JP2016518137A - 多分化能細胞および多能性細胞の分化を方向付けることによって発生させる皮質介在ニューロンおよびその他のニューロン細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
本開示に記載される研究は、一部において、アメリカ国立衛生研究所からの補助金交付番号2RO1MH06691および1RC1MH089690によって資金提供を受けた。米国政府は、本開示について特定の権利を有する。
PCT国際特許出願として2014年4月28日に出願された本出願は、その全体が参考として援用される2013年4月26日に出願された米国仮特許出願第61/816,624号に対する利益を主張する。
技術分野
本開示は一般に、幹細胞および神経前駆細胞のin vitroにおける分化、障害および疾患を研究するための、in vitroにおける細胞ベースのモデル系の開発、ならびにニューロン細胞の方向付けられた分化を介してin vitroで発生させた細胞の投与による障害および疾患の処置に関する。より具体的に、本開示は、例えば、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および視索前野コリン作動性ニューロン、ならびにこれらの前駆体細胞を含む、ニューロン細胞およびニューロン細胞の前駆体細胞を発生させるためのin vitroにおける方法、およびこれらを含む組成物を提供する。このようなニューロン細胞は、ニューロン細胞を発生させるために幹細胞を含む多分化能、多能性、および/または全能性細胞を、SMADおよびWntシグナル伝達阻害剤および/またはアンタゴニストと接触させ、かつ、1つまたは複数のSHHシグナル伝達経路の活性化因子と、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および/または視索前野コリン作動性ニューロンのマーカー1つまたは複数を産生するニューロン細胞を発生させるのに要求される時点において、これに要求される持続期間にわたり接触させることにより発生させる。本明細書で開示されるin vitroにおける方法により発生させた、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および視索前野コリン作動性ニューロンは、神経変性障害および神経精神障害ならびに神経変性疾患および神経精神疾患を処置するのに治療的に使用することができ、このような神経変性障害および神経精神障害ならびに神経変性疾患および神経精神疾患を研究するためモデル系として使用することができ、かつ、このような障害および疾患を処置するための治療用候補化合物をスクリーニングおよび同定するために使用することができる。
神経学的障害の処置は従来、1つまたは複数の低分子のin vivoにおける投与を含んだ。これらの治療アプローチがin vivoにおいて神経学的障害に罹患した患者にもたらす有効性は、残念ながら、極めて微弱なものであった。
マウス皮質介在ニューロンは、Lhx6::GFPレポーターマウスESC系を使用して導出されているが、皮質介在ニューロン発生の効率は低かった(Maroofら、J Neurosci、30巻:4667〜4675頁(2010年))。ヒト皮質介在ニューロンの発生上の起源は、いまだ確立されておらず、介在ニューロン特化は、哺乳動物の種間で異なりうることが報告されている(Letinicら、Nature、417巻:645〜649頁(2002年);ならびにYuおよびZecevic、J Neurosci、31巻:2413〜2420頁(2011年))。さらに、長期間を要するin vivoにおける皮質介在ニューロンの発生は、ヒト細胞による、in vitroにおける分化の達成に対して、難題を提示してきた。したがって、Maroofらにより記載された条件を、ヒトESCおよび/または他の多能性幹細胞からのヒト皮質介在ニューロンの発生に適用しうるのかどうかは、依然として不確定である。
a.多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される、1つまたは複数の出発細胞を、少なくとも2つのSMAD阻害剤および少なくとも1つのWntシグナル伝達アンタゴニストと接触させて、該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からの該前脳前駆体細胞の発生に助力するステップと、
b.任意選択で、発生させた該前脳前駆体細胞を、それらのさらなる分化に助力する条件に晒すステップと
を含むin vitroにおける方法を提供する。
本開示は、前脳ニューロン分化は、増強することができ、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および視索前野コリン作動性ニューロンを含む、中枢神経系(CNS)のある特定のニューロンは、ある特定の多能性および/または多分化能細胞(例えば、ヒト胚性幹細胞(hESC)および/またはヒト人工多能性幹細胞(hiPSC))を、1つまたは複数のWntアンタゴニストと組み合わせた、1つ、好ましくは2つまたはそれより多くのSMAD転写因子阻害剤と、ニューロン前駆体細胞を発生させるのに適切な濃度で、これに適切な持続期間にわたり接触させることにより、in vitroで効率的に誘導することができ、これらのニューロン前駆体細胞を、適切な濃度の1つまたは複数のSHHシグナル伝達活性化因子と、適切な持続期間にわたり接触させ、これにより、皮質介在ニューロンもしくはその前駆体細胞のマーカー1つもしくは複数、視床下部ニューロンもしくはその前駆体細胞のマーカー1つもしくは複数、および/または視索前野コリン作動性ニューロンもしくはその前駆体細胞のマーカー1つもしくは複数の産生を誘導しうるという発見に基づく。
(1)皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞のマーカー1つまたは複数を含むニューロンを含む、ニューロンを発生させるためのin vitroにおける方法であって、
a.多能性細胞および/または多分化能細胞を、1つまたは複数のSMAD阻害剤および1つまたは複数のWntシグナル伝達アンタゴニストと接触させ、これにより、該多能性および/または多分化能細胞からのニューロン前駆体細胞の発生を誘導するステップと、
b.ニューロン前駆体細胞を、1つまたは複数のSHHシグナル伝達活性化因子と接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞内で、皮質介在ニューロンおよび/または皮質介在ニューロン前駆体細胞のマーカー1つまたは複数の産生を誘導するステップと
による多能性細胞または多分化能細胞の分化を含むin vitroにおける方法;
(2)視床下部ニューロンおよび/または視床下部ニューロン前駆体細胞のマーカー1つまたは複数を産生するニューロン細胞を発生させるためのin vitroにおける方法であって、ニューロン細胞を、多能性細胞または多分化能細胞の分化により発生させ、
a.1つもしくは複数の多能性細胞および/または1つもしくは複数の多分化能細胞を、(i)2つまたはそれより多くのSMAD阻害剤、および(ii)1つまたは複数のWntシグナル伝達アンタゴニストと接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞の発生を誘導するステップと、
b.ニューロン前駆体細胞を、1つまたは複数のSHHシグナル伝達活性化因子と接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞内で、視床下部ニューロンおよび/または視床下部ニューロン前駆体細胞のマーカー1つまたは複数の産生を誘導するステップと
を含むin vitroにおける方法;
(3)視索前野コリン作動性ニューロンおよび/または視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞のマーカー1つまたは複数を産生するニューロン細胞を発生させるためのin vitroにおける方法であって、ニューロン細胞を、多能性細胞および/または多分化能細胞の分化により発生させ、
a.1つもしくは複数の多能性細胞および/または1つもしくは複数の多分化能細胞を、(i)2つまたはそれより多くのSMAD阻害剤、および(ii)1つまたは複数のWntシグナル伝達アンタゴニストと接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞の発生を誘導するステップと、
b.ニューロン前駆体細胞を、1つまたは複数のSHHシグナル伝達活性化因子と接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞内で、視索前野コリン作動性ニューロンおよび/または視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞のマーカー1つまたは複数の産生を誘導するステップと
を含むin vitroにおける方法;
(4)皮質介在ニューロン細胞および/または皮質介在ニューロン前駆体細胞のマーカー1つまたは複数を産生する1つまたは複数のin vitroで分化させたニューロン細胞を含む組成物であって、in vitroで分化させたニューロン細胞が、
a.多分化能細胞または多能性細胞を、2つまたはそれより多くのSMADシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、
b.多分化能細胞または多能性細胞を、1つまたは複数のWntシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、
c.多分化能細胞または多能性細胞を、1つまたは複数のSHHシグナル伝達活性化因子と接触させるステップ
により産生される、組成物;
(5)視床下部ニューロンまたは視床下部ニューロン前駆体細胞のマーカー1つまたは複数を産生する1つまたは複数のin vitroで分化させたニューロン細胞を含む組成物であって、in vitroで分化させたニューロン細胞が、
a.多分化能細胞または多能性細胞を、2つまたはそれより多くのSMADシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、
b.多分化能細胞または多能性細胞を、1つまたは複数のWntシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、
c.多分化能細胞または多能性細胞を、1つまたは複数のSHHシグナル伝達活性化因子と接触させるステップ
により産生される、組成物;
(6)視索前野コリン作動性ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞のマーカー1つまたは複数を産生する1つまたは複数のin vitroで分化させたニューロン細胞を含む組成物であって、in vitroで分化させたニューロン細胞が、
a.多分化能細胞または多能性細胞を、2つまたはそれより多くのSMADシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、
b.多分化能細胞または多能性細胞を、1つまたは複数のWntシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、
c.多分化能細胞または多能性細胞を、1つまたは複数のSHHシグナル伝達活性化因子と接触させるステップ
により産生される、組成物;
(7)SMADおよびWntシグナル伝達阻害剤および/またはアンタゴニストならびにSHHの活性化因子を同定し、特徴付けるための細胞ベースの方法;
(8)SMADおよびWntシグナル伝達阻害剤および/またはアンタゴニストならびにSHHシグナル伝達活性化因子の組合せを含む組成物;
(9)前脳細胞を発生させるためのin vitroにおける方法;
(10)パーキンソン病、アルツハイマー病、ALS、多系統萎縮症などの神経変性障害および疾患、ならびに統合失調症および自閉症関連障害などの神経精神障害および疾患を含む神経学的障害および疾患を処置するための方法であって、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および/または視索前野コリン作動性ニューロンをin vivoにおいて患者に投与するステップを含む方法
を提供する。
本明細書で使用される場合、以下の用語(およびその同族語)は、文脈によりそうでないことが要求されない限りにおいて、以下でそれらに帰せられた意味を有する。
本開示は、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、視索前野コリン作動性ニューロンのマーカー1つまたは複数を含むニューロン細胞を含む、ニューロン細胞を発生させるためのin vitroにおける方法を提供する。本方法は、多能性細胞および/または多分化能細胞を、1つまたは複数のSMADシグナル伝達阻害剤および1つまたは複数のWntシグナル伝達アンタゴニストと接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞の発生を誘導するステップを含み、このニューロン前駆体細胞は、1つまたは複数のSHHシグナル伝達活性化因子と接触させることにより、このニューロン前駆体細胞を、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、視索前野コリン作動性ニューロンのマーカー1つまたは複数を含むニューロン細胞に分化するように誘導することができる。
本明細書で開示される通り、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および視索前野コリン作動性ニューロンは、1つまたは複数のSHHシグナル伝達活性化因子を伴うニューロン前駆体細胞の分化を誘導することにより発生させることができる。前方/前脳運命は、hPSCのニューロン分化中におけるデフォルトのプログラムとして特定され得る(Chambersら、Nat Biotechnol、27巻:275〜280頁(2009年);Eirakuら、Cell Stem Cell、3巻:519〜532頁(2008年);Espuny−Camachoら、Neuron、77巻:440〜456頁(2013年);およびGaspardら、Nature、455巻:351〜357頁(2008年))。全ての細胞または細胞系が、神経および前方運命を、同等の効率で成立させるわけではない(Kimら、Cell Stem Cell、8巻:695〜706頁(2011年);およびWuら、Proc Natl Acad Sci USA、104巻:13821〜13826頁(2007年))。細胞を分化させることにより分泌されるパターン化因子として、例えば、線維芽細胞増殖因子(FGF)、Wnt、およびレチノイドが挙げられ、これらの因子は、前脳の誘導を抑制し、これにより、尾側の細胞運命の誘導を誘発しうる。
本開示の方法は、ある特定の多分化能、多能性、および/または全能性細胞を含む未分化および/または傾倒していない細胞は、1つまたは複数のSMAD阻害剤および1つまたは複数のWntアンタゴニストの組合せと接触させることにより、ニューロン細胞を発生させるように誘導しうるという観察に部分的に基づく。本開示の一部として、このようなニューロン細胞は、SHH活性化因子の性質および濃度の両方のほか、SHH活性化因子と接触させる持続期間を含む、接触させるタイミングを含む、適切な条件下で、ニューロン細胞を、SHHの1つまたは複数の活性化因子と接触させることにより、皮質ニューロン、視床下部ニューロン、および視索前野皮質ニューロンを発生させるようにさらに誘導しうることが発見された。
「SMAD(small mothers against decapentaplegic)」の阻害剤
SMADシグナル伝達経路の阻害は、TGFβ/アクチビン/Nodal経路およびBMP経路の阻害を含む。
例示的なBMP経路の阻害剤として、ノギン、BMP受容体阻害剤、SMAD1/5/8リン酸化の阻害剤、SMAD1/5/8とSMAD4との相互作用の阻害剤、ならびにSMAD6およびSMAD7の活性化因子/アゴニストが挙げられるがこれらに限定されない。下記に記載される区分は、単に構成上の目的のためのものであり、当業者には、化合物は、経路内の1つまたは複数の点に影響を及ぼす可能性があり、したがって、化合物は、規定された区分のうちの複数において機能しうることが公知である。
SMADシグナル伝達阻害剤は、二重SMAD阻害剤であるSB431542およびLDN−193189、またはこれらの機能的な誘導体および/もしくは改変体を含みうる。本明細書で使用される場合、「LSB」および「XLSB」という用語については、既に「定義」節で記載した。二重SMAD阻害剤は、分化の効率を実質的に増大させる。
「ウィングレス」または「Wnt」とは、β−カテニンを伴うかまたは伴わずに媒介される、FrizzledおよびLRPDerailed/RYK受容体など、WntファミリーのリガンドおよびWntファミリーの受容体から構成されるシグナル経路を指す。Wntタンパク質は、腫瘍形成、ならびに細胞運命および胚発生中のパターン化の調節を含む、複数の発生上の過程に関与している。
本明細書では、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および/または視索前野コリン作動性ニューロンのマーカー1つまたは複数を含むニューロン細胞を発生させるためのin vitroにおける方法が提供される。ニューロン前駆体細胞は、多能性細胞または多分化能細胞を、1つまたは複数のSMADシグナル伝達阻害剤および1つまたは複数のWntシグナル伝達アンタゴニストと接触させ、これにより、多能性細胞または多分化能細胞の分化を誘導して、ニューロン前駆体細胞を発生させることにより発生させ、次いで、これらを、1つまたは複数のSHHシグナル伝達活性化因子と接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞内で、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、視索前野コリン作動性ニューロン、またはこれらの前駆体細胞のマーカー1つまたは複数の産生を誘導することができる。
SHHシグナル伝達経路は、細胞運命の決定、組織化の再構築、極性、形態、増殖、および分化を含む胚発生中の多様な過程の調節と関連する(BertrandおよびDahmane、Trends Cell Biol、16巻:597〜605頁(2006年))。ソニックヘッジホッグ(SHH)とは、ヘッジホッグと呼ばれる、哺乳動物のシグナル伝達経路ファミリー内の3つのタンパク質のうちの1つであり、他のものは、インディアンヘッジホッグ(IHH)およびデザートヘッジホッグ(DHH)である。SHHシグナル伝達経路は、2つの膜貫通タンパク質である、Ptc(Patched)およびSmo(Smoothened)を伴う。SHHの非存在下では、Ptcは、Smoと相互作用し、これを阻害する。SHHがPtcに結合すると、Ptcの、Smoとの相互作用が変化し、Smoがもはや阻害されなくなり、Ci/Gliタンパク質の核への移入、および標的遺伝子のための転写活性化因子としての作用がもたらされる。それがSHHが媒介するシグナル伝達経路を増強するのであれば、SHHシグナル伝達経路活性化因子へと特定の限定が付与されることはない。
本明細書で使用される場合、「マーカー」または「細胞マーカー」という用語については、「定義」節で既に記載されており、特定の細胞または細胞型を識別する遺伝子またはタンパク質を指す。細胞のマーカーは、1つのマーカーに限定されなくてもよい。マーカーとは、指定されたマーカー群により、細胞または細胞型を、別の細胞または細胞型から識別しうるような、マーカーの「パターン」を指す場合がある。例えば、本開示の前脳細胞は、前脳細胞を弁別する、1つまたは複数のマーカー、すなわち、FOXA2陽性およびNKX2.1陽性を発現させる。本明細書で使用される場合、「前脳(forebrain)」または「前脳(prosencephalon)」という用語については、「定義」節で既に記載されており、脳の最吻側(最前方)部分を指し、中枢神経系(CNS)の初期発生の間における、脳の1つの主要部分である。前脳は、間脳(腹側視床、視床、視床下部、視床腹部、視床上部、および視蓋前域)と終脳(大脳)とに分かれる。
ある特定の実施形態では、本開示は、腹側前駆細胞を発生させるための方法であって、細胞を、ソニックヘッジホッグ(SHH)などの腹側化因子へと曝露するステップを含む方法を提供する。代替的に、細胞は、Shhを模倣する薬剤またはSHHのアゴニストに曝露される。
神経節隆起に由来する皮質介在ニューロンは、皮質回路内の興奮と抑制との平衡化に関与しうる。加えて、皮質介在ニューロンはまた、発生上の可塑性の制御においても役割を果たし、てんかんから自閉症および統合失調症の範囲にわたる多様な病態において機能不全性となりうる(Barabanら、Proc Natl Acad Sci USA、106巻:15472〜15477頁(2009年);Eaglesonら、Autism Res、4巻:68〜83頁(2011年);Insel、Nature、468巻:187〜193頁(2010年);Lewisら、Nat Rev Neurosci、6巻:312〜324頁(2005年);およびPenagarikanoら、Cell、147巻:235〜246頁(2011年))。
皮質介在ニューロン発生については、マウス胚MGE由来の前駆細胞を、主にマウス皮質錐体ニューロンおよびグリアから構成される「フィーダー培養物」上に播種した共培養系を使用して研究されている(Xuら、J Neurosci、24巻:2612〜2622頁(2004年))。ヒト介在ニューロンの成熟の態様が、この系では、異種移植片と比べて加速されるのかどうかを決定するために、NKX2.1::GFP+細胞を、分化32日目において、FACSにより回収し、解離させたマウス胚皮質の培養物上に再播種した(図7A)。皮質細胞は、腹側由来の皮質介在ニューロンの背側新皮質への遊走の前の段階である、胚生13.5日目のマウス胚から単離した(Andersonら、Science、278巻:474〜476頁(1997年))。
さらなる実施形態では、本開示は、皮質介在ニューロン細胞および/または皮質介在ニューロン前駆体細胞のマーカー1つまたは複数を産生する1つまたは複数のin vitroで分化させたニューロン細胞を含む組成物であって、in vitroで分化させたニューロン細胞が、(a)多分化能細胞または多能性細胞を、2つまたはそれより多くのSMADシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、(b)多分化能細胞または多能性細胞を、1つまたは複数の阻害剤と接触させるステップ、(c)多分化能細胞または多能性細胞を、1つまたは複数のSHHシグWntシグナル伝達ナル伝達活性化因子と接触させるステップにより産生されている、組成物を提供する。
in vitroにおける、ニューロン細胞の、幹細胞または前駆細胞からの導出は、著明な臨床的含意を有し、また、疾患のモデル化および薬物スクリーニングのためにも重要である。本発明のこの方法に従う処置のために適切な状態として、てんかんまたは乳児けいれんなどの発作障害;自閉症、統合失調症、不安障害、および摂食障害などの神経精神障害;全前脳症または小頭症などの神経発達障害;ならびにパーキンソン病が挙げられるが、これらに限定されない。hPSCを使用した初期研究は、パーキンソン病における中脳ドーパミンニューロン(PD;Kriksら、Nature、480巻:547〜551頁(2011年);Soldnerら、Cell、136巻:964〜977頁(2009年);およびSoldnerら、Cell、146巻:318〜331頁(2011年))、または筋萎縮性側索硬化症(ALS;Dimosら、Science、321巻:1218〜1221頁(2008年))および脊髄筋萎縮症(SMA;Ebertら、Nature、457巻:277〜280頁(2009年))における運動ニューロンなど、特定のニューロン型に影響を及ぼすことが公知の神経変性障害に主に向けたものであった。より最近の研究では、統合失調症(Brennandら、Nature、473巻:221〜225頁(2011年))または自閉症関連症候群(Marchettoら、Cell、143巻:527〜539頁(2010年);およびPascaら、Nat Med、17巻:1657〜1662頁(2011年))など、複合的な神経障害に取り組むことができる可能性が示唆される。
ある特定の実施形態では、本開示は、例えば、パーキンソン病(PD)およびアルツハイマー病(AD)を含む神経変性と関連する障害および疾患を処置するための方法であって、本明細書で開示される方法により発生させた皮質介在ニューロンを、PDまたはADに罹患した患者へin vivoにおいて投与するステップを含む、方法を提供する。
他の実施形態では、本開示は、例えば、統合失調症および自閉症関連障害を含む、精神障害および疾患を処置するための方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、再生医療における適用のための、精製ヒトin vitro導出皮質介在ニューロンモデルを発生させるための方法を提供する。本明細書で提示されるデータは、新生仔マウス皮質への移植後における、hESC由来の皮質介在ニューロンの遊走能力を例示する。したがって、本開示で産生される皮質介在ニューロンおよびそれらの前駆体細胞は、再生医療において使用することができる。
皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および視索前野コリン作動性(chorionic)ニューロンを含む、本開示のニューロン細胞は、細胞の移植を達成するための慣用的な手段により、in vivoにおいて患者へと投与することができる。例えば、ニューロン細胞は、髄腔内注射などの注射により移植することができる。移植の適切な方法は、植え込まれたニューロン細胞の、中枢神経系の所望の領域へのホーミングおよび生着をモニタリングすることにより決定することができる。
SMADシグナル伝達の阻害とWntシグナル伝達の阻害との組合せによる、前脳神経前駆細胞の誘導
本実施例では、神経前駆細胞の発生を、SMADおよびWntシグナル伝達の阻害と、SHHシグナル伝達の活性化との組合せにより、達成しうることが実証される。
SHH活性化のタイミングを変化させることによる、異なる腹側前駆細胞集団の誘導
本実施例では、ニューロン細胞のSHH活性化のタイミングを変化させることにより、異なる腹側前駆細胞集団を発生させうることが実証される。
前脳神経前駆細胞の、ニューロン細胞への方向付けられた分化およびこれらのニューロン細胞の遊走特性
本実施例は、前脳神経前駆細胞の方向付けられた分化による、ニューロン細胞の発生を実証する。
前脳ニューロン前駆体細胞の表現型成熟およびシナプス成熟
本実施例では、前脳ニューロン前駆体細胞の表現型成熟およびシナプス成熟が実証される。
(予測的実施例(prophetic))
in vitroで分化させた皮質介在ニューロンを使用して、薬物をスクリーニングするための方法
本実施例は以下を示す。
Claims (62)
- ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのin vitroにおける方法であって、該ニューロンは、皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞を示す1つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
a.多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される1つまたは複数の出発細胞を、少なくとも2つのSMAD阻害剤および少なくとも1つのWntアンタゴニストと接触させて、該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からのニューロン前駆体細胞の発生に助力するステップと、
b.所定の期間にわたる継代培養の後で、該ニューロン前駆体細胞を、少なくとも1つのSHHシグナル伝達活性化因子と接触させて、該前駆体細胞からの、皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞を示す少なくとも1つのマーカーを有するニューロンの発生に助力するステップと、
c.任意選択で、発生させた該介在ニューロンまたは介在ニューロン前駆体細胞を、それらの成熟に助力する条件に晒すステップと
を含むin vitroにおける方法。 - ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのin vitroにおける方法であって、該ニューロンは、視床下部ニューロンまたは視床下部ニューロン前駆体細胞を示す1つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
a.多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される1つまたは複数の出発細胞を、少なくとも2つのSMAD阻害剤および少なくとも1つのWntアンタゴニストと接触させて、該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からのニューロン前駆体細胞の発生に助力するステップと、
b.所定の期間にわたる継代培養の後で、該ニューロン前駆体細胞を、少なくとも1つのSHHシグナル伝達活性化因子と接触させて、該前駆体細胞からの、視床下部ニューロンまたは視床下部ニューロン前駆体細胞を示す少なくとも1つのマーカーを有するニューロンの発生に助力するステップと、
c.任意選択で、発生させた該視床下部ニューロンまたは視床下部ニューロン前駆体細胞を、それらの成熟に助力する条件に晒すステップと
を含むin vitroにおける方法。 - ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのin vitroにおける方法であって、該ニューロンは、視索前野コリン作動性ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞を示す1つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
a.多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される1つまたは複数の出発細胞を、少なくとも1つ、好ましくは2つのSMAD阻害剤および少なくとも1つのWntアンタゴニストと接触させて、該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からのニューロン前駆体細胞の発生に助力するステップと、
b.所定の期間にわたる継代培養の後で、該ニューロン前駆体細胞を、少なくとも1つのSHHシグナル伝達活性化因子と接触させて、該前駆体細胞からの、視索前野コリン作動性ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞を示す少なくとも1つのマーカーを有するニューロンの発生に助力するステップと、
c.任意選択で、発生させた該視索前野コリン作動性ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞を、それらの成熟に助力する条件に晒すステップと
を含むin vitroにおける方法。 - 該1つまたは複数の出発細胞が、ヒトのものである、請求項1、2、または3に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の出発細胞が、マウスのものである、請求項1、2、または3に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の出発細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、神経幹細胞、人工多能性細胞、操作多能性細胞、初代前駆細胞、誘導前駆細胞、および操作前駆細胞からなる群から選択される、少なくとも1つの細胞のクラスを含む、請求項1、2、または3に記載の方法。
- SMAD阻害剤と接触させる前記ステップおよびWntシグナル伝達アンタゴニストと接触させる前記ステップを同時または逐次的に実行し、各ステップの持続期間が、約5日間〜約30日間の間である、請求項1、2、または3に記載の方法。
- 前記SMADシグナル伝達阻害剤が、SB431542、LDN−193189、ノギン、PD169316、SB203580、LY364947、A77−01、A−83−01、BMP4、GW788388、GW6604、SB−505124、レルデリムマブ、メテリムマブ、GC−I008、AP−12009、AP−110I4、LY550410、LY580276、LY364947、LY2109761、SB−505124、E−616452(ALK阻害剤であるRepSox)、SD−208、SMI6、NPC−30345、Ki26894、SB−203580、SD−093、アクチビン−M108A、P144、可溶性TBR2−Fc、DMH−1、ドルソモルフィン二塩酸塩、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項1、2、または3に記載の方法。
- 前記SMADシグナル伝達阻害剤が、SB431542およびLDN−193189を含む、請求項8に記載の方法。
- SB431542が、前記細胞を含有する培養培地中に約0.1μM〜約1mMの間の範囲内の濃度で提供される、請求項9に記載の方法。
- LDN−193189が、前記細胞を含有する培養培地中に約1nM〜約10μMの間の範囲内の濃度で提供される、請求項9に記載の方法。
- 前記Wntシグナル伝達アンタゴニストが、XAV939、DKK1、DKK−2、DKK−3、Dkk−4、SFRP−1、SFRP−2、SFRP−5、SFRP−3、SFRP−4、WIF−1、Soggy、IWP−2、IWR1、ICG−001、KY0211、Wnt−C59、LGK974、IWP−L6、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項1、2、または3に記載の方法。
- 前記Wntシグナル伝達アンタゴニストが、XAV939を含む、請求項12に記載の方法。
- XAV939が、前記細胞を含有する培養培地中に約10nM〜約500μMの間の範囲内の濃度で提供される、請求項13に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のSHHシグナル伝達活性化因子が、スムーズンドアゴニスト(SAG)、SAG類似体、SHH、C25−SHH、C24−SHH、プルモルファミン、Hg−Ag、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項1、2、または3に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のSHHシグナル伝達活性化因子が、組換えSHHおよびプルモルファミンの両方を含む、請求項15に記載の方法。
- 組換えSHHが、前記細胞を含有する培養培地中に約5ng/mL〜約5μg/mLの間の範囲内の濃度で提供される、請求項16に記載の方法。
- プルモルファミンが、前記細胞を含有する培養培地中に約0.1μM〜約20μMの間の範囲内の濃度で提供される、請求項16に記載の方法。
- 前記ステップ(b)を、前記ステップ(a)の開始の少なくとも4日後かつ最大で20日後に開始する、請求項1に記載の方法。
- 前記ステップ(b)を、その開始の約5〜約30日後に終了する、請求項1に記載の方法。
- 前記ステップ(b)を、前記ステップ(a)の開始の約8〜約18日後の間に開始し、該ステップ(b)の開始の約8〜約16日後の間に終了する、請求項1に記載の方法。
- 皮質介在ニューロンを示す前記1つまたは複数のマーカーが、SST、PV、GABA、カルビンディン、LHX6、RAX、FOXA2、FOXG1、OLIG2、NKX6.2、VGLUT1、MAP2、CTIP2、SATB2、TBR1、DLX2、ASCL1、ChAT、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記ステップ(b)を、前記ステップ(a)の開始の少なくとも1日後かつ最大で4日後に開始する、請求項2に記載の方法。
- 前記ステップ(b)を、その開始の約5〜約30日後に終了する、請求項2に記載の方法。
- 前記ステップ(b)を、前記ステップ(a)の開始の約1〜約4日後の間に開始し、該ステップ(b)の開始の約8〜約20日後の間に終了する、請求項2に記載の方法。
- 視床下部ニューロンを示す前記1つまたは複数のマーカーが、NGFI−B、c−fos、CRF、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、RAX、POMC、ヒポクレチン、NADPH、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記ステップ(b)を、前記ステップ(a)の開始の少なくとも4日後かつ最大で10日後に開始する、請求項3に記載の方法。
- 前記ステップ(b)を、その開始の約5〜約30日後に終了する、請求項3に記載の方法。
- 前記ステップ(b)を、前記ステップ(a)の開始の約4〜約8日後の間に開始し、該ステップ(b)の開始の約8〜約24日後の間に終了する、請求項3に記載の方法。
- 視索前野コリン作動性ニューロンを示す前記1つまたは複数のマーカーが、ChAT、NGF、Ach、VAChT、LHX8、Isl1、p75、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記ニューロン前駆体細胞が、NKX2.1、NKX2.2、LHX6、LHX8、DLX1、DLX2、DLX5、DLX6、SOX6、MAFB、NPAS1、ASCL1、SIX6、OLIG2、およびNKX6.2からなる群から選択される1つまたは複数のマーカーを含む、請求項1、2、または3に記載の方法。
- 前記ステップ(a)および(b)のうちの1つまたは複数と、存在する場合、任意選択の前記ステップ(c)とを、フィーダー細胞の存在下で実行する、請求項1、2、または3に記載の方法。
- 前記フィーダー細胞が、マウス皮質錐体ニューロンである、請求項32に記載の方法。
- 前記マウス皮質錐体ニューロンが、マウスESCから導出される、請求項33に記載の方法。
- 皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞を示す1つまたは複数のマーカーを含み、多分化能細胞または多能性細胞を、少なくとも2つのSMADシグナル伝達阻害剤、1つまたは複数のWntシグナル伝達阻害剤、および1つまたは複数のSHHシグナル伝達活性化因子と接触させることにより産生されるin vitroで分化させたニューロン細胞を含む組成物。
- 前記細胞のうちの少なくとも30%、または該細胞のうちの少なくとも40%、または該細胞のうちの少なくとも50%、または該細胞のうちの少なくとも60%、または該細胞のうちの少なくとも70%、または該細胞のうちの少なくとも80%、または該細胞のうちの少なくとも90%、または該細胞のうちの少なくとも95%が、皮質介在ニューロンである、請求項35に記載の組成物。
- 前記細胞のうちの少なくとも5%、または少なくとも10%、または少なくとも20%、または少なくとも30%、または少なくとも40%、または少なくとも50%が、NKX2.1+/PV+皮質介在ニューロンである、請求項35に記載の組成物。
- 前記皮質介在ニューロンのうちの少なくとも5%、または少なくとも10%、または少なくとも20%、または少なくとも30%、または少なくとも40%、または少なくとも50%が、γ−アミノ酪酸(GABA)作動性抑制性介在ニューロンである、請求項35に記載の組成物。
- 視床下部ニューロンまたは視床下部ニューロン前駆体細胞を示す1つまたは複数のマーカーを含み、多分化能細胞または多能性細胞を、少なくとも2つのSMADシグナル伝達阻害剤、1つまたは複数のWntシグナル伝達阻害剤、および1つまたは複数のSHHシグナル伝達活性化因子と接触させることにより産生されるin vitroで分化させたニューロン細胞を含む組成物。
- 前記細胞のうちの少なくとも30%、または該細胞のうちの少なくとも40%、または該細胞のうちの少なくとも50%、または該細胞のうちの少なくとも60%、または該細胞のうちの少なくとも70%、または該細胞のうちの少なくとも80%、または該細胞のうちの少なくとも90%、または該細胞のうちの少なくとも95%が、視床下部ニューロンである、請求項39に記載の組成物。
- 視索前野コリン作動性ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞を示す1つまたは複数のマーカーを含み、多分化能細胞または多能性細胞を、少なくとも2つのSMADシグナル伝達阻害剤、1つまたは複数のWntシグナル伝達阻害剤、および1つまたは複数のSHHシグナル伝達活性化因子と接触させることにより産生されるin vitroで分化させたニューロン細胞を含む組成物。
- 前記細胞のうちの少なくとも30%、または該細胞のうちの少なくとも40%、または該細胞のうちの少なくとも50%、または該細胞のうちの少なくとも60%、または該細胞のうちの少なくとも70%、または該細胞のうちの少なくとも80%、または該細胞のうちの少なくとも90%、または該細胞のうちの少なくとも95%が、視索前野コリン作動性ニューロンである、請求項41に記載の組成物。
- 前記細胞が、ヒトのものである、請求項35、39、41に記載の組成物。
- 前記細胞が、マウスのものである、請求項35、39、41に記載の組成物。
- 前記Wntアンタゴニストと接触させる前記ステップを、ステップ(a)の開始後5日以内に、好ましくは、ステップ(a)の開始の0〜1日後に開始する、請求項7に記載の方法。
- SB431542を、前記細胞を含有する培養培地中に約0.1μM〜約100μMの間の範囲内の濃度で提供する、請求項10に記載の方法。
- LDN−193189を、前記細胞を含有する培養培地中に約1nM〜約1μMの間の範囲内の濃度で提供する、請求項11に記載の方法。
- XAV939を、前記細胞を含有する培養培地中に約0.2μM〜約200μMの間の範囲内の濃度で提供する、請求項14に記載の方法。
- 前記ステップ(b)を、前記ステップ(a)の開始の少なくとも6日後かつ最大で20日後に開始する、請求項19に記載の方法。
- 前記ステップ(b)を、前記ステップ(a)の開始の少なくとも8日後かつ最大で18日後に開始する、請求項19に記載の方法。
- 前記培養培地が、Essential 6培地およびKSRベースの培地からなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記皮質介在ニューロンまたは介在ニューロン前駆体細胞が、検出マーカーを発現するトランス遺伝子で改変されている、請求項35に記載の組成物。
- 前記検出マーカーが、CT−2およびGFPからなる群から選択される、請求項53に記載の組成物。
- 前記皮質介在ニューロン前駆体細胞が、培養物中で、数週間〜数カ月間にわたり維持されうる、請求項20に記載の方法。
- 前記皮質介在ニューロンが、培養物中またはin vivoで、何カ月間にもわたり維持されうる、請求項20に記載の方法。
- ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのin vitroにおける方法であって、該ニューロンが、前脳前駆細胞を示す1つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
a.多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される1つまたは複数の出発細胞を、血清を補充した培養培地中で、少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つのSMAD阻害剤および少なくとも1つのWntシグナル伝達アンタゴニストと接触させて、該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からの該前脳前駆細胞の発生に助力するステップと、
b.任意選択で、発生させた該前脳前駆細胞を、ニューロンへのそれらのさらなる分化に助力する条件に晒すステップと
を含むin vitroにおける方法。 - 前脳前駆細胞視索前野コリン作動性ニューロンを示す前記1つまたは複数のマーカーが、FOXG1、PAX6、EMX2、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項56に記載の方法。
- ステップ(a)において、前記細胞を、XAV939、LDN−193189およびSB431542と接触させる、請求項56に記載の方法。
- ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのin vitroにおける方法であって、該ニューロンが、皮質投射ニューロンまたは皮質投射ニューロン前駆体細胞を示す1つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
a.多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される1つまたは複数の出発細胞を、少なくとも2つのSMAD阻害剤および少なくとも1つのWntシグナル伝達アンタゴニストと接触させて、SHH活性化因子の非存在下における該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からの該皮質投射ニューロンまたは皮質投射ニューロン前駆体細胞の発生に助力するステップと、
b.任意選択で、発生させた該皮質投射ニューロンまたは皮質投射ニューロン前駆体細胞を、SHH活性化因子の非存在下においてそれらのさらなる成熟に助力させるステップと
を含むin vitroにおける方法。 - ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのin vitroにおける方法であって、該ニューロンが、皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞を示す1つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
a.多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される1つまたは複数の出発細胞を、少なくとも2つのSMAD阻害剤および少なくとも1つのWntアンタゴニストと接触させて、SHH活性化因子の非存在下における該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からの該皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞の発生に助力するステップと、
b.任意選択で、発生させた該皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞を、SHH活性化因子の非存在下においてそれらのさらなる成熟に助力させるステップと
を含むin vitroにおける方法。 - 前脳前駆体細胞の皮質への遊走をモジュレートするための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、
a.1つまたは複数のin vitroで分化させた前脳前駆体細胞を動物の腹側終脳に注射するステップと、
b.薬剤を該動物に投与するステップと、
c.該薬剤が、前脳前駆体細胞の皮質への遊走をモジュレートするのかどうかを決定するステップと
を含む方法。 - ポリヌクレオチドを動物の皮質に送達する方法であって、該方法は、
a.該ポリヌクレオチドを含有する少なくとも1つの分化させた前脳前駆体細胞を哺乳動物の腹側終脳に、in vitroで注射するステップと、
b.該少なくとも1つの細胞が、該哺乳動物の皮質に遊走するのかどうかを検出するステップと、
c.遊走した該少なくとも1つの細胞が、該ポリヌクレオチドを含有するのかどうかを決定するステップと
を含む方法。
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