CN114262687A - 一种从非神经细胞转化制备保留年龄特征的人源性背根节神经元的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从非神经细胞转化制备保留年龄特征的背根节神经元的方法。本发明的制备方法优化了关键的细胞直接转分化基因组合及调控表达水平的启动子，包装可以高效感染各种年龄供体源细胞的病毒，并采用合适的包被基质促进供体源细胞及转化后的神经细胞贴壁生长，并利用含有可以促进转分化的小分子化合物与生长因子的诱导分化培养液，在10‑14天内经过若干次更换分化培养液后转分化得到大量的背根节神经元，最后经过分离纯化获得高纯度的背根节神经元。

Description

一种从非神经细胞转化制备保留年龄特征的人源性背根节神 经元的方法

技术领域

本发明涉及神经痛的研究和治疗领域，更具体地，本发明涉及与之相关的一种从非神经细胞转化制备保留年龄特征的人源性背根节神经元的方法。

背景技术

神经痛是一种临床常见的复杂疾病，根据病因或发病部位分为很多类型，如带状疱症后遗神经痛、癌性神经痛、糖尿病性神经痛、中风后神经痛、三叉神经痛、舌咽神经痛等。各种长期慢性的神经痛都会严重影响患者的生活质量，有的剧痛甚至会导致病人难以忍受而自杀。多种神经痛均呈现年龄相关性(诱发疾病也与年龄密切相关)，如带状疱疹后遗神经痛的发生主要在成年以后，年龄越大发病率越高。糖尿病性神经痛、中风后神经痛等也均呈现明显的年龄相关性。

背根节神经元是分布于脊髓背根节的外周感觉神经元，是各种痛觉传入中枢的初级神经元，与多种疼痛症状及其发病机制密切相关。采用发病阶段人源背根节神经元作为细胞病理模型对深入研究神经痛的发病机制、筛选研发有效的治疗药物以及开发基因疗法等具有非常重要的意义以及极为可观的市场价值。

背根节神经的获得方式主要包括原代培养和分化两种方式。原代培养动物(以小鼠、大鼠为主)背根节神经细胞技术相对成熟且来源充足。然而，人与其它动物的神经系统具有较大的差异，动物来源的神经细胞种属不匹配，病理机制(与人类)不相符是导致众多研究成果不可靠及筛选药物无效的主要原因；原代培养人源的神经细胞，虽解决了种属匹配问题，但由于技术、伦理与法律的限制，仅有少数机构能够获得极其有限数量的人源的神经细胞，无法保障广泛的研究和药物筛选的使用。很显然，原代培养动物及人源背根神经细胞都无法保障或满足机制研究及筛药的需要。如何能源源不断地获得具有年龄及病理特征的人源性背根节神经细胞一直是一项尚待攻克的国际性难题。

由2012年诺贝尔医学或生理学奖得主山中伸弥等人提出的诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)技术虽然解决了无法获得人源性亚神经细胞的难题，但iPSC诱导技术方法较为复杂，分离及鉴定过程繁琐，获得细胞的时间较长(6-7个月)，而且在制备过程中细胞被重设至胚龄特征，从而失去了神经痛病理模型细胞所需要的发病阶段的关键病理特征。虽然iPSC诱导亚型神经细胞在神经退行疾病的治疗领域应用前景较大，但由于现代技术的限制以及神经细胞的修复特征，在短时期内将其用于修复神经退行性疾病损伤还有诸多无法解决的问题。而在机制研究及新药筛选领域，iPSC诱导的神经细胞由于失去了发病年龄以及关键的病理特征，其实际应用效果也有待深入评估验证。基于iPSC技术制备背根节神经元的相关方法可参见Nickolls等公开发表的论文(Transcriptional programming of human mechanosensory neuron subtypes frompluripotent stem cells，Cell Reports，2020)。

直接转分化技术(直接细胞重编程技术)是在iPSC技术基础上快速发展崛起的一种新兴生物技术，即，在特定的培养条件下，利用特定的基因组合等促使不同细胞类型之间互相直接转换。目前利用这一技术已可从多种体细胞直接转分化得到若干特化亚型神经元，包括背根节神经元、运动神经元以及抑制性中间神经元等。该技术的独特优势在于所生成的患者功能性神经细胞保留了母细胞的年龄相关特征以及患者体内同类神经细胞受到疾病影响的关键病理特征，因此在发病阶段疾病的病理机制研究、新药筛选、药物研发及基因疗法开发方面具有引人瞩目的应用前景。相应地，由此生成的正常人功能性神经细胞则保留了母细胞的年龄特征及正常的生理功能特征，可以用于药物的毒性分析测试等。

然而，上述技术的普遍缺点在于转化效率低、分离纯化收率低、难以获得大量高纯度的亚型神经元。以背根节神经元为例，目前已报道的直接转分化技术主要用于由小鼠成纤维细胞或人胚胎成纤维细胞等转化生成背根节神经元，该过程的转化效率以及产品纯度均很低；当用于由成年人或老年人皮肤成纤维细胞转分化制备背根节神经元时，上述问题尤为显著。以Blanchard等人之前发表的文章(Selective conversion of fibroblastsinto peripheral sensory neurons，Nature Neuroscience，2015)为例，当其采用的供体源细胞为鼠胚胎细胞时，转分化效率低于6％；而当采用人胚胎细胞或成年人皮肤成纤维细胞时，转分化效率分别仅为12％和1％，上述极低的转分化效率难以满足实际应用需求。相关现有技术文献及技术细节比较可参见附表1。

综上所述，各种神经痛病理机制研究及筛药的最理想的细胞模型，是处于发病年龄(发病期)、具有病理特征的人源性背根节神经元。尽管需求极大，但市场上仍无可以高效率、高纯度制备正常人或神经痛患者发病阶段背根节神经元的相关技术与产品。因此本领域中迫切需要研发一种可以高效率、高纯度制备保留年龄特征的背根节神经元的方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明旨在采用直接转分化技术将各种年龄的人的皮肤成纤维细胞等非神经细胞高效转化为高纯度的、保留相应年龄/病理特征的背根节神经元。上述通过直接转分化技术获取的功能细胞不仅可保留供体源细胞的年龄特征，还可保留神经痛患者受影响功能细胞的关键病理特征(当供体源细胞来源于神经痛患者时)，因而在疾病机理研究与新药筛选研发方面具有独特的应用前景。

基于上述目的，在第一方面中，本发明提供了一种从非神经细胞转化制备保留年龄特征的背根节神经元的方法，其包括如下步骤：

1)构建含有细胞转分化基因组合的病毒载体，并通过转染细胞进行病毒包装；

2)培养供体源细胞，并用经包装的病毒感染经培养的供体源细胞；

3)在诱导分化培养液中诱导所述供体源细胞直接转分化为背根节神经元；以及

4)分离纯化所得的背根节神经元，

其中，所述细胞转分化基因组合包含以下基因的组合：(1)选自NGN1、NGN2和ASCL1中的至少一种基因；(2)选自ISL1、ISL2、Brn3a、Brn3b和Brn3c中的至少两种基因；以及任选的(3)选自SOX4和SOX11中的至少一种基因。

在进一步的实施方式中，所述基因为来源于人或小鼠等其它任何种属的同源基因。

在进一步的实施方式中，所述病毒载体可选自逆转录病毒载体、慢病毒载体或AAV病毒载体，且各载体中调控表达水平的启动子可选自CMV、CAG、EF1α、PGK、TRE Tight、TRE3G中的任何一种或多种。优选地，所述启动子选自CMV。

在进一步的实施方式中，在病毒载体的构建过程中可以通过不同来源的2A序列(例如，T2A、E2A、P2A、F2A等)或IRES序列来连接上述基因，并可任选地进一步引入绿色或红色荧光报告基因，以便于确定病毒包装质量和滴度、观察细胞形态的变化、测定细胞纯度以及用于后续各种具体应用分析等。

在进一步的实施方式中，所述供体源细胞可以是任何年龄的正常人或患者的皮肤成纤维细胞或其它非神经细胞，如各种干细胞、肺成纤维细胞、包皮成纤维细胞、胶质细胞等。优选地，所述供体源细胞为正常人或患者的皮肤成纤维细胞。

在进一步的实施方式中，在培养供体源细胞的过程中采用合适的包被基质对培养皿等培养容器进行预包被，所述合适的包被基质可选自层粘连蛋白(laminin)、明胶(gelatin)、纤连蛋白(fibronectin)、Matrigel中的至少一种。优选地，所述包被基质为Matrigel。

在进一步的实施方式中，所述诱导分化培养液含有特定的促进转分化的小分子化合物以及生长因子的组合，所述促进转分化的小分子化合物包含佛司可林(FSK)、cAMP、双丁酰环腺苷酸(DB-cAMP)、RA、LDN-193189(LDN)、SB431542、CHIR99021中的一种以上，优选两种以上；所述生长因子包含bFGF2、NGF、GDNF、NT3中的一种以上。优选地，所述小分子化合物为佛司可林和/或LDN-193189。优选地，所述生长因子为bFGF2。

在进一步的实施方式中，所述分离纯化是采用本领域常用的消化方法(如胰蛋白酶法等)将转分化后的细胞消化并重悬为单细胞悬浮液，用细胞滤器、流式细胞仪或在明胶或纤连蛋白包被的培养皿上差异性贴壁等方法分离得到高纯度的背根节神经元。

在第二方面中，本发明提供了采用第一方面所述的制备方法制备得到的保留年龄特征的背根节神经元。

在第三方面中，本发明提供了在二方面中所述的保留年龄特征的背根节神经元在建立用于筛选神经痛治疗药物的方法中的用途。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言将是显而易见的。

此外，应当理解，在本发明的范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间均可互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1.为病毒包装时，293T细胞共转染包装质粒以及携带绿色荧光蛋白和目标基因的表达质粒后的转染效率示意图。在293T细胞中质粒转染50小时左右后，几乎所有细胞均表达较高水平的绿色荧光报告基因，转染效率高于90％。图中显示比例尺为50μm。缩写含义(下同)：GFP：绿色荧光蛋白；BF：明场图像；TFs：转录因子。

图2.为人皮肤成纤维细胞感染病毒后开始诱导分化前的显微示意图。在幼儿及成年正常人的皮肤成纤维细胞中，病毒感染48小时左右，大部分细胞均显示较强的绿色荧光，表明GFP阳性细胞中转化基因表达水平较高，有利于后续高效地转分化为目标神经元。图中白色箭头显示少数未感染病毒或GFP弱表达的皮肤成纤维细胞。图中显示比例尺为300μm。缩写含义(下同)：DRGN：背根节神经元。

图3.为幼儿及成年人皮肤成纤维细胞感染病毒并在诱导分化培养液中培养3天期间的细胞形态变化示意图。感染了选定基因组合的GFP阳性的皮肤成纤维细胞在特定的诱导分化培养液中逐渐发生形态变化，在诱导后第1天一些GFP阳性细胞胞体开始缩小、隆圆，诱导后第二天大部分GFP阳性细胞胞体都明显变化，第3天部分细胞已经开始长出神经突起(如红色箭头所示)，形成明显的神经元形态，转化效率达90％以上。白色箭头显示少数未感染病毒或GFP弱表达的未能转化的皮肤成纤维细胞。图中显示比例尺为300μm。

图4.为诱导生成的人背根节神经元经分离纯化以后的示意图。在感染病毒后第10-14天期间，大部分GFP阳性细胞完全转化为神经元，未转化的皮肤细胞经过分离去除后，神经元的纯度达到95％以上。图中显示比例尺为300μm。

图5.为分析包被基质对转化效率影响的示意图。选择4种包被基质，即，层粘连蛋白(L)、明胶(G)、纤连蛋白(F)、Matrigel(M)，按不同的组合分别加入培养皿中包被过夜，在转分化第10天用荧光显微镜每组分别随机选取5-10个20x视野，统计各视野中GFP阳性的神经细胞数目，然后计算相对于数目最多组的相对转化率以进行对比分析。由图可见，不含包被基质的实验组(-LGFM)几乎没有背根节神经元生成，而以上4种基质单独包被或以≥2种的组合包被均可以获得不同程度的转化效果。

图6.为分析小分子化合物及生长因子的组合对转化效率影响的示意图。选择FSK、RA、LDN、SB431542(SB)、CHIR99021(CHIR)等小分子化合物以及bFGF2、NGF、GDNF、NT3等生长因子，按不同组合加入诱导分化培养液中，在第10天用荧光显微镜每组分别随机选取5-10个20x视野，统计各视野中GFP阳性的神经细胞数目，然后计算相对于数目最多组的相对转化率以进行对比分析。由图可见，在诱导分化培养液中加入以上各种成分时转化效率最高，去掉FSK、LDN或bFGF2后对转化效率的影响最大。

图7.为诱导生成的人背根节神经元表达一般神经元特征蛋白质Tuj1的示意图。其中99％以上GFP阳性的细胞同时特异性地表达一般神经元特征蛋白质Tuj1。图中显示比例尺为300μm。

图8.为诱导生成的人背根节神经元表达一般神经元特征蛋白质MAP2的示意图。其中99％以上GFP及Tuj1阳性的细胞同时特异性地表达一般神经元特征蛋白质MAP2。图中显示比例尺为50μm。

图9.为诱导生成的人背根节神经元表达神经元突触蛋白SYN1的示意图。GFP及Tuj1阳性细胞为转化生成的人背根节神经元，其明显表达了神经突触蛋白SYN1。GFP及Tuj1阴性、HST阳性的细胞中SYN1染色为阴性，表明抗体特异性强。图中显示比例尺为20μm。

图10.为诱导生成的人背根节神经元表达外周神经元特征性蛋白质外周蛋白Peripherin及神经丝蛋白NF200的示意图。GFP及Tuj1阳性细胞为转化生成的人背根节神经元，其中：A)转化生成的人背根节神经元表达特征性的外周蛋白Peripherin；B)转化生成的人背根节神经元表达特征性的神经丝蛋白NF200。图中显示比例尺为20μm。

图11.为诱导生成的人背根节神经元表达背根节神经元特征性转录因子Brn3a的示意图。GFP及Tuj1阳性细胞为转化生成的人背根节神经元，其细胞核中明显表达了背根节神经元特征性转录因子Brn3a。图中显示比例尺为20μm。

图12.为诱导生成的人背根节神经元表达兴奋性神经元特征性蛋白VGluT1的示意图。GFP及Tuj1阳性细胞为转化生成的人背根节神经元，其胞体与突起中明显表达了兴奋性神经元特征性蛋白VGluT1。图中显示比例尺为20μm。

图13.为诱导生成的人背根节神经元表达功能性受体蛋白TrkA的示意图。GFP及Tuj1阳性细胞为转化生成的人背根节神经元，其胞体与突起中都明显表达了背根节神经元特征性的功能性受体蛋白TrkA。图中显示比例尺为20μm。

图14.为诱导生成的幼儿及成人背根节神经元中β-半乳糖苷酶(β-Gal)的染色示意图。成年皮肤细胞转化制备的背根节神经细胞中衰老标记物β-Gal染色阳性细胞更多，且各个阳性细胞染色密度显著增强。图中显示比例尺为20μm。

图15.为诱导生成的幼儿及成人背根节神经元中端粒保护性抗氧化酶(PRDX1)表达水平的示意图。GFP阳性细胞为转化生成的人背根节神经元，其胞体与突起中都表达了端粒保护性抗氧化酶PRDX1。成人背根节神经元中端粒保护性抗氧化酶PRDX1表达水平显著下降。图中显示比例尺为20μm。

图16.为诱导生成的幼儿及成人背根节神经元中长寿相关异染色质蛋白(HP1γ)表达水平的示意图。GFP阳性细胞为转化生成的人背根节神经元，长寿相关异染色质蛋白HP1γ分布于细胞核中。成人背根节神经元中长寿相关异染色质蛋白HP1γ表达水平显著下降。图中显示比例尺为20μm。

图17.为人NGN1基因及蛋白质序列。小鼠或其它种属的NGN1同源基因在本发明直接转分化制备方法中也有与之类似的效果。

图18.为人NGN2基因及蛋白质序列。小鼠或其它种属的NGN2同源基因在本发明直接转分化制备方法中也有与之类似的效果。

图19.为人ASCL1基因及蛋白质序列。小鼠或其它种属的ASCL1同源基因在本发明直接转分化制备方法中也有与之类似的效果。

图20.为人SOX4基因及蛋白质序列。小鼠或其它种属的SOX4同源基因在本发明直接转分化制备方法中也有与之类似的效果。

图21.为人SOX11基因及蛋白质序列。小鼠或其它种属的SOX11同源基因在本发明直接转分化制备方法中也有与之类似的效果。

图22.为人ISL1基因及蛋白质序列。小鼠或其它种属的ISL1同源基因在本发明直接转分化制备方法中也有与之类似的效果。

图23.为人ISL2基因及蛋白质序列。小鼠或其它种属的ISL2同源基因在本发明直接转分化制备方法中也有与之类似的效果。

图24.为人BRN3a基因及蛋白质序列。小鼠或其它种属的BRN3a同源基因在本发明直接转分化制备方法中也有与之类似的效果。

图25.为人BRN3b基因及蛋白质序列。小鼠或其它种属的BRN3b同源基因在本发明直接转分化制备方法中也有与之类似的效果。

图26.为人BRN3c基因及蛋白质序列。小鼠或其它种属的BRN3c同源基因在本发明直接转分化制备方法中也有与之类似的效果。

具体实施方式

为制备保留年龄特征的背根节神经元，本发明根据直接转分化的技术原理，在供体源细胞中通过病毒导入能够决定神经细胞命运及其亚型的关键基因组合，并在适当的转化培养条件下诱导转化生成功能性的背根节神经元。

具体地，本发明提供了一种从非神经细胞转化制备保留年龄特征的背根节神经元的方法，其包括如下步骤：

1)构建含有细胞转分化基因组合的病毒载体，并通过转染细胞进行病毒包装；

2)培养供体源细胞，并用经包装的病毒感染经培养的供体源细胞；

3)在诱导分化培养液中诱导所述供体源细胞直接转分化为背根节神经元；以及

4)分离纯化所得的背根节神经元，

其中，所述细胞转分化基因组合包含以下基因的组合：(1)选自NGN1、NGN2和ASCL1中的至少一种基因；(2)选自ISL1、ISL2、Brn3a、Brn3b和Brn3c中的至少两种基因；以及任选的(3)选自SOX4和SOX11中的至少一种基因。

其中，NGN1、NGN2和ASCL1基因在SOX4或SOX11的协同作用下对于神经系统发育过程中不同类型神经细胞的分化起决定性的作用，而ISL1、ISL2、Brn3a、Brn3b和Brn3c五种基因对特定亚型背根节神经元的特化起决定性的作用。上述基因的各种有效组合可以诱导产生本发明所述的背根节神经元。需要重点强调的是，在上述基因组合中发挥协同作用的SOX4或SOX11可以显著性地使转化效率提高至70％以上，该技术效果是预料不到的。

上述各基因及其蛋白质序列可参见说明书核苷酸和氨基酸序列表以及附图图17-26。

对于上述制备方法，在实际制备应用中可具体包含如下步骤：

a.将上述基因分别构建入商售或自有的逆转录病毒载体、慢病毒载体或AAV病毒载体中，各载体中调控表达水平的启动子可以是CMV,CAG,EF1α,PGK,TRE Tight,TRE3G中的任何一种或多种。同时可以通过不同来源的2A序列(例如，T2A、E2A、P2A、F2A等)或IRES序列来连接上述基因，并可任选地进一步引入绿色或红色荧光报告基因，以便于确定病毒包装质量和滴度，观察细胞形态的变化，测定细胞纯度以及用于后续各种具体应用分析。

b.通过细胞转染将上述基因载体分别包装成相应的逆转录病毒、慢病毒或AAV病毒，测定各种病毒的滴度，确定感染供体源细胞的病毒用量，使各种病毒感染率达到50％～100％。

c.将供体源细胞按适当密度接种于层粘连蛋白、明胶、纤连蛋白、Matrigel中的至少一种所预包被的培养皿中。所述供体源细胞可以是任何年龄的正常人或患者的皮肤成纤维细胞或其它非神经细胞，如各种干细胞、肺成纤维细胞、包皮成纤维细胞、胶质细胞等。优选地，所述供体源细胞为正常人或患者的皮肤成纤维细胞。

d.加入适量的病毒进行感染，一段时间(例如24小时)后更换为新鲜的源细胞培养液。

e.确定含有促进转分化的小分子化合物与生长因子的特定诱导分化培养液：在含有0.5％-2％B27,0.5％-2％N2的DMEM/F12/Neurobasal(1:1:1或2:2:1)基础液中，加入1-20μM FSK,0.1-5μM RA,0.1-1μM LDN,1-10μM SB431542,1-10μM CHIR99021中的一种以上，以及1-200ng/mL bFGF2、NGF、GDNF、NT3中的一种以上的组合。

f.在供体源细胞感染病毒后定期(例如第3、5、7、10天；或每天；或其它不同间隔时间)更换诱导分化培养液。

g.在第10-14天分离纯化带有荧光的背根节神经元，用荧光显微镜分别计数总细胞及神经细胞以确定其纯度。

h.将部分纯化后的背根节神经元接种在预先包被好的培养皿中，用背根节神经细胞培养液继续培养以供鉴定，余下冻存于适于神经细胞的冻存液备储存、运输。

i.对以上制备得到的背根节神经元进行特征鉴定，该鉴定可包含例如以下方面：

A.一般神经元表达的特征蛋白质：Tuj1、MAP2、NeuN,Tau等；

B.神经元突触蛋白质：Synapsin 1(SYN1)；

C.背根节神经元特征蛋白质:Peripherin、NF200、BRN3a、BRN3b、VGluT1、TrkA等。

需要注意的是，上述具体制备方法仅为更好地阐释本发明，而非限制本发明的范围。本领域技术人员可根据实际制备需求选择性地调整其中部分步骤的顺序，以及省略其中部分步骤。此外，其中相应步骤中的试剂、时间、浓度以及其他参数等均可根据实际情况进行适当调整，这对于本领域技术人员而言均是显而易见的。

由上文可知，本发明的制备方法优化了关键的细胞直接转分化基因组合及调控表达水平的启动子，包装可以高效感染各种年龄供体源细胞的病毒，并采用合适的包被基质促进供体源细胞及转化后的神经细胞贴壁生长，并利用含有可以促进转分化的小分子化合物与生长因子的诱导分化培养液，在10-14天内经过若干次更换分化培养液后转分化得到大量的背根节神经元，最后经过分离纯化获得高纯度的背根节神经元。

本发明制备方法所具有的独特优势列举如下：

1.简单：供体源细胞感染病毒以后，只需更换诱导分化培养液若干次(例如4次)即可，无需进行繁琐操作；

2.快速：仅需10-14天即可获得大量目标产品；

3.成本低：相比于iPSC技术，无需长期每日更换昂贵的培养液(iPSC的培养液非常昂贵)；

4.转化效率高，对感染病毒(GFP阳性)的各种年龄皮肤细胞的转化效率高达90％以上；

5.收率高：仅需1-2个100mm培养皿即可获得百万数量级的经纯化背根节神经细胞；

6.分离纯化简单、产品纯度高，经纯化的背根节神经细胞可达90％以上纯度；

7.制得的背根节神经细胞符合神经痛患者的发病期年龄与病理特征；

8.制得的背根节神经细胞可以有效冻存、复苏，液氮冻存可达半年以上，复苏存活率达到90％；

9.制得的背根节神经细胞可以短期或长期培养，最长可培养3个月以上；

10.制得的背根节神经细胞适用于作为细胞病理模型，研究发病机制、药物作用机制、筛选研发药物及开发基因疗法，或用于化合物毒性测试等；

11.可用于快速建立大样本正常及患者人群的背根节神经细胞库，用以支持大数据分析以及精准疗法开发。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例

实施例1从幼儿及成人皮肤成纤维细胞快速、高效地制备高纯度的背根节神经元

1.材料

1)细胞：用于病毒包装的293T细胞购自美国ATCC(CRL-3216)；幼儿及成人皮肤成纤维细胞分别购自Genetic Cell Repository(Coriell Institute for MedicalResearch，NJ，USA，货号AG07095)及Sciencell(货号#2320)公司。将293T及人皮肤成纤维细胞用含10-20％FBS及1×P/S双抗的高糖DMEM培养液进行培养。

2)仪器设备与试剂：

A.CO2细胞培养箱(ESCO CLM-170B-8-CN)；超净工作台(ESCO AC2-5S1)；荧光显微镜(Thermo EVOS M5000)；超低温冰箱(海尔DW-86L388J)；液氮罐(海尔YDS-175-216-F)；高速冷冻离心机(白洋BY-R20型)；常温高速离心机(湘仪H1650-W)；

B.智能高压蒸汽灭菌器(上海申安LDZM-80KCS)；美国SHELLAB干燥箱(CE3F-2)；电热数显恒温水浴锅(力辰HH-2)；

C.BIO-RAD梯度PCR仪(T100)；BIO-RAD电泳仪(PowerPac HC)；化学发光成像系统(勤翔ChemiScope 6200Touch)；紫外割胶分析仪(君意JY02)；隔水式培养箱(上海一恒GHP-9080)；振荡培养箱(知楚仪器，ZQTY-70N)；

D.DMEM，F12(Hyclone)；FBS，Neurobasal，B27，N2，胰蛋白酶,DMSO(Invitrogen)；明胶，纤连蛋白，层粘连蛋白，Matrigel(BD)；佛司可林，RA，LDN-193189.HCl，CHIR99021，SB431542(Selleck)；bFGF2，NGF，GDNF，NT3(Peprotech)；Lipofectamine2000(Invitrogen)；PEI(Polysciences)；系列DNA限制性内切酶(Neb)，QIAGEN Plasmid Midi试剂盒(100)，Zymoclean Gel DNA回收试剂盒，60mm培养皿，100mm培养皿，24-MTP，48-MTP，96-MTP，细胞冻存管(康宁)；其它化学试剂(Sigma)等。

2.制备方法

1)质粒构建：将NGN2、ISL1、BRN3b及SOX11基因分别构建入慢病毒载体，载体中调控基因表达水平的启动子采用CMV。同时通过IRES序列引入绿色荧光报告基因，以便于确定病毒包装质量和滴度，观察细胞形态的变化，测定细胞纯度及用于后续各种具体应用。

2)病毒包装：将携有上述基因的各质粒与pRSV、pMDLg及pVSV-G按本领域常用比例与转染试剂PEI混合，加入24小时前预种的293T细胞中转染过夜，更换新鲜培养液，24小时后收集含有病毒的上清液并加入新鲜培养液，再24小时后重复收集一次，合并两次病毒液后用0.45μm的滤器过滤除去死细胞及其碎片，加入凝聚胺至终浓度1-12μg/mL，用少量测定病毒滴度，其余储存于4℃冰箱备用。质粒转染效率可以通过随机选择5-10个20x视野，分别统计各视野中的总细胞数以及GFP阳性细胞数，计算各视野GFP阳性细胞比例，然后取平均值而获得。在293T细胞中40小时左右质粒转染效率高达90％，参见附图图1，可以确保获得高滴度的病毒液。

3)皮肤成纤维细胞培养及感染：先用DMEM或PBS按1:50至1:2000间的任何比例稀释Matrigel，并加入0.1-20μg/mL层粘连蛋白，预包被培养皿过夜。包被基质的选择参见附图图5。然后将皮肤成纤维细胞按适当密度预种于培养皿中过夜。在皮肤成纤维细胞培养液中加入适量的携有基因的病毒，混匀后在培养箱中继续培养过夜，将含病毒的培养液直接吸入含有消毒液的废液瓶，在细胞培养皿中沿壁迅速小心加入新鲜的皮肤成纤维细胞培养液。病毒感染率可以通过随机选择5-10个20x视野，分别统计各视野中的总细胞数以及GFP阳性细胞数，计算各视野GFP阳性细胞比例，然后取平均值而获得。通过在幼儿或成年皮肤成纤维细胞中调整病毒用量，可使病毒感染率在48小时左右高达60％以上，参见附图图2，从而确保感染病毒的细胞可高效地转化为背根节神经元。

4)直接诱导转分化:感染48小时后，将培养液直接吸入含有消毒液的废液瓶，在细胞培养皿中沿壁小心加入含有促进转分化的小分子化合物与生长因子的诱导分化培养液，小分子化合物与生长因子的选择参见附图图6。然后间隔1-2天换液。所述诱导分化培养液的组成为：在含有0.5％-2％B27、0.5％-2％N2的DMEM/F12/Neurobasal(1:1:1或2:2:1)基础液中，加入1-20μM FSK、0.1-5μM RA、1-10μM SB431542和0.1-1μM LDN，以及1-200ng/mLbFGF2、NGF、NT3和GDNF。GFP阳性的皮肤成纤维细胞在特定的诱导分化培养液中逐渐发生形态变化，在诱导后第1天一些GFP阳性细胞胞体开始缩小、隆圆，诱导后第二天大部分GFP阳性细胞胞体都明显变化，第3天部分细胞已经开始长出神经突起(如红色箭头所示)，形成明显的神经元形态，参见附图图3。

5)背根节神经元的分离纯化：10天左右即可看到大量转化的背根节神经元，在荧光显微镜下观察更为清晰。采用细胞滤器及在明胶包被的培养皿上差异性贴壁进行分离纯化。纯化后的背根节神经元通过细胞计数器和荧光显微镜分别统计获得总细胞数及GFP阳性的神经细胞数目，三次重复计算得出纯度高达95％，转化效率高达90％，参见附图图4。将少量纯化后的背根节神经元接种在预先包被好的培养皿中用背根节神经细胞培养液继续培养以供鉴定。

6)冻存及运输：按照常规细胞冻存方法操作，将背根节神经元按每管50万或100万个细胞冻存于适于神经细胞的专用冻存液备储存、运输。

3.表征

在适宜的时间(如15dpi、20dpi或培养期间其它任何时间)，采用4％PFA在室温下固定Matrigel预先包被的盖玻片上培养的背根节神经元10-20分钟后，用含有0.1-0.2％Triton X-100及3-5％BSA的PBS缓冲液封闭约0.5-2小时。然后在同样的缓冲液中稀释待分析特征蛋白质的抗体，将其加入细胞中并于4℃下孵育过夜，洗涤5分钟2-3次后，加入经稀释的带有荧光素的相应二抗，在室温下孵育0.5-1小时，洗涤5分钟2-3次后，再用1μg/mLHoechst33258(HST)室温共染10分钟，洗涤后用载玻片封片处理。采用EVOS荧光显微镜或共聚焦荧光显微镜，分析背根节神经元有无表达一般神经元特征蛋白质(Tuj1及MAP2)、神经突触蛋白质(SYN1)、背根节神经元特征蛋白质(Peripherin、NF200、BRN3a、VGluT1、TrkA)等。抗体来源及稀释度参见表2，分析结果分别参见附图图7(Tuj1)、图8(MAP2)、图9(SYN1)、图10(Peripherin及NF200)、图11(BRN3a)、图12(VGluT1)及图13(TrkA)。上述结果表明，采用实施例1技术制备的背根节神经元不仅表达了一般神经元的特征蛋白质、神经突触蛋白质，还特异性地表达了背根节神经元的特征蛋白质。

实施例2从人胚胎肺成纤维细胞快速、高效地制备高纯度的背根节神经元

1.材料

人胚胎肺成纤维细胞MRC-5购自上海中乔新舟生物科技有限公司(ZQ0006)。其余材料同实施例1(略)。

2.制备方法

1)质粒构建：将NGN2、ISL2、BRN3b及SOX4基因分别构建入逆转录病毒载体，载体中调控基因表达水平的启动子采用CMV。同时通过T2A序列引入绿色荧光报告基因，以便于确定病毒包装质量和滴度，观察细胞形态的变化，测定细胞纯度及用于后续各种具体应用。

2)病毒包装：将携有上述基因的各质粒与pGP及pVSV-G按本领域常用比例与转染试剂Lipofectamine2000混合，加入24小时前预种的293T细胞中转染过夜，更换新鲜培养液，24小时后收集含有病毒的上清液并加入新鲜培养液，再24小时后重复收集一次，合并两次病毒液后用0.45μm的滤器过滤除去死细胞及其碎片，加入凝聚胺至终浓度1-12μg/mL，用少量测定病毒滴度，其余储存于4℃冰箱备用。质粒转染效率可以通过随机选择5-10个20x视野，分别统计各视野中的总细胞数以及GFP阳性细胞数，计算各视野GFP阳性细胞比例，然后取平均值而获得。在293T细胞中50小时左右质粒转染效率高达90％。

3)MRC-5成纤维细胞培养及感染：先用0.1-20μg/mL层粘连蛋白与纤连蛋白预包被培养皿过夜。然后将MRC-5成纤维细胞按适当密度预种于培养皿中过夜。在MRC-5成纤维细胞培养液中加入适量的携有基因的病毒，混匀后在培养箱中继续培养过夜，将含病毒的培养液直接吸入含有消毒液的废液瓶，在细胞培养皿中沿壁迅速小心加入新鲜的MRC-5成纤维细胞培养液。病毒感染率可以通过随机选择5-10个20x视野，分别统计各视野中的总细胞数以及GFP阳性细胞数，计算各视野GFP阳性细胞比例，然后取平均值而获得。通过在MRC-5成纤维细胞中调整病毒用量，可使病毒感染率在48小时左右高达60％。

4)直接诱导转分化:感染48小时后，将培养液直接吸入含有消毒液的废液瓶，在细胞培养皿中沿壁小心加入含有促进转分化的小分子化合物与生长因子的诱导分化培养液。然后间隔1-2天换液。所述诱导分化培养液的组成为：在含有0.5％-2％B27、0.5％-2％N2的DMEM/F12/Neurobasal(1:1:1或2:2:1)基础液中，加入1-20μM FSK和0.1-1μM LDN，以及1-200ng/mL NGF。

5)背根节神经元的分离纯化：10天左右即可看到大量转化的背根节神经元，在荧光显微镜下观察更为清晰。采用细胞滤器及在明胶包被的培养皿上差异性贴壁进行分离纯化。纯化后的背根节神经元通过细胞计数器和荧光显微镜分别统计获得总细胞数及GFP阳性的神经细胞数目，三次重复计算得出纯度高达90％，转化效率高达90％。将少量纯化后的背根节神经元接种在预先包被好的培养皿中用背根节神经细胞培养液继续培养以供鉴定。

3.表征

采用与实施例1中相同的方法，采用EVOS荧光显微镜或共聚焦荧光显微镜，分析制得的背根节神经元有无表达一般神经元特征蛋白质(Tuj1及MAP2)、神经突触蛋白质(SYN1)以及背根节神经元特征蛋白质(Peripherin、NF200、BRN3a、VGluT1、TrkA)等。分析结果同样表明，采用实施例2技术制备的背根节神经元不仅表达了一般神经元的特征蛋白质、神经突触蛋白质，还特异性地表达了背根节神经元的特征蛋白质。

实施例3从人包皮成纤维细胞快速、高效地制备高纯度的背根节神经元

1.材料

人包皮成纤维细胞BJ(CRL-2522)购自美国ATCC公司。其余材料同实施例1(略)。

2.制备方法

1)质粒构建：将NGN1、ASCL1、ISL1、BRN3a及SOX11基因分别构建入慢病毒载体，载体中调控ASCL1基因表达水平的启动子采用CMV，调控其它基因表达水平的启动子采用PGK。同时在ASCL1基因终止密码子前通过T2A序列引入绿色荧光报告基因，以便于确定病毒包装质量和滴度，观察细胞形态的变化，测定细胞纯度及用于后续各种具体应用。

2)病毒包装：将携有上述基因的各质粒与pRSV、pMDLg及pVSV-G按本领域常用比例与转染试剂PEI混合，加入24小时前预种的293T细胞中转染过夜，更换新鲜培养液，24小时后收集含有病毒的上清液并加入新鲜培养液，再24小时后重复收集一次，合并两次病毒液后用0.45μm的滤器过滤除去死细胞及其碎片，加入凝聚胺至终浓度1-12μg/mL，用少量测定病毒滴度，其余储存于4℃冰箱备用。质粒转染效率可以通过随机选择5-10个20x视野，分别统计各视野中的总细胞数以及GFP阳性细胞数，计算各视野GFP阳性细胞比例，然后取平均值而获得。在293T细胞中50小时左右质粒转染效率高达90％。

3)BJ成纤维细胞培养及感染：先用DMEM或PBS按1:50至1:2000间的任何比例稀释Matrigel，预包被培养皿过夜。然后将BJ成纤维细胞按适当密度预种于培养皿中过夜。在BJ成纤维细胞培养液中加入适量的携有基因的病毒，混匀后在培养箱中继续培养过夜，将含病毒的培养液直接吸入含有消毒液的废液瓶，在细胞培养皿中沿壁迅速小心加入新鲜的BJ成纤维细胞培养液。病毒感染率可以通过随机选择5-10个20x视野，分别统计各视野中的总细胞数以及GFP阳性细胞数，计算各视野GFP阳性细胞比例，然后取平均值而获得。通过在BJ成纤维细胞中调整病毒用量，可使病毒感染率在48小时左右高达60％。

4)直接诱导转分化:感染48小时后，将培养液直接吸入含有消毒液的废液瓶，在细胞培养皿中沿壁小心加入含有促进转分化的小分子化合物与生长因子的诱导分化培养液。然后间隔1-2天换液。所述诱导分化培养液的组成为：在含有0.5％-2％B27、0.5％-2％N2的DMEM/F12/Neurobasal(1:1:1或2:2:1)基础液中，加入1-20μM FSK和0.1-1μM LDN，以及1-200ng/mL bFGF2、NGF和GDNF。

5)背根节神经元的分离纯化：10天左右即可看到大量转化的背根节神经元，在荧光显微镜下观察更为清晰。采用细胞滤器及流式细胞仪进行分离纯化。纯化后的背根节神经元通过细胞计数器和荧光显微镜分别统计获得总细胞数及GFP阳性的神经细胞数目，三次重复计算得出纯度高达90％，转化效率高达90％。将少量纯化后的背根节神经元接种在预先包被好的培养皿中用背根节神经细胞培养液继续培养以供鉴定。

3.表征

采用与实施例1中相同的方法，采用EVOS荧光显微镜或共聚焦荧光显微镜，分析制得的背根节神经元有无表达一般神经元特征蛋白质(Tuj1及MAP2)、神经突触蛋白质(SYN1)以及背根节神经元特征蛋白质(Peripherin、NF200、BRN3a、VGluT1、TrkA)等。分析结果同样表明，采用实施例3技术制备的背根节神经元不仅表达了一般神经元的特征蛋白质、神经突触蛋白质，还特异性地表达了背根节神经元的特征蛋白质。

实施例4包被基质的选择研究

一般的细胞培养皿在没有预先包被的情况下对皮肤成纤维细胞的贴壁生长没有明显影响，可是在感染病毒后，细胞会从玻璃介质上脱落，因此应针对所用培养皿选择合适的包被条件以促进细胞在转分化过程中的贴壁生长。重要的是，包被基质的选择对转分化期间诱导生成的神经细胞的贴壁生长、存活至关重要，是提高转化效率的重要前提。

因此，本实施例选择了4种成纤维细胞或神经细胞的包被基质：层粘连蛋白(L)、明胶(G)、纤连蛋白(F)、Matrigel(M)，按不同的组合分别加入培养皿中包被过夜，在转分化第10天用荧光显微镜每组分别随机选取5-10个20x视野，统计各视野中GFP阳性的神经细胞数目，然后计算相对于数目最多组的相对转化率以进行对比分析。由图5可见，不含包被基质的实验组(-LGFM)几乎没有背根节神经元生成，而以上4种基质单独包被或以≥2种的组合包被均可以获得不同程度的转化率。在单独包被的情况下，Matrigel相比其它包被基质导致了最高的转化效率。因此，在实际制备过程中可以参考成本、效率等因素选择合适的包被基质。

实施例5诱导分化培养液中小分子化合物和生长因子的选择研究

本实施例考察了不同小分子化合物以及生长因子对转分化效率的影响。按实施例1所述条件进行转分化实验，选择FSK、RA、LDN、SB431542(SB)、CHIR99021(CHIR)等小分子化合物以及bFGF2、NGF、GDNF、NT3等生长因子，按不同组合加入诱导分化培养液中，在第10天用荧光显微镜每组分别随机选取5-10个20x视野，统计各视野中GFP阳性的神经细胞数目，然后计算相对于数目最多组的相对转化率以进行对比分析。由图6可见，在诱导分化培养液中加入以上全部成分(ALL)时转化效率最高，去掉FSK、LDN或bFGF2后对转化效率的影响最大。因此，在实际制备过程中可以参考成本、效率等因素选择合适的小分子化合物及生长因子组合。

实施例6幼儿及成年背根节神经元年龄相关的特征鉴定

1.衰老标记物β-半乳糖苷酶(β-Gal)检测

衰老标记物β-Gal检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司(货号C0602)。先将实施例1中制备的幼儿及成年背根节神经元按适当密度接种于Matrigel预包被的圆形细胞爬片上，在24孔板中培养48小时以后，采用该试剂盒提供的特定固定液固定细胞，然后按照试剂盒说明书配制染色反应液，在37℃孵育10小时左右终止反应。在普通光学显微镜下(宁波永新光学股份有限公司，NIB-100)观察并拍照，代表性结果参见附图图14。分析结果表明，与幼儿皮肤细胞转化制备的背根节神经元比较，成年皮肤细胞转化制备的背根节神经细胞中衰老标记物β-Gal染色阳性细胞更多，且大部分阳性细胞染色密度显著增强。

2.端粒保护性抗氧化酶PRDX1及长寿相关异染色质蛋白(HP1γ)表达水平检测

端粒保护性抗氧化酶PRDX1及长寿相关异染色质蛋白(HP1γ)表达水平的检测被认为可以反映细胞的相对年龄特征(2017,Tang,Frontiers in Mol Neurosci)。其检测按照实施例1中的免疫荧光细胞化学染色方法进行。抗体来源及稀释度参见表2，染色代表性结果分别参见附图图14(PRDX1)及图15(HP1γ)。分析结果表明，与幼儿皮肤细胞转化制备的背根节神经元比较，成年皮肤细胞转化制备的背根节神经细胞中端粒保护性抗氧化酶PRDX1及长寿相关异染色质蛋白(HP1γ)表达水平都显著降低。

综合上述年龄相关的特征鉴定结果表明，与幼儿皮肤细胞转化的DRGN比较，成年人皮肤细胞转化的DRGN显示了系列老化相关的特征，提示直接转分化过程并没有出现像iPSC技术一样的年龄逆转，而是保留了源细胞的相应年龄特征。

实施例7背根节神经元在神经痛新药筛选中的应用

先将若干96孔培养板按上述方法预包被过夜，取出一管冻存神经细胞，在水浴中小心快速解冻复苏，按适当密度接种后，把预先准备好的待筛选化合物加入预先设计好的各孔中(应含溶剂对照、阳性对照等)，轻轻混匀后，放回细胞培养箱中，培养适当时间后，按照适宜的方法进行定性、定量分析，确定有效化合物。最优活性化合物可以进一步采用背根节神经元来研究其作用机制、明确主要作用靶点、优化结构以改善成药性、并利用作用靶点开发潜在的基因疗法等。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，然而，应当理解的是，以上所述实施例无意于限制本发明的范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 宁波易赛腾生物科技有限公司

<120> 一种从非神经细胞转化制备保留年龄特征的人源性背根节神经元的方法

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 714

<212> DNA

<213> human NGN1 cDNA

<400> 1

atgccagccc gccttgagac ctgcatctcc gacctcgact gcgccagcag cagcggcagt 60

gacctatccg gcttcctcac cgacgaggaa gactgtgcca gactccaaca ggcagcctcc 120

gcttcggggc cgcccgcgcc ggcccgcagg ggcgcgccca atatctcccg ggcgtctgag 180

gttccagggg cacaggacga cgagcaggag aggcggcggc gccgcggccg gacgcgggtc 240

cgctccgagg cgctgctgca ctcgctgcgc aggagccggc gcgtcaaggc caacgatcgc 300

gagcgcaacc gcatgcacaa cttgaacgcg gccctggacg cactgcgcag cgtgctgccc 360

tcgttccccg acgacaccaa gctcaccaaa atcgagacgc tgcgcttcgc ctacaactac 420

atctgggctc tggccgagac actgcgcctg gcggatcaag ggctgcccgg aggcggtgcc 480

cgggagcgcc tcctgccgcc gcagtgcgtc ccctgcctgc ccggtccccc aagccccgcc 540

agcgacgcgg agtcctgggg ctcaggtgcc gccgccgcct ccccgctctc tgaccccagt 600

agcccagccg cctccgaaga cttcacctac cgccccggcg accctgtttt ctccttccca 660

agcctgccca aagacttgct ccacacaacg ccctgtttca ttccttacca ctag 714

<210> 2

<211> 237

<212> PRT

<213> human NGN1 protein

<400> 2

Met Pro Ala Arg Leu Glu Thr Cys Ile Ser Asp Leu Asp Cys Ala Ser

1 5 10 15

Ser Ser Gly Ser Asp Leu Ser Gly Phe Leu Thr Asp Glu Glu Asp Cys

20 25 30

Ala Arg Leu Gln Gln Ala Ala Ser Ala Ser Gly Pro Pro Ala Pro Ala

35 40 45

Arg Arg Gly Ala Pro Asn Ile Ser Arg Ala Ser Glu Val Pro Gly Ala

50 55 60

Gln Asp Asp Glu Gln Glu Arg Arg Arg Arg Arg Gly Arg Thr Arg Val

65 70 75 80

Arg Ser Glu Ala Leu Leu His Ser Leu Arg Arg Ser Arg Arg Val Lys

85 90 95

Ala Asn Asp Arg Glu Arg Asn Arg Met His Asn Leu Asn Ala Ala Leu

100 105 110

Asp Ala Leu Arg Ser Val Leu Pro Ser Phe Pro Asp Asp Thr Lys Leu

115 120 125

Thr Lys Ile Glu Thr Leu Arg Phe Ala Tyr Asn Tyr Ile Trp Ala Leu

130 135 140

Ala Glu Thr Leu Arg Leu Ala Asp Gln Gly Leu Pro Gly Gly Gly Ala

145 150 155 160

Arg Glu Arg Leu Leu Pro Pro Gln Cys Val Pro Cys Leu Pro Gly Pro

165 170 175

Pro Ser Pro Ala Ser Asp Ala Glu Ser Trp Gly Ser Gly Ala Ala Ala

180 185 190

Ala Ser Pro Leu Ser Asp Pro Ser Ser Pro Ala Ala Ser Glu Asp Phe

195 200 205

Thr Tyr Arg Pro Gly Asp Pro Val Phe Ser Phe Pro Ser Leu Pro Lys

210 215 220

Asp Leu Leu His Thr Thr Pro Cys Phe Ile Pro Tyr His

225 230 235

<210> 3

<211> 819

<212> DNA

<213> human NGN2 cDNA

<400> 3

atgttcgtca aatccgagac cttggagttg aaggaggaag aggacgtgtt agtgctgctc 60

ggatcggcct cccccgcctt ggcggccctg accccgctgt catccagcgc cgacgaagaa 120

gaggaggagg agccgggcgc gtcaggcggg gcgcgtcggc agcgcggggc tgaggccggg 180

cagggggcgc ggggcggcgt ggctgcgggt gcggagggct gccggcccgc acggctgctg 240

ggtctggtac acgattgcaa acggcgccct tcccgggcgc gggccgtctc ccgaggcgcc 300

aagacggccg agacggtgca gcgcatcaag aagacccgta gactgaaggc caacaaccgc 360

gagcgaaacc gcatgcacaa cctcaacgcg gcactggacg cgctgcgcga ggtgctcccc 420

acgttccccg aggacgccaa gctcaccaag atcgagaccc tgcgcttcgc ccacaactac 480

atctgggcac tcaccgagac cctgcgcctg gcggatcact gcgggggcgg cggcgggggc 540

ctgccggggg cgctcttctc cgaggcagtg ttgctgagcc cgggaggcgc cagcgccgcc 600

ctgagcagca gcggagacag cccctcgccc gcctccacgt ggagttgcac caacagcccc 660

gcgccgtcct cctccgtgtc ctccaattcc acctccccct acagctgcac tttatcgccc 720

gccagcccgg ccgggtcaga catggactat tggcagcccc cacctcccga caagcaccgc 780

tatgcacctc acctccccat agccagggat tgtatctag 819

<210> 4

<211> 272

<212> PRT

<213> human NGN2 protein

<400> 4

Met Phe Val Lys Ser Glu Thr Leu Glu Leu Lys Glu Glu Glu Asp Val

1 5 10 15

Leu Val Leu Leu Gly Ser Ala Ser Pro Ala Leu Ala Ala Leu Thr Pro

20 25 30

Leu Ser Ser Ser Ala Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gly Ala Ser

35 40 45

Gly Gly Ala Arg Arg Gln Arg Gly Ala Glu Ala Gly Gln Gly Ala Arg

50 55 60

Gly Gly Val Ala Ala Gly Ala Glu Gly Cys Arg Pro Ala Arg Leu Leu

65 70 75 80

Gly Leu Val His Asp Cys Lys Arg Arg Pro Ser Arg Ala Arg Ala Val

85 90 95

Ser Arg Gly Ala Lys Thr Ala Glu Thr Val Gln Arg Ile Lys Lys Thr

100 105 110

Arg Arg Leu Lys Ala Asn Asn Arg Glu Arg Asn Arg Met His Asn Leu

115 120 125

Asn Ala Ala Leu Asp Ala Leu Arg Glu Val Leu Pro Thr Phe Pro Glu

130 135 140

Asp Ala Lys Leu Thr Lys Ile Glu Thr Leu Arg Phe Ala His Asn Tyr

145 150 155 160

Ile Trp Ala Leu Thr Glu Thr Leu Arg Leu Ala Asp His Cys Gly Gly

165 170 175

Gly Gly Gly Gly Leu Pro Gly Ala Leu Phe Ser Glu Ala Val Leu Leu

180 185 190

Ser Pro Gly Gly Ala Ser Ala Ala Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ser Pro

195 200 205

Ser Pro Ala Ser Thr Trp Ser Cys Thr Asn Ser Pro Ala Pro Ser Ser

210 215 220

Ser Val Ser Ser Asn Ser Thr Ser Pro Tyr Ser Cys Thr Leu Ser Pro

225 230 235 240

Ala Ser Pro Ala Gly Ser Asp Met Asp Tyr Trp Gln Pro Pro Pro Pro

245 250 255

Asp Lys His Arg Tyr Ala Pro His Leu Pro Ile Ala Arg Asp Cys Ile

260 265 270

<210> 5

<211> 711

<212> DNA

<213> human ASCL1 cDNA

<400> 5

atggaaagct ctgccaagat ggagagcggc ggcgccggcc agcagcccca gccgcagccc 60

cagcagccct tcctgccgcc cgcagcctgt ttctttgcca cggccgcagc cgcggcggcc 120

gcagccgccg cagcggcagc gcagagcgcg cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 180

cagcaggcgc cgcagctgag accggcggcc gacggccagc cctcaggggg cggtcacaag 240

tcagcgccca agcaagtcaa gcgacagcgc tcgtcttcgc ccgaactgat gcgctgcaaa 300

cgccggctca acttcagcgg ctttggctac agcctgccgc agcagcagcc ggccgccgtg 360

gcgcgccgca acgagcgcga gcgcaaccgc gtcaagttgg tcaacctggg ctttgccacc 420

cttcgggagc acgtccccaa cggcgcggcc aacaagaaga tgagtaaggt ggagacactg 480

cgctcggcgg tcgagtacat ccgcgcgctg cagcagctgc tggacgagca tgacgcggtg 540

agcgccgcct tccaggcagg cgtcctgtcg cccaccatct cccccaacta ctccaacgac 600

ttgaactcca tggccggctc gccggtctca tcctactcgt cggacgaggg ctcttacgac 660

ccgctcagcc ccgaggagca ggagcttctc gacttcacca actggttctg a 711

<210> 6

<211> 236

<212> PRT

<213> human ASCL1 protein

<400> 6

Met Glu Ser Ser Ala Lys Met Glu Ser Gly Gly Ala Gly Gln Gln Pro

1 5 10 15

Gln Pro Gln Pro Gln Gln Pro Phe Leu Pro Pro Ala Ala Cys Phe Phe

20 25 30

Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln

35 40 45

Ser Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ala Pro

50 55 60

Gln Leu Arg Pro Ala Ala Asp Gly Gln Pro Ser Gly Gly Gly His Lys

65 70 75 80

Ser Ala Pro Lys Gln Val Lys Arg Gln Arg Ser Ser Ser Pro Glu Leu

85 90 95

Met Arg Cys Lys Arg Arg Leu Asn Phe Ser Gly Phe Gly Tyr Ser Leu

100 105 110

Pro Gln Gln Gln Pro Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg

115 120 125

Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Ala Thr Leu Arg Glu His

130 135 140

Val Pro Asn Gly Ala Ala Asn Lys Lys Met Ser Lys Val Glu Thr Leu

145 150 155 160

Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Gln Leu Leu Asp Glu

165 170 175

His Asp Ala Val Ser Ala Ala Phe Gln Ala Gly Val Leu Ser Pro Thr

180 185 190

Ile Ser Pro Asn Tyr Ser Asn Asp Leu Asn Ser Met Ala Gly Ser Pro

195 200 205

Val Ser Ser Tyr Ser Ser Asp Glu Gly Ser Tyr Asp Pro Leu Ser Pro

210 215 220

Glu Glu Gln Glu Leu Leu Asp Phe Thr Asn Trp Phe

225 230 235

<210> 7

<211> 1425

<212> DNA

<213> human SOX4 cDNA

<400> 7

atggtgcagc aaaccaacaa tgccgagaac acggaagcgc tgctggccgg cgagagctcg 60

gactcgggcg ccggcctcga gctgggaatc gcctcctccc ccacgcccgg ctccaccgcc 120

tccacgggcg gcaaggccga cgacccgagc tggtgcaaga ccccgagtgg gcacatcaag 180

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<400> 17

atgatgatga tgtccctgaa cagcaagcag gcgtttagca tgccgcacgg cggcagcctg 60

cacgtggagc ccaagtactc ggcactgcac agcacctcgc cgggctcctc ggctcccacc 120

gcgccctcgg ccagctcccc cagcagctcg agcaacgctg gtggtggcgg cggcggcggc 180

ggcggcggcg gaggccgaag cagcagctcc agcagcagtg gcagcagcgg cggcgggggc 240

tcggaggcta tgcggagagc ctgtcttcca accccaccga gcaatatatt cggcgggctg 300

gatgagagtc tgctggcccg cgccgaggct ctggcagccg tggacatcgt ctcccagagc 360

aagagccacc accaccatcc accccaccac agccccttca aaccggacgc cacctaccac 420

actatgaata ccatcccgtg cacgtcggcc gcctcttctt catcggtgcc catctcgcac 480

ccttccgcgt tggcgggcac gcaccaccac caccaccatc accaccacca ccaccaccaa 540

ccgcaccagg cgctggaggg cgagctgctg gagcacctga gtcccgggct ggccctgggc 600

gctatggcgg gccccgacgg cgctgtggtg tccacgccgg ctcacgcgcc gcacatggcc 660

accatgaacc ccatgcacca agcagcgctc agcatggccc acgcgcacgg gctgccgtca 720

cacatgggct gcatgagcga cgtggacgcc gacccgcggg acctggaggc attcgccgag 780

cgcttcaagc agcgacgcat caagctgggg gtgacccagg cagatgtggg ctccgcgctg 840

gccaacctca agatccccgg cgtgggctcg cttagccaga gcaccatctg caggttcgag 900

tccctcacac tgtcgcacaa taatatgatc gcgctcaaac ccatcctgca ggcatggctc 960

gaggaggccg agaagtccca ccgcgagaag ctcaccaagc ctgaactctt caatggcgcg 1020

gagaagaagc gcaagcgcac gtccatcgct gcgccagaga agcgctcgct cgaagcctac 1080

tttgccattc agcctcggcc ctcctctgaa aagatcgccg ccatcgcgga gaagctggac 1140

ctgaagaaaa acgtggtgcg cgtctggttc tgcaaccaga ggcagaaaca gaaaagaatg 1200

aaatattccg ccggcattta g 1221

<210> 18

<211> 406

<212> PRT

<213> human BRN3b protein

<400> 18

Met Met Met Met Ser Leu Asn Ser Lys Gln Ala Phe Ser Met Pro His

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu His Val Glu Pro Lys Tyr Ser Ala Leu His Ser Thr

20 25 30

Ser Pro Gly Ser Ser Ala Pro Thr Ala Pro Ser Ala Ser Ser Pro Ser

35 40 45

Ser Ser Ser Asn Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

50 55 60

Gly Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly

65 70 75 80

Ser Glu Ala Met Arg Arg Ala Cys Leu Pro Thr Pro Pro Ser Asn Ile

85 90 95

Phe Gly Gly Leu Asp Glu Ser Leu Leu Ala Arg Ala Glu Ala Leu Ala

100 105 110

Ala Val Asp Ile Val Ser Gln Ser Lys Ser His His His His Pro Pro

115 120 125

His His Ser Pro Phe Lys Pro Asp Ala Thr Tyr His Thr Met Asn Thr

130 135 140

Ile Pro Cys Thr Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ser Val Pro Ile Ser His

145 150 155 160

Pro Ser Ala Leu Ala Gly Thr His His His His His His His His His

165 170 175

His His His Gln Pro His Gln Ala Leu Glu Gly Glu Leu Leu Glu His

180 185 190

Leu Ser Pro Gly Leu Ala Leu Gly Ala Met Ala Gly Pro Asp Gly Ala

195 200 205

Val Val Ser Thr Pro Ala His Ala Pro His Met Ala Thr Met Asn Pro

210 215 220

Met His Gln Ala Ala Leu Ser Met Ala His Ala His Gly Leu Pro Ser

225 230 235 240

His Met Gly Cys Met Ser Asp Val Asp Ala Asp Pro Arg Asp Leu Glu

245 250 255

Ala Phe Ala Glu Arg Phe Lys Gln Arg Arg Ile Lys Leu Gly Val Thr

260 265 270

Gln Ala Asp Val Gly Ser Ala Leu Ala Asn Leu Lys Ile Pro Gly Val

275 280 285

Gly Ser Leu Ser Gln Ser Thr Ile Cys Arg Phe Glu Ser Leu Thr Leu

290 295 300

Ser His Asn Asn Met Ile Ala Leu Lys Pro Ile Leu Gln Ala Trp Leu

305 310 315 320

Glu Glu Ala Glu Lys Ser His Arg Glu Lys Leu Thr Lys Pro Glu Leu

325 330 335

Phe Asn Gly Ala Glu Lys Lys Arg Lys Arg Thr Ser Ile Ala Ala Pro

340 345 350

Glu Lys Arg Ser Leu Glu Ala Tyr Phe Ala Ile Gln Pro Arg Pro Ser

355 360 365

Ser Glu Lys Ile Ala Ala Ile Ala Glu Lys Leu Asp Leu Lys Lys Asn

370 375 380

Val Val Arg Val Trp Phe Cys Asn Gln Arg Gln Lys Gln Lys Arg Met

385 390 395 400

Lys Tyr Ser Ala Gly Ile

405

<210> 19

<211> 1017

<212> DNA

<213> human BRN3c cDNA

<400> 19

atgatggcca tgaactccaa gcagcctttc ggcatgcacc cggtgctgca agaacccaaa 60

ttctccagtc tgcactctgg ctccgaggct atgcgccgag tctgtctccc agccccgcag 120

ctgcagggta atatatttgg aagctttgat gagagcctgc tggcacgcgc cgaagctctg 180

gcggcggtgg atatcgtctc ccacggcaag aaccatccgt tcaagcccga cgccacctac 240

cataccatga gcagcgtgcc ctgcacgtcc acttcgtcca ccgtgcccat ctcccaccca 300

gctgcgctca cctcacaccc tcaccacgcc gtgcaccagg gcctcgaagg cgacctgctg 360

gagcacatct cgcccacgct gagtgtgagc ggcctgggcg ctccggaaca ctcggtgatg 420

cccgcacaga tccatccaca ccacctgggc gccatgggcc acctgcacca ggccatgggc 480

atgagtcacc cgcacaccgt ggcccctcat agcgccatgc ctgcatgcct cagcgacgtg 540

gagtcagacc cgcgcgagct ggaagccttc gccgagcgct tcaagcagcg gcgcatcaag 600

ctgggggtga cccaggcgga cgtgggcgcg gctctggcta atctcaagat ccccggcgtg 660

ggctcgctga gccaaagcac catctgcagg ttcgagtctc tcactctctc gcacaacaac 720

atgatcgctc tcaagccggt gctccaggcc tggttggagg aggccgaggc cgcctaccga 780

gagaagaaca gcaagccaga gctcttcaac ggcagcgaac ggaagcgcaa acgcacgtcc 840

atcgcggcgc cggagaagcg ttcactcgag gcctatttcg ctatccagcc acgtccttca 900

tctgagaaga tcgcggccat cgctgagaaa ctggacctta aaaagaacgt ggtgagagtc 960

tggttctgca accagagaca gaaacagaaa cgaatgaagt attcggctgt ccactga 1017

<210> 20

<211> 338

<212> PRT

<213> human BRN3c protein

<400> 20

Met Met Ala Met Asn Ser Lys Gln Pro Phe Gly Met His Pro Val Leu

1 5 10 15

Gln Glu Pro Lys Phe Ser Ser Leu His Ser Gly Ser Glu Ala Met Arg

20 25 30

Arg Val Cys Leu Pro Ala Pro Gln Leu Gln Gly Asn Ile Phe Gly Ser

35 40 45

Phe Asp Glu Ser Leu Leu Ala Arg Ala Glu Ala Leu Ala Ala Val Asp

50 55 60

Ile Val Ser His Gly Lys Asn His Pro Phe Lys Pro Asp Ala Thr Tyr

65 70 75 80

His Thr Met Ser Ser Val Pro Cys Thr Ser Thr Ser Ser Thr Val Pro

85 90 95

Ile Ser His Pro Ala Ala Leu Thr Ser His Pro His His Ala Val His

100 105 110

Gln Gly Leu Glu Gly Asp Leu Leu Glu His Ile Ser Pro Thr Leu Ser

115 120 125

Val Ser Gly Leu Gly Ala Pro Glu His Ser Val Met Pro Ala Gln Ile

130 135 140

His Pro His His Leu Gly Ala Met Gly His Leu His Gln Ala Met Gly

145 150 155 160

Met Ser His Pro His Thr Val Ala Pro His Ser Ala Met Pro Ala Cys

165 170 175

Leu Ser Asp Val Glu Ser Asp Pro Arg Glu Leu Glu Ala Phe Ala Glu

180 185 190

Arg Phe Lys Gln Arg Arg Ile Lys Leu Gly Val Thr Gln Ala Asp Val

195 200 205

Gly Ala Ala Leu Ala Asn Leu Lys Ile Pro Gly Val Gly Ser Leu Ser

210 215 220

Gln Ser Thr Ile Cys Arg Phe Glu Ser Leu Thr Leu Ser His Asn Asn

225 230 235 240

Met Ile Ala Leu Lys Pro Val Leu Gln Ala Trp Leu Glu Glu Ala Glu

245 250 255

Ala Ala Tyr Arg Glu Lys Asn Ser Lys Pro Glu Leu Phe Asn Gly Ser

260 265 270

Glu Arg Lys Arg Lys Arg Thr Ser Ile Ala Ala Pro Glu Lys Arg Ser

275 280 285

Leu Glu Ala Tyr Phe Ala Ile Gln Pro Arg Pro Ser Ser Glu Lys Ile

290 295 300

Ala Ala Ile Ala Glu Lys Leu Asp Leu Lys Lys Asn Val Val Arg Val

305 310 315 320

Trp Phe Cys Asn Gln Arg Gln Lys Gln Lys Arg Met Lys Tyr Ser Ala

325 330 335

Val His

Claims (10)

1.一种从非神经细胞转化制备保留年龄特征的背根节神经元的方法，其包括如下步骤：

1)构建含有细胞转分化基因组合的病毒载体，并通过转染细胞进行病毒包装；

2)培养供体源细胞，并用经包装的病毒感染经培养的供体源细胞；

3)在诱导分化培养液中诱导所述供体源细胞直接转分化为背根节神经元；以及

4)分离纯化所得的背根节神经元，

其中，所述细胞转分化基因组合包含以下基因的组合：(1)选自NGN1、NGN2和ASCL1中的至少一种基因；(2)选自ISL1、ISL2、Brn3a、Brn3b和Brn3c中的至少两种基因；以及任选的(3)选自SOX4和SOX11中的至少一种基因。

2.权利要求1所述的方法，其中所述基因为来源于人、小鼠或其它任何种属的同源基因。

3.权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述病毒载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体或AAV病毒载体；和/或载体中调控表达水平的启动子选自CMV、CAG、EF1α、PGK、TRETight、TRE3G中的任何一种或多种，优选地，所述启动子选自CMV。

4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在病毒载体的构建过程中可通过不同来源的2A序列或IRES序列来连接上述基因，并可任选地进一步引入荧光报告基因。

5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述供体源细胞为任何年龄的正常人或患者的皮肤成纤维细胞或其它非神经元细胞，例如干细胞、肺成纤维细胞、包皮成纤维细胞、胶质细胞，优选地，所述供体源细胞为正常人或患者的皮肤成纤维细胞。

6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在培养供体源细胞的过程中采用合适的包被基质对培养容器进行预包被，所述合适的包被基质选自层粘连蛋白、明胶、纤连蛋白、Matrigel中的至少一种，优选地，所述包被基质为Matrigel。

7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述诱导分化培养液含有促进转分化的小分子化合物以及生长因子的组合，所述促进转分化的小分子化合物包含佛司可林(FSK)、cAMP、双丁酰环腺苷酸(DB-cAMP)、RA、LDN-193189(LDN)、SB431542、CHIR99021中的一种以上，优选地，所述小分子化合物为佛司可林和/或LDN-193189；所述生长因子包含bFGF2、NGF、GDNF、NT3中的一种以上，优选地，所述生长因子为bFGF2。

8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述分离纯化是将转分化后的细胞消化并重悬为单细胞悬浮液，用细胞滤器、流式细胞仪或在明胶包被的培养皿上差异性贴壁等方法以分离得到高纯度的背根节神经元。

9.采用权利要求1-8中任一项所述的方法制备得到的保留年龄特征的背根节神经元。

10.权利要求9所述的保留年龄特征的背根节神经元在建立用于筛选疼痛治疗药物的方法中的用途。

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