CN103305458A - 从多潜能干细胞诱导胆碱能神经元的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从多潜能干细胞诱导胆碱能神经元的方法。首次揭示一种可诱导多潜能干细胞向基底前脑胆碱能神经元高效分化的方法，所述方法包括在合适的时间点进行悬浮培养或贴壁培养，采用联合骨形态发生蛋白9(BMP9)与Sonic hedgehog(Shh)诱导拟胚体使之分化为基底前脑胆碱能神经元。本发明的方法简单高效，获得含有高比例基底前脑胆碱能神经元的细胞群。

Description

从多潜能干细胞诱导胆碱能神经元的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及从多潜能干细胞诱导胆碱能神经元的方法。

背景技术

随着我国老龄人口的增多和社会压力的增加，神经退行性疾病已成为危害人类生活质量的一类重要疾病，其中痴呆症对老年人健康的影响尤为突出，WHO已将老年痴呆症定为21世纪五大重点疾病之一。阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是痴呆症最常见类型，AD主要的临床特征是失忆型记忆功能障碍、语言功能恶化和视觉空间缺陷。随着上述症状的加重，病人出现各种神经精神症状和行为障碍，日常生活能力进行性减退。AD患者脑内显示主要有三种异常病理特征：老年斑(Senile plaques，SP)、神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles，NFT)和神经细胞的大量丧失(Neuron loss)。现在，一般认为β淀粉样蛋白(Aβ)肽的生成和蓄积，进而老年斑的形成是AD发病机制的中心环节。老年斑的病理分布区域主要集中在病人大脑的边缘系统，特别是海马，杏仁核，额叶底部区域。

研究证实，脑内胆碱能神经元释放的乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)与记忆认知活动关系密切。脑内主要的胆碱能神经系统是基底前脑至皮层和海马的胆碱能纤维投射，当机体需要对新刺激进行分析时，基底前脑胆碱能神经元被激活，皮层、海马等脑区内ACh的释放水平随着学习与记忆等认知活动而发生改变。AD病人尸检和活检也显示基底前脑内胆碱能神经元有70％～80％缺失，突触前ACh的高亲和力胆碱摄取系统功能明显降低，降低程度与AD病人的智能障碍密切相关。因此，针对能够调整脑内胆碱能神经系统功能的干预措施，如胆碱酯酶抑制剂和神经元保护性药物成为治疗AD的主要方案之一，其他的治疗方法还有干扰Aβ形成和沉积的药物，抗氧化剂，抗炎药物以及β-分泌酶抑制剂等。这些措施可能通过暂时改善和减慢认知功能的衰退速度，而减轻病人的症状，但总体治疗效果非常有限。近年来出现的疫苗免疫疗法，虽然可以减少Aβ的形成，甚至部分清除已经形成的老年斑，却不能恢复已被损害的与记忆认知相关的神经系统功能。因此，寻找一种能够显著延缓AD发病和长期改善AD症状的干预措施显得尤为重要。基于干细胞的细胞替代治疗，强调对受损细胞功能进行长久替代和恢复，为实现上述AD的治疗策略提供了新选择。

干细胞特别是胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ES或ESC)是人体及各种组织细胞的最初来源，具有高度自我复制、高度增殖和多向分化潜能等特征。随着干细胞研究的发展，干细胞本身所具有的特性使人类可以在体外培养某些干细胞，并将其定向诱导分化为所需的细胞类型，以供临床所需。目前，ES细胞诱导分化为神经细胞的方法已经取得了较大进展，可以较高效率地得到中枢神经系统的多种神经元和神经胶质细胞，如多巴胺能神经元和少突胶质细胞等治疗细胞的诱导体系已比较成熟，从而推动了帕金森氏病(Parkinson’s Disease，PD)和多发性硬化等疾病干细胞治疗的研究进展。但是，对于应用多潜能干细胞治疗AD的研究，在国际上进展不大。主要面临以下几个瓶颈问题尚待解决。首先，由于胚胎干细胞向胆碱能神经元分化的分子机制尚未充分阐明，在体外诱导多潜能ES细胞分化为胆碱能神经元的效率还很低。而胆碱能神经元的丢失和/或功能异常在AD发病过程中发挥着核心的作用，这就限制了AD干细胞治疗的相关研究进展。而且，从ES细胞分化为具有功能的胆碱能神经元存在多着个步骤和阶段，这些不同分化阶段的细胞是否都能用来治疗AD，哪一阶段的细胞治疗AD最有效等问题也还没有明确答案。另外，相对于治疗PD等病变部位比较局限的神经退行性疾病而言，AD的病变部位可以从基底前脑扩散至皮层、海马和纹状体等广泛的脑区，这就加大了AD的治疗难度。由此，一些必需回答的问题是，在AD发病过程中哪个阶段是干细胞治疗的最佳阶段？在AD病变部位比较广泛的中晚期阶段移植的细胞能否迁移到多个病损脑区？AD症状是否能够通过干细胞治疗得到明显改善吗？最近有研究显示，ES诱导来源的神经干细胞植入宫内胎鼠和新生鼠的大脑皮层后，可以完成远距离迁移和功能投射(Gaspard N，Bouschet T，Hourez R，et al.An intrinsicmechanism of corticogenesis from embryonic stem cells.Nature 2008；455(7211)：351-7)，但干细胞植入成体动物特别是疾病动物脑内后其迁移分化、投射和整合能力如何，还有待深入研究。最后，应用多潜能干细胞进行神经退行性疾病治疗还有一个在脑内形成肿瘤的问题，成瘤的原因有哪些？如何预防和控制？这些问题它直接关系到干细胞治疗的安全性，对治疗效果也有重要影响，因此也是需要着力解决的问题。

综上所述，现有针对AD等神经退行性疾病的各种干预措施尚不能满足临床治疗的需要，而多潜能的细胞正成为治疗的一个新的重要方向，急需在相关的研究方面取得突破。多潜能干细胞具有强大的增值潜力和可塑性，在治疗AD中拥有巨大的潜力，但目前尚缺乏有效的诱导基底前脑胆碱能神经元的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供从多潜能干细胞诱导胆碱能神经元的方法。

在本发明的第一方面，提供一种制备含基底前脑胆碱能神经元或其前体的细胞群的方法，包括：

(1)培养多潜能干细胞，形成拟胚体(EB)；和

(2)培养拟胚体，以骨形态发生蛋白9(BMP9)和音猬因子(Sonic hedgehog；Shh)诱导；获得含基底前脑胆碱能神经元或其前体的细胞群。

在一个优选例中，步骤(2)中，培养拟胚体6±1(较佳地6±0.5)天后，以音猬因子(Sonic hedgehog；Shh)诱导；或

培养拟胚体8±1(较佳地8±0.5)天后，以骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导。

在另一优选例中，在加入骨形态发生蛋白9的2±1(较佳地2±0.5)天后，收获细胞群，该细胞群为含基底前脑胆碱能神经元前体的细胞群；或

在加入骨形态发生蛋白9后2±1(较佳地2±0.5)后，进行单细胞贴壁培养；单细胞贴壁培养4±2天(较佳地4±1天；更佳地，4±0.5天)后收获细胞群，该细胞群为含基底前脑胆碱能神经元的细胞群。

在另一优选例中，在单细胞贴壁培养时，采用N2培养液培养。

在另一优选例中，骨形态发生蛋白9诱导6±2天(较佳地，诱导6±1天；更佳地，诱导6±0.5天)；和/或

音猬因子诱导4±2天(较佳地，诱导4±1天；更佳地，诱导4±0.5天)。

在另一优选例中，所述的音猬因子的终浓度是300±200(较佳地300±100；更佳地300±50；也可以高于500ng/ml，浓度较高的Shh具有较好的诱导效果；但综合考虑经济，故采取300ng/ml左右浓度)ng/ml；和/或

所述的骨形态发生蛋白9的终浓度是5-10ng/ml。

在另一优选例中，步骤(1)中，培养多潜能干细胞2±0.5天，形成拟胚体。

在另一优选例中，步骤(1)中，采用添加KSR的GMEM无血清培养液培养多潜能干细胞；或步骤(2)中，采用N2B27培养液培养细胞。

在另一优选例中，步骤(1)中，通过悬浮培养法培养多潜能干细胞。

在另一优选例中，培养过程中，隔天更换新鲜的培养液。

在另一优选例中，所述方法还包括：(3)从含基底前脑胆碱能神经元的细胞群中分离出基底前脑胆碱能神经元。

在另一优选例中，采用特异性识别基底前脑胆碱能神经元(如其表面标志物，更具体地如BF1和ChAT)的结合分子来分离出基底前脑胆碱能神经元。

在另一优选例中，所述的多潜能干细胞选自(但不限于)：胚胎干细胞(ES)或诱导多能干细胞(iPS)。

在另一优选例中，多潜能干细胞是非人哺乳动物(如鼠)的胚胎干细胞。

在本发明的另一方面，提供一种含基底前脑胆碱能神经元或其前体的细胞群，其通过前面所述的方法制备获得。

在另一优选例中，所述细胞群中基底前脑胆碱能神经元和其前体占40％以上(较佳地45％以上)。

在本发明的另一方面，提供所述的含基底前脑胆碱能神经元的细胞群的用途，用于制备增加脑内(如基底核内)基底前脑胆碱能神经元的组合物(如药物)。

在另一优选例中，所述的组合物还用于：

制备预防、缓解或治疗神经退行性疾病(如阿尔茨海默症(AD))的组合物(如药物)；或

制备改善认知能力的组合物(如药物)；或

制备提高记忆的组合物(如药物)。

在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其包括：

有效量的所述的含基底前脑胆碱能神经元或其前体的细胞群；以及

药学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种骨形成蛋白9的用途，用于以多潜能干细胞作为起始细胞来制备含基底前脑胆碱能神经元的细胞群。

在本发明的另一方面，提供一种音猬因子和骨形成蛋白9(的试剂组合)的用途，用于以多潜能干细胞作为起始细胞来制备含基底前脑胆碱能神经元的细胞群。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、将多能干细胞和iPS特异的高效诱导成胆碱能神经元的诱导体系。

A.图示本发明所建立的高效的双因子小鼠胚胎干细胞和iPS在无血清培养体系中向胆碱能神经元诱导分化的过程。

B.对分化至不同时期的细胞进行免疫染色和计数分析。

C.为了检测本发明人所建立的这个高效的胆碱能诱导体系的特异性，在诱导的第16天，对各个不同亚型的神经元Marker通过免疫染色进行检测，包括胆碱能神经元标志物ChAT，GABA能神经元标志物GAD65，谷氨酰胺能标志物vGLUT1/2和多巴胺能神经元标志物TH。对照组为非诱导的但其它培养情况与诱导组相同的细胞。

D.对C中免疫染色的细胞计数和统计分析的结果。

E.利用Real-time PCR对上述神经元Marker和5-羟色胺能标志物TPH1、TPH2的mRNA水平进行检测。

F.为了证实诱导得到的ChAT阳性细胞是成熟的神经元，对诱导至16天的细胞进行ChAT和NeuN双荧光染色，结果显示，与对照组(不给予Shh/BMP9处理，其它培养相同)相比，Shh/BMP9处理能显著提高ChAT和NeuN双阳性细胞的数量，证明诱导得到的ChAT阳性细胞是成熟的神经元。

G.对F组的实验进行细胞计数和统计分析，显示ChAT和NeuN双阳性细胞占NeuN阳性细胞的90％。

图2、利用本发明所建立的诱导体系得到的胆碱能神经元是基底前脑胆碱能神经元。

A.验证Isl1和HB9在体内的表达模式。

B.对Shh/BMP9和Shh/RA诱导至12天的细胞进行Isl1和HB9双荧光染色，其中Shh/RA诱导作为Shh/BMP9诱导方法的对照。

C.对B组的实验进行细胞计数和统计分析。

D.对Shh/BMP9诱导至12天的细胞进行ChAT和Isl1，或者ChAT和前脑标志物BF1，或者是Isl1和BF1，或者是Isl和腹侧前脑Marker Nkx2.1的一系列双荧光染色。

E.对D组的实验进行细胞计数和统计分析。

F.用Real-time PCR检测Shh/BMP9诱导至12天的细胞中一系列位置信息Marker基因的表达变化。

图3、利用本发明所建立的诱导体系得到的胆碱能神经元能在体外形成有功能的突触。

A.利用ELISA分析，检测小鼠胚胎干细胞向基底前脑胆碱能神经元分化至16天的细胞中乙酰胆碱的含量和乙酰胆碱酯酶的活性。

B.利用全细胞记录的方式检测小鼠胚胎干细胞向基底前脑胆碱能神经元分化至15-16天或20-22天的细胞的电生理特性。

C.把细胞钳制在-75mV(抑制性突触后电位的反转电位)可以单独记录到兴奋性突触后电位，把细胞钳制在0mV(兴奋性突触后电位的反转电位)可以单独记录到抑制性突触后电位。

D.双细胞膜片钳记录的结果显示，刺激Shh/BMP9诱导的细胞发放的动作电位，可以在突触后的细胞上记录到突触电位，并且该突触后电位可以被谷氨酸受体的阻断剂(CNQX和APV)所阻断。

E.双细胞膜片钳记录的结果显示，Shh/BMP9诱导的细胞之间还能形成电突触连接。

图4、将诱导的基底前脑胆碱能神经元前体(诱导至第10天的产物)移植到AD小鼠的基底核能改善小鼠的认知功能。

A和B.通过测试小鼠找到隐藏平台的时间(Latency)来判断它们的空间学习能力。A为5XFAD小鼠及其对照，B为APP/PS1AD小鼠及其对照。

C和D.对小鼠进行probe测试，以检测小鼠的空间记忆能力。C为5XFAD小鼠及其对照，D为APP/PS1AD小鼠及其对照。

图5.移植BFCN细胞(诱导至第10天的产物)在AD小鼠大脑中2个月的特异性分布和向神经元分化命运决定。

A.带有绿色荧光(EGFP)的移植细胞在小鼠大脑基底核内的分布。

B.小鼠大脑的解剖示意图和EGFP阳性细胞在大脑各个区域的分布。

C.利用免疫染色检测存活下来的EGFP阳性细胞在NBM中分化的命运。

D.对NeuN阳性细胞的神经元亚型检测发现，超过一半的为ChAT阳性，并具有粗短的突起。

E.对C和D组实验的细胞计数和统计分析。

图6、移植细胞(诱导至第10天的产物)能整合到体内胆碱能神经元的投射束中并发挥功能。

A.用Avidin-PE染色标示出用全细胞记录方法所检测的细胞，箭头指示出所检测的细胞整合到了基底核的投射束中。

B.选择轴突的长度约为700μm的神经元作为典型个例，展示所记录的基底前脑神经元的形态和其突起投射的方向和趋势。

C.各类细胞中，EGFP阳性细胞的百分比统计。

D-G.免疫组化的方法验证所检测细胞所具有的神经元特性。

H.小鼠前脑基底区EGFP阳性细胞的电生理特性。

I.绝大多数EGFP阳性细胞中，都能同时检测到兴奋性和抑制性突触后电位，mEPSPs的平均频率为4.8±0.5Hz，而sIPSPs的平均频率为1.3±0.1Hz。

图7、将诱导至第10天的EB包埋，冰冻切片后进行Oct4，Nestin，Tuj1，NeuN和ChAT免疫染色；上面一排是代表上述Marker的红色荧光，中间为显示细胞总数的蓝色DAPI染色，下面一排是红色和蓝色重叠在一起后情况。

图8、本发明人所建立的这个诱导体系还能高效特异的将小鼠iPS细胞诱导为胆碱能神经元。

A.与对照组(不给予Shh/BMP9处理，其它培养相同)相比，Shh/BMP9处理能显著提高ChAT阳性的胆碱能神经元的数量。

B.利用Real-time PCR检测ChAT，GAD65，vGLUT2，TH和TPH2mRNA的表达水平。

C.全细胞记录由iPSC诱导来的细胞能够发放动作电位和自发突触后电流。

图9、通过检测AD小鼠脑中的Aβ沉淀物以确定两株AD小鼠5XFAD和APP/PS1的病理表现。

A.与文献报道相吻合，在两个月(Mon)大的5XFAD小鼠的海马支脚(subiculum)和深层大脑皮层中，有Aβ沉淀物开始形成；等到5XFAD三个或四个月(Mon)大时，其大脑的绝大部分区域中已经有Aβ沉淀物大量沉积。

B.与5XFAD相比，APP/PS1小鼠的病理表现较晚。直到APP/PS1小鼠六个月大时，其大脑中才有Aβ沉淀物开始形成；到其九个月大时，Aβ沉淀物在大脑的绝大部分区域出现。

具体实施方式

本发明人经过长期而广泛的研究，首次揭示一种可诱导多潜能干细胞向基底前脑胆碱能神经元分化的效率的方法，所述方法包括采用骨形态发生蛋白9(BMP9)或联合采用BMP9与Sonic hedgehog(Shh)诱导拟胚体使之分化为基底前脑胆碱能神经元，并采取合适的时间点进行悬浮培养或贴壁培养。本发明的方法简单高效，获得含有高比例基底前脑胆碱能神经元的细胞群。

多潜能干细胞(如胚胎干细胞)的定向分化的难点在于：①定向分化效率低；②分化的目的细胞纯度低，难于富集。本发明人针对这几个难题，对哺乳动物干细胞向基底前脑胆碱能神经元的分化进行了深入探索和优化，使分化效率大大提高，还通过基因表达分析验证了富集到的细胞群的真实性。经过动物试验发现，本发明诱导获得的基底前脑胆碱能神经元可以有效地增加脑内成熟胆碱能神经元数量，对于改善记忆能力、缓解神经退行性疾病有显著的作用。

骨形态发生蛋白9(BMP9)和Sonic hedgehog(Shh)

Sonic hedgehog(Shh)是一种已知的蛋白，为一种信号调节因子。现有研究认为：Shh信号在前列腺导管形成分化以及基质-上皮的相互作用等机制中发挥着重要作用，从而调节前列腺发育、生长和细胞增殖；在整个神经系统发育过程中，Shh信号发挥着重要的作用，指导腹侧各种类型神经细胞的分化。

在本发明中，所用的Shh蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。所述的Shh蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组Shh蛋白。优选的，本发明可采用重组的Shh蛋白。目前，重组的Shh蛋白已经是商业化的产品了，例如可购自R&D公司。

任何适合的Shh蛋白均可用于本发明。所述的Shh蛋白包括全长的Shh蛋白或其生物活性片段。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的Shh蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。Shh蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域的公知技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。

任何一种Shh蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，Shh蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的Shh蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长Shh蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长Shh蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明也可采用经修饰或改良的Shh蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的Shh蛋白。所述经过修饰或改良的Shh蛋白可以是一种Shh蛋白的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的Shh蛋白或者基因可以是与天然存在的Shh蛋白或基因虽然具有一定的不同点，但也具有诱导基底前脑胆碱能神经元的活性，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响Shh蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。

任何与所述的Shh蛋白同源性高(比如与Shh蛋白的同源性为70％或更高，优选的，同源性为80％或更高，更优选的，同源性为90％或更高)的、且具有Shh蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。

BMP是正常胚胎时期骨、牙组织内部骨和成年骨修复中较为重要的诱导分化因子。其中，BMP9蛋白是一种与成骨相关的蛋白，已经发现其能定向诱导多潜能干细胞成骨分化的能力。同时，BMP9对于胆碱能神经元发育也具有重要的作用。

在本发明中，所用的BMP9蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。所述的BMP9蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组BMP9蛋白。优选的，本发明可采用重组的BMP9蛋白。目前，重组的BMP9蛋白已经是商业化的产品了，例如可购自R&D公司。

任何适合的BMP9蛋白均可用于本发明。所述的BMP9蛋白包括全长的BMP9蛋白或其生物活性片段。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的BMP9蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。BMP9蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域的公知技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。

任何一种BMP9蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，BMP9蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的BMP9蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长BMP9蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长BMP9蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明也可采用经修饰或改良的BMP9蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的BMP9蛋白。所述经过修饰或改良的BMP9蛋白可以是一种BMP9蛋白的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的BMP9蛋白或者基因可以是与天然存在的BMP9蛋白或基因虽然具有一定的不同点，但也具有诱导基底前脑胆碱能神经元的活性，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响BMP9蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。

任何与所述的BMP9蛋白同源性高(比如与BMP9蛋白的同源性为70％或更高，优选的，同源性为80％或更高，更优选的，同源性为90％或更高)的、且具有BMP9蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。

本发明人在深入研究后第一次发现，SHH/BMP9顺序联合诱导，对于从多潜能干细胞高效形成基底前脑胆碱能神经元具有重要的作用。

制备含基底前脑胆碱能神经元的细胞群

本发明提供一种制备含基底前脑胆碱能神经元的细胞群的方法，所述方法包括：(1)培养多潜能干细胞，形成拟胚体(EB)；和(2)培养拟胚体，以骨形态发生蛋白9(BMP9)和音猬因子(Sonic hedgehog；Shh)诱导；获得含基底前脑胆碱能神经元或其前体的细胞群。并且，在加入骨形态发生蛋白9的2±1天后可形成基底前脑胆碱能神经元的前体细胞，该前体细胞可用于移植体内；或可进一步地进行单细胞贴壁培养；单细胞贴壁培养4±2天后收获细胞群，该细胞群为含基底前脑胆碱能神经元的细胞群。进一步地，单细胞贴壁培养更长的时间，则可获得更为成熟的基底前脑胆碱能神经元的细胞群。

本发明中，所述的“多潜能干细胞”在制备过程中，首先需要使未分化的多潜能干细胞形成拟胚体，拟胚体的培养是本领域人员已知的技术。作为本发明的优选方式，采用悬浮培养的方式制备拟胚体。培养多潜能干细胞以获得拟胚体的时间可以根据本领域人员的经验来确定。作为本发明的优选方式，诱导拟胚体的时间在36-60小时，如48小时(2天)左右。本领域人员也可以通过在诱导过程中分析细胞群中多个细胞的性质来确定合适的时间。

在获得拟胚体后，培养拟胚体适当的时间，之后采用BMP9蛋白连续诱导，以促进拟胚体向神经元细胞的分化。BMP9蛋白的诱导显示在细胞悬浮状态下进行，2±1天后即可获得基底前脑胆碱能神经元的前体细胞，该前体细胞可用于移植体内；或可进一步地进行单细胞贴壁培养，以为细胞提供良好的分化环境，促进成熟细胞的生成。

作为本发明的优选方式，不仅应用BMP9进行诱导，还应用了Shh进行诱导，Shh较佳地在培养拟胚体6天左右添加；也即早于BMP9的添加。相比于仅应用BMP9的诱导，还添加Shh进行诱导的优点在于：使更多诱导的胆碱能神经细胞具有了前脑基底的位置特征。

作为本发明的优选方式，在用于诱导时，所述的骨形态发生蛋白9的终浓度较佳地是5-10ng/ml或者，所述的Sonic hedgehog的较佳地终浓度是300-500ng/ml。本发明人发现，上述浓度是适宜高效率地诱导细胞定向分化为基底前脑胆碱能神经元的。

作为本发明的优选方式，步骤(2)中，单细胞贴壁培养之前，采用N2B27培养液培养细胞；在单细胞贴壁培养时，采用N2培养液培养。N2B27和N2为一种已知的用于干细胞培养和诱导的培养基。本领域人员均了解的是，这些培养基原料均可以通过商购的方式获得。

作为本发明的一种方式，还可以从富含基底前脑胆碱能神经元的细胞群中分离所述的基底前脑胆碱能神经元。本发明对分离基底前脑胆碱能神经元的方法没有特别的限制，可采用本领域常规使用的方法，例如，采用一些可特异性识别基底前脑胆碱能神经元特异性的表面标志物的结合分子。目前，完全可以通过一些细胞分选的仪器来实现特定细胞的分离、纯化。

本发明实施例中涉及的胚胎干细胞或多潜能干细胞是非人哺乳动物的胚胎干细胞或多潜能干细胞，或是通过商业途径购买的，而并非通过破坏胚胎的方式获得的胚胎干细胞或多潜能干细胞。所述的胚胎干细胞或多潜能干细胞优选的是非人哺乳动物来源的，如兔、鼠、羊、猪、猴。例如，所述的胚胎干细胞或多潜能干细胞是鼠源的。

早在1998年人胚胎干细胞和胚胎生殖细胞就已经建系成功，例如1998年Thomson领导的小组从14个囊胚中最终建立起5个人类ES细胞系：H1、H13、H14、H7和H19；Gearhart领导的小组从5-9周龄的流产胎儿的性腺嵴及肠系膜中分离原始的干细胞，以期避免因直接利用胚胎所造成的伦理学上的麻烦。见晁岚等，“人胚胎干细胞的研究进展”，《现代妇产科进展》，2003年7月第12卷第4期。基于上述工作，在2000年的2月份，Wisconsin Alumni Research Foundation(WARF)建立了WiCell，WiCell是一家非官方的、非盈利性的附属机构，它以低费用向合格的科学家分配人胚胎干细胞。此外，提供这种现成的人胚胎干细胞的机构还包括NSCB(NationalStem Cell Bank)、ES CELL INTERNATIONAL、nov cell、TECHNION-HOME TOISRAEL’S NOBEL SCIENTISTS、UCSF(University of California San Fransisco)等机构。

含基底前脑胆碱能神经元的细胞群

经本发明人验证，通过本发明的上述方法，在诱导多潜能干细胞8天后，ChAT阳性的胆碱能神经元第8天开始出现，之后的6天内其数量迅速上升至总细胞数的45％，并维持在该数值直至诱导过程的第22天，说明本发明的方法的诱导基底前脑胆碱能神经元效率超过40％，这是非常高的诱导效率。且，本发明的方法只是诱导ChAT表达阳性，对GAD65，vGLUT2，TH，TPH1和TPH2的表达均没有显著的刺激；可见，这种诱导是特异性的，不会诱导产生其它亚型的神经元。并且，本发明的方法可显著提高ChAT和NeuN双阳性细胞的数量，证明诱导得到的ChAT阳性细胞是成熟的神经元。在ChAT阳性细胞中Isl1和BF1都有不同程度的表达，而BF1和Nkx2.1在Isl1阳性细胞中也有不同程度的表达，说明多潜能干细胞来源的胆碱能神经元能表达多种前脑前端或腹侧的标志物，具有基底前脑的特性。

因此，本发明提供了一种含(富含)基底前脑胆碱能神经元的细胞群，所述细胞群中基底前脑胆碱能神经元占所有细胞的30％以上，更佳地40％以上，更佳地45％以上。

本发明还包括来从富含基底前脑胆碱能神经元的细胞群中分离或纯化获得的基底前脑胆碱能神经元(或富集度或浓度更高的含基底前脑胆碱能神经元的细胞群)。

将本发明的方法诱导获得的基底前脑胆碱能神经元(至第16天的阶段多为同时表达TUJ-1和NeuN的成熟神经元)移植到AD小鼠的基底核，结果证实其空间记忆能力得以改善，认知功能得以改善。移植到体内的BFCN前体特异性的多分布于基底核(nucleus basalis of Meynert，NBM)中，并最终在体内胆碱能神经元微环境中分化为成熟的胆碱能神经元，并且能够整合到接受移植小鼠的胆碱能神经元投射束中，发挥功能。

因此，本发明还提供了含基底前脑胆碱能神经元的细胞群的用途，用于制备增加脑内胆碱能神经元的组合物；或用于制备预防、缓解或治疗脑内胆碱能神经元缺失疾病的组合物；或用于制备预防、缓解或治疗神经退行性疾病(如阿尔茨海默症)的组合物；或用于制备改善认知能力的组合物；或用于制备提高记忆的组合物。

组合物

如本文所用，术语“本发明的组合物”包括药物组合物、饮食补充剂、保健品组合物，只要它们含有有效量(如用于小鼠基底脑内时，5×10⁴～10⁵个细胞)的本发明的含基底前脑胆碱能神经元的细胞群作为活性成分。

本文所用，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的物质，即有合理的效益/风险比的物质。

如本文所用，“药学上可接受的载体(药学载体)”是用于将含基底前脑胆碱能神经元的细胞群传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂、培养液或赋形剂。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

可将本发明的含基底前脑胆碱能神经元的细胞群与适当的药学载体混合，制备成药物组合物或食品组合物的形式。所述的药物组合物或食品组合物对于需要的群体(例如神经元丢失严重或神经退行性疾病的患者)是有用的。

所述的药学上可接受的载体可以是固态的或液态的，一般根据所用的给予方式而选择类型。含基底前脑胆碱能神经元的细胞群可以液体形式给予。例如液体剂型可含有，适当的细胞培养成分、溶剂、防腐剂、乳化剂、悬浮剂、稀释剂、甜味剂、增稠剂和助溶剂。

在本发明中，作为活性成分的小分子蛋白片段混合物可用任何合适的剂量，取决于动物或人的体重、身体状况(如神经元的丢失情况)等因素。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I.材料和方法

一、胚胎干细胞培养及其向基底前脑胆碱能神经元的分化

小鼠胚胎干细胞的生长和维持

小鼠胚胎干细胞系(mouse Embryonic Stem Cell，mES或mESC)R1/E(购自中科院上海生化细胞所干细胞技术平台)，CE3(或称为CE-3，购自中科院上海生化细胞所干细胞技术平台)和小鼠iPS细胞(购自生化细胞所干细胞技术平台)生长在添加1000U/mL LIF(Leukemia Inhibitory Factor)的常规干细胞培养液和经过丝裂霉素C(mitomycin-C)处理过的小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblast，MEF)上，以维持其未分化状态。MEF细胞为胚胎干细胞提供支持和营养，并分泌一些抑制其分化的因子。其中，从CE3细胞系诱导得到的神经元前体，神经元和胶质细胞能发放绿色荧光，从而能够方便地跟踪和辨别出移植到体内的神经元前体和由该前体分化的成熟神经元，所以以下实施例所涉及的体内移植实验所用的神经元前体都是从CE3细胞诱导来的。

小鼠胚胎干细胞向基底前脑胆碱能神经元的诱导分化

A.Shh/BMP9双因子诱导

小鼠胚胎干细胞用0.05％Trypsin-EDTA消化成单细胞，计数后稀释至3×10⁴细胞/毫升，接种于用于悬浮培养的非贴壁培养皿中，用添加KSR (Knockout serumreplacement，KSR)的GMEM分化培养液进行培养，将此天定为向胆碱能神经元分化的第0天(D0)。2天后(D2)，拟胚体(Embryonic bodies，EB)形成，之后转入N2B27培养液中继续培养4天。第6天(D6)开始连续4天向N2B27中添加重组Shh(300ng/ml，购自R&D)。第8天(D8)开始连续6天向培养中添加BMP9(10ng/ml；购自R&D)至第14天(D14)停止添加。第10天(D10)，把细胞(该时间，已获得基底前脑胆碱能神经元前体)消化(0.05％胰酶处理10分钟)成单细胞，将其贴在经过PDL(多聚赖氨酸，促进细胞贴壁)预处理的培养皿中，密度为1.25×10⁵细胞/cm²，用N2培养液培养直至最后。在整个培养过程中都是隔天换液，换液的同时添加必要的生长因子Shh或BMP9。主要试剂的加入流程如图1A。

其中，N2的100×储存液(10ml)如下：

混合1mL胰岛素(2.5mg/mL)，1mL apo-转铁蛋白(10mg/mL)，0.67mL BSA(5mg/mL)，33uL孕酮，(2ug/mL)，100uL腐胺(1.6mg/mL)，10uL亚硒酸钠(3mM)，7.187mL DMEM/F12。使用前进行稀释。

其中，N2B27培养液如下：

配制10mL，其中混合100uL N2，200uL B27进入Neurobasal培养基以及5mLDMEM/F12。

B.BMP9单因子诱导

该诱导体系与Shh/BMP9双因子诱导相比，除了在诱导过程中不使用Shh以外，其它步骤都相同。通过免疫荧光染色、Real-time PCR和电生理等技术，本发明人对BMP9单因子诱导来的神经元进行了一系列的定性研究，并与Shh/BMP9双因子诱导来的神经元进行对比，证明BMP9单因子诱导也是一个有效的特异的基底前脑胆碱能神经元诱导体系。

C.Shh/RA诱导方法

Shh/RA(阳性对照)诱导方法见cell，2002Wichterle，H.，Lieberam，I.，Porter，J.A.，and Jessell，T.M.(2002).Directed differentiation of embryonic stem cells into motorneurons.Cell 110，385-397。

对小鼠胚胎干细胞来源的胆碱能神经元的定性检测

细胞免疫荧光检测

参考已发表的方法(Xia C等；Induction of a high population of neural stem cellswith anterior neuroectoderm characters from epiblast-like P19 embryonic carcinoma cells.Differentiation 2007；75(10)：912-27)，对诱导至不同时期的细胞中胆碱能神经元特异性标志物(marker)的表达进行细胞免疫荧光检测，所使用的一抗主要包括anti-Oct4(多能干细胞标志物)(1∶200，Santa Cruz)，anti-Nestin(神经干细胞标志物)(1∶200，Upstate)，anti-Tuj1(未成熟神经元标志物)(1∶500；Sigma)，anti-NeuN(成熟神经元标志物)(1∶300，Millipore)，anti-GFAP(星形胶质细胞标志物)(1∶300，Abcam)，anti-O4(少突胶质细胞标志物)(1∶200，Chemicon)，anti-Islet1(1∶300，DSHB)，anti-Nkx2.1(腹侧前脑标志物)(1∶500，Dako)，anti-GAD65(GABA能神经元标志物)(1∶200，Sigma)，anti-vGLUT1/2(谷氨酰胺能标志物)(1∶200，Synaptic Systems)和Aβ(1∶300，Convance)，anti-BF1(前脑标志物)(1∶100，Abcam)和anti-TH(多巴胺能标志物)(1∶500，Millipore)，anti-Ki67(细胞分裂标志物)(1∶100，Santa Cruz)，anti-HB9(运动神经元标志物)(1∶500，DSHB)和anti-ChAT(胆碱能神经元标志物)(1∶200，Millipore)。

Real-time PCR检测

主要对各种胆碱能神经元标志物和各种不同神经元标志物在诱导至不同时期的细胞中的表达水平进行检测，主要包括ChAT(胆碱能神经元标志物)，TPH1(5-羟色胺能标志物)，TPH2，Islet1，Nkx2.1(前脑位置信息的标志物)，BF1(前脑位置信息的标志物)，Six3(前脑位置信息的标志物)，En2(中后脑组织标志物)，Gbx2(前脑组织标志物)，Hoxb9(中后脑和脊髓的标志物)，HB9，GAD65(GABA能神经元标志物)，vGLUT2(谷氨酰胺能标志物)，TH(多巴胺能神经元标志物等。

PCR引物序列如表1。

表1

膜片电生理检测

依据常规的电生理方法，用全细胞记录的方式检测小鼠胚胎干细胞来源的胆碱能神经元在体外动作电位(action potential，AP)，抑制性突触后电位(inhibitorypostsynaptic potentials，IPSP)和兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potentials，EPSP)。记录的细胞均为体外分化至15-16天或20-22天的细胞。

胆碱能活性的检测

小鼠胚胎干细胞向基底前脑胆碱能神经元分化至16天，检测分化细胞中乙酰胆碱(acetylcholine ACh)和乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase AChE)的活性。所用试剂为Amplex Red Acetylcholine/Acetylcholinesterase Assay Kit(Molecular Probe)，实验操作按试剂盒中的实验操作手册进行。

二.体外诱导得到的胆碱能神经元的体内移植

实验用的动物模型

本实施例中所用的动物模型是杂合的转基因AD小鼠模型，APPswe/PS1dE9(APP/PS1)和5XFAD，购自Jackson Laboratory。所有的实验操作均得到了上海生命科学院实验动物道德委员会的批准。

利用脑立体定向注射(Stereotaxic surgery)技术把干细胞来源的基底前脑胆碱能神经元(basal forebrain cholinergic neuron，BFCN)前体移植到AD小鼠大脑内。基底前脑胆碱能神经元前体采取如前所述的Shh/BMP9双因子诱导法，以小鼠胚胎干细胞系CE3起始诱导，体外诱导至第10天而获得，其中以基底前脑胆碱能神经元前体为主，也包括部分早期胆碱能神经元。

所有实验动物均为4月龄的5XFAD或10月龄的APPswe/PS1dE9。小鼠被三溴乙醇(0.6ml/25克体重)麻醉以后，置于立体定位仪上，大脑用两个耳棒以及牙套固定住，将头顶的毛剃掉，打开上皮后，去除骨膜。本发明人所用的立体定位值为：前后(anterior-posterior AP)-1.06mm(5XFAD)，-1.58mm(APP/PS1)，左右(ML)：±2.02mm，背腹(dorso-ventral，DV)-3.68mm。用5μl的微量进样器(Hamilton，33-gauge)将2ul干细胞来源的胆碱能神经元前体(8×10⁴个细胞，实验组)或2ul N2培养液(Sham对照组)按照上述位置缓缓的注射进入基底核(nucleus basalis of Meynert NBM)，时间为2分钟。注射完成后，缓缓移出注射器，向手术部位涂抹抗生素软膏并缝合。将手术后的小鼠放置在热毯上使其恢复清醒，然后单独笼养直至对其进行行为学检测。年龄相匹配的野生型小鼠和未接受细胞移植的转基因AD小鼠作为本实验的阴性对照。本实验中所用的神经元前体是通过Shh/BMP9双因子诱导得到的。

行为学实验：水迷宫

水迷宫实验在细胞移植手术后两个月进行，本发明人所用的水迷宫带有隐蔽的逃生平台，与以前文献报道的一致(Vorhees and Williams，2006)。迷宫为圆桶状，直径为1.2米，被人为的分为4个象限。直径为11厘米的逃生平台置于其中一个象限的中央，并低于水面1厘米。用无毒的白色素将水迷宫内的水混合成不透明的乳白色，并保持25℃恒温。随机对各个实验组和对照组中的小鼠进行行为学的训练及其随后的检测，并根据该随机顺序对所有小鼠进行重编号。每次水迷宫训练持续6天，每一天训练4场，记录小鼠找到隐藏逃生平台的时间(Latency)，该时间值能反映出小鼠的空间学习能力。6天训练结束后，移去隐藏平台，对经过训练的小鼠进行60-秒测试：将小鼠从离平台位置最远的一点放入水中，让其在水中自由游动60秒，记录小鼠在60秒内待在各个象限的时间(time in each quadrant)以及穿越前平台的次数(crossings)，以反映小鼠对空间的记忆能力。所有的实验数据都用Etho Vision XT软件分析。

膜片电生理检测

用常规全细胞记录的方式检测小鼠胚胎干细胞来源的且移植到基底核的胆碱能神经元的动作电位(action potentials，AP)，抑制性突触后电位(inhibitory postsynapticpotentials，IPSP)和兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potentials，EPSP)。把水迷宫检测后的5XFAD小鼠用戊巴比妥盐(30mg/kg体重)深度麻醉后，迅速取出大脑并放入冰冷的氧饱和蔗糖替代ACSF，在该ACSF中，NaCl被equiosmolar蔗糖取代。在蔗糖替代ACSF中，用薄片切片机(microtome，VT1000S，Leica)把小鼠大脑且成200um的冠状切片。将含有基底核的脑切片浸泡在一般的ACSF中，一小时之后，将其放入Chamber中，并用氧饱和的ACSF连续灌注，维持在36-36.5℃进行上述各项电生理指标检测。

II.实施例

实施例1、建立多能干细胞和iPSC特异的诱导成胆碱能神经元的体系

本发明所建立的高效的Shh/BMP9双因子小鼠胚胎干细胞(ESC，也称为ES)(或iPSC，也称为iPS)在无血清培养体系中向胆碱能神经元诱导分化的过程见图1A。该诱导方法中用到的两个重要的蛋白因子是Sonic hedgehog(Shh)和骨形态发生蛋白9(Bone Morphogenetic Proteins 9，BMP9)。Shh是由位于神经管腹侧的脊索分泌的蛋白因子，贯穿整个神经管腹侧，形成一个从腹侧到背侧的浓度逐渐降低的浓度梯度。Shh是诱导各种腹侧神经元的最关键的一个因子，而受到不同的Shh浓度影响的神经上皮将形成不同的神经元，其中前脑Medial ganglionic eminence(MGE)区域的胆碱能神经元的发育就受到高浓度Shh的调控。所以，为了能有效地从胚胎干细胞诱导得到胆碱能神经元，本发明人在自己的诱导体系中，依次使用Shh和BMP9，并得到了很高的诱导效率。此外，本发明人所建立的单因子诱导体系，即BMP9也有较高的诱导效率，仅次于Shh和BMP9双因子体系。

对分化至不同时期的细胞进行免疫染色和计数分析见图1B，发现代表多能干细胞的Oct4阳性细胞的数量随着诱导的进行快速下降，到第6天其仅占总细胞数的20％；与此相反，代表神经干细胞的Nestin阳性的细胞数量迅速上升，第6天时达到高峰，约占总细胞数量的80％；Tuj1阳性的神经元细胞的数量从诱导的第4天开始上升，至第12天达到高峰，约占总细胞数量的75％；ChAT阳性的胆碱能神经元第8天开始出现，6天之后其数量迅速上升至总细胞数的45％，并维持在这一水平，说明本发明的方法的诱导基底前脑胆碱能神经元效率超过40％；代表成熟神经元的NeuN阳性细胞在诱导的第12天开始出现，10天后其数量迅速上升至总细胞数的50％。该结果证实，本发明人所建立的这个胆碱能诱导体系是非常高效的。通过DAPI细胞核染色计数总细胞数量。

将诱导至第10天的EB包埋，冰冻切片后进行Oct4，Nestin，Tuj1，NeuN和ChAT免疫染色，见图7，上面一排是代表上述Marker的红色荧光，中间为显示细胞总数的蓝色DAPI染色，下面一排是红色和蓝色重叠在一起后情况，以便能直观的显示各类细胞占总细胞数的比例。在第10天的EB中，Oct4阳性的细胞只剩很少的一部分，与之相比，Nestin和Tuj1阳性的细胞占绝大多数，而NeuN和ChAT阳性的细胞则刚刚开始出现。此结果与图1B的统计结果非常吻合。

为了检测本发明人所建立的这个高效的胆碱能诱导体系的特异性，在诱导的第16天，对各个不同亚型的神经元Marker通过免疫染色进行检测，包括胆碱能神经元Marker ChAT，GABA能神经元标志物GAD65，谷氨酰胺能Marker vGLUT1/2和多巴胺能神经元Marker TH，结果见图1C。与对照组相比，在本发明人所建立的这个Shh/BMP9诱导体系能显著提高ChAT阳性的胆碱能神经元的数量，而GAD65，vGLUT1/2和TH阳性细胞的数量不仅很少，且与对照组也没有明显的差别。这个结果显示，该诱导体系可以用来特异的诱导胆碱能神经元或其前体)。同时，BMP9单因子也能特异性的诱导胆碱能神经元。

对图1C中免疫染色的细胞计数和统计分析的结果见图1D，这进一步证实，本发明人所建立的Shh/BMP9双因子和BMP9单因子诱导体系都能高效、特异性地诱导胆碱能神经元，不能有效地诱导其它亚型的神经元；且Shh/BMP9双因子诱导体系效果更佳，获得的基底脑区ChAT阳性细胞数较多。

利用Real-time PCR对上述神经元Marker和5-羟色胺能标志物TPH1、TPH2的mRNA水平进行检测地结果见图1E。与对照组相比，Shh/BMP9诱导只是显著提高ChAT mRNA的水平，对GAD65，vGLUT2，TH，TPH1和TPH2的表达均没有显著的刺激。该结果从基因表达的水平再次验证本发明所建立的Shh/BMP9双因子和BMP9单因子诱导体系是高效特异的胆碱能神经元诱导体系；尤其以Shh/BMP9双因子体系效果较为理想。

为了证实诱导得到的ChAT阳性细胞是成熟的神经元，对诱导至16天的细胞进行ChAT和NeuN双荧光染色，结果见图1F，与对照组相比，Shh/BMP9处理能显著提高ChAT和NeuN双阳性细胞的数量，证明诱导得到的ChAT阳性细胞是成熟的神经元。

对图1F的实验进行细胞计数和统计分析见图1G，显示ChAT和NeuN双阳性细胞占NeuN阳性细胞的90％。

本发明人所建立的这个诱导体系还能高效特异的将小鼠iPS细胞诱导为胆碱能神经元。如图1A进行诱导后，免疫染色显示，Shh/BMP9处理能显著提高ChAT阳性的胆碱能神经元的数量(图8A)。利用Real-time PCR检测ChAT，GAD65，vGLUT2，TH和TPH2mRNA的表达水平，与对照组相比，发现Shh/BMP9显著提高ChAT mRNA的水平，但对其它标志物的基因表达没有显著影响(图8B)。该实验结果证实本发明人所建立的这个诱导体系不仅能高效特异的将小鼠ES细胞诱导为胆碱能神经元，对小鼠iPS细胞的胆碱能神经元诱导也同样有效。

全细胞记录由iPS诱导来的细胞能够发放动作电位和自发突触后电流(spontaneous postsynaptic currents，SPSC)见图8C，证明它们具有成熟神经元的膜特性。

实施例2、利用诱导体系得到的胆碱能神经元是基底前脑胆碱能神经元

文献报道胆碱能神经元主要分布在哺乳动物中枢神经系统中的基底前脑和脊髓内，其中脊髓中的胆碱能神经元就是运动神经元。为了检测诱导得到的胆碱能神经元是基底前脑胆碱能神经元，还是脊髓运动神经元，对诱导得到的胆碱能神经元进行了Isl1(基底前脑胆碱能神经元和脊髓运动神经元的Marker)和HB9(运动神经元Marker)双染色。

免疫组织染色验证Isl1和HB9在体内的表达模式。在12.5天的小鼠胚胎中的染色结果见图2A，Isl1在基底前脑和脊髓中都有表达，而HB9只特异地在脊髓中表达，证明这两个Marker的双荧光染色能用来判定ChAT阳性神经元的位置信息。

对Shh/BMP9和Shh/RA诱导至16天的细胞进行Isl1和HB9双荧光染色，其中Shh/RA诱导(获得的是HB9阳性的脊髓胆碱能运动神经元)可以作为Shh/BMP9诱导方法的阳性对照，结果见图2B。与阴性对照组相比，发现Shh/BMP9处理能显著增加Isl1(Islet1)阳性细胞的数量，但几乎不能诱导出HB9阳性的细胞；Shh/RA能诱导出少量Isl1和HB9双阳性的细胞，并且Isl1阳性细胞的数量明显比Shh/BMP9组少，提示(Isl1阳性增加、HB9阳性没有即可证明)本发明Shh/BMP9双因子诱导得到的胆碱能神经元是基底前脑胆碱能神经元。与Shh/BMP9双因子诱导效果类似，BMP9单因子诱导得到的胆碱能神经元也是基底前脑胆碱能神经元(basal forebraincholinergic neuron BFCN)。

对B组的实验进行细胞计数和统计分析，结果见图2C，显示Shh/BMP9处理得到Isl1阳性的细胞大约占细胞总数的40％，其中90％是HB9阴性。而作为阳性对照的Shh/RA可以诱导得到Isl1阳性的细胞大约占细胞总数的30％，其中70％是HB9阳性。BMP9单因子处理也可以得到较好的效果，效果仅次于Shh/BMP9双因子。该统计结果与B组结果相吻合，进一步提示本发明人用双因子和单因子诱导都能得到的胆碱能神经元是基底前脑胆碱能神经元。

为了进一步证实小鼠胚胎干细胞来源的胆碱能神经元的基底前脑特性，对Shh/BMP9诱导至16天的细胞进行ChAT和Isl1，或者ChAT和前脑Marker BF1，或者是Isl1和BF1，或者是Isl和腹侧前脑标志物Nkx2.1的一系列双荧光染色，结果见图1D，显示Isl1和BF1在ChAT阳性细胞中都有不同程度的表达，而BF1和Nkx2.1在Isl1阳性细胞中也有不同程度的表达，说明胚胎干细胞来源的胆碱能神经元能表达多种前脑前端或腹侧的标志物，提示具有基底前脑的特性。

对图1D的实验进行细胞计数和统计分析见图1E，结果显示ChAT阳性细胞细胞中Isl1阳性细胞约占50％，BF1阳性细胞约占25％；Isl1阳性细胞中BF1阳性细胞约占50％，Nkx2.1阳性细胞约占10％，进一步证实了图1D中的实验结果。

用Real-time PCR检测Shh/BMP9诱导至16天的细胞中一系列位置信息Marker基因的表达变化，结果见图1F显示，与对照组相比，Shh/BMP9能使Isl1的表达水平提高约20倍，其它代表前脑位置信息的标志物基因Nkx2.1，BF1和Six3的mRNA水平也有不同程度的显著上升；与之相反，中后脑和脊髓的标志物基因的表达则受到了不同程度的显著抑制，包括En2，Gbx2，Hoxb9和HB9。BMP9单因子处理可以得到与Shh/BMP9双因子类似的效果。该结果进一步证明胚胎干细胞来源的胆碱能神经元具有基底前脑的特性。

实施例3、利用本发明的诱导体系得到的胆碱能神经元能在体外形成有功能的突触

为了验证本发明人诱导得到的前脑基底胆碱能神经元在体外是有功能的，本发明人做了下面的系列检测：

利用常规的ELISA分析方法，检测小鼠胚胎干细胞向基底前脑胆碱能神经元分化至16天的细胞中乙酰胆碱的含量和乙酰胆碱酯酶的活性，结果如图3A，发现Shh/BMP9和BMP9都能显著提高细胞中乙酰胆碱的含量和乙酰胆碱酯酶的活性，证明诱导得到的胆碱能神经元与体内成熟的胆碱能神经元乙酰胆碱的合成和代谢功能方面类似。

利用全细胞记录的方式检测小鼠胚胎干细胞向基底前脑胆碱能神经元分化至15-16天或20-22天的细胞的电生理特性。随机挑取的37个15-16天和42个20-22天的细胞中，各有66.7％的可以发放连续的动作电位，证明它们具有成熟神经元的膜特性。大约有25.5％的分化到15-16天(DIV15/16)细胞和27.8％分化到20-22天(DIV20/22)的细胞对500ms long-step电流刺激能产生一次性动作电位。大约有7.8％的15-16天细胞和5.5％的20-22天的细胞不能发放动作电位，表明它们可能是胶质细胞或不成熟的神经元，如图3B。

把细胞钳制在-75mV(抑制性突触后电位的反转电位)可以单独记录到兴奋性突触后电位(Excitatory postsynaptic potentials EPSPs)，把细胞钳制在0mV(兴奋性突触后电位的反转电位)可以单独记录到抑制性突触后电位(Inhibitory postsynapticpotentials IPSPs)。在超过50％的20-22天的细胞中能检测到EPSPs和IPSPs，但15-16天细胞中能同时检测到EPSPs和IPSPs的细胞则比较少，提示有功能的突触连接在成熟的神经元中形成，并且突触的形成受到细胞分化程度的影响，如图3C。

双细胞膜片钳记录的结果，刺激Shh/BMP9诱导的细胞发放的动作电位，可以在突触后的细胞上记录到突触电位，并且该突触后电位可以被谷氨酸受体的阻断剂(CNQX和APV)所阻断，说明是谷氨酸能的兴奋性突触，如图3D。该结果证明诱导的细胞之间能形成有功能的化学突触连接。

双细胞膜片钳记录的结果显示，Shh/BMP9诱导的细胞之间还能形成电突触连接，如图3E。

实施例4、将诱导的基底前脑胆碱能神经元前体移植到AD小鼠的基底核能改善小鼠的认知功能

APPswe/PS1dE9(APP/PS1)和5XFAD，购自Jackson Laboratory。通过检测阿尔茨海默症(AD)小鼠脑中的Aβ沉淀物以确定AD小鼠5XFAD和APP/PS1的病理表现。如图9A-B，在两个月大的5XFAD小鼠的海马支脚(subiculum)和深层大脑皮层中，有Aβ沉淀物开始形成；等到5XFAD三个或四个月大时，其大脑的绝大部分区域中已经有Aβ沉淀物大量沉积。与5XFAD相比，APP/PS1小鼠的病理表现较晚。直到APP/PS1小鼠六个月大时，其大脑中才有Aβ沉淀物开始形成；到其九个月大时，Aβ沉淀物才能在大脑的绝大部分区域出现。此外，在六个月大的5XFAD和十二个月大的APP/PS1小鼠中均能检测到明显的神经元丢失或减少。

利用脑立体定向注射(Stereotaxic surgery)将80,000个CE3来源的基底前脑胆碱能神经元(basal forebrain cholinergic neuron，BFCN)前体移植到4个月大的5XFADAD小鼠和10个月大的APP/PS1小鼠的基底核(nucleus basalis of Meynert，NBM)中，进而检测细胞移植能否改善AD小鼠的认知功能。设置19只5XFAD小鼠和23只APP/PS1小鼠接受细胞移植和随后的行为学检测，每组接受BFCN前体移植的小鼠各有三组年龄与之相匹配的阴性对照，分别为接受培养液注射的AD小鼠(Sham)，未接受注射的AD小鼠和野生型小鼠(WT)。初步的可见平台水迷宫实验证实，四组小鼠在游泳的速度和找到平台的时间(Latency)上都没有显著差异，说明转基因或细胞注射并没有影响其感官运动(sensory-motor)和对刺激的响应性。

通过测试小鼠找到隐藏平台的时间(Latency)来判断它们的空间学习能力，与野生型小鼠相比，5XFAD和APP/PS1 AD小鼠在水迷宫测试中都表现出明显的缺陷，主要表现为较长的latency；与未接受注射的AD小鼠相比，BFCN移植小鼠在空间学习能力得到显著的改善，主要表现为较短的Latency，而Sham组的小鼠则没有明显的变化，证明细胞移植使得AD小鼠的空间学习能力得以改善。图4A为5XFAD小鼠及其对照的Latency测定结果，图4B为APP/PS1 AD小鼠及其对照的Latency测定结果。

上述水迷宫实验24小时后，对小鼠进行probe测试(即平台撤除，让训练后的实验小鼠自由游泳60秒，检测各象限时间分布)，以检测小鼠的空间记忆能力。与野生型小鼠相比，Sham和未接受注射的AD小鼠都表现出明显的空间记忆缺陷，主要表现为较长的latency(A和B)，较短的待在目标象限(target quadrant)的时间和较少的穿越平台位置(crossings across the target)的次数，而BFCN移植小鼠的上述行为学指标恰恰与Sham和未接受注射的AD小鼠相反，证明细胞移植可能使得AD小鼠的空间记忆能力得以改善。图4C为5XFAD小鼠及其对照的测试结果，图4D为APP/PS1 AD小鼠及其对照的测试结果。

实施例5、移植BFCN前体细胞在AD小鼠大脑中的特异性分布和向神经元分化命运决定

在证实了细胞移植能改善AD小鼠的空间学习和记忆能力之后，本发明人在接受细胞移植的小鼠的矢状面和冠状面脑切片上检测被移植的BFCN前体在体内的分布和神经分化。一般的，注射两个月之后，被移植细胞在大脑内保持正常的迁移和分化模式。

带有绿色荧光(EGFP)的移植细胞在小鼠大脑基底核(nucleus basalis of Meynert，NBM)内的分布见图5A，数据统计绝大多数EGFP阳性细胞都位于NBM中，即其最初被注射到的大脑的部位。

表2、EGFP⁺在移植AD小鼠脑内后的分布

区域

NBMB

NBMF

NBMT

NBMI

FF

CC

DG

其它

百分率

33.6％

25.2％

12.3％

7.2％

11.2％

1.6％

3.1％

4.2％

NBMB：NBM基底；NBMF：NBM投射束；NBMT：NBM顶端；NBMI：NBM峡部；FF：fimbria fornix(穹窿)；CC：胼胝体；DG：齿状回。

表2、数据显示了带有绿色荧光(EGFP)的移植细胞在小鼠大脑各个区域内的分布比例，表明大约80％的细胞位于基底核(nucleus basalis of Meynert，NBM)中，此外，有相当一部分细胞迁移到fimbria fornix，此外，偶尔发现，EGFP阳性细胞在齿状回(dentate gyrus)和胼胝体(corpus callosum)中也有零星分布。其中，在NBM内的EGFP阳性细胞中，约有35％位于NBM底部，12％位于NBM tip，7％位于NBM isthmus。

小鼠大脑的解剖示意图和EGFP阳性细胞在大脑各个区域的分布见图5B。利用免疫染色检测存活下来的EGFP阳性细胞在NBM中分化的命运(图5C)，发现大多数EGFP细胞都表达成熟神经元标志物NeuN，只有少数细胞表达神经元前体标志物Nestin(图5E)，表明大多数存活下来的BFCN前体都能在受体小鼠大脑内继续分化为成熟的神经元。并且在EGFP阳性细胞中，与占大多数的NeuN阳性的细胞相比，只有少数分化为GFAP阳性的星形胶质细胞和O4阳性的少突胶质细胞(图5E)。

对NeuN阳性细胞的神经元亚型检测见图5D，发现超过一半的为ChAT阳性，并具有粗短的突起，这是典型的成熟胆碱能神经元的形态特征。此外，与ChAT阳性细胞相比，GAD65阳性或vGLUT1/2阳性的细胞数量少很多(图5E)。

对42只接受细胞移植的AD小鼠大脑中EGFP阳性细胞存活率的统计发现，其中33只小鼠大脑中存活的EGFP阳性细胞数量在60000至80000之间，四只小鼠中EGFP阳性细胞数量低于60000个，5只小鼠中的高于80000个，说明EGFP阳性细胞在接受移植的小鼠中的存活率是比较一致的。在小鼠NBM中的所有细胞移植部位都没有检测到肿瘤的形成，但如果接受移植的区域为侧脑室(lateral ventricle)有时会有肿瘤的形成。与该现象相吻合，细胞分裂标志物Ki67在NBM内的EGFP阳性细胞中不表达，但在侧脑室内的EGFP阳性细胞中高表达。

上述结果证明，移植到体内的BFCN前体特异性的位于NBM中，并最终在体内胆碱能神经元微环境中分化为成熟的胆碱能神经元。

实施例6、移植到NBM的BFCN前体细胞可以发育为成熟的胆碱能神经元

在对接受细胞移植的AD小鼠进行行为学检测后，将其处死，制备厚度为200μm的脑切片，最后在含有所有移植细胞的脑切片内用全细胞记录的方式检测EGFP阳性细胞的电生理特性。

用Avidin-PE染色标示出用全细胞记录方法所检测的细胞，如图6A，箭头指示出所检测的细胞整合到了基底核的投射束中。

选择轴突的长度约为700μm的神经元作为典型个例，展示所记录的基底前脑神经元的形态和其突起投射的方向和趋势，结果见图6B。

各类细胞中，EGFP阳性细胞的百分比统计见图6C。

在所检测到的18个EGFP阳性细胞中，有15个细胞可以发放连续的动作电位，证明它们是成熟的神经元。进一步分析所得到的电生理数据(表1)，显示与在体外诱导分化的BFCN相比，移植到体内并分化成熟的BFCN的静息膜电位和动作电位阈值更加去极化，证明体内的BFCN更加成熟。此外，移植到体内并分化成熟的BFCN具有较低的输入阻抗，较高的膜电容，显著增加的AP振幅和显著减少的AP半宽度(表1)。

表1、胚胎干细胞来源的细胞的特性

数值以平均值±标准差表示，**代表p＜0.01。液界电位差已经校正。

表1中的数据表明分化至15-16天(DIV 15-16)和20-22天(DIV 20-22)的两组细胞的输入阻抗和膜电容都没有明显的差别，但与15-16天的细胞相比，20-22天的细胞的静息膜电位更加去极化。此外，与15-16天的细胞相比，20-22天的细胞表现出显著增加的AP振幅(amplitude)和显著减少的AP半宽度(half-width)，表明20-22天的细胞中钠离子和钾离子通道的表达增加。进一步分析所得到的电生理数据，显示与在体外诱导分化的BFCN相比，移植到体内并分化成熟的BFCN的静息膜电位和动作电位阈值更加去极化，证明体内的BFCN更加成熟。此外，移植到体内并分化成熟的BFCN具有较低的输入阻抗，较高的膜电容，显著增加的AP振幅和显著减少的AP半宽度。

这些结果显示小鼠基底前脑为移植细胞提供了向胆碱能神经元分化和成熟的更为适合的微环境。

在所检测的绝大多数EGFP阳性细胞中，都能同时检测到兴奋性和抑制性突触后电位，mEPSPs的平均频率为4.8±0.5Hz，而sIPSPs的平均频率为1.3±0.1Hz。进一步的实验证明，整合体内的神经元的活性和功能至少可以持续到移植后的第9周，如图6C和图6I。

在对脑片中的EGFP阳性细胞进行电生理检测之后，用免疫组化的方法验证所检测细胞所具有的神经元特性。在所记录的EGFP阳性细胞中，约有80％的细胞具有典型的基底核的投射模式，如图6C和图6E，超过50％的细胞为ChAT阳性，如图6C和图6F。

所用这些结果都表明移植到NBM的BFCN前体细胞可以在体内的微环境中发育为成熟的胆碱能神经元，并且能够整合到接受移植小鼠的胆碱能神经元投射束中，并发挥功能，从而对AD小鼠与记忆相关的一系列病理损伤起到修复作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种制备含基底前脑胆碱能神经元或其前体的细胞群的方法，包括：

(1)培养多潜能干细胞，形成拟胚体；和

(2)培养拟胚体，以骨形态发生蛋白9和音猬因子诱导；获得含基底前脑胆碱能神经元或其前体的细胞群。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，培养拟胚体6±1天后，以音猬因子诱导；或

培养拟胚体8±1天后，以骨形态发生蛋白9诱导。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在加入骨形态发生蛋白9的2±1天后，收获细胞群，该细胞群为含基底前脑胆碱能神经元前体的细胞群；或

在加入骨形态发生蛋白9后2±1后，进行单细胞贴壁培养；单细胞贴壁培养4±2天后收获细胞群，该细胞群为含基底前脑胆碱能神经元的细胞群。

4.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，骨形态发生蛋白9诱导6±2天；和/或

音猬因子诱导4±2天。

5.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，

所述的音猬因子的终浓度是300±200ng/ml；和/或

所述的骨形态发生蛋白9的终浓度是5-10ng/ml。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的多潜能干细胞选自：胚胎干细胞或诱导多能干细胞。

7.一种含基底前脑胆碱能神经元或其前体的细胞群，其通过权利要求1-6任一所述的方法制备获得。

8.权利要求7所述的含基底前脑胆碱能神经元的细胞群的用途，用于制备增加脑内基底前脑胆碱能神经元的组合物。

9.一种药物组合物，其包括：

权利要求7所述的含基底前脑胆碱能神经元或其前体的细胞群；以及

药学上可接受的载体。

10.一种音猬因子和骨形成蛋白9的用途，用于以多潜能干细胞作为起始细胞来制备含基底前脑胆碱能神经元的细胞群。

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