CN107435050B - 一种将人或动物体细胞诱导为神经干细胞的方法 - Google Patents

一种将人或动物体细胞诱导为神经干细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107435050B
CN107435050B CN201710467838.5A CN201710467838A CN107435050B CN 107435050 B CN107435050 B CN 107435050B CN 201710467838 A CN201710467838 A CN 201710467838A CN 107435050 B CN107435050 B CN 107435050B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
human
ptf1a
animal
stem cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710467838.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107435050A (zh
Inventor
向孟清
晋康新
邹珉
肖冬长
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhongshan Ophthalmic Center
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201710467838.5A priority Critical patent/CN107435050B/zh
Publication of CN107435050A publication Critical patent/CN107435050A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107435050B publication Critical patent/CN107435050B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0623—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18841—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18843—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Abstract

本发明公开了一种将人或动物体细胞诱导为神经干细胞的方法及该方法得到的神经干细胞用途。通过在分离的人或动物的体细胞内过表达转录因子Ptf1a，在含有EGF、bFGF的培养基中进行培养，可将体细胞诱导为神经干细胞(induced neural stem cells，iNSCs)。通过这种方法获得的iNSCs具有自我更新的能力，可以稳定传代50代以上，并保持原有的细胞特性。在不同的体外分化培养基中培养，iNSCs可以高效地分化为神经元、星型胶质细胞、以及少突胶质细胞。在动物体内注射iNSCs，注射的细胞可以整合到视网膜、大脑等神经组织中。本发明所使用的方法比以前的方法更加简便、高效和安全。本发明方法所得到的iNSCs以及其进一步分化的细胞，可以应用于神经疾病的细胞模型、药物筛选以及干细胞治疗等方面。

Description

一种将人或动物体细胞诱导为神经干细胞的方法
技术领域
本发明涉及到干细胞、细胞组织再生、细胞替代治疗等生物技术领域，主要是利用转录因子将人或者动物的体细胞在体外诱导转分化为神经干细胞，提供了一个新的诱导神经干细胞的获得方式，相较于其他方式更为简便、安全和高效，在神经退行性疾病的基础研究、药物筛选及干细胞治疗方面有很大的应用。
背景技术
随着全球老龄化社会的不断进展，以老年痴呆、帕金森病、老年黄斑变性、视网膜色素变性等为代表的神经退行性疾病发病率越来越高，给个人、家庭和社会带来严重的健康威胁和沉重的经济负担。这些疾病的共同特点是局部的神经细胞渐进性的死亡，但没有有效的再生恢复细胞数量，从而导致组织功能的不断丧失。这些疾病的治疗仅限于提供营养、防止氧化、抗炎等神经保护措施，以延缓疾病的进展速度，但不能恢复丢失的神经细胞，无法逆转疾病的进程。近年来，随着生物技术的不断进步，以干细胞治疗为代表的方法有望应用于这些疾病的治疗。
常用的用于治疗的干细胞种类可以分为胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)、成体干细胞(adultstem cells)等。胚胎干细胞分离自早期的胚胎，具有很强的自我更新能力和多能性，在动物体内实验中很容易形成畸胎瘤，而且会有免疫排斥反应，这些缺点使其逐渐偏移临床应用的主流。自从Yamanaka实验室首次利用转录因子将成纤维细胞诱导为iPSC以来[1]，越来越多的临床测试开始利用iPSCs。和ESCs相比，自体的iPSCs可以避免异体排斥反应，但仍然具有成瘤性的危险。成体干细胞分离自不同的组织，如皮肤干细胞、小肠干细胞、心肌干细胞、神经干细胞等。不同组织来源的成体干细胞只能分化为本组织的少数几种细胞，优点是体内应用时几乎没有成瘤性，比ESCs和iPSCs更加安全。
神经干细胞拥有近乎无限的增殖能力，能够在特定的环境或培养条件下分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞的三方向潜能，而且不具有成瘤性等危险性，从而在科研和临床上有巨大的应用价值。成人体内的神经干细胞数量稀少，只存在于若干组织特定部分，很难分离出来，从而限制了其应用，而且应用于别人会有免疫排斥反应。因此，从自体分离出体细胞(皮肤成纤维细胞、外周血液细胞、尿液细胞等)，在体外转分化为诱导神经干细胞(induced neural stem cells,iNSCs,下同)成为更好的选择。体外诱导获得iNSCs的途径有两种，第一种是间接诱导，首先将体细胞诱导成为多能干细胞(inducedpluripotent stem cells,iPSCs)，或经过iPSCs阶段，然后再诱导成为iNSCs。这种方法较为繁琐，而且总体效率很低。第二种方法是直接诱导，即不经过iPSCs的中间阶段，这种方法避免了早期的繁琐步骤，而且免除了iPSCs污染的可能性，从而更加安全。
早期直接诱导iNSCs采用多个转录因子，尤其是Yamanaka重编程因子(Oct4,Sox2,Klf9,c-Myc)，不久诱导效率较低，而且得到的iNSCs不具有三方向分化的潜能[2-4]。最早单个转录因子直接诱导iNSCs是利用Sox2基因[5]。Sox2可以将人或小鼠成纤维细胞重编程为iNSCs；iNSCs也具有三方向分化的能力。第二个被用来重编程iNSCs的单个转录因子是锌指蛋白Zfp521[6]。Zfp521可以将小鼠成纤维细胞转分化为具有三方向潜能的iNSCs，但并没有测试在人体细胞是否具有相同的功能。Sox2和Zfp521都是在胚胎早期表达的转录因子，具有潜在的成瘤能力，在研究中发现和癌症的发病有一定的关联[7-9]。因而探索更安全的转录因子是非常必要的。科学家们也发现，由于对甲基化等表观遗传因素的不同影响，用不同的方法得到的诱导干细胞会有不同的特性，而这些特性会对其应用有不同的影响。因而探索多样化的转分化方法也是有必要的。
参考文献
[1].Takahashi,K.and S.Yamanaka,Induction of pluripotent stem cellsfrom mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell,2006.126(4):p.663-76.
[2].Kim,J.,et al.,Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neuralprogenitors.Proc NatlAcad Sci U S A,2011.108(19):p.7838-43.
[3].Thier,M.,et al.,Direct conversion of fibroblasts into stablyexpandable neural stem cells.Cell Stem Cell,2012.10(4):p.473-9.
[4].Lujan,E.,et al.,Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing,tripotent neural precursor cells.Proc Natl Acad Sci U S A,2012.109(7):p.2527-32.
[5].Ring,K.L.,et al.,Direct reprogramming of mouse and humanfibroblasts into multipotent neural stem cells with a single factor.Cell StemCell,2012.11(1):p.100-9.
[6].Shahbazi,E.,et al.,Conversion ofHuman Fibroblasts to Stably Self-Renewing Neural Stem Cells with a Single Zinc-Finger TranscriptionFactor.Stem Cell Reports,2016.6(4):p.539-51.
[7].Weina,K.and J.Utikal,SOX2and cancer:current research and itsimplications in the clinic.Clin Transl Med,2014.3:p.19.
[8].Yamasaki,N.,et al.,Identification of Zfp521/ZNF521as acooperative gene for E2A-HLF to develop acute B-lineage leukemia.Oncogene,2010.29(13):p.1963-75.
[9].Spina,R.,et al.,Critical role of zinc finger protein 521in thecontrol of growth,clonogenicity and tumorigenic potential of medulloblastomacells.Oncotarget,2013.4(8):p.1280-92.
发明内容
本发明的目的在于提供一种将人和动物体细胞诱导为神经干细胞的方法，解决转录因子存在安全隐患的问题，使转分化方法多样化。
本发明采用如下技术方案：
本发明利用在人或者动物体细胞内过表达转录因子Ptf1a，从而将体细胞转分化为神经干细胞。所采用的技术方案可以分为如下步骤：
1、人或动物体细胞的采集和扩增：可利用的人或动物体细胞有多种，包括人或动物成纤维细胞、人或动物上皮细胞、人或动物血液细胞、人或动物尿液细胞等。这些细胞的采集以及增殖采用本领域中常用的方法。
2、转染人或动物体细胞，使人或动物体细胞内过表达转录因子Ptf1a：由于Ptf1a在不同种属间具有很高的保守性，都可以达到同样的效果。过表达Ptf1a的方法也有多种，可以利用下列不同的方法达到同样目的：
A.将Ptf1a编码序列克隆入慢病毒(lentivirus)、逆转录病毒(retrovirus)、仙台病毒(Sendai virus)、腺病毒(adenovirus)、腺相关病毒(adeno-associated virus)或其它病毒载体，利用病毒颗粒感染人或动物体细胞，从而过表达Ptf1a。
B.将Ptf1a编码序列克隆入游离体(episome)或其它质粒，利用脂质体、电转移、磷酸钙等直接转染人或动物体细胞，从而过表达Ptf1a。
C.利用CRISPR技术(成簇规律间隔短回文重复技术)，通过dCAS9-VP64(或类似功能融合蛋白)和指向Ptf1a的gRNA激活Ptf1a在人或动物体细胞内的表达，从而过表达Ptf1a。
D.利用ZFN(锌指核酸酶)、TALEN(转录激活样效应因子核酸酶)等靶向Ptf1a的核酸酶-VP64融合蛋白(或类似功能融合蛋白)激活Ptf1a在人或动物体细胞内的表达，从而过表达Ptf1a。
E.利用Ptf1a的mRNA或者蛋白质转染人或动物体细胞，从而过表达Ptf1a。
3、将转染后的人或动物体细胞在特定培养基里进行培养，人或动物体细胞形成神经球状结构。
4、将神经球挑出，进行传代培养、鉴定并冷冻保存iNSC细胞株。
一种将人或动物体细胞诱导为神经干细胞的方法得到的神经干细胞的应用，包括神经疾病的细胞模型，细胞移植及干细胞治疗，还包括将iNSCs复苏培养，进行体内/外分化实验、药物筛选等应用。
本发明的优点在于：
(1)Ptf1a诱导iNSC的效率比现有方法高。例如，参考文献[4]中应用Sox2形成神经球的效率只有不到0.1％，而Ptf1a的诱导效率可达到0.5％；
(2)Ptf1a诱导iNSC的定向分化效率比现有方法高，在定向分化培养基中能分化出约83.3％的神经元、87.2％的星型胶质细胞以及26.6％的少突胶质细胞。相对而言，Sox2诱导iNSC只能分化形成59-67％的神经元以及18-25％的星型胶质细胞。
(3)Ptf1a诱导的iNSC自我更新能力较强，传代50代以上没有衰老及特性改变，而早期参考文献[1]采用Yamanaka因子的方案诱导iNSC只能传代3-5代[1]。
(4)Ptf1a诱导iNSC的过程简单，不需要特殊处理及繁琐的步骤。
(5)Ptf1a应用较为安全，不需要考虑成瘤等危险性。
附图说明
图1：Ptf1a转染成纤维细胞诱导为神经球状结构；
利用Ptf1a慢病毒感染人或小鼠的成纤维细胞后，从第八天开始，陆续形成不同大小的神经球状结构，其中含有iNSC细胞。
图2：Ptf1a诱导的iNSCs表达神经前体细胞标记基因；
实时定量PCR结果显示，和成纤维细胞相比，Ptf1a病毒诱导得到的iNSC细胞高表达Pax6、Sox1、Sox2、Nestin等神经前体细胞标记；同时，Colla1、Dkk3、SnaiR等成纤维细胞标记大幅度下降，Oct3/4、Klf4等iPSC细胞标记保持不变。
图3：Ptf1a诱导形成iNSC以及iNSC扩展的全过程；
从Ptf1a病毒转染成纤维细胞开始，到形成神经球，再到iNSC扩展的全过程展示，每个步骤都显示有代表图片、时间点、及培养条件等。
图4：Ptf1a诱导的iNSCs具有三方向分化的潜能；
在不同的体外分化培养基培养条件下，iNSC可以高效率分化为Map2阳性的神经元(左图)、GFAP阳性的星型胶质细胞(中图)、O1阳性的少突胶质细胞(右图)。DAPI复染显示细胞核(蓝色)。
图5：iNSC定向诱导的效率；
Ptf1a诱导的iNSCs具有三方向分化潜能，并且比其他方法具有更高的效率，体外定向分化后得到83.3％的神经元、87.2％的星型胶质细胞以及26.6％的少突胶质细胞。
图6：移植后的iNSCs能整合到体内神经组织内；
Ptf1a诱导的iNSCs经移植后能够整合到大脑以及视网膜等神经组织。图中绿色为含GFP标记的iNSC移植来源细胞，这些细胞整合到下丘脑组织，并表达Dcx(左图)、GABA(右图)神经元标记分子。DAPI复染显示细胞核(蓝色)。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
下面以“Ptf1a慢病毒将成纤维细胞转分化iNSCs”为实施例详细描述本发明的具体过程与细节。
(一)慢病毒载体(Tet-O-FUW-Ptf1a)的构建
将小鼠Ptf1a(NM_018809.2，972bp)编码序列克隆进入含tet-on调控序列的慢病毒载体(Tet-O-FUW)。目的是将来和RTTA病毒共转染，并可加入Dox(Doxycyclin)控制Ptf1a在体细胞内的表达。经DNA测序验证正确克隆后，制备转染用的质粒。
(二)慢病毒的制备
1)质粒转染前24小时，在10cm细胞培养皿中铺4.0x106的HEK293T细胞，加入6mlMEF培养基进行培养。
2)转染前，移除原培养基，换成9ml新鲜的提前预热的MEF培养基。
3)制备Ptf1a慢病毒：在装有500μl Opti-MEM培养基的1.5ml离心管中，分别加入质粒Tet-O-FUW-Ptf1a(10μg)以及慢病毒包装质粒pMDLg/pRRE(5μg)、pRSV-rev(2.5μg)、pMD2.G(2.5μg)，充分混匀；再准备另一个装有460μl Opti-MEM培养基的1.5ml离心管，加入40ul的lipofectamin 2000，轻轻混匀，室温条件孵育5min；将Opti-MEM/lipofectamine2000混合液加入Opti-MEM/DNA混合液中，从液体中间加入，避免贴壁加，轻轻混匀，室温下孵育20-30分钟。
4)制备M2rtTA慢病毒：将质粒Tet-O-FUW-Ptf1a换成TUW-M2rtTA，其余步骤不变。
5)将Opti-MEM/lipofectamine 2000/DNA的混合液(约1ml)，均匀滴加于培养HEK293T的10cm培养皿中，CO2培养箱37℃培养。
6)48小时后收集上清液，0.45μm无菌过滤器过滤，分装保存，4℃可保存两周，-80℃可长期保存。一旦解冻，最好用完或者丢弃，避免反复冻融。
(三)小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的制备
1)取E13.5-E16.5的C57BL/6j小鼠胚胎，放入盛有HBSS的10cm培养皿中，简单漂洗后转入另一个新的盛有HBSS的10cm培养皿；
2)显微镜下用显微剪剪除头、脊柱、四肢和内脏，剩下的组织放入一个新的10cm培养皿；
3)每个培养皿中放入不超过8个胚胎，加入1ml 0.25％胰蛋白酶(0.25％trypsin-EDTA)，用剪刀将组织剪至均质状态。在37℃培养箱中孵育15分钟，期间摇晃1-2次；
4)加入适当培养基用10ml移液管将组织吹散。每2-3ml培养基放入1个10cm培养皿中；
5)加入MEF培养基，在37℃CO2培养箱中培养；
6)当细胞长满后(大概1-2天)，移除培养基，PBS漂洗一遍，加入1ml0.25％胰蛋白酶，37℃消化3分钟。加5ml MEF培养基，用移液管上下吹打数次打散细胞后，转入15ml离心管；
7)离心，1000rpm/5min。移除上清，加MEF培养基重悬后，以1：4的比例分盘；
8)待细胞长满后，移除培养基，PBS漂洗一遍，加入1ml 0.25％胰蛋白酶，37℃消化3分钟。加5ml MEF培养基，用移液管上下吹打数次，1000rpm/5min离心。移除上清，加入5ml冻存培养基；
9)迅速将细胞悬液转入冻存管，1ml/管；立即将冻存管置于冰上，再转入-80℃保存箱过夜，次日移入液氮中长期保存。
(四)细胞培养皿的包被
1)将poly-l-ornithine和laminin的保存液在4℃缓慢溶解；
2)将100×的poly-l-ornithine保存液在冷的无菌ddH2O中稀释成1×，加入培养皿使其完全覆盖培养皿底部，37℃培养箱孵育至少1小时；
3)移除poly-l-ornithine溶液，并用无菌ddH2O漂洗一次；将laminin在冷的无菌ddH2O中稀释成5μg/ml的浓度，加入培养皿，同样使其完全覆盖培养皿底部，37℃培养箱孵育至少1小时；
4)移除laminin，加入PBS漂洗，备用。
(五)iNSCs的诱导
1)将MEFs以3-4×104/孔的密度铺于包被过的12孔板，加入1ml MEF培养基/孔，CO2培养箱中37℃培养；
2)24小时后，移除MEF培养基，每孔加入1ml慢病毒和MEF培养基的混合液以及促转染剂polybrene(10μg/ml)。Ptf1a慢病毒与M2rtTA慢病毒以1：1的比例转染MEFs；为了保证较高的重编程效率，慢病毒的量需要提前做浓度梯度测试，以免加入过量病毒导致MEF细胞大量死亡；
3)转染16小时后，移除病毒与培养基的混合液，换成NSC培养基(N3培养基加上10ng/ml recombinant mouse EGF、10ng/ml recombinant human FGF-basic以及2ng/mldoxycycline)；
4)诱导iNSCs期间，每两天换一次NSC培养基；
5)转染8-10天后，就可以在培养皿中观察到小球体的产生，孔周边相对较多小球体的体积在3-4天内会迅速增大。
如图1所示，经过上述步骤之后，Ptf1a病毒转染的成纤维细胞形态结构改变，形成很多神经球样细胞团，其中包含iNSC细胞。实时定量PCR结果显示，细胞转分化前后的基因表达谱显著不同。和成纤维细胞相对比，Ptf1a病毒诱导得到的iNSC细胞高表达Pax6、Sox1、Sox2、Nestin等神经前体细胞分子标记；同时，Colla1、Dkk3、SnaiR等成纤维细胞分子标记大幅度下降；Oct3/4、Klf4等iPSC分子细胞标记保持不变(图2)。这些结果表明，成纤维细胞被Ptf1a转分化为神经干细胞，而不是多能干细胞。
(六)iNSCs的传代与保存
1)待克隆团长到一定大小，用无菌针头在显微镜下将其挑出，铺在24孔板中，一个克隆团/孔，加入NSC培养基在CO2培养箱中37℃培养；
2)3-5天后，移除NSC培养基，PBS漂洗一遍，加入100-200μl Accutase在37℃消化3分钟，加2mlNSC培养基，将细胞吹起，混匀，转入15ml离心管；
3)离心，1000rpm/5min；移除上清，加1ml NSC培养基重悬，铺在包被过的12孔板中；
4)根据其生长速度及状态，再分别转入同样预处理过的6孔板、6cm皿以及10cm皿中传代培养；大约传到8-10代以后，每个克隆团呈现出单层细胞的生长状态；
5)冻存方法同MEFs。
具体的转分化和iNSCs增殖传代过程总结为图3。每个步骤所需要的大致时间也在图3中列出，不同批次之间略微会有些差异。我们得到的iNSCs传代50代以上，没有显示有衰老、形态改变、细胞状态改变等。这些数据表明，我们可以获得足够数量的iNSCs，用于进一步的应用。
(七)iNSCs的分化潜能
1)将iNSCs以1×105/孔的密度铺在包被过24孔培养板，加入NSC培养基在CO2培养箱中37℃培养12小时；
2)若往神经元方向分化，换成神经元分化培养基-1培养2天，后换成神经元分化培养基-2培养12天；
3)若往星型胶质细胞方向分化，在星形胶质细胞的分化培养基中培养14天即可得到。
4)若往少突胶质细胞的分化，需要先在少突胶质细胞培养基中培养5天，再在培养基中添加ascorbic acid(200nM)和T3(30ng/ml)50ul，培养5天。
如图4-5所示，经过上述不同的分化培养基培养后，Ptf1a诱导的iNSCs可以在体外分化为MAP2阳性的神经元(图4左)、GFAP阳性的星型胶质细胞(图4中)、O1阳性的少突胶质细胞(图4右)。和以往的其它方法相比，Ptf1a诱导的iNSCs显示了很高的分化效率，分别得到了83.3％的神经元、87.2％的星型胶质细胞和26.6％少突胶质细胞(图5)。
用GFP标记iNSCs细胞后，将细胞直接注射到小鼠大脑或者视网膜等神经组织内，以检测iNSCs在体内是否具有分化能力。结果显示，注射的iNSCs能顺利整合到体内组织中，并且能分化成不同亚型的神经元。如图6所示，移植后的iNSCs可以整合进入下丘脑，并分化形成Dcx和GABA阳性的神经元(图6)。
(八)培养细胞的免疫荧光染色
1)用铺有盖玻片的且用poly-l-ornithine和laminin包被过的培养皿培养准备做免疫荧光染色的细胞；
2)小心移除培养基，加入PBS，漂洗3分钟；
3)移除PBS，加入4％PFA，室温下固定10-15mins；
4)移除PFA，用PBS漂洗两次；加入封闭液，室温下封闭至少1小时；
5)移除封闭液，加入一抗(稀释于0.1％Triton X-100以及2％normal donkeyserum的PBS中，不同抗体的稀释度见表2)，室温下孵育至少1小时；
6)移除一抗，PBS漂洗两次，加入二抗(1：1000稀释于2％normal donkey serum的PBS中)，避光孵育1小时；
7)移除二抗，PBS漂洗两次，加入DAPI(0.5μg/ml，溶于PBS)暗室中孵育3分钟；
8)移除DAPI，加入PBS；在载玻片上滴一滴封片剂，用镊子小心将盖玻片取出，小心倒扣在封片剂上，静置，以备在共聚焦显微镜(Carl Zeiss，LSM700)下观察拍照。
图4作为例子可以显示细胞免疫荧光染色的结果。
(十)主要试剂的配方
1)MEF培养基
Figure BDA0001326338050000111
2)冻存培养基
MEF media 80ml
FBS 10ml
DMSO 10ml
3)N3培养基
Figure BDA0001326338050000112
4)神经元分化培养基-1
Figure BDA0001326338050000113
5)神经元分化培养基-2
Figure BDA0001326338050000121
6)星型胶质细胞分化培养基
Figure BDA0001326338050000122
7)少突胶质细胞分化培养基
Figure BDA0001326338050000123
本发明得到的技术效果如下：
(1)和野生型NSC对照相比，Ptf1a诱导的iNSC表达同样的神经前体细胞分子标记，包括Pax6、Sox2、Nestin、Olig2等。
(2)Ptf1a诱导的iNSC可以自我更新，形成新的神经球。
(3)Ptf1a诱导的iNSC可以稳定传代50代以上，并保持相同的特性，没有衰老及特性改变。
(4)Ptf1a诱导的iNSC在神经元分化培养基中培养2-3周后，大多数细胞表达Tuj1、Map2、Dcx(doublecortin)、NeuN、Tau、peripherin以及GABA等神经元分子标记。约有83.3％的细胞Tuj1阳性。分化的神经元具有正常神经元的膜电位、动作电位和其它电生理活动。
(5)Ptf1a诱导的iNSC在星型胶质细胞分化培养基中培养，87.2％的细胞分化为GFAP免疫荧光阳性的星型胶质细胞。
(6)Ptf1a诱导的iNSC在少突胶质细胞分化培养基中培养，可以分化为O1、CNP或者MBP免疫荧光阳性的少突胶质细胞，大约26.6％的分化细胞表现为O1阳性。
(7)Ptf1a诱导iNSC移植到视网膜、大脑之后，可以整合到移植组织中。
(8)Ptf1a诱导的iNSC能在神经疾病的细胞模型、药物筛选、细胞移植、体内/外分化实验以及干细胞治疗等方面应用。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种将人或动物体细胞诱导为神经干细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)采集、扩增人或动物体细胞；
(2)转染人或动物体细胞，使人或动物体细胞内过表达转录因子Ptf1a；
转染的操作是：将Ptf1a编码序列克隆入病毒载体，利用病毒颗粒感染人或动物体细胞，
或，将Ptf1a编码序列克隆入游离体(episome)或质粒，利用脂质体、电转移、磷酸钙方式直接转染人或动物体细胞，
或，利用Ptf1a的mRNA或者蛋白质转染人或动物体细胞；
(3)将转染后的人或动物体细胞在对应的培养基里进行培养，人或动物体细胞形成神经球状结构；
(4)将神经球挑出，进行传代培养形成细胞株，鉴定是iNSC细胞株后冷冻保存。
2.如权利要求1所述的一种将人或动物体细胞诱导为神经干细胞的方法，其特征在于：
所述病毒载体包括慢病毒、逆转录病毒、仙台病毒、腺病毒、腺相关病毒。
3.如权利要求1所述的一种将人或动物体细胞诱导为神经干细胞的方法，其特征在于：步骤(2)中的方法是利用CRISPR技术，通过dCAS9-VP64质粒载体或具有相同功能的融合蛋白，以及指向Ptf1a的gRNA激活Ptf1a在人或动物体细胞内的表达，从而过表达Ptf1a。
4.如权利要求1所述的一种将人或动物体细胞诱导为神经干细胞的方法，其特征在于：步骤(2)中的方法是利用靶向Ptf1a的核酸酶-VP64融合蛋白激活Ptf1a在人或动物体细胞内的表达，从而过表达Ptf1a。
5.如权利要求4所述的一种将人或动物体细胞诱导为神经干细胞的方法，其特征在于：
所述核酸酶-VP64融合蛋白包括ZFN、TALEN。
6.如权利要求1-5任一所述的一种将人或动物体细胞诱导为神经干细胞的方法得到的神经干细胞在神经疾病的细胞模型、药物筛选、体外分化实验的应用。
CN201710467838.5A 2017-06-20 2017-06-20 一种将人或动物体细胞诱导为神经干细胞的方法 Active CN107435050B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710467838.5A CN107435050B (zh) 2017-06-20 2017-06-20 一种将人或动物体细胞诱导为神经干细胞的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710467838.5A CN107435050B (zh) 2017-06-20 2017-06-20 一种将人或动物体细胞诱导为神经干细胞的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107435050A CN107435050A (zh) 2017-12-05
CN107435050B true CN107435050B (zh) 2021-02-09

Family

ID=60458845

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710467838.5A Active CN107435050B (zh) 2017-06-20 2017-06-20 一种将人或动物体细胞诱导为神经干细胞的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107435050B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108048405A (zh) * 2018-01-15 2018-05-18 上海市东方医院 稳定表达人内源性INav的细胞模型及其制备方法和用途
CN108285892A (zh) * 2018-02-01 2018-07-17 上海市东方医院 一种稳定产生人内源性Ito，s电流的细胞模型及构建方法与应用
CN114231489A (zh) * 2020-09-08 2022-03-25 纽伦捷生物医药科技（苏州）有限公司 用于重编程的功能性片段、组合及其应用
CN116555260A (zh) * 2023-04-24 2023-08-08 中山大学中山眼科中心 一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102604894A (zh) * 2012-02-29 2012-07-25 中国科学院广州生物医药与健康研究院 用于制备神经干细胞的培养基及其用途
CN105296432A (zh) * 2015-12-07 2016-02-03 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种将t淋巴细胞诱导成多能干细胞的方法
WO2016063985A1 (ja) * 2014-10-24 2016-04-28 大日本住友製薬株式会社 神経組織の製造方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102604894A (zh) * 2012-02-29 2012-07-25 中国科学院广州生物医药与健康研究院 用于制备神经干细胞的培养基及其用途
WO2016063985A1 (ja) * 2014-10-24 2016-04-28 大日本住友製薬株式会社 神経組織の製造方法
CN105296432A (zh) * 2015-12-07 2016-02-03 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种将t淋巴细胞诱导成多能干细胞的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN107435050A (zh) 2017-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7407865B2 (ja) 細胞の再プログラミングのための方法とその用途
JP6080871B2 (ja) 神経幹細胞を調製するための培養培地およびその使用
EP2982747B1 (en) Method for producing reprogrammed derivative neuronal stem cell from non-neuronal cell by using hmga2
CN107435050B (zh) 一种将人或动物体细胞诱导为神经干细胞的方法
CN110396499B (zh) 一种诱导神经干细胞的方法及其应用
EP3766962A1 (en) Induced pluripotent cell-derived oligodendrocyte progenitor cells for the treatment of myelin disorders
CN105683359B (zh) 将从间充质干细胞诱导的多能干细胞分化为肝细胞的方法
CN105683360B (zh) 将从间充质干细胞诱导的多能干细胞分化为神经细胞的方法
CN105219729B (zh) 一种利用非整合质粒载体诱导神经干细胞的方法及其用途
KR102143320B1 (ko) 합성 메신저 rna를 이용하여 소변세포를 신경줄기세포로 직접 역분화하는 방법
WO2013124309A1 (en) Direct reprogramming of somatic cells into neural stem cells
Jin et al. Reprogramming fibroblasts to neural stem cells by overexpression of the transcription factor Ptf1a
JP6002581B2 (ja) 細胞プログラミング
WO2005095587A1 (ja) 胚性幹細胞から分化した体性幹細胞の製造方法、及びその用途
CN111440771A (zh) 一种含有clcn2纯合突变的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系
Bae Developing an efficient process for the production of retinal progenitor cells (RPCs) from human pluripotent stem cells using lowered oxygen tension
WO2011121636A1 (ja) 人工多能性幹細胞の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20221226

Address after: 510000 No. 54 martyrs South Road, Guangdong, Guangzhou

Patentee after: ZHONGSHAN OPHTHALMIC CENTER, SUN YAT-SEN University

Address before: Room 406A, Building 3, Zhongshan Ophthalmology Center, No. 54, Xianlie South Road, Yuexiu District

Patentee before: Xiang Mengqing

Patentee before: Jin Kangxin

Patentee before: Zou Min

Patentee before: Xiao Dongchang