JP7023840B2 - 神経筋接合活性のモジュレーターを同定するin vitroの方法 - Google Patents
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Description
本願は、2015年10月7日に出願された米国仮出願第62/238,531号の優先権を主張し、その内容全体が組み込まれる。
本発明は、米国国立衛生研究所および米国国立神経疾患・卒中研究所によって授与された補助金番号NS052671のもとの政府援助により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、ヒト神経筋接合部のin vitroモデルを使用する、神経筋活性および/または筋活性のモジュレーターを同定する方法に関する。
神経筋疾患は、運動ニューロンもしくは筋肉細胞の損失、運動ニューロンもしくは筋肉細胞の機能の低減、または中枢神経系(CNS)もしくは末梢神経系(PNS)の運動経路における変性変化に起因する運動ニューロンおよび/または筋の機能の障害をもたらす疾患である。このような疾患は、運動ニューロン以外のニューロンの破壊によって引き起こされるアルツハイマー病などの他の神経変性疾患とは異なる。典型的には、神経筋疾患は、発生における、または進行性の変性障害である。症状として、嚥下困難、四肢の脱力、不明瞭発語、歩行障害、顔面脱力および筋痙攣が挙げられうる。呼吸は、死に至ることの多いこれらの疾患の後期に影響を受ける場合がある。ほとんどの神経筋疾患の原因は知られていないが、環境的、毒性、ウイルス性または遺伝性要因のすべてが疑わしい。
本発明は、ヒト運動ニューロンおよびヒト筋肉細胞(例えば、前記運動ニューロンおよび任意選択で前記筋肉細胞は、in vitro分化の産物である)を培養することによって調製された培養ヒト神経筋接合部(NMJ)に関する。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される:
(項目1)
ヒト運動ニューロンとヒト骨格筋の共培養物とを含むin vitro神経筋接合部を含む組成物であって、該運動ニューロンはヒト多能性幹細胞(PSC)由来脊髄運動ニューロンを含み、該骨格筋はヒト筋芽細胞由来骨格筋またはPSC由来筋肉を含む組成物。
(項目2)
前記神経筋接合部がPSC由来筋肉細胞を含む、項目1に記載の組成物。
(項目3)
前記運動ニューロンが、検出可能レベルの、ホメオボックス遺伝子9(HB9)、神経フィラメントマーカーSMI32、Islet1(ISL1)、ホメオボックス転写因子NKX6.1、オリゴデンドロサイト転写因子2(OLIG2)、コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)、アセチルコリンエステラーゼ(ACHE)、およびアグリン(AG)の1種または複数を発現する、項目1に記載の組成物。
(項目4)
前記ヒトPSC由来脊髄運動ニューロンを、ヒトPSCを有効量の少なくとも1つのSmall Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)阻害剤、少なくとも1つの腹側化因子、および少なくとも1つの尾方化因子と接触させることによって分化させる、項目1に記載の組成物。
(項目5)
前記少なくとも1つのSMAD阻害剤が、形質転換増殖因子β(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤および骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の阻害剤からなる群から選択される、項目4に記載の組成物。
(項目6)
TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の前記阻害剤がSB431542である、項目5に記載に記載の組成物。
(項目7)
BMPシグナル伝達の前記阻害剤がLDN193189である、項目5に記載に記載の組成物。
(項目8)
前記少なくとも1つの腹側化因子が、ヘッジホッグ経路の活性化剤を含む、項目4に記載の組成物。
(項目9)
前記ヘッジホッグ経路の前記活性化剤が、ソニックヘッジホッグ(SHH)、パーモルファミン、およびその組合せからなる群から選択される、項目8に記載に記載の組成物。
(項目10)
前記少なくとも1つの尾方化因子が、レチノイン酸(RA)、ウィングレス(Wnt)活性化因子、およびその組合せからなる群から選択される、項目4に記載の組成物。
(項目11)
前記運動ニューロンが光感受性タンパク質を発現する、項目1に記載の組成物。
(項目12)
前記光感受性タンパク質は光ゲートイオンチャネルを含む、項目11に記載の組成物。
(項目13)
前記光ゲートイオンチャネルが、ロドプシン、チャネルロドプシン、ハロロドプシン、アーキロドプシン、バクテリオロドプシン、プロテオロドプシン、それらの誘導体、およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目12に記載の組成物。
(項目14)
前記チャネルロドプシンはチャネルロドプシン-2である、項目13に記載の組成物。
(項目15)
前記ヒト運動ニューロンおよびヒト骨格筋は、ALS、重症筋無力症、または悪液質と診断されたか、またはALS、重症筋無力症、または悪液質を有するリスクのある被験体から単離された細胞に由来する、項目1に記載の組成物。
(項目16)
前記ヒト運動ニューロンおよびヒト骨格筋は、重症筋無力症患者由来の免疫グロブリンの存在下で共培養され、該免疫グロブリンは該患者の前記神経筋接合部のタンパク質に対する自己抗体を含む、項目1に記載の組成物。
(項目17)
前記ヒト運動ニューロンおよびヒト骨格筋は、悪液質と診断されたか、または悪液質を有するリスクのある被験体由来の血液、血清、および/または血漿の存在下で共培養される、項目1に記載の組成物。
(項目18)
前記ヒト運動ニューロンおよびヒト骨格筋は、タンパク質分解因子および/または炎症性サイトカインの存在下で共培養される、項目1に記載の組成物。
(項目19)
前記炎症性サイトカインが、腫瘍壊死因子アルファ、インターフェロンガンマおよびインターロイキン6からなる群から選択される、項目18に記載の組成物。
(項目20)
神経筋接合部活性のアゴニストを同定するための方法であって、項目1から19のいずれか一項に記載のin vitro神経筋接合部の運動ニューロンを刺激するステップと、該神経筋接合部を候補化合物と接触させるステップとを含み、該in vitro神経筋接合部の活性を増加させる候補化合物が該アゴニストとして選択される方法。
(項目21)
神経筋接合部活性のアゴニストを同定するための方法であって、
(a)候補化合物の存在下で、項目1から19のいずれか一項に記載のin vitro神経筋接合部の運動ニューロンを刺激するステップ、および該in vitro神経筋接合部の活性を決定するステップと、
(b)該候補化合物の非存在下で、項目1から19のいずれか一項に記載のin vitro神経筋接合部の運動ニューロンを刺激するステップ、および該in vitro神経筋接合部の活性を決定するステップと、
(c)(a)および(b)の活性を比較するステップと、
(d)(a)の活性のレベルが(b)の活性のレベルより高い場合に、該候補化合物を該アゴニストとして選択するステップと
を含む方法。
(項目22)
神経筋接合部活性のアンタゴニストを同定するための方法であって、項目1から19のいずれか一項に記載のin vitro神経筋接合部の運動ニューロンを刺激するステップと、該神経筋接合部を候補化合物と接触させるステップとを含み、該in vitro神経筋接合部の活性を低下させる候補化合物が該アンタゴニストとして選択される方法。
(項目23)
神経筋接合部活性のアンタゴニストを同定するための方法であって、
(a)候補化合物の存在下で、項目1から19のいずれか一項に記載のin vitro神経筋接合部の運動ニューロンを刺激するステップ、および該in vitro神経筋接合部の活性を決定するステップと、
(b)該候補化合物の非存在下で、項目1から19のいずれか一項に記載のin vitro神経筋接合部の運動ニューロンを刺激するステップ、および該in vitro神経筋接合部の活性を決定するステップと、
(c)(a)および(b)の活性を比較するステップと、
(d)(a)の活性のレベルが(b)の活性のレベルより低い場合に、該候補化合物をアンタゴニストとして選択するステップと
を含む方法。
(項目24)
前記in vitro神経筋接合部の活性が、前記運動ニューロンおよび/または筋肉において検出可能な活動電位の振幅、該運動ニューロンおよび/または筋肉において検出可能な活動電位の周波数、該運動ニューロンおよび/または筋肉において検出可能な活動電位の期間、該運動ニューロンによって放出される神経伝達物質のレベル、該運動ニューロンと該筋肉との間のシナプスの神経伝達物質のレベル、カルシウム電流の振幅、カルシウム電流の周波数、カルシウム電流の期間、筋肉運動、およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目20から23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
前記運動ニューロンが光ゲートイオンチャネルを発現し、該運動ニューロンが、該運動ニューロンにおいて活動電位を誘導するのに十分な光の波長に該運動ニューロンを曝露することによって刺激される、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記運動ニューロンが、該運動ニューロンにおいて活動電位を誘導するのに有効な量で、電流を該運動ニューロンに注入すること、および/または該運動ニューロンの膜電位を脱分極させることによって刺激される、項目24に記載の方法。
(項目27)
項目1から19のいずれか一項に記載のin vitro神経筋接合部を含むキット。
(項目28)
PSC由来運動ニューロンと骨格筋、またはそれらの共培養物を含むキット。
(項目29)
神経筋接合部活性をモジュレートする遺伝子を同定する方法であって、神経筋接合部の運動ニューロンおよび/または筋肉の遺伝子の発現レベルを上昇させるまたは低下させるステップと、該神経筋接合部の活性を決定するステップとを含み、遺伝子の発現レベルの上昇または低下と相関する神経筋接合部活性の増加または低下が、該遺伝子が神経筋接合部活性のモジュレーターであることを示す方法。
(項目30)
in vitro神経筋接合部を調製する方法であって、多能性幹細胞(PSC)を脊髄運動ニューロンに分化させるステップと、該PSC由来脊髄運動ニューロンを骨格筋と共培養するステップとを含む方法。
(項目31)
前記PSCを、該PSCを有効量の少なくとも1つのSmall Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)阻害剤、少なくとも1つの腹側化因子、および少なくとも1つの尾方化因子と接触させることによって脊髄運動ニューロンへと分化させ、該分化した脊髄運動ニューロンが、検出可能レベルの、ホメオボックス遺伝子9(HB9)、神経フィラメントマーカーSMI32、Islet1(ISL1)、ホメオボックス転写因子NKX6.1、オリゴデンドロサイト転写因子2(OLIG2)、コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)、アセチルコリンエステラーゼ(ACHE)、およびアグリン(AG)の1種または複数を発現する、項目30に記載の方法。
本発明は、ヒト神経筋接合部(NMJ)が、ヒト多能性幹細胞(PSC)由来脊髄運動ニューロンをヒト筋芽細胞由来骨格筋、またはPSC由来筋肉細胞と共培養することによって調製される、NMJのin vitroモデルの作製に関する。ある特定の実施形態では、ニューロンは、光遺伝学的制御下にあり、ニューロンの活性化は、光を用いる刺激によって達成されうる。本明細書に記載されているように、in vitroモデルは、NMJ活性のモジュレーター、およびそれによって運動ニューロンおよび/または筋活性をモジュレートする化合物を同定するために使用されうる。ある特定の実施形態では、in vitroモデルは、神経筋疾患を有する被験体由来のPSCから調製され、その結果、疾患状態のNMJの活性をモジュレートすることができる化合物を同定することができ、同定された化合物は、神経筋疾患を処置する際に治療的に有効でありうる。
(i)培養した神経筋接合部(NMJ)、および
(ii)NMJモジュレーターを同定する方法。
本発明は、ヒト運動ニューロンおよびヒト筋肉細胞(例えば、前記運動ニューロンおよび任意選択で前記筋肉細胞は、in vitro分化の産物である)を培養することによって調製された培養ヒト神経筋接合部(NMJ)に関する。
本発明は、運動ニューロンがシナプス接続を形成する際に運動ニューロンおよび/または筋肉の活性をモジュレートする(すなわち、NMJ活性のモジュレーション)化合物を同定する方法を提供する。神経筋接合部の活性をモジュレートする候補化合物のキャパシティーは、本明細書に記載されているように、in vitro NMJモデルの活性をモジュレートする候補化合物の能力をアッセイすることによって決定することができる。したがって、本明細書に記載されている方法は、候補化合物が、当技術分野で公知の任意のNMJ活性指数、例えば、神経伝達物質の放出もしくは安定性の増加もしくは低下、例えば、カルシウム、ナトリウムもしくはカリウムなどのイオンの透過性、および/または運動ニューロンと筋肉との間の接続性をモジュレートするかどうかを決定するための方法を提供する。非限定的な一実施形態では、候補化合物は、運動ニューロンと筋肉との間の神経の接続性を増加または低下させることによってNMJ活性をモジュレートすることができる。
本開示の主題は、限定としてではなく、本発明の例として提供される以下の実施例を参照して、よりよく理解される。
(実施例1)
光遺伝学的制御下でin vitro神経筋接合部を使用するヒト神経筋疾患のモデリング
疾患モデリングおよび再生医療におけるヒト多能性幹細胞(PSC)由来ニューロンの潜在能力を十分に把握するには、複雑な機能的系でのそれらの照合が必要である。ここで、本発明者らは、ヒトPSC由来脊髄運動ニューロンにおける光遺伝学的制御の確立を示す。これらの運動ニューロンをヒト筋芽細胞由来骨格筋と共培養することが、光刺激の際に攣縮を誘発しうる。生理学的アプローチおよびイメージングアプローチを使用して、新たに確立した、すべてのヒト神経筋接合部を特徴付けた。神経筋疾患をモデル化するために、本発明者らは、これらの共培養物を重症筋無力症患者からのIgGと、および活性補体とインキュベートした。重症筋無力症は、神経筋接合部を選択的に標的とする自己免疫障害である。本発明者らは、筋肉強度の特徴的損失のサロゲートマーカーに該当する、筋肉収縮の振幅における可逆的低減を観察した。疾患の重要な態様とその対症療法を再現することができることにより、本発明者らの新規な神経筋接合部アッセイが、神経筋疾患および再生のモデリングに広く密接な関係を有することが示される。
ヒト脊髄MN集団において光遺伝学的制御を確立するために、本発明者らは、ヒトシナプシンプロモーターの制御下で、チャネルロドプシン-2-EYFPまたはEYFP単独の発現のために、レンチウイルスベクターで未分化H9hESCを形質導入した。シナプシンプロモーターは、ヒトPSC由来ニューロンにおける正確かつロバストな発現のために選択した。クローンhESC株を増殖させ、導入遺伝子のゲノム統合(データは示さず)および多能性マーカー発現の維持(図1A、O)に関してPCRで検証した。種々のニューロン分化パラダイム(Steinbeckら、2015年)を通じてロバストな導入遺伝子発現を有するESCクローンのみを、さらなる実験のために選択した。脊髄運動ニューロンへの分化は、SMADによる二重阻害(Chambersら、2009年)と、腹側化のためのヘッジホッグ経路の活性化および尾方化のためのレチノイン酸への曝露(Calderら、2015年)とを組み合わせることによって達成した。分化20日目までに、ChR2-EYFP導入遺伝子は、これらの培養条件下で出現するニューロンクラスターにおいて強く発現した(図1B)。本発明者らは、20日目に培養物を解離させ、非ニューロン細胞を含有する上清を廃棄する一方でニューロンクラスターを沈降させることを含む簡便な精製手順を開発した。このストラテジーにより、hESC由来MNの有意な精製が可能となった(図1C)。5回の連続したMN分化のQRT-PCR分析により、精製MNクラスター中の真の脊髄運動ニューロン(sMN)マーカーISL1、NKX6.1およびOLIG2の3倍富化が確認され(図1D)、一方、非ニューロン夾雑物についてのマーカー(FOXA2、PDX1)は精製MN培養物中でおよそ10倍枯渇した(図1E)。40日目の精製MNに関するさらなるQRT-PCR実験において、本発明者らは、生理学的に関連するMNマーカーであるコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)アセチルコリンエステラーゼ(ACHE)およびアグリン(AG)が発現されることを見出した(CHAT 60.3±29.6% HPRT、ACHE HPRTの273.6±59.3%、AG HPRTの79.3±32.1%)。免疫細胞化学によって、本発明者らは、精製MNが、ChR2-EYFP(図1F)ならびにChATおよび成熟神経フィラメントマーカーSMI32(図1G)と組み合わせて、HB9およびISL1を発現したことを確認した。MN誘導(Mauryら、2015年)についての代替プロトコルにより、同等の結果が得られた(図1H~J)。光遺伝学的制御を電気生理学実験で検証した。明視野および緑色蛍光光学下で同定した成熟した脊髄運動ニューロンでは(60日目を超える)(図1K)、強い活動電位(AP)の発火が、脱分極電流の注入ステップによって、-70±2mVに保った膜電位から惹起された(図1L)。膜の静止電位は、-62.4±4.8mVであった。さらに、4つのChR2発現ニューロンのうちの4つが、0.2~10Hzの広範な周波数範囲で、光誘導APを発火した(図1M、N)。スパイクフィデリティは、0.2から2Hzで100%、5Hzで93.3±5.7%および10Hzで65.5±23.3%であった。EYFP hESC株由来の精製ニューロンは、HB9およびISL1も発現し(図1O、P)、電流注入によってAPの発火を誘導することができた(図1Q)。膜の静止電位は、-58.4±2.6mVであった。期待されたように、2つの試験したEYFP+ニューロンのうち2つは、いかなる光刺激にも応答しなかった(図1R)。
再生医療において最も期待されるヒト脊髄運動ニューロンの適用(Davis-Dusenberyら、2014年;SteinbeckおよびStuder、2015年)は、神経筋接合部を介して骨格筋に機能的に接続するそれらの能力に依存する。しかしながら、ニューロンの移植片対宿主接続性の非常に一般的な展望は、技術的制限と適切なin vitroアッセイの欠如によって十分に検証されないままである。光遺伝学を使用して、本発明者らは、多大な治療的潜在性を有するヒトPSC由来ニューロン集団が、その真正のヒト標的組織に機能的に接続することをはじめて実証する。一研究では、成体マウスの坐骨神経の部分的に除神経した枝に移植した、光遺伝学的制御下の、マウス胚性幹細胞由来運動ニューロンが、後肢の下部筋肉を再神経支配した(Brysonら、2014年)。しかしながら、本研究は、PSC由来運動ニューロンと筋芽細胞由来筋肉とから調製した完全ヒトin vitro神経筋接合部について記載し、ここで、運動ニューロンは、in vitroで筋肉に対する機能的シナプス形成することができる。このようなin vitroアプローチによって、機能的実験において、神経筋接続性の詳細な機能的特徴付けおよび細胞融合の明確な排除が可能となる。いかなる特定の理論にも拘泥されることなく、本発明者らの系では、神経筋のシナプス形成は、おそらく、MuSKとラプシンを介してシグナル伝達して神経筋接続部のアセンブリーを誘導するMN終末によるアルギンの分泌に関する(SanesおよびLichtman、2001年;Wuら、2010年)。プラーク様AChRクラスタリング(Marquesら、2000年)は、刺激により誘導した収縮性の強化と共に(図4J)、完全に機能的であるが未だ未成熟の神経筋シナプスの形成を示唆する。
シナプシン-hChR2-EYFPのhESC株
H9ヒトES細胞にレンチウイルス粒子を形質導入し(pLenti-Syn-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE)、クローン密度でプレーティングした。出現するコロニーを導入遺伝子統合に関して、PCRによってスクリーニングし、分化させて、すべてのニューロン後代において安定な長期発現を確実にした。
ES細胞をコンフルエント単層にプレート培養し、SMADによる二重阻害によって神経誘導を開始した。腹側化および尾方化のために、パルモルファミンとレチノイン酸を1日目~15日目に添加した(Calderら、2015年)。20日目までに出現するMNクラスターを沈降によって精製した。
ヒト初代筋芽細胞は、Life Technologies(成人ドナー)およびLonza(胎児ドナー)から購入した。両方の筋芽細胞集団は骨格筋成長培地(SkGM-2、Lonza)で成長させた。筋芽細胞が、2%のウマ血清を含有する培地に曝露することによって、70%コンフルエンスに達したら、分化を誘導した。
筋芽細胞分化の開始の5から10日後、精製したMNクラスターをマトリゲルに再懸濁させ、筋培養物の上部の中心にプレーティングした。培養物を、2%のウマ血清を添加してMN分化培地中に保った。
成熟した共培養物を、間欠的に蛍光光に対してシャッターを開きながら、10×の明視野照明下で観察した(470nm、2mW/mm2、およそ300ミリ秒のパルス)。安定な収縮領域を、標準のTyrode溶液中、室温で、一定の明視野照明下で画像化した(40ミリ秒の曝露時間、500ミリ秒毎、100フレーム)。光遺伝学的刺激(470または630nm、2mW/mm2、およそ300ミリ秒のパルス)を指定の周波数で適用した。運動の定量のために、複数の代表的な高コントラスト領域を自動でトレースした(MetaMorph Software)。
カバーガラス上の筋管または共培養物をレシオメトリックカルシウム色素Fura2とともにインキュベートし、標準のTyrode溶液中連続灌流下で画像化した。筋管はアセチルコリンで刺激した。共培養物には、5秒毎に470nm(4mW/mm2)で10ミリ秒間の光遺伝学的刺激のために照明を当てた。
成熟したEYFP+ MNの全細胞に関して、電流固定記録を室温で実施した。光惹起APを、447nmのダイオードレーザー(OEM Laser)を使用して、およそ1mW/mm2の5ミリ秒の光パルスで誘発した。光刺激に応じて収縮する筋管を、細胞内記録のために鋭い電極で突き刺した。
5名の健康なドナー由来の血清(補体を含有する)をプールし、示された培地に添加した(2%v/v)。IgG画分を2名の重度に罹患したMG患者から得て、サンドグロブリン多価IgGは対照としての役割を果たした(すべて200nMの総IgG、患者番号1 AChR抗体力価576nmol/l、番号2 AChR抗体力価17nmol/l)。患者は、調査に対してこれらの材料を使用するための同意書を与え、これは、Wuerzburg University Medical School Ethics Committeeによって承認された。
細胞または培養物はPFA中に固定し、5%FBS/0.3%Tritonでブロッキングした。一次抗体を製造業者の推奨に従ってインキュベートし、続いて、適当なAlexa Flourコンジュゲート二次抗体をインキュベートした。染色したものを倒立蛍光顕微鏡で画像化するか、または共焦点イメージングを40/63×の油浸対物レンズを使用する白色レーザー技術を備える倒立Leica SP8顕微鏡で実施し、続いて、示された場合には、次にデータデコンボリューションを実施した。
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Claims (21)
- ヒト運動ニューロンとヒト骨格筋の共培養物を含むin vitro神経筋接合部を含む組成物であって、該ヒト運動ニューロンは光感受性タンパク質を発現し、かつ、ヒト多能性幹細胞(PSC)由来脊髄運動ニューロンを含み、該ヒト骨格筋はヒト筋芽細胞由来骨格筋を含み、
ここで、該ヒトPSC由来脊髄運動ニューロンは、ヒトPSCを、以下:
形質転換増殖因子β(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤、骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の阻害剤、およびその組合せからなる群より選択される少なくとも1つのSmall Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)阻害剤;
ヘッジホッグ経路の活性化剤を含む少なくとも1つの腹側化因子;および
レチノイン酸(RA)、ウィングレス(Wnt)活性化因子、またはその組合せを含む少なくとも1つの尾方化因子
と接触させることにより分化させるものである、
組成物。 - 前記ヒトPSC由来脊髄運動ニューロンが、検出可能レベルの、ホメオボックス遺伝子9(HB9)、神経フィラメントマーカーSMI32、Islet1(ISL1)、ホメオボックス転写因子NKX6.1、オリゴデンドロサイト転写因子2(OLIG2)、コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)、アセチルコリンエステラーゼ(ACHE)、およびアグリン(AG)からなる群より選択される少なくとも1種のマーカーを発現する、請求項1に記載の組成物。
- TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の前記阻害剤がSB431542である、請求項1または2に記載に記載の組成物。
- BMPシグナル伝達の前記阻害剤がLDN193189である、請求項1から3のいずれか一項に記載に記載の組成物。
- 前記ヘッジホッグ経路の前記活性化剤が、ソニックヘッジホッグ(SHH)、パーモルファミン、およびその組合せからなる群から選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載に記載の組成物。
- 前記光感受性タンパク質は光ゲートイオンチャネルを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記光ゲートイオンチャネルが、ロドプシン、チャネルロドプシン、ハロロドプシン、アーキロドプシン、バクテリオロドプシン、プロテオロドプシン、それらの誘導体、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項6に記載の組成物。
- 前記チャネルロドプシンはチャネルロドプシン-2である、請求項7に記載の組成物。
- 前記ヒト運動ニューロンおよびヒト骨格筋は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、重症筋無力症、または悪液質と診断されたか、あるいはALS、重症筋無力症、または悪液質を有するリスクのある被験体から単離された細胞に由来する、請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ヒト運動ニューロンおよびヒト骨格筋は、重症筋無力症患者由来の免疫グロブリンの存在下で共培養され、該免疫グロブリンは該患者の神経筋接合部のタンパク質に対する自己抗体を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ヒト運動ニューロンおよびヒト骨格筋は、悪液質と診断されたか、または悪液質を有するリスクのある被験体由来の血液、血清、および/または血漿の存在下で共培養される、請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ヒト運動ニューロンおよびヒト骨格筋は、タンパク質分解因子および/または炎症性サイトカインの存在下で共培養される、請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記炎症性サイトカインが、腫瘍壊死因子アルファ、インターフェロンガンマおよびインターロイキン6からなる群から選択される、請求項12に記載の組成物。
- 神経筋接合部活性のアゴニストを同定するための方法であって、a)請求項1から13のいずれか一項に記載のin vitro神経筋接合部のヒト運動ニューロンを刺激するステップと、b)該神経筋接合部を候補化合物と接触させるステップと、c)該候補化合物が該in vitro神経筋接合部の活性を増加させる場合に、該候補化合物を該アゴニストとして同定するステップと、を含む方法。
- 神経筋接合部活性のアゴニストを同定するための方法であって、
(a)候補化合物の存在下で、請求項1から13のいずれか一項に記載のin vitro神経筋接合部のヒト運動ニューロンを刺激するステップ、および該in vitro神経筋接合部の活性を決定するステップと、
(b)該候補化合物の非存在下で、請求項1から13のいずれか一項に記載のin vitro神経筋接合部のヒト運動ニューロンを刺激するステップ、および該in vitro神経筋接合部の活性を決定するステップと、
(c)(a)で決定された活性および(b)で決定された活性を比較するステップと、
(d)(a)で決定された活性のレベルが(b)で決定された活性のレベルより高い場合に、該候補化合物を該アゴニストとして同定するステップと
を含む方法。 - 神経筋接合部活性のアンタゴニストを同定するための方法であって、a)請求項1から13のいずれか一項に記載のin vitro神経筋接合部のヒト運動ニューロンを刺激するステップと、b)該神経筋接合部を候補化合物と接触させるステップと、c)該候補化合物が該in vitro神経筋接合部の活性を低下させる場合に、該候補化合物を該アンタゴニストとして同定するステップと、を含む方法。
- 神経筋接合部活性のアンタゴニストを同定するための方法であって、
(a)候補化合物の存在下で、請求項1から13のいずれか一項に記載のin vitro神経筋接合部のヒト運動ニューロンを刺激するステップ、および該in vitro神経筋接合部の活性を決定するステップと、
(b)該候補化合物の非存在下で、請求項1から13のいずれか一項に記載のin vitro神経筋接合部のヒト運動ニューロンを刺激するステップ、および該in vitro神経筋接合部の活性を決定するステップと、
(c)(a)で決定された活性および(b)で決定された活性を比較するステップと、
(d)(a)で決定された活性のレベルが(b)で決定された活性のレベルより低い場合に、該候補化合物をアンタゴニストとして同定するステップと
を含む方法。 - 前記in vitro神経筋接合部の活性が、前記ヒト運動ニューロンにおいて検出可能な活動電位の振幅、前記ヒト骨格筋において検出可能な活動電位の振幅、該ヒト運動ニューロンにおいて検出可能な活動電位の周波数、該ヒト骨格筋において検出可能な活動電位の周波数、該ヒト運動ニューロンにおいて検出可能な活動電位の期間、該ヒト骨格筋において検出可能な活動電位の期間、該ヒト運動ニューロンによって放出される神経伝達物質のレベル、該ヒト運動ニューロンと該ヒト骨格筋との間のシナプスの神経伝達物質のレベル、カルシウム電流の振幅、カルシウム電流の周波数、カルシウム電流の期間、筋肉運動、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項14から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヒト運動ニューロンが光ゲートイオンチャネルを発現し、該ヒト運動ニューロンが、該ヒト運動ニューロンにおいて活動電位を誘導するのに十分な光の波長に該ヒト運動ニューロンを曝露することによって刺激される、請求項18に記載の方法。
- 前記ヒト運動ニューロンが、該ヒト運動ニューロンにおいて活動電位を誘導するのに有効な量で、電流を該ヒト運動ニューロンに注入すること、および/または該ヒト運動ニューロンの膜電位を脱分極させることによって刺激される、請求項18に記載の方法。
- 神経筋接合部のモジュレーターを同定するための、請求項1から13のいずれか一項に記載のin vitro神経筋接合部を含むキット。
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