CN102604894A - 用于制备神经干细胞的培养基及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于制备神经干细胞的培养基及其用途。其中，用于制备神经干细胞的培养基包括：基础培养基，其适于干细胞生长；以及细胞信号通路抑制剂，其为选自GSK抑制剂、MEK抑制剂、TGF-β抑制剂、ROCK抑制剂和BMP抑制剂的至少一种。通过使用本发明的培养基对体细胞进行培养，尤其是对表达转录调控因子的体细胞进行培养，能够有效地使得体细胞转分化为神经干细胞，并且时间大大缩短。

Description

用于制备神经干细胞的培养基及其用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域。具体地，本发明涉及用于制备神经干细胞的培养基及其用途。
背景技术
干细胞(stem cells)是人体及其各种组织细胞的初始来源，其最显著的生物学特征是既有自我更新和不断增殖的能力，又有多向分化的潜能。干细胞根据不同的来源分为成体干细胞(somatic stem cells)和胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)。成体干细胞包括神经干细胞、骨髓间充质干细胞、造血干细胞等。目前除对造血干细胞和间充质干细胞的研究较多外，对神经干细胞的研究也比较深入。
1992年，Reynolds和Weiss等首次成功地从成年小鼠的纹状体分离出了神经干细胞，这种细胞具有自我更新和分裂增殖能力，可以分化为神经系统大部分类型的细胞，对损伤和疾病具有反应能力。1998年，日本学者Okano和美国康内尔大学的Goldman合作，证实了成人脑组织中神经干细胞的存在。目前，人们通过不断的实践证明了神经系统内多潜能干细胞的存在并分离成功，为神经系统损伤修复和退行性病变的细胞替代治疗带来了新希望。因为神经元不可再生修复的特性一直是医学科学难以超越的障碍，兼之中枢神经系统组织结构的脆弱易损性和它决定智能活动的重要性，中枢神经系统疾病及其后遗症始终是影响人类生命健康和生存质量的顽疾之一，神经干细胞的研究成为干细胞研究领域中最积极和最活跃的部分，临床方面拥有光明的应用前景。
然而，目前对于神经干细胞的相关研究仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效制备神经干细胞的手段。
为此，根据本发明的一个方面，本发明提出了一种用于制备神经干细胞的培养基。根据本发明的实施例，该用于制备神经干细胞的培养基包括：基础培养基，所述基础培养基适于干细胞生长；以及细胞信号通路抑制剂，所述细胞信号通路抑制剂为选自GSK抑制剂、MEK抑制剂、TGF-β抑制剂、ROCK抑制剂和BMP抑制剂至少一种。发明人发现，通过使用该培养基对体细胞进行培养，尤其是对表达转录调控因子的体细胞进行培养，能够有效地使得体细胞转分化为神经干细胞(在本文中有时也称为“诱导性神经干细胞”)，并且时间大大缩短。
根据本发明的又一方面，本发明提出了一种用于制备神经干细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有细胞信号通路抑制剂，所述细胞信号通路抑制剂为选自GSK抑制剂、MEK抑制剂、TGF-β抑制剂、ROCK抑制剂和BMP抑制剂的至少一种。发明人发现，通过使用该试剂盒对体细胞进行培养，尤其是表达转录调控因子的体细胞进行培养，能够有效地使得体细胞转分化为神经干细胞，并且时间大大缩短。
根据本发明的又一方面，本发明提出了一种用于制备神经干细胞的试剂盒，该试剂盒包含前述的培养基。发明人发现，通过使用该试剂盒对体细胞进行培养，尤其是表达转录调控因子的体细胞进行培养，能够有效地使得体细胞转分化为神经干细胞，并且时间大大缩短。
根据本发明的再一方面，本发明提出了前面所述的试剂盒在制备神经干细胞中的用途。利用根据本发明实施例的试剂盒，能够有效地对体细胞进行培养，尤其是表达转录调控因子的体细胞进行培养，能够有效地使得体细胞转分化为神经干细胞，并且时间大大缩短。
根据本发明的另一方面，本发明提出了前面所述的培养基在制备神经干细胞中的用途。由此，能够有效地通过对体细胞尤其是表达转录调控因子的体细胞进行体外培养，能够有效地使得体细胞转分化为神经干细胞，并且时间大大缩短。
根据本发明的又一方面，本发明提出了一种制备神经干细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：利用前面所述的培养基，培养体细胞，所述体细胞携带编码选自Oct4、Sox2、Klf4以及miR302的至少一种多功能干细胞因子的核酸序列，以便诱导所述体细胞转分化为神经干细胞。发明人发现，通过利用根据本发明实施例的培养基，对携带编码特定转录因子即多功能干细胞因子的核酸序列的体细胞进行培养，能够有效地使得体细胞转分化为神经干细胞，并且时间可以大大缩短。
根据本发明的再一方面，本发明还提出了一种神经干细胞或其衍生物。根据本发明的实施例，该神经干细胞是根据前面所述的方法获得的。此外，根据本发明实施例的神经干细胞或其衍生物能够在适当的条件下有效地分化成神经细胞。
根据本发明的又一方面，本发明提出了前面所述的神经干细胞或其衍生物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗神经细胞损伤所引起的疾病。由于根据本发明实施例的神经干细胞或其衍生物能够在适当的条件下有效地分化成神经细胞，因而，可以进一步将该神经干细胞或其衍生物制成药物，从而可以治疗神经细胞损伤所引起的疾病。
根据本发明的再一方面，本发明提出了一种治疗神经细胞损伤所引起的疾病的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述的神经干细胞或其衍生物引入患者体内。通过将前面所述的神经干细胞或其衍生物引入患者体内，神经干细胞或其衍生物能够在患者体内有效地分化为神经细胞，从而可以进一步弥补由于神经细胞损伤所引起的身体损伤。
根据本发明的另一方面，本发明提出了一种制备神经细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括将前面所述的神经干细胞在适于分化的条件下进行培养。通过本发明的方法，能够有效地使得神经干细胞分化成为神经细胞，从而有效地制备了神经细胞。
根据本发明的再一方面，本发明提出了一种用于制备神经干细胞的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：分离装置，所述分离装置用于从人尿液中分离人尿液脱落细胞；转化装置，所述转化装置与所述分离装置相连，并且设置有携带编码选自Oct4、Sox2、Klf4以及miR302的至少一种多功能干细胞因子的核酸序列的载体，以便对所述人尿液脱落细胞进行转化；以及转分化装置，所述转分化装置与所述转化装置相连，并且设置有前面所述的培养基，用于对所述经过转化的人尿液脱落细胞进行转分化，以便诱导所述经过转化的人尿液脱落细胞转分化为神经干细胞。利用该系统，能够有效地实施前述制备神经干细胞的方法，从而可以有效地制备神经干细胞。
根据本发明的另一方面，本发明提出了一种筛选诱导神经干细胞分化的化合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：将前面所述的神经干细胞与候选化合物接触；以及检测接触所述候选化合物前后神经干细胞的多能性；其中，基于接触所述候选化合物后，所述神经干细胞的多能性是否降低，判断所述候选化合物是否具有诱导神经干细胞分化的活性。利用该方法能够有效地筛选获得能够诱导神经干细胞分化的化合物。
根据本发明的再一方面，本发明提出了一种治疗神经退行性疾病和神经损伤疾病的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：分离患者的体细胞；根据前面所述的制备神经干细胞的方法，基于所述体细胞，制备神经干细胞；将所述神经干细胞引入所述患者体内。利用本发明的治疗神经退行性疾病和神经损伤疾病的方法，能够有效地将制备获得的神经干细胞引入患者体内，进而神经干细胞在患者体内能够有效地分化为神经细胞，进一步，能够弥补由于神经退行和神经细胞损伤所引起的身体损伤，从而能够治疗神经退行性疾病和神经损伤疾病。
根据本发明的又一方面，本发明提出了一种鉴定制剂对神经系统是否具有影响的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：将所述制剂与根据本发明实施例的神经干细胞接触；以及对接触前后的神经干细胞进行检测，其中，基于所述神经干细胞的行为变化，判断所述制剂对神经系统是否具有影响。利用该方法能够有效地鉴定制剂对神经系统是否具有影响。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1：显示了根据本发明一个实施例的制备神经干细胞的方法的流程示意图；
图2：显示了根据本发明一个实施例的用于制备神经干细胞的系统的结构示意图；
图3：显示了根据本发明一个实施例的治疗神经退行性疾病和神经损伤疾病的方法的流程示意图；
图4：显示了根据本发明一个实施例的诱导诱导性神经干细胞过程中各阶段的细胞的形态图；
图5：显示了根据本发明一个实施例的免疫荧光及Real-Time PCR方法鉴定诱导性神经干细胞的神经干细胞标志基因表达水平的结果；以及
图6：显示了根据本发明一个实施例的免疫荧光检测诱导性神经干细胞体外分化物中不同类型神经元及神经胶质细胞的标志物表达的结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
根据本发明的一个方面，本发明提出了一种用于制备神经干细胞的培养基。根据本发明的实施例，该用于制备神经干细胞的培养基可以包括：基础培养基，该基础培养基适于干细胞生长；以及细胞信号通路抑制剂，该细胞信号通路抑制剂为选自GSK抑制剂、MEK抑制剂、TGF-β抑制剂、ROCK抑制剂和BMP抑制剂的至少一种。发明人发现，通过使用该培养基对体细胞进行培养，尤其是对表达转录调控因子的体细胞进行培养，能够有效地使得体细胞转分化为神经干细胞，并且培养时间大大缩短。
根据本发明的实施例，基础培养基的类型并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，基础培养基为mTeSR1(可以从Stem Cell公司购得)。根据本发明的实施例，各细胞信号通路的抑制剂的具体类型也不受特别限制。根据本发明的一个实施例，细胞信号通路抑制剂可以为GSK抑制剂CHIR99021、MEK抑制剂PD0325901、TGF-β抑制剂A83-01、ROCK抑制剂thiazovivin和BMP抑制剂DMH1的组合。这些抑制剂均为市售可得的，并且由此，可以进一步提高将体细胞转分化为神经干细胞的效率。对于各抑制剂在用于制备神经干细胞的培养基中的浓度，并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，按照重量百分比，该培养基可以含有：浓度为0.3μM-30μM的GSK抑制剂CHIR99021；浓度为10nM-10μM的MEK抑制剂PD0325901；浓度为50nm-5μM的TGF-β抑制剂A83-01；浓度为50nm-5μM的ROCK抑制剂thiazovivin；以及浓度为20nm-2μM的BMP抑制剂DMH1。优选地，根据本发明的一个实施例，按照重量百分比，所述培养基可以含有：浓度为3μM的GSK抑制剂CHIR99021；浓度为1μM的MEK抑制剂PD0325901；浓度为0.5μM的TGF-β抑制剂A83-01；浓度为0.5μM的ROCK抑制剂thiazovivin；以及浓度为0.2μM的BMP抑制剂DMH1。由此，可以进一步提高将降体细胞转分化为神经干细胞的效率。
根据本发明的又一方面，本发明提出了一种用于制备神经干细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有细胞信号通路抑制剂，该细胞信号通路抑制剂为选自GSK抑制剂、MEK抑制剂、TGF-β抑制剂、ROCK抑制剂和BMP抑制剂的至少一种。发明人发现，通过使用该试剂盒对体细胞进行培养，尤其是对表达转录调控因子的体细胞进行培养，能够有效地使得体细胞转分化为神经干细胞，并且时间大大缩短。根据本发明的实施例，各细胞信号通路的抑制剂的具体类型不受特别限制。根据本发明的一个实施例，所述细胞信号通路抑制剂可以为GSK抑制剂CHIR99021、MEK抑制剂PD0325901、TGF-β抑制剂A83-01、ROCK抑制剂thiazovivin和BMP抑制剂DMH1的组合。这些抑制剂均为市售可得的，并且由此，可以进一步提高将体细胞转分化为神经干细胞的效率。对于各抑制剂在用于制备神经干细胞的培养基中的浓度，并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，GSK抑制剂CHIR99021、MEK抑制剂PD0325901、TGF-β抑制剂A83-01、ROCK抑制剂thiazovivin和BMP抑制剂DMH1分别设置在不同的容器中。由此，可以方便地使用该试剂盒对体细胞进行转分化处理。根据本发明的一个实施例，该试剂盒可以进一步包括基础培养基，其中该基础培养基为mTeSR1(可以从Stem Cell公司购得)。
根据本发明的实施例，细胞信号通路抑制剂的存在形式并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，在该试剂盒中，细胞信号通路抑制剂可以溶解于基础培养基中。由此，可以方便地使用试剂盒对体细胞进行转分化处理。根据本发明的一个实施例，在该试剂盒中，按照重量百分比，溶解于基础培养基中的细胞信号通路抑制剂可以为：浓度为3μM的GSK抑制剂CHIR99021、浓度为1μM的MEK抑制剂PD0325901、浓度为0.5μM的TGF-β抑制剂A83-01、浓度为0.5μM的ROCK抑制剂thiazovivin以及浓度为0.2μM的BMP抑制剂DMH1的组合。由此，可以进一步提高使用试剂盒对体细胞进行转分化处理的效率。
根据本发明的又一方面，本发明提出了一种用于制备神经干细胞的试剂盒，该试剂盒包含前述的用于制备神经干细胞的培养基。发明人发现，通过使用该试剂盒对体细胞进行培养，尤其是对表达转录调控因子的体细胞进行培养，能够有效地使得体细胞转分化为神经干细胞，并且时间大大缩短。关于用于制备神经干细胞的培养基，前面已经进行了详细描述，在此不再赘述。
根据本发明的再一方面，本发明提出了前面所述的试剂盒在制备神经干细胞中的用途。利用根据本发明实施例的试剂盒，能够有效地对体细胞进行培养，尤其是对表达转录调控因子的体细胞进行培养，能够有效地使得体细胞转分化为神经干细胞，并且时间大大缩短。关于试剂盒，前面已经进行了详细描述，在此不再赘述。
根据本发明的另一方面，本发明提出了前面所述的培养基在制备神经干细胞中的用途。由此，能够有效地通过对体细胞尤其是表达转录调控因子的体细胞进行体外培养，能够有效地使得体细胞转分化为神经干细胞，并且时间大大缩短。关于用于制备神经干细胞的培养基，前面已经进行了详细描述，在此不再赘述。
根据本发明的又一方面，本发明提出了一种制备神经干细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法可以包括以下步骤：利用前面所述的用于制备神经干细胞的培养基，培养体细胞，该体细胞携带编码选自Oct4、Sox2、Klf4以及miR302的至少一种多功能干细胞因子的核酸序列，以便诱导体细胞转分化为神经干细胞。发明人发现，通过利用根据本发明实施例的培养基，对携带编码特定转录因子即多功能干细胞因子的核酸序列的体细胞进行培养，能够有效地使得体细胞转分化为神经干细胞，并且时间可以大大缩短。根据本发明的实施例，体细胞的类型并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，体细胞可以为人尿液脱落细胞。由此，可以方便地获得起始细胞，从而提高制备神经干细胞的效率，降低制备神经干细胞的成本，避免采用侵入式手术方法获取起始细胞带来的人力物力成本。
进一步，根据本发明的实施例，携带编码选自Oct4、Sox2、Klf4以及miR302的至少一种多功能干细胞因子的核酸序列的体细胞，也可以通过对不携带所述多功能干细胞因子的体细胞进行生物学处理而得到。具体地，根据本发明的实施例，携带编码选自Oct4、Sox2、Klf4以及miR302的至少一种多功能干细胞因子的核酸序列的体细胞可以通过下列步骤获得：
首先，对人尿液进行离心，以便获得沉淀物。
接着，利用尿液培养基对所述沉淀物进行培养，以便获得原代人尿液脱落细胞。
然后，利用携带编码选自Oct4、Sox2、Klf4以及miR302的至少一种多功能干细胞因子的核酸序列的载体，对原代人尿液脱落细胞进行转化，以便获得体细胞。根据本发明的一个实施例，载体携带编码Oct4、Sox2、Klf4以及miR302的核酸序列。根据本发明的一个实施例，载体为分别携带编码Oct4、Sox2、Klf4以及miR302的核酸序列的不同质粒。根据本发明的一个实施例，利用电转导对原代人尿液脱落细胞进行转化。
在获得神经干细胞后，还可以进一步对神经干细胞进行扩增培养。根据本发明的实施例，对神经干细胞进行扩增培养的方法并不受特别限制，根据本发明的一个实施例，本发明的制备神经干细胞的方法可以进一步包括下列步骤以实现对神经干细胞的扩增：
首先，利用基础培养基，对神经干细胞进行贴壁培养。其中，该基础培养基可以为mTeSR1。
然后，将经过贴壁培养的神经干细胞在神经干细胞培养基中进行培养，该神经干细胞培养基为含有1％N2 supplement、1％非必需氨基酸、0.1％肝素、20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和20ng/ml表皮生长因子的DMEM/F12培养基。
根据本发明的再一方面，本发明还提出了一种神经干细胞或其衍生物。根据本发明的实施例，该神经干细胞是根据前面所述的方法获得的。此外，根据本发明实施例的神经干细胞或其衍生物能够在适当的条件下有效地分化成神经细胞。
根据本发明的又一方面，本发明提出了前面所述的神经干细胞或其衍生物在制备药物中的用途，该药物用于治疗神经细胞损伤所引起的疾病。由于根据本发明实施例的神经干细胞或其衍生物能够在适当的条件下有效地分化成神经细胞，因而，可以进一步将该神经干细胞或其衍生物制成药物，从而可以治疗神经细胞损伤所引起的疾病。
根据本发明的再一方面，本发明提出了一种治疗神经细胞损伤所引起的疾病的方法。根据本发明的实施例，该方法可以包括：将前面所述的神经干细胞或其衍生物引入患者体内。通过将前面所述的神经干细胞或其衍生物引入患者体内，神经干细胞或其衍生物能够在患者体内有效地分化为神经细胞，从而可以进一步弥补由于神经细胞损伤所引起的身体损伤。
根据本发明的另一方面，本发明提出了一种制备神经细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括将前面所述的神经干细胞在适于分化的条件下进行培养。通过本发明的方法，能够有效地使得神经干细胞分化成为神经细胞，从而有效地制备了神经细胞。根据本发明的实施例，对神经干细胞进行分化培养的方法并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，可以利用含有1％N2 supplement、1％非必需氨基酸、0.1％肝素，并添加有浓度均为10ng/mL的神经营养因子BDNF、GDNF、CNTF和IGF的DMEM/F12培养基，对神经干细胞进行培养，以便获得不同类型的神经元和神经胶质细胞。
根据本发明的再一方面，本发明提出了一种用于制备神经干细胞的系统。根据本发明的实施例，参照图2，该系统1000可以包括：分离装置100、转化装置200以及转分化装置300。其中，分离装置100用于从人尿液中分离人尿液脱落细胞。转化装置200与分离装置100相连，并且设置有携带编码选自Oct4、Sox2、Klf4以及miR302的至少一种多功能干细胞因子的核酸序列的载体，用于从分离装置100接收人尿液脱落细胞并对其进行转化。转分化装置300与转化装置200相连，并且设置有前面所述的用于制备神经干细胞的培养基，用于从转化装置200接收经过转化的人尿液脱落细胞并对其进行转分化，以便诱导经过转化的人尿液脱落细胞转分化为神经干细胞。利用该系统，能够有效地实施前述制备神经干细胞的方法，从而可以有效地制备神经干细胞。
根据本发明的另一方面，本发明提出了一种筛选诱导神经干细胞分化的化合物的方法。根据本发明的实施例，该方法可以包括以下步骤：将前面所述的神经干细胞与候选化合物接触；以及检测接触候选化合物前后神经干细胞的多能性；其中，基于接触候选化合物后，神经干细胞的多能性是否降低，判断候选化合物是否具有诱导神经干细胞分化的活性。利用该方法能够有效地筛选获得能够诱导神经干细胞分化的化合物。
根据本发明的再一方面，本发明提出了一种治疗神经退行性疾病和神经损伤疾病的方法。根据本发明的实施例，参照图3，该方法可以包括以下步骤：
首先，分离患者的体细胞。
其次，根据前面所述的制备神经干细胞的方法，基于获得的体细胞，制备神经干细胞。
然后，将获得的神经干细胞引入患者体内。
利用本发明的治疗神经退行性疾病和神经损伤疾病的方法，能够有效地将制备获得的神经干细胞引入患者体内，进而神经干细胞在患者体内能够有效地分化为神经细胞，进一步，能够弥补由于神经退行和神经细胞损伤所引起的身体损伤，从而能够治疗神经退行性疾病和神经损伤疾病。
根据本发明的又一方面，本发明提出了一种鉴定制剂对神经系统是否具有影响的方法。根据本发明的实施例，该方法可以包括以下步骤：将制剂与根据本发明实施例的神经干细胞接触；以及对接触前后的神经干细胞进行检测，其中，基于神经干细胞的行为变化，判断制剂对神经系统是否具有影响。利用该方法能够有效地鉴定制剂对神经系统是否具有影响。
需要说明的是，本发明的用于制备神经干细胞的培养基及其用途，是本申请的发明人通过艰苦的创造性劳动和优化的工作而完成的。并且，在本发明的各方面中所描述的特征是可以相互引用的，为方便起见，不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：制备神经干细胞
1、分离人尿液脱落细胞(Urine cells，UC)
按照以下步骤，分离尿液脱落细胞：
(1)收集中段尿液150-200ml，置于无菌容器，并加入双抗(青霉素/链霉素)；
(2)然后将上述尿液转入50ml离心管，400g离心10min；
(3)吸掉上清，以便剩余约5ml尿液；
(4)向上述剩余尿液中加入含有双抗的PBS约10-30ml，轻轻混匀，然后400g离心10min；
(5)吸掉上清至剩余液体少于0.5ml；
(6)然后向上述剩余尿液中加入1ml尿液细胞培养基重悬沉淀，并收集细胞；
(7)将上述收集到的细胞平铺接种于已用0.1％的明胶(Gelatin)预包被处理的60mm培养皿(或六孔板)中，补加1ml尿液细胞培养基，其中，尿液细胞培养基是通过将含10％胎牛血清(FBS，PAA公司)、双抗的高葡萄糖DMEM(Dulbcco′s Modifed Eagle Medium)培养基(HyClone公司)和SingleQuot Kit CC-4127REGM培养基(Lonza公司)1∶1混合而获得的；
(8)将接种有细胞的培养皿置于37℃，5％CO2的培养箱内培养3天；
(9)观察培养皿内是否有细胞贴壁，然后轻轻补加1ml培养基，继续置于37℃，5％CO2培养箱内进行培养；
(10)在接种细胞的第5-7天，吸去培养皿内的培养基，并用PBS洗涤一遍，然后向培养皿中添加新鲜尿液培养基(不加抗生素)，可见细胞贴壁生长；
(11)视细胞生长情况添加或更换培养基，可用0.25％胰酶消化传代扩增；
(12)当尿液细胞扩增至第2代开始，收获原代人尿液脱落细胞，并用冻存液(90％FBS+10％DMSO)将其用液氮冻存，备用。
2、诱导诱导性神经干细胞(induced neural stem cell，iNSC)
iNSC的诱导试验包括细胞准备、质粒电转、细胞接种诱导、细胞克隆挑取、iNSC扩增等环节，具体步骤如下：
(1)将冻存的原代人尿液脱落细胞进行复苏，并接种于10cm盘(或者六孔板)中；
(2)待原代人尿液脱落细胞在10cm盘中的汇合度至90％左右时，用0.25％胰酶对其进行消化，然后收集细胞并计数；
(3)将适量细胞(每个电转体系的细胞数量在50-150万范围)转移至1.5ml的EP管中，200g离心5min；
(4)吸掉EP管中的上清，并收集细胞沉淀于电转杯中；
(5)配制质粒转化体系：向上述电转杯中依次加入82μl Basic
Figure BDA0000139659540000081
Solutionfor Mammalian Epithelial Cells和18μl supplement 1(Lonza公司)轻轻混匀，然后加入5μg质粒，充分混匀，以便获得质粒转化体系，其中质粒包括pCEP4-O2SET2K(3μg)和pCEP4-miR-302(2μg)；
(6)将电转杯置于Amaxa电转仪(Lonza公司)上，选择T-013(或T-020)程序进行电转；
(7)将电转后的细胞转移至包被有基质胶(Matrigel)的六孔板(或者10cm盘)上，每孔接种约10-30万细胞，可根据细胞状态进行调整，然后添加尿液细胞培养基，将细胞培养过夜；
(8)次日(或转染后第二日)，将上述六孔板中的尿液细胞培养基更换为含有3μMCHIR99021、1μM PD0325901、0.5μM A83-01(Tocris Bioscience)、0.5μM thiazovivin和0.2μMDMH1(Tocris Bioscience)的mTeSR1培养基(Stem Cell公司)——本发明的用于制备神经干细胞的培养基进行培养，观察细胞，并每隔一天更换一次培养基；
(9)在电转后约12-15天，经过诱导的细胞将长出大小合适、边缘清晰、细胞排列紧密的克隆，利用机械法挑取细胞克隆，并将其分成小块，接种于包被有Matrigel的基质胶(Matrigel)的六孔板(或十二孔板)上，用普通mTeSR1培养基进行培养；
(10)当经过培养的细胞克隆贴壁后，更换新鲜培养基，并继续培养3-5天，隔天换液，可见大量排列成神经花环(Rosette)样结构的或者具有极性排列的神经干细胞样细胞团；
(11)机械法挑取神经干细胞样细胞团，并用1ml枪头轻轻吹打，将细胞团吹成小块或单细胞，并将获得的单细胞转移至装有神经干细胞培养基的T25培养瓶中继续培养，其中，神经干细胞培养基为含有1％N2 supplement(Gibco)、1％非必需氨基酸(NEAA，Gibco)、0.1％肝素(Heparin，Sigma)、20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Invitrogen)和20ng/ml表皮生长因子(EGF，R&D Systems)的DMEM/F12培养基；
(12)悬浮生长于培养瓶中一周后，细胞可形成边界清晰的神经球(这时的神经球被定义为P1代神经球)，此后，每2-3天更换一次培养基，更换的量为原培养基的一半；
(13)当细胞生长到7-14天(视神经球大小)时，即从细胞置于培养瓶中用神经干细胞培养基培养开始的第7-14天，将其进行传代，将直径超过300μm的神经球转移至15ml的离心管中，待神经球自然沉降或离心(50g，1-2min)后，吸除上清，并向离心管中添加1ml Accutase，使其于37℃下进行消化3-5min；
(14)向上述离心管中添加神经干细胞培养基(其中，神经干细胞培养基为含有1％N2supplement(Gibco)、1％非必需氨基酸(NEAA，Gibco)、0.1％肝素(Heparin，Sigma)、20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Invitrogen)和20ng/ml表皮生长因子(EGF，R&D Systems)的DMEM/F12培养基)至反应体系的体积为10ml，然后200g离心5min；
(15)吸掉上清，然后向离心管中添加少量神经干细胞培养基(约500μl)，混匀，并用1ml枪头轻轻吹打将细胞团打散成小块，再向离心管中添加1ml神经干细胞培养基，混匀后接种于新的培养瓶中，继续培养以形成第二代神经球。
其中，利用倒置显微镜(Olympus，BX51)对从原代人尿液脱落细胞诱导制备神经干细胞过程中各阶段的细胞进行形态观察并照相，结果见图4。图4显示了本实施例的诱导诱导性神经干细胞过程中各阶段的细胞的形态图。如图4所示，A为原代人尿液脱落细胞；B为细胞经过电转后诱导形成的细胞克隆；C为挑取的克隆贴壁后的形态；D为iNSC神经球，放大倍数为100。
实施例2：诱导性神经干细胞(iNSC)表型的鉴定
1、免疫荧光染色检测iNSC中NSC标志物的表达
(1)将已包被基质胶(Matrigel)的玻片置于24孔板中，取5-10个实施例1制备的体积较小的iNSC神经球(即iNSC神经干细胞)贴在玻片上，然后向玻片上添加100μl神经干细胞培养基，培养过夜，次日再向每个孔中添加500μl神经干细胞培养基，培养1-2天；
(2)利用4％的多聚甲醛，将上述经过培养的细胞于室温下固定20min；
(3)用PBS将经过固定的细胞充分漂洗3次，每次5min；
(4)向经过漂洗的细胞中添加一抗(Pax6、Nestin、Sox1、Sox2)、1％BSA、10％normalgoat serum、0.3％Triton X-100和PBS，然后于4℃下培养过夜；
(5)用PBS将培养过夜的细胞洗涤3次，每次5min；
(6)向经过洗涤的细胞中添加相应的标记有Alexa 568或488的二抗(Invitrigen)，然后于室温下进行避光孵育1h；
(7)用PBS将经过避光孵育的细胞洗涤3次，每次5min；
(8)向上步获得的经过洗涤的细胞中添加DAPI(Sigma)，然后于室温下进行避光孵育3min；
(9)用PBS将上步获得的经过避光孵育的细胞洗涤3次，每次5min；
(10)然后进行封片，并对样品进行观察照相，结果见图5.
2、Real-Time PCR鉴定诱导性神经干细胞(iNSC)中神经干细胞标志基因的表达
首先，使用Trizol(Takara公司)试剂，按照制造商说明，提取实施例1制备的诱导性神经干细胞的总RNA。然后，用M-MLV(Takara公司)试剂盒对提取的总RNA进行逆转录，获得cDNA，并使用
Figure BDA0000139659540000101
Premix Ex TaqTM试剂盒(Takara公司)和ABI 7300荧光定量PCR仪(ABI公司)对cDNA进行Real-Time PCR，以便鉴定神经干细胞标志基因的表达，结果见图5。其中，Real-Time PCR引物的序列见下表。
  引物名称   引物序列(SEQ ID NO：)
  PAX6-F   ATGTGTGAGTAAAATTCTGGGCA(1)
  PAX6-R   GCTTACAACTTCTGGAGTCGCTA(2)
  SOX1-F   CAGTACAGCCCCATCTCCAAC(3)
  SOX1-R   GCGGGCAAGTACATGCTGA(4)
  NESTIN-F   CTGGAGCAGGAGAAACAGG(5)
  NESTIN-R   TGGGAGCAAAGATCCAAGAC(6)
  SOX2-F   CCCAGCAGACTTCACATGT(7)
  SOX2-R   CCTCCCATTTCCCTCGTTTT(8)
注：F：正向；R反向。
图5显示了利用免疫荧光及Real-Time PCR方法鉴定、检测实施例1制备的iNSC中神经干细胞标志基因的表达水平的结果。如图5所示，其中，A和B为免疫荧光染色结果，A表明iNSC中有Pax6和Nestin表达，B表明iNSC中有Sox1(B)表达；C为Real-Time PCR检测结果，结果分别显示了iNSC中Sox2、Pax6、Sox及Nestin的基因表达水平，其中UC为尿液细胞，iPS为由原代人尿液脱落细胞诱导形成的多能性干细胞。
3、体外鉴定iNSC的分化能力
将已包被基质胶(Matrigel)的玻片置于24孔板中，将实施例1制备的iNSC神经球(诱导性神经干细胞)贴在玻片上，然后向玻片上添加100μl神经干细胞培养基，培养过夜，次日再向每个孔中添加1ml神经分化培养基，培养1-2天，其中，神经分化培养基为含有1％N2supplement(Gibco)、1％非必需氨基酸(NEAA，Gibco)、0.1％肝素(heparin，Sigma)和每种均为10ng/mL的神经营养因子BDNF、GDNF、CNTF和IGF(Peprotech公司)的DMEM/F12培养基。然后，每隔一天更换神经分化培养基，换液量为原培养基的一半，培养2周后，获得诱导性神经干细胞的体外分化物。然后，通过免疫荧光检测获得的诱导性神经干细胞的体外分化物中Tuj、Map2、Dcx、TH、GABA、Glutamine及GFAP蛋白的表达，结果见图6。其中TH、GABA、Glutamine及GFAP蛋白分别为不同类型的神经元和神经胶质细胞的标志物，由此，能够通过检测诱导性神经干细胞的体外分化物中Tuj、Map2、Dcx、TH、GABA、Glutamine及GFAP蛋白的表达，来鉴定诱导性神经干细胞经体外分化获得的不同类型的神经元和神经胶质细胞，从而能够确认iNSC的体外分化能力。
图6显示了根据本发明一个实施例的免疫荧光检测诱导性神经干细胞体外分化的不同类型神经元及神经胶质细胞的标志物表达的结果。如图6所示，A表明iNSC自发分化形成了大量的神经元和胶质细胞；B表明诱导性神经干细胞体外分化物中有Map2和GABA表达；C表明诱导性神经干细胞体外分化物中有Map2和Glutamine表达；D表明诱导性神经干细胞体外分化物中有TH表达；E表明诱导性神经干细胞体外分化物中有Tuj和星形胶质细胞标记物GFAP表达；F表明诱导性神经干细胞体外分化物中有Dcx和Tuj表达。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Figure IDA0000139659640000011
Figure IDA0000139659640000021

Claims (30)

1.一种用于制备神经干细胞的培养基，其特征在于，包含：
基础培养基，所述基础培养基适于干细胞生成；以及
细胞信号通路抑制剂，所述细胞信号通路抑制剂为选自GSK抑制剂、MEK抑制剂、TGF-β抑制剂、ROCK抑制剂和BMP抑制剂的至少一种。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基为mTeSR1。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述细胞信号通路抑制剂为GSK抑制剂CHIR99021、MEK抑制剂PD0325901、TGF-β抑制剂A83-01、ROCK抑制剂thiazovivin和BMP抑制剂DMH1的组合。
4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，按照重量百分比，所述培养基含有：
浓度为0.3μM-30μM的GSK抑制剂CHIR99021；
浓度为10nM-10μM的MEK抑制剂PD0325901；
浓度为50nm-5μM的TGF-β抑制剂A83-01；
浓度为50nm-5μM的ROCK抑制剂thiazovivin；以及
浓度为20nm-2μM的BMP抑制剂DMH1。
5.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，按照重量百分比，所述培养基含有：
浓度为3μM的GSK抑制剂CHIR99021；
浓度为1μM的MEK抑制剂PD0325901；
浓度为0.5μM的TGF-β抑制剂A83-01；
浓度为0.5μM的ROCK抑制剂thiazovivin；以及
浓度为0.2μM的BMP抑制剂DMH1。
6.一种用于制备神经干细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有细胞信号通路抑制剂，所述细胞信号通路抑制剂为选自GSK抑制剂、MEK抑制剂、TGF-β抑制剂、ROCK抑制剂和BMP抑制剂的至少一种。
7.根据权利要求6所述的制备神经干细胞的试剂盒，其特征在于，所述细胞信号通路抑制剂为GSK抑制剂CHIR99021、MEK抑制剂PD0325901、TGF-β抑制剂A83-01、ROCK抑制剂thiazovivin和BMP抑制剂DMH1的组合。
8.根据权利要求7所述的制备神经干细胞的试剂盒，其特征在于，所述GSK抑制剂CHIR99021、MEK抑制剂PD0325901、TGF-β抑制剂A83-01、ROCK抑制剂thiazovivin和BMP抑制剂DMH1分别设置在不同的容器中。
9.根据权利要求6所述的制备神经干细胞的试剂盒，其特征在于，进一步包括基础培养基，所述基础培养基为mTeSR1。
10.根据权利要求9所述的制备神经干细胞的试剂盒，其特征在于，所述细胞信号通路抑制剂溶解于所述基础培养基中。
11.根据权利要求10所述的制备神经干细胞的试剂盒，其特征在于，按照重量百分比，所述细胞信号通路抑制剂为：浓度为3μM的GSK抑制剂CHIR99021、浓度为1μM的MEK抑制剂PD0325901、浓度为0.5μM的TGF-β抑制剂A83-01、浓度为0.5μM的ROCK抑制剂thiazovivin以及浓度为0.2μM的BMP抑制剂DMH1的组合。
12.一种用于制备神经干细胞的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-5任一项所述的培养基。
13.权利要求6-12任一项所述的试剂盒在制备神经干细胞中的用途。
14.权利要求1-5任一项所述的培养基在制备神经干细胞中的用途。
15.一种制备神经干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用权利要求1-5任一项所述的培养基，培养体细胞，所述体细胞携带编码选自Oct4、Sox2、Klf4以及miR302的至少一种多功能干细胞因子的核酸序列，以便诱导所述体细胞转分化为神经干细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述体细胞为人尿液脱落细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述体细胞是通过下列步骤获得的：
对人尿液进行离心，以便获得沉淀物；
利用尿液培养基对所述沉淀物进行培养，以便获得原代人尿液脱落细胞；以及
利用携带编码选自Oct4、Sox2、Klf4以及miR302的至少一种多功能干细胞因子的核酸序列的载体，对所述原代人尿液脱落细胞进行转化，以便获得所述体细胞。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述载体携带编码Oct4、Sox2、Klf4以及miR302的核酸序列。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述载体为分别携带编码Oct4、Sox2、Klf4以及miR302的核酸序列的不同质粒。
20.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，利用电转导对所述原代人尿液脱落细胞进行转化。
21.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，进一步包括：
利用基础培养基，对所述神经干细胞进行贴壁培养；以及
将经过贴壁培养的神经干细胞在神经干细胞培养基中进行培养，所述神经干细胞培养基为含有1％N2 supplement、1％非必需氨基酸、0.1％肝素、20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和20ng/ml表皮生长因子的DMEM/F12培养基。
22.一种神经干细胞或其衍生物，其特征在于，所述神经干细胞是根据权利要求15-21任一项所述的方法获得的。
23.权利要求22所述的神经干细胞或其衍生物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗神经细胞损伤所引起的疾病。
24.一种治疗神经细胞损伤所引起的疾病的方法，其特征在于，包括：
将权利要求22所述的神经干细胞或其衍生物引入患者体内。
25.一种制备神经细胞的方法，其特征在于，将权利要求22所述的神经干细胞在适于分化的条件下进行培养。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，利用含有1％N2 supplement、1％非必需氨基酸、0.1％肝素，并添加有浓度均为10ng/mL的神经营养因子BDNF、GDNF、CNTF和IGF的DMEM/F12培养基，对所述神经干细胞进行培养，以便获得不同类型的神经元和神经胶质细胞。
27.一种用于制备神经干细胞的系统，其特征在于，包括：
分离装置，所述分离装置用于从人尿液中分离人尿液脱落细胞；
转化装置，所述转化装置与所述分离装置相连，并且设置有携带编码选自Oct4、Sox2、Klf4以及miR302的至少一种多功能干细胞因子的核酸序列的载体，以便对所述人尿液脱落细胞进行转化；以及
转分化装置，所述转分化装置与所述转化装置相连，并且设置有权利要求1-5任一项所述的培养基，用于对所述经过转化的人尿液脱落细胞进行转分化，以便诱导所述经过转化的人尿液脱落细胞转分化为神经干细胞。
28.一种筛选诱导神经干细胞分化的化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求22所述的神经干细胞与候选化合物接触；以及
检测接触所述候选化合物前后神经干细胞的多能性，
其中，基于接触所述候选化合物后，所述神经干细胞的多能性是否降低，判断所述候选化合物是否具有诱导神经干细胞分化的活性。
29.一种治疗神经退行性疾病和神经损伤疾病的方法，其特征在于，包括以下步骤：
分离患者的体细胞；
根据权利要求15-21任一项所述的方法，基于所述体细胞，制备神经干细胞；以及
将所述神经干细胞引入所述患者体内。
30.一种鉴定制剂对神经系统是否具有影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述制剂与权利要求22所述的神经干细胞接触；以及
对接触前后的神经干细胞进行检测，
其中，
基于所述神经干细胞的行为变化，判断所述制剂对神经系统是否具有影响。
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