JP7297674B2 - 下垂体組織を含む細胞塊の製造方法及びその細胞塊 - Google Patents
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Description
特許文献1及び非特許文献1、2には、ヒト多能性幹細胞をBMPシグナル伝達経路阻害因子乃至作用因子、ソニック・ヘッジホッグ(本明細書において、Shhと記載することがある)シグナル伝達経路作用因子、及びTGF-βシグナル伝達経路阻害剤存在下で分化誘導することにより、下垂体細胞を含む頭部プラコード由来細胞を製造したことが報告されている。しかしながら、製造された細胞は二次元的に培養されたものであり、機能の発揮に重要な生体の複雑な下垂体組織の構造を再現するには至っていない。そのため、効率よく立体的な下垂体組織を製造できる方法が切望されていた。
(1)多能性幹細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
(2)第一工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程。
[2]下記工程(a)、(1)及び(2)を含む、下垂体組織を含む細胞塊の製造方法;
(a)多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1)TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び/又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに2)未分化維持因子を含む培地で培養するa工程、
(1)a工程で培養された多能性幹細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
(2)第一工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含有する細胞塊を得る第二工程。
[3]下記工程(1)、(2-1)及び(2-2)を含む、下垂体組織を含む細胞塊の製造方法;
(1)多能性幹細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
(2-1)第一工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養する第二工程(1)、
(2-2)第二工程(1)で浮遊培養された凝集体を、BMPシグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程(2)。
[4]下記工程(a)、(1)、(2-1)及び(2-2)を含む、下垂体組織を含む細胞塊の製造方法;
(a)多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1)TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び/又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに2)未分化維持因子を含む培地で培養するa工程、
(1)a工程で培養された多能性幹細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
(2-1)第一工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養する第二工程(1)、
(2-2)第二工程(1)で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程(2)。
[5]前記工程(2)又は工程(2-1)におけるBMPシグナル伝達経路作用物質が、前記工程(1)における多能性幹細胞の浮遊培養開始時から0.5時間以降、72時間以内に添加されることを特徴とする[1]~[4]のいずれかに記載の製造方法。
[6]前記工程(2)又は工程(2-1)におけるBMPシグナル伝達経路作用物質が、前記工程(1)で形成された凝集体の表層の細胞の1割以上が密着結合を形成している期間内に添加されることを特徴とする[1]~[4]のいずれかに記載の製造方法。
[7]前記BMPシグナル伝達経路作用物質が、BMP2、BMP4、BMP7及びGDF7からなる群から選ばれる少なくとも1種のタンパク質である、[1]~[6]のいずれかに記載の製造方法。
[8]前記BMPシグナル伝達経路作用物質が、BMP4である、[1]~[7]のいずれかに記載の製造方法。
[9]前記工程(2)又は工程(2-1)における浮遊培養が、前記BMP4の濃度が10pM~5nMである培地でおこなわれることを特徴とする、[8]に記載の製造方法。
[10]前記工程(2-2)におけるBMPシグナル伝達経路阻害物質の添加が、前記工程(2-1)におけるBMPシグナル伝達経路作用物質の添加から12時間以降、20日以内に実施されることを特徴とする[3]~[9]のいずれかに記載の製造方法。
[11]前記Wntシグナル伝達経路阻害物質が非古典的Wnt経路に対する阻害活性を有することを特徴とする、[1]~[10]のいずれかに記載の製造方法。
[12]前記Wntシグナル伝達経路阻害物質がPORCN阻害剤であることを特徴とする、[1]~[11]のいずれかに記載の製造方法。
[13]前記PORCN阻害剤がIWP-2、IWP-3、IWP-4、IWP-L6、IWP-12、LGK-974、Wnt-C59、ETC-159及びGNF-6231からなる群から選ばれる少なくとも1種の化合物であることを特徴とする、[12]に記載の製造方法。
[14]前記Wntシグナル伝達経路阻害物質がKY-02111又はKY-03-Iであることを特徴とする[1]~[11]のいずれかに記載の製造方法。
[15]前記Wntシグナル伝達経路阻害物質がTANK阻害剤であることを特徴とする[1]~[10]のいずれかに記載の製造方法。
[16]前記TANK阻害剤がIWR1-endo、XAV939及びMN-64からなる群から選ばれる少なくとも1種の化合物であることを特徴とする[15]に記載の製造方法。
[17]前記工程(1)、(2)、(2-1)及び(2-2)における浮遊培養が、さらにTGFβシグナル伝達経路阻害物質の存在下で行われることを特徴とする[1]~[16]のいずれかに記載の製造方法。
[18]前記TGFβシグナル伝達経路阻害物質がAlk5/TGFβR1阻害剤であることを特徴とする、[17]に記載の製造方法。
[19]前記Alk5/TGFβR1阻害剤がSB431542、SB505124、SB525334、LY2157299、GW788388、LY364947、SD-208、EW-7197、A 83-01及びRepSoxからなる群から選ばれる少なくも1種の化合物であることを特徴とする、[18]に記載の製造方法。
[20]前記TGFβシグナル伝達経路阻害物質がSMAD3阻害剤であることを特徴とする、[17]に記載の製造方法。
[21]前記SMAD3阻害剤がSIS3であることを特徴とする、[20]に記載の製造方法。
[22]ソニック・ヘッジホッグシグナルシグナル伝達経路作用物質がSAG、Purmorphamine及びGSA-10からなる群から選ばれる少なくとも1種の化合物であることを特徴とする、[1]~[21]のいずれかに記載の製造方法。
[23]前記工程(a)における培地に含まれるソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の濃度が、10nMから700nMのSAGに相当するソニック・ヘッジホッグシグナル伝達促進活性を有する濃度であることを特徴とする、[22]に記載の製造方法。
[24]前記工程(2)又は工程(2-1)における培地に含まれるソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の濃度が、100nMから3μMのSAGに相当するソニック・ヘッジホッグシグナル伝達促進活性を有する濃度であることを特徴とする、[22]又は[23]に記載の製造方法。
[25]前記BMPシグナル伝達経路阻害物質は、I型BMP受容体阻害剤を含む、[3]~[24]のいずれかに記載の製造方法。
[26]前記I型BMP受容体阻害剤は、K02288、Dorsomorphin、LDN-193189、LDN-212854、LDN-214117、ML347、DMH1及びDMH2からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[25]に記載の製造方法。
[27]前記I型BMP受容体阻害剤はK02288を含み、前記K02288の濃度が10nM~50μMである培地中で前記工程(2-2)を開始する、[25]又は[26]に記載の製造方法。
[28]前記工程(1)、(2)、(2-1)及び(2-2)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程がFGFシグナル伝達経路作用物質の存在下で実施されることを特徴とする、[1]~[27]のいずれかに記載の製造方法。
[29]前記工程(2-2)がFGFシグナル伝達経路作用物質の存在下で実施されることを特徴とする、[3]~[27]のいずれかに記載の製造方法。
[30]前記FGFシグナル伝達経路作用物質は、FGF2及びFGF8、並びに、これらの改変体からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[28]又は[29]に記載の製造方法。
[31]前記工程(1)、(2)、(2-1)及び(2-2)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程がWntシグナル伝達経路作用物質の存在下で実施されることを特徴とする、[1]~[30]のいずれかに記載の製造方法。
[32]前記Wntシグナル伝達経路作用物質が前記工程(1)において添加されるWntシグナル伝達経路阻害物質の作用点よりも下流のシグナル伝達因子に作用することを特徴とする、[31]に記載の製造方法。
[33]前記Wntシグナル伝達経路作用物質が古典的Wnt経路を活性化させる物質であることを特徴とする、[31]又は[32]に記載の製造方法。
[34]前記古典的Wnt経路を活性化させる物質がβカテニンの分解の阻害、安定化を促進する作用を有することを特徴とする、[31]~[33]のいずれかに記載の製造方法。
[35]前記Wntシグナル伝達経路作用物質がGSK3阻害剤であることを特徴とする、[31]~[34]のいずれかに記載の製造方法。
[36]前記Wntシグナル伝達経路阻害物質がPORCN阻害剤であり、前記Wntシグナル伝達経路作用物質がGSK3阻害剤であることを特徴とする、[31]~[35]のいずれかに記載の製造方法。
[37]前記GSK3阻害剤がCHIR99021、CHIR98014、TWS119、SB216763、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、IM-12、Indirubin、Bikinin、A 1070722、3F8、Kenpaullone、10Z-Hymenialdisine、Indirubin-3’-oxime、NSC 693868、TC-G 24、TCS 2002、TCS 21311、CP21R7及びこれら化合物の誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[31]~[36]のいずれかに記載の製造方法。
[38]前記GSK3阻害剤はCHIR99021を含み、前記工程(1)、(2)、(2-1)および(2-2)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程に添加される前記CHIR99021の濃度が10nM~50μMである、[31]~[37]のいずれかに記載の製造方法。
[39]前記Wntシグナル伝達経路作用物質がBML-284、SKL2001からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[31]~[34]のいずれかに記載の製造方法。
[40]前記工程(1)で実施される浮遊培養が、無血清培地を用いた浮遊培養であることを特徴とする、[1]~[39]のいずれかに記載の製造方法。
[41]前記無血清培地が、血清代替物を含有することを特徴とする、[40]に記載の製造方法。
[42]前記工程(1)で実施される浮遊培養が、分散処理された多能性幹細胞を用いておこなわれることを特徴とする、[1]~[41]のいずれかに記載の製造方法。
[43]前記工程(1)で実施される浮遊培養が、ROCK阻害剤の存在下で実施されることを特徴とする、[1]~[42]のいずれかに記載の製造方法。
[44]前記工程(1)で添加されるROCK阻害剤の濃度が、1nMから1mMのY-27632に相当する細胞保護能を有する濃度であることを特徴とする、[43]に記載の製造方法。
[45]前記工程(1)、(2)、(2-1)及び(2-2)からなる群より選ばれるいずれか一つ以上の工程における浮遊培養が、さらにNotchシグナル阻害剤の存在下でおこなわれることを特徴とする、[1]~[44]のいずれかに記載の製造方法。
[46]前記Notchシグナル阻害剤がγセクレターゼ阻害剤である、[45]に記載の製造方法。
[47]前記γセクレターゼ阻害剤がDAPTである、[46]に記載の製造方法。
[48]前記工程(1)、(2)、(2-1)及び(2-2)からなる群より選ばれるいずれか一つ以上の工程における浮遊培養が、さらにデキサメタゾンの存在下でおこなわれることを特徴とする、[1]~[47]のいずれかに記載の製造方法。
[49]前記多能性幹細胞が、霊長類多能性幹細胞であることを特徴とする、[1]~[48]のいずれかに記載の製造方法。
[50]前記霊長類多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞であることを特徴とする、[49]に記載の製造方法。
[51][1]~[50]のいずれかに記載の製造方法により得られる下垂体組織を含む細胞塊。
[52]下記工程(1)~(3)を含む、下垂体組織の製造方法;
(1)多能性幹細胞を、Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
(2)第一工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程、
(3)第二工程で得られた細胞塊から下垂体組織を回収する第三工程。
[53]下記工程(1)、(2-1)、(2-2)及び(3)を含む、下垂体組織の製造方法;
(1)多能性幹細胞を、Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
(2-1)第一工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養する第二工程(1)、
(2-2)第二工程(1)で浮遊培養された凝集体を、BMPシグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程(2)、
(3)第二工程(2)で得られた細胞塊から下垂体組織を回収する第三工程。
[54][52]又は[53]に記載の製造方法により得られる下垂体組織。
[55]1)神経系細胞又は神経組織、2)下垂体組織及び3)間葉系細胞を含む細胞塊。
[56]前記3)間葉系細胞が、Nestin、Vimentin、Cadherin-11、Laminin、CD44、CD90及びCD105からなる群から選ばれる少なくとも1種の間葉系細胞マーカーを発現することを特徴とする、[55]に記載の細胞塊。
[57]1)神経系細胞又は神経組織、2)下垂体組織及び4)神経提細胞又は神経提由来細胞を含む細胞塊。
[58]前記4)神経提細胞が、Nestin、Sox10、Slug、Snail、Pax3、Zic1、FoxD3、p75 NTR、HNK-1、CHD7、Numb、Ascl1からなる群から選ばれる少なくとも1種の神経提細胞マーカーを発現することを特徴とする、[57]に記載の細胞塊。
[59]表面が非神経上皮組織で覆われ、非神経上皮組織の少なくも一部に2)下垂体組織が形成されていることを特徴とする[55]~[58]いずれかに記載の細胞塊。
[60]前記非神経上皮組織が、サイトケラチン、E-Cadherin及びEpCAMからなる群から選ばれる少なくとも1種の非神経上皮組織マーカーを発現することを特徴とする、[59]に記載の細胞塊。
[61]前記非神経上皮組織が、1)神経系細胞又は神経組織及び3)間葉系細胞の少なくとも一方を被覆していることを特徴とする、[55]又は[56]に記載の細胞塊。
[62]前記非神経上皮組織が、1)神経系細胞又は神経組織及び4)神経提細胞又は神経提由来細胞の少なくとも一方を被覆していることを特徴とする、[57]又は[58]に記載の細胞塊。
[63]前記3)間葉系細胞が、細胞塊の表面を被覆している非神経上皮組織と、細胞塊の内側に存在する1)神経系細胞又は神経組織との間に存在することを特徴とする、[61]に記載の細胞塊。
[64]前記4)神経提細胞又は神経提由来細胞が、細胞塊の表面を被覆している非神経上皮組織と、細胞塊の内側に存在する1)神経系細胞又は神経組織との間に存在することを特徴とする、[62]に記載の細胞塊。
[65]前記非神経上皮組織が、口腔上皮またはその前駆組織であることを特徴とする[59]~[64]のいずれかに記載の細胞塊。
[66]前記2)下垂体組織が、下垂体ホルモン産生細胞を含むことを特徴とする、[55]~[65]のいずれかに記載の細胞塊。
[67]前記下垂体ホルモン産生細胞が、成長ホルモン(GH)産生細胞、プロラクチン(PRL)産生細胞及び副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)産生細胞からなる群から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする、[66]に記載の細胞塊。
[68]前記下垂体組織が、下垂体組織幹細胞を含むことを特徴とする、[55]~[67]のいずれか一項に記載の細胞塊。
[69]前記下垂体組織幹細胞が、Sox2、Sox9、E-Cadherin、Nestin、S100β、GFRα2、Prop1、CD133、β-Catenin、Klf4、Oct4、Pax6、コクサッキーウイルス・アデノウイルス共通受容体(CXADR)、PRRX1/2、Ephrin-B2及びACEからなる群から選ばれる少なくとも1種の下垂体組織幹細胞マーカーを発現することを特徴とする、[68]に記載の細胞塊。
[70]前記下垂体組織幹細胞が下垂体ニッチを形成していることを特徴とする、請求項[68]又は[69]に記載の細胞塊。
[71]前記1)神経系細胞又は神経組織が、腹側間脳・視床下部の細胞又は組織であることを特徴とする、[55]~[70]いずれかに記載の細胞塊。
[72]前記1)神経系細胞又は神経組織が、N-Cadherin陽性の神経上皮組織であることを特徴とする、[71]に記載の細胞塊。
[73]前記神経上皮組織の内部に脳室様の空胞が形成され、該空胞に接している神経上皮組織の面がPKC-zeta陽性の頂端面であることを特徴とする、[72]に記載の細胞塊。
[74][1]~[50]のいずれか一項に記載の方法により製造される細胞塊又は請求項52に記載の方法により製造される下垂体組織と、被験物質とを接触させる工程と、該被験物質が細胞塊又は下垂体組織に及ぼす影響を検定する工程とを含む、被験物質の毒性・薬効評価方法。
[75][1]~[50]のいずれか一項に記載の方法により製造される細胞塊又は[52]に記載の方法により製造される下垂体組織を含む、被験物質の毒性・薬効評価用試薬。
[76][52]に記載の方法により製造される下垂体組織の有効量を、移植を必要とする対象に移植する工程を含む、下垂体の障害に基づく非ヒト動物の疾患の治療方法。
[77][1]~[50]のいずれか一項に記載の方法により製造される細胞塊又は[52]に記載の方法により製造される下垂体組織を含む、下垂体の障害に基づく疾患の治療薬。
本発明において、「幹細胞」とは、分化能及び分化能を維持した増殖能(特に自己複製能)を有する未分化な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞(pluripotent stem cell)、複能性幹細胞(multipotent stem cell)、単能性幹細胞(unipotent stem cell)等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成するすべての細胞(三胚葉(外胚葉、中胚葉、内胚葉)由来の組織)に分化しうる能力(分化多能性(pluripotency))を有する幹細胞をいう。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーション法やPCR法等があげられる。
浮遊培養中の細胞凝集体あるいは細胞塊においては、細胞と細胞が面接着する。浮遊培養中の細胞凝集体あるいは細胞塊では、細胞-基質間結合が培養器材等との間にはほとんど形成されないか、あるいは、形成されていてもその寄与が小さい。一部の態様では、浮遊培養中の細胞凝集体又は細胞塊では、内在の細胞-基質間結合が凝集体あるいは細胞塊の内部に存在するが、細胞-基質間結合が培養器材等との間にはほとんど形成されないか、あるいは、形成されていてもその寄与が小さい。
細胞と細胞が面接着(plane attachment)するとは、細胞と細胞が面で接着することをいう。より詳細には、細胞と細胞が面接着するとは、ある細胞の表面積のうち別の細胞の表面と接着している割合が、例えば、1%以上、好ましくは3%以上、より好ましくは5%以上であることをいう。細胞の表面は、膜を染色する試薬(例えばDiI)による染色や、細胞接着因子(例えば、E-cadherinやN-cadherin)の免疫組織化学等の手法により検出できる。
多能性幹細胞の培養には、上記基礎培地をベースとした多能性幹細胞培養用の培地、好ましく公知の胚性幹細胞及び/又は人工多能性幹細胞用の培地や、フィーダーフリー下で多能性幹細胞を培養するための培地を用いることができる。例えばEssential 8培地や、TeSR培地、mTeSR培地、mTeSR-E8培地、StemFit培地等のフィーダーフリー培地を挙げることができる。
例えば、「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地」とは、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が添加された培地または外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地を意味する。
本発明において、「均一な凝集体」とは、複数の凝集体を培養する際に各凝集体の大きさが一定であることを意味し、凝集体の大きさを最大径の長さで評価する場合、均一な凝集体とは、最大径の長さの分散が小さいことを意味する。より具体的には、凝集体の集団全体のうちの75%以上の凝集体が、当該凝集塊の集団における最大径の平均値±100%、好ましくは平均値±50%の範囲内、より好ましくは平均値±20%の範囲内であることを意味する。
「分散させる」とは、細胞や組織を酵素処理や物理処理等の分散処理により、小さな細胞片(2細胞以上100細胞以下、好ましくは50細胞以下)又は単一細胞まで分離させることをいう。一定数の分散した細胞とは、細胞片又は単一細胞を一定数集めたもののことをいう。
多能性幹細胞を分散させる方法としては、例えば、機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤添加処理が挙げられる。これらの処理を組み合わせて行ってもよい。好ましくは、細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。
機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。
細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、DNase又はパパイン等の酵素類や、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤のいずれかを含む溶液を挙げることができる。市販の細胞分散液、例えば、Accumax(Innovative cell technologies社製)やTrypLE Select (Life Technologies社製)を用いることもできる。
細胞保護剤添加処理に用いられる細胞保護剤としては、FGFシグナル伝達経路作用物質、ヘパリン、ROCK阻害物質、血清、又は血清代替物を挙げることができる。好ましい細胞保護剤としては、ROCK阻害物質が挙げられる。
例えば、多能性幹細胞を分散させる方法として、多能性幹細胞のコロニーを、細胞保護剤としてROCK阻害物質の存在下、細胞分散液(Accumax)で処理し、さらにピペッティングにより分散させる方法が挙げられる。
多能性幹細胞の凝集体が形成されたことや、凝集体を形成する各細胞において上皮様構造が形成されたことは、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき判断することが可能である。
ニューロンは、神経回路を形成し情報伝達に貢献する機能的な細胞であり、TuJ1、Dcx、HuC/D等の幼若神経細胞マーカー、及び/又は、Map2、NeuN等の成熟神経細胞マーカーの発現を指標に同定することができる。
グリア細胞(glial cell)としては、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミュラーグリア等が挙げられる。アストロサイトのマーカーとしてはGFAP、オリゴデンドロサイトのマーカーとしてはo4、ミュラーグリアのマーカーとしてはCRALBP等が挙げられる。
神経幹細胞とは、神経細胞及びグリア細胞への分化能(多分化能)と、多分化能を維持した増殖能(自己複製能ということもある)を持つ細胞である。神経幹細胞のマーカーとしてはNestin、 Sox2、Musashi、Hesファミリー、CD133等が挙げられるが、これらのマーカーは前駆細胞全般のマーカーであり神経幹細胞特異的なマーカーとは考えられていない。神経幹細胞の数は、ニューロスフェアアッセイやクローナルアッセイ等により評価することができる。
ニューロン前駆細胞とは、増殖能をもち、神経細胞を産生し、グリア細胞を産生しない細胞である。ニューロン前駆細胞のマーカーとしては、Tbr2、Tα1等が挙げられる。あるいは、幼若神経細胞マーカー(TuJ1, Dcx, HuC/D)陽性かつ増殖マーカー(Ki67, pH3, MCM)陽性の細胞を、ニューロン前駆細胞として同定することもできる。
グリア前駆細胞とは、増殖能をもち、グリア細胞を産生し、神経細胞を産生しない細胞である。
神経系前駆細胞(Neural Precursor cell)は、神経幹細胞、ニューロン前駆細胞及びグリア前駆細胞を含む前駆細胞の集合体であり、増殖能とニューロン及びグリア細胞産生能をもつ。神経系前駆細胞はNestin, GLAST, Sox2,Sox1, Musashi, Pax6等をマーカーとして同定することができる。あるいは、神経系細胞のマーカー陽性かつ増殖マーカー(Ki67, pH3, MCM)陽性の細胞を、神経系前駆細胞として同定することもできる。
上皮組織は通常種々の細胞間結合によりつながれており、単層または重層化した層構造を有する組織を形成する。これら上皮組織の有無の確認、存在量の定量は光学顕微鏡による観察か、上皮細胞マーカーに対する抗体(抗E-Cadherin抗体、抗N-Cadherin抗体、抗EpCAM抗体等)を用いた免疫組織化学等の手法により可能である。
生体由来の組織中並びに本発明の製造方法等で作製された細胞塊中の上皮細胞並びに上皮組織に上皮細胞極性が存在しているかどうかは、Phalloidin、頂端側マーカー(抗MUC-1抗体、抗PKC-zeta抗体等)並びに基底側マーカー(抗α6インテグリン抗体、抗β1インテグリン抗体等)を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。
本発明は、下垂体組織を含む細胞塊及びその製造方法を提供する。以下、本発明の製造方法とも称する。
本発明の製造方法の一態様は、下記工程(1)及び(2)を含む、下垂体組織を含む細胞塊の製造方法である。
(1)多能性幹細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
(2)第一工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程。
(a)多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1)TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び/又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに2)未分化維持因子を含む培地で培養するa工程、
(1)a工程で培養された細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
(2)第一工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質とソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含有する細胞塊を得る第二工程。
(1)多能性幹細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
(2-1)第一工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養する第二工程(1)、
(2-2)第二工程(1)で浮遊培養された凝集体を、BMPシグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程(2)。
(a)多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1)TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び/又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに2)未分化維持因子を含む培地で培養するa工程、
(1)a工程で培養された細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
(2-1)第一工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養する第二工程(1)、
(2-2)第二工程で浮遊培養された凝集体を、BMPシグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程(2)。
多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1)TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び/又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに2)未分化維持因子を含む培地で培養するa工程について説明する。
工程(a)において、多能性幹細胞をTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び/又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質で処理してから、第一工程において浮遊培養に付すことにより、多能性幹細胞の状態が変わり、非神経上皮組織の形成効率が改善し、凝集体の質が向上し、分化しやすく、細胞死が生じにくく、凝集体の内部が密な未分化性を維持した細胞凝集体を高効率で製造することができる。
本発明におけるフィーダー細胞非存在下(フィーダーフリー)とは、フィーダー細胞を実質的に含まない(例えば、全細胞数に対するフィーダー細胞数の割合が3%以下)条件を意味する。
「単離」とは、目的とする成分や細胞以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。従って、「単離されたタンパク質X」には、培養対象の細胞や組織から産生され細胞や組織及び培地中に含まれている内在性のタンパク質Xは包含されない。「単離されたタンパク質X」の純度(総タンパク質重量に占めるタンパク質Xの重量の百分率)は、通常70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、更に好ましくは99%以上、最も好ましくは100%である。
本発明は、一態様において、単離された未分化維持因子を提供する工程を含む。また、一態様において、工程(a)に用いる培地中へ、単離された未分化維持因子を外来的(又は外因的)に添加する工程を含む。あるいは、工程(a)に用いる培地に予め未分化維持因子が添加されていてもよい。
工程(a)におけるフィーダーフリー条件での多能性幹細胞の培養においては、フィーダー細胞に代わる足場を多能性幹細胞に提供するため、適切なマトリクスを足場として用いてもよい。足場であるマトリクスにより、表面をコーティングした細胞容器中で、多能性幹細胞を接着培養する。
培地中のTGFβシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。工程(a)におけるTGFβシグナル伝達経路阻害物質としてSB431542を用いる場合は、通常、約1nM~約100μM、好ましくは約10nM~約50μM、より好ましくは約100nM~約50μM、更に好ましくは約1μM~約10μMの濃度で使用される。また、SB431542以外のTGFβシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、前記濃度のSB431542と同等のTGFβシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
未分化条件で維持された多能性幹細胞、好ましくは工程(a)で得られた多能性幹細胞を、Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程について説明する。
本発明で用いられるWntシグナル伝達経路阻害物質は、非古典的Wnt経路(Non-Canonical Wnt pathway)に対する阻害活性を有することもまた好ましい。非古典的Wnt経路に対する阻害活性を有するWntシグナル伝達経路阻害物質としては例えばPORCN阻害剤、抗Frizzled抗体、Box5ペプチド等が挙げられる。Porcupineは古典的Wnt経路のリガンドであるWnt1やWnt3a等に加えて、非古典的Wnt経路のリガンドであるWnt5aやWnt5b、Wnt11の脂質修飾に関わることが知られており(Dev Biol. 2012 Jan 15;361(2):392-402.、Biochem J. 2007 Mar 15; 402(Pt 3): 515-523.)、PORCN阻害剤は古典的Wnt経路と非古典的Wnt経路の双方を阻害する。
培地中のWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。例えばWntシグナル伝達経路阻害物質としてPORCN阻害剤の1種であるIWP-2を用いる場合は、その濃度は通常約0.01μM~約30μM、好ましくは約0.1μM~約30μM、より好ましくは、約2μMである。PORCN阻害剤の1種であるWnt-C59を用いる場合は、その濃度は通常約1pM~約30μM、好ましくは約100pM~約30μM、より好ましくは、約1nM~約1μMである。TANK阻害剤の1種であるXAV939を用いる場合は、その濃度は通常約0.01μM~約30μM、好ましくは約0.1μM~約30μM、より好ましくは、約1μMである。KY-02111を用いる場合は、その濃度は通常約0.01μM~約30μM、好ましくは約0.1μM~約30μM、より好ましくは、約5μMである。
工程(1)において用いられるTGFβシグナル伝達経路阻害物質としては工程(a)で例示したものと同様のものが用いられる。工程(a)及び工程(1)のTGFβシグナル伝達経路阻害物質は同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
培地中のTGFβシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。工程(1)においてTGFβシグナル伝達経路阻害物質としてSB431542を用いる場合は、通常、約1nM~約100μM、好ましくは約10nM~約50μM、より好ましくは約100nM~約50μM、更に好ましくは約500nM~約10μMの濃度で使用される。また、SB431542以外のTGFβシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、前記濃度のSB431542と同等のTGFβシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
分散された細胞として、好ましくは 、8割以上が単一細胞であり、2~50細胞の塊が2割以下存在する状態が挙げられる。分散された細胞とは、細胞同士の接着(例えば面接着)がほとんどなくなった状態があげられる。一部の態様において、分散された細胞とは、細胞―細胞間結合(例えば、接着結合)がほとんどなくなかった状態が挙げられる。
工程(a)で得られた多能性幹細胞の分散操作は、前述した、機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤添加処理を含んでよい。これらの処理を組み合わせて行ってもよい。好ましくは、細胞保護剤添加処理と同時に、細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。
細胞保護剤添加処理に用いられる細胞保護剤としては、FGFシグナル伝達経路作用物質、ヘパリン、ROCK阻害物質、ミオシン阻害物質、血清、又は血清代替物を挙げることができる。好ましい細胞保護剤としては、ROCK阻害物質が挙げられる。分散により誘導される多能性幹細胞(特に、ヒト多能性幹細胞)の細胞死を抑制するために、Rho-associated coiled-coilキナーゼ(ROCK)の阻害物質を第一工程培養開始時から添加してもよい。ROCK阻害物質としては、Y-27632、Fasudil(HA1077)、H-1152、HA-100等を挙げることができる。あるいは、調製済みの細胞保護剤を用いることもできる。調製済みの細胞保護剤としては、例えばRevitaCell Supplement(Thermo Fisher Scientific社製)、CloneR(Stemcell Technologies社製)が挙げられる。
細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、DNase又はパパイン等の酵素類や、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤のいずれかを含む溶液を挙げることができる。市販の細胞分散液、例えば、TrypLE Select (Thermo Fisher Scientific社製)やTrypLE Express (Thermo Fisher Scientific社製)、Accumax(Innovative Cell Technologies社製)を用いることもできる。
機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。
分散された細胞は上記培地中に懸濁される。
ある時点で、特定の成分(例えば、分化誘導因子)を添加する場合、例えば、終濃度を計算した上で、元ある培地を半量程度捨てて、特定の成分を終濃度よりも高い濃度で含む新しい培地を半量程度加える操作(半量培地交換操作)を行ってもよい。
ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、例えば、培地交換操作を、1日に複数回、好ましくは1時間以内に複数回(例えば2~3回)行ってもよい。また、ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、細胞または凝集体を別の培養容器に移してもよい。
培地交換操作に用いる道具は特に限定されないが、例えば、ピペッター、ピペットマン、マルチチャンネルピペットマン、連続分注器、などが挙げられる。例えば、培養容器として96ウェルプレートを用いる場合、マルチチャンネルピペットマンを使ってもよい。
工程(1)で得られた細胞凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程、あるいは工程(1)で得られた細胞凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する第二工程(1)について説明する。
培地中のBMPシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。BMPシグナル伝達経路作用物質としてBMP4を用いる場合は、通常、約1pM~約100nM、好ましくは約10pM~約50nM、より好ましくは約10pM~約25nM、更に好ましくは約10pM~約5nMの濃度で使用される。また、BMP4以外のBMPシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、前記濃度のBMP4と同等のBMPシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
培地中のShhシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。工程(2)又は工程(2-1)においてShhシグナル伝達経路作用物質としてSAGを用いる場合は、通常、約1nM~約5μM、好ましくは約10nM~約4.5μM、より好ましくは約50nM~約4μM、更に好ましくは約100nM~約3μMの濃度で使用される。
工程(2-1)で得られた細胞凝集体を、さらにBMPシグナル伝達経路阻害物質を含む培地中で浮遊培養して、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程(2)について説明する。
培地中のShhシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。工程(2-2)においてShhシグナル伝達経路作用物質としてSAGを用いる場合は、通常、約1nM~約5μM、好ましくは約10nM~約4.5μM、より好ましくは約50nM~約4μM、更に好ましくは約100nM~約3μMの濃度で使用される。工程(2-1)においてBMPシグナル伝達経路作用物質を添加した後に、Shhシグナル伝達経路作用物質を添加する場合、Shhシグナル伝達経路作用物質の添加と工程(2-2)の開始を同時に行っても良い。
工程(2)、(2-1)及び(2-2)において用いられるTGFβシグナル伝達経路阻害物質としては工程(a)で例示したものと同様のものが用いられる。工程(a)、工程(1)、(2)、(2-1)及び(2-2)のTGFβシグナル伝達経路阻害物質は同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
培地中のTGFβシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。工程(2)、(2-1)及び(2-2)においてTGFβシグナル伝達経路阻害物質としてSB431542を用いる場合は、通常、約1nM~約100μM、好ましくは約10nM~約50μM、より好ましくは約100nM~約50μM、更に好ましくは約500nM~約10μMの濃度で使用される。また、SB431542以外のTGFβシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、前記濃度のSB431542と同等のTGFβシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
Notchシグナル阻害剤は、工程(1)において用いる培地に含まれていても良い。
本発明は、1)神経系細胞又は神経組織、2)下垂体組織、及び3)間葉系細胞を含む細胞塊を提供する。またあるいは、1)神経系細胞又は神経組織、2)下垂体組織、及び4)神経提細胞又は神経提由来細胞を含む細胞塊を提供する。以下、本発明の細胞塊とも称する。本発明の細胞塊は、好ましくは上記した本発明の製造方法により製造することができる。
前記非神経上皮組織が口腔上皮またはその前駆組織であることもまた好ましい。下垂体組織は下垂体ホルモン産生細胞を含むことが好ましく、下垂体組織幹細胞を含むことが好ましく、濾胞星状細胞を含むことが好ましく、下垂体ホルモン産生細胞、下垂体組織幹細胞、濾胞星状細胞すべてを含むことがさらに好ましい。下垂体ホルモン産生細胞としては、例えば成長ホルモン(GH)産生細胞、プロラクチン(PRL)産生細胞及び副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)産生細胞からなる群から選ばれる少なくとも1種が挙げられる。
下垂体組織中に下垂体ニッチが形成されていることもまた好ましく、下垂体ニッチが下垂体前葉と中葉の間に残る遺残腔周辺のMCLニッチ様の構造であることもまた好ましく、下垂体ニッチが実質層ニッチ様の構造であることもまた好ましく、MCLニッチ様の構造と実質層ニッチ様の構造をともに含むことがさらに好ましい。
3)間葉系細胞は、細胞塊の表面を被覆している非神経上皮組織と、細胞塊の内側に存在する1)神経系細胞又は神経組織との間に存在することが好ましい。
4)神経提細胞又は神経提由来細胞は、細胞塊の表面を被覆している非神経上皮組織と、細胞塊の内側に存在する1)神経系細胞又は神経組織との間に存在することが好ましい。4)神経提細胞又は神経提由来細胞は、3)間葉系細胞であることもまた好ましい。
本発明の細胞塊に含まれる3)神経提細胞又は神経提由来細胞は、例えば、Nestin、Sox10、Slug、Snail、Pax3、Zic1、FoxD3、p75 NTR、HNK-1、CHD7、Numb、Ascl1からなる群から選ばれる少なくとも1種の神経提細胞マーカーを発現する。
本発明に含まれうる非神経上皮組織は、例えば、サイトケラチン、E-Cadherin及びEpCAMからなる群から選ばれる少なくとも1種の非神経上皮組織マーカーを発現する。
本発明の細胞塊に含まれうる下垂体組織幹細胞は、例えばSox2、Sox9、E-Cadherin、Nestin、S100β、GFRα2、Prop1、CD133、β-Catenin、Klf4、Oct4、Pax6、コクサッキーウイルス・アデノウイルス共通受容体(CXADR)、PRRX1/2、Ephrin-B2及びACEからなる群から選ばれる少なくとも1種の下垂体幹細胞マーカーを発現する。
本発明は、下垂体組織の製造方法を提供し、該方法は下記工程(1)~(3)を含む。
(1)多能性幹細胞を、Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
(2)第一工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程、
(3)第二工程で得られた細胞塊から下垂体組織を回収する第三工程。
第一工程及び第二工程は、上記、「2.下垂体組織を含む細胞塊の製造方法」の第一工程及び第二工程と同様にして実施することができる。また、所望により第一工程の前にa工程を実施してもよい。あるいは、所望により第二工程の代わりに第二工程(1)及び第二工程(2)を実施してもよい。
第二工程又は第二工程(2)で得られた細胞塊から下垂体組織を回収する第三工程は、通常、顕微鏡観察下でピンセット等を用い、細胞塊の外側(ラトケ嚢部分)に形成される下垂体組織を剥離・回収することによっておこなわれる。下垂体組織は、例えばNature communications,2016,7.に記載されているように、得られた細胞塊の表層にある半透明な薄い上皮として判別することができる。第三工程における下垂体組織の回収方法として、凍結融解、好ましくは緩慢凍結法を用いることもできる。当該方法は、外側に下垂体組織及び内側に間葉系神経や神経上皮組織を有する細胞塊を凍結融解することで物理的処理を施すことなく外側の下垂体組織が細胞塊から剥離されるというものである。
本発明の細胞塊、本発明の製造方法により製造される細胞塊、又は該細胞塊から回収される組織は、下垂体組織であり得る。従って、本発明の細胞塊、本発明の製造方法により製造される細胞塊又は該細胞塊から回収される下垂体組織を含有してなる、被験物質の毒性・薬効性評価用試薬が提供され得る。
また、本発明は、上述の細胞塊又は該細胞塊から回収される下垂体組織を用いて、毒性・薬効評価方法を提供することができる。
例えば、細胞塊又は該細胞塊から回収される下垂体組織と、被験物質とを接触させる工程と、
該被験物質が該細胞塊又は下垂体組織に及ぼす影響を検定する工程とを含む、被験物質の毒性・薬効評価方法が挙げられる。
本発明の細胞塊、本発明の製造方法により製造される細胞塊又は該細胞塊から回収される下垂体組織を含有してなる、下垂体の障害に基づく疾患の治療薬が提供され得る。
下垂体の障害に基づく疾患の治療薬としては、例えば本発明の細胞塊もしくは本発明の製造方法により製造される細胞塊を含む懸濁液を含む移植片が挙げられる。
懸濁液としては、例えば細胞塊を人工涙液または生理食塩水に懸濁した液が挙げられる。懸濁液は、細胞塊から単離された非神経上皮細胞を含んでいてもよく、細胞の接着を促進する因子、例えば細胞外基質やヒアルロン酸等を含んでいてもよい。
細胞塊に替えて細胞塊から回収した下垂体組織を用いてもよい。
前記下垂体の障害に基づく疾患は、下垂体の障害に基づく動物の疾患であってよく、下垂体の障害に基づく非ヒト動物の疾患であってよい。下垂体の障害に基づく疾患としては、具体的には、汎下垂体機能低下症、下垂体性小人症、副腎皮質機能低下症、部分的下垂体機能低下症、下垂体前葉ホルモン単独欠損症などが挙げられる。
ヒトES細胞(KhES-1株、京都大学より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作としては、まずサブコンフレントになったヒトES細胞(KhES-1株)を、PBSにて洗浄後、Accumax(Innovative Cell Technologies社製)を用いて酵素処理を行った後、StemFit培地を添加しセルスクレーパーを用いて培養ディッシュ表面より細胞を剥がし、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。その後、前記単一細胞へ分散されたヒトES細胞を、Laminin511-E8にてコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Y27632(ROCK阻害物質、和光純薬社製、10 μM)存在下、StemFit培地にてフィーダーフリー培養した。前記プラスチック培養ディッシュとして、6ウェルプレート(Corning社製、細胞培養用、培養面積9.5 cm2)を用いた場合、前記単一細胞へ分散されたヒトES細胞の播種細胞数は1.2×104とした。播種した1日後に、Y27632を含まないStemFit培地に全量培地交換した。以降、1日~2日に一回Y27632を含まないStemFit培地にて全量培地交換した。その後、播種した7日後にサブコンフレント(培養面積の6割が細胞に覆われる程度)になるまで培養した。培養した細胞を分化誘導に用いる際には、播種した6日後にStemfit培地の培地交換と同時にSB-431542(TGFβシグナル伝達経路阻害物質、和光純薬社製、5μM)とSAG(Shhシグナル伝達経路作用物質、Enzo Life Sciences社製、300nM)を添加した。
浮遊培養開始後2日目にY27632を含まず、IWP-2、SB-431542、BMP4(BMPシグナル伝達経路作用物質)、SAGを含む無血清培地を1ウェルあたり100μl加えた。BMP4は添加する培地に3nM添加し、ウェル中の終濃度を1.5nMとし、SAGは添加する培地に4μM添加し、ウェル中の終濃度を2μMとなるようにした。その後、浮遊培養開始後6、10、13、17、21及び24日目にY27632とBMP4を含まず、IWP-2、SB-431542とSAGを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。
浮遊培養開始後28日目に細胞塊をディッシュに回収し、倒立顕微鏡(キーエンス社製、BIOREVO)を用いて、明視野観察を行った(図1A-B)。図1A右下のスケールバーは1000μm、図1B右下のスケールバーは200μmを示す。その結果、上記分化誘導法によりヒトES細胞から浮遊培養28日目までに神経組織及び非神経上皮組織を含む直径約1mm前後の細胞塊が形成された。細胞塊の表面には厚さ30μm前後の上皮様の構造が形成されていた。
ヒトES細胞(KhES-1株、京都大学より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作としては、実施例1と同様に行った。
浮遊培養開始後28日目に細胞塊を10cm浮遊培養用ディッシュ(住友ベークライト社製)へとディッシュ1枚あたり48個の細胞塊を移し、無血清培地を用いて培養84日目まで浮遊培養を実施した。その際の無血清培地(gfCDM+KSR)には、F-12+Glutamax培地(Thermo Fisher Scientific社製)とIMDM+Glutamax培地(Thermo Fisher Scientific社製)の1:1混合液に10% Knockout Serum Replacement(Thermo Fisher Scientific社製)、450μM 1-モノチオグリセロール(和光純薬社製)、1x Chemically defined lipid concentrate(Thermo Fisher Scientific社製)、50 unit/mlペニシリン-50μg/mlストレプトマイシン(ナカライテスク社製)、2μM SAGを添加した無血清培地をディッシュ1枚あたり15ml用い、3日乃至4日に一回半量の培地を交換した。
さらに、Dexamethasoneを添加して14日間培養した浮遊培養開始後84日目の細胞塊には、下垂体のホルモン産生細胞マーカーであるPRL陽性の細胞とGH陽性の細胞がそれぞれ存在していた(図2E、H)。これらの結果から、上記分化誘導法によりヒト多能性幹細胞から下垂体のホルモン産生細胞が分化誘導されたことが分かった。
ヒトES細胞(KhES-1株、京都大学より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作は、実施例1と同様に実施した。
浮遊培養期間中にBMPシグナル伝達経路作用物質を添加しない条件をコントロールとした(-BMP4条件、図3A)。その後、浮遊培養開始後1、2または3日目にBMPシグナル伝達経路作用物質を添加する条件(Day1~3+BMP4条件、図3B~D)では、Y27632を含まず、IWP-2、SB-431542、BMP4を含む無血清培地を1ウェルあたり100μl加えた。BMP4は添加する培地に3nM添加し、ウェル中の終濃度が1.5nMとなるようにした。浮遊培養開始後6日目にY27632とBMP4を含まず、IWP-2とSB-431542を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。浮遊培養開始後10日目に、倒立顕微鏡(キーエンス社製、BIOREVO)を用いて、明視野観察を行った(図3A-D)。図3A-D右下のスケールバーは、200μmを示す。
ヒトES細胞(KhES-1株、京都大学より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作は、実施例1と同様に実施した。
培地を添加することなく浮遊培養開始後2日目及び3日目に倒立顕微鏡を用いて、凝集体の明視野観察を行った。図4A右下のスケールバーは、200μmを示す。観察の結果、BMP4の添加に好ましい時期である浮遊培養開始後2日目の凝集体は表面に凹凸がみられ、歪な形状であった(図4A)。一方で、浮遊培養開始後3日目の凝集体は2日目に見られた凹凸が減少し、球体に近い形状を呈していた(図4B)。
ヒトES細胞(KhES-1株、京都大学より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作は、実施例1と同様に実施した。
浮遊培養開始後2日目にY27632を含まず、IWP-2、SB-431542、BMP4、SAGを含む無血清培地を1ウェルあたり100μl加えた。BMP4は添加する培地に3nM添加し、ウェル中の終濃度が1.5nMとなるようにし、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAGを終濃度が100、300、500、700nM、1、2、5μMの各濃度条件となるよう添加した。浮遊培養期間中にソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しない条件をコントロールとした(-SAG条件、図5A)。
浮遊培養開始後6、10、13、17、21、24日目にY27632とBMP4を含まず、IWP-2、SB-431542と各濃度のSAGを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。
浮遊培養開始後28日目に、倒立顕微鏡(キーエンス社製、BIOREVO)を用いて、明視野観察を行った(図5A-H)。図5A右下のスケールバーは、1000μmを示す。
ヒトES細胞(KhES-1株)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。具体的な維持培養操作としては、実施例1と同様に行った。
培養した細胞を分化誘導する前処理として、播種した6日後にStemfit培地の培地交換と同時に何も添加しない条件(Control)、300nM SAGのみを添加した条件(+300nM SAG)、5μM SB-431542のみを添加した条件(+5μM SB-431542)、SAG とSB431542を同時に添加した条件(+SAG/SB)の4条件の細胞を維持培養した。
浮遊培養開始後28日目に、倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った(図6A-D)。図6A右下のスケールバーは、1000μmを示す。その結果、浮遊培養前に化合物(SAG及び/又はSB431542)を添加しない条件では、形成された細胞塊が小さく、外側の非神経上皮組織と内側の神経上皮組織の間に間葉系細胞が確認できなかった(図6A)。300nM SAGのみで処理した条件では、無添加条件と比較して細胞塊が大きくなり、間葉系細胞の存在も確認できた(図6B)。5μM SB-431542のみを添加した条件及びSAG とSB431542を同時に添加した条件ではさらに大きな下垂体組織を含む細胞塊が形成された(図6C、D)。
上記の結果から、浮遊培養開始前に化合物処理を実施することで下垂体組織を含む細胞塊の形成効率が向上し、さらにその条件として5μM SB-431542のみを添加した条件(+5μM SB-431542)およびSAG とSB431542を同時に添加した条件(+SAG/SB)が好ましいことが分かった。
ヒトES細胞(KhES-1株)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作としては、実施例1と同様に行った。
浮遊培養開始後2日目にY27632を含まず、各Wntシグナル伝達経路阻害物質、SB-431542、BMP4、SAGを含む無血清培地を1ウェルあたり100μl加えた。BMP4は添加する培地に3nM添加し、ウェル中の終濃度を1.5nMとし、SAGは添加する培地に4μM添加し、ウェル中の終濃度を2μMとなるようにした。
浮遊培養開始後6、10、13、17、21、24日目にY27632とBMP4を含まず、各Wntシグナル伝達経路阻害物質、SB-431542およびSAGを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。上記条件に加えて、浮遊培養中にSB431542とWntシグナル伝達経路阻害物質を両方とも加えない条件も実施した。
浮遊培養開始後28日目に、倒立顕微鏡(キーエンス社製、BIOREVO)を用いて、明視野観察を行った(図7A~H)。図7A右下のスケールバーは、1000μmを示す。
ヒトES細胞(KhES-1株、京都大学より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作としては、実施例1と同様に行った。
その後、実施例1と同様の条件で、96ウェルプレートでの浮遊培養を開始した。
浮遊培養開始後2日目にY27632を含まず、IWP-2、SB-431542、BMP4、SAGを含む無血清培地を1ウェルあたり100μl加えた。その際に、BMP4の添加量は0.5nM 、1.5nM、5nM 及び無添加コントロールの4条件とした。BMP4は添加する培地に設定した条件の2倍の濃度で添加し、ウェル中の終濃度が設定した条件となるようにした。SAGは添加する培地に4μM添加し、ウェル中の終濃度を2μMとなるようにした。
浮遊培養開始後6、10、13、17、21及び24日目にY27632とBMP4を含まず、IWP-2、SB-431542およびSAGを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。
浮遊培養開始後28日目に、倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った(図8A~D)。図8A右下のスケールバーは、1000μmを示す。
ヒトES細胞(KhES-1株)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作としては、実施例1と同様に行った。
その後、浮遊培養開始時に添加するTGFβシグナル伝達経路阻害物質の濃度及び種類を変更する以外は実施例1と同様の条件で、96ウェルプレートでの浮遊培養を実施した。その際のTGFβシグナル伝達経路阻害物質として、SB431542(1 or 10μM)、A 83-01(Cayman Chemicals社製、1 or 10μM)、RepSox(Cayman Chemicals社製、1μM)を各濃度条件で添加した。
その後、浮遊培養開始後2日目にY27632を含まず、IWP-2、各TGFβシグナル伝達経路阻害物質、BMP4、SAGを含む無血清培地を1ウェルあたり100μl加えた。BMP4は添加する培地に3nM添加し、ウェル中の終濃度を1.5nMとし、SAGは添加する培地に4μM添加し、ウェル中の終濃度を2μMとなるようにした。
浮遊培養開始後6、10、13、17、21、24日目にY27632とBMP4を含まず、IWP-2、各TGFβシグナル伝達経路阻害物質およびSAGを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。上記条件に加えて、浮遊培養中にTGFβシグナル伝達経路阻害物質とIWP-2を両方とも加えない条件、及びIWP-2を加え、TGFβシグナル伝達経路阻害物質を加えない条件も実施した。
ヒトiPS細胞(201B7株、iPSアカデミアジャパンより入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作としては、実施例1と同様に実施した。
その後、実施例1と同様の条件で、96ウェルプレートでの浮遊培養を実施した。
浮遊培養開始後2日目にY27632を含まず、IWP-2、SB-431542、SAG、BMP4を含む無血清培地を1ウェルあたり100μl加えた。BMP4は添加する培地に3nM添加し、ウェル中の終濃度を1.5nMとし、SAGは添加する培地に4μM添加し、ウェル中の終濃度を2μMとなるようにした。
浮遊培養開始後6、10、13、17、21、24日目にY27632とBMP4を含まず、IWP-2、SB-431542及びSAGを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。
浮遊培養開始後28日目に倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った(図10A、B)。図10A右下のスケールバーは1000μm、図10B右下のスケールバーは200μmを示す。その結果、実施例1にてヒトES細胞株KhES-1から作製した際と同様に、ヒトiPS細胞株201B7から中心部の神経組織を非神経上皮組織が取り巻く細胞塊が形成されていることが分かった。
上記培養28日目の細胞塊を実施例1と同様の方法で固定し、凍結切片を作成した。これらの凍結切片に関し、下垂体の初期マーカーである抗Lhx3抗体、口腔上皮・下垂体プラコードマーカーである抗Pitx2抗体(R&D Systems社製、ヒツジ)、非神経上皮・プラコードマーカーである抗Six1抗体(Atlas Antibodies社製、ウサギ)、腹側間脳マーカーである抗Nkx2.1抗体、未分化神経およびプラコードマーカーであるSox2抗体、終脳およびプラコードマーカーであるBf1抗体(タカラバイオ社製、ウサギ)、非神経上皮組織マーカーである抗CD326/EpCAM抗体(R&D Systems社製、ヤギ)、抗汎サイトケラチン抗体、抗E-Cadherin抗体(Santa Cruz Biotechnology社製、マウス)未分化神経及び神経堤・間葉系細胞マーカーである抗Nestin抗体、神経細胞マーカーである抗βIIIチューブリン(Tuj1)抗体、間葉系細胞マーカーである抗Vimentin抗体(R&D Systems社製、ヤギ)を用いて蛍光免疫染色を行った。蛍光標識二次抗体として実施例1で用いたものに加えAlexa647標識ロバ抗ヤギ抗体(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて多重染色を行い、核の対比染色にはHoechst33342を用いた。図10Fは図10C、D、E、図10Jは図10G、H、I、図10Nは図10K、L、M、図10Rは図10O、P、Qに対する核の対比染色像である。染色した切片の観察および画像の取得には正立蛍光顕微鏡Axio Imager M2(ツァイス社製)および附属ソフトウェアのAxio Visionを用いた。図10C右下のスケールバーは200μm、図10O右下のスケールバーは100μmを示す。
ヒトiPS細胞(HC-6#10株、理化学研究所より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作としては、実施例1と同様に実施した。
浮遊培養開始後2日目にY27632を含まず、SB-431542、IWP-2、BMP4(BMPシグナル伝達経路作用物質)及び各設定条件のCHIR99021を含む無血清培地を1ウェルあたり100μl加えた。BMP4は添加する培地に3nM添加し、ウェル中の終濃度を1.5nMとした。非神経上皮及びプラコードを含む細胞塊を誘導するための手法として、浮遊培養開始後3日目にY27632とBMP4を含まず、IWP-2、SB-431542、K02288(BMPシグナル伝達経路阻害物質、AdooQ Bioscience社製)、FGF2-TS(FGFシグナル伝達経路作用物質、HumanZyme社製)及びHeparin Sodium(富士フィルム和光純薬社製)を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。K02288、FGF2とHeparin Sodiumは添加する培地にそれぞれ2μM、40ng/ml、20μg/ml添加し、ウェル中の終濃度が1μM、20ng/ml、10μg/mlとなるようにした。浮遊培養開始後6日目、10日目に半量培地交換を行った。
浮遊培養開始後13日目に倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った(図11A~D)。図11A右下のスケールバーは1000μmを示す。その結果、実施例1にてヒトES細胞株KhES-1から作製した際と同様に、ヒトiPS細胞株HC-6#10株から中心部の神経組織を非神経上皮組織が取り巻く細胞塊が形成されていることが分かった。また、浮遊培養開始後3日目にBMPシグナル伝達経路阻害物質とFGFシグナル伝達経路作用物質を添加しても非神経上皮組織が表面に形成されることが分かった。さらに、Wntシグナル伝達経路阻害物質であるIWP-2存在下でも、Wntシグナル伝達経路作用物質であるCHIR99021は作用し、濃度依存的に細胞塊が大きくなる一方で、3μM CHIR99021添加条件では細胞塊表面の非神経上皮組織形成が阻害されていることが分かった。
上記培養13日目の細胞塊を実施例1と同様の方法で固定し、凍結切片を作成した。これらの凍結切片に関し、非神経上皮・プラコードマーカーである抗Six1抗体、中枢神経系・プラコードマーカーである抗Dlx5抗体(Atlas Antibodies社製、ウサギ)、抗E-Cadherin抗体(R&D Systems社製、ヤギ)、抗N-Cadherin抗体(BD Biosciences社製、マウス)を用いて蛍光免疫染色を行った(図11E~P、図12Q~AB)。染色した切片の観察および画像の取得には正立蛍光顕微鏡Axio Imager M2(ツァイス社製)および附属ソフトウェアのAxio Visionを用いた。図11E、H、K、N、図12Q、T、W、Z右下のスケールバーは100μmを示す。
ヒトiPS細胞(HC-6#10株、理化学研究所より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作としては、実施例1と同様に実施した。
浮遊培養開始後2日目にY27632を含まず、SB-431542、IWP-2、CHIR99021、BMP4(BMPシグナル伝達経路作用物質)、SAG(Shhシグナル伝達経路作用物質)を含む無血清培地を1ウェルあたり100μl加えた。BMP4は添加する培地に3nM添加し、ウェル中の終濃度を1.5nMとした。SAGは添加する培地に1.4μM添加し、ウェル中の終濃度を700nMとなるようにした。
浮遊培養開始後6、10、13日目にY27632、BMP4を含まず、SAG、SB-431542、IWP-2、CHIR99021を同濃度含む無血清培地で半量培地交換を行った。浮遊培養開始後17、21、24日目にSAG、SB-431542、IWP-2、CHIR99021に加えて形成されたプラコード前駆組織をさらに成長させる目的でFGF2-TS(FGFシグナル伝達経路作用物質、HumanZyme社製、20ng/ml)、ヘパリンナトリウム(FGF安定化剤、富士フイルム和光純薬社製、10μg/ml)を含む無血清培地で半量培地交換を行った。
浮遊培養開始後28日目に倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った(図13A)。図11A右下のスケールバーは1000μmを示す。その結果、実施例1にてヒトES細胞株KhES-1から作製した際と同様に、SAGを添加した条件においてヒトiPS細胞株HC-6#10株から中心部の神経組織を非神経上皮組織が取り巻く細胞塊が形成されていることが分かった。
上記培養28日目の細胞塊を実施例1と同様の方法で固定し、凍結切片を作成した。これらの凍結切片に関し、Lhx3、Nkx2.1、E-Cadherin、Nestin、Pitx2、Sox2、Six1、Vimentin、Rx、N-Cadherin、Tbx3、汎サイトケラチンに対する抗体を用いて実施例1と同様の方法で蛍光免疫染色を行った(図13B~I、図14J~V)。図13E、I、図14M、P、S、Vは同行の免疫染色像に対する細胞核の対比染色像である。
ヒトiPS細胞(HC-6#10株、理化学研究所より入手)を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作としては、実施例1と同様に実施した。
浮遊培養開始後2日目にY27632を含まず、SB-431542、IWP-2、CHIR99021、BMP4(BMPシグナル伝達経路作用物質)、SAG(Shhシグナル伝達経路作用物質)を含む無血清培地を1ウェルあたり100μl加えた。BMP4は添加する培地に3nM添加し、ウェル中の終濃度を1.5nMとした。SAGは添加する培地に1.4μM添加し、ウェル中の終濃度を700nMとなるようにした。浮遊培養開始後3、6、10、13日目にY27632、BMP4を含まず、SAG、SB-431542、IWP-2、CHIR99021を同濃度含む無血清培地で半量培地交換を行った。また、その際に浮遊培養開始後3、6、10日目のいずれかの時点でK02288(BMPシグナル伝達経路阻害物質、Adooq BioScience社製、300nM)を半量培地交換時に添加する条件、およびコントロールとして溶媒のDMSOを添加した4条件を設定した。K02288は添加する培地に600nM添加し、ウェル中の終濃度を300nMとした。浮遊培養開始後17、21、24日目にSAG、SB-431542、IWP-2、CHIR99021、K02288に加えて形成されたプラコード前駆組織をさらに成長させる目的で終濃度が20ng/ml FGF2-TS、10μg/mlヘパリンナトリウムとなる無血清培地で半量培地交換を行った。浮遊培養開始後28日目に倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った(図15A~D)。図15A右下のスケールバーは1000μmを示す。その結果、K02288無添加のコントロールに加えて、浮遊培養開始後3、6、10日目のいずれかの時点でK02288を添加した条件でも、中心部の神経組織を非神経上皮組織が取り巻く細胞塊が形成されていることが分かった。
さらに、浮遊培養開始後6日目にK02288を添加し分化誘導した上記培養28日目の細胞塊を実施例1と同様の方法で固定し、凍結切片を作成した。これらの凍結切片に関し、Lhx3、Nkx2.1、E-Cadherin、Nestin、Pitx2、Sox2、Six1、Vimentin、Rx、N-Cadherin、Tbx3、汎サイトケラチンに対する抗体を用いて実施例1と同様の方法で蛍光免疫染色を行った(図15E~L、図16M~Y)。図15H、L、図16P、S、V、Yは同行の免疫染色像に対する細胞核の対比染色像である。
その結果、ヒトiPS細胞株HC-6#10株より上記BMPシグナル伝達経路作用物質を添加して一定期間後にBMPシグナル伝達経路阻害物質を添加する分化誘導法で誘導された浮遊培養開始後28日目の細胞塊の内側はNkx2.1、Sox2、Tbx3、Rx、N-Cadherin陽性の腹側間脳・視床下部の神経上皮組織が存在し、外側は汎サイトケラチン、E-Cadherin、Pitx2陽性の口腔の非神経上皮組織であることが分かった。さらに、非神経上皮組織の一部はLhx3、Six1、Sox2陽性であり、非神経上皮組織が陥入しているラトケ嚢様の構造と下垂体プラコードが形成されていることが分かった。加えて、外側の非神経上皮組織と内側の神経上皮組織の間に、Nestin、Vimentin陽性、汎サイトケラチン弱陽性の頭部間葉系細胞が存在していた。さらに、BMPシグナル伝達経路阻害物質を添加することにより、細胞塊表面における下垂体プラコードマーカーLhx3陽性細胞の割合が極めて高い細胞塊を得ることができた。
上記の結果より、ヒトiPS細胞からBMPシグナル伝達経路作用物質を添加して一定期間後にBMPシグナル伝達経路阻害物質を添加する分化誘導条件により、非神経上皮の一部に形成される下垂体プラコードの割合を高めることができることが示された。
本出願は、日本で出願された特願2017-226312(出願日:2017年11月24日)を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (18)
- 下記工程(1)及び(2)を含む、ヒト下垂体組織を含む細胞塊の製造方法;
(1)多能性幹細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
(2)第一工程で得られた凝集体を、前記第一工程の浮遊培養開始時から0.5時間以降、72時間以内に、10pM~5nMのBMP4に相当するBMPシグナル伝達経路促進活性を示す濃度のBMPシグナル伝達経路作用物質及び、100nM~3μMのSAGに相当するソニック・ヘッジホッグシグナル伝達促進活性を有する濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、ヒト下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程、
ここにおいて、Wntシグナル伝達経路阻害物質は、Purcupine阻害剤(PORCN阻害剤)、DKK阻害剤、Frizzled阻害剤、Dvl阻害剤、Tankyrase阻害剤(TANK阻害剤)、カゼインキナーゼ1阻害剤、カテニン応答性転写阻害剤、p300阻害剤、CBP阻害剤及びBCL-9阻害剤から選択され、
BMPシグナル伝達経路作用物質は、BMP2、BMP4、BMP7及びGDF7から選択され、
ソニック・ヘッジホッグシグナル伝経路作用物質は、Hedgehogファミリーに属するタンパク質、Shh受容体、Shh受容体アゴニスト、Smoアゴニスト、Purmorphamine、GSA-10、Hh-AG1.5、20(S)-Hydroxycholesterol及びSAGから選択される。 - 下記工程(a)、(1)及び(2)を含む、ヒト下垂体組織を含む細胞塊の製造方法;
(a)多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1)1nM~100μMのSB431542に相当するTGFβシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度のTGFβシグナル伝達経路阻害物質及び/又は10nMから700nMのSAGに相当するソニック・ヘッジホッグシグナル伝達促進活性を有する濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに2)未分化維持因子を含む培地で2時間~96時間培養するa工程、
(1)a工程で培養された多能性幹細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
(2)第一工程で得られた凝集体を、前記第一工程の浮遊培養開始時から0.5時間以降、72時間以内に、10pM~5nMのBMP4に相当するBMPシグナル伝達経路促進活性を示す濃度のBMPシグナル伝達経路作用物質及び、100nM~3μMのSAGに相当するソニック・ヘッジホッグシグナル伝達促進活性を有する濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、ヒト下垂体組織を含有する細胞塊を得る第二工程、
ここにおいて、未分化維持因子として少なくともbFGFを含み、
TGFβシグナル伝達経路阻害物質が、Alk5/TGFβR1阻害剤又はSMAD3阻害剤であり、
Wntシグナル伝達経路阻害物質は、Purcupine阻害剤(PORCN阻害剤)、DKK阻害剤、Frizzled阻害剤、Dvl阻害剤、Tankyrase阻害剤(TANK阻害剤)、カゼインキナーゼ1阻害剤、カテニン応答性転写阻害剤、p300阻害剤、CBP阻害剤及びBCL-9阻害剤から選択され、
BMPシグナル伝達経路作用物質は、BMP2、BMP4、BMP7及びGDF7から選択され、
ソニック・ヘッジホッグシグナル伝経路作用物質は、Hedgehogファミリーに属するタンパク質、Shh受容体、Shh受容体アゴニスト、Smoアゴニスト、Purmorphamine、GSA-10、Hh-AG1.5、20(S)-Hydroxycholesterol及びSAGから選択される。 - 下記工程(1)、(2-1)及び(2-2)を含む、ヒト下垂体組織を含む細胞塊の製造方法;
(1)多能性幹細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
(2-1)第一工程で得られた凝集体を、前記第一工程の浮遊培養開始時から0.5時間以降、72時間以内に、10pM~5nMのBMP4に相当するBMPシグナル伝達経路促進活性を示す濃度のBMPシグナル伝達経路作用物質、及び100nM~3μMのSAGに相当するソニック・ヘッジホッグシグナル伝達促進活性を有する濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養する第二工程(1)、
(2-2)第二工程(1)で浮遊培養された凝集体を、前記第二工程(1)の浮遊培養開始時から12時間以降、20日以内に、BMPシグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、ヒト下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程(2)、
ここにおいて、Wntシグナル伝達経路阻害物質は、Purcupine阻害剤(PORCN阻害剤)、DKK阻害剤、Frizzled阻害剤、Dvl阻害剤、Tankyrase阻害剤(TANK阻害剤)、カゼインキナーゼ1阻害剤、カテニン応答性転写阻害剤、p300阻害剤、CBP阻害剤及びBCL-9阻害剤から選択され、
BMPシグナル伝達経路作用物質は、BMP2、BMP4、BMP7及びGDF7から選択され、
ソニック・ヘッジホッグシグナル伝経路作用物質は、Hedgehogファミリーに属するタンパク質、Shh受容体、Shh受容体アゴニスト、Smoアゴニスト、Purmorphamine、GSA-10、Hh-AG1.5、20(S)-Hydroxycholesterol及びSAGから選択され、
BMPシグナル伝達経路阻害物質が、I型BMP受容体阻害剤である。 - 下記工程(a)、(1)、(2-1)及び(2-2)を含む、ヒト下垂体組織を含む細胞塊の製造方法;
(a)多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1)TGFβシグナル伝達経路阻害物質及び/又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに2)未分化維持因子を含む培地で培養するa工程、
(1)a工程で培養された多能性幹細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
(2-1)第一工程で得られた凝集体を、前記第一工程の浮遊培養開始時から0.5時間以降、72時間以内に、10pM~5nMのBMP4に相当するBMPシグナル伝達経路促進活性を示す濃度のBMPシグナル伝達経路作用物質及び、100nM~3μMのSAGに相当するソニック・ヘッジホッグシグナル伝達促進活性を有する濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養する第二工程(1)、
(2-2)第二工程(1)で浮遊培養された凝集体を、前記第二工程(1)の浮遊培養開始時から12時間以降、20日以内に、BMPシグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、ヒト下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程(2)、
ここにおいて、未分化維持因子として少なくともbFGFを含み、
TGFβシグナル伝達経路阻害物質が、Alk5/TGFβR1阻害剤又はSMAD3阻害剤であり、
Wntシグナル伝達経路阻害物質は、Purcupine阻害剤(PORCN阻害剤)、DKK阻害剤、Frizzled阻害剤、Dvl阻害剤、Tankyrase阻害剤(TANK阻害剤)、カゼインキナーゼ1阻害剤、カテニン応答性転写阻害剤、p300阻害剤、CBP阻害剤及びBCL-9阻害剤から選択され、
BMPシグナル伝達経路作用物質は、BMP2、BMP4、BMP7及びGDF7から選択され、
ソニック・ヘッジホッグシグナル伝経路作用物質は、Hedgehogファミリーに属するタンパク質、Shh受容体、Shh受容体アゴニスト、Smoアゴニスト、Purmorphamine、GSA-10、Hh-AG1.5、20(S)-Hydroxycholesterol及びSAGから選択され、
BMPシグナル伝達経路阻害物質が、I型BMP受容体阻害剤である。 - 前記工程(2)又は工程(2-1)におけるBMPシグナル伝達経路作用物質が、前記工程(1)で形成された凝集体の表層の細胞の1割以上が密着結合して形成している期間内に添加されることを特徴とする請求項1~4のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記Wntシグナル伝達経路阻害物質がPORCN阻害剤、TANK阻害剤、KY-02111又はKY-03-01である、請求項1~5のいずれか一項に記載の製造方法。
- PORCN阻害剤がIWP-2、IWP-3、IWP-4、IWP-L6、IWP-12、LGK-974、Wnt-C59、ETC-159、GNF-6231からなる群から選ばれる少なくとも1種の化合物であり、TANK阻害剤がIWR1-endo、XAV939及びMN-64からなる群から選ばれる少なくとも1種の化合物である、請求項6に記載の製造方法。
- ソニック・ヘッジホッグシグナル伝経路作用物質が、SAG、Purmorphamine及びGSA-10からなる群から選ばれる少なくとも1種の化合物である、請求項1~7のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記工程(1)、(2)、(2-1)及び(2-2)における浮遊培養が、さらにAlk5/TGFβR1阻害剤の存在下で行われることを特徴とする請求項1~8のいずれか一項に記載の製造方法。
- Alk5/TGFβR1阻害剤が、SB431542、SB505124、SB525334、LY2157299、GW788388、LY364947、SD-208、EW-7197、A 83-01及びRepSoxからなる群から選ばれる少なくも1種の化合物であり、SMAD3阻害剤がSIS3である、請求項2及び請求項4~8のいずれか一項に記載の製造方法。
- I型BMP受容体阻害剤が、K02288、Dorsomorphine、LDN-193189、LDN-212854、LDN-214117、ML347、DMH1及びDMH2からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む請求項3~9のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記工程(1)、(2)、(2-1)及び(2-2)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程がFGF2、FGF8及びこれらの改変体からなる群より選ばれる少なくとも一つを含むFGFシグナル伝達経路作用物質の存在下で実施されることを特徴とする、請求項1~11のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記工程(1)、(2)、(2-1)及び(2-2)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程がWntシグナル伝達経路作用物質の存在下で実施されることを特徴とする、請求項1~12のいずれか一項に記載の製造方法、
ここにおいて、Wntシグナル伝達経路作用物質が、古典的Wnt経路を活性化させる物質である。 - 前記古典的Wnt経路を活性化させる物質が、GSK3阻害剤である、請求項13に記載の製造方法。
- GSK3阻害剤がCHIR99021、CHIR98014、TWS119、SB216763、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、IM-12、Indirubin、Bikinin、A 1070722、3F8、Kenpaullone、10Z-Hymenialdisine、Indirubin-3’-oxime、NSC 693868、TC-G 24、TCS 2002、TCS 21311、CP21R及びこれら化合物の誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、請求項14に記載の製造方法。
- 前記工程(1)、(2)、(2-1)及び(2-2)からなる群より選ばれるいずれか一つ以上の工程における浮遊培養が、さらにγ-セクレターゼ阻害剤の存在下でおこなわれることを特徴とする、請求項1~15のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記工程(1)、(2)、(2-1)及び(2-2)からなる群より選ばれるいずれか一つ以上の工程における浮遊培養が、さらにデキサメタゾンの存在下でおこなわれることを特徴とする、請求項1~16のいずれか一項に記載の製造方法。
- 下記工程(1)及び(2)を含む、ヒト下垂体組織の製造方法;
(1)請求項1~17のいずれか一項に記載の製造方法で、ヒト下垂体組織を含む細胞塊を得る工程、
(2)第一工程で得られた細胞塊からヒト下垂体組織を回収する第二工程。
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