JP2022546482A - 中脳ドーパミンニューロンの生成及び単離方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、中脳ドーパミンニューロン（ｍＤＡ）及びその前駆体を生成するための方法、そのような方法よって生成されるｍＤＡ及びその前駆体、並びにそのような細胞を含む組成物、並びに神経障害を予防及び／又は処置するためのその使用を提供する。本開示はさらに、新規表面マーカーを使用して細胞集団からｍＤＡ及びその前駆体を単離する方法を提供する。特定の実施形態では、細胞を、少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤と少なくとも約１日間接触させる。特定の実施形態では、細胞を、少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤と最大約１５日間接触させる。特定の実施形態では、細胞を、少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤と約５日間接触させる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月２９日に出願された米国仮出願第６２／８９３，６７４号の優先権を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、優先権が主張される。

１．序論
本開示は、中脳ドーパミンニューロン（ｍＤＡ）及びその前駆体を生成するための方法、そのような方法によって生成されるｍＤＡ及びその前駆体並びにそのような細胞を含む組成物を提供する。本開示はまた、神経障害を予防及び／又は処置するためのｍＤＡ及びそれを含む組成物の使用を提供する。本開示はさらに、新規表面マーカーを使用して細胞集団からｍＤＡ及びその前駆体を単離する方法を提供する。

２．背景
以前は、胚性及び体性幹細胞が、神経変性疾患の治療薬及びモデル系として使用されていた。胚性及び体性幹細胞の定方向分化に関する研究及び技術開発は、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、及び多発性硬化症などの中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患の分野で行われている。しかしながら、これらの研究の結果は、ニューロン機能を回復させるインビボ能力をほとんど示さず、患者において望ましくない腫瘍の成長をしばしばもたらした。

したがって、パーキンソン病などの神経変性障害の処置するために適した中脳ドーパミンニューロンを生成するための改善された方法が、依然として必要とされている。

３．発明の概要
本開示は、中脳ドーパミンニューロン（ｍＤＡ）及びその前駆体、そのような方法によって生成されたｍＤＡ及びその前駆体を生成するための方法、そのような細胞を含む組成物、並びに神経障害を予防及び／又は処置するためのそのような細胞及び組成物の使用を提供する。さらに、本開示は、新規な表面マーカーを使用して細胞集団からｍＤＡ及びその前駆体を単離する方法を提供する。

特定の実施形態では、本開示は、幹細胞の分化を誘導するためのインビトロ方法であって、幹細胞を、少なくとも１つのＳｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達阻害剤、少なくとも１つのソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤、及び少なくとも１つのウイングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達活性化剤と接触させることと、細胞を少なくとも１つの線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達活性化剤と接触させて、中脳ドーパミンニューロン（ｍＤＡ）又はその前駆体を示す少なくとも１つのマーカーを発現する分化細胞の集団を得ることと、を含み、少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤が、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ８ａ、及びそれらの組合せから選択される、方法を提供する。

特定の実施形態では、本開示は、幹細胞の分化を誘導するためのインビトロ方法であって、幹細胞を、少なくとも１つのＳｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達阻害剤、少なくとも１つのソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤、及び少なくとも１つのウイングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達活性化剤と接触させることと、細胞を少なくとも１つの線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達活性化剤と接触させて、中脳ドーパミンニューロン（ｍＤＡ）又はその前駆体を示す少なくとも１つのマーカーを発現する分化細胞の集団を得ることと、を含み、細胞と少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤との初期接触が、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤との初期接触から少なくとも約５日後である、方法を提供する。

特定の実施形態では、細胞を、少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤と少なくとも約１日間接触させる。特定の実施形態では、細胞を、少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤と最大約１５日間接触させる。特定の実施形態では、細胞を、少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤と約５日間接触させる。

特定の実施形態では、細胞と少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤との初期接触が、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤との初期接触から少なくとも約５日後である。

特定の実施形態では、細胞と少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤との初期接触が、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤との初期接触から約１０日後である。特定の実施形態では、細胞と少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤との初期接触が、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤との初期接触から１２日後である。

特定の実施形態では、細胞を、少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤と約５日間接触させる。特定の実施形態では、細胞を、少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤と７日間接触させる。

特定の実施形態では、細胞を、少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化剤と約５日間接触させる。特定の実施形態では、細胞を、少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化剤と７日間接触させる。

特定の実施形態では、細胞を、少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤と約１０日間接触させる。特定の実施形態では、細胞を、少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤と１２日間接触させる。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤の濃度は、幹細胞とのその初期接触から約４日増加する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤の濃度は、少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤の初期濃度から約３００％～約１０００％増加する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤の濃度は、約３μＭ～１０μＭの濃度に増加する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤の濃度は、約３μＭの濃度に増加する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤の濃度は、約７．５μＭの濃度に増加する。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤は、ＦＧＦ１８を含む。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌシグナル伝達阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤、及びそれらの組合せから選択される。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌシグナル伝達阻害剤は、ＡＬＫ５の阻害剤を含む。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌシグナル伝達阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、又はその誘導体、若しくは混合物を含む。特定の実施形態では、ＳＢ４３１５４２の誘導体は、Ａ８３－０１である。特定の実施形態では、少なくとも１つのＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌシグナル伝達阻害剤は、ＳＢ４３１５４２を含む。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９、ノギン、ドルソモルフィン、それらの誘導体又はそれらの混合物を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ－１９３１８９を含む。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）シグナル伝達阻害剤を含む。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、ＣＨＩＲ９８０１４、リチウム、３Ｆ８、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ５ａ、それらの誘導体、及びそれらの混合物から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１を含む。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化剤は、ＳＨＨタンパク質、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト（ＳＡＧ）、それらの誘導体及びそれらの混合物から選択される。特定の実施形態では、ＳＨＨタンパク質は、組換えＳＨＨ、精製ＳＨＨ、又は前記の組合せを含む。

特定の実施形態では、組換えＳＨＨが、マウスソニックヘッジホッグＮ末端断片と少なくとも約８０％同一である組換えタンパク質を含む。特定の実施形態では、組換えＳＨＨは、ＳＨＨ Ｃ２５ＩＩを含む。特定の実施形態では、ＳＡＧは、パルモルファミンを含む。

特定の実施形態では、中脳ドーパミンニューロン又はその前駆体を示す少なくとも１つのマーカーは、ＥＮ１、ＯＴＸ２、ＴＨ、ＮＵＲＲ１、ＦＯＸＡ２、ＰＩＴＸ３、ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＯ３、ＳＮＣＡ、ＡＤＣＡＰ１、ＣＨＲＮＡ４、ＧＩＲＫ２、及びそれらの組合せから選択される。

特定の実施形態では、分化細胞は、幹細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤との初期接触から少なくとも約１０日後に、中脳ドーパミンニューロン又はその前駆体を示す少なくとも１つのマーカーの検出可能なレベルの発現を有する。

特定の実施形態では、分化細胞は、幹細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤との初期接触から約３０日後にＥＮ１の検出可能なレベルの発現を有する。特定の実施形態では、分化細胞は、幹細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤との初期接触から約４０日後にＥＮ１の検出可能なレベルの発現を有する。

特定の実施形態では、分化細胞は、ＰＡＸ６、ＥＭＸ２、ＬＨＸ２、ＳＭＡ、ＳＩＸ１、ＰＩＴＸ２、ＳＩＭ１、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＨＯＸ２Ａ、ＢＡＲＨＬ１、ＢＡＲＨＬ２、ＧＢＸ２、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ２、ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、及びそれらの組合せから選択される少なくとも１つのマーカーを発現しない。

特定の実施形態では、本方法は、分化細胞の集団を、中脳ドーパミンニューロン前駆体の中脳ドーパミンニューロンへの分化に有利な条件に供することをさらに含む。

特定の実施形態では、条件は、細胞を、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、トランスフォーミング成長因子ベータ３（ＴＧＦＰ３）、アスコルビン酸（ＡＡ）及びＤＡＰＴのうちの少なくとも１つに曝露することを含む。

特定の実施形態では、幹細胞は、ヒト、非ヒト霊長類又はげっ歯類の非胚性幹細胞；ヒト、非ヒト霊長類又はげっ歯類の胚性幹細胞；ヒト、非ヒト霊長類又はげっ歯類の人工多能性幹細胞；及びヒト、非ヒト霊長類又はげっ歯類の組換え多能性細胞から選択される。特定の実施形態では、幹細胞は、ヒト幹細胞である。特定の実施形態では、幹細胞は、多能性又は複能性幹細胞である。特定の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞である。特定の実施形態では、多能性幹細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞及びそれらの組合せから選択される。

別の態様では、本開示は、インビトロ分化細胞の細胞集団を提供し、前記インビトロ分化細胞は、任意の前記の方法によって得られる。

別の態様では、本開示は、インビトロ分化細胞の細胞集団であって、細胞のうちの少なくとも約５０％が、中脳ドーパミンニューロン又はその前駆体を示す少なくとも１つのマーカーを発現し、分化細胞のうちの約５０％未満が、ＰＡＸ６、ＥＭＸ２、ＬＨＸ２、ＳＭＡ、ＳＩＸ１、ＰＩＴＸ２、ＳＩＭ１、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＨＯＸ２Ａ、ＢＡＲＨＬ１、ＢＡＲＨＬ２、ＧＢＸ２、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ２、ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、及びそれらの組合せから選択される少なくとも１つのマーカーを発現する、細胞集団を提供する。特定の実施形態では、中脳ドーパミンニューロン又はその前駆体を示す少なくとも１つのマーカーは、ＥＮ１、ＯＴＸ２、ＴＨ、ＮＵＲＲ１、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＰＩＴＸ３、ＬＭＯ３、ＳＮＣＡ、ＡＤＣＡＰ１、ＣＨＲＮＡ４、ＧＩＲＫ２から選択される。

別の態様では、本開示は、本明細書に開示される細胞集団を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容され得る担体をさらに含む医薬組成物である。

別の態様では、本開示は、細胞の集団から中脳ドーパミンニューロン及びその前駆体を単離するための方法であって、検出可能なレベルの少なくとも１つの陰性表面マーカーを発現せず、検出可能なレベルの少なくとも１つの陽性表面マーカーを発現する細胞を単離することを含む、方法を提供する。

別の態様では、本開示は、細胞の集団から中脳ドーパミンニューロン及びその前駆体を単離するための方法であって、（ａ）細胞の集団における少なくとも１つの陰性表面マーカーの平均発現レベルと比較して、検出可能なレベルの少なくとも１つの陰性表面マーカーを発現しないか、又は低下したレベルの少なくとも１つの陰性表面マーカーを発現する、かつ（ｂ）細胞の集団における少なくとも１つの陽性表面マーカーの平均発現レベルと比較して、少なくとも１つの陽性表面マーカーのレベルが上昇した、細胞を単離することを含む、方法を提供する。

特定の実施形態では、少なくとも１つの陽性表面マーカーは、ＣＤ１７１、ＣＤ１８４及びそれらの組合せから選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの陽性表面マーカーは、ＣＤ１８４を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの陰性表面マーカーは、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ９９、ＣＤ３４０、及びそれらの組合せから選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの陰性表面マーカーは、ＣＤ４９ｅを含む。特定の実施形態では、本方法は、検出可能なレベルのＣＤ４９ｅを発現せず、かつ、検出可能なレベルのＣＤ１８４を発現する細胞を単離することを含む。

特定の実施形態では、本方法は、細胞の集団におけるＣＤ４９ｅの平均発現レベルと比較して、検出可能なレベルのＣＤ４９ｅを発現しないか、又は低下したレベルのＣＤ４９ｅを発現する、かつ細胞の集団におけるＣＤ１８４の平均発現レベルと比較して、増加したレベルのＣＤ１８４を発現する、細胞を単離することを含む。

別の態様では、本開示は、インビトロ分化細胞の細胞集団であって、細胞のうちの少なくとも約５０％が、検出可能なレベルの少なくとも１つの陽性表面マーカーを発現し、かつ検出可能なレベルの少なくとも１つの陰性表面マーカーを発現しない、インビトロ分化細胞の細胞集団を提供する。

別の態様では、本開示は、インビトロ分化細胞の細胞集団であって、細胞のうちの少なくとも約５０％が、細胞の集団における少なくとも１つの陽性表面マーカーの平均発現レベルと比較して、増加したレベルの少なくとも１つの陽性表面マーカーを発現する、かつ細胞の集団における少なくとも１つの陰性表面マーカーの平均発現レベルと比較して、検出可能なレベルの少なくとも１つの陰性表面マーカーを発現しないか、又は低下したレベルの少なくとも１つの陰性表面マーカーを発現する、インビトロ分化細胞の細胞集団を提供する。

特定の実施形態では、少なくとも１つの陽性表面マーカーは、ＣＤ１７１、ＣＤ１８４及びそれらの組合せから選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの陽性表面マーカーは、ＣＤ１８４を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの陰性表面マーカーは、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ９９、ＣＤ３４０、及びそれらの組合せから選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの陰性表面マーカーは、ＣＤ４９ｅを含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの陽性表面マーカーは、ＣＤ１８４を含み、かつ少なくとも１つの陰性表面マーカーは、ＣＤ４９ｅを含む。

別の態様では、本開示は、本明細書に開示される細胞集団を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、薬学的に許容され得る担体をさらに含む医薬組成物である。別の態様では、本開示は、中脳ドーパミンニューロン又はその前駆体への幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、（ａ）少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤と、（ｂ）少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化剤と、（ｃ）少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤と、（ｄ）少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤と、を含むキットを提供する。

特定の実施形態では、キットは、（ｆ）少なくとも１つの中脳ＤＡ前駆体マーカーを発現する分化細胞の集団への幹細胞の分化を誘導するための指示をさらに含む。

別の態様では、本開示は、対象の神経変性障害を予防及び／又は処置する方法であって、有効量の（ａ）本明細書に開示される細胞集団、又は（ｂ）本明細書に開示される組成物のうちの１つを対象に投与することを含む、方法を提供する。

特定の実施形態では、神経変性障害は、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、又は多発性硬化症である。

特定の実施形態では、本明細書に開示される細胞集団又は本明細書に開示される組成物は、対象における神経変性障害の予防及び／又は処置することにおける使用のためものである。特定の実施形態では、神経変性障害は、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、又は多発性硬化症である。
４．図面の簡単な説明

図１は、Ｗｎｔ－Ｂｏｏｓｔプロトコルを使用して３日目から３０日目までの幹細胞由来ｍＤＡ及び前駆体におけるＥＮ１発現を示す。

図２は、Ｗｎｔ－Ｂｏｏｓｔプロトコルと組合せてＦＧＦ８ｂを使用するプロトコルを示す。

図３は、分化細胞において、ＦＧＦ８ｂ接触期間依存的様式でＥＮ１タンパク質が維持されたことを示す。ＥＮ１を発現する細胞はまた、ＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１Ａを発現した。

図４Ａ～図４Ｂは、３０日目にｑＲＴ－ＰＣＲによって測定された分化細胞のｍＲＮＡ発現レベルを示す。図４Ａは、ＥＮ１のｍＲＮＡ発現レベルがＦＧＦ８ｂの接触期間依存的様式で維持され、ＦＯＸＡ２、ＮＵＲＲ１及びＴＨの発現レベルがすべての条件で同等であったことを示す。図４Ｂは、ＦＧＦ８ｂ接触期間依存的様式で誘導された非ｍＤＡマーカー、例えばＳＭＡ及びＳＩＸ１のｍＲＮＡ発現レベルを示す。 同上。

図５は、分化３０日目におけるＦＧＦ８ｂ処理細胞のＳＩＸ１免疫染色を示す。

図６は、分化１６日目におけるＦＧＦ処理細胞のマーカーのｍＲＮＡ発現を示す。

図７は、分化１６日目におけるＦＧＦ８ｂ及びＦＧＦ１８処理細胞のマーカーの免疫染色を示す。

図８は、分化２７日目及び４０日目におけるＦＧＦ８ｂ及びＦＧＦ１８処理細胞のマーカーのＲＮＡ発現を示す。

図９Ａは、ＮＵＲＲ１：：ＧＦＰレポーターｈＰＳＣについてのドナーベクター構造を示す概略図である。

図９Ｂは、Ｗｎｔ－Ｂｏｏｓｔプロトコルを使用してｈＰＳＣから分化させた細胞におけるＮＵＲＲ１ ｍＲＮＡレベルを示す。

図９Ｃは、分化２５日目におけるＨ９－ｈＰＳＣ及びＮＵＲＲ１：：ＧＦＰ ｈＰＳＣから分化した中脳ＤＡニューロンのＦＡＣＳ結果を示す。

図１０Ａは、分化２５日目及び４０日目に単離されたＮＵＲＲ１：ＧＦＰ陽性細胞における単一細胞ｑＲＴ－ＰＣＲ結果を示す。

図１０Ｂは、分化６０日目におけるＴＨ、ＦＯＸＡ２及びＮＵＲＲ１を発現するＮＵＲＲ１選別されたｍＤＡの免疫染色を示す。細胞を２５日目に選別し、続いて６０日目まで連続培養した。

図１１は、細胞を免疫不全マウスに注射した８週間後の、インビボで移植されたＮＵＲＲ１：：ＧＦＰ陽性中脳ＤＡニューロンの免疫染色画像を提供する。

図１２は、ＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔプロトコル及びＷＮＴ－ｂｏｏｓｔ＋ＦＧＦ１８（１２日目～１６日目）プロトコル下で培養したＮＵＲＲ１：ＧＦＰ陽性細胞の免疫染色画像を提供する。細胞を２５日目に選別し、続いて４０日目まで連続培養した。

図１３Ａは、ＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔプロトコル及びＷＮＴ－ｂｏｏｓｔ＋ＦＧＦ１８（１２日目～１６日目）プロトコル下で培養したＮＵＲＲ１：ＧＦＰ陽性細胞におけるＦＯＸＡ２、ＥＮ１、及びＮＵＲＲ１ ｍＲＮＡ発現を提供する。選別された細胞及び選別されていない細胞の両方におけるｍＲＮＡ発現を比較した。

図１３Ｂは、ＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔプロトコル及びＷＮＴ－ｂｏｏｓｔ＋ＦＧＦ１８（１２日目～１６日目）プロトコル下で培養した選別されたＮＵＲＲ１：ＧＦＰ陽性細胞を免疫不全マウスに移植したことを示す。格子状細胞における神経突起伸長並びにＴＨ及びＳＣ１２１の発現が検出された。

図１４は、Ｗｎｔ－Ｂｏｏｓｔプロトコルを使用して、ＮＵＲＲ１：：ＧＦＰ ｈＰＳＣに由来する分化２５日目にｍＤＡで３９０個の表面マーカーをスクリーニングしたことを示す。抗体は、ＰＥ、ＦＩＴＣ又はＡＰＣにコンジュゲートされた。 同上。 同上。 同上。 同上。

図１５Ａは、陽性表面マーカーＣＤ１７１及びＣＤ１８４が、ＮＵＲＲ１^＋細胞において富化されたことを示す。

図１５Ｂは、Ｗｎｔ－Ｂｏｏｓｔプロトコルを使用した分化細胞におけるＣＤ１７１及びＣＤ１８４のＲＮＡ発現を提供する。

図１６Ａは、陰性表面マーカーであるＣＤ４９ｅ、ＣＤ９９及びＣＤ３４０が、ＮＵＲＲ１＋細胞において富化されたことを示す。

図１６Ｂは、Ｗｎｔ－Ｂｏｏｓｔプロトコルを使用した分化細胞におけるＣＤ４９ｅ、ＣＤ９９及びＣＤ３４０のＲＮＡ発現を提供する。

図１７は、ＣＤ４９ｅ弱又はＣＤ４９ｅ高によって選別された細胞の形態を提供する。ＷＮＴ－ｂｏｏｓｔ及びＷＮＴ－ｂｏｏｓｔ＋ＦＧＦ１８プロトコル下でインビトロ分化２５日目に細胞を選別した。選別後、細胞をさらに１５日間培養した。

図１８は、ＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔプロトコル及びＷＮＴ－ｂｏｏｓｔ＋ＦＧＦ１８プロトコル下でインビトロ分化４０日目における選別されたＣＤ４９ｅ弱細胞の免疫染色画像を示す。

図１９は、ｈＰＳＣ細胞株ＭＥＬ１に由来するｍＤＡのＣＤ４９ｅに基づく精製の選別に関するＦＡＣＳ結果を示す。

図２０は、ＣＤ４９ｅ弱又はＣＤ４９ｅ高で選別したＭＥＬ１ ｈＰＳＣ由来ｍＤＡ細胞の形態を示す。ＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔプロトコル及びＷＮＴ－ｂｏｏｓｔ＋ＦＧＦ１８プロトコル下でインビトロ分化２５日目に細胞を選別した。選別後、細胞をさらに１５日間培養した。

図２１は、ＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔプロトコル及びＷＮＴ－ｂｏｏｓｔ＋ＦＧＦ１８プロトコル下でのインビトロ分化４０日目におけるＭＥＬ１ ｈＰＳＣ由来ＣＤ４９ｅ弱ｍＤＡの免疫染色画像を示す。ＣＤ４９ｅ弱細胞を２５日目に選別した。

図２２は、ＷＮＴ－ｂｏｏｓｔプロトコル及びＷＮＴ－ｂｏｏｓｔ＋ＦＧＦ１８プロトコル下でのインビトロ分化４０日目におけるＭＥＬ１ ｈＰＳＣ由来ＣＤ４９ｅ弱ｍＤＡにおける相対ｍＲＮＡ発現を示す。ＣＤ４９ｅ弱細胞を２５日目に選別した。

図２３は、ＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔ＋ＦＧＦ１８プロトコル下でインビトロ分化４０日目におけるＣＤ４９ｅ、ＣＤ９９又はＣＤ３４０選別された細胞の形態を示す。細胞をインビトロ分化２５日目に選別した。

図２４は、ＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔ＋ＦＧＦ１８プロトコル下でインビトロ分化４０日目におけるＣＤ４９ｅ、ＣＤ９９又はＣＤ３４０選別された細胞の相対的なｍＲＮＡ発現を示す。細胞をインビトロ分化２５日目に選別した。

図２５は、ＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔプロトコル下でのインビトロ分化２５日目に４９Ｅ（ＰＥ）及び１７１（ＡＰＣ）によって選別されたＮＵＲＲ１＋細胞のＦＡＣＳ選別結果を示す。

図２６は、ＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔプロトコル下でのインビトロ分化２５日目に４９Ｅ（ＰＥ）及び１８４（ＡＰＣ）によって選別されたＮＵＲＲ１＋細胞のＦＡＣＳ選別結果を示す。

図２７は、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ１７１、ＣＤ１８８によって選別された細胞の形態を提供する。細胞を、ＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔプロトコル下でインビトロ分化２５日目に選別した。選別後、細胞をさらに２日間培養した。

図２８は、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ１７１、ＣＤ１８８で選別した細胞のｍＲＮＡ発現を示す。細胞を、ＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔプロトコル下でインビトロ分化２５日目に選別した。選別後、細胞をさらに２日間培養した。

図２９は、インビトロ分化２５日目の単一ＣＤ４９ｅ弱選別細胞におけるＮＵＲＲ１：：ＧＦＰ集団の富化を示す。

図３０は、インビトロ分化２５日目のＣＤ４９ｅ弱ＣＤ１８４高二重選別細胞におけるＮＵＲＲ１：ＧＦＰ集団の富化を示す。

図３１は、ＴＨ^＋中脳ＤＡニューロンが、ＦＯＸＡ２及びＧＦＰと共発現したことを示し、図３０の富化されたＮＵＲＲ１：ＧＦＰ集団における中脳ＤＡニューロン同一性を意味している。

図３２は、インビトロ分化２５日目におけるＣＤ４９ｅ及びＣＤ１８４によって選別された細胞における中脳ＤＡマーカーｍＲＮＡ発現を示す。選別後、細胞をインビトロでさらに１５日間培養した。

図３３は、インビトロ分化２５日目のＣＤ４９ｅ及びＣＤ１８４によって選別された細胞における非中脳ＤＡ ｍＲＮＡ発現を示す。選別後、細胞をインビトロでさらに１０日間培養した。

図３４Ａ～図３４Ｄは、ＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔプロトコル下でインビトロ分化後の、本開示のＣＤマーカー（ＣＤ４９ｅ枯渇及びＣＤ１８４富化）で選別された移植細胞のインビボ生存を示す。図３４Ａは、選別されていない細胞と比較して、選別された細胞の堅固な生存及び移植片内のＴＨ^＋細胞の富化を示す。図３４Ｂは、移植の１ヶ月後のＳＯＸ２^＋前駆体及びＫＩ６７^＋分裂細胞の数の減少を示す。図３４Ｃは、図３４ＢにおけるＳＯＸ２^＋染色細胞の定量を示す。図３４Ｄは、図３４ＢにおけるＫｉ６７^＋細胞の定量を示す。 同上。 同上。

図３５Ａ～図３５Ｂは、ＷＮＴ－ｂｏｏｓｔ及びＷＮＴ－ｂｏｏｓｔ＋ＦＧＦ１８プロトコル下で分化させられる細胞のインビボ生存及びＥＮ１発現を示す。図３５Ａは、ＥＮ１を発現する細胞のパーセンテージを示す。図３５Ｂは、移植部位における線維を伴う線条体神経支配の出現を示す。 同上。

５．詳細な説明
本開示は、ｍＤＡ及びその前駆体を生成するための方法、そのような方法によって生成されるｍＤＡ及びその前駆体、そのような細胞を含む組成物、並びに神経障害を予防及び／又は処置するためのその使用を提供する。さらに、本開示は、新規な表面マーカーを使用して細胞集団からｍＤＡ及びその前駆体を単離する方法を提供する。

本開示は、少なくとも、本開示の方法によって生成された幹細胞由来ｍＤＡがＥＮ１の持続的発現を有する、例えば、ＥＮ１の発現がｍＤＡの発生及び成熟を通して維持されるという発見に基づく。

本開示の主題の非限定的な実施形態は、本明細書及び実施例によって説明される。

限定ではなく、開示の明確さの目的で、詳細な説明は以下のサブセクションに分割される。
５．１．定義、
５．２．幹細胞を分化する方法、
５．３．中脳ＤＡニューロン及びその前駆体を単離する方法、
５．４．中脳ＤＡニューロン及びその前駆体を含む組成物、
５．５．神経変性障害を処置する方法、及び
５．６．キット。

５．１．定義
本明細書で使用される用語は、一般に、本開示の文脈内及び各用語が使用される特定の文脈内で、当技術分野における通常の意味を有する。特定の用語は、本開示の組成物及び方法並びにそれらを作製及び使用する方法を説明する際に実施者に追加のガイダンスを提供するために、以下又は本明細書の他の箇所で論じられる。

「約（ａｂｏｕｔ）」又は「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容され得る誤差範囲内を意味し、これは値がどのように測定又は決定されるか、すなわち測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣例に従って、３標準偏差以内又は３標準偏差を超えることを意味することができる。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、例えば最大１０％、最大５％、又は最大１％の範囲を意味することができる。あるいは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、一桁以内、例えば、値の５倍以内、又は２倍以内を意味し得る。

本明細書で使用される場合、「シグナル伝達タンパク質」に関して「シグナル」という用語は、膜受容体タンパク質へのリガンド結合又はいくらかの他の刺激によって活性化されるか又は他の方法で影響を受けるタンパク質を指す。シグナル伝達タンパク質の例としては、ＳＭＡＤ、β－カテニンを含むウイングレス（Ｗｎｔ）複合タンパク質、ＮＯＴＣＨ、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦＰ）、アクチビン、Ｎｏｄａｌ、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）タンパク質、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。多くの細胞表面受容体又は内部受容体タンパク質の場合、リガンド－受容体相互作用は、細胞の応答に直接関連していない。リガンド活性化受容体は、細胞の挙動に対するリガンドの最終的な生理学的効果が生じる前に、最初に細胞内の他のタンパク質と相互作用することができる。多くの場合、いくつかの相互作用する細胞タンパク質の鎖の挙動は、受容体の活性化又は阻害後に変化する。受容体活性化によって誘導される一連の細胞変化全体は、シグナル伝達機構又はシグナル伝達経路と呼ばれる。

本明細書で使用される場合、「シグナル」という用語は、細胞の構造及び機能の変化を制御する内部因子及び外部因子を指す。それらは、本質的に化学的又は物理的であり得る。

本明細書で使用される場合、「リガンド」という用語は、受容体に結合する分子及びタンパク質、例えばトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＦＧＰ）、アクチビン、Ｎｏｄａｌ、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）などを指す。

本明細書で使用される「阻害剤」は、分子又は経路のシグナル伝達機能を妨げる（例えば、低減する、減少させる、抑制する、排除する、又はブロックする）化合物又は分子（例えば、小分子、ペプチド、ペプチド模倣体、天然化合物、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマー、又は抗体）を指す。阻害剤は、例えば、ＳＭＡＤシグナル伝達を直接接触させること、ＳＭＡＤ ｍＲＮＡを接触させること、ＳＭＡＤの立体構造変化を引き起こすこと、ＳＭＡＤタンパク質レベルを低下させること、又はシグナル伝達パートナー（例えば、本明細書に記載されるものを含む）とのＳＭＡＤ相互作用を妨害すること、及びＳＭＡＤ標的遺伝子（例えば、本明細書に記載されるもの）の発現に影響を及ぼすことを介して、指定されたタンパク質（シグナル伝達分子、指定されたシグナル伝達分子に関与する任意の分子、指定された関連分子、例えばグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β））（例えば、限定されないが、本明細書に記載されるシグナル伝達分子を含む）の任意の活性を変化させる任意の化合物又は分子であり得る。

阻害剤には、上流のシグナル伝達分子を生物学的活性、例えば、ＳＭＡＤ生物学的活性を間接的に調節する分子も含まれる（例えば、細胞外ドメイン内で、シグナル伝達分子及び効果の例には、骨形態形成タンパク質を隔離し、ＡＬＫ受容体１、２、３及び６の活性化を阻害し、したがって下流のＳＭＡＤ活性化を防止するノギンが含まれる。同じく、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎも同様にＳＭＡＤシグナル伝達の細胞外活性化因子を隔離する。膜貫通タンパク質であるＢａｍｂｉは、細胞外ＴＧＦβシグナル伝達分子を隔離するための偽性受容体としても作用する）。上流又は下流のタンパク質をブロックする抗体は、タンパク質シグナル伝達の細胞外活性化因子などを中和するための使用が企図される。阻害剤は、指定されたシグナル伝達分子の上流の分子に結合してそれに影響を及ぼし、次に指定された分子の阻害を引き起こすことによって誘導される阻害に加えて、競合阻害（別の既知の結合化合物の結合を排除又は低減するような様式で活性部位に結合する）及びアロステリック阻害（タンパク質の活性部位への化合物の結合を妨げる様式でタンパク質の立体構造を変化させる様式でタンパク質に結合する）に関して記載される。阻害剤は、シグナル伝達標的に実際に接触することにより、シグナル伝達標的又はシグナル伝達標的経路を阻害する「直接阻害剤」であり得る。

本明細書で使用される「活性化剤」は、分子又は経路のシグナル伝達機能、例えばＷｎｔシグナル伝達、ＳＨＨシグナル伝達などを増加、誘導、刺激、活性化、促進又は増強する化合物を指す。

本明細書で使用される場合、リガンドに関して「ＷＮＴ」又は「ウイングレス」という用語は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ及びＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体ファミリーの受容体などのＷＮＴ受容体と相互作用することができる分泌タンパク質（例えば、ヒトにおけるインテグレーション１）のグループを指す。本明細書で使用される場合、「ＷＮＴ又はウイングレスシグナル伝達経路」という用語は、β－カテニンを用いて又は用いずに媒介される、Ｗｎｔファミリーリガンド及びＷｎｔファミリー受容体、例えばＦｒｉｚｚｌｅｄ及びＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体から構成されるシグナル伝達経路を指す。特定の実施形態では、ＷＮＴシグナル伝達経路は、β－カテニン、例えばＷＮＴ／－カテニンによる媒介を含む。

本明細書で使用される場合、「誘導体」という用語は、同様のコア構造を有する化合物を指す。

本明細書で使用される場合、「細胞の集団」又は「細胞集団」という用語は、少なくとも２つの細胞のグループを指す。非限定的な例では、細胞集団は、少なくとも約１０個、少なくとも約１００個、少なくとも約２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、少なくとも約５００個、少なくとも約６００個、少なくとも約７００個、少なくとも約８００個、少なくとも約９００個、少なくとも約１０００個の細胞を含み得る。集団は、中脳ＤＡ前駆体の集団又は未分化幹細胞の集団などの１つの細胞型を含む純粋な集団であり得る。あるいは、集団は、１つより多くの細胞型、例えば混合細胞集団を含み得る。

本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、培養中に無期限に分裂し、特殊化した細胞を生じさせる能力を有する細胞を指す。

本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞」及び「ＥＳＣ」という用語は、移植前段階の胚に由来し、培養中に長期間分化することなく分裂することができ、３つの初代胚葉の細胞及び組織に発達することが知られている原始（未分化）細胞を指す。ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚に由来する胚性幹細胞を指す。本明細書で使用される場合、「ヒト胚性幹細胞」又は「ｈＥＳＣ」という用語は、培養中に長期間分化することなく分裂することができ、３つの初代胚葉の細胞及び組織に発達することが知られている、胚盤胞期までのおよびそれを含む初期段階のヒト胚に由来する多能性幹細胞の一種を指す。

本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞株」という用語は、最大数日、数ヶ月から数年にわたって分化なしで増殖を可能にするインビトロ条件下で培養された胚性幹細胞の集団を指す。

本明細書中で使用されるとき、「全能性」という用語は、身体のすべての細胞型に加えて、胎盤などの胚体外組織を構成するすべての細胞型を生じさせる能力を指す。

本明細書で使用される場合、「複能性」という用語は、身体の１つより多くの細胞型に発達する能力を指す。

本明細書中で使用されるとき、「多能性」という用語は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉を含む生物の３つの発生胚葉に発達する能力を指す。

本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」という用語は、特定の胚性遺伝子（例えば、限定されないが、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４導入遺伝子）（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＴａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ Ｃｅｌｌ １２６，６６３－６７６（２００６）を参照のこと）を体細胞に導入することによって形成される多能性幹細胞の一種を指す。

本明細書で使用される場合、「体細胞」という用語は、配偶子（卵又は精子）以外の体内の任意の細胞を指す。「成熟」細胞と呼ばれることもある。

本明細書で使用される場合、「体性（成熟）幹細胞」という用語は、多くの器官及び分化組織に見られる比較的まれな未分化細胞を指し、自己再生（実験室で）及び分化の両方の能力が限られている。

本明細書で使用される場合、「ニューロン」という用語は、神経系の主要な機能単位である神経細胞を指す。ニューロンは、細胞体及びその突起－軸索及び少なくとも１つの樹状突起からなる。ニューロンは、シナプスで神経伝達物質を放出することによって、他のニューロン又は細胞に情報を伝達する。

本明細書で使用される場合、「増殖」という用語は、細胞数の増加を指す。

本明細書で使用される場合、「未分化」という用語は、特殊な細胞型にまだ発達していない細胞を指す。

本明細書で使用される場合、「分化」という用語は、特殊化されていない胚性細胞が、神経、心臓、肝臓、又は筋肉細胞などの特殊化された細胞の特徴を獲得するプロセスを指す。分化は、通常、細胞表面に埋め込まれたタンパク質を含むシグナル伝達経路を介して、細胞の遺伝子と細胞外の物理的及び化学的条件との相互作用によって制御される。

本明細書で使用される場合、「定方向分化」という用語は、神経、神経堤、頭蓋プラコード及び非神経外胚葉前駆体などの特定の（例えば、望ましい）細胞型への分化を誘導するための幹細胞培養条件の操作を指す。幹細胞に関して、「定方向分化」は、幹細胞の多能性状態からより成熟した又は特殊化した細胞運命への移行を促進するための小分子、成長因子タンパク質、及び他の成長条件の使用を指す。

本明細書で使用される場合、細胞に関して「分化を誘導する」という用語は、デフォルトの細胞型（遺伝子型及び／又は表現型）を非デフォルトの細胞型（遺伝子型及び／又は表現型）に変更することを指す。したがって、「幹細胞において分化を誘導する」とは、遺伝子型（例えば、マイクロアレイなどの遺伝子分析によって決定される遺伝子発現の変化）及び／又は表現型（例えば、ＥＮ１、ＯＴＸ２、ＴＨ、ＮＵＲＲ１、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＰＩＴＸ３、ＬＭＯ３、ＳＮＣＡ、ＡＤＣＡＰ１、ＣＨＲＮＡ４及びＧＩＲＫ２などのｍＤＡ又はその前駆体のタンパク質マーカーの発現の変化）などの幹細胞とは異なる特徴を有する子孫細胞に分裂するように、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）を誘導することを指す。

本明細書で使用される場合、「細胞培養」という用語は、研究又は医学的処置のための人工培地中でのインビトロでの細胞の成長を指す。

本明細書で使用される場合、「培養培地」という用語は、例えば、ペトリ皿、マルチウェルプレートなどの培養容器内の細胞を覆い、細胞に栄養を与えて支持するための栄養素を含む液体を指す。培養培地はまた、細胞に所望の変化を生じさせるために添加される成長因子を含み得る。

本明細書で使用される場合、１つ又は複数の細胞を化合物（例えば、少なくとも１つの阻害剤、活性化剤及び／又は誘導剤）と「接触させる」という用語は、１つ又は複数の細胞が化合物にアクセスすることを可能にする位置に化合物を提供することを指す。接触は、任意の適切な方法を使用して達成することができる。例えば、接触は、所望の濃度を達成するために、例えば細胞培養物の状況で、濃縮形態の化合物を細胞又は細胞集団に添加することによって達成することができる。接触はまた、配合された培養培地の構成成分として化合物を含めることによって達成され得る。

本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、人工環境、及び人工環境内で起こるプロセス又は反応を指す。インビトロ環境は、試験管及び細胞培養物を例示したが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、自然環境（例えば、動物又は細胞）、並びに胚発生、細胞分化、神経管形成などの自然環境内で起こるプロセス又は反応を指す。

本明細書で使用される場合、遺伝子又はタンパク質に関して「発現する」という用語は、マイクロアレイアッセイ、抗体染色アッセイなどのアッセイを使用して観察することができるｍＲＮＡ又はタンパク質を作製することを指す。

本明細書で使用される場合、「マーカー」又は「細胞マーカー」という用語は、特定の細胞又は細胞型を同定する遺伝子又はタンパク質を指す。細胞のマーカーは、１つのマーカーに限定されなくてもよく、マーカーは、指定されたマーカーのグループが、細胞又は細胞型を別の細胞又は細胞型と識別し得るようなマーカーの「パターン」を指し得る。

本明細書で使用される場合、本明細書に開示される任意の細胞を参照して行う場合の「に由来する」又は「から確立された」又は「から分化した」という用語は、任意の操作、例えば限定されないが、単一細胞単離、インビトロでの培養、例えばタンパク質、化学物質、放射線、ウイルスによる感染、ＤＮＡ配列、例えばモルフォゲンによるトランスフェクションなどを用いた処理及び／又は変異誘発、培養された親細胞に含まれる任意の細胞の選択（連続培養などによる）を使用して、細胞株、組織（解離した胚など）、又は体液中の（例えば、単離された、精製された、など）最終的な親細胞から得られた細胞を指す。誘導された細胞は、成長因子に対する応答、サイトカイン、サイトカイン処置の選択された進行、接着性、接着性の欠如、選別手順などによって混合集団から選択され得る。

本明細書における「個体」又は「対象」は、脊椎動物、例えばヒト又は非ヒト動物、例えば哺乳動物である。哺乳動物には、ヒト、非ヒト霊長類、農場動物、スポーツ動物、げっ歯類及びペットが含まれるが、これらに限定されない。非ヒト動物対象の非限定的な例としては、マウス、ラット、ハムスター及びモルモットなどのげっ歯類；ウサギ；イヌ；ネコ；ヒツジ；ブタ；ヤギ；ウシ；ウマ；並びに類人猿及びサルなどの非ヒト霊長類が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「疾患」という用語は、細胞、組織、又は器官の正常な機能を損なうか又は妨げる任意の症状又は障害を指す。

本明細書で使用される場合、「処置する」又は「処置」という用語は、処置されている個体又は細胞の疾患経過を変化させる試みにおける臨床的介入を指し、予防のため又は臨床病理の過程のいずれかで実行することができる。処置の治療効果には、限定されないが、疾患の発生又は再発の予防、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、疾患進行速度の低下、疾患状態の寛解又は緩和、並びに寛解又は予後の改善が含まれる。疾患又は障害の進行を予防することによって、処置は、罹患した若しくは診断された対象又は障害を有すると疑われる対象における障害による悪化を予防することができるが、処置はまた、障害のリスクがあるか又は障害を有すると疑われる対象における障害又は障害の症状の発症を予防することができる。

本明細書で使用される場合、本明細書に開示される任意の表面マーカーに関して使用される場合の「陰性」、「弱い」又は「－」という用語は、表面マーカー（例えば、ＣＤ４９ｅ）が、細胞が選択又は選別される細胞の集団における表面マーカーの平均発現と比較して、検出可能なレベルで発現されないか、又は細胞において低下したレベルで発現されることを指す。本明細書で使用される場合、本明細書に開示される任意の表面マーカーに関して使用される場合の「高い」、「強い」、「＋」又は「陽性」という用語は、表面マーカー（例えば、ＣＤ１８４）が、細胞の集団における表面マーカーの平均発現と比較して、検出可能なレベルで発現されるか、又は増加したレベルで発現されることを指す。

特定の実施形態では、細胞は、当業者に知られているように、染色強度の容易に識別可能な差に基づいて、それらの表面マーカー発現レベルに従って区別される。特定の実施形態では、細胞を表面マーカー「弱」、「陰性」又は「－」細胞として指定するためのカットオフは、すべての細胞について観察される染色強度分布（例えば、蛍光強度分布）に関して設定することができ、染色強度の約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％又は約５％を下回る細胞を、表面マーカー「弱」、「陰性」又は「－」細胞として指定することができる。特定の実施形態では、細胞を表面マーカー「強」、「高」、「＋」又は「陽性」細胞として指定するためのカットオフは、すべての細胞について観察される染色強度分布（例えば、蛍光強度分布）に関して設定することができ、染色強度の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又は約９５％を超える細胞を、表面マーカー「強」、「高」、「＋」又は「陽性」細胞として指定することができる。特定の実施形態では、表面マーカー染色の頻度分布は、すべての細胞について得られ、集団曲線は、より高い染色及びより低い染色集団、並びにそれぞれの集団分布の統計分析を考慮して最も統計的に属する可能性が高い集団に割り当てられた細胞に適合する。

５．２．幹細胞を分化させる方法
本開示は、幹細胞の分化を誘導するためのインビトロ方法であって、幹細胞を、少なくとも１つのＳｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達阻害剤（「ＳＭＡＤ阻害剤」と呼ばれる）、少なくとも１つのソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤（「ＳＨＨ活性化剤」と呼ばれる）、及び少なくとも１つのウイングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達活性化剤（「Ｗｎｔ活性化剤」と呼ばれる）と接触させることと、細胞を少なくとも１つの線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達活性化剤（「ＦＧＦ活性化剤」と呼ばれる）と接触させて、ｍＤＡ又はｍＤＡ前駆体を示す少なくとも１つのマーカーを発現する分化細胞を含む細胞集団を得ることと、を含む方法を提供する。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤は、中脳発達を促進することができる。特定の実施形態では、少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤は、ＦＧＦ８ａ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ２及びＦＧＦ４から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤は、ＦＧＦ８ａ、ＦＧＦ１７及びＦＧＦ１８から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤は、ＦＧＦ１８を含む。

特定の実施形態では、細胞と少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤との初期接触が、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤との初期接触から少なくとも約５日後である。特定の実施形態では、細胞の少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤への初期曝露は、幹細胞の少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤への初期曝露から少なくとも約１０日間である。特定の実施形態では、ＦＧＦ活性化剤は、ＦＧＦ８ａ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ２及びＦＧＦ４から選択される。少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤への細胞の曝露は、分化細胞によるＥＮ１の発現を延長する。

特定の実施形態では、ｍＤＡ又はｍＤＡ前駆体を示す少なくとも１つのマーカーは、ＥＮ１、ＦＯＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ａ、ＯＴＸ２、ＮＵＲＲ１、ＴＨ、ＰＩＴＸ３、ＬＭＯ３、ＳＮＣＡ、ＡＤＣＡＰ１、ＣＨＲＮＡ４、及びＧＩＲＫ２から選択される。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤の濃度は、細胞への曝露中に増加する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤の濃度の増加は、幹細胞の少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤への初期曝露から約４日で開始される。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤の濃度は、約３００％～約１０００％増加する。特定の実施形態では、細胞は、少なくとも約７日間、増加した濃度を有する少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤に曝露される。特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなるＷｎｔ活性化剤が添加されて、Ｗｎｔ活性化剤（複数可）の全体濃度が増加する。

特定の実施形態では、方法は、細胞を中脳ＤＡ系譜特異的活性化剤及び阻害剤、例えばＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ｃＡＭＰ、ＴＧＦβ、アスコルビン酸（ＡＡ）及び／又はＤＡＰＴと接触させて、ｍＤＡ前駆体のｍＤＡへの分化を誘導することをさらに含む。

５．２．１．幹細胞
本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導してｍＤＡ及びその前駆体を産生するためのインビトロ方法を提供する。特定の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞である。特定の実施形態では、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及びそれらの組合せから選択される。特定の実施形態では、幹細胞は複能性幹細胞である。本開示の方法と共に使用することができる幹細胞の非限定的な例としては、ヒト、非ヒト霊長類又はげっ歯類の非胚性幹細胞、胚性幹細胞、人工非胚性多能性細胞及び操作多能性細胞が挙げられる。特定の実施形態では、幹細胞は、ヒト幹細胞である。ヒト幹細胞の非限定的な例としては、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、ヒト単為生殖幹細胞、始原生殖細胞様多能性幹細胞、エピブラスト幹細胞、Ｆクラス多能性幹細胞、体性幹細胞、がん幹細胞、又は系譜特異的分化が可能な任意の他の細胞が挙げられる。特定の実施形態では、幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である。特定の実施形態では、幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である。

特定の実施形態では、幹細胞又はその子孫細胞は、導入された異種核酸を含み、核酸は、所望の核酸又はタンパク質産物をコードするか、又は情報価値を有し得る（例えば、参照によりその全体が組み込まれる米国特許第６，３１２，９１１号を参照のこと）。タンパク質産物の非限定的な例としては、インビボイメージング研究によって検出可能なマーカー、例えば受容体又は他の細胞膜タンパク質が挙げられる。マーカーの非限定的な例としては、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、アズライト、ｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２）、及び黄色蛍光タンパク質誘導体（ＹＦＰ、シトリン、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＥＹＦＰ））、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）、酵素（例えば、オキシダーゼ及びペルオキシダーゼ）、及び抗原性分子が挙げられる。本明細書で使用される場合、「レポーター遺伝子」又は「レポーター構築物」という用語は、着色タンパク質、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質又はβ－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子）などの酵素などの、容易に検出可能又は容易にアッセイ可能なタンパク質をコードする核酸を含む遺伝子構築物を指す。特定の実施形態では、レポーターは、成熟前の有糸分裂後の中脳ＤＡニューロンマーカー遺伝子、例えば、ＮＵＲＲ１の組換えプロモーターによって駆動され得る。

５．２．２．ＳＭＡＤ阻害剤
ＳＭＡＤ阻害剤の非限定的な例としては、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌシグナル伝達阻害剤（「ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤」と呼ばれる）、及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤が挙げられる。特定の実施形態では、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤は、ＴＧＦβ、ＢＭＰ、Ｎｏｄａｌ、及びアクチビンを含むリガンドを中和することができ、かつ／又は受容体及び下流エフェクターをブロックすることによってそれらのシグナル経路を遮断することができる。ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤の非限定的な例としては、国際公開第２０１０／０９６４９６号、国際公開第２０１１／１４９７６２号、国際公開第２０１３／０６７３６２号、国際公開第２０１４／１７６６０６号、国際公開第２０１５／０７７６４８号、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９ Ｍａｒ；２７（３）：２７５－８０、Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１ Ｎｏｖ ６；４８０（７３７８）：５４７－５１、及びＣｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２ Ｊｕｌ １；３０（７）：７１５－２０（２０１２）に記載されており、これらはすべて、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、少なくとも１つのＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤が、ＡＬＫ５の阻害剤、ＡＬＫ４の阻害剤、ＡＬＫ７の阻害剤、及びそれらの組合せから選択される。特定の実施形態では、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤は、ＡＬＫ５の阻害剤を含む。特定の実施形態では、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、その誘導体及びそれらの混合物から選択される小分子である。「ＳＢ４３１５４２」は、ＣＡＳ ３０１８３６－４１－９の番号、Ｃ_２２Ｈ_１８Ｎ_４Ｏ_３の分子式、及び４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミドの名前を有する分子を指し、例えば、以下の構造を参照されたい。

特定の実施形態では、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２を含む。特定の実施形態では、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２の誘導体を含む。特定の実施形態では、ＳＢ４３１５４２の誘導体は、Ａ８３－０１である。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤は、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤（「ＢＭＰ阻害剤」と呼ばれる）を含む。ＢＭＰ阻害剤の非限定的な例としては、国際公開第２０１１／１４９７６２号、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９ Ｍａｒ；２７（３）：２７５－８０、Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１ Ｎｏｖ ６；４８０（７３７８）：５４７－５１、及びＣｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２ Ｊｕｌ １；３０（７）：７１５－２０に記載されており、これらはすべて参照によりその全体が組み込まれる。特定の実施形態では、ＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９、ノギン、ドルソモルフィン、それらの誘導体及びそれらの混合物から選択される小分子である。「ＬＤＮ１９３１８９」は、以下の式を有するＣ_２５Ｈ_２２Ｎ_６の化学式を有する小分子ＤＭ－３１８９、ＩＵＰＡＣ名４－（６－（４－（ピペラジン－１－イル）フェニル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル）キノリンを指す。

ＬＤＮ１９３１８９は、ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤として機能することができる。ＬＤＮ１９３１８９はまた、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３及びＡＬＫ６、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）の非常に強力な小分子阻害剤であり、Ｉ型ＴＧＦβ受容体のＡＬＫ１及びＡＬＫ３ファミリーのメンバーのシグナル伝達を阻害し、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７及びアクチビンサイトカインシグナルを含む複数の生物学的シグナルの伝達の阻害、並びにその後のＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ５及びＳｍａｄ８のＳＭＡＤリン酸化をもたらす（Ｙｕら（２００８）、Ｎａｔ Ｍｅｄ １４：１３６３－１３６９；Ｃｕｎｙら、（２００８）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１８：４３８８－４３９２、参照により本明細書に組み込まれる）。

特定の実施形態では、ＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９を含む。特定の実施形態では、ＢＭＰ阻害剤は、ノギンを含む。

特定の実施形態では、幹細胞は、１つのＳＭＡＤ阻害剤、例えば、１つのＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤に曝露される。特定の実施形態では、１つのＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２又はＡ８３－０１である。特定の実施形態では、幹細胞は、２つのＳＭＡＤ阻害剤に曝露される。特定の実施形態では、２つのＳＭＡＤ阻害剤は、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤及びＢＭＰ阻害剤である。特定の実施形態では、幹細胞は、ＳＢ４３１５４２又はＡ８３－０１、及びＬＤＮ１９３１８９又はノギンに曝露される。特定の実施形態では、幹細胞は、ＳＢ４３１５４２及びＬＤＮ１９３１８９に曝露される。

特定の実施形態では、幹細胞を、少なくとも約５日間、又は少なくとも約１０日間、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤に曝露するか、又は少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤と接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を、最大約５日間又は最大約１０日間、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤と接触させるか、又は少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、幹細胞を、約５日間～約１０日間、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤と接触させるか又は少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤に、曝露する。特定の実施形態では、幹細胞を、約５日間、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤と接触させるか、又は少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、幹細胞を、７日間、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤と接触させるか又は少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、細胞を、０日目～６日目まで、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤と接触させるか又は少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤を、０日目～６日目まで、幹細胞を含む細胞培養培地に毎日又は１日おきに添加する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤を、０日目～６日目まで、幹細胞を含む細胞培養培地に毎日（ｅｖｅｒｙ ｄａｙ）（毎日（ｄａｉｌｙ））添加する。

特定の実施形態では、細胞を、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤と接触させるか又はＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、細胞と接触させるか又は細胞に曝露するＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤の濃度は、約１μＭ～約２０μＭ、約１μＭ～約１０μＭ、約１μＭ～約１５μＭ、約１０μＭ～約１５μＭ、約５μＭ～約１０μＭ、約５μＭ～約１５μＭ、約５μＭ～約２０μＭ、又は約１５μＭ～約２０μＭである。特定の実施形態では、細胞と接触させるか又は細胞に曝露するＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤の濃度は、約１μＭ～約１０μＭである。特定の実施形態では、細胞と接触させるか又は細胞に曝露するＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤の濃度は、約５μＭである。約１０μＭ。特定の実施形態では、細胞と接触させるか又は細胞に曝露するＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤の濃度は、約１０μＭである。特定の実施形態では、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２又はその誘導体（例えば、Ａ８３－０１）を含む。特定の実施形態では、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２を含む。

特定の実施形態では、細胞を、ＢＭＰ阻害剤と接触させるか又はＢＭＰ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、細胞と接触させるか又は細胞に曝露するＢＭＰ阻害剤の濃度は、約５０ｎＭ～約５００ｎＭ、又は約１００ｎＭ～約５００ｎＭ、又は約２００ｎＭ～約５００ｎＭ、又は約２００～約３００ｎＭ、又は約２００ｎＭ～約４００ｎＭ、又は約１００ｎＭ～約２５０ｎＭ、又は約１００ｎＭ～約２５０ｎＭ、又は約２００ｎＭ～約２５０ｎＭ、又は約２５０ｎＭ～約３００ｎＭである。特定の実施形態では、細胞と接触させるか又は細胞に曝露するＢＭＰ阻害剤の濃度は、約２００ｎＭ～約３００ｍＭである。特定の実施形態では、細胞と接触させるか又は細胞に曝露するＢＭＰ阻害剤の濃度は、約１５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約３００ｎＭ又は約３５０ｎＭである。特定の実施形態では、細胞と接触させるか又は細胞に曝露するＢＭＰ阻害剤の濃度は、約２５０ｎＭである。特定の実施形態では、ＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９又はその誘導体を含む。特定の実施形態では、ＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９を含む。

特定の実施形態では、細胞を、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤及びＢＭＰ阻害剤と同時に接触させるか、又はＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤及びＢＭＰ阻害剤に同時に曝露する。特定の実施形態では、幹細胞を、７日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤及びＢＭＰ阻害剤と接触させるか又はＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤及びＢＭＰ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、細胞を、０日目～６日目まで、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤及びＢＭＰ阻害剤と接触させるか又はＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤及びＢＭＰ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤及びＢＭＰ阻害剤を、０日目～６日目まで、幹細胞を含む細胞培養培地に毎日又は１日おきに添加する。特定の実施形態では、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤及びＢＭＰ阻害剤を、０日目～６日目まで、幹細胞を含む細胞培養培地に毎日（毎日）添加する。

５．２．３．Ｗｎｔ活性化剤
特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤は、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のためにＧＳＫ３βを低下させる。したがって、特定の実施形態では、Ｗｎｔ活性化剤は、ＧＳＫ３β阻害剤である。ＧＳＫ３Ｐ阻害剤は、ＷＮＴシグナル伝達経路を活性化することができ、例えば、Ｃａｄｉｇａｎら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２００６；１１９：３９５－４０２；Ｋｉｋｕｃｈｉら、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．２００７；１９：６５９－６７１を参照のこと。これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される場合、「グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β阻害剤」又は「ＧＳＫ３β阻害剤」という用語は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β酵素を阻害する化合物を指し、例えば、Ｄｏｂｌｅら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２００３；１１６：１１７５－１１８６を参照のこと。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

Ｗｎｔ活性化剤又はＧＳＫ３β阻害剤の非限定的な例としては、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ５ａ、ＢＩＯ（（３Ｅ）－６－ブロモ－３－［３－（ヒドロキシアミノ）インドール－２－イリデン］－１Ｈ－インドール－２－オン）、ＣＨＩＲ９８０１４、リチウム、３Ｆ８、国際公開第２０１１／１４９７６２号、国際公開第１３／０６７３６２号、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２ Ｊｕｌ １；３０（７）：７１５－２０、Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１ Ｎｏｖ ６；４８０（７３７８）：５４７－５１、及びＣａｌｄｅｒら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１５ Ａｕｇ １９；３５（３３）：１１４６２－８１に記載されたものが挙げられ、これらはすべて参照によりその全体が組み込まれる。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ５ａ、ＢＩＯ、ＣＨＩＲ９８０１４、リチウム、３Ｆ８、それらの誘導体、及びそれらの混合物から選択される小分子である。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１又はその誘導体を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１を含む。「ＣＨＩＲ９９０２１」（「アミノピリミジン」又は「３－［３－（２－カルボキシエチル）－４－メチルピロール－２－メチリデニル］－２－インドリノン」としても知られている）は、以下の式を有するＩＵＰＡＣ名６－（２－（４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）ピリミジン－２－イルアミノ）エチルアミノ）ニコチノニトリルを指す。

ＣＨＩＲ９９０２１は、高度に選択的であり、一群の関連キナーゼ及び非関連キナーゼに対してほぼ１０００倍の選択性を示し、ヒトＧＳＫ３βに対してＩＣ５０＝６．７ｎＭ、及びげっ歯類ＧＳＫ３βホモログに対してナノモル濃度のＩＣ５０値を有する。

特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約５日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１５日間、又は少なくとも約２０日間、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤と接触させるか又は少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤に曝露する。特定の実施形態では、細胞を、最大約５日間、最大約１０日間、最大約１５日間、又は最大約２０日間、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤と接触させるか又は少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤に曝露する。特定の実施形態では、細胞を、約５日間～約２０日間、約５日間～約１５日間、約１０日間～約２０日間、約５日間～約１５日間、又は約１０日間～約１５日間、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤と接触させるか又は少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤に曝露する。特定の実施形態では、細胞を、約１０日間～約１５日間、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤と約１０日間接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を、少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤と１２日間接触させる。特定の実施形態では、細胞を、０日目～１１日目まで、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤と接触させる。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤を、０日目～１１日目まで、細胞を含む細胞培養培地に毎日又は１日おきに添加する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤を、０日目～１１日目まで、細胞を含む細胞培養培地に毎日（毎日）添加する。

特定の実施形態では、少なくともＷｎｔ活性化剤の濃度は、細胞への曝露中に増加する（「Ｗｎｔ Ｂｏｏｓｔ」とも呼ばれる）。特定の実施形態では、増加又はＷｎｔ Ｂｏｏｓｔは、細胞の少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤への初期曝露から少なくとも約２日、少なくとも約４日、又は少なくとも約５日で開始される。特定の実施形態では、増加又はＷｎｔ Ｂｏｏｓｔは、細胞の少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤への初期曝露から約４日で開始される。

特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約５日間、又は少なくとも約１０日間、増加した濃度の少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤と接触させるか又はそれに曝露する。特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約５日間、増加した濃度の少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤と接触させるか又はそれに曝露する。特定の実施形態では、細胞を、最大約５日間、最大約１０日間、又は最大約１５日間、増加した濃度の少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を、最大約１０日間、増加した濃度の少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤と接触させる。

特定の実施形態では、細胞を、約５日間～約１５日間、又は約５日間～約１０日間、又は約１０日間～約１５日間、増加した濃度の少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤と接触させるか又はそれに曝露する。特定の実施形態では、細胞を、約５日間～約１０日間、増加した濃度の少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤と接触させるか又はそれに曝露する。特定の実施形態では、細胞を、約５日間、約１０日間、又は約１５日間、増加した濃度の少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤と接触させるか又はそれに曝露する。特定の実施形態では、細胞を、約５日間、増加した濃度の少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤と接触させるか又はそれに曝露する。特定の実施形態では、細胞を、６日間、増加した濃度の少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤と接触させるか又はそれに曝露する。特定の実施形態では、細胞を、４日目～９日目まで、増加した濃度の少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤と接触させるか又はそれに曝露する。特定の実施形態では、細胞を、約１０日間、増加した濃度の少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤と接触させるか又はそれに曝露する。特定の実施形態では、細胞を、８日間、増加した濃度の少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤と接触させるか又はそれに曝露する。特定の実施形態では、細胞を、４日目～１１日目まで、増加した濃度の少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤と接触させるか又はそれに曝露する。

特定の実施形態では、Ｗｎｔ Ｂｏｏｓｔの前に細胞と接触させるか又は細胞に曝露する少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤の初期濃度は、約５μＭ未満、約３μＭ未満、又は約１μＭ未満であり、これらには、約０．０１μＭ～約５μＭ、約０．０１μＭ～約３μＭ、約０．０５μＭ～約３μＭ、約０．１μＭ～約３μＭ、約０．５μＭ～約３μＭ、約０．５μＭ～約２μＭ、又は約０．５μＭ～約１μＭが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、Ｗｎｔ Ｂｏｏｓｔの前に細胞と接触させるか又は細胞に曝露する少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤の初期濃度は、約１μＭ未満、例えば約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、又は約１μＭである。特定の実施形態では、Ｗｎｔブースト（Ｗｎｔ ｂｏｏｓｔ）の前に細胞と接触させるか又は細胞に曝露する少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤の初期濃度は、約０．５μＭである。特定の実施形態では、Ｗｎｔブーストの前に細胞と接触させるか又は細胞に曝露する少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤の初期濃度は、約０．７μＭである。

特定の実施形態では、Ｗｎｔ Ｂｏｏｓｔ後の少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤の増加した濃度は、約３μＭ又はそれを超える、約５μＭ又はそれを超える、約１０μＭ又はそれを超える、約１５μＭ又はそれを超える、又は約２０μＭ又はそれを超える。特定の実施形態では、Ｗｎｔ Ｂｏｏｓｔ後の少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤の増加した濃度は、約３μＭ～約１５μＭ、約３μＭ～約１０μＭ、又は約５μＭ～約１０μＭである。特定の実施形態では、Ｗｎｔ Ｂｏｏｓｔ後の少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤の増加した濃度は、約３μＭ、約３．５μＭ、約４μＭ、約４．５μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約８．５μＭ、約９μＭ、約９．５μＭ、又は約１０μＭである。特定の実施形態では、Ｗｎｔ Ｂｏｏｓｔ後の少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤の増加した濃度は、約３μＭである。特定の実施形態では、Ｗｎｔ ｂｏｏｓｔ後の少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤の増加した濃度は、約７μＭである。特定の実施形態では、Ｗｎｔ Ｂｏｏｓｔ後の少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤の増加した濃度は、約７．５μＭである。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤の濃度は、細胞と接触させるか又は細胞に曝露する初期濃度から約５０％～約２０００％、又は約１００％～約１５００％、又は約１５０％～約１５００％、又は約２００％～約１５００％、又は約２５０％～約１５００％、又は約３００％～約１５００％、又は約３００％～約１０００％、又は約３００％～約４００％、又は約５００％～約１０００％、又は約８００％～約１０００％、又は約９００％～約１０００％、又は約９５０％～約１０００増加する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤の濃度は、細胞と接触させるか又は細胞に曝露する初期濃度から約３００％～約１０００％増加する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤の濃度は、細胞と接触させるか又は細胞に曝露する初期濃度から約３００％～約４００％増加する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤の濃度は、細胞と接触させるか又は細胞に曝露する初期濃度から約９００％～約１０００％増加する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤の濃度は、細胞と接触させるか又は細胞に曝露する初期濃度から約３００％、約３５０％、約４００％、約４５０％、約５００％、約５５０％、約６００％、６５０％、約７００％、約７５０％、約８００％、約８５０％、約９００％、約９５０％、約１０００％、約１０５０％、又は約１１００％増加する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤の濃度は、細胞と接触させるか又は細胞に曝露する初期濃度から約３００％増加する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤の濃度は、細胞と接触させるか又は細胞に曝露する初期濃度から約３５０％増加する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤の濃度は、細胞と接触させるか又は細胞に曝露する初期濃度から約９５０％増加する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤の濃度は、細胞と接触させるか又は細胞に曝露する初期濃度から約１０００％増加する。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤は、ＧＳＫ３β阻害剤を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１又はその誘導体を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１を含む。

５．２．４．ＳＨＨ活性化剤
本明細書で使用される場合、「ソニックヘッジホッグ」、「ＳＨＨ」又は「Ｓｈｈ」という用語は、ヘッジホッグと呼ばれる哺乳動物シグナル伝達経路ファミリーの少なくとも３つのタンパク質のうちの１つであるタンパク質を指し、別のものはデザートヘッジホッグ（ＤＨＨ）であり、一方（ｗｉｌｅ）、第３のものはインディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）である。ＳＨＨは、膜貫通分子Ｐａｔｃｈｅｄ（ＰＴＣ）及びＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（ＳＭＯ）と相互作用することによって、少なくとも２つの膜貫通タンパク質と相互作用する。ＳＨＨは、典型的には、ＰＴＣに結合し、次いで、ＳＭＯをシグナル伝達物質として活性化させる。ＳＨＨの非存在下では、ＰＴＣは典型的にはＳＭＯを阻害し、ＳＭＯは次に転写リプレッサーを活性化するので、特定の遺伝子の転写は起こらない。ＳＨＨが存在し、ＰＴＣに結合する場合、ＰＴＣはＳＭＯの機能を妨げることができない。ＳＭＯが阻害されない場合、ある特定のタンパク質は、核に入り、ある特定の遺伝子が活性化されることを可能にする転写因子として作用することができる（Ｇｉｌｂｅｒｔ、２０００ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照のこと）。特定の実施形態では、ＳＨＨ活性化剤は、ＰＴＣ又はＳＭＯに結合することができる分子又は化合物を含む、ＳＨＨシグナル伝達経路を活性化することができる任意の分子又は化合物を指す。特定の実施形態では、ＳＨＨ活性化剤は、ＰＣＴに結合する分子、ＳＭＯに結合する分子、及びそれらの組合せから選択される。ＳＨＨ活性化剤の非限定的な例としては、国際公開第１０／０９６４９６号、国際公開第１３／０６７３６２号、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９ Ｍａｒ；２７（３）：２７５－８０、及びＫｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１ Ｎｏｖ ６；４８０（７３７８）：５４７－５１に記載されたものが挙げられる。特定の実施形態では、ＳＨＨ活性化剤は、ＳＨＨタンパク質、ＳＭＯアゴニスト、又はそれらの組合せを含む。特定の実施形態では、ＳＨＨタンパク質は、組換えＳＨＨ、精製ＳＨＨ、又はそれらの組合せを含む。特定の実施形態では、組換えＳＨＨは、マウスＳＨＨのＮ末端断片と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９９％同一である組換えタンパク質を含む。特定の実施形態では、組換えＳＨＨは、ＳＨＨ Ｃ２５ＩＩを含む。特定の実施形態では、ＳＭＯアゴニストは、パルモルファミンを含む。

特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約５日間、又は少なくとも約１０日間、少なくとも１つのＳＨＨ活性化剤と接触させるか又は少なくとも１つのＳＨＨ活性化剤に曝露する。特定の実施形態では、細胞を、最大約５日間又は最大約１０日間、少なくとも１つのＳＨＨ活性化剤と接触させるか又は少なくとも１つのＳＨＨ活性化剤に曝露する。特定の実施形態では、細胞を、約５日間～約１０日間、少なくとも１つのＳＨＨ活性化剤と接触させるか又は少なくとも１つのＳＨＨ活性化剤に曝露する。特定の実施形態では、細胞を、少なくとも１つのＳＨＨ活性化剤と約５日間接触させるか又は少なくとも１つのＳＨＨ活性化剤に約５日間曝露する。特定の実施形態では、細胞を、７日間、少なくとも１つのＳＨＨ活性化剤と接触させるか又は少なくとも１つのＳＨＨ活性化剤に曝露する。特定の実施形態では、細胞を、０日目～６日目まで、少なくとも１つのＳＨＨ活性化剤と接触させるか又は少なくとも１つのＳＨＨ活性化剤に曝露する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＨＨ活性化剤を、０日目～６日目まで、細胞を含む細胞培養培地に毎日又は１日おきに添加する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＨＨ活性化剤を、０日目～６日目まで、細胞を含む細胞培養培地に毎日（毎日）添加する。

特定の実施形態では、細胞と接触させるか、又は細胞に曝露する少なくとも１つのＳＨＨ活性化剤の濃度は、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、又は約５００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、細胞と接触させるか又は細胞に曝露する少なくとも１つのＳＨＨ活性化剤の濃度は、約４００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、細胞と接触させるか又は細胞に曝露する少なくとも１つのＳＨＨ活性化剤の濃度は、約４００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ、又は約６００ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、細胞と接触させるか、又は細胞に曝露する少なくとも１つのＳＨＨ活性化剤の濃度は、約５００ｎｇ／ｍＬである。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化剤は、ＳＨＨ Ｃ２５ＩＩを含む。

５．２．５．ＦＧＦ活性化剤
ＦＧＦファミリーには、受容体チロシンキナーゼにシグナル伝達する分泌シグナル伝達タンパク質（分泌ＦＧＦ）が含まれる。系統発生分析は、２２個のＦｇｆ遺伝子が、それぞれが２～４つのメンバーを含む７つのサブファミリーに整理され得ることを示唆している。分岐の長さは、各遺伝子間の進化的距離に比例する。

特定の実施形態では、ＦＧＦ活性化剤は、ＦＧＦ８ａ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４及びそれらの誘導体から選択される。特定の実施形態では、ＦＧＦ活性化剤は、ＦＧＦ８ａ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、及びそれらの誘導体から選択される。特定の実施形態では、ＦＧＦ活性化剤は、ＦＧＦ８ａ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８から選択される。

ＦＧＦ８サブファミリーは、ＦＧＦ８ａ、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ１７及びＦＧＦ１８からなる。脊椎動物の中脳及び小脳の初期のパターン形成は、ＦＧＦ８ａ、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ１７及びＦＧＦ１８を産生する中脳／後脳の形成体によって調節される。ＦＧＦ８ｂは、ＦＧＦ８ａ、ＦＧＦ１７及びＦＧＦ１８とは異なって機能することが示されている（Ｌｉｕら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２００３ Ｄｅｃ；１３０（２５）：６１７５－８５）。ＦＧＦ８ｂは、ｒ１遺伝子Ｇｂｘ２を誘導し、経路阻害剤Ｓｐｒｙ１／２を強く活性化し、中脳遺伝子Ｏｔｘ２を抑制することができる唯一のタンパク質である（Ｌｉｕ ２００３）。さらに、ＦＧＦ８ｂは、誘導されたＧｂｘ２ドメインと中脳の残りのＯｔｘ２領域との間の接合部に沿って形成体を伸長させ、それは、小脳の発生と相関する（Ｌｉｕ ２００３）。対照的に、ＦＧＦ８ａ、ＦＧＦ１７及びＦＧＦ１８は、中脳の拡大及び中脳遺伝子発現の上方調節を引き起こす（Ｌｉｕ ２００３）。

特定の実施形態では、ＦＧＦ活性化剤は、中脳の拡大を引き起こし、中脳の遺伝子発現を上方調節することができる。特定の実施形態では、ＦＧＦ活性化剤は、ＦＧＦ８ａ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、それらの誘導体、及びそれらの組合せから選択される。特定の実施形態では、ＦＧＦ活性化剤は、ＦＧＦ１８を含むか、又はＦＧＦ１８である。

特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約１日間、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約８日間又は少なくとも約１０日間、少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤と接触させるか又は少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤に曝露する。特定の実施形態では、細胞を、約５日間まで、又は約１０日間まで、又は約１５日間まで、又は約２０日間まで、少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤と接触させるか又は少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤に曝露する。特定の実施形態では、細胞を、約１日間～約２０日間、約１日間～約１５日間、又は約５日間～約２０日間、又は約５日間～約１５日間、又は約５日間～約１０日間、又は約１０日間～約２０日間、少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤と接触させるか又は少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤に曝露する。特定の実施形態では、細胞を、約５日間～約１０日間、少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤と接触させるか又は少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤に曝露する。特定の実施形態では、細胞を、約３日間、約５日間又は約８日間、少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤と接触させるか又は少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤に曝露する。特定の実施形態では、細胞を、約５日間、少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤と接触させるか又は少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤に曝露する。

特定の実施形態では、細胞と少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤への初期曝露は、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤への初期曝露から少なくとも約５日間又は少なくとも約１０日間である。特定の実施形態では、細胞と少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤への初期曝露は、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤への初期曝露から約５日以内、約１０日以内、又は約１５日以内である。特定の実施形態では、細胞と少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤への初期曝露は、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤への初期曝露から約５日間～約１５日間、約５日間～約１０日間、又は約１０日間～約１５日間である。特定の実施形態では、細胞と少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤への初期曝露は、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤への初期曝露から約５日間～約１０日間である。特定の実施形態では、細胞と少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤への初期曝露は、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤への初期曝露から約１０日間である。特定の実施形態では、細胞と少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤への初期曝露は、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤への初期曝露から９日間である。特定の実施形態では、細胞と少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤への初期曝露は、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤への初期曝露から１０日間である。特定の実施形態では、細胞と少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤への初期曝露は、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤への初期曝露から１２日間である。

特定の実施形態では、細胞と少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤への初期曝露は、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤への初期曝露から約５日間であり、細胞を少なくともＦＧＦ活性化剤と約３日間接触させる。特定の実施形態では、細胞と少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤への初期曝露は、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤への初期曝露から約５日間であり、細胞を少なくともＦＧＦ活性化剤と約５日間接触させる。特定の実施形態では、細胞と少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤への初期曝露は、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤への初期曝露から約１０日間であり、細胞を少なくともＦＧＦ活性化剤と約３日間接触させる。特定の実施形態では、細胞と少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤への初期曝露は、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤への初期曝露から約１０日間であり、細胞を少なくともＦＧＦ活性化剤と約５日間接触させる。特定の実施形態では、細胞と少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤への初期曝露は、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤との初期接触又は細胞の少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤への初期曝露から１２日間であり、細胞を少なくともＦＧＦ活性化剤と５日間接触させる。

特定の実施形態では、細胞と接触させるか又は細胞に曝露する少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤の濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、細胞と接触させるか又は細胞に曝露する少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤の濃度は、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、細胞と接触させるか又は細胞に曝露する少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤の濃度は、約１００ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、細胞と接触させるか又は細胞に曝露する少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤の濃度は、約２００ｎｇ／ｍＬである。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤は、ＦＧＦ１８を含む。

特定の非限定的な実施形態では、幹細胞を、少なくとも１つのＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２、例えば、約１０μＭの濃度）、少なくとも１つのＢＭＰ阻害剤（例えば、ＬＤＮ１９３１８９、例えば、約２５０ｎＭの濃度）、及び少なくとも１つのＳＨＨ活性化剤（例えば、ＳＨＨ Ｃ２５ＩＩ、例えば、約５００ｎｇ／ｍＬの濃度）と約５日間（例えば、７日間、例えば、０日目～６日目まで）接触させるか又は曝露し、細胞を、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、例えば、約０．７μＭの濃度で５日間（例えば、４日間、例えば、０日目～３日目まで）、及び約７．５μＭの濃度で約５日間（例えば、６日間、例えば、４日目～９日目まで）、及び約３μＭの濃度で約２日間（例えば、１０日目～１１日目まで）接触させる。細胞を、少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤（例えば、ＦＧＦ１８、例えば約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で）と接触させるか又は少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤に曝露し、ここで、細胞と少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤との初期接触は、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤との初期接触から約１０日間（例えば、１０日間又は１２日間）であり、細胞を少なくとも１つのＦＧＦ活性化剤と約５日間（例えば、例えば、５日間（１２日目～１６日目）又は７日間（例えば、１０日目～１６日目まで）接触させる。

５．２．６．細胞培養培地
特定の実施形態では、上記の阻害剤及び活性化剤は、細胞を含む細胞培養培地に添加される。適切な細胞培養培地には、限定するものではないが、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（「ＫＳＲ」）培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）培地（ＮＢ）、Ｎ２培地、Ｂ－２７培地、及びＥｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）／Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ６（登録商標）（「Ｅ８／Ｅ６」）培地、並びにそれらの組合せが含まれる。ＫＳＲ培地、ＮＢ培地、Ｎ２培地、Ｂ－２７培地、及びＥ８／Ｅ６培地は、市販されている。ＫＳＲ培地は、培養中の未分化ｈＥＳＣを成長及び維持するために最適化された、定義された無血清配合である。

特定の実施形態では、細胞培養培地は、ＫＳＲ培地である。ＫＳＲ培地の構成成分は、国際公開第２０１１／１４９７６２号に開示されている。特定の実施形態では、ＫＳＲ培地は、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ血清代替物、Ｌ－グルタミン、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、ＭＥＭ及び１３－メルカプトエタノールを含む。特定の実施形態では、１リットルのＫＳＲ培地は、８２０ｍＬのＫｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ、１５０ｍＬのＫｎｏｃｋｏｕｔ血清代替物、１０ｍＬの２００ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１０ｍＬの１０ｍＭ ＭＥＭ及び５５μＭの１３メルカプトエタノールを含む。

特定の実施形態では、細胞培養培地は、Ｅ８／Ｅ６培地である。Ｅ８／Ｅ６培地は、ヒト多能性幹細胞の成長及び拡大を支援するフィーダーフリー及びゼノフリーの培地である。Ｅ８／Ｅ６培地は、体細胞リプログラミングを支援することが証明されている。さらに、Ｅ８／Ｅ６培地は、ＰＳＣの培養のためのカスタム培地の配合のためのベースとして使用することができる。Ｅ８／Ｅ６培地の一例は、Ｃｈｅｎら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１１ Ｍａｙ；８（５）：４２４－９に記載され、これは、その全体が参照により組み込まれる。Ｅ８／Ｅ６培地の一例は、国際公開第１５／０７７６４８号に開示されており、その全体が参照により組み込まれる。特定の実施形態では、Ｅ８／Ｅ６細胞培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、アスコルビン酸、セレン、インスリン、ＮａＨＣＯ_３、トランスフェリン、ＦＧＦ２及びＴＧＦβを含む。Ｅ８／Ｅ６培地は、Ｅ８／Ｅ６培地が活性ＢＭＰやＷｎｔ成分を含まないという点でＫＳＲ培地とは異なる。したがって、特定の実施形態では、Ｅ８／Ｅ６培地を使用して本開示の幹細胞の集団を培養して固有受容器の集団に分化させる場合、少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤（例えば、ＢＭＰを阻害するもの）をＥ８／Ｅ６培地に添加する必要はない。

５．２．７．分化細胞
特定の実施形態では、本方法は、分化細胞の細胞集団を得ることを含み、分化細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％が、ｍＤＡ又はｍＤＡ前駆体を示す少なくとも１つのマーカーを発現する。ｍＤＡ又はｍＤＡ前駆体を示すマーカーの非限定的な例としては、エングレイルド－１（ＥＮ１）、オルソデンチクルホメオボックス２（ＯＴＸ２）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、核内受容体関連－１タンパク質（ＮＵＲＲ１）、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、及びＬＩＭホメオボックス転写因子１アルファ（ＬＭＸ１Ａ）、ＰＩＴＸ３、ＬＭＯ３、ＳＮＣＡ、ＡＤＣＡＰ１、ＣＨＲＮＡ４、及びＧＩＲＫ２が挙げられる。

特定の実施形態では、分化細胞は、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤との初期接触から少なくとも約１０日間（例えば、約１５日間（例えば、１６日間）、約２０日間、約３０日間、約４０日間、又は約５０日間）、ｍＤＡ又はｍＤＡ前駆体を示す少なくとも１つのマーカーを発現する。

少なくともＦＧＦ活性化剤による細胞の処理は、ＥＮ１の持続的発現をもたらし得る。ＥＮ１は、発生中の中脳ＤＡニューロンの生存因子であり、成体中脳ＤＡニューロンにおいて神経保護及び生理学的機能を発揮し続ける。したがって、ＥＮ１の持続的発現を有する細胞は、さらなる発達及び成熟の際に機能的に成熟したｍＤＡに発達することができる。特定の実施形態では、分化細胞は、幹細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤との初期接触から少なくとも約１０日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２７日間、少なくとも約３０日間、少なくとも約３５日間、少なくとも約４０日間、少なくとも約４５日間、少なくとも約５０日間、少なくとも約６０日間、少なくとも約７０日間、少なくとも約８０日間、又は少なくとも約９０日間、ＥＮ１の検出可能なレベルの発現を有する。特定の実施形態では、分化細胞は、幹細胞の少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤への初期接触から約３０日間、ＥＮ１の検出可能なレベルの発現を有する。特定の実施形態では、分化細胞は、幹細胞の少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤への初期接触から約４０日間、ＥＮ１の検出可能なレベルの発現を有する。

特定の実施形態では、本開示の方法に由来する分化細胞は、ＰＡＸ６、ＥＭＸ２、ＬＨＸ２、ＳＭＡ、ＳＩＸ１、ＰＩＴＸ２、ＳＩＭ１、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＨＯＸ２Ａ、ＢＡＲＨＬ１、ＢＡＲＨＬ２、ＧＢＸ２、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ２、ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、及びそれらの組合せから選択される少なくとも１つのマーカーを発現しないか、又は低発現を有する。

特定の実施形態では、細胞を、少なくとも１つのＤＡニューロンのマーカー、例えばＥＮ１の検出可能なレベルの発現を増加させるのに有効な濃度及び時間で、本明細書に記載の活性化剤及び阻害剤と接触させる、又は、ここで細胞はＡ９型ニューロン細胞である。

特定の実施形態では、細胞を、ＳＭＡ、ＳＩＸ１、ＰＩＴＸ２、ＳＩＭ１、ＰＯＵ４Ｆ１及び／又はＰＨＯＸ２Ａの発現を減少させるのに有効な濃度及び時間で、本明細書に記載の活性化剤及び阻害剤と接触させる。

５．２．８．ｍＤＡ前駆体のｍＤＡへの分化
特定の実施形態では、細胞を、ＤＡニューロン系譜特異的活性化剤及び阻害剤、例えば、Ｌ－グルタミン、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ、例えばＴＧＦβ３）、アスコルビン酸（ＡＡ）、及びＤＡＰＴ（Ｎ－［（３，５－ジフルオロフェニル）アセチル］－Ｌ－アラニル－２－フェニル］グリシン－ｌ，ｌ－ジメチルエチルエステルとしても知られている；ＬＹ－３７４９７３，Ｎ－［Ｎ－（３，５－ジフルオロフェンアセチル（ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎａｃｅｔｙｌ））－Ｌ－アラニル］－Ｓ－フェニルグリシンｔ－ブチルエステル；又はＮ－［Ｎ－（３，５－ジフルオロフェンアセチル）－Ｌ－アラニル］－Ｓ－フェニルグリシンｔ－ブチルエステル）とさらに接触させる。特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、又は少なくとも約１０日間またはそれを超えて、例えば約２日間～約２０日間、約３日間～約１９日間、約４日間～約１８日間、約５日間～約１７日間、約６日間～約１６日間、約７日間～約１５日間、約８日間～約１５日間、約９日間～約１４日間、又は約１０日間～約１３日間、前記のＤＡニューロン系譜特異的活性化剤及び阻害剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を、最大約２日間、最大約３日間、最大約４日間、最大約５日間、最大約６日間、最大約７日間、最大約８日間、最大約９日間、又は最大約１０日間又はそれを超えて、前記のＤＡニューロン系譜特異的活性化剤及び阻害剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間又は約８日間、前記のＤＡニューロン系譜特異的活性化剤及び阻害剤と接触させる。

特定の実施形態では、細胞を、約０．５ｍＭ～約５ｍＭ、又は約１ｍＭ～約５ｍＭ、又は約１．５ｍＭ～約２．５ｍＭ、又は約１ｍＭ～約２ｍＭの濃度のＬ－グルタミンと接触させる。特定の実施形態では、細胞を、約２ｍＭの濃度のＬ－グルタミンと接触させる。

特定の実施形態では、細胞を、約５ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍＬ、又は約１０ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍＬ、又は約１０ｎｇ／ｍｌ～約４０ｎｇ／ｍＬ、又は約２０ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍＬ、又は約２０ｎｇ／ｍｌ～約４０ｎｇ／ｍＬ、又は約１０ｎｇ／ｍｌ～約３０ｎｇ／ｍＬ、又は約１０ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍＬ、又は約２０ｎｇ／ｍｌ～約３０ｎｇ／ｍＬの濃度のＢＤＮＦと接触させる。特定の実施形態では、細胞を、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度のＢＤＮＦと接触させる。

特定の実施形態では、細胞を、約５０ｎＭ～約５００ｎＭ、又は約１００ｎＭ～約５００ｎＭ、又は約１００ｎＭ～約４００ｎＭ、又は約２００ｎＭ～約４００ｎＭ、又は約２００ｎＭ～約３００ｎＭ、又は約１００ｎＭ～約３００ｎＭの濃度のアスコルビン酸（ＡＡ）と接触させる。特定の実施形態では、細胞を、約２００ｎＭの濃度のＡＡと接触させる。

特定の実施形態では、細胞を、約５ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍＬ、又は約１０ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍＬ、又は約１０ｎｇ／ｍｌ～約４０ｎｇ／ｍＬ、又は約２０ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍＬ、又は約２０ｎｇ／ｍｌ～約４０ｎｇ／ｍＬ、又は約１０ｎｇ／ｍｌ～約３０ｎｇ／ｍＬ、又は約１０ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍＬ、又は約２０ｎｇ／ｍｌ～約３０ｎｇ／ｍＬの濃度のＧＤＮＦと接触させる。特定の実施形態では、細胞を、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度のＧＤＮＦと接触させる。

特定の実施形態では、細胞を、約２００ｎＭ～約８００ｎＭ、又は約２００ｎＭ～約７００ｎＭ、又は約３００ｎＭ～約７００ｎＭ、又は約３００ｎＭ～約６００ｎＭ、又は約４００ｎＭ～約６００ｎＭ、又は約４５０ｎＭ～約５５０ｎＭの濃度のｃＡＭＰと接触させる。特定の実施形態では、細胞を、約５００ｎＭの濃度のｃＡＭＰと接触させる。

特定の実施形態では、細胞を、約０．０１ｎｇ／ｍｌ～約５ｎｇ／ｍＬ、又は約０．１ｎｇ／ｍｌ～約４ｎｇ／ｍＬ、又は約０．５ｎｇ／ｍｌ～約５ｎｇ／ｍＬ、又は約１ｎｇ／ｍｌ～約３ｎｇ／ｍＬ、又は約１ｎｇ／ｍｌ～約２ｎｇ／ｍＬの濃度でＴＧＦβ３と接触させる。特定の実施形態では、細胞を、約１ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＧＦβ３と接触させる。

特定の実施形態では、分化中脳ＤＡ前駆体は、米国特許出願公開第２０１５／００１０５１４号に記載されているようにさらに培養され、これは参照によりその全体が組み込まれる。

５．３．中脳ＤＡニューロン及びその前駆体を単離する方法
本開示は、少なくとも１つ又は少なくとも２つの表面マーカーに基づいてｍＤＡ及びその前駆体を単離する方法を提供する。特定の実施形態では、表面マーカーは陰性表面マーカーであり、細胞は検出可能なレベルの陰性表面マーカーを発現しない。特定の実施形態では、細胞は、細胞がそれから単離される細胞の集団の陰性表面マーカーの平均発現レベルと比較して、低下したレベルの陰性表面マーカーを発現する。

特定の実施形態では、表面マーカーは陽性表面マーカーであり、細胞は検出可能なレベルの陽性表面マーカーを発現する。特定の実施形態では、細胞は、細胞がそれから単離される細胞の集団の陽性表面マーカーの平均発現レベルと比較して、増加したレベルの陽性表面マーカーを発現する。

特定の実施形態では、ｍＤＡ及びその前駆体を細胞の集団から単離するための本開示の方法は、検出可能なレベルの少なくとも１つの陰性表面マーカーを発現しない細胞を単離することを含む。特定の実施形態では、ｍＤＡ及びその前駆体を細胞の集団から単離するための本開示の方法は、細胞の集団における少なくとも１つの陰性表面マーカーの平均発現レベルと比較して、検出可能なレベルの少なくとも１つの陰性表面マーカーを発現しないか、又は低下したレベルの少なくとも１つの陰性表面マーカーを発現する、細胞を単離することを含む。特定の実施形態では、ｍＤＡ及びその前駆体を細胞の集団から単離するための本開示の方法は、検出可能なレベルの少なくとも１つの陽性表面マーカーを発現する細胞を単離することを含む。特定の実施形態では、ｍＤＡ及びその前駆体を細胞の集団から単離するための本開示の方法は、細胞の集団における少なくとも１つの陽性マーカーの平均発現レベルと比較して、増加したレベルの少なくとも１つの陽性表面マーカーを発現する細胞を単離することを含む。

特定の実施形態では、ｍＤＡ及びその前駆体を細胞の集団から単離するための本開示の方法は、検出可能なレベルの少なくとも１つの陰性表面マーカーを発現せず、検出可能なレベルの少なくとも１つの陽性表面マーカーを発現する細胞を単離することを含む。特定の実施形態では、ｍＤＡ及びその前駆体を細胞の集団から単離するための本開示の方法は、（ａ）細胞の集団における少なくとも１つの陰性表面マーカーの平均発現レベルと比較して、検出可能なレベルの少なくとも１つの陰性表面マーカーを発現しないか、又は低下したレベルの少なくとも１つの陰性表面マーカーを発現する、かつ（ｂ）細胞の集団における少なくとも１つの陽性表面マーカーの平均発現レベルと比較して、少なくとも１つの陽性表面マーカーのレベルが上昇した、細胞を単離することを含む。

特定の実施形態では、陰性表面マーカーは、ＣＤ４９ｅ（インテグリンアルファ５としても知られる）、ＣＤ９９、ＣＤ３４０、及びそれらの組合せから選択される。特定の実施形態では、陽性表面マーカーは、ＣＤ１７１、ＣＤ１８４及びそれらの組合せから選択される。

特定の実施形態では、ｍＤＡ及びその前駆体を細胞の集団から単離するための本開示の方法は、検出可能なレベルのＣＤ４９ｅを発現せず、かつ検出可能なレベルのＣＤ１８４を発現する細胞を単離することを含む。特定の実施形態では、ｍＤＡ及びその前駆体を細胞の集団から単離するための本開示の方法は、細胞の集団におけるＣＤ４９ｅの平均発現レベルと比較して、検出可能なレベルのＣＤ４９ｅを発現しないか、又は低下したレベルのＣＤ４９ｅを発現する、かつ細胞の集団におけるＣＤ１８４の平均発現レベルと比較して、増加したレベルのＣＤ１８４を発現する、細胞を単離することを含む。

当技術分野で公知の任意の表面マーカーに基づく細胞単離技術を、本開示の方法において使用することができる。特定の実施形態では、フローサイトメトリーは、本開示の単離方法に使用される。

５．４．細胞集団及び組成物
本開示は、インビトロ分化細胞の細胞集団であって、細胞の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％）が、ｍＤＡ又はｍＤＡ前駆体を示す少なくとも１つのマーカーを発現する、インビトロ分化細胞の細胞集団を提供する。ｍＤＡ又はｍＤＡ前駆体を示すマーカーの非限定的な例としては、ＥＮ１、ＯＴＸ２、ＴＨ、ＮＵＲＲ１、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＰＩＴＸ３、ＬＭＯ３、ＳＮＣＡ、ＡＤＣＡＰ１、ＣＨＲＮＡ４及びＧＩＲＫ２が挙げられる。本開示はまた、そのような細胞集団を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、インビトロ分化細胞は、本明細書で、例えば、第５．２節に記載される分化方法によって得られる。

特定の実施形態では、分化細胞の約５０％未満（例えば、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、又は約０．１％未満）が、ＰＡＸ６、ＥＭＸ２、ＬＨＸ２、ＳＭＡ、ＳＩＸ１、ＰＩＴＸ２、ＳＩＭ１、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＨＯＸ２Ａ、ＢＡＲＨＬ１、ＢＡＲＨＬ２、ＧＢＸ２、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ２、ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、及びそれらの組合せから選択される少なくとも１つのマーカーを発現する。

本開示はまた、インビトロ分化細胞の細胞集団であって、細胞の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％）が、本明細書に開示される少なくとも１つの陽性表面マーカー（例えば、第５．３節）を発現し、かつ本明細書に開示される少なくとも１つの陰性表面マーカー（例えば、第５．３節）を発現しない、インビトロ分化細胞の細胞集団を提供する。本開示はまた、インビトロ分化細胞の細胞集団であって、細胞の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％）が、細胞の集団における少なくとも１つの陽性マーカーの平均発現レベルと比較して、増加したレベルの本明細書（例えば、第５．３節）に開示される少なくとも１つの陽性表面マーカーを発現し、かつ、細胞の集団における少なくとも１つの陰性表面マーカーの平均発現レベルと比較して、検出可能なレベルの本明細書（例えば、第５．３節）に開示される少なくとも１つの陰性表面マーカーを発現しないか、又は低下したレベルの本明細書（例えば、第５．３節）に開示される少なくとも１つの陰性表面マーカーを発現する、インビトロ分化細胞の細胞集団を提供する。

特定の実施形態では、細胞の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％）が、検出可能なレベルのＣＤ４９ｅを発現せず、かつ検出可能なレベルのＣＤ１８４を発現する。特定の実施形態では、細胞の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％）が、細胞集団中のＣＤ４９ｅの平均発現レベルと比較して、検出可能なレベルのＣＤ４９ｅを発現しないか、又は低下したレベルのＣＤ４９ｅを発現し、かつ細胞の集団におけるＣＤ１８４の平均発現レベルと比較して、増加したレベルのＣＤ１８４を発現する。さらに、本開示は、そのような細胞集団を含む組成物を提供する。

特定の実施形態では、細胞は、生体適合性足場又はマトリックス、例えば細胞が対象に埋め込まれた又は移植された場合に組織再生を促進する生体適合性三次元足場をさらに含む組成物に含まれる。特定の実施形態では、生体適合性足場は、細胞外マトリックス材料、合成ポリマー、サイトカイン、コラーゲン、ポリペプチド又はタンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、アガロース又はゼラチンを含む多糖類、及び／又はヒドロゲルを含む。（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０１５９１３５号、同第２０１１／０２９６５４２号、同第２００９／０１２３４３３号及び同第２００８／０２６８０１９号を参照のこと。これらの各々の内容は、参照によりその全体が組み込まれる）。特定の実施形態では、組成物は、中脳ＤＡ細胞へ埋め込まれた／移植された細胞の成熟を促進するための成長因子をさらに含む。

特定の実施形態では、組成物は、約１×１０^４～約１×１０^１０、約１×１０^４～約１×１０^５、約１×１０^５～約１×１０^９、約１×１０^５～約１×１０^６、約１×１０^５～約１×１０^７、約１×１０^６～約１×１０^７、約１×１０^６～約１×１０^８、約１×１０^７～約１×１０^８、約１×１０^８～約１×１０^９、約１×１０^８～約１×１０^１０、又は約１×１０^９～約１×１０^１０個の細胞の細胞集団を含み対象に投与される。特定の実施形態では、約１×１０^５個～約１×１０^７個のその細胞が、対象に投与される。

特定の実施形態では、前記組成物は凍結される。特定の実施形態では、前記組成物は、少なくとも１つの凍結保護剤、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリエチレングリコール、スクロース、トレハロース、デキストロース、又はそれらの組合せをさらに含むが、これらに限定されない。

特定の実施形態では、組成物は、生体適合性足場又はマトリックス、例えば、細胞が対象に埋め込まれた又は移植された場合に組織再生を促進する生体適合性三次元足場をさらに含む。特定の実施形態では、生体適合性足場は、細胞外マトリックス材料、合成ポリマー、サイトカイン、コラーゲン、ポリペプチド又はタンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、アガロース又はゼラチンを含む多糖類、及び／又はヒドロゲルを含む。（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０１５９１３５号、同第２０１１／０２９６５４２号、同第２００９／０１２３４３３号及び同第２００８／０２６８０１９号を参照のこと。これらの各々の内容は、参照によりその全体が組み込まれる）。

特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物である。組成物は、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、及び多発性硬化症を含む神経変性障害を予防及び／又は処置するために使用することができる。

本開示の主題はまた、本明細書に開示される分化細胞又はそれを含む組成物を含むデバイスを提供する。デバイスの非限定的な例としては、シリンジ、微細ガラス管、定位針及びカニューレが挙げられる。

５．５．神経変性障害を処置する方法
本明細書に開示される細胞集団及び組成物（例えば、第５．４節に開示されているもの）は、神経変性障害を処置するために使用することができる。本開示の主題は、神経変性障害を処置する方法を提供する。特定の実施形態では、本方法は、有効量の本開示の幹細胞由来ｍＤＡ又はそれを含む組成物を、神経変性障害に罹患している対象に投与することを含む。特定の実施形態では、本方法は、検出可能なレベルの少なくとも１つの陰性表面マーカー（例えば、ＣＤ４９ｅ）を発現せず、かつ検出可能なレベルの少なくとも１つの陽性表面マーカー（例えば、ＣＤ１８４）を発現する有効量のインビトロ分化細胞、又はそのような細胞を含む組成物を、神経変性障害に罹患している対象に投与することを含む。特定の実施形態では、方法は、細胞がそれから単離される細胞の集団の少なくとも１つの陰性表面マーカーの平均発現と比較して、検出可能なレベルの少なくとも１つの陰性表面マーカー（例えば、ＣＤ４９ｅ）を発現しないか、又は低下したレベルの少なくとも１つの陰性表面マーカー（例えば、ＣＤ４９ｅ）を発現し、かつ細胞がそれから単離される細胞の集団の少なくとも１つの陽性表面マーカーの平均発現と比較して、増加したレベルの少なくとも１つの陽性表面マーカー（例えば、ＣＤ１８４）を発現する有効量のインビトロ分化細胞を、又はそのような細胞を含む組成物を、神経変性障害に罹患している対象に投与することを含む。特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容され得る担体をさらに含む医薬組成物である。

神経変性障害の非限定的な例としては、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病及び多発性硬化症が挙げられる。

特定の実施形態では、神経変性疾患は、パーキンソン病である。パーキンソン病の一次運動徴候には、例えば、手、腕、脚、顎及び顔の振戦、運動緩慢又は動きの遅さ、四肢及び体幹の硬直又はこわばり、並びに姿勢不安定性又はバランス及び協調の障害が含まれるが、これらに限定されない。

特定の実施形態では、神経変性疾患は、運動を制御する脳の一部である基底核におけるドーパミンの欠乏に関連する疾患を指すパーキンソニズム疾患である。症状としては、振戦、運動緩慢（極端な動きの遅さ）、屈曲姿勢、姿勢不安定性、及び硬直が挙げられる。パーキンソニズム疾患の非限定的な例としては、皮質基底核変性症、レビー小体型認知症、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍａｔｒｏｐｈｙ）及び進行性核上性麻痺が挙げられる。

細胞又は組成物は、神経変性障害を処置又は予防するために、対象に全身に又は直接投与又は提供することができる。特定の実施形態では、細胞又は組成物は、目的の器官（例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）又は末梢神経系（ＰＮＳ））に直接注射される。特定の実施形態では、細胞又は組成物は、線条体に直接注射される。

細胞又は組成物は、任意の生理学的に許容され得るビヒクル中で投与することができる。細胞又は組成物は、局部注射、同所性（ＯＴ）注射、全身注射、静脈内注射、又は非経口投与によって投与することができる。特定の実施形態では、細胞又は組成物を、同所性（ＯＴ）注射によって、神経変性障害に罹患している対象に投与する。

細胞又は組成物は、滅菌液体調製物、例えば、選択されたｐＨに緩衝され得る等張水性液剤、懸濁剤、乳剤、分散液剤又は粘性組成物として便利に提供され得る。液体調製物は、通常、ゲル剤、他の粘性組成物、及び固体組成物よりも調製することが容易である。さらに、液体組成物は、特に注射によって投与するのにいくらか便利である。一方、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間を提供するために、適切な粘度範囲内で製剤化することができる。液体又は粘性組成物は担体を含むことができ、担体は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。滅菌注射用液剤は、本開示の主題の組成物、例えば、本開示の幹細胞由来前駆体を含む組成物を、必要な量の適切な溶媒に、必要に応じて様々な量の他の成分と共に組み込むことによって調製することができる。そのような組成物は、例えば、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの適切な担体、希釈剤、又は賦形剤と混合していてもよい。組成物はまた、凍結乾燥することができる。組成物は、投与経路及び所望の調製物に応じて、例えば、湿潤剤、分散剤又は乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化又は増粘添加剤、保存剤、香味剤、着色剤などの補助物質を含有することができる。参照により本明細書に組み込まれる「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ」、第１７版、１９８５などの標準的なテキストは、過度の実験を行うことなく適切な調製物を調製するために参照され得る。

抗菌保存剤、抗酸化剤、キレート剤、及びバッファーを含む、組成物の安定性及び無菌性を高める様々な添加剤を添加することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確実にすることができる。注射用医薬形態の長期吸収は、吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム（ａｌｕｍ ｉｎｕｒｎ ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ）及びゼラチンの使用によってもたらされ得る。

組成物の粘度は、所望であれば、薬学的に許容され得る増粘剤を使用して選択されたレベルに維持することができる。メチルセルロースは、容易かつ経済的に入手可能であり、取り扱いが容易であるため、使用することができる。他の適切な増粘剤としては、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが挙げられる。増粘剤の濃度は、選択された剤に依存し得る。重要な点は、選択された粘度を達成する量を使用することである。適切な担体及び他の添加剤の選択は、正確な投与経路及び特定の剤形、例えば液体剤形（例えば、組成物が、液剤、懸濁剤、ゲル剤又は他の液体形態、例えば、時間放出形態又は液体充填形態に製剤化されるかどうか）の性質に依存する。

当業者は、組成物の構成成分が化学的に不活性であるように選択されるべきであり、本開示の幹細胞由来前駆体の生存率又は有効性に影響を与えないことを認識する。これは、化学的及び薬学的原理の当業者に問題を提示しないか、又は本開示及び本明細書に引用された文献から、標準的なテキストを参照することによって、又は単純な実験（過度の実験を伴わない）によって問題を容易に回避することができる。

細胞の治療的使用に関する１つの考慮事項は、最適な効果を達成するために必要な細胞の量である。最適な効果には、神経変性障害に罹患している対象のＣＮＳ及び／又はＰＮＳ領域の再増殖、並びに／あるいは対象のＣＮＳ及び／又はＰＮＳの改善された機能が含まれるが、これらに限定されない。

「有効量」（又は「治療有効量」）は、処置の際に有益な又は所望の臨床結果に影響を及ぼすのに十分な量である。有効量は、少なくとも１つの用量で対象に投与することができる。処置に関して、有効量は、神経変性障害若しくは下垂体障害の進行を緩和、改善、安定化、逆転若しくは遅延させるか、又は別途、神経変性障害の病理学的帰結を軽減するのに十分な量である。有効量は、一般に、個々の場合に応じて医師によって決定され、当業者の技術の範囲内である。有効量を達成するための適切な投与量を決定するとき、いくつかの要素が通常考慮される。これらの要素には、対象の年齢、性別及び体重、処置される症状、症状の重症度並びに投与される細胞の形態及び有効濃度が含まれる。

特定の実施形態では、有効量の細胞は、神経変性障害に罹患している対象のＣＮＳ及び／又はＰＮＳ領域を再増殖させるのに十分な量である。特定の実施形態では、有効量の細胞は、神経変性障害に罹患している対象のＣＮＳ及び／又はＰＮＳの機能を改善するのに十分な量であり、例えば、改善された機能は、正常者のＣＮＳ及び／又はＰＮＳの機能の約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％又は約１００％であり得る。

投与される細胞の量は、処置されている対象によって変化する。特定の実施形態では、約１×１０^４個～約１×１０^１０個、約１×１０^４個～約１×１０^５個、約１×１０^５個～約１×１０^９個、約１×１０^５個～約１×１０^６個、約１×１０^５個～約１×１０^７個、約１×１０^６個～約１×１０^７個、約１×１０^６個～約１×１０^８個、約１×１０^７個～約１×１０^８個、約１×１０^８個～約１×１０^９個、約１×１０^８個～約１×１０^１０個、又は約１×１０^９個～約１×１０^１０個の細胞が、対象に投与される。特定の実施形態では、約１×１０^５個～約１×１０^７個の細胞が、神経変性障害に罹患している対象に投与される。特定の実施形態では、約１×１０^６個～約１×１０^７個の細胞が、神経変性障害に罹患している対象に投与される。特定の実施形態では、約１×１０^６個～約４×１０^６個の細胞が、神経変性障害に罹患している対象に投与される。有効用量と考えられるものの正確な決定は、特定の対象のサイズ、年齢、性別、体重及び状態を含む、各対象に個別の要素に基づいてもよい。投与量は、本開示及び当技術の知識から当業者によって容易に確認され得る。

５．６．キット
本開示の主題は、幹細胞のｍＤＡ又はその前駆体への分化を誘導するためのキットを提供する。特定の実施形態では、キットは、（ａ）少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤と、（ｂ）少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化剤と、（ｃ）少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤と、（ｄ）少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤と、を含む。特定の実施形態では、キットは、（ｅ）ｍＤＡ又はその前駆体を示す少なくとも１つのマーカーを発現する分化細胞の集団への幹細胞の分化を誘導するための指示をさらに含む。

特定の実施形態では、指示は、幹細胞を特定の配列の阻害剤（複数可）、活性化剤（複数可）及び分子（複数可）と接触させることを含む。阻害剤（複数可）、活性化剤（複数可）及び分子（複数可）を接触させる順序は、幹細胞を培養するために使用される細胞培養培地によって決定することができる。

特定の実施形態では、指示は、幹細胞を、本開示の方法（第５．２節参照）によって記載されるような阻害剤（複数可）、活性化剤（複数可）及び分子（複数可）と接触させることを含む。

特定の実施形態では、本開示は、有効量の単位剤形の本明細書に開示される細胞集団又は組成物を含むキットを提供する。特定の実施形態では、キットは、治療用組成物を含有する滅菌容器を含む。そのような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック、又は当技術分野で公知の他の適切な容器形態であり得る。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、又は薬剤を保持するのに適した他の材料で製造することができる。

特定の実施形態では、キットは、細胞集団又は組成物を神経変性障害に罹患している対象に投与するための指示を含む。指示は、神経変性障害を処置又は予防するための細胞又は組成物の使用に関する情報を含み得る。特定の実施形態では、指示は、治療薬剤の説明、神経変性障害若しくはその症状を処置若しくは予防するための投与スケジュール及び投与、使用上の注意（ｐｒｅｃａｕｔｉｏｎ）、警告、適応症、禁忌、過剰投与量情報、有害反応、動物薬理学、臨床研究、並びに／又は参考文献のうちの少なくとも１つを含む。指示は、容器に直接（存在する場合）、又は容器に貼付されたラベルとして、又は容器内又は容器と共に供給される別個のシート、パンフレット、カード、又はフォルダとして印刷することができる。

６．実施例
本開示の主題は、限定ではなく、本開示の主題の例示として提供される以下の実施例を参照することによってよりよく理解される。

実施例１：中脳ＤＡニューロン分化プロトコルの最適化
中脳ＤＡニューロン及びその前駆体は、以前に開示されたＷｎｔ－Ｂｏｏｓｔプロトコル（国際公開第２０１６／１９６６６１号に開示されている「７．５μＭバンププロトコル（ＧＭＰ Ｖ２Ｂの改変）」プロトコル、これは参照によりその全体が組み込まれる）の下で幹細胞に由来し、これは本明細書の以下で「Ｗｎｔ－Ｂｏｏｓｔプロトコル」又は「Ｂｏｏｓｔプロトコル」と呼ばれる。ＥＮ１発現が、Ｗｎｔ－Ｂｏｏｓｔプロトコルによる分化１１日目から始まって減少することが見出された（図１参照）。分化細胞におけるＥＮ１発現の維持は、成熟した機能的な中脳ＤＡニューロンを生成するために重要である。したがって、ＥＮ１発現を維持するために、本実施例では、分化後期にＷｎｔ－ＢｏｏｓｔプロトコルにＦＧＦ８ｂ処理を追加する試験を行った（図２を参照のこと）。細胞を、Ｗｎｔ－Ｂｏｏｓｔプロトコルに加えて、９日目～１６日目まで、１０日目～１６日目まで、１１日目から１６日目まで、１２日目～１６日目まで、１３日目～１６日目まで、１４日目～１６日目まで、又は１５日目～１６日目までＦＧＦ８ｂと接触させて、試験した。分化１６日目の細胞の免疫染色は、ＥＮ１タンパク質発現がＦＧＦ８ｂ接触期間依存的様式で維持されたことを示す（図３を参照のこと）。ＥＮ１陽性細胞はまた、ＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１Ａを発現した。分化３０日目に細胞において測定されたＲＮＡ発現は、ｍＤＡ又はｍＤＡ前駆体マーカーＦＯＸＡ２、ＮＵＲＲ１、ＬＭＸ１Ａ、ＯＸＴ２、及びＴＨの発現レベルがすべての条件で同等であり、ＥＮ１のｍＲＮＡ発現がＦＧＦ８ｂ接触期間依存的様式で維持されたことを示す（図４Ａ～４Ｂを参照のこと）。しかし、汚染マーカー（非ｍＤＡ又は非ｍＤＡ前駆体マーカー）、例えばＳＭＡ及びＳＩＸ１のｍＲＮＡレベルも、ＦＧＦ８ｂ接触期間依存的様式で誘導された（図４Ｂを参照のこと）。分化３０日目の細胞のＳＩＸ１免疫染色により、ｍＲＮＡ結果を確認した（図５を参照のこと）。

ＦＧＦ８ｂは、多能性幹細胞から中脳ＤＡニューロンを誘導するために使用されている。ＦＧＦ８、ＦＧＦ１７及びＦＧＦ１８は、ＦＧＦのサブファミリーであり、ＦＧＦ１７ｂ、ＦＧＦ１８は、中脳発生においてＦＧＦ８ｂとは異なる役割を有することが実証されている（Ｌｉｕら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２００３ Ｄｅｃ；１３０（２５）：６１７５－８５）。ＦＧＦ１８は、６－ＯＨＤＡ誘導性中脳ドーパミンニューロン損傷を再び保護することができることも示されている（Ｇｕｏら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０１７ Ｊｕｌ ２５；３５６：２２９－２４１）。さらに、ＦＧＦ８ｂ（峡部及び菱脳節１）は、誘導されたＧｂｘ２ドメイン及び中脳内の残りのＯｔｘ２領域との間の接合部に沿って形成体を伸長させる。ＦＧＦ８ａ、ＦＧＦ１７及びＦＧＦ１８は、中脳の拡大及び中脳遺伝子の上方調節を担う。ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ１７及びＦＧＦ１８はすべて、ＦＧＦ８ｂに対するパラクリンＦＧＦの同じＦＧＦサブグループである。

ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ１７及びＦＧＦ１８を、ＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔプロトコル下で１００ｎｇ／ｍｌの濃度で１２日目～１６日目まで細胞培養物に添加することによって試験した。分化１６日目の細胞において、ＦＧＦ１８は、ＦＧＦ８ｂと同様のＥＮ１のｍＲＮＡ発現レベルを誘導したが、ＳＭＡの低下したｍＲＮＡ発現レベルが発見された（図６及び７を参照のこと）。ＥＮ１タンパク質発現もまた、ＦＧＦ８ｂとしてＦＧＦ１８接触期間依存的様式に高度に維持された。

分化の成熟段階において、ＥＮ１は、ＦＧＦ８ｂ及びＦＧＦ１８処理条件において依然として高度に維持された（図８を参照のこと）。さらに、ＦＧＦ１８処理細胞及びＦＧＦ８ｂ処理細胞の両方は、ＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔプロトコルによって分化させた細胞と比較して、ＰＩＴＸ２の低下した発現レベルを有していたが、ＦＧＦ１８処理細胞は、ＦＧＦ８ｂ処理細胞よりも、ＳＭＡ１及びＳＩＸ１の減少した発現レベルを有していた（図８を参照のこと）。これらの結果は、ＦＧＦ１８処理が、ＦＧＦ８ｂ処理と比較して非ｍＤＡマーカーの発現レベルを最小化又は減少させながら、持続的なＥＮ１発現をもたらすことを示している。

ＷＮＴ－ｂｏｏｓｔ＋ＦＧＦ１８プロトコルから生成した分化細胞のインビボ生存を調べた。ＷＮＴ－ｂｏｏｓｔ及びＷＮＴ－ｂｏｏｓｔ＋ＦＧＦ１８プロトコルから生成した細胞を、無傷のマウスタンパク質に移植した。ＷＮＴ－ｂｏｏｓｔ＋ＦＧＦ１８プロトコルから作製した細胞は、ＷＮＴ－ｂｏｏｓｔプロトコルから生成した細胞と比較して、インビボでのＥＮ１発現の維持が改善されていた（図３５Ａ）。ＷＮＴ－ｂｏｏｓｔ＋ＦＧＦ１８プロトコルから生成された細胞はまた、移植後１ヶ月までに移植片コアから末梢に向かって既に出現している線維を伴うより良好な線条体神経支配を有していた（図３５Ｂ）。

実施例２：レポーターを使用したｍＤＡの精製
ＮＵＲＲ１は、有糸分裂後及び未成熟中脳ＤＡニューロンのマーカーであり、成熟中脳ＤＡニューロンにおいても発現する。それは転写因子であり、ＤＡの分化及び維持に寄与する。

細胞集団からｍＤＡを精製するために、本実施例では、内因性ＮＵＲＲ１：：ＧＦＰレポーターｈＰＳＣ（図９Ａを参照のこと）を使用した。ｍＤＡをレポーター細胞株から分化させた。ＮＵＲＲ１ ｍＲＮＡ発現が、分化２０日目から高度に誘導されたことに基づいて、分化２５日目にＧＦＰ陽性細胞のＦＡＣＳベースの単離を行った（図９Ｂ～９Ｃを参照のこと）。

分化２５日目及び４０日目に単一細胞ｑＲＴ－ＰＣＲをＮＵＲＲ１：ＧＦＰ陽性細胞分離株において行った。ほぼ約１００％のＮＵＲＲ１：ＧＦＰ陽性細胞が分化４０日目にＴＨ（成熟ｍＤＡマーカー）、ＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１Ａを発現し、ｍＤＡの運命を示すことが見出された（図１０Ａを参照のこと）。６０日目まで単離したＮＵＲＲ１：ＧＦＰ陽性細胞を連続培養したところ、これらの細胞が高レベルのＴＨを発現していることが示され、これらの細胞が高純度のｍＤＡであることが示された（図１０Ｂを参照のこと）。

分化２５日目のＮＵＲＲ１：：ＧＦＰ陽性中脳ＤＡニューロンをヌードマウスに移植した。図１１は、移植細胞がインビボで生存し、ＴＨ、ヒトマーカーＳＣ１２１、ＧＦＰを発現したことを示す。細胞移植領域に神経突起伸長が見られた（図１１を参照のこと）。

次いで、ＮＵＲＲ１：ＧＦＰ ｈＰＳＣを、ＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔ及びＷＮＴ－ｂｏｏｓｔ＋ＦＧＦ１８（１２日目～１６日目）プロトコル下で培養した。ＮＵＲＲ１：ＧＦＰ陽性細胞を、分化２５日目に単離し、続いて４０日目まで連続培養した。分化４０日目に、これらの中脳ＤＡニューロンは、ＦＯＸＡ２と共に高ＴＨを発現した（図１２を参照のこと）。

ｍＲＮＡ発現分析は、ＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔ＋ＦＧＦ１８（１２日目～１６日目）プロトコルに由来し、かつＮＵＲＲ１：ＧＦＰによって選別されたｍＤＡが、ＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔに由来し、かつＮＵＲＲ１：ＧＦＰによって選別されたｍＤＡよりも、高いＥＮ１発現レベルを有したことを示す（図１３Ａを参照のこと）。これらの選別された細胞を免疫不全マウスに移植した。ＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔプロトコル及びＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔ＋ＦＧＦ１８（１２日目～１６日目）プロトコルに由来するｍＤＡは両方とも、優れた細胞生存を示し、マーカーＳＣ１２１及びＴＨを発現した。しかしながら、ＦＧＦ１８処理細胞（ＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔ＋ＦＧＦ１８プロトコル）は、移植領域からのより良好な神経突起伸長を示した（図１３Ｂを参照のこと）。

実施例３：精製ＤＡニューロンにおける表面マーカーの発見
公開された論文は、各ｉＰＳＣ株が特定の細胞型誘導についての変動を有することを示した。中脳ＤＡ細胞の精製に使用される各ｉＰＳＣ株について報告された株を生成することは困難である。また、遺伝子操作された細胞は、臨床使用に適していない。本実施例は、ＮＵＲＲ１：：ＧＦＰレポーター株を使用して候補表面マーカー、特に、ＮＵＲＲ１：：ＧＦＰ陽性細胞が富化されているが、ＮＵＲＲ１：：ＧＦＰ陰性細胞が富化されていない表面マーカーを同定した、又はその逆も同じであった。

本実施例では、ＮＵＲＲ１：ＧＦＰ ｈＰＳＣに由来する分化２５日目のｍＤＡ分化細胞における３８７個の表面マーカーを試験した（図１４を参照のこと）。

２つの陽性ＣＤマーカーＣＤ１７１及びＣＤ１８４は、ＮＵＲＲ１：：ＧＦＰ陽性集団において濃縮され（図１５Ａ－１５Ｂを参照のこと）、３つの陰性ＣＤマーカーＣＤ４９ｅ、９９及び３４０は、ＮＵＲＲ１：：ＧＦＰ陰性集団において濃縮された（図１６Ａ－１６Ｂを参照のこと）。

細胞を、ＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔプロトコル又はＷＮＴ－ｂｏｏｓｔ＋ＦＧＦ１８（１２日目～１６日目）プロトコル下で分化２５日目にＣＤ４９ｅ（陰性及び／又は弱い発現）によって選別し、さらに１０日間培養した。細胞形態は、これらの細胞が実質的に純粋なｍＤＡであることを示した（図１７を参照のこと）。分化４０日目の選別されたｍＤＡ（２５日目に選別し、さらに１５日間培養）は、高いＴＨ免疫染色を有していた（図１８を参照のこと）。

中脳ＤＡニューロンを精製するために、ＣＤ４９ｅマーカーを別のｈＰＳＣ株ＭＥＬ１で試験した。実質的に純粋なｍＤＡ形態が、分化２５日目にＣＤ４９ｅ（陰性及び／又は弱い発現）で選別され、ＷＮＴ－ｂｏｏｓｔプロトコル及びＷＮＴ－ｂｏｏｓｔ＋ＦＧＦ１８（１２日目～１６日目）プロトコル下でさらに１５日間（分化４０日目）連続培養された細胞において発見された（図１９～２０を参照のこと）。これらの選別されたｍＤＡは、高いＴＨ免疫染色を有していた（図２１を参照のこと）。

ｍＲＮＡ発現は、ＷＮＴ－ｂｏｏｓｔ＋ＦＧＦ１８（１２日目～１６日目）プロトコル下で分化させたＣＤ４９ｅ選別細胞が、ＷＮＴ－Ｂｏｏｓｔプロトコル下で分化させたＣＤ４９ｅ選別細胞よりもＥＮ１の高い発現レベル及びＰＩＴＸ２（グルタミン酸作動性ニューロン（ｇｌｕｔａｍｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）（視床下核マーカー（ｓｕｂｔａｌａｍｉｃ ｎｅｃｌｅｏｕｓ ｍａｒｋｅｒ）））の低い発現レベルを有することを示した。両方のプロトコル下で分化させた選別細胞は、非中脳ＤＡマーカー（ＨＯＸＡ２、ＳＭＡ１、及びＳＩＸ１）の発現レベルをほとんど又は全く有していなかった（図２２を参照のこと）。

３つすべての陰性ＣＤマーカーＣＤ４９ｅ、ＣＤ９９及びＣＤ３４０を試験した。分化２５日目にＣＤ４９ｅ、ＣＤ９９又はＣＤ３４０で選別された細胞（陰性及び／又は弱く発現した細胞）において実質的に純粋なニューロン形状が観察され、さらに１５日間（分化４０日目）連続培養された（図２３を参照のこと）。しかしながら、選別された細胞のｍＲＮＡ発現は、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＩＴＸ２、ＰＯＵ４Ｆ１及びＳＩＭ１を含む非ＤＡニューロンマーカーの増加した発現を示し、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ９９又はＣＤ３４０に基づく単離が非ＤＡニューロンを排除しなかったことを示唆した（図２４）。

ＣＤ１８４を使用する二重選別戦略は、陰性ＣＤマーカーの欠損を直し得ると考えられた。Ｃｘｃｒ４（ＣＤ１８４）は、マウス中脳発達中の中脳ＤＡニューロンの遊走及び配向にとって重要である。ＦＧＦ１８処理ｍＤＡは、ＣＤ１８４^＋／ＣＤ４９ｅ^－による選別後にＡ９中脳ＤＡサブタイプを富化することができる。

ＣＤ４９Ｅ（ＰＥ）及びＣＤ１７１（ＡＰＣ）を使用して、ＮＵＲＲ１：：ＧＦＰ ｈＰＳＣに由来する分化２５日目に中脳ＤＡでＦＡＣＳ選別を行った。単一のＣＤ４９ｅが陰性に選別された細胞は、約６３％のＮＵＲＲ１：ＧＦＰ部分を有することが分かった。そして、ＣＤ１７１陽性選別は、ＣＤ４９ｅと組み合わせてＮＵＲＲ１：ＧＦＰ集団を富化することができない（図２５を参照のこと）。

しかしながら、ＣＤ４９ｅを用いたＣＤ１８４（陽性発現細胞）による選別は、単一の選別された細胞（ＣＤ４９ｅ；６３％）よりもＮＵＲＲ１：ＧＦＰ部分を約８０％まで富化することができる（図２６を参照のこと）。

その後、選別されたＦＡＣＳを、ＣＤ４９ｅ及びＣＤ１７１又はＣＤ４９ｅ及びＣＤ１８４によって分化２５日目に細胞において行った。選別の２日後に培養した細胞の形態は、より高いＣＤ４９ｅに基づく選別された細胞を除いて純粋なニューロン形状を示した（図２７を参照のこと）。

ｍＲＮＡ発現は、ＣＤ４９ｅ^－／ＣＤ１８４^＋（ＣＤ４９ｅ陰性／ＣＤ１８４陽性）細胞が、他の方法で選別された細胞よりも、ｍＤＡマーカー（ＮＵＲＲ１，ＥＮ１，ＰＩＴＸ３）の高い発現レベル、非ｍＤＡマーカー（ＰＩＴＸ２、ＳＩＭ１、ＰＯＵ４Ｆ１）の低い発現レベルを有したこと示した（図２８を参照のこと）。

次に、ＣＤ４９ｅ及びＣＤ１８４がｍＤＡを強く選別できるかどうかを調べた。図２９に示すように、単一のＣＤ４９ｅ^－選別は、インビトロ分化細胞においてＮＵＲＲ１：ＧＦＰ陽性集団を約２０％～最大４３％に富化した。図３０に示すように、二重ＣＤ４９ｅ^－及びＣＤ１８４^＋選別は、インビトロ分化細胞において ＮＵＲＲ１：：ＧＦＰ陽性部分を７４％及び８５％に富化した。

その後の２週間のインビトロ培養によって、選別された細胞は、ＦＯＸＡ２及びＧＦＰを共発現する高いＴＨ^＋ｍＤＡを示し、これにより、ｍＤＡ同一性が確認された（図３１を参照のこと）。

ｍＲＮＡ発現は、二重ＣＤマーカー媒介性の選別された細胞（ＣＤ４９ｅ－及びＣＤ１８４＋）が、他のＣＤ選別された細胞よりも、一般にｍＤＡマーカー（図３２参照）のより高い発現を有し、一方、２５日目にＣＤマーカーによって選別された分化の４０日目における非ｍＤＡマーカー（図３３参照）のより低い発現レベルを有することを示した。

本開示の新規表面マーカーで選別された分化細胞のインビボ生存を調べた。分化細胞をＷＮＴ－ｂｏｏｓｔプロトコルから生成し、ＣＤ４９ｅ弱ＣＤ１８４高細胞を選別し、無傷のマウス脳に移植した。選別されていない細胞と比較して、選別された細胞で移植された組織は、Ｔｈ＋細胞の富化を有し（図３４Ａ）、移植後１ヶ月でＳＯＸ２＋前駆体及びＫＩ６７＋分裂細胞の数が減少した（図３４Ｂ～３４Ｄ）。

本開示の主題及びその利点を詳細に説明してきたが、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書において様々な変更、置換及び変更を行うことができることを理解されたい。さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載のプロセス、機械、製造、並びに物質の組成、手段、方法及びステップの特定の実施形態に限定されることを意図しない。当業者であれば、現在開示されている主題、プロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法、又はステップの現在の開示から、本明細書に記載の対応する実施形態と実質的に同じ機能を実行するか、又は実質的に同じ結果を達成する、現在存在するか、又は後に開発されることになるものは、現在開示されている主題に従って利用することができることを容易に理解する。したがって、添付の特許請求の範囲は、そのようなプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法、又はステップをその範囲内に含むことを意図している。

様々な特許、特許出願、刊行物、製品説明、プロトコル及び配列アクセッション番号は、本出願を通して引用され、その本開示は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (74)

1. 幹細胞の分化を誘導するためのインビトロ方法であって、
   前記幹細胞を、少なくとも１つのＳｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達阻害剤、少なくとも１つのソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤、及び少なくとも１つのウイングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達活性化剤と接触させることと、前記細胞を少なくとも１つの線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達活性化剤と接触させて、中脳ドーパミンニューロン（ｍＤＡ）又はその前駆体を示す少なくとも１つのマーカーを発現する分化細胞の集団を得ることと、を含み、前記少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤が、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ８ａ、及びそれらの組合せから選択される、方法。
2. 幹細胞の分化を誘導するためのインビトロ方法であって、
   前記幹細胞を、少なくとも１つのＳｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達阻害剤、少なくとも１つのソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤、及び少なくとも１つのウイングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達活性化剤と接触させることと、前記細胞を少なくとも１つの線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達活性化剤と接触させて、中脳ドーパミンニューロン（ｍＤＡ）又はその前駆体を示す少なくとも１つのマーカーを発現する分化細胞の集団を得ることと、を含み、前記細胞と前記少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤との初期接触が、前記細胞と前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤との初期接触から少なくとも約５日後である、方法。
3. 前記細胞を、少なくとも約１日間、前記少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤と接触させる、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記細胞を、前記少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤と最大約１５日間接触させる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記細胞を、前記少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤と約５日間接触させる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記細胞と前記少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤との前記初期接触が、前記細胞と前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤との前記初期接触から少なくとも約５日後、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記細胞と前記少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤との前記初期接触が、前記細胞と前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤との前記初期接触から約１０日後である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記細胞と前記少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤との前記初期接触が、前記細胞と前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤との前記初期接触から１２日後である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記細胞を、前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤と約５日間接触させる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記細胞を、前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤と７日間接触させる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記細胞を、前記少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化剤と約５日間接触させる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記細胞を、前記少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化剤と７日間接触させる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記細胞を、前記少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤と約１０日間接触させる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記細胞を、前記少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤と１２日間接触させる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤の濃度が、前記幹細胞とのその初期接触から約４日間増加する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤の前記濃度が、前記少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤の初期濃度から約３００％～約１０００％増加する、請求項１５に記載の方法。
17. 前記少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤の前記濃度が、約３μＭ～１０μＭの濃度に増加する、請求項１５～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤の前記濃度が、約３μＭの濃度に増加する、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤の前記濃度が、約７．５μＭの濃度に増加する、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
20. 少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤が、ＦＧＦ１８を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤が、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌシグナル伝達阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤、及びそれらの組合せから選択される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記少なくとも１つのＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌシグナル伝達阻害剤が、ＡＬＫ５の阻害剤を含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記少なくとも１つのＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌシグナル伝達阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、又はその誘導体、若しくはその混合物を含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
24. 前記ＳＢ４３１５４２の誘導体が、Ａ８３－０１である、請求項２３に記載の方法。
25. 前記少なくとも１つのＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌシグナル伝達阻害剤が、ＳＢ４３１５４２を含む、請求項２１７～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９、ノギン、ドルソモルフィン、それらの誘導体又はそれらの混合物を含む、請求項２１に記載の方法。
27. 前記少なくとも１つのＢＭＰ阻害剤が、ＬＤＮ－１９３１８９を含む、請求項２１又は２６に記載の方法。
28. 前記少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤が、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）シグナル伝達阻害剤を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ１、それらの誘導体、及びそれらの混合物から選択される、請求項２８に記載の方法。
30. 前記少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化剤が、ＳＨＨタンパク質、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト（ＳＡＧ）、それらの誘導体及びそれらの混合物から選択される、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記ＳＨＨタンパク質が、組換えＳＨＨ、精製ＳＨＨ、又は前記の組合せを含む、請求項３０に記載の方法。
32. 前記組換えＳＨＨが、マウスソニックヘッジホッグＮ末端断片と少なくとも約８０％同一である組換えタンパク質を含む、請求項３１に記載の方法。
33. 組換えＳＨＨが、ＳＨＨ Ｃ２５ＩＩを含む、請求項３１又は３２記載の方法。
34. 前記ＳＡＧが、パルモルファミンを含む、請求項３０に記載の方法。
35. 中脳ドーパミンニューロン又はその前駆体を示す前記少なくとも１つのマーカーが、ＥＮ１、ＯＴＸ２、ＴＨ、ＮＵＲＲ１、ＦＯＸＡ２、ＰＩＴＸ３、ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＯ３、ＳＮＣＡ、ＡＤＣＡＰ１、ＣＨＲＮＡ４、ＧＩＲＫ２、及びそれらの組合せから選択される、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記分化細胞が、前記幹細胞と前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤との前記初期接触から少なくとも約１０日後に、中脳ドーパミンニューロン又はその前駆体を示す前記少なくとも１つのマーカーの検出可能なレベルの発現を有する、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記分化細胞が、前記幹細胞と前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤との前記初期接触から約３０日後にＥＮ１の検出可能なレベルの発現を有する、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記分化細胞が、前記幹細胞と前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤との前記初期接触から約４０日後にＥＮ１の検出可能なレベルの発現を有する、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記分化細胞が、ＰＡＸ６、ＥＭＸ２、ＬＨＸ２、ＳＭＡ、ＳＩＸ１、ＰＩＴＸ２、ＳＩＭ１、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＨＯＸ２Ａ、ＢＡＲＨＬ１、ＢＡＲＨＬ２、ＧＢＸ２、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ２、ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、及びそれらの組合せから選択される少なくとも１つのマーカーを発現しない、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記分化細胞の集団を、中脳ドーパミンニューロン前駆体の中脳ドーパミンニューロンへの分化に有利な条件に供することをさらに含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 前記条件が、前記細胞を、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、トランスフォーミング成長因子ベータ３（ＴＧＦＰ３）、アスコルビン酸（ＡＡ）及びＤＡＰＴのうちの少なくとも１つに曝露することを含む、請求項４０に記載の方法。
42. 前記幹細胞が、ヒト、非ヒト霊長類又はげっ歯類の非胚性幹細胞；ヒト、非ヒト霊長類又はげっ歯類の胚性幹細胞；ヒト、非ヒト霊長類又はげっ歯類の人工多能性幹細胞；及びヒト、非ヒト霊長類又はげっ歯類の組換え多能性細胞から選択される、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 幹細胞が、ヒト幹細胞である、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
44. 前記幹細胞が、多能性又は複能性幹細胞である、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
46. 前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞及びそれらの組合せから選択される、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
47. インビトロ分化細胞の細胞集団であって、前記インビトロ分化細胞が、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法によって得られる、インビトロ分化細胞の細胞集団。
48. インビトロ分化細胞の細胞集団であって、前記細胞のうちの少なくとも約５０％が、中脳ドーパミンニューロン又はその前駆体を示す少なくとも１つのマーカーを発現し、前記分化細胞のうちの約５０％未満が、ＰＡＸ６、ＥＭＸ２、ＬＨＸ２、ＳＭＡ、ＳＩＸ１、ＰＩＴＸ２、ＳＩＭ１、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＨＯＸ２Ａ、ＢＡＲＨＬ１、ＢＡＲＨＬ２、ＧＢＸ２、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ２、ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、及びそれらの組合せから選択される少なくとも１つのマーカーを発現する、インビトロ分化細胞の細胞集団。
49. 中脳ドーパミンニューロン又はその前駆体を示す前記少なくとも１つのマーカーが、ＥＮ１、ＯＴＸ２、ＴＨ、ＮＵＲＲ１、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＰＩＴＸ３、ＬＭＯ３、ＳＮＣＡ、ＡＤＣＡＰ１、ＣＨＲＮＡ４、ＧＩＲＫ２、及びそれらの組合せから選択される、請求項４８に記載の細胞集団。
50. 請求項４８又は４９に記載の細胞集団を含む、組成物。
51. 薬学的に許容され得る担体をさらに含む医薬組成物である、請求項５０に記載の組成物。
52. 細胞の集団から中脳ドーパミンニューロン及びその前駆体を単離するための方法であって、検出可能なレベルの少なくとも１つの陰性表面マーカーを発現せず、検出可能なレベルの少なくとも１つの陽性表面マーカーを発現する、細胞を単離することを含む、方法。
53. 細胞の集団から中脳ドーパミンニューロン及びその前駆体を単離するための方法であって、（ａ）前記細胞の集団における少なくとも１つの陰性表面マーカーの平均発現レベルと比較して、検出可能なレベルの前記少なくとも１つの陰性表面マーカーを発現しないか、又は低下したレベルの前記少なくとも１つの陰性表面マーカーを発現する、かつ（ｂ）前記細胞の集団における少なくとも１つの陽性表面マーカーの平均発現レベルと比較して、前記少なくとも１つの陽性表面マーカーのレベルが上昇した、細胞を単離することを含む、方法。
54. 前記少なくとも１つの陰性表面マーカーが、ＣＤ１７１、ＣＤ１８４及びそれらの組合せから選択される、請求項５２又は５３に記載の方法。
55. 前記少なくとも１つの陰性表面マーカーがＣＤ１８４を含む、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の方法。
56. 前記少なくとも１つの陰性表面マーカーが、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ９９、ＣＤ３４０、及びそれらの組合せから選択される、請求項５２～５５のいずれか一項に記載の方法。
57. 前記少なくとも１つの陰性表面マーカーが、ＣＤ４９ｅを含む、請求項５２～５６のいずれか一項に記載の方法。
58. 検出可能なレベルのＣＤ４９ｅを発現せず、かつ、検出可能なレベルのＣＤ１８４を発現する、細胞を単離することを含む、請求項５２～５７のいずれか一項に記載の方法。
59. 前記細胞の集団におけるＣＤ４９ｅの平均発現レベルと比較して、検出可能なレベルのＣＤ４９ｅを発現しないか、又は低下したレベルのＣＤ４９ｅを発現する、かつ前記細胞の集団におけるＣＤ１８４の平均発現レベルと比較して、増加したレベルのＣＤ１８４を発現する、細胞を単離することを含む、請求項５２～５８のいずれか一項に記載の方法。
60. インビトロ分化細胞の細胞集団であって、前記細胞のうちの少なくとも約５０％が、検出可能なレベルの少なくとも１つの陽性表面マーカーを発現し、かつ検出可能なレベルの少なくとも１つの陰性表面マーカーを発現しない、インビトロ分化細胞の細胞集団。
61. インビトロ分化細胞の細胞集団であって、前記細胞の集団における少なくとも１つの陽性表面マーカーの平均発現レベルと比較して、前記細胞のうちの少なくとも約５０％が、増加したレベルの前記少なくとも１つの陽性表面マーカーを発現する、かつ前記細胞の集団における少なくとも１つの陰性表面マーカーの平均発現レベルと比較して、検出可能なレベルの前記少なくとも１つの陰性表面マーカーを発現しないか、又は低下したレベルの前記少なくとも１つの陰性表面マーカーを発現する、インビトロ分化細胞の細胞集団。
62. 前記少なくとも１つの陰性表面マーカーが、ＣＤ１７１、ＣＤ１８４及びそれらの組合せから選択される、請求項６０又は６１に記載の細胞集団。
63. 前記少なくとも１つの陰性表面マーカーがＣＤ１８４を含む、請求項６０～６２のいずれか一項に記載の細胞集団。
64. 前記少なくとも１つの陰性表面マーカーが、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ９９、ＣＤ３４０、及びそれらの組合せから選択される、請求項６０～６３のいずれか一項に記載の細胞集団。
65. 前記少なくとも１つの陰性表面マーカーが、ＣＤ４９ｅを含む、請求項６０～６４のいずれか一項に記載の細胞集団。
66. 前記少なくとも１つの陰性表面マーカーが、ＣＤ１８４を含み、かつ前記少なくとも１つの陰性表面マーカーが、ＣＤ４９ｅを含む、請求項６０～６５のいずれか一項に記載の細胞集団。
67. 請求項６０～６６のいずれか一項に記載の細胞集団を含む、組成物。
68. 薬学的に許容され得る担体をさらに含む医薬組成物である、請求項６７に記載の組成物。
69. 中脳ドーパミンニューロン又はその前駆体への幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、
    （ａ）少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤と、
    （ｂ）少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化剤と、
    （ｃ）少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤と、
    （ｄ）少なくとも１つのＦＧＦシグナル伝達活性化剤と、を含むキット。
70. （ｆ）少なくとも１つの中脳ＤＡ前駆体マーカーを発現する分化細胞の集団への前記幹細胞の分化を誘導するための指示をさらに含む、請求項６９に記載のキット。
71. 対象の神経変性障害を予防及び／又は処置する方法であって、有効量の以下
    （ａ）請求項４７～４９及び６０～６６のいずれか一項に記載の細胞集団、又は
    （ｂ）請求項５０、５１、６７及び６８のいずれか一項に記載の組成物
    のうちの１つを前記対象に投与することを含む、方法。
72. 前記神経変性障害が、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、又は多発性硬化症である、請求項６８に記載の方法。
73. 対象における神経変性障害の予防及び／又は処置することにおける使用のための、請求項４７～４９及び６０～６６のいずれか一項に記載の細胞集団又は請求項５０、５１、６７及び６８のいずれか一項に記載の組成物。
74. 前記神経変性障害が、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、又は多発性硬化症である、請求項７３に記載の使用のための細胞集団又は組成物。

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