包装成相应的逆转录病毒、慢病毒或AAV病毒，测定各种病毒的滴度，确定感染供体源细胞的病毒用量，使各种病毒感染率达到50％～100％。
c.将供体源细胞按适当密度接种于层粘连蛋白、明胶、纤连蛋白、Matrigel中的至少一种所预包被的培养皿中。所述供体源细胞可以是任何年龄的正常人或患者的皮肤成纤维细胞或其它非神经细胞，如各种干细胞、肺成纤维细胞、包皮成纤维细胞、胶质细胞等。优选地，所述供体源细胞为正常人或患者的皮肤成纤维细胞。
d.加入适量的病毒进行感染，一段时间(例如24小时)后更换为新鲜的源细胞培养液。
e.确定含有促进转分化的小分子化合物与生长因子的特定诱导分化培养液：在含有0.5％-2％B27，0.5％-2％N2的DMEM/F12/Neurobasal(1∶1∶1或2∶2∶1)基础液中，加入1-20μM FSK，0.1-5μM RA，0.1-1μM LDN，1-10μM SB431542，1-10μM CHIR99021中的一种以上，以及1-200ng/mL bFGF2，NGF，BDNF中的一种以上的组合。
f.在供体源细胞感染病毒后定期(例如第3、5、7、10天；或每天；或其它不同间隔时间)更换诱导分化培养液。
g.在第10-14天分离纯化带有荧光的基底前脑胆碱能神经元，用荧光显微镜分别计数总细胞及神经细胞以确定其纯度。
h.将部分纯化后的胆碱能神经元接种在预先包被好的培养皿中用胆碱能神经细胞培养液继续培养以供鉴定，余下冻存于适于神经细胞的冻存液备储存、运输。
i.对以上制备得到的基底前脑胆碱能神经元进行特征鉴定，该鉴定可包含例如以下方面：
A.一般神经元表达的特征蛋白质：Tuj1、MAP2、NeuN，Tau等；
B.神经元突触蛋白质：Synapsin 1(SYN1)；
C.胆碱能神经元特征蛋白质：ChAT、VaCHT、ISL1、LHX8、GBX1、GBX2(后四种为基底前脑胆碱能神经元特征蛋白质)；
D.NGF受体：TrkA、p75NTR。
需要注意的是，上述具体制备方法仅为更好地阐释本发明，而非限制本发明的范围。本领域技术人员可根据实际制备需求选择性调整其中部分步骤的顺序，以及省略其中部分步骤。此外，其中相应步骤中的试剂、时间、浓度以及其他参数等均可根据实际情况进行适当调整，这对于本领域技术人员而言均是显而易见的。
由上文可知，与现有技术中的方法截然不同，本发明采用ASCL1作为核心转化基因，并结合SOX4或SOX11以及基底前脑胆碱能神经元必需的特化基因如LHX8、GBX1、GBX2等，通过联合小分子化合物以及生长因子等特定的转分化条件，可以高效地促使人非神经细胞直接转分化为保留年龄特征的基底前脑胆碱能神经元，因而是一种兼具创造性和实用性的创新技术。
本发明的制备方法优化了关键的细胞直接转分化基因组合及调控表达水平的启动子，包装可以高效感染各种年龄供体源细胞的病毒，并采用合适的包被基质促进供体源细胞及转化后的神经细胞贴壁生长，并利用含有可以促进转分化的小分子化合物与生长因子的诱导分化培养液，在10-14天内经过若干次更换分化培养液后转分化得到大量的基底前脑胆碱能神经元，最后经过分离纯化获得高纯度的基底前脑胆碱能神经元。
本发明制备方法所具有的独特优势列举如下：
1.简单：供体源细胞感染病毒以后，只需更换诱导分化培养液若干次即可，无需进行繁琐操作；
2.快速：仅需10-14天即可获得大量目标产品；
3.成本低：相比于iPSC，无需长期每日更换昂贵的培养液(iPSC的培养液非常昂贵)；
4.收率高：仅需1-2个100mm培养皿即可获得百万数量级的经纯化胆碱能神经细胞；
5.分离纯化简单、产品纯度高，经纯化的胆碱能神经细胞普遍可达90％以上纯度；
6.制得的胆碱能神经细胞符合AD患者的发病年龄与病理特征；
7.制得的胆碱能神经细胞可以有效冻存、复苏，液氮冻存可达半年以上，复苏存活率达到90％；
8.制得的胆碱能神经细胞可以短期或长期培养，最长可培养3个月以上；
9.制得的胆碱能神经细胞适用于作为细胞病理模型，研究发病机制、药物作用机制、筛选研发药物及开发基因疗法，或用于化合物毒性测试等；
10.可用于快速建立大样本正常及患者人群的胆碱能神经细胞库，用以支持大数据分析以及精准疗法开发。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例
实施例1从人皮肤成纤维细胞快速、高效地制备高纯度的基底前脑胆碱能神经元
1.材料
1)细胞：用于病毒包装的293T细胞购自和元生物技术(上海)股份有限公司；人皮肤成纤维细胞AG08517购自Genetic Cell Repository(Coriell Institute for MedicalResearch，NJ，USA)。将293T及人皮肤成纤维细胞用含10-20％FBS及1×P/S双抗的高糖DMEM培养液进行培养。
2)仪器设备与试剂：
A.CO2细胞培养箱(Thermo BB15)；超净工作台(苏州净化，SW-CJ-2FD)；荧光显微镜(Thermo EVOS M5000)；超低温冰箱(Thermo 900系列-902)；高速冷冻离心机(湘仪TGL-20M)；常温高速离心机(Eppendorf 5424)；
B.智能高压蒸汽灭菌器(上海申安LDZM-80KCS)；美国SHELLAB干燥箱(CE3F-2)；电热数显恒温水浴锅(力辰HH-2)；
C.BIO-RAD梯度PCR仪(S 1000)；BIO-RAD电泳仪(PowerPac HC)；紫外割胶分析仪(君意JY02)；隔水式培养箱(上海一恒GHP-9080)；恒温振荡器(上海一恒，THZ-98C)；
D.DMEM，F12(Hyclone)；FBS，Neurobasal，B27，N2，胰蛋白酶，DMSO(Invitrogen)；明胶，纤连蛋白，层粘连蛋白，Matrigel(BD)；佛司可林，RA，LDN-193189.HCl，CHIR99021，SB431542(Selleck)；bFGF2，NGF，BDNF(Peprotech)；Lipofectamine2000(Invitrogen)；PEI(Polysciences)；系列DNA限制性内切酶(Neb)，QIAGEN Plasmid Midi试剂盒(100)，Zymoclean Gel DNA回收试剂盒，60mm培养皿，100mm培养皿，24-MTP，48-MTP，96-MTP，细胞冻存管(康宁)；其它化学试剂(Sigma)等。
2.制备方法
1)质粒构建：将ASCL1、LHX8、GBX1及SOX11四种基因分别构建入慢病毒载体，载体中调控基因表达水平的启动子采用CMV。同时在ASCL1基因起始密码子前通过T2A序列引入绿色荧光报告基因，以便于确定病毒包装质量和滴度，观察细胞形态的变化，测定细胞纯度及用于后续各种具体应用。
2)病毒包装：将携有上述基因的各质粒与pRSV、pMDLg及pVSV-G按本领域常用比例与转染试剂Lipofectamine2000混合，加入24小时前预种的293T细胞中转染过夜，更换新鲜培养液，24小时后收集含有病毒的上清液并加入新鲜培养液，再24小时后重复收集一次，合并两次病毒液后用0.45μm的滤器过滤除去死细胞及其碎片，加入聚凝胺至终浓度1-12μg/mL，用少量测定病毒滴度，其余储存于4℃冰箱备用。质粒转染效率可以通过随机选择5-10个20x视野，分别统计各视野中的总细胞数以及GFP阳性细胞数，计算各视野GFP阳性细胞比例，然后取平均值而求得。在293T细胞中40小时左右质粒转染效率高达90％以上，参见附图图1，可以确保获得高滴度的病毒液。
3)皮肤成纤维细胞培养及感染：先在DMEM或PBS中按1∶50至1∶2000间的任何比例稀释Matrigel，并加入0.1-20μg/mL层粘连蛋白，预包被培养皿过夜。然后将皮肤成纤维细胞按适当密度预种于培养皿中过夜。在皮肤成纤维细胞培养液中加入适量的携有基因的病毒，混匀后在培养箱中继续培养过夜，将含病毒的培养液直接吸入含有消毒液的废液瓶，在细胞培养皿中沿壁迅速小心加入新鲜的皮肤成纤维细胞培养液。病毒感染率可以通过随机选择5-10个20x视野，分别统计各视野中的总细胞数以及GFP阳性细胞数，计算各视野GFP阳性细胞比例，然后取平均值而求得。通过在成年或老年皮肤成纤维细胞中调整病毒用量，可使病毒感染率在72小时左右高达70％以上，参见附图图2，从而确保感染病毒的细胞可高效地转化为基底前脑胆碱能神经元。
4)直接诱导转分化：感染48小时后，将培养液直接吸入含有消毒液的废液瓶，在细胞培养皿中沿壁小心加入含有促进转分化的小分子化合物与生长因子的诱导分化培养液。然后间隔1-2天换液。所述诱导分化培养液的组成为：在含有0.5％-2％B27、0.5％-2％N2的DMEM/F12/Neurobasal(1∶1∶1或2∶2∶1)基础液中，加入1-20μM FSK、0.1-5μM RA、1-10μMSB431542和0.1-1μM LDN，以及1-200ng/mL bFGF2、NGF和BDNF。
5)胆碱能神经元的分离纯化：10天左右即可看到大量转化的胆碱能神经元，在荧光显微镜下观察更为清晰。采用细胞滤器及在明胶包被的培养皿上差异性贴壁进行分离纯化。对于纯化后的胆碱能神经元，通过细胞计数器和荧光显微镜分别统计获得总细胞数及GFP阳性的神经细胞数目，三次重复计算测得纯度高达99％，参见附图图4。将少量纯化后的胆碱能神经元接种在预先包被好的培养皿中用胆碱能神经细胞培养液继续培养以供鉴定表征。
6)冻存及运输：按照常规细胞冻存方法操作，将胆碱能神经元按每管50万或100万个细胞冻存于适于神经细胞的专用冻存液备储存、运输。
3.表征
在适宜的时间(如15dpi、20dpi或培养期间其它任何时间)，采用4％PFA在室温下固定小鼠皮层胶质细胞预先包被的盖玻片上培养的胆碱能神经元10-20分钟后，用含有0.1-0.2％Triton X-100及3-5％BSA的PBS缓冲液封闭约0.5-2小时。然后在同样的缓冲液中稀释待分析特征蛋白质的抗体，将其加入细胞中并于4℃下孵育过夜，洗涤5分钟2-3次后，加入经稀释的带有荧光素的相应二抗，在室温下孵育0.5-1小时，洗涤5分钟2-3次后，再用1μg/mL Hoechst33258(HST)室温共染10分钟，洗涤后用载玻片封片处理。采用EVOS荧光显微镜或共聚焦荧光显微镜，分析胆碱能神经元有无表达一般神经元特征蛋白质(Tuj1及MAP2)、神经突触蛋白质(SYN1)、胆碱能神经元特征蛋白质(ISL1及ChAT)以及NGF的受体蛋白质(p75NTR)等。抗体来源及稀释度参见表1，分析结果分别参见附图图7(Tuj1及MAP2)、图8(SYN1)、图9(ISL1及ChAT)以及图10(p75NTR)。
表1.胆碱能神经元鉴定分析抗体来源及稀释比例
检测蛋白质 公司 产品号 稀释度
Tuj Covance PRB-435P 1∶1000
MAP2 Sigma M4403 1∶300
SYN1 Cell Signaling 5297S 1∶200
ISL1 Abcam ab109517 1∶2000
ChAT Bimake A5303 1∶1000
p75NTR Abcam ab8874 1∶200
结果表明，采用本实施例技术制备的基底前脑胆碱能神经元除了表达一般神经元的特征蛋白质、神经突触蛋白质外，在过表达的ASCL1、SOX11以及基底前脑胆碱能神经元特化基因GBX1和LHX8的共同作用下，还特异性地诱导表达了基底前脑胆碱能神经元的重要特征蛋白质ISL1，这与本发明背景技术部分提到的论文(Nat Commun.2013；4：2183)中得到的不能表达ISL1的脊髓胆碱能神经元(类运动神经元)形成显著区别。需要说明的是，鉴于本实施例采用了基底前脑胆碱能神经元特异性基因LHX8和GBX1，上述基因所对应的特征蛋白质在制备得到的神经元中即相应获得表达，因此本实施例未再针对上述蛋白质进行额外染色鉴定。
实施例2从人胚胎肺成纤维细胞快速、高效地制备高纯度的基底前脑胆碱能神经元
1.材料
人胚胎肺成纤维细胞MRC-5购自和元生物技术(上海)股份有限公司。其余材料同实施例1(略)。
2.制备方法
1)质粒构建：将ASCL1、LHX8、GBX1及SOX4四种基因分别构建入逆转录病毒载体，载体中调控基因表达水平的启动子采用EF1α。同时在ASCL1基因终止密码子后通过IRES序列引入绿色荧光报告基因，以便于确定病毒包装质量和滴度，观察细胞形态的变化，测定细胞纯度及用于后续各种具体应用。
2)病毒包装：将携有上述基因的各质粒与pGP及pVSV-G按本领域常用比例与转染试剂Lipofectamine2000混合，加入24小时前预种的293T细胞中转染过夜，更换新鲜培养液，24小时后收集含有病毒的上清液并加入新鲜培养液，再24小时后重复收集一次，合并两次病毒液后用0.45μm的滤器过滤除去死细胞及其碎片，加入聚凝胺至终浓度1-12μg/mL，用少量测定病毒滴度，其余储存于4℃冰箱备用。在293T细胞中40小时左右质粒转染效率高达90％以上。
3)MRC-5成纤维细胞培养及感染：先用0.1-20μg/mL层粘连蛋白与纤连蛋白预包被培养皿过夜。将MRC-5成纤维细胞按适当密度预种于培养皿中过夜。在MRC-5成纤维细胞培养液中加入适量的携有基因的病毒，混匀后在培养箱中继续培养过夜，将含病毒的培养液直接吸入含有消毒液的废液瓶，在细胞培养皿中沿壁迅速小心加入新鲜的成纤维细胞培养液。通过在MRC-5成纤维细胞中调整病毒用量，可使病毒感染率在72小时左右高达70％以上。
4)直接诱导转分化：感染48小时后，将培养液直接吸入含有消毒液的废液瓶，在细胞培养皿中沿壁小心加入含有促进转分化的小分子化合物与生长因子的诱导分化培养液。然后间隔1-2天换液。所述诱导分化培养液的组成为：在含有0.5％-2％B27、0.5％-2％N2的DMEM/F12/Neurobasal(1∶1∶1或2∶2∶1)基础液中，加入1-20μM FSK和0.1-1μM LDN，以及1-200ng/mL NGF和BDNF。
5)胆碱能神经元的分离纯化：10天左右即可看到大量转化的胆碱能神经元，在荧光显微镜下观察更为清晰。采用细胞滤器及在明胶包被的培养皿上差异性贴壁进行分离纯化。纯化后的胆碱能神经元纯度高达90％。
3.表征
采用与实施例1中相同的方法，采用EVOS荧光显微镜或共聚焦荧光显微镜，分析制得的基底前脑胆碱能神经元有无表达一般神经元特征蛋白质(Tuj1及MAP2)、神经突触蛋白质(SYN1)、胆碱能神经元特征蛋白质(ISL1及ChAT)以及NGF的受体蛋白质(p75NTR)等。分析结果同样表明，采用本实施例技术制备的基底前脑胆碱能神经元不仅表达了一般神经元的特征蛋白质、神经突触蛋白质，在过表达的ASCL1、SOX4以及基底前脑胆碱能神经元特化基因GBX1和LHX8的共同作用下，还特异性地诱导表达了基底前脑胆碱能神经元的重要特征蛋白质ISL1，这与本发明背景技术部分提到的论文(Nat Commun.2013；4：2183)中得到的不能表达ISL1的脊髓胆碱能神经元(类运动神经元)形成显著区别。
实施例3从人包皮成纤维细胞快速、高效地制备高纯度的基底前脑胆碱能神经元
1.材料
人包皮成纤维细胞BJ(CRL-2522)购自美国ATCC公司。其余材料同实施例1(略)。
2.制备方法
1)质粒构建：将ASCL1、LHX8、GBX2及SOX11四种基因分别构建入慢病毒载体，载体中调控ASCL1基因表达水平的启动子采用CMV，调控其它基因表达水平的启动子采用PGK。同时在ASCL1基因终止密码子前通过T2A序列引入绿色荧光报告基因，以便于确定病毒包装质量和滴度，观察细胞形态的变化，测定细胞纯度及用于后续各种具体应用。
2)病毒包装：将携有上述基因的各质粒与pRSV、pMI)Lg及pVSV-G按本领域常用比例与转染试剂PEI混合，加入24小时前预种的293T细胞中转染过夜，更换新鲜培养液，24小时后收集含有病毒的上清液并加入新鲜培养液，再24小时后重复收集一次，合并两次病毒液后用0.45μm的滤器过滤除去死细胞及其碎片，加入聚凝胺至终浓度1-12μg/mL，用少量测定病毒滴度，其余储存于4℃冰箱备用。在293T细胞中40小时左右质粒转染效率高达90％以上。
3)BJ成纤维细胞培养及感染：先用DMEM或PBS按1∶50至1∶2000间的任何比例稀释Matrigel，预包被培养皿过夜。将BJ成纤维细胞按适当密度预种于培养皿中过夜。在BJ成纤维细胞培养液中加入适量的携有基因的病毒，混匀后在培养箱中继续培养过夜，将含病毒的培养液直接吸入含有消毒液的废液瓶，在细胞培养皿中沿壁迅速小心加入新鲜的成纤维细胞培养液。通过在BJ成纤维细胞中调整病毒用量，可使病毒感染率在72小时左右高达70％以上。
4)直接诱导转分化：感染48小时后，将培养液直接吸入含有消毒液的废液瓶，在细胞培养皿中沿壁小心加入含有促进转分化的小分子化合物与生长因子的诱导分化培养液。然后间隔1-2天换液。所述诱导分化培养液的组成为：在含有0.5％-2％B27、0.5％-2％N2的DMEM/F12/Neurobasal(1∶1∶1或2∶2∶1)基础液中，加入1-20μM FSK和0.1-1μM LDN，以及1-200ng/mL NGF和bFGF2。
5)胆碱能神经元的分离纯化：10天左右即可看到大量转化的胆碱能神经元，在荧光显微镜下观察更为清晰。采用细胞滤器及流式细胞仪进行分离纯化。纯化后的胆碱能神经元纯度高达90％。
3.表征
采用与实施例1中相同的方法，采用EVOS荧光显微镜或共聚焦荧光显微镜，分析制得的基底前脑胆碱能神经元有无表达一般神经元特征蛋白质(Tuj1及MAP2)、神经突触蛋白质(SYN1)、胆碱能神经元特征蛋白质(ISL1及ChAT)以及NGF的受体蛋白质(p75NTR)等。分析结果同样表明，采用本实施例技术制备的基底前脑胆碱能神经元不仅表达了一般神经元的特征蛋白质、神经突触蛋白质，在过表达的ASCL1、SOX11以及基底前脑胆碱能神经元特化基因GBX2和LHX8的共同作用下，还特异性地诱导表达了基底前脑胆碱能神经元的重要特征蛋白质ISL1，这与本发明背景技术部分提到的论文(Nat Commun.2013；4：2183)中得到的不能表达ISL1的脊髓胆碱能神经元(类运动神经元)形成显著区别。
实施例4包被基质的选择研究
一般的细胞培养皿在没有预先包被的情况下对皮肤成纤维细胞的贴壁生长没有明显影响，可是在感染病毒后，细胞会从玻璃介质上脱落，因此应针对所用培养皿选择合适的包被条件以促进细胞在转分化过程中的贴壁生长。重要的是，包被基质的选择对转分化期间诱导生成的神经细胞的贴壁生长及存活至关重要，是提高转化效率的重要前提。
因此，本实施例选择了4种成纤维细胞或神经细胞的包被基质：层粘连蛋白(L)、明胶(G)、纤连蛋白(F)、Matrigel(M)，按不同的组合分别加入培养皿中包被过夜，在转分化第10天用荧光显微镜每组分别随机选取5-10个20x视野，统计各视野中GFP阳性的神经细胞数目，然后计算相对于数目最多组的相对转化率以进行对比分析。由图5可见，不含包被基质的实验组(-LGFM)几乎没有胆碱能神经元生成，而以上4种基质单独包被或以≥2种的组合包被均可以获得不同程度的转化率。在单独包被的情况下，Matrigel相比其它包被基质导致了最高的转化效率。因此，在实际制备过程中可以参考成本、效率等因素选择合适的包被基质。
实施例5诱导分化培养液中小分子化合物和生长因子的选择研究
本实施例考察了不同小分子化合物以及生长因子对转分化效率的影响。按实施例1所述条件进行转分化实验，选择FSK、RA、LDN、SB431542(SB)、CHIR99021(CHIR)等小分子化合物以及bFGF2、NGF、BDNF等生长因子，按不同组合加入诱导分化培养液中，在第10天用荧光显微镜每组分别随机选取5-10个20x视野，统计各视野中GFP阳性的神经细胞数目，然后计算相对于数目最多组的相对转化率以进行对比分析。由图6可见，在诱导分化培养液中加入以上全部成分(ALL)时转化效率最高，去掉FSK、LDN或bFGF2后对转化效率的影响最大。因此，在实际制备过程中可以参考成本、效率等因素选择合适的小分子化合物及生长因子组合。
实施例6基底前脑胆碱能神经元在AD新药筛选中的应用
先将若干96孔培养板按上述方法预包被过夜，取出一管冻存神经细胞，在水浴中小心快速解冻复苏，按适当密度接种后，把预先准备好的待筛选化合物加入预先设计好的各孔中(应含溶剂对照、阳性对照等)，轻轻混匀后，放回细胞培养箱中，培养适当时间后，按照适宜的方法进行定性、定量分析，确定有效化合物。最优活性化合物可以进一步采用胆碱能神经元来研究其作用机制、明确主要作用靶点、优化结构以改善成药性、并利用作用靶点开发潜在的基因疗法等。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明。然而，应当理解的是，以上所述实施例无意于限制本发明的范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure ISA0000187216170000011
Figure ISA0000187216170000021
Figure ISA0000187216170000031
Figure ISA0000187216170000041
Figure ISA0000187216170000051
Figure ISA0000187216170000061
Figure ISA0000187216170000071
Figure ISA0000187216170000081
Figure ISA0000187216170000091
Figure ISA0000187216170000101
Figure ISA0000187216170000111
Figure ISA0000187216170000121
Figure ISA0000187216170000131

Claims (8)

1.一种从非神经细胞转化制备保留年龄特征的基底前脑胆碱能神经元的方法，其包括如下步骤：
1)构建含有细胞转分化基因组合的病毒载体，并通过转染细胞进行病毒包装；
2)培养供体源细胞，并用经包装的病毒感染经培养的供体源细胞；
3)在诱导分化培养液中诱导所述供体源细胞直接转分化为基底前脑胆碱能神经元；以及
4)分离纯化所得的基底前脑胆碱能神经元，
其中，所述细胞转分化基因组合包含以下基因的组合：(1)ASCL1和LHX8；(2)选自GBX1和GBX2中的至少一种基因；以及(3)选自SOX4和SOX11中的至少一种基因；
所述供体源细胞为任何年龄的正常人或患者的皮肤成纤维细胞、肺成纤维细胞或包皮成纤维细胞；
所述诱导分化培养液含有促进转分化的小分子化合物以及生长因子的组合，所述促进转分化的小分子化合物包含佛司可林、cAMP、双丁酰环腺苷酸、RA、LDN-193189、SB431542、CHIR99021中的一种以上；所述生长因子包含bFGF2、NGF、BDNF中的一种以上。
2.权利要求1所述的方法，其中所述基因为来源于人和小鼠的基因及其同源基因。
3.权利要求1所述的方法，其中所述病毒载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体或AAV病毒载体；载体中调控表达水平的启动子选自CMV、CAG、EF1α、PGK、TRETight、TRE3G中的任何一种或多种。
4.权利要求1所述的方法，其中在病毒载体的构建过程中可通过不同来源的2A序列或IRES序列来连接上述基因，并可任选地进一步引入荧光报告基因。
5.权利要求1所述的方法，其中在培养供体源细胞的过程中采用合适的包被基质对培养容器进行预包被，所述合适的包被基质选自层粘连蛋白、明胶、纤连蛋白、Matrigel中的至少一种。
6.权利要求1所述的方法，其中所述分离纯化是将转分化后的细胞消化并重悬为单细胞悬浮液，用细胞滤器、流式细胞仪或在明胶包被的培养皿上差异性贴壁的方法分离以得到高纯度的基底前脑胆碱能神经元。
7.采用权利要求1-6中任一项所述的方法制备得到的保留年龄特征的基底前脑胆碱能神经元。
8.权利要求7所述的保留年龄特征的基底前脑胆碱能神经元在建立用于筛选阿尔茨海默病治疗药物的方法中的用途。
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