CN115125209B - 一种从诱导多能干细胞诱导颈段脊髓神经干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从诱导多能干细胞诱导颈段脊髓神经干细胞的方法。本发明方法包括：第1天将诱导多能干细胞置于诱导培养基1（含Y‑27632、CHIR98014、碱性成纤维生长因子和Dorsomorphin）中培养；第2‑3天转入诱导培养基2（含CHIR98014、碱性成纤维生长因子和Dorsomorphin）中培养；第4天转入诱导培养基3（含Y‑27632、SB431542、Dorsomorphin、嘌吗啡胺和视黄酸）中培养；第5‑10天转入诱导培养基4（含SB431542、Dorsomorphin、嘌吗啡胺和视黄酸）中培养；获得颈段脊髓神经干细胞。本发明能够从诱导多能干细胞特异性的诱导生成针对颈段的脊髓神经干细胞，从而为治疗颈段部位的脊髓损伤提供了可能性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种从诱导多能干细胞诱导颈段脊髓神经干细胞的方法。
背景技术
神经退行性疾病和创伤性中枢神经系统疾病，会出现神经细胞进行性退化和死亡，导致严重神经功能缺损，大部分缺乏有效治疗方法。以脊髓损伤、脊髓炎、脊髓前角病变为代表的疾病出现脊髓变性病理改变，包括神经细胞的凋亡、脱髓鞘和神经胶质瘢痕的形成，患者临床表现为肢体无力、肌肉萎缩、感觉异常和二便功能障碍等。损伤或炎症后继发的胶质增生、炎症细胞浸润、轴突逆行性华勒变性等，会进一步加重症状。而由于中枢神经系统细胞的不可再生性，上述变性过程很难自行逆转。脊髓损伤修复需要轴突再生、髓鞘再生、缺失细胞（神经元和神经胶质细胞）的替换，并提供一个适合损伤细胞再生的微环境。目前，干细胞疗法为几乎所有形式的神经退行性和创伤性疾病提供了可能。
神经干细胞的一个特性是自我更新和多能性，即它们可以产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等，因此理论上可以补充凋亡的神经细胞，或为濒临坏死的神经元提供神经营养因子从而挽救其功能，或帮助组织对抗炎症损伤过程。因此，它们对神经功能障碍的治疗和受损神经系统的修复具有重要意义。
目前，神经干细胞主要从胚胎干细胞诱导获得或直接从成年哺乳动物的中枢神经系统（主要指分布于室管膜下、纹状体、海马齿状回、侧脑室下带等部位）中分离培养获得。但是上述方法存在诸多伦理和安全性问题，并且细胞数量受限，批次间存在极大差异。这在一定程度上限制了神经干细胞的移植应用。因此，急需寻找其它替代方案获得安全和疗效稳定的神经干细胞。
多能干细胞（PSC）代表了一种有前途的干细胞替代来源，主要是因为它们具有很强的自我更新和分化能力，人诱导多能干细胞（iPSC）是从成人体细胞人工诱导的多能干细胞，克服了与使用胚胎干细胞相关的伦理问题。通过iPSC诱导特异性脊髓神经干细胞，区别于既往脑源神经干细胞，将具有细胞来源稳定、细胞成分和功能均一可控的优势，从而克服在脊髓修复过程中干细胞药物供给不足和质量不稳定的问题。
发明内容
为了有效克服上述不足，本发明专门开发出一种高效的针对脊髓神经干细胞的诱导体系，通过本体系能特异性的生成针对颈段脊髓的神经干细胞，从而为治疗颈段部位的脊髓损伤提供了可能性。
第一方面，本发明要求保护一种从诱导多能干细胞诱导颈段脊髓神经干细胞的方法。
本发明要求保护的从诱导多能干细胞诱导颈段脊髓神经干细胞的方法，可包括如下：
第1天：将诱导多能干细胞置于诱导培养基1中培养；所述诱导培养基1中含有的诱导分子为Y-27632、CHIR98014、碱性成纤维生长因子（bFGF）和Dorsomorphin；
第2-3天：将第1天培养后的细胞转入诱导培养基2中培养；所述诱导培养基2中含有的诱导分子为CHIR98014、碱性成纤维生长因子（bFGF）和Dorsomorphin；
第4天：将第3天培养后的细胞转入诱导培养基3中培养；所述诱导培养基3中含有的诱导分子为Y-27632、SB431542、Dorsomorphin、嘌吗啡胺（Purmorphamine）和视黄酸（Retinoic acid）；
第5-10天：将第4天培养后的细胞转入诱导培养基4中培养；所述诱导培养基4中含有的诱导分子为SB431542、Dorsomorphin、嘌吗啡胺（Purmorphamine）和视黄酸（Retinoicacid）；在第10天时可获得颈段脊髓神经干细胞。
进一步地，在所述诱导培养基1中，Y-27632的终浓度为2-20μM（如10μM）、CHIR98014的终浓度为0.5-7μM（如3μM）、碱性成纤维生长因子（bFGF）的终浓度为2-200ng/mL（如20ng/mL）、Dorsomorphin的终浓度为0.2-20μM（如2μM）。
进一步地，在所述诱导培养基2中，CHIR98014的终浓度为0.5-7μM（如3μM）、碱性成纤维生长因子（bFGF）的终浓度为2-200ng/mL（如20ng/mL）、Dorsomorphin的终浓度为0.2-20μM（如2μM）。
进一步地，在所述诱导培养基3中，Y-27632的终浓度为2-20μM（如10μM）、SB431542的终浓度为2-20μM（如10μM）、Dorsomorphin的终浓度为0.2-20μM（如2μM）、嘌吗啡胺（Purmorphamine）的终浓度为0.5-10μM（如2μM）、视黄酸（Retinoic acid）的终浓度为100nM-5μM（如1μM）。
进一步地，在所述诱导培养基4中，SB431542的终浓度为2-20μM（如10μM）、Dorsomorphin的终浓度为0.2-20μM（如2μM）、嘌吗啡胺（Purmorphamine）的终浓度为0.5-10μM（如2μM）、视黄酸（Retinoic acid）的终浓度为100nM-5μM（如1μM）。
更进一步地，所述诱导培养基1为向KOSR培养基中加入Y-27632、CHIR98014、碱性成纤维生长因子（bFGF）和Dorsomorphin后得到；Y-27632的终浓度为2-20μM（如10μM）、CHIR98014的终浓度为0.5-7μM（如3μM）、碱性成纤维生长因子（bFGF）的终浓度为2-200ng/mL（如20ng/mL）、Dorsomorphin的终浓度为0.2-20μM（如2μM）。
更进一步地，所述诱导培养基2为向KOSR培养基中加入CHIR98014、碱性成纤维生长因子（bFGF）和Dorsomorphin后得到；CHIR98014的终浓度为0.5-7μM（如3μM）、碱性成纤维生长因子（bFGF）的终浓度为2-200ng/mL（如20ng/mL）、Dorsomorphin的终浓度为0.2-20μM（如2μM）。
其中，所述KOSR培养基为向DMEM/F-12加入KnockOut血清替代物（KnockOut SerumReplacement (KOSR)）、非必需氨基酸、2-巯基乙醇、GlutaMAX添加剂和P/S双抗（青霉素-链霉素）后得到的。在所述KOSR培养基中，所述KnockOut血清替代物的体积百分含量为20%。所述非必需氨基酸为100×非必需氨基酸；在所述KOSR培养基中，所述100×非必需氨基酸的体积百分含量为1%。在所述KOSR培养基中，2-巯基乙醇的终浓度为90μM。在所述KOSR培养基中，GlutaMAX添加剂的体积百分含量为1%。在所述KOSR培养基中，所述P/S双抗的体积百分含量为1%（100单位/mL青霉素和100µg/mL链霉素）。
更进一步地，所述诱导培养基3为向N2B27培养基中加入Y-27632、SB431542、Dorsomorphin、嘌吗啡胺（Purmorphamine）和视黄酸（Retinoic acid）后得到；Y-27632的终浓度为2-20μM（如10μM）、SB431542的终浓度为2-20μM（如10μM）、Dorsomorphin的终浓度为0.2-20μM（如2μM）、嘌吗啡胺（Purmorphamine）的终浓度为0.5-10μM（如2μM）、视黄酸（Retinoic acid）的终浓度为100nM-5μM（如1μM）。
更进一步地，所述诱导培养基4为向N2B27培养基中加入SB431542、Dorsomorphin、嘌吗啡胺（Purmorphamine）和视黄酸（Retinoic acid）后得到；SB431542的终浓度为2-20μM（如10μM）、Dorsomorphin的终浓度为0.2-20μM（如2μM）、嘌吗啡胺（Purmorphamine）的终浓度为0.5-10μM（如2μM）、视黄酸（Retinoic acid）的终浓度为100nM-5μM（如1μM）。
其中，所述N2B27培养基为向由DMEM/F-12培养基和Neurobasal培养基等体积混合后的培养基中加入GlutaMAX添加剂、2-巯基乙醇、N-2添加剂、B27、P/S双抗（青霉素-链霉素）和非必需氨基酸后得到的培养基。在所述N2B27培养基中，GlutaMAX添加剂终浓度为1mM；2-巯基乙醇终浓度为0.1mM；N-2添加剂的体积百分含量为0.5%；B27的体积百分含量为1%；所述P/S双抗的体积百分含量为1%（100 单位/mL青霉素和100µg/mL链霉素）。所述非必需氨基酸为100×非必需氨基酸；在所述N2B27培养基中，所述100×非必需氨基酸的体积百分含量为1%。
根据需要，所述方法还可包括：
第11天：将第10天培养后的细胞转入扩增培养基中培养；所述扩增培养基中含有生长因子，所述生长因子为碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）。
进一步地，在所述扩增培养基中，碱性成纤维生长因子（bFGF）的终浓度可为2-200ng/mL（如10ng/mL）、表皮生长因子（EGF）的终浓度可为2-200ng/mL（如10ng/mL）。
更进一步地，所述扩增培养基为向DMEM/F-12中加入N-2添加剂、B27、P/S双抗（青霉素-链霉素）、GlutaMAX添加剂、碱性成纤维生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）和非必需氨基酸后得到的。在所述扩增培养基中，N-2添加剂的体积百分含量为1%；B27的体积百分含量为0.1%；所述P/S双抗的体积百分含量为1%（100单位/mL青霉素和100µg/mL链霉素）；GlutaMAX添加剂的体积百分含量为1%；碱性成纤维生长因子（bFGF）的终浓度为2-200ng/mL（如10ng/mL）；表皮生长因子（EGF）的终浓度为2-200ng/mL（如10ng/mL）。所述非必需氨基酸为100×非必需氨基酸；在所述扩增培养基中，所述100×非必需氨基酸的体积百分含量为1%。
在本发明的具体实施方式中，所述B27为去除维生素A的B27添加剂，如ThermoFisher Scientific公司货号为12587010的产品。当然也可以为含有维生素A的B27添加剂，如Thermo Fisher Scientific公司货号为17504-044的产品。
第二方面，本发明要求保护一种用于从诱导多能干细胞诱导颈段脊髓神经干细胞的成套培养基。
本发明要求保护的用于从诱导多能干细胞诱导颈段脊髓神经干细胞的成套培养基，含有前文第一方面中所述的诱导培养基1、所述诱导培养基2、所述诱导培养基3和所述诱导培养基4。
根据需要，所述成套培养基中还含有前文第一方面中所述的扩增培养基。
进一步地，所述成套培养基由所述诱导培养基1、所述诱导培养基2、所述诱导培养基3和所述诱导培养基4组成。或者，所述成套培养基由所述诱导培养基1、所述诱导培养基2、所述诱导培养基3、所述诱导培养基4和所述扩增培养基组成。
第三方面，本发明要求保护一种用于从诱导多能干细胞诱导颈段脊髓神经干细胞的成套物质。
本发明要求保护的用于从诱导多能干细胞诱导脊髓神经干细胞的成套物质，含有如下A1至A4：
A1、用于配制前文第一方面中所述诱导培养基1的添加剂，由Y-27632、CHIR98014、碱性成纤维生长因子（bFGF）和Dorsomorphin组成；
A2、用于配制前文第一方面中所述的诱导培养基2的添加剂，由CHIR98014、碱性成纤维生长因子（bFGF）和Dorsomorphin组成；
A3、用于配制前文第一方面中所述的诱导培养基3的添加剂，由Y-27632、SB431542、Dorsomorphin、嘌吗啡胺（Purmorphamine）和视黄酸（Retinoic acid）组成；
A4、用于配制前文第一方面中所述的诱导培养基4的添加剂，由SB431542、Dorsomorphin、嘌吗啡胺（Purmorphamine）和视黄酸（Retinoic acid）组成。
进一步地，在所述A1中，Y-27632、CHIR98014、碱性成纤维生长因子（bFGF）和Dorsomorphin的配比可为10μmol：0.5-7μmol：2-200mg：0.2-20μmol，具体如10μmol：3μmol：20mg：2μmol。
进一步地，在所述A2中，CHIR98014、碱性成纤维生长因子（bFGF）和Dorsomorphin的配比可为3μmol：2-200mg：0.2-20μmol，具体如3μmol：20mg：2μmol。
进一步地，在所述A3中，Y-27632、SB431542、Dorsomorphin、嘌吗啡胺（Purmorphamine）和视黄酸（Retinoic acid）的配比可为10μmol：2-20μmol：0.2-20μmol：0.5-10μmol：100nmol-5μmol，具体如10μmol：10μmol：2μmol：2μmol：1μmol。
进一步地，在所述A4中，SB431542、Dorsomorphin、嘌吗啡胺（Purmorphamine）和视黄酸（Retinoic acid）的配比可为10μmol：0.2-20μmol：0.5-10μmol：100nmol-5μmol，具体如10μmol：2μmol：2μmol：1μmol。
根据需要，所述成套物质中还含有如下A5：
A5、用于配制前文第一方面中所述的扩增培养基的添加剂，由碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）组成。
进一步地，在所述A5中，碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）的质量比为1：1。
更进一步地，所述成套物质由所述A1、所述A2、所述A3和所述A4组成。或者，所述成套物质由所述A1、所述A2、所述A3、所述A4和所述A5组成。
第四方面，本发明要求保护如下任一应用：
P1、前文第二方面中所述成套培养基或前文第三方面中所述成套物质在将诱导多能干细胞诱导为颈段脊髓神经干细胞中的应用；
P2、前文第三方面中所述成套物质在制备用于从诱导多能干细胞诱导颈段脊髓神经干细胞的产品中的应用。
在P2中，所述产品可如培养基。
在本发明中，所述颈段脊髓神经干细胞为高表达颈段脊髓基因HOXC6的神经干细胞。
在本发明的具体实施方式中，所述高表达颈段脊髓基因HOXC6的神经干细胞是指HOXC6阳性细胞比例高于93%的神经干细胞。
实验证明，本发明能够从诱导多能干细胞特异性的诱导生成针对颈段的脊髓神经干细胞，从而为治疗颈段部位的脊髓损伤提供了可能性。
附图说明
图1为本发明所用抗体相关信息。
图2为本发明从诱导多能干细胞诱导脊髓神经干细胞的过程中，在诱导培养的第1天、第5天和第10天对培养中的细胞进行显微镜形态鉴定。A为诱导培养的第1天；B为诱导培养的第5天；C为诱导培养的第10天。
图3为免疫荧光染色结果。DAPI为细胞核标记物，Nestin为神经干细胞的标记物；HOXC6为颈段脊髓标记物，Merge为融合图。标尺为100μm。
图4为颈段脊髓神经干细胞进行星形胶质细胞分化。左为DAPI核染色，中为星形胶质细胞标记物GFAP染色，右为Merge融合图。标尺为20μm。
图5为颈段脊髓神经干细胞进行谷氨酸能神经元分化（TUJ1+VGLUT1）。TUJ1标记的泛神经元由488nm激发，VGLUT1标记的谷氨酸能神经元由594nm激发，DAPI标记细胞核。
图6为颈段脊髓神经干细胞进行GABA能神经元分化（TUJ1+GABA）。TUJ1标记的泛神经元由488nm激发，GABA标记的GABA能神经元由594nm激发，DAPI标记细胞核。
图7为Dorsomorphin对颈段脊髓神经干细胞表达的影响。
图8为bFGF对颈段脊髓神经干细胞表达的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所涉及的各物质的厂家货号信息如下：
Y-27632（Merck，Y0503）、CHIR98014（Merck，SML1094）、碱性成纤维生长因子（bFGF）（Peprotech，100-18B）、Dorsomorphin（Merck，P5499）、SB431542（Merck，S4317）、嘌吗啡胺（Purmorphamine）（Merck，SML0868）、视黄酸（Retinoic acid）（Merck，R2625）、表皮生长因子（EGF）（Peprotech，AF-100-15）。
DMEM/F-12培养基（Thermo Fisher Scientific，11330032）、Neurobasal培养基（Thermo Fisher Scientific，21103049）、GlutaMAX添加剂（Thermo Fisher Scientific，35050061）、KnockOut血清替代物（Thermo Fisher Scientific，10828028）、100×非必需氨基酸（Thermo Fisher Scientific，11140050）、2-巯基乙醇（Thermo Fisher Scientific，21985023）、P/S双抗（Thermo Fisher Scientific，15140122）、N-2添加剂（Thermo FisherScientific，17502048）、B-27添加剂 (50×)，去除维生素A（Thermo Fisher Scientific，12587010）。其中，“B-27添加剂 (50×)，去除维生素A（Thermo Fisher Scientific，12587010）”也可以用含有VA的B27添加剂（Thermo Fisher Scientific，17504-044）替代。
实施例1、从诱导多能干细胞诱导颈段脊髓神经干细胞的方法的建立
一、从诱导多能干细胞诱导颈段脊髓神经干细胞的诱导方法
本发明按照如下步骤从诱导多能干细胞诱导颈段脊髓神经干细胞：
第1天：将诱导多能干细胞（iPSC）置于诱导培养基1中培养；所述诱导培养基1中含有的诱导分子为Y-27632、CHIR98014、碱性成纤维生长因子（bFGF）和Dorsomorphin。
第2-3天：将第1天培养后的细胞转入诱导培养基2中培养；所述诱导培养基2中含有的诱导分子为CHIR98014、碱性成纤维生长因子（bFGF）和Dorsomorphin。
第4天：将第3天培养后的细胞转入诱导培养基3中培养；所述诱导培养基3中含有的诱导分子为Y-27632、SB431542、Dorsomorphin、嘌吗啡胺（Purmorphamine）和视黄酸（Retinoic acid）。
第5-10天：将第4天培养后的细胞转入诱导培养基4中培养；所述诱导培养基4中含有的诱导分子为SB431542、Dorsomorphin、嘌吗啡胺（Purmorphamine）和视黄酸（Retinoicacid）；在第10天时获得目的脊髓神经干细胞。
第11天：将第10天培养后的细胞转入扩增培养基中培养；所述扩增培养基中含有的生长因子为碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）。
所述诱导培养基1为向KOSR培养基中加入Y-27632、CHIR98014、碱性成纤维生长因子（bFGF）和Dorsomorphin后得到；Y-27632的终浓度为10μM、CHIR98014的终浓度为3μM、碱性成纤维生长因子（bFGF）的终浓度为20ng/mL、Dorsomorphin的终浓度为2μM。
所述诱导培养基2为向KOSR培养基中加入CHIR98014、碱性成纤维生长因子（bFGF）和Dorsomorphin后得到；CHIR98014的终浓度为3μM、碱性成纤维生长因子（bFGF）的终浓度为20ng/mL、Dorsomorphin的终浓度为2μM。
所述KOSR培养基为向DMEM/F-12加入KnockOut血清替代物、非必需氨基酸、2-巯基乙醇、GlutaMAX添加剂中和P/S双抗（青霉素-链霉素）后得到的。在所述KOSR培养基中，所述KnockOut血清替代物的体积百分含量为20%。所述非必需氨基酸为100×非必需氨基酸；在所述KOSR培养基中，所述100×非必需氨基酸的体积百分含量为1%。在所述KOSR培养基中，2-巯基乙醇的终浓度为90μM。在所述KOSR培养基中，GlutaMAX添加剂的体积百分含量为1%。在所述KOSR培养基中，所述P/S双抗的体积百分含量为1%（100单位/mL青霉素和100µg/mL链霉素）。
所述诱导培养基3为向N2B27培养基中加入Y-27632、SB431542、Dorsomorphin、嘌吗啡胺（Purmorphamine）和视黄酸（Retinoic acid）后得到；Y-27632的终浓度为10μM、SB431542的终浓度为10μM、Dorsomorphin的终浓度为2μM、嘌吗啡胺（Purmorphamine）的终浓度为2μM、视黄酸（Retinoic acid）的终浓度为1μM。
所述诱导培养基4为向N2B27培养基中加入SB431542、Dorsomorphin、嘌吗啡胺（Purmorphamine）和视黄酸（Retinoic acid）后得到；SB431542的终浓度为10μM、Dorsomorphin的终浓度为2μM、嘌吗啡胺（Purmorphamine）的终浓度为2μM、视黄酸（Retinoic acid）的终浓度为1μM。
所述N2B27培养基为向由DMEM/F-12培养基和Neurobasal培养基等体积混合后的培养基中加入GlutaMAX添加剂、2-巯基乙醇、N-2添加剂、B27、P/S双抗（青霉素-链霉素）和非必需氨基酸后得到的培养基。在所述N2B27培养基中，GlutaMAX添加剂终浓度为1mM；2-巯基乙醇终浓度为0.1mM；N-2添加剂的体积百分含量为0.5%；所述B27的体积百分含量为1%；所述P/S双抗的体积百分含量为1%（100单位/mL青霉素和100µg/mL链霉素）。所述非必需氨基酸为100×非必需氨基酸；在所述N2B27培养基中，所述100×非必需氨基酸的体积百分含量为1%。
所述扩增培养基为向DMEM/F-12中加入N-2添加剂、B27、P/S双抗（青霉素-链霉素）、GlutaMAX添加剂、碱性成纤维生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）和非必需氨基酸后得到的。在所述扩增培养基中，N-2添加剂的体积百分含量为1%；所述B27的体积百分含量为0.1%；所述P/S双抗的体积百分含量为1%（100单位/mL 青霉素和100µg/mL链霉素）；GlutaMAX添加剂的体积百分含量为1%；碱性成纤维生长因子（bFGF）的终浓度为10ng/mL；表皮生长因子（EGF）的终浓度为10ng/mL。所述非必需氨基酸为100×非必需氨基酸；在所述扩增培养基中，所述100×非必需氨基酸的体积百分含量为1%。
二、从诱导多能干细胞诱导颈段脊髓神经干细胞的诱导效果鉴定
1、方法
取诱导完成后的神经干细胞行免疫荧光染色鉴定：采用4％多聚甲醛室温固定细胞40分钟，用DPBS缓冲液小心清洗两遍；然后用0.1％Triton X-100透化处理5分钟，用DPBS缓冲液清洗两遍；然后用含10％马血清和0.1％Triton X-100的DPBS缓冲液将细胞4℃孵育过夜；然后加入用DPBS缓冲液稀释的抗体，37℃孵育2小时，用DPBS缓冲液清洗三遍后拍照。
所用抗体相关信息参见图1。
2、结果与分析
在将诱导多能干细胞诱导为颈段脊髓神经干细胞的过程中，本发明分别在诱导培养的第1天、第5天和第10天对培养中的细胞进行了显微镜形态鉴定（40倍），如图2所示。由图可见在分化的第10天，能够看到非常明显的玫瑰花环结构，这是神经干细胞典型的聚集形态。另外，在诱导培养的第10天通过荧光染色进行脊髓神经干细胞标记物相关抗体定性以及定量检测，结果显示：标记物Nestin（神经干）阳性细胞比例为97%，标记物HOXC6（颈脊髓）（参考文献“Milica Bulajić,et al. Differential abilities to engageinaccessible chromatin diversify vertebrate Hox binding patterns.Development. 2020 Nov 15; 147(22): dev194761.”）阳性细胞比例为93.25%，如图3所示。可见，本发明从诱导多能干细胞诱导的颈段脊髓神经干细胞完全达标。
三、本发明诱导所得颈段脊髓神经干细胞体外分化为神经元、星形胶质细胞
将4×104个上述步骤一诱导和扩增得到的P10代的颈段脊髓神经干细胞，将其接种到D型多聚赖氨酸（Gibco，A3890401）PLO/Laminin包被的24孔板中，使用去除EGF和bFGF的本发明步骤一中的扩增培养基（去除EGF和bFGF，这两种物质可避免神经干细胞分化）进行自分化培养，培养期间每隔两天换液一次。细胞培养条件为37℃，5％二氧化碳。持续培养42天，然后进行免疫荧光染色，检测神经元标志物TUJ1和GABA，及星形胶质细胞GFAP标志物的表达情况。所用抗体信息参见图1。
结果显示：本发明步骤一诱导和扩增得到P10代的颈段脊髓神经干细胞具有明确的神经干性，表现为可在除去bFGF和EGF的扩增培养基中，进行成功的自分化为神经元，如TUJ1阳性细胞、GABA阳性细胞、VGLUT1阳性细胞，及星形胶质细胞（GFAP 阳性细胞）。如图4、图5和图6所示。
四、对本发明诱导的颈段脊髓神经干细胞进行诱导培养基的优化
针对Dorsomorphin和bFGF的添加时机，我们进行了2项测试，分别为：前三天是否添加Dorsomorphin，以及第4-10天是否添加bFGF。评价指标为Nestin（神经干）和HOXC6（颈脊髓）的表达。
对于第1项测试，分为前三天添加Dorsomorphin组和前三天不添加Dorsomorphin组。其中，前三天添加Dorsomorphin组的操作与步骤一完全相同；前三天不添加Dorsomorphin组的操作与步骤一相比，差别仅在于去掉前三天诱导培养基（即诱导培养基1和诱导培养基2）中的Dorsomorphin，其余与步骤一完全相同。
对于第2项测试，前三天均正常添加Dorsomorphin，剩余分为第4-10天不添加bFGF组和第4-10天添加bFGF组。其中，第4-10天不添加bFGF组的操作与步骤一完全相同，第4-10天不添加bFGF组的操作与步骤一相比，差别仅在于将第4-10天的诱导培养基中额外加入bFGF至其终浓度为20ng/mL，其余与步骤一完全相同。
对评价指标的检测方法参见步骤二。
结果如图7和图8所示。结果显示，Dorsomorphin添加后，对最终Nestin（神经干）和HOXC6（颈脊髓）的表达均有显著性差异（P<0.01）。说明在前三天添加Dorsomorphin有利于颈段脊髓神经干的生成。bFGF添加后，对于Nestin（神经干）的表达无显著性差异，但对于HOXC6（颈脊髓）的表达具显著性差异（P<0.01），因此在第4-10天添加bFGF对于颈段脊髓的分化有损害。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (7)
1.一种将诱导多能干细胞诱导为颈段脊髓神经干细胞的方法，包括如下步骤：对诱导多能干细胞进行诱导分化培养以形成颈段脊髓神经干细胞，具体包括：
第1天：将诱导多能干细胞置于诱导培养基1中培养；所述诱导培养基1中含有的诱导分子为Y-27632、CHIR98014、碱性成纤维生长因子和Dorsomorphin；
第2-3天：将第1天培养后的细胞转入诱导培养基2中培养；所述诱导培养基2中含有的诱导分子为CHIR98014、碱性成纤维生长因子和Dorsomorphin；
第4天：将第3天培养后的细胞转入诱导培养基3中培养；所述诱导培养基3中含有的诱导分子为Y-27632、SB431542、Dorsomorphin、嘌吗啡胺和视黄酸；
第5-10天：将第4天培养后的细胞转入诱导培养基4中培养；所述诱导培养基4中含有的诱导分子为SB431542、Dorsomorphin、嘌吗啡胺和视黄酸；
在所述诱导培养基1中，Y-27632的终浓度为10μM、CHIR98014的终浓度为0.5-7μM、碱性成纤维生长因子的终浓度为2-200ng/mL、Dorsomorphin的终浓度为0.2-20μM；
在所述诱导培养基2中，CHIR98014的终浓度为0.5-7μM、碱性成纤维生长因子的终浓度为2-200ng/mL、Dorsomorphin的终浓度为0.2-20μM；
在所述诱导培养基3中，Y-27632的终浓度为10μM、SB431542的终浓度为2-20μM、Dorsomorphin的终浓度为0.2-20μM、嘌吗啡胺的终浓度为0.5-10μM、视黄酸的终浓度为100nM-5μM；
在所述诱导培养基4中，SB431542的终浓度为2-20μM、Dorsomorphin的终浓度为0.2-20μM、嘌吗啡胺的终浓度为0.5-10μM、视黄酸的终浓度为100nM-5μM。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述诱导培养基1为向KOSR培养基中加入Y-27632、CHIR98014、碱性成纤维生长因子和Dorsomorphin后得到；
所述诱导培养基2为向KOSR培养基中加入CHIR98014、碱性成纤维生长因子和Dorsomorphin后得到；
所述诱导培养基3为向N2B27培养基中加入Y-27632、SB431542、Dorsomorphin、嘌吗啡胺和视黄酸后得到；
所述诱导培养基4为向N2B27培养基中加入SB431542、Dorsomorphin、嘌吗啡胺和视黄酸后得到。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法还包括：
第11天：将第10天培养后的细胞转入扩增培养基中培养；所述扩增培养基中含有生长因子，所述生长因子为碱性成纤维生长因子和表皮生长因子。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在所述扩增培养基中，碱性成纤维生长因子的终浓度为10ng/mL、表皮生长因子的终浓度为10ng/mL。
5.一种用于将诱导多能干细胞诱导为颈段脊髓神经干细胞的成套培养基，含有权利要求1或2中所述的诱导培养基1、所述诱导培养基2、所述诱导培养基3和所述诱导培养基4。
6.根据权利要求5所述的成套培养基，其特征在于：所述成套培养基中还含有权利要求3或4中所述的扩增培养基。
7.权利要求5或6所述成套培养基在将诱导多能干细胞诱导为颈段脊髓神经干细胞中的应用。
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