CN110484505B - 一种运动神经元及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干细胞生物学领域，尤其涉及一种运动神经元及其制备方法和应用。所述运动神经元，其表达OLIG2+、MAP2+和CHAT+，还表达PAX6+、HB9+、ISL1+、Synaptophysin+和Tubulin+中的一种或任意组合。本发明还公开了制备运动神经元的方法，包括以下步骤：多能干细胞向神经上皮细胞分化；神经上皮细胞向运动神经前体细胞分化；运动神经前体细胞向有丝分裂后运动神经元分化；有丝分裂后运动神经元向成熟运动神经元分化，即得到成熟的运动神经元。本发明提供的制备方法未使用含有血清或血清替代物的体系；分化效率高，分化效果稳定；纯化方法简便，获得的细胞纯度高。使用运动神经前体细胞冻存液，成分明确、价格低廉；复苏后细胞活力高(＞80％)，仍保持高效地向成熟运动神经元分化的能力。

Description

一种运动神经元及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及干细胞生物学领域，尤其涉及一种运动神经元及其制备方法和应用。
背景技术
运动神经元病(motor neuron disease，MND)，是一组病因尚未明确的选择性侵犯脊髓前角细胞、脑干运动神经元、皮质椎体细胞及椎体束的慢性退行性疾病，其病理特征为进行性上、下运动神经元的变性、坏死及凋亡。由于症状和体征的组合不同，形成不同类型的运动神经元病，包括肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、脊肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)、原发性侧索硬化(primary lateral sclerosis，PLS)和进行性延髓麻痹(progressive bulbar palsy，PBP)等，其中ALS是慢性运动神经元病的最常见类型，俗称“渐冻人症”。ALS具有两种形式：一种是散发的ALS(sALS)，这是最常见的ALS的形式，并占所有诊断的病例的90-95％；另一种是家族性的ALS(fALS)，这发生在主要具有显性遗传的家族谱系中，占所有诊断的病例的5-10％。其特征在于在初级运动皮质、脑干和脊髓中的运动神经元(MN)的显著损失。运动神经元的损失会破坏基础性的基本动作，诸如呼吸，手、臂、腿或吞咽肌的肌无力，并通常在诊断以后2～5年内造成患者的死亡。针对运动神经元病的治疗，一个策略是基于可以促进神经元存活的神经营养因子(诸如胰岛素-样生长因子I(IGF-I)、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)、Colivelin和活性依赖性的神经营养因子(ADNF)衍生的肽的神经保护和/或再生作用。多个研究结果已表明，神经营养因子在SOD1转基因小鼠中可以维持其运动神经元的功能性，因此改善运动表现。但是，这样的治疗并不能延长SOD1小鼠的存活，从而提示，神经营养因子不足以维持神经元存活(Yacila and Sari.,2014)。
运动神经元病的主要病理特征为特定运动神经元的损失，但是大部分运动神经元病的发病机理仍不明确，目前没有治愈的方法。多能干细胞包括胚胎干细胞(embryonicstem cell,ESC)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)，具有无限增殖的能力，并且在体外可以分化为几乎所有功能细胞，包括运动神经元。因此，体外通过多能干细胞诱导大规模制备纯度高的运动神经元，对于研究运动神经元病的发生机理、药物筛选、药物毒性测试等方面具有重要意义。
目前已有研究报道了体外诱导人多能干细胞分化为成熟运动神经元的方法，虽然可以成功诱导获得成熟运动神经元，但仍然存在培养时间长、效率低、纯度低等问题。例如，专利文献CN106701824A公开了一种基于iPS细胞获取脊髓运动神经元及其功能性细胞的方法，CN107868772A公开了一种诱导人脊髓运动神经前体细胞分化为脊髓运动神经元的方法)，CN105567636A公开了一种人源脂肪干细胞来源的神经元细胞的制备方法及其应用。
上述专利文献中诱导分化运动神经元的方法相似，都是从干细胞或神经前体细胞诱导分化获得成熟运动神经元；均在前期主要采用抑制Nodal、BMP和GSK-3信号通路进行分化，其中，CN105567636A在前期分化选择联合使用更稳定的小分子化合物。但上述专利文献中公开的方法具有以下缺点：第一，CN106701824A采用前9天拟胚体培养，后消化细胞并转至2D条件培养的方法，该过程经历了一次细胞消化过程，不仅会对细胞状态造成一定的损伤，还会损失细胞的产量；第二，CN106701824A中9天后拟胚体消化采用2D培养方法，其培养基采用的是星型胶质细胞条件培养基。星型胶质细胞条件培养基的制备不仅涉及小鼠原代星形胶质细胞的获取和培养，操作繁琐，成本较高，而且条件培养基成分复杂不清晰，批次间质量差异非常大，不利于MN的规模化生产；第三，CN106701824A中仅公开运动神经元的制备方法，并没有涉及运动神经元的冻存方法；第四，CN107868772A细胞来源是体内分离获得的运动神经前体细胞，CN105567636A细胞来源与人源脂肪干细胞的分离培养，不仅很难获得纯度较高的前体细胞，而且操作相对复杂。
虽然从多能干细胞体外分化为运动神经元的过程在原理层面已经较为明确，且目前已有多种诱导分化的方法，但现有的分化方法或者存在培养时间长、效率低的问题，或者使用细胞因子等生物成分复杂且成本较高的诱导剂，因而不适于后续大量的科学研究和药物筛选。因此，亟需发明一种快速、高效、简便，且成本较低的诱导多能干细胞分化为成熟运动神经元的方法。
发明内容
为了解决现有的技术中诱导获得成熟运动神经元培养时间长、效率低或纯度低等问题，本发明公开了一种可快速、高效、简便从多能干细胞分化获得运动神经元的方法及应用。此外，本发明提供的制备方法未使用含有血清或血清替代物的体系；分化效率高，分化效果稳定；纯化方法简便，获得的细胞纯度高。因此，本发明提供的诱导分化方法非常适于科研级和临床级运动神经元的制备和研究。
具体的，本发明的技术方案如下：
本发明第一个方面公开了一种运动神经元，其表达OLIG2+、MAP2+和CHAT+，还表达PAX6+、HB9+、ISL1+、Synaptophysin+和Tubulin+中的一种或任意组合。
优选的，所述运动神经元贴壁培养。更优选的，所述运动神经元在不含血清的培养体系中铁壁培养。
本发明第二个方面公开了一种制备上述的运动神经元的方法，包括以下步骤：
S1：多能干细胞向神经上皮细胞分化；
S2：神经上皮细胞向运动神经前体细胞分化；
S3：运动神经前体细胞向有丝分裂后运动神经元分化；
S4：有丝分裂后运动神经元向成熟运动神经元分化，即得到成熟的运动神经元。
优选的，步骤S1之前还包括步骤S0：多能干细胞的培养。
本发明中制备上述的运动神经元的方法的流程图如图1所示，具体的，操作如下：
一、D-3-D0：多能干细胞的培养
将聚合度达到70-80％的未分化的多能干细胞用TrypLE消化成完全的单细胞，以一定密度重悬于适量体积的多能干细胞维持培养基中，并接种在Vitronectin包被的孔板上，置于37℃，5％CO2浓度，饱和湿度的培养箱内培养。
D-3-D0实验操作细节及优化
实验中所用的多能干细胞经过严格的多能性验证(表达各种多能性标志物，并可在免疫缺陷型小鼠体内形成包含内、中、外三个胚层的畸胎瘤)。多能干细胞在其维持培养基中正常培养，所用的培养基E8或TeSR或其它类似培养基。
按上述方法培养多能干细胞至70-80％聚合度时，使用TrypLE或Accutase消化成完全的单细胞，以一定密度重悬于适量体积的多能干细胞维持培养基中，并向培养基中加入Rock抑制剂。将细胞悬液接种在Vitronectin包被的孔板上，置于37℃，5％CO2浓度，饱和湿度的培养箱内培养，每天换液。Rock抑制剂可以是Y-27632，浓度可以为10μM；细胞密度可以为1-10x 104/cm2。
二、D0-4：多能干细胞向神经上皮细胞分化
当状态良好未分化的多能干细胞培养至汇合度70％～80％的时候，将其维持培养基(E8或TeSR或其它类似培养基)吸除，加入特异性分化培养基，并向培养基中加入BMP、Nodal和GSK-3抑制剂，继续于37℃，5％CO2浓度，饱和湿度的培养箱内培养。
D0-D4实验操作细节及优化
当多能干细胞培养至70％～80％汇合度时进行分化实验。具体操作为：将多能干细胞的维持培养基吸除，用1x DPBS(w/o Ca2+/Mg2+)洗一遍，加入TrypLE消化液，置于37℃，5％CO2浓度，饱和湿度的培养箱中孵育5-7分钟，轻轻晃动使得细胞完全脱离培养皿底部。细胞悬液转入1.5mL离心管中，掌上离心机离心10～15秒，吸弃上清液，加入1mL新鲜的特异性分化培养基重悬细胞，轻柔吹打1-2次使细胞尽量分散成单细胞，计数后接种到Laminin包被的6孔板中，接种密度3～5×104cells/cm2。加入新鲜的特异性分化培养基(含10μM/mL的ROCK抑制剂)，并向培养基中加入BMP、Nodal和GSK-3抑制剂。每天更换新鲜培养基，培养基的使用量为0.2-0.3mL/cm2(培养皿底面积)。
BMP抑制剂：抑制BMP信号通路的物质。可选择Chordin、Noggin、Follistatin、LDN193189、Dorsomorphin等。本发明中使用的BMP抑制剂较佳为LDN193189。培养基中LDN193189浓度只要是阻碍Nodal信号通路就没有特别的限定，例如为0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM，但不限于此。最佳为0.1μM。
Nodal抑制剂：抑制Nodal信号通路的物质。可选择Lefty-A、Lefty-B、Lefty-1、Lefty-2、SB431542、SB202190、SB505124、NPC30345、SD093、SD908、SD208、LY2109761、LY364947、LT580276、A83-01，以及它们的衍生物。本发明中使用的Nodal抑制剂较佳为SB431542。培养基中SB431542浓度只要是阻碍Nodal信号通路就没有特别的限定，例如为1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM，但不限于此。最佳为10μM。
GSK-3抑制剂：抑制GSK-3信号通路的物质。可选择BIO、TWS119、SB415286和CHIR-99021。本发明中使用的GSK-3抑制剂较佳为CHIR-99021。培养基中CHIR-99021浓度只要是阻碍GSK-3信号通路就没有特别的限定，例如为1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM，但不限于此。最佳为3μM。
三、D4-D9：神经上皮细胞向运动神经前体细胞分化
将上述D4的培养基吸除，加入新鲜的特异性分化培养基，并添加优化浓度的小分子RAR核受体激活剂和Sonic Hedgehog信号通路激活剂，继续于37℃，5％CO2浓度，饱和湿度的培养箱内培养。
D4-D9实验操作细节及优化
从培养箱中取出培养皿，去除上清，加入新鲜的特异性分化培养基，并添加小分子RAR核受体激活剂和Sonic Hedgehog信号通路激活剂。每天更换新鲜培养基，培养基的使用量为0.2-0.3mL/cm2(培养皿底面积)。
RAR核受体激活剂：激活RAR核受体的物质。可选择Tamibarotene(他米巴罗汀)、AM580、Bexarotene(蓓萨罗丁)、Retinoic acid(视黄酸)等。本发明中使用的RAR核受体优选为Retinoic acid。培养基中Retinoic acid浓度只要是能激活RAR核受体就没有特别的限定，例如为0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM，但不限于此。最佳为1μM。
Sonic Hedgehog信号通路激活剂：激活Sonic Hedgehog信号通路的物质。可选择Purmorphamine、SAG、SHH C24II等。本发明中使用的Sonic Hedgehog激活剂优选为SHHC24II。培养基中SHH C24II浓度只要是能激活Sonic Hedgehog信号通路就没有特别的限定，例如为1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、350ng/ml、400ng/ml、450ng/ml、500ng/ml，但不限于此。最佳为400ng/ml。
第4-9天，使用特异性分化培养基和添加剂(RAR核受体激活剂和Sonic Hedgehog信号通路激活剂)会明显加快神经上皮细胞向神经前体细胞分化的效率，并在第9天获得数量多、比例高的神经前体细胞。
四、D9-D12：运动神经前体细胞向有丝分裂后运动神经元分化
将上述D9的培养基吸除，加入新鲜的特异性分化培养基，并添加优化浓度的小分子γ分泌酶抑制剂，继续于37℃，5％CO2浓度，饱和湿度的培养箱内培养。
D9-D12实验操作细节及优化
具体操作为：将D9培养基吸除，用1x DPBS(w/o Ca2+/Mg2+)洗一遍，加入TrypLE消化液，置于37℃，5％CO2浓度，饱和湿度的培养箱中孵育8-12分钟，轻轻晃动使得细胞完全脱离培养皿底部。细胞悬液转入1.5mL离心管中，掌上离心机离心10～15秒，吸弃上清液，加入1mL新鲜的特异性分化培养基重悬细胞，轻柔吹打1-2次使细胞尽量分散成单细胞，计数后接种到Laminin包被的12孔板中，接种密度1～2×104cells/cm2。加入新鲜的特异性分化培养基(含10μM/mL的ROCK抑制剂)，并向培养基中加入γ分泌酶抑制剂。每天更换新鲜培养基，培养基的使用量为0.2-0.3mL/cm2(培养皿底面积)。
γ分泌酶抑制剂：抑制γ分泌酶的活性。可选择RO4929097、YO-13526、Semagacestat、DAPT等。本发明中使用的γ分泌酶抑制剂优选为DAPT。培养基中DAPT浓度只要是阻碍γ分泌酶的活性就没有特别的限定，例如为1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM，但不限于此。最佳为10μM。
第9-12天，使用特异性分化培养基和添加剂(γ分泌酶抑制剂)会明显加快神经前体细胞向有丝分裂后运动神经元方向分化的效率。
五、D12-D35：有丝分裂后运动神经元向成熟运动神经元分化
将上述D12的培养基吸除，加入新鲜的特异性分化培养基，并添加优化浓度的神经元成熟和生长的相关分化因子。本发明中使用的相关分化因子包括：BDNF(brain derivedneurotrophic factor)；GDNF(glial cell-line derived neurotrophic factor)；IGF-1(insulin-like growth factor 1)；维生素C；dibutyryl-cAMP(Na Salt)。隔天更换新鲜培养基，培养基的使用量为0.2-0.3mL/cm2(培养皿底面积)。
培养基中BDNF浓度只要是能维持运动神经元生长和成熟就没有特别的限定，例如为1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、7ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、80ng/ml、100ng/ml，但不限于此。优选为10ng/ml。
培养基中GDNF浓度只要是能维持运动神经元生长和成熟就没有特别的限定，例如为1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、7ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、80ng/ml、100ng/ml，但不限于此。优选为10ng/ml。
培养基中IGF-1浓度只要是能维持运动神经元生长和成熟就没有特别的限定，例如为1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、7ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、80ng/ml、100ng/ml，但不限于此。优选为10ng/ml。
培养基中维生素C浓度只要是能维持运动神经元生长和成熟就没有特别的限定，例如为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml、20ug/ml、30ug/ml、40ug/ml、50ug/ml、60ug/ml、80ug/ml、100ug/ml，但不限于此。优选为50ng/ml。
培养基中dibutyryl-cAMP(Na Salt)浓度只要是能维持运动神经元生长和成熟就没有特别的限定，例如为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、11μM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM，但不限于此。优选为0.5mM。
此外，本发明还包括将运动神经前体细胞的冻存的步骤：可用运动神经前体细胞冻存液将运动神经前体细胞冻存。
具体的，将培养基吸除，用1x DPBS(w/o Ca2+/Mg2+)洗一遍，加入TrypLE消化液，置于37℃，5％CO2浓度，饱和湿度的培养箱中孵育8-12分钟，轻轻晃动使得细胞完全脱离培养皿底部。细胞悬液转入1.5mL离心管中，掌上离心机离心10～15秒，吸弃上清液，加入1mL运动神经前体细胞冻存液，轻柔吹打1-2次使细胞尽量分散成单细胞并计数，冻存细胞数建议2～3×106cells/管。
本发明运动神经前体细胞冻存液的主要成分为DMSO、HSA。
冻存液中DMSO浓度只要是能保护低温状态下运动神经前体细胞的活率和分化效率没有特别的限定，例如为1％、2％、3％、4％、5％、7％、10％、15％、20％、30％，但不限于此。优选浓度为10％。
冻存液中HSA浓度只要是能保护低温状态下运动神经前体细胞的活率和分化效率没有特别的限定，例如为1％、2％、3％、4％、5％、7％、10％、15％、20％、30％，但不限于此。优选浓度为10％。
在本发明的一具体实施例中，上述人多能干细胞通过专利CN 108085299A公开的方法进行制备。
应当理解，本领域技术人员还可以根据需要选择任意的人多能干细胞商业细胞系或细胞株来完成本发明，且均在本发明的保护范围之内。
对所得的成熟运动神经元进行检测，以下方法中任选一种：
方法一：使用RT-QPCR检测，证明所得细胞为PAX6+/OLIG2+/HB9+/ISL1+/MAP2+/CHAT+/Synaptophysin+/。
其中，PAX6、OLIG2运动神经前体细胞的指标；HB9、ISL1为有丝分裂后运动神经元的指标；MAP2、CHAT、Synaptophysin(Syn，突触素)为成熟运动神经元的指标(成熟标志)。
方法二：使用细胞免疫荧光检测细胞表型，证明所得细胞表型为：OLIG2+/Tubulin+/CHAT+/MAP2+，OLIG2运动神经前体细胞的指标，MAP2、CHAT为成熟运动神经元的指标，进一步说明分化所得的细胞群是成熟的运动神经元。
方法三：使用膜片钳的方法检测细胞功能，发现分化成熟的运动神经元具有成熟运动神经元特定的电生理功能。
在本发明一具体实施例中，方法二中免疫荧光的抗体信息如下：OLIG2，Millipore，#AB9610；CHAT，Millipore，#AB144P；MAP2，Millipore，#MAB3418A5；Tubulin(微管蛋白)，sigma，T8578；Donkey anti-Goat IgG(H+L),FITC，Jackson，705-095-147；Donkeyanti-Mouse IgG(H+L),FITC，Jackson，715-095-151；Donkey anti-Rabbit IgG(H+L),Cy3，Jackson，711-165-152。
上文所述特异性分化培养基的成分如下表1所示：
表1
Figure BDA0002174813020000071
Figure BDA0002174813020000081
Figure BDA0002174813020000091
上文所述运动神经前体细胞冻存液的成分如表2所示：
表2
序号 成分 终浓度
1 氯化钠 1-10mg/ml
2 葡萄糖酸钠 1-10mg/ml
3 醋酸钠 1-10mg/ml
4 氯化钾 0-1mg/ml
5 氯化镁 0-1mg/ml
6 HSA(人血白蛋白) 10-30％
7 DMSO(二甲基亚砜) 5-20％
本发明第三个方面公开了一种运动神经元，其由上述的方法制备而得。
本发明第四个方面公开了一种细胞群，其富集有上述的运动神经元。
本发明第五个方面公开了一种治疗运动神经元病的药物，所述药物包含上述的运动神经元。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
本发明的关键技术包括以下几点：
1)基于小分子化合物联合使用的快速、高效、成本低的诱导方法(包括小分子化合物的种类及其组合方式、加入时间、浓度等)。
2)运动神经元分化培养基的成分。关键的创新点：分化培养基的成分明确，不含生物异源物质(包括KSR)；分化添加剂的成分明确，为更高效经济的小分子化合物，使分化的结果更稳定、成本更经济，适用于后续大量的科学研究和药物筛选。
3)冻存工作液成分。关键的创新点：冻存液成分明确，在低温情况下，对细胞的保护性高于市面上大部分普通冻存液；细胞冻存复苏后，细胞活力高，并且仍保持高效地向成熟运动神经元分化的能力。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
第一，本方法可在短期内获得数量多，且纯度高的成熟运动神经元，即30天之内就可获得数量高达1x107以上，纯度高达90％以上且具有功能性的成熟运动神经元。因此，具有极大的科研应用潜力。
第二，本方法的分化诱导方法为贴壁的固定化状态培养，这种诱导方式更加利于操作和观察细胞状态，且可显著提高分化效率。
第三，本方法提供的冻存液，在低温情况下对细胞的保护性好，细胞复苏的存活率高，并且仍保持高效地向成熟运动神经元分化的能力。
附图说明
图1为本发明制备运动神经元方法的流程图。
图2显示了本发明从多能干细胞诱导分化为成熟运动神经元的细胞显微镜图(分别为第4天、第9天、第12天、第30天)。
图3采用RT-QPCR对D4-D9神经前体细胞的特异性指标进行检测图(显示PAX6+/OLIG2+神经前体细胞逐渐形成)。
图4采用RT-QPCR对D9-D12有丝分裂后运动神经元的特异性指标进行检测图(显示HB9+/ISL1+有丝分裂后运动神经元逐渐形成)。
图5采用RT-QPCR对D12-D35成熟运动神经元的特异性指标进行检测图(显示CHAT+/MAP2+/Synaphyophysin+成熟运动神经元逐渐形成)。
图6采用免疫荧光对D9神经前体细胞的特异性指标进行检测图(显示OLIG2+有丝分裂后运动神经元形成)。
图7采用免疫荧光对D30成熟运动神经元的特异性指标进行检测图(显示CHAT+/MAP2+成熟运动神经元形成)。
图8采用膜片钳对成熟运动神经元的电生理功能检测图(显示D30成熟的运动神经元可以检测到正常运动神经元具有的电生理功能)。
图9显示了冻存的运动神经前体细胞复苏后细胞的复苏活率。
图10采用RT-QPCR对冻存复苏后的神经前体细胞分化所得成熟运动神经元的特异性指标检测图(显示CHAT+/MAP2+/Synaphyophysin+成熟运动神经元逐渐形成)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例1
本实施例公开了一种制备运动神经元的方法，包括以下步骤：
S1：多能干细胞向神经上皮细胞分化；
S2：神经上皮细胞向运动神经前体细胞分化；
S3：运动神经前体细胞向有丝分裂后运动神经元分化；
S4：有丝分裂后运动神经元向成熟运动神经元分化，即得到成熟的运动神经元。
具体的，步骤如下：
(1)多能干细胞的培养(D-3-D0)
实验中所用的多能干细胞经过严格的多能性验证(表达各种多能性标志物，并可在免疫缺陷型小鼠体内形成包含内、中、外三个胚层的畸胎瘤)。多能干细胞在其维持培养基中正常培养，所用的培养基E8或TeSR或其它类似培养基。该实施例中人多能干细胞通过专利CN 108085299A公开的方法进行制备。
按上述方法培养多能干细胞至70-80％聚合度时，使用TrypLE或Accutase消化成完全的单细胞，以一定密度重悬于适量体积的多能干细胞维持培养基中，并向培养基中加入Rock抑制剂。将细胞悬液接种在Vitronectin包被的孔板上，置于37℃，5％CO2浓度，饱和湿度的培养箱内培养，每天换液。Rock抑制剂可是Y-27632，浓度为10μM；细胞密度为1-10x104/cm2。
(2)多能干细胞向神经上皮细胞分化(D0-D4)
当多能干细胞培养至70％～80％汇合度时进行分化实验。具体操作为：将多能干细胞的维持培养基吸除，用1x DPBS(w/o Ca2+/Mg2+)洗一遍，加入TrypLE消化液，置于37℃，5％CO2浓度，饱和湿度的培养箱中孵育5-7分钟，轻轻晃动使得细胞完全脱离培养皿底部。细胞悬液转入1.5mL离心管中，掌上离心机离心10～15秒，吸弃上清液，加入1mL新鲜的特异性分化培养基重悬细胞，轻柔吹打1-2次使细胞尽量分散成单细胞，计数后接种到Laminin包被的6孔板中，接种密度3～5×104cells/cm2。加入新鲜的特异性分化培养基(含10μM/mL的ROCK抑制剂)，并向培养基中加入BMP、Nodal和GSK-3抑制剂。本发明中使用的BMP抑制剂为LDN193189，浓度为0.1μM；Nodal抑制剂为SB431542，浓度为10μM；GSK-3抑制剂为CHIR-99021，浓度为3μM。每天更换新鲜培养基，培养基的使用量为0.2-0.3mL/cm2(培养皿底面积)。
(3)神经上皮细胞向运动神经前体细胞分化(D4-D9)
从培养箱中取出培养皿，去除上清，加入新鲜的特异性分化培养基，并添加小分子RAR核受体激活剂和Sonic Hedgehog信号通路激活剂。RAR核受体激活剂可选择Tamibarotene、AM580、Bexarotene、Retinoic acid等；Sonic Hedgehog信号通路激活剂可选择Purmorphamine、SAG、SHHC24II等。本发明中使用的RAR核受体激活剂为Retinoicacid，浓度为1μM；Sonic Hedgehog信号通路激活剂为SHHC24II，浓度为400ng/ml。每天更换新鲜培养基，培养基的使用量为0.2-0.3mL/cm2(培养皿底面积)。
加入特异性分化培养基和添加剂之后，在第4天、第5天、第7天和第9天用RT-QPCR的方法检测，发现随培养天数的增加，神经前体细胞的特异性指标增高。结果见附图3(其中，PAX6和OLIG2是神经前体细胞的特异性指标)。在第8天同时用免疫荧光的方法检测，发现神经前体细胞的特异性指标明显表达。结果见附图6(其中，OLIG2是神经前体细胞的特异性指标)。
(4)运动神经前体细胞向有丝分裂后运动神经元分化(D9-D12)
将D9培养基吸除，用1x DPBS(w/o Ca2+/Mg2+)洗一遍，加入TrypLE消化液，置于37℃，5％CO2浓度，饱和湿度的培养箱中孵育8-12分钟，轻轻晃动使得细胞完全脱离培养皿底部。细胞悬液转入1.5mL离心管中，掌上离心机离心10～15秒，吸弃上清液，加入1mL新鲜的特异性分化培养基重悬细胞，轻柔吹打1-2次使细胞尽量分散成单细胞，计数后接种到Laminin包被的12孔板中，接种密度1～2×104cells/cm2。加入新鲜的特异性分化培养基(含10μM/mL的ROCK抑制剂)，并向培养基中加入γ分泌酶抑制剂。本发明中使用的γ分泌酶抑制剂为DAPT，浓度为10μM。每天更换新鲜培养基，培养基的使用量为0.2-0.3mL/cm2(培养皿底面积)。
加入特异性分化培养基和添加剂之后，在第9天、第10天、第11天和第12天用RT-QPCR的方法检测，发现随培养天数的增加，有丝分裂后运动神经元的特异性指标增高。结果见附图4(其中，HB9和ISL1是有丝分裂后运动神经元的特异性指标)。
(5)有丝分裂后运动神经元向成熟运动神经元分化(D12-D35)
将上述D12的培养基吸除，加入新鲜的特异性分化培养基，并添加优化浓度的神经元成熟和生长的相关蛋白和维生素。本发明中使用的相关蛋白和维生素包括：BDNF(brainderived neurotrophic factor)浓度为10ng/ml；GDNF(glial cell-line derivedneurotrophic factor)浓度为10ng/ml；IGF-1(insulin-like growth factor 1)，浓度为10ng/ml；维生素C浓度为50ug/ml；dibutyryl-cAMP(Na Salt)浓度为0.5mM。隔天更换新鲜培养基，培养基的使用量为0.2-0.3mL/cm2(培养皿底面积)，最终得到成熟的运动神经元。
其中，分化培养的第4天、第9天、第12天和第30天的具体细胞形态见图2所示。在第15天、第25天、第30天、第35天和第40天用RT-QPCR的方法检测，发现随培养天数的增加，成熟运动神经元的特异性指标增高，35天之后特异性指标稍有降低，但依然维持在较高水平。结果见附图5(其中，MAP2、CHAT和Synapyophysin是成熟运动神经元的特异性指标)。
在第30天同时用免疫荧光的方法检测，发现运动神经元成熟的特异性指标明显表达。结果见附图7(其中，MAP2和CHAT是运动神经元成熟的特异性指标)。
此外，在第30天用膜片钳的方法检测，发现具有成熟运动神经元特定的电生理功能。结果见附图8(其中，重复动作电位激发是运动神经元功能成熟的标志；去极化电压步骤显示快速灭活的外向电流)。
简而言之，上述使用RT-QPCR检测，证明所得细胞为运动神经元，该运动神经元表达PAX6+/OLIG2+/HB9+/ISL1+/MAP2+/CHAT+/Synaptophysin+/(图3-5)。
抽提RNA所用的试剂盒是RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit，厂家为TIANGEN，货号是DP430；逆转录所用试剂盒是Reverse Transcriptase，厂家为Vazyme，货号是R223-01；RT-QPCR所用试剂盒是TransStart Top Green qPCR SuperMix，厂家为Transgen，货号是AQ131。
其中，PAX6、OLIG2运动神经前体细胞的指标；HB9、ISL1为有丝分裂后运动神经元的指标；MAP2、CHAT、Synaptophysin为成熟运动神经元的指标(成熟标志)。
为了进一步验证是否为运动神经元，使用细胞免疫荧光检测细胞表型，证明所得细胞表型为：OLIG2+/Tubulin+/CHAT+/MAP2+(图6-7)，OLIG2运动神经前体细胞的指标，MAP2、CHAT为成熟运动神经元的指标，进一步说明分化所得的细胞群是成熟的运动神经元。使用膜片钳的方法检测细胞功能，发现分化成熟的运动神经元具有成熟运动神经元特定的电生理功能。
本实施例中上述特异性分化培养基的成分如下表1所示：
表1
Figure BDA0002174813020000131
Figure BDA0002174813020000141
Figure BDA0002174813020000151
本实施例公开的方法可在短期内获得数量多，且纯度高的成熟运动神经元，即30天之内就可获得数量高达1x107以上，纯度高达90％以上且具有功能性的成熟运动神经元。因此，具有极大的科研应用潜力。本方法的分化诱导方法为贴壁的固定化状态培养，这种诱导方式更加利于操作和观察细胞状态，且可显著提高分化效率。
实施例2
实施例1的方法中培养第9天时，用运动神经前体细胞冻存液将运动神经前体细胞冻存。具体步骤为：
将培养基吸除，用1x DPBS(w/o Ca2+/Mg2+)洗一遍，加入TrypLE消化液，置于37℃，5％CO2浓度，饱和湿度的培养箱中孵育8-12分钟，轻轻晃动使得细胞完全脱离培养皿底部。细胞悬液转入1.5mL离心管中，掌上离心机离心10～15秒，吸弃上清液，加入1mL运动神经前体细胞冻存液，轻柔吹打1-2次使细胞尽量分散成单细胞并计数，冻存细胞数建议2～3×106cells/管，液氮保存。
运动神经前体细胞冻存后细胞复苏活率达到80％以上，结果见附图9(高于普通冻存液60％的效率)。将复苏后的运动神经前体细胞根据实施例1的方法继续培养，第30天获得MAP2+/CHAT+/Synaptophysin+成熟运动神经元。结果见附图10(RT-QPCR检测结果显示，冻存与未冻存D30所得的成熟运动神经元，MAP2+/CHAT+/Synaptophysin+表达量没有显著差异)。
本实施例中运动神经前体细胞冻存液的成分如表2所示：
表2
Figure BDA0002174813020000152
Figure BDA0002174813020000161
本实施例提供的冻存液，在低温情况下对细胞的保护性好，细胞复苏的存活率高，并且仍保持高效地向成熟运动神经元分化的能力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种制备运动神经元的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：多能干细胞向神经上皮细胞分化；
S2：神经上皮细胞向运动神经前体细胞分化；
S3：运动神经前体细胞向有丝分裂后运动神经元分化；
S4：有丝分裂后运动神经元向成熟运动神经元分化，即得到成熟的运动神经元；
所述S1包括：
S11：将人多能干细胞的上清液吸除，加入特异性分化培养基诱导分化，并向特异性分化培养基中加入BMP抑制剂、Nodal抑制剂和GSK-3抑制剂；
S12：每天更换培养基，培养4-5天；
所述S2包括：
S21：吸除神经上皮细胞的上清液，加入特异性分化培养基诱导分化，并向特异性分化培养基中加入RAR核受体激活剂和Sonic Hedgehog信号通路激活剂；
S22：每天更换培养基，培养4-5天；
在S22之后，还可包括步骤S23：将分化得到的运动神经前体细胞进行冻存；
所述S3包括：
S31：吸除运动神经前体细胞上清液，加入特异性分化培养基诱导分化，并向特异性分化培养基中加入γ分泌酶抑制剂；
S32：每天更换培养基，培养3-4天；
所述S4包括：
S41：吸除有丝分裂后运动神经元上清液，加入特异性分化培养基诱导分化，并向特异性分化培养基中加入相关分化因子；所述相关分化因子包括：BDNF、GDNF、IGF-1、dibutyryl-cAMP和维生素C；
S42：隔天更换培养基，培养20-25天；
所述运动神经元表达PAX6+、OLIG2+、HB9+、和ISL1+，还表达MAP2+、CHAT+、Synaptophysin+中的一种或任意组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1之前还包括步骤S0：多能干细胞的培养。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，BMP抑制剂、Nodal抑制剂和GSK-3抑制剂分别为LDN193189、SB431542和CHIR-99021。
4.一种细胞群，其特征在于，含有权利要求1-3中任意一项所述的方法制备而得的运动神经元。
5.一种治疗运动神经元病的药物，其特征在于，所述药物包含权利要求4所述的细胞群。
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