CN109294991A - 神经干细胞诱导分化培养基及神经干细胞诱导分化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种神经干细胞诱导分化培养基及神经干细胞诱导分化的方法。其中，该神经干细胞诱导分化培养基包括基础培养基和添加剂；其中，基础培养基为DMEM/F12培养基；添加剂包括谷氨酰胺1～5mM，GSK‑3抑制剂2～8μM，BMP抑制剂2～10μM，ALK抑制剂2～10μM，细胞培养添加剂0.5％～2％和双抗0.5％～2％。本发明的神经干细胞诱导分化培养基成分明确且简单、分化效率高、分化时间短，且不含动物源成分，分化过程中不需要动物源细胞做饲养层，无需形成EB，也不需要多次更换分化中的培养液组分，短时间内可获得大量高纯度的神经干细胞。

Description

神经干细胞诱导分化培养基及神经干细胞诱导分化的方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种神经干细胞诱导分化培养基及神经干细胞诱导分化的方法。

背景技术

日本学者中山申弥(Shinya Yamanaka)于2006年和2007年，首次通过导入四个转录因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)的方法，分别成功将小鼠(Takahashi and Yamanaka.,2006)和人(Takahashi et al.,2007)的皮肤成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)，并因此获得了2012年的诺贝尔医学和生理学奖。hiPS细胞(人诱导多能干细胞)具备hES细胞(人胚胎干细胞)的所有分化能力，并且没有伦理问题，在不久的将来会完全取代hES细胞，成为再生医学的最主要细胞来源。

神经科学研究包括其发育，分化以及退化的全过程，涉及结构与发育生物学，神经兴奋与突触传导，神经退行性疾病研究等。神经干细胞(neural stem cell，NSCs)是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞(神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞等)，神经干细胞在神经发育和修复受损神经组织中发挥重要作用。

目前神经退行性疾病如帕金森病、阿尔兹海默等均是由于神经细胞的病变而引起，目前再生医学为这些疾病带来希望，因此需要大量的神经元等神经干细胞来源细胞解决研究中的细胞来源问题。

常见的iPSCs诱导神经分化有拟胚体(Embryoid Bodies,EBs)法、基质细胞共培养法和单层细胞诱导法。

其中，拟胚体(Embryoid Bodies,EBs)法：当hiPSCs在悬浮培养中分化，形成一个三维的细胞聚合体时称之为拟胚体(embryoid body，EB)。EB形成以后，可以定向诱导其向神经系统分化。当进一步分化之后，EB形成了一个多层结构，这种多层结构包括多种混合型细胞，其中包括神经细胞。为了增强其神经分化并且提高所需细胞的存活率，通常需要在培养基中添加生长因子及成形素。最近，Koch等发明了一种方法，该方法使用由hESC短期培养产生的EB在贴壁条件下直接分化，可以完成由hESC逐步分化成人类神经前体细胞。另外，有人发明了一种液-固界面交替的培养系统来产生同种均一的人类神经前体细胞。这种方法实现了三维立体并且形成了紧密相连的神经组织。当神经前体细胞诱导形成之后，再根据需要将分化成的神经前体细胞用特定的神经细胞培养基(添加有不同神经细胞生长因子)进一步分化成所需的神经细胞。

该方法的局限性在于：1)形成EB的变异性(由于初始不同的细胞数目或者分化所持续时间)影响了人类神经前体细胞产生的数量；2)存在于EB不同层的成形素，其浓度的不均一性形成了一个浓度梯度，导致了不同胚层组织不同发展阶段的细胞产生；3)在神经分化过程中，EBs中聚集的细胞阻碍对细胞形态学的监控。

基质细胞共培养法：基质细胞通过分泌细胞因子，促进培养体系中目的细胞的生长。为了促进hiPSCs向神经细胞分化，将hiPSCs与PA6或MS5基质细胞共培养，这些基质细胞分泌或者表达出还未完全被鉴定的因子，这些因子能促进神经玫瑰花样结构的形成，并且被称之为“基质细胞来源的诱导性活力分子”(SDIA)，这种共培养方法的理论基础是中胚层的信号有助于神经分化。虽然这项技术有效的促进了hESC分化成神经细胞，但这种模型不适宜细致分析这种驱动其向神经分化的分子机制，因为由那些基质细胞分泌的因子是随基质细胞种类变化而变化的。

单层细胞诱导法：在胚胎形成过程中，神经胚形成是器官形成的开端，外胚层的形成可以通过不改变饲养层细胞而延长hiPSCs的培养时间来实现。事实上，在无血清和成形素培养条件下，hiPSCs是可以分化成同种均一类型的神经上皮细胞的，这些神经上皮细胞形成玫瑰花样的结构，它们具有神经管的细胞分子结构。此分化过程大致需要2周，与人类胚胎发育过程中神经管的形成在所需时间上是一致的。但是在玫瑰花样阶段，细胞容易形成中枢或周围神经系统。随着体外培养时间的延长，多向分化潜能的缺失，神经分化也会停止。应用这种方法所获得的细胞在很大程度上是不均一的。因此需要改进培养条件来促进细胞分化成均一的神经前体细胞。

上述分化方法中，单层细胞诱导法与基质细胞共培养法均存在分化不均一、成分不纯净等缺点，因此目前绝大部分分化方法是模拟体内发育过程分步诱导(EB法)。以其中一篇文献为例，培养多潜能干细胞用的是20％KOSR加入到DMEM/F12基础培养基，再添加谷氨酸、bFGF、非必须氨基酸(NEAA)等。分化时，先将干细胞传代，在低贴附的培养皿内悬浮培养形成拟胚体(EB)，此时用DMEM/F12添加ITS培养，第4天将EB贴附到基质胶包被的培养板中，形成rosette后手动分离或者传代，期间加入Noggin和SB421542，分化到第14天得到神经干细胞。

现有技术中部分多潜能干细胞仍然使用明胶包被和饲养层细胞(小鼠胚胎成纤维细胞，mouse embryonic fibroblasts,MEF)的支持，还采用成分复杂的敲除血清替代品(Knockout Serum Replacement,KOSR)作为主要的培养基添加剂，这限制了细胞产品的后续应用。此外，EB成分复杂，在分化过程中产生不同种类的杂细胞，且很难纯化到高纯度的目的细胞；且这些分化方法使用不同的添加剂，使得分化成本较高，不利于大批量制备。另外，传统分化方法周期教长，进一步阻碍了目的细胞的获得。

发明内容

本发明旨在提供一种神经干细胞诱导分化培养基及神经干细胞诱导分化的方法，以解决现有技术中神经干细胞诱导分化成本高、周期长且不稳定的而技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种神经干细胞诱导分化培养基。该神经干细胞诱导分化培养基包括基础培养基和添加剂；其中，基础培养基为DMEM/F12培养基；添加剂包括谷氨酰胺1～5mM，GSK-3抑制剂2～8μM，BMP抑制剂2～10μM，ALK抑制剂2～10μM，细胞培养添加剂0.5％～2％和双抗0.5％～2％。

进一步地，添加剂包括谷氨酰胺2～4mM，GSK-3抑制剂3～6μM，BMP抑制剂2～8μM，ALK抑制剂2～10μM，细胞培养添加剂0.5％～2％和双抗1％。

进一步地，添加剂包括谷氨酰胺3mM，GSK-3抑制剂4μM，BMP抑制剂5μM，ALK抑制剂5μM，细胞培养添加剂1％和双抗1％。

进一步地，GSK-3抑制剂为CHIR99021，BMP抑制剂为DMH1，ALK抑制剂为SB431542，细胞培养添加剂为B27，双抗为青霉素和链霉素。

进一步地，基础培养基保存在4～8℃，添加剂保存在-20～-80℃冰冻保存。

进一步地，神经干细胞诱导分化培养基在使用前配制，具体包括以下步骤：在2～8℃化冻添加剂；将添加剂与基础培养基以1：50的体积混合后形成神经干细胞诱导分化培养基。

进一步地，神经干细胞诱导分化培养基在使用前0～14天配制，并在2～8℃保存。

根据本发明的另一方面，提供了一种神经干细胞诱导分化的方法。该方法包括采用上述神经干细胞诱导分化培养基培养。

进一步地，包括以下步骤：S1，接种诱导多能干细胞或胚胎干细胞于基质胶中，在细胞汇合度达到90％～100％时加入神经干细胞诱导分化培养基，每两天换一次神经干细胞诱导分化培养基；S2，当出现大量玫瑰花样细胞后，加入神经细胞消化液消化，终止消化后，用神经干细胞培养基重悬细胞，并接种，每两到三天换一次神经干细胞培养基；S3，当神经球<＝200μm时，进行神经球传代；以及S4，传代3～4次后，收集到大量神经干细胞，再按贴壁培养或直接向下分化。

进一步地，S2中重悬的细胞在神经干细胞诱导分化培养基中培养包括：水平十字摇匀，5％CO₂的37℃恒温细胞培养箱中培养24小时。

本发明的神经干细胞诱导分化培养基成分明确且简单、分化效率高、分化时间短，且不含动物源成分，分化过程中不需要动物源细胞做饲养层，无需形成EB，也不需要多次更换分化中的培养液组分，短时间内可获得大量高纯度的神经干细胞。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了实验一中以胚胎干细胞H9为例，使用本发明的培养基诱导分化得到神经干细胞的过程中的细胞形态变化(day 1-6，第1天到第6天)；以及细胞传代后2天(传代后)的细胞形态；。

图2示出了实验二中以诱导多能干细胞UiPSCs为例，使用本发明的培养基诱导分化得到神经干细胞的过程中的细胞形态变化(day 1-6)；以及细胞传代后2天(传代后)的细胞形态；

图3示出了实验三中诱导多能干细胞UiPSCs为例，使用本发明的培养基诱导分化(非最佳浓度配比)得到神经干细胞的过程中的细胞形态变化(day 1-6)；以及细胞传代后2天(传代后)的细胞形态；

图4示出了实验四中激光共聚焦显微镜图像。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

针对现有技术中神经干细胞诱导分化过程中存在的技术问题，本发明提供了一种适用于无饲养层细胞培养、成分完全明确的hiPSCs定向分化为神经干细胞的诱导培养基，该培养基使用方法简便，流程清晰。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种神经干细胞诱导分化培养基。该神经干细胞诱导分化培养基包括基础培养基和添加剂；其中，基础培养基为DMEM/F12培养基；所述添加剂包括1～5mM，GSK-3抑制剂2～8μM，BMP抑制剂2～10μM，ALK抑制剂2～10μM，细胞培养添加剂0.5％～2％和双抗0.5％～2％。

其中，抑制剂可以采用本领域的常规抑制剂，例如GSK-3的抑制剂可以为CHIR-99021、SB216763或者CHIR-98014；BMP抑制剂可以为DMH1、LDN-212854或者ML347；ALK抑制剂可以为SB431542、GW788388或者RepSox。

上述添加剂各组分含量是指在神经干细胞诱导分化培养基中的浓度含量。

本发明的神经干细胞诱导分化培养基成分明确且简单、分化效率高、分化时间短，且不含动物源成分，分化过程中不需要动物源细胞做饲养层，无需形成EB，也不需要多次更换分化中的培养液组分，短时间内可获得大量高纯度的神经干细胞。

优选的，添加剂包括谷氨酰胺2～4mM，GSK-3抑制剂3～6μM，BMP抑制剂2～8μM，ALK抑制剂2～10μM，细胞培养添加剂0.5％～2％和双抗1％。

更优选的，添加剂包括谷氨酰胺3mM，GSK-3抑制剂4μM，BMP抑制剂5μM，ALK抑制剂5μM，细胞培养添加剂1％和双抗1％。

根据本发明一种典型的实施方式，优选的，GSK-3抑制剂为CHIR99021，BMP抑制剂为DMH1，ALK抑制剂为SB431542，细胞培养添加剂为B27，双抗为青霉素和链霉素。其中双抗可以是商品化已经配好的青霉素混合链霉素，通常按1％直接使用。

根据本发明一种典型的实施方式，基础培养基保存在4～8℃，添加剂保存在-20～-80℃冰冻保存。

根据本发明一种典型的实施方式，神经干细胞诱导分化培养基在使用前配制，具体包括以下步骤：在2～8℃化冻添加剂；将添加剂与基础培养基以1：50的体积混合后形成神经干细胞诱导分化培养基。优选的，神经干细胞诱导分化培养基在使用前0～14天配制，并在2～8℃保存。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种神经干细胞诱导分化的方法。该方法采用上述任一种神经干细胞诱导分化培养基培养。

优选的，包括以下步骤：S1，接种诱导多能干细胞或胚胎干细胞于基质胶(例如：基质胶包被过的六孔板)中，在细胞汇合度达到90％～100％时加入神经干细胞诱导分化培养基，每两天换一次神经干细胞诱导分化培养基；S2，当出现大量玫瑰花样细胞后，加入神经细胞消化液消化，终止消化后，用神经干细胞培养基(本领域的常规培养基)重悬细胞，并接种，每两到三天换一次神经干细胞培养基；S3，当神经球<＝200μm时，进行神经球传代；以及S4，传代3～4次后，收集到大量神经干细胞，再按贴壁培养或直接向下分化。

根据本发明一种典型的实施方式，S2中重悬的细胞在神经干细胞诱导分化培养基中培养包括：水平十字摇匀，5％CO₂的37℃恒温细胞培养箱中培养2。

在本发明一典型的实施例中，神经干细胞诱导分化的方法包括：

1)接种iPSC/ESC于基质胶(例如：E8或本公司的PSCeasy)包被过的6孔板，在汇合度达到100％时加入4mL神经诱导培养基，每2天换液；

2)6天时出现大量玫瑰花样细胞(rosette样细胞)，进行消化：

PBS清洗皿底，加入神经细胞消化液消化10min左右，加入神经干细胞培养基中止消化，800rpm离心3min，弃去上清，用4mL神经干细胞培养基重悬细胞，接种于10cm的培养皿(盛有常规神经干细胞培养基)中，水平十字摇匀，5％CO₂的37℃恒温细胞培养箱中培养24h；

3)每2～3天换液；

4)当神经球<＝200μm时，进行神经球传代：

将皿里培养基吸入15mL离心管中，800rpm离心1min，弃去上清，用4mL PBS重悬，800rpm离心1min，弃去上清，加入神经细胞消化液2-4mL，将离心管平放于37℃恒温细胞培养箱中孵育10-15min。当绝大多数神经球变为单细胞之后，800rpm离心3min，弃去上清，用神经球维持培养基重悬，接种于培养皿中；

5)传代3～4次后，可收集到大量神经干细胞(纯度约90％)，再按需贴壁培养或直接向下分化(如神经元)。

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

在下列实施例中，通过以下步骤配置神经干细胞诱导分化培养基：

培养液添加剂：

①谷氨酰胺1～5mM，②GSK-3抑制剂2～8μM，③BMP抑制剂2～10μM，④ALK抑制剂2～10μM，⑤细胞培养添加剂0.5％～2％和⑥双抗0.5％～2％。

上述成分中，GSK-3抑制剂为CHIR99021，所述BMP抑制剂为DMH1，所述ALK抑制剂为SB431542，所述细胞培养添加剂为B27，所述双抗为青霉素和链霉素。

培养液基础液：

DMEM/F12。

在下列实施例中培养基制备方法为：使用时按照规定量将所有成分混合均匀。

实施例1-5中的重编程培养基的组分如表1所示。

所用基础培养基为DMEM/F12，可从Hyclone购买。所用B27添加剂、双抗可从thermofisher购买。

实施例1～5中的添加剂在-20～-80-℃单独冰冻保存。

将上述实施例1～5中的神经干细胞诱导分化培养基按照如下步骤配制：

在2～8℃化冻添加剂，随后将添加剂加入基础培养基形成神经干细胞诱导分化培养基工作液，该培养基可在2～8℃稳定储存达两周。

神经干细胞诱导分化实施例

实验一：

1.实验材料：人胚胎干细胞(H9)

2.培养基：实施例3中的神经干细胞诱导分化培养基

3.实验步骤：

在H9细胞汇合度达到80％时传代，并接种到提前使用matrigel包被的六孔板中，干细胞培养液培养；

在汇合度达到100％时加入4mL神经干细胞诱导分化培养基，每2d换液；

6d时出现大量rosette(玫瑰花)样细胞，进行消化：PBS清洗皿底，加入神经细胞消化液消化10min左右，加入神经干细胞诱导分化培养基中止消化，800rpm离心3min，弃去上清，用4mL神经干细胞诱导分化重悬细胞，接种于10cm的培养皿中，水平十字摇匀，5％CO₂的37℃恒温细胞培养箱中培养24小时；

每2-3d换液；

当神经球大小为<＝200μm时，进行神经球传代：将皿里培养基吸入15mL离心管中，800rpm离心1min，弃去上清，用4mL PBS重悬，800rpm离心1min，弃去上清，加入神经细胞消化液(Gibco，cat.15050057)2-4mL，将离心管平放于37℃恒温细胞培养箱中孵育10-15min。当绝大多数神经球变为单细胞之后，800rpm离心3min，弃去上清，用神经干细胞诱导分化培养基重悬，接种于培养皿中；

上述方法中，分化的第6天可得到大量未纯化的神经干细胞，经过后续传代筛选后纯度可超过90％。

图1展示了实施例3(最优浓度)的分化过程中不同时期的细胞形态图，及传代纯化后的细胞形态图。使用实施例3中浓度进行分化时，前4天只需要隔天换液而无需进行其他操作，可以观察到细胞密度逐渐增加，到第6天时已经有大量神经花环(rosette)样细胞出现，传代后得到大量神经球，后续只需要消化接种并重复纯化即可得到大量神经干细胞。

实验二：

1.实验材料：人诱导多能干细胞(UiPSCs)

2.培养基：实施例3中的神经干细胞诱导分化培养基

3.实验步骤：

在UiPSCs细胞汇合度达到80％时传代，并接种到提前使用matrigel包被的六孔板中，干细胞培养液培养；

在汇合度达到100％时加入4mL神经干细胞诱导分化培养基，每2d换液；

6d时出现大量rosette样细胞，进行消化：PBS清洗皿底，加入神经细胞消化液消化10min左右，加入神经干细胞诱导分化培养基中止消化，800rpm离心3min，弃去上清，用4mL神经干细胞诱导分化重悬细胞，接种于10cm的培养皿中，水平十字摇匀，5％CO₂的37℃恒温细胞培养箱中培养24小时；

每2-3d换液；

当神经球大小为<＝200μm时，进行神经球传代：将皿里培养基吸入15mL离心管中，800rpm离心1min，弃去上清，用4mL PBS重悬，800rpm离心1min，弃去上清，加入神经细胞消化液2-4mL，将离心管平放于37℃恒温细胞培养箱中孵育10-15min。当绝大多数神经球变为单细胞之后，800rpm离心3min，弃去上清，用神经干细胞诱导分化培养基重悬，接种于培养皿中；

上述方法中，分化的第6天可得到大量未纯化的神经干细胞，经过后续传代筛选后纯度可超过90％。

图2展示了实施例3(最优浓度)的分化过程中不同时期的细胞形态图，及传代纯化后的细胞形态图。使用实施例3中浓度进行分化时，前4天只需要隔天换液而无需进行其他操作，可以观察到细胞密度逐渐增加，且有神经花环(rosette)样细胞出现，第6天时rosette占比更多，此时传代即可得到大量神经球，后续只需要消化接种并重复纯化即可得到大量神经干细胞。

上述实验二中的UiPSCs是体细胞经过重编程获得的，实验使用了尿液来源的UiPSCs，经测试，血液来源的BiPSCs及皮肤来源的FiPSCs，均能达到图2中展示的结果。

实验三：

1.实验材料：人诱导多能干细胞(UiPSCs)

2.培养基：实施例1中的神经干细胞诱导分化培养基

3.实验步骤：

在UiPSCs细胞汇合度达到80％时传代，并接种到提前使用matrigel包被的六孔板中，干细胞培养液培养；

在汇合度达到100％时加入4mL神经干细胞诱导分化培养基，每2d换液；

6d时出现rosette样细胞，进行消化：PBS清洗皿底，加入神经细胞消化液消化10min左右，加入神经干细胞诱导分化培养基中止消化，800rpm离心3min，弃去上清，用4mL神经干细胞诱导分化重悬细胞，接种于10cm的培养皿中，水平十字摇匀，5％CO₂的37℃恒温细胞培养箱中培养24小时；

每2-3d换液；

当神经球大小为<＝200μm时，进行神经球传代：将皿里培养基吸入15mL离心管中，800rpm离心1min，弃去上清，用4mL PBS重悬，800rpm离心1min，弃去上清，加入神经细胞消化液2-4mL，将离心管平放于37℃恒温细胞培养箱中孵育10-15min。当绝大多数神经球变为单细胞之后，800rpm离心3min，弃去上清，用神经干细胞诱导分化培养基重悬，接种于培养皿中；

上述方法中，分化的第6天可得到未纯化的神经干细胞。

图3展示了实施例1(最低浓度)的分化过程中不同时期的细胞形态图，及传代纯化后的细胞形态图。分化开始时，本实验与实验二起始状态相同，但换液到第4天时，出现的rosette样细胞较实验二少，到第6天时可观察到rosette样细胞明显少于实验二，但仍能得到该细胞。后续传代后，也可得到形态正常的神经球。

实验四：

1.实验目的：人神经干细胞免疫荧光染色鉴定

2.实验步骤：

(1)将已包被基质胶(Matrigel)的玻片置于24孔板中，取上述分化实验得到的神经球接种到玻片上，使用神经干细胞诱导分化培养基培养1～2天；

(2)4％多聚甲醛固定上述玻片上的细胞15min；

(3)PBS洗3次，每次5min；

(4)加入0.3％Triton×100封闭20min；

(5)加入与二抗相同的5％血清封闭40min；

(6)PBS洗3次，每次5min；

(7)加入用1％二抗相同血清稀释的一抗(Nestin、Sox2)，4℃过夜；

(8)PBS洗3次，每次5min；

(9)加入用1％二抗相同血清稀释的二抗，室温避光90min；

(10)PBS洗3次，每次5min；

(11)用PBS按1：1000稀释的hoechst或DAPI避光核染15min；

(12)PBS洗3次，每次5min；

(13)小心擦干水迹，加入适量抗荧光淬灭剂封片，中性树脂固定封片；

(14)避光平放风干2h，使用激光共聚焦显微镜采集图像，结果见图4。

SOX2是一种胚胎神经嵴干细胞转录因子，NESTIN是一种中间丝类型的蛋白，两者均是神经干细胞特异性的生物标记物。通过免疫荧光染色，可以看出通过上述方法分化得到的细胞是SOX2阳性，同时是NESTIN阳性，观察重合的MERGE图，可以看出两种标记物表达位置与预期相符，证明分化得到的细胞是神经干细胞。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：

1.本发明的神经干细胞诱导分化培养基成分明确，不含动物源成分；

2.分化过程中不需要动物源细胞做饲养层；

3.分化过程无需形成EB；

4.培养基成分简单；

5.根据分化的过程，独特设计了B27添加剂和各种浓度小分子抑制剂，这些小分子的添加大大提高细胞的分化效率。

6.分化周期短；

7.分化效率高；

8.神经干细胞诱导分化培养基分化得到的细胞谱系更广，包括各种诱导来源的人诱导多能干细胞和人胚胎干细胞的不同细胞系。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种神经干细胞诱导分化培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加剂；

其中，所述基础培养基为DMEM/F12培养基；

所述添加剂包括谷氨酰胺1～5mM，GSK-3抑制剂2～8μM，BMP抑制剂2～10μM，ALK抑制剂2～10μM，细胞培养添加剂0.5％～2％和双抗0.5％～2％。

2.根据权利要求1所述的神经干细胞诱导分化培养基，其特征在于，所述添加剂包括谷氨酰胺2～4mM，GSK-3抑制剂3～6μM，BMP抑制剂2～8μM，ALK抑制剂2～10μM，细胞培养添加剂0.5％～2％和双抗1％。

3.根据权利要求2所述的神经干细胞诱导分化培养基，其特征在于，所述添加剂包括谷氨酰胺3mM，GSK-3抑制剂4μM，BMP抑制剂5μM，ALK抑制剂5μM，细胞培养添加剂1％和双抗1％。

4.根据权利要求1所述的神经干细胞诱导分化培养基，其特征在于，所述GSK-3抑制剂为CHIR99021，所述BMP抑制剂为DMH1、LDN-212854或者ML347，所述ALK抑制剂为SB431542、GW788388或者RepSox，所述细胞培养添加剂为B27，所述双抗为青霉素和链霉素。

5.根据权利要求1所述的神经干细胞诱导分化培养基，其特征在于，所述基础培养基保存在4～8℃，所述添加剂保存在-20～-80℃冰冻保存。

6.根据权利要求1所述的神经干细胞诱导分化培养基，其特征在于，所述神经干细胞诱导分化培养基在使用前配制，具体包括以下步骤：

在2～8℃化冻所述添加剂；

将所述添加剂与所述基础培养基以1：50的体积混合后形成所述神经干细胞诱导分化培养基。

7.根据权利要求1所述的神经干细胞诱导分化培养基，其特征在于，所述神经干细胞诱导分化培养基在使用前0～14天配制，并在2～8℃保存。

8.一种神经干细胞诱导分化的方法，其特征在于，采用如权利要求1至7中任一项所述的神经干细胞诱导分化培养基培养。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，接种诱导多能干细胞或胚胎干细胞于基质胶中，在细胞汇合度达到90％～100％时加入所述神经干细胞诱导分化培养基，每两天换一次所述神经干细胞诱导分化培养基；

S2，当出现大量玫瑰花样细胞后，加入神经细胞消化液消化，终止消化后，用神经干细胞培养基重悬细胞，并接种，每两到三天换一次所述神经干细胞培养基；

S3，当神经球<＝200μm时，进行神经球传代；以及

S4，传代3～4次后，收集到大量神经干细胞，再按贴壁培养或直接向下分化。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述S2中重悬的细胞在所述神经干细胞诱导分化培养基中培养包括：水平十字摇匀，5％CO₂的37℃恒温细胞培养箱中培养24小时。