CN114214279A - 人脊髓神经干细胞诱导分化培养体系及方法 - Google Patents

人脊髓神经干细胞诱导分化培养体系及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人脊髓神经干细胞诱导分化培养体系及方法，该人脊髓神经干细胞诱导分化培养体系主要包括脊髓神经干细胞诱导培养基和脊髓神经干细胞维持培养基，其中，脊髓神经干细胞诱导培养基以N2B27培养基为基础培养基，每10ml N2B27培养基中包括10‑12μl BMP抑制剂、10‑12μl ALK5抑制剂、10‑12μl GSK‑3抑制剂、10‑12μl FGF2和10‑12μlFGF8；脊髓神经干细胞维持培养基以N2B27培养基为基础培养基，每50ml N2B27培养基中包括10‑12μl ALK5抑制剂、15‑18μl GSK‑3抑制剂和1‑1.2μl Hedgehog激动剂。通过该诱导分化培养体系对人胚胎干细胞进行诱导分化培养，可定向分化形成人脊髓NSC细胞，这些人脊髓神经干细胞具有多向分化潜能，从而能够更好地理解人脊髓发育/再生相关的细胞过程，对后续提供人脊髓损伤和退变等疾病的治疗策略具有重要意义。

Description

人脊髓神经干细胞诱导分化培养体系及方法
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种人脊髓神经干细胞诱导分化培养体系，还涉及一种基于该人脊髓神经干细胞诱导分化培养体系进行的人脊髓神经干细胞诱导分化的方法。
背景技术
神经干细胞(Neural Stem Cell，NSC)是存在于神经系统中具有分化为神经元、星形胶质和少突胶质细胞的潜能，并能进行自我更新的细胞群。人胚胎干细胞(Humanembryonic stem cell，HESC)体外经诱导分化可形成NSC，因此成为研究干细胞治疗的重要平台。HESC具有自我更新(Self-renewal)和多能性(Pluripotent)的特点，体外可分化为三胚层(内胚层、中胚层和外胚层)进而分化成人体任意细胞。HESC定向脊髓神经干细胞分化更成为人神经发育研究的重要手段，也是目前治疗脊髓相关神经退行性疾病和脊髓损伤研究领域的热点，对脊髓神经发育生物学研究、脊髓损伤和脊髓退变等相关疾病的细胞替代治疗、疾病模型建立和相关药物筛选均有重要意义。
由于伦理限制，以人胚胎获得神经干细胞研究难以开展。其次，以动物胚胎为对象来源的神经干细胞被广泛运用，但是因种属差异病理和修复机制不尽相同，难以完全替代人相关研究。再者，脊髓损伤和脊髓退变等疾病的替代治疗，疾病模型建立和相关药物筛选都需合适的HESC衍生的脊髓神经干细胞来源。HESC衍生的脊髓NSC形成研究将为脊髓相关研究提供基础，具有较好的理论意义和实际效益。
如何寻找有效方法诱导HESC体外定向脊髓NSC的形成是目前面临的难题，诱导因子在HESC体外定向分化中起到非常重要的作用。目前，国际上重视采用多种诱导因子的外源性因素诱导HESC形成NSC的技术，但缺乏定向诱导HESC为脊髓神经干细胞的技术。国内更是缺乏同类研究技术，也没有类似专利技术的发布。
发明内容
有鉴于此，本发明有必要提供一种人脊髓神经干细胞诱导分化培养体系，通过激活WNT和FGF2/8信号以及双重抑制SMAD信号诱导HESC定向分化形成人脊髓NSC细胞，这些人脊髓神经干细胞具有多向分化潜能，可分化为人脊髓神经元以及神经胶质细胞，且脊髓神经干细胞可以在体外长期扩增。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明首先提供了一种人脊髓神经干细胞诱导分化培养体系，包括以下培养基：
脊髓神经干细胞诱导培养基，其以N2B27培养基为基础培养基，每10ml N2B27培养基中包括10-12μl BMP抑制剂、10-12μl ALK5抑制剂、10-12μl GSK-3抑制剂、10-12μl FGF2和10-12μl FGF8；
脊髓神经干细胞维持培养基，其以N2B27培养基为基础培养基，每50ml N2B27培养基中包括10-12μl ALK5抑制剂、15-18μl GSK-3抑制剂和1-1.2μl Hedgehog激动剂。
进一步方案，所述脊髓神经干细胞诱导培养基中，每10ml N2B27培养基中还添加有3.6-4.3μl 1000U/ml肝素。
进一步方案，还包括脊髓神经干细胞扩增培养基，所述脊髓神经干细胞扩增培养基以N2B27培养基为基础培养基，其中含有20-24ng/ml FGF2和20-24ng/ml EGF。
进一步方案，所述N2B27培养基以体积比为1：1的DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基作为基础培养基，且添加有1-1.2％的N2添加剂和2-2.4％的B27添加剂。
优选的，所述N2B27培养基中，还添加有1-1.2％青链霉素双抗和1-1.2％GlutaMAX添加剂。
本发明进一步提供了一种人脊髓神经干细胞诱导分化方法，采用如前述任一项所述的人脊髓神经干细胞诱导分化培养体系培养。
进一步方案，包括下列步骤：
获得融合度为40％-70％的单细胞生长的人胚胎干细胞；
加入脊髓神经干细胞诱导培养基，每天换液一次，诱导10天；
弃去脊髓神经干细胞诱导培养基，更换为脊髓神经干细胞维持培养基，每天换液一次，第五次传代后更换为脊髓神经干细胞扩增培养基继续培养。
进一步方案，在细胞传代过程中，使用Rock抑制剂提升单细胞存活率。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明中的人脊髓神经干细胞诱导分化培养体系可在较短时间内稳定高效的诱导出人脊髓神经干细胞，其分化纯度高。
本发明中的人脊髓神经干细胞诱导分化培养体系可诱导表达脊髓特征蛋白的人的脊髓神经干细胞，实现体外诱导人来源的脊髓神经干细胞，从而能够更好地理解人脊髓发育/再生相关的细胞过程，对后续提供人脊髓损伤和退变等疾病的治疗策略具有重要意义。
附图说明
图1为实施例4中双标免疫荧光方法检测多能性特征蛋白OCT4和神经外胚层特征蛋白PAX6表达的免疫细胞化学检测结果；
图2为实施例5中Western blot检测诱导10d神经干细胞标记Nestin及PAX6表达结果；
图3为实施例6中双标免疫荧光方法检测神经干细胞特征蛋白Nestin和脊髓特征蛋白HOXC9表达结果；
图4为实施例6中双标免疫荧光方法检测神经干细胞特征蛋白Nestin和SOX1表达结果；
图5为实施例7中荧光双标检测结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将结合具体的实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明第一方面提供了一种人脊髓神经干细胞诱导分化培养体系，包括以下培养基：
脊髓神经干细胞诱导培养基，其以N2B27培养基为基础培养基，每10ml N2B27培养基中包括10-12μl BMP抑制剂、10-12μl ALK5抑制剂、10-12μl GSK-3抑制剂、10-12μl FGF2和10μl FGF8，在本发明的一个或多个实施例中，每10ml N2B27培养基中包括10μl BMP抑制剂、10μl ALK5抑制剂、10μl GSK-3抑制剂、10μl FGF2和10μl FGF8；
脊髓神经干细胞维持培养基，其以N2B27培养基为基础培养基，每50ml N2B27培养基中包括10-12μl ALK5抑制剂、15-18μl GSK-3抑制剂和1-1.2μl Hedgehog激动剂，在本发明的一个或多个实施例中，每50ml N2B27培养基中包括10μl ALK5抑制剂、15μl GSK-3抑制剂和1μl Hedgehog激动剂。
本发明采用特殊组成的培养基，通过激活WNT和FGF2/8信号以及双重抑制SMAD信号诱导HESC定向分化形成人脊髓NSC细胞，并且这些人脊髓神经干细胞具有多向分化潜能，可分化为人脊髓神经元以及神经胶质细胞，且脊髓神经干细胞可以在体外长期扩增。
进一步方案，除了以上必要成分，所述脊髓神经干细胞诱导培养基中，可以选择性添加适量的肝素，比如每10ml N2B27培养基中还添加有3.6-4.3μl 1000U/ml肝素，在本发明的一个或多个实施例中，每10ml N2B27培养基中还添加有3.6μl 1000U/ml肝素。
进一步方案，还包括脊髓神经干细胞扩增培养基，通过该脊髓神经干细胞扩增培养基对人胚胎干细胞神经诱导分化后形成的脊髓神经干细胞进行扩增培养，维持其多向分化潜能，所述脊髓神经干细胞扩增培养基以N2B27培养基为基础培养基，其中含有20-24ng/ml FGF2和20-24ng/ml EGF，在本发明的一个或多个实施例中，其中含有20ng/ml FGF2和20ng/ml EGF。
进一步方案，所述N2B27培养基以体积比为1：1的DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基作为基础培养基，且添加有1-1.2％的N2添加剂和2-2.4％的B27添加剂，优选的，添加有1％N2添加剂和2％的B27添加剂，N2添加剂和B27添加剂的添加能够增强神经细胞生存能力，维持向神经细胞分化的潜能。
进一步方案，所述N2B27培养基中，还添加有1-1.2％青链霉素双抗和1-1.2％GlutaMAX添加剂，在本发明的一个或多个实施例中，添加有1％的青链霉素双抗和1％的GlutaMAX添加剂，具体的说，通过添加微量的青链霉素双抗防止培养液被细菌污染，通过添加微量GlutaMAX添加剂使得氨含量较低的培养物显示出更高的细胞活力。
本发明第二方面提供了一种人脊髓神经干细胞诱导分化方法，采用如本发明第一方面任一项所述的人脊髓神经干细胞诱导分化培养体系培养。
进一步方案，包括下列步骤：
获得融合度为40％-70％的单细胞生长的人胚胎干细胞；
加入脊髓神经干细胞诱导培养基，每天换液一次，诱导10天；
弃去脊髓神经干细胞诱导培养基，更换为脊髓神经干细胞维持培养基，每天换液一次，第五次传代后更换为脊髓神经干细胞扩增培养基继续培养。
进一步方案，在细胞传代过程中，使用Rock抑制剂提升单细胞存活率，在本发明的一个或多个实施例中，Rock抑制剂选择Y27632。
下面结合具体的实施例对本发明的技术方案进行进一步的说明。
实施例1培养基的配制
1、N2B27培养基(以配置500mL N2B27培养基为例)：
Figure BDA0003375461070000041
Figure BDA0003375461070000051
该培养基中，青链霉素双抗和GlutaMAX添加剂可根据需要选择添加，从而防止培养液被细菌污染，通过添加微量GlutaMAX添加剂使得氨含量较低的培养物显示出更高的细胞活力。
2、脊髓神经干细胞诱导培养基(以配置10mL脊髓神经干细胞诱导培养基为例)
Figure BDA0003375461070000052
其中，该脊髓神经干细胞诱导培养基中，通过添加特定的抑制剂以及生长因子信号蛋白，实现调节特定种类细胞的增值和分化的目的。
3、脊髓神经干细胞维持培养基(以50ml脊髓神经干细胞维持培养基为例)
Figure BDA0003375461070000053
该脊髓神经干细胞维持培养基能够实现WNT/SHH的持续激活和SMAD2/3的抑制，从而可以指定细胞向脊髓神经干细胞的分化，并在较长时间内维持细胞的干性。
4、脊髓神经干细胞扩增培养基
以N2B27培养基为基础培养基，其中添加20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子FGF2、20ng/ml表皮细胞生长因子EGF，从而调节特定种类细胞的增殖和分化，并维持细胞增殖能力。
实施例2人胚胎干细胞(以H9细胞为例，其中，H9细胞购自广州贵一生物科技有限公司)传代培养
H9细胞的复苏
细胞复苏前1个小时，使用Matrigel基质胶包被培养皿，提升细胞贴壁效率，具体的说，6孔板的每孔用1ml Matrigel溶液(由160μL Matrigel溶于冰上预冷的12mL的DMEM/F12培养基中获得)铺板，室温中放置1h以上，超净台紫外消毒；同时将DMEM/F12培养基，mTeSRTM1培养基从冰箱中取出37℃水浴锅中预热；
将液氮中冻存的H9细胞取出，立即放入37℃水浴中；待完全融化后，将H9细胞混入5mL的温暖的DMEM/F12培养基中，用800r离心机离心5分钟后去除上清液；用2mL mTesRTM1培养基轻轻重悬细胞，吹打一次，保持细胞聚集状态，保持细胞团块生长提升存活率；将悬浮细胞后转入Matrigel处理过的培养板，37℃、5％CO2培养箱培养。
H9细胞的传代
待H9细胞达到80％融合时，进行传代，单细胞传代种板时使用Rock抑制剂孵育1h后再使用Accutase酶消化为单细胞，使用含Rock抑制剂的培养液重悬细胞，从而提升单细胞存活及贴壁效率，具体步骤如下：
6孔板的每孔用1ml Matrigel溶液(由160μl Matrigel溶于冰上预冷的12mL的DMEM/F12培养基中获得)铺板，室温中放置1h以上，获得Matrigel胶包被的六孔培养板；
H9细胞经含终浓度10μM Y27623的mTeSRTM1培养液在37℃培养箱孵育1h；使用Accutase(1ml/孔)37℃消化6-8min，使用DMEM/F12培养基终止消化；吹打细胞脱落后转移至15ml离心管中，室温500rpm离心5min，弃去上清，使用含10μM Y27623的mTeSR1培养液重悬细胞，吹打使之分散为单细胞状态，转移至Matrigel胶包被的六孔培养板上(2ml/孔)，前后左右晃动六孔培养板使细胞团分散均匀，于37℃、5％CO2培养箱培养。
实施例3 H9细胞诱导分化
将实施例2中传代获得的H9细胞，次日更换为mTeSR1培养基，待H9细胞生长达50％融合时更换为实施例1中脊髓神经干细胞诱导培养基培养。培养期间视细胞生长密度传代1-2次，使用Y27632提升单细胞存活率，具体传代方法同实施例2。
实施例4检测多能性特征蛋白OCT4和神经外胚层特征蛋白PAX6表达
本实施例中采用本领域中常规的双标免疫荧光方法检测多能性特征蛋白OCT4和神经外胚层特征蛋白PAX6表达，其中，1xPBS购自武汉博士德公司，anti-OCT4购自Santacruz公司，anti-PAX购自Millipore公司，二抗Alexa Fluor购自Invitrogen公司。
检测具体步骤为：将实施例3中培养的细胞用1xPBS清洗1遍后，用4％多聚甲醛固定30min，1xPBS清洗3min×5次后，用0.3％Triton、0.1％Tween-20室温透膜7min，1xPBST(含0.1％Tween-20的1xPBS)洗3遍；再用0.4％BSA 4℃封闭1h，然后以anti-OCT4和anti-PAX6抗体在4℃孵育过夜；
第二天用1xPBST洗3遍，再以荧光二抗Alexa Fluo在室温孵育2h后，用1xPBST洗3遍；然后用DAPI染料室温孵育5分钟，1xPBS清洗3遍后，封片，置于荧光显微镜下观察拍照。
结果如图1中所示的，未分化的人胚胎干细胞H9细胞表达多能性特征蛋白OCT4，不表达神经外胚层标记蛋白PAX6(图1A)；使用脊髓神经干细胞诱导培养基诱导5d、10d引起OCT4蛋白表达明显下降，而多数细胞出现PAX6表达(图1B和图1C)；统计学结果证实OCT4的下降和PAX6的表达(图1D)。
根据图1中的检测结果可知，采用实施例3中的脊髓神经干细胞诱导培养基和方法，在5天及10天成功诱导出神经干细胞特征蛋白PAX6表达，胚胎干细胞特征蛋白OCT4明显下调。
实施例5诱导10d神经干细胞标记Nestin及PAX6表达
本实施例采用Western blot检测诱导10d神经干细胞标记Nestin及PAX6表达，其中，采用的材料来源为：RIPA裂解液购自碧云天公司；anti-OCT4(Santa cruz公司，1：500)、anti-PAX6(Millipore公司，1：2000)、anti-Nestin(Sigma公司，1：2000)、anti-β-Actin(Santa Cruz公司，1：1000)；二抗Goat anti-Rabbit lgG(Millipore，Cat.#AP132P)，Goatanti-Mouse lgG(Millipore，Cat.#AP124P)
检测方法具体为：将实施例3中六孔板内诱导5d、10d的细胞从培养箱中取出，吸去培养液，每孔细胞使用1ml预冷的PBS(0.01M pH 7.2-7.3)平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液，重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液；然后每孔加入1ml冰冷的PBS，使用细胞刮将细胞收集至1.5ml EP管中，于4℃、12000rpm离心1min，弃去上清；每管细胞加100-200μL RIPA裂解液(使用时加入100xPMSF、25x PIC)摇匀置于冰上裂15-30min，于4℃、12000rpm离心25min；将离心后的上清分装转移倒1.5ml的离心管中，BCA法测定蛋白浓度；每管中加入6xSDS上样缓冲液，100℃煮沸5min。
制胶(10％分离胶、5％凝缩胶、10孔)、电泳：每孔上样10μl，加入电泳液(25mmol/LTris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％SDS)，80V电泳30min，转电压120V电泳2h。
电转：使用PVDF膜甲醇激活1min，在加有转移液(48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％SDS，20％甲醇)的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜；将夹子打开使黑的一面保持水平，在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡，小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡；将PVDF膜盖于胶上，要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡，在膜上盖2张滤纸并除去气泡，最后盖上另一个海绵垫，擀几下合起夹子，整个操作在转移液中进行；将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面；在槽的一边放冰降温，200mA转移2h，最后PVDF膜使用5％牛奶摇床封闭1h。
一抗分别检测anti-OCT4、anti-PAX6、anti-Nestin、anti-β-Actin，4℃过夜；TBST(100mmol/L Tris·HCl，pH7.5,150mmol/L NaCl，0.05％Tween20)洗膜30min，二抗Goatanti-Rabbit lgG、Goat anti-Mouse lgG室温1h、TBST洗膜30min；暗示曝光，显影8min、定影5min。
结果如图2中所示的，未分化的人胚胎干细胞H9细胞表达多能性特征蛋白OCT4，不表达神经外胚层标记蛋白PAX6、Nestin。使用脊髓神经干细胞诱导培养基诱导5d、10d引起OCT4蛋白表达明显下降，而多数细胞出现PAX6及Nestin表达，β-Actin作为内参无明显变化。
通过图2中的检测结果可知，采用实施例3中脊髓神经干细胞诱导培养基及方法，在5天及10天成功诱导出神经干细胞特征蛋白PAX6及NESTIN表达，胚胎干细胞特征蛋白OCT4明显下调。
实施例6 H9细胞经过神经分化诱导转为脊髓神经干细胞
实施例3中神经诱导的H9衍生细胞，弃去脊髓神经干细胞诱导培养基，更换为实施例1中脊髓神经干细胞维持培养基；培养期间视细胞生长状态适当传代，使用Y27632提单细胞存活率，具体传代方式同实施例2。
脊髓神经干细胞维持期间继续使用Matrigel按实施例2中方法包被，然后更换为实施例1中的脊髓神经干细胞扩增培养基培养。
更换为脊髓神经干细胞扩增培养基后得到的脊髓神经干细胞，采用双标免疫荧光方法检测神经干细胞特征蛋白PAX6、Nestin表达，检测脊髓相关蛋白HOXC9表达，具体方法为：将培养的细胞用1xPBS清洗1遍，用4％多聚甲醛固定30分钟，1xPBS清洗3minx5次；后用0.3％Triton、0.1％Tween-20室温透膜7min，1xPBST(含0.1％Tween-20的1xPBS)洗3遍。再用0.4％BSA4℃封闭1h，然后以anti-Nestin和anti-SOX1、anti-Nestin和anti-HOXC9抗体在4℃孵育过夜；第二天用1xPBST洗3遍，再以荧光二抗Alexa Fluor在室温孵育2h，后用1xPBST洗3遍；然后用DAPI染料室温孵育5分钟，1xPBS清洗3遍后，封片；置于荧光显微镜下观察拍照。
结果见图3和图4：H9细胞经神经干细胞诱导、神经干细胞维持后分化为脊髓神经干细胞，其中，图3A中显示人胚胎干细胞H9几乎不表达神经干细胞特征蛋白Nestin及脊髓特征蛋白HOXC9；图3B中显示诱导的脊髓神经干细胞出现干细胞特征蛋白Nestin及脊髓特征蛋白HOXC9表达。
如图4A中所示的，人胚胎干细胞H9几乎不表达神经干细胞特征蛋白Nestin和SOX1(A)，如图4B中所示的，诱导的脊髓神经干细胞出现神经干细胞特征蛋白Nestin及SOX1表达。
通过上述检测结果证明，采用实施例3中的脊髓神经干细胞诱导培养基及方法，诱导10d后再脊髓神经干细胞扩增培养基维持传代五次更换为脊髓神经干细胞扩增培养基后，诱导的细胞表达脊髓特征蛋白HOXC9及神经干细胞特征NESTIN及SOX1，诱导的脊髓神经干细胞能够长期维持脊髓特征及神经干细胞干性。
实施例7获得的脊髓神经干细胞具有多向分化潜能
将实施例6中诱导分化得到的H9衍生脊髓神经干细胞，使用实施例1中的脊髓神经干细胞扩增培养基使细胞自发分化，将培养的细胞用1xPBS清洗1遍，用4％多聚甲醛固定30分钟，1xPBS清洗3minx5次，后用0.3％Triton、0.1％Tween-20室温透膜7min，1xPBST(含0.1％Tween-20的1xPBS)洗3遍，再用0.4％BSA 4℃封闭1h；然后以anti-Nestin和anti-TUJ1、anti-MBP抗体在4℃孵育过夜，第二天用1xPBST洗3遍，再以荧光二抗Alexa Fluor在室温孵育2h，后用1xPBST洗3遍，然后用DAPI染料室温孵育5分钟，1xPBS清洗3遍后，封片；置于荧光显微镜下观察拍照。
结果见图5，如图5中所示的，诱导分化得到的H9衍生脊髓神经干细胞，经荧光双标检测有神经元标记蛋白TUJ1表达，少突胶质细胞标记蛋白MBP表达，说明诱导分化得到的H9衍生脊髓神经干细胞具有多向分化潜能。
其他平行实施方案
实施例8培养基的配制
1、N2B27培养基(以配置500mL N2B27培养基为例)：
Figure BDA0003375461070000091
Figure BDA0003375461070000101
2、脊髓神经干细胞诱导培养基(以配置10mL脊髓神经干细胞诱导培养基为例)
Figure BDA0003375461070000102
3、脊髓神经干细胞维持培养基(以50ml脊髓神经干细胞维持培养基为例)
Figure BDA0003375461070000103
4、脊髓神经干细胞扩增培养基
以N2B27培养基为基础培养基，其中添加22ng/ml碱性成纤维细胞生长因子FGF2、22ng/ml表皮细胞生长因子EGF。
实施例9培养基的配制
1、N2B27培养基(以配置500mL N2B27培养基为例)：
Figure BDA0003375461070000104
2、脊髓神经干细胞诱导培养基(以配置10mL脊髓神经干细胞诱导培养基为例)
Figure BDA0003375461070000111
3、脊髓神经干细胞维持培养基(以50ml脊髓神经干细胞维持培养基为例)
Figure BDA0003375461070000112
4、脊髓神经干细胞扩增培养基
以N2B27培养基为基础培养基，其中添加24ng/ml碱性成纤维细胞生长因子FGF2、24ng/ml表皮细胞生长因子EGF。
采用实施例8和9中的人脊髓神经干细胞诱导分化培养体系对人胚胎干细胞进行诱导分化培养，具体培养过程同实施例2-7，最终结果显示可诱导出人脊髓神经干细胞，且分化纯度高，并同样具有多向分化潜能。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种人脊髓神经干细胞诱导分化培养体系，其特征在于，包括以下培养基：
脊髓神经干细胞诱导培养基，其以N2B27培养基为基础培养基，每10ml N2B27培养基中包括10-12μl BMP抑制剂、10-12μl ALK5抑制剂、10-12μl GSK-3抑制剂、10-12μl FGF2和10-12μl FGF8；
脊髓神经干细胞维持培养基，其以N2B27培养基为基础培养基，每50ml N2B27培养基中包括10-12μl ALK5抑制剂、15-18μl GSK-3抑制剂和1-1.2μl Hedgehog激动剂。
2.如权利要求1所述的人脊髓神经干细胞诱导分化培养体系，其特征在于，所述脊髓神经干细胞诱导培养基中，每10ml N2B27培养基中还添加有3.6-4.3μl 1000U/ml肝素。
3.如权利要求1所述的人脊髓神经干细胞诱导分化培养体系，其特征在于，还包括脊髓神经干细胞扩增培养基，所述脊髓神经干细胞扩增培养基以N2B27培养基为基础培养基，其中含有20-24ng/ml FGF2和20-24ng/ml EGF。
4.如权利要求1所述的人脊髓神经干细胞诱导分化培养体系，其特征在于，所述N2B27培养基以体积比为1：1的DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基作为基础培养基，且添加有1-1.2％的N2添加剂和2-2.4％的B27添加剂。
5.如权利要求4所述的人脊髓神经干细胞诱导分化培养体系，其特征在于，所述N2B27培养基中，还添加有1-1.2％青链霉素双抗和1-1.2％GlutaMAX添加剂。
6.一种人脊髓神经干细胞诱导分化方法，其特征在于，采用如权利要求1-5中任一项所述的人脊髓神经干细胞诱导分化培养体系培养。
7.如权利要求6所述的人脊髓神经干细胞诱导分化方法，其特征在于，包括下列步骤：
获得融合度为40％-70％的单细胞生长的人胚胎干细胞；
加入脊髓神经干细胞诱导培养基，每天换液一次，诱导10天；
弃去脊髓神经干细胞诱导培养基，更换为脊髓神经干细胞维持培养基，每天换液一次，第五次传代后更换为脊髓神经干细胞扩增培养基继续培养。
8.如权利要求7所述的人脊髓神经干细胞诱导分化方法，其特征在于，在细胞传代过程中，使用Rock抑制剂提升单细胞存活率。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115074327A (zh) * 2022-06-24 2022-09-20 北京慧心医谷生物科技有限责任公司 一种用于治疗肌萎缩侧索硬化症的脊髓祖细胞及其诱导分化方法和用途
CN115125210A (zh) * 2022-08-31 2022-09-30 华科星河(北京)生物科技有限公司 从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的培养基与方法
CN115125209A (zh) * 2022-08-31 2022-09-30 华科星河(北京)生物科技有限公司 一种从诱导多能干细胞诱导颈段脊髓神经干细胞的方法
CN115125208A (zh) * 2022-08-31 2022-09-30 华科星河(北京)生物科技有限公司 一种从诱导多能干细胞诱导胸段脊髓神经干细胞的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109294991A (zh) * 2018-11-07 2019-02-01 北京赛贝生物技术有限公司 神经干细胞诱导分化培养基及神经干细胞诱导分化的方法
US20200087623A1 (en) * 2018-08-03 2020-03-19 The Regents Of The University Of California Generation of Human Spinal Cord Neural Stem Cells
US20200318065A1 (en) * 2016-05-31 2020-10-08 The J. David Gladstone Institutes, a testamentary trust established under the Will of J. David Glads In vitro methods of differentiating stem cells into neurons and neurons generated using the same
CN112626023A (zh) * 2021-01-12 2021-04-09 中国人民解放军海军军医大学 脊髓olig2+神经祖细胞诱导及自我更新培养体系、诱导方法及应用
CN112725278A (zh) * 2021-01-19 2021-04-30 上海爱萨尔生物科技有限公司 诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液及分化方法
CN112746057A (zh) * 2020-12-25 2021-05-04 中国人民解放军海军军医大学 于体外将人多能干细胞诱导为神经中胚层祖细胞并维持自我更新的培养体系、方法及应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200318065A1 (en) * 2016-05-31 2020-10-08 The J. David Gladstone Institutes, a testamentary trust established under the Will of J. David Glads In vitro methods of differentiating stem cells into neurons and neurons generated using the same
US20200087623A1 (en) * 2018-08-03 2020-03-19 The Regents Of The University Of California Generation of Human Spinal Cord Neural Stem Cells
CN109294991A (zh) * 2018-11-07 2019-02-01 北京赛贝生物技术有限公司 神经干细胞诱导分化培养基及神经干细胞诱导分化的方法
CN112746057A (zh) * 2020-12-25 2021-05-04 中国人民解放军海军军医大学 于体外将人多能干细胞诱导为神经中胚层祖细胞并维持自我更新的培养体系、方法及应用
CN112626023A (zh) * 2021-01-12 2021-04-09 中国人民解放军海军军医大学 脊髓olig2+神经祖细胞诱导及自我更新培养体系、诱导方法及应用
CN112725278A (zh) * 2021-01-19 2021-04-30 上海爱萨尔生物科技有限公司 诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液及分化方法

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115074327A (zh) * 2022-06-24 2022-09-20 北京慧心医谷生物科技有限责任公司 一种用于治疗肌萎缩侧索硬化症的脊髓祖细胞及其诱导分化方法和用途
CN115074327B (zh) * 2022-06-24 2023-10-27 北京慧心医谷生物科技有限责任公司 一种用于治疗肌萎缩侧索硬化症的脊髓祖细胞及其诱导分化方法和用途
WO2023246644A1 (zh) * 2022-06-24 2023-12-28 北京慧心医谷生物科技有限责任公司 一种用于治疗肌萎缩侧索硬化症的脊髓祖细胞及其诱导分化方法和用途
CN115125210A (zh) * 2022-08-31 2022-09-30 华科星河(北京)生物科技有限公司 从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的培养基与方法
CN115125209A (zh) * 2022-08-31 2022-09-30 华科星河(北京)生物科技有限公司 一种从诱导多能干细胞诱导颈段脊髓神经干细胞的方法
CN115125208A (zh) * 2022-08-31 2022-09-30 华科星河(北京)生物科技有限公司 一种从诱导多能干细胞诱导胸段脊髓神经干细胞的方法
CN115125210B (zh) * 2022-08-31 2022-12-02 华科星河(北京)生物科技有限公司 从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的培养基与方法
CN115125208B (zh) * 2022-08-31 2022-12-06 华科星河(北京)生物科技有限公司 一种从诱导多能干细胞诱导胸段脊髓神经干细胞的方法
CN115125209B (zh) * 2022-08-31 2022-12-06 华科星河(北京)生物科技有限公司 一种从诱导多能干细胞诱导颈段脊髓神经干细胞的方法

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