KR102534488B1 - 기능성 신경교세포를 단기간에 효율적으로 분화시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명에 따른 줄기세포의 신경교세포로의 분화 방법은 신경전구세포를 시작세포로 사용하면서, NFIB라는 전사인자를 과발현시키면 2주 내에 성인의 뇌에서 분리한 세포와 생리학적 기능이 유사한 수준의 성숙한 신경교세포로 분화되며, 세포가 분화하는 과정 또한 정상적인 신경교세포의 분화 과정과 유사한 분자적 및 기능적 변화 과정을 모사할 수 있다.

Description

기능성 신경교세포를 단기간에 효율적으로 분화시키는 방법 {Efficient and short-term method for generating functional astrocytes}

본 발명은 기능성 신경교세포를 단기간에 효율적으로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

신경교세포(astrocytes)는 신경계 내 항상성 유지를 위한 다양한 기능을 수행하며, 이들의 정상 기능이 소실되었을 때 신경발달 질환 혹은 신경 퇴행성 질환이 유발된다고 알려져 있다. 이전 신경교세포의 신경계 내에서의 생리학적 기능과 다양한 신경질환에서의 병태생리의 연구는 주로 설치류의 뇌에서 분리한 세포를 이용하여 진행되었다. 그러나, 설치류의 세포와 인간의 세포는 다양한 차이를 보인다고 알려져 있고, 따라서 인간 신경교세포를 얻을 수 있는 방법은 신경과학의 발전과 신경질환의 치료 기술 개발에 반드시 필요하다. 이와 동시에 줄기세포로부터 분화된 신경교세포는 실제 인간 뇌에 존재하는 세포와 매우 유사한 성질(분자적 및 세포 생리학적)을 가져야 할 필요가 있다.

줄기세포, 특히 전분화능줄기세포를 신경교세포로 분화시키기 위한 방법이 연구 개발되어 보고[비특허문헌 1, 2, 및 3]된 바 있으나, 다음과 같은 문제점이 제시된다:

(1) 신경교세포를 얻기까지 상당한 시간이 소요된다.

비특허문헌 1의 경우, 인간 전분화능줄기세포로부터 신경교세포 (혹은 그 전구세포)를 분화시키는 기술을 개시하고 있다. 그러나, 비특허문헌 1에 따른 방법으로는 인간 전분화능줄기세포로부터 신경교세포를 얻기까지 최소 180일(약 26주 혹은 6개월)이 소요된다는 단점이 있다.

비특허문헌 3의 프로토콜의 경우, 특정 유전자 도입(NFIA)을 통해 인간 전분화능줄기세포에서 유래된 신경줄기세포(LTNSC)로부터 성숙한 신경교세포를 얻기까지 약 8주가 소요된다는 점이 개시되어 있다. 비특허문헌 3의 프로토콜에서와 같이, 성숙한 신경교세포를 얻기까지 약 8 내지 26주가 소요된다면, 매 실험마다 적어도 2개월 이상의 준비 기간이 필요하기 때문에 원활한 세포 확보를 위해 분화 시기를 앞당기는 것이 중요하다.

(2) 신경계 이외의 세포 혼재의 가능성이 있다.

비특허문헌 2는 인간 전분화능줄기세포로부터 특정 유전자(SOX9 및 NFIB)의 도입을 통해 신경교세포를 분화시키는 기술을 개시하는 문헌으로, 전분화능줄기세포로부터 분화를 유도할 경우 다른 조직의 세포(예를 들어, 내배엽, 중배엽 세포 등)의 오염 가능성을 배재할 수 없어, 항상 고순도의 신경교세포 분화를 보장할 수 없다.

(3) 인간 뇌에서 분리한 신경교세포와 유사성이 낮다.

비특허문헌 1 내지 3에서 제시한 방법으로 제작된 신경교세포들은 신경교세포로서 갖추어야 할 기본적인 생리학적 기능성을 어느 정도 갖춘 것으로 판단된다. 하지만 이들 방법에 의해 제작된 세포가 실제 인간의 뇌에서 분리된 신경교세포의 기능성과 어느 정도의 유사성 혹은 차별성이 있는지 확인할 수 있는 근거는 부족하다. 즉, 이들 기술에 의해 생산된 세포가 인간의 뇌 조직에 존재하는 신경교세포 수준의 기능을 갖추고 있다고 보장할 수 없다.

따라서, 단기간에 고수율로 인간 뇌 조직에 존재하는 신경교세포와 기능적 특성이 유사한 세포를 생산하는 기술이 여전히 요구되고 있는 실정이다.

Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nat Biotech, 29(6), 528-534. Rapid and efficient induction of functional astrocytes from human pluripotent stem cells. Nat Methods, 15(9), 693-696. NFIA is a gliogenic switch enabling rapid derivation of functional human astrocytes from pluripotent stem cells. Nat Biotechnol, 37(3), 267-275.

이에, 본 발명자들은 신경전구세포를 시작세포로 사용하고 여기에 NFIB를 과발현시켜 신경교세포를 단기간에 효율적으로 분화시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 신경전구세포로부터 인간 뇌 조직에 존재하는 세포와 유사한 기능을 가진 신경교세포를 단기간에 효율적으로 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은

NFIB 단백질; 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 신경전구세포로부터 신경교세포로의 분화 유도용 조성물, 및 분화 유도 방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 상세하게 설명 한다.

본 발명은 NFIB 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 신경전구세포로부터 신경교세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.

상기 NFIB(Nuclear factor I B)는 CTF/NF-I 패밀리에 속하는 프로모터의 CCAAT-결합 전사인자로 기능하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에 있어서, 상기 NFIB는 신경전구세포에 도입되어 신경전구세포에서 내재적으로 발현되는 SOX9의 발현을 상향 조절할 수 있다.

한 구체예에서, NFIB 유전자 및 단백질은 마우스, 래트, 유인원, 혹은 사람 등과 같은 포유동물 유래이며, 특히 사람 유래의 것일 수 있다. NFIB 유전자 및 단백질은 그 전장 또는 본 발명의 효과를 달성하는 한, 그 단편이 사용될 수 있으며, 전장 서열은, 예를 들어, GenBank Accession No. NC_000009.12, NC_000070.7, NC_005104.4 또는 NC_041768.1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 신경전구세포는 전분화능줄기세포로부터 유래한 것일 수 있다.

본 발명에서, 용어 "전분화능줄기세포(pluripotent stem cell, 이하 PSC, 인간의 경우 human PSC, 혹은 hPSC)"는 몸을 구성하는 어떠한 형태의 세포로도 유도 분화가 가능한 줄기세포를 의미하며, 상기 전분화능줄기세포(또는 만능줄기세포)에는 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC)와 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC, 역분화줄기세포)가 포함된다.

본 발명은 전분화능줄기세포로부터 유래된 신경전구세포를 시작 세포(원료 세포)로 사용하는 것에 기술적 특징이 있다. 신경전구세포는 전분화능줄기세포에 비해 다루기 쉽고, 이미 신경계 세포로의 운명이 결정되어 있어 신경교세포로의 유도가 빠르고 용이할 수 있다. 또한, 일반적인 줄기세포와 마찬가지로 계대 배양을 통해 무한히 증폭시킬 수 있는 이점이 있다. 본 발명에서와 같이, 신경교세포로의 분화를 위해, 신경전구세포를 시작 세포로 사용함으로써 신경교세포의 대량 생산이 가능하며, 신경교세포로의 분화 후 다른 조직 세포(예를 들어, 내배엽, 중배엽 세포 등)들의 오염 가능성이 없다는 장점이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 "신경전구세포(neural precusor cells, 혹은 neural progenitor cells, 이하 NPC)"는 신경 세포의 형태 및 기능을 완전히 갖추기 전 단계의 세포를 의미한다. NPC는 전분화능 줄기세포에서 분화할 수 있으며, 이 과정 중 전분화능줄기세포에서 높게 발현되는 OCT4, NANOG와 같은 필수 전사인자의 발현이 감소하고, 여러 세포가 군집(colony)을 이루어 자라는 특성이 사라지며, 점차 기둥 모양(columnar shape)의 작은 양극성을 띤 형태를 갖추게 된다. 내배엽, 중배엽, 외배엽으로의 분화가 모두 가능한 전분화능줄기세포와는 달리 NPC는 오로지 신경외배엽 계열의 세포(예, 신경세포, 신경교세포, 희소돌기아교세포)로만 분화할 수 있는 능력을 가졌다. 본 발명에 따른 NPC는 SOX1, SOX2, NESITIN 및 PLZF를 공통적으로 발현하는 세포일 수 있다. 특히, 상기 NPC는 상기 인자들과 함께 SOX9을 발현하는 세포일 수 있다. 이들 유전자는 NPC에서 고유하게 발현되는 유전자들로서, 이들의 발현은 형성된 세포가 NPC임을 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 NPC는 NFIB 이외의 어떠한 인자도 외부로부터 인위적으로 도입되지 않은 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 NFIB 단백질을 암호화하는 유전자는 벡터에 의해 NPC에 도입될 수 있다. 상기 "벡터"는 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 내로 삽입된 외부 DNA를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 상기 벡터는 NFIB의 핵산 서열이 게놈 내로 삽입된 벡터로서, 이들 벡터는, 예를 들어, DNA 벡터, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 효모 벡터, 또는 바이러스 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예컨대, 상기 벡터는 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터의 예로, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, SV 40, 폴리오마 바이러스, 파필로마 바이러스, 피카르노바이러스, 벡시니아 바이러스 또는 헬퍼 의존성 아데노바이러스 등이 NFIB를 발현하는 매개체로 사용될 수 있다. 상기 바이러스들은 재조합 바이러스일 수 있다.

한 구체예에서, 상기 벡터는 생체 내 도입 후 벡터 내 도입된 NFIB의 발현을 on-off 할 수 있는 시스템이 적용된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 벡터로 렌티바이러스 벡터를 사용하는 경우, 독시사이클린과 같은 on-off 조절제를 통해 NFIB의 발현을 조절할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 실시예에서는, NFIB를 발현하는 바이러스 벡터로 렌티바이러스 벡터를 사용하여 NPC에 도입하였으나, 본 발명에 적용 가능한 벡터가 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

한 구체예에서, 상기 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터를 통해 NFIB 유전자를 발현시킬 경우, NFIB 유전자의 발현을 조절시킬 수 있는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 벡터에 도입되는 NFIB 유전자는 NFIB 단백질 또는 이들과 기능적으로 동등한 특성을 갖는 유사체를 암호화하는 핵산 서열일 수 있다. 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 본 명세서에서 기능적으로 동등한 특성을 갖는 유사체란 상기 NFIB와 기능적으로 동등한 특성을 갖는 것으로, 구체적으로, NFIB 또는 이의 단편의 아미노산 서열과 적어도 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩타이드 또는 펩타이드 중의 일부의 아미노산 잔기를 치환, 결실 또는 부가한 펩타이드를 의미한다. 상기 아미노산 잔기의 치환 또는 결실은, 바람직하게는 NFIB 폴리펩타이드의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치하는 것일 수 있다. 상기 아미노산 잔기의 부가 역시 NFIB 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 기능적으로 동등한 특성을 갖는 유사체는 NFIB 폴리펩타이드의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 폴리펩타이드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩타이드 유도체도 포함될 수 있다. 예를 들어, NFIB 폴리펩타이드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변형시키기 위한 구조 변경이 이에 포함될 수 있다.

또한, 본 발명에서 NFIB를 발현하는 벡터를 줄기세포에 도입하는 방법은, 공지된 형질도입(transduction) 또는 형질전환(transfection) 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 원심분리법, 미세주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 신경계 세포로의 분화는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 무혈청 배지; FGFs, Wnt 및 RA(retinoic acid)와 같은 모르포겐(morphogens)의 처리 등에 의해 분화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위해 형태나 기능이 변해가는 것을 의미한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체 발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나, 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이, 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.

특히, 본 발명에 있어서, 상기 신경교세포로의 분화는 3주 내, 예컨대 2주 내에 수행되는 것일 수 있다. 본 발명에 따르면, 단기간에 고수율로 신경교세포로 분화시키기 위해 시작세포로 신경전구세포를 사용하였으며, 도입 인자로 NFIB만을 단독으로 사용하였다. 본 발명자들은 신경전구세포가 SOX9을 내재적으로 발현하고 있다는 점뿐만 아니라, 상기 내인성 SOX9가 NFIB의 도입에 의해 발현이 상향 조절되는 특성을 갖는다는 점을 새로이 밝혀냈기 때문에, NFIB의 단독 도입만으로도 신경교세포로의 분화를 빠르고 효율적으로 유도할 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명은 NFIB 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 NPC에 도입하는 단계를 포함하는, NPC로부터 신경교세포로의 분화 유도 방법을 제공한다.

상기 분화 유도 방법은, NFIB 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 NPC에 도입하기에 앞서, hPSC로부터 NPC를 분화시키는 단계를 수행하는 것을 포함할 수 있다.

예컨대, 상기 hPSC로부터 NPC를 분화시키는 단계는,

(a) hPSC를 NPC로 분화시키기 위해, 2종의 SMAD 억제제가 포함된 배지에서 8일동안 배양하는 단계; 및

(b) 배양 8일째에, 분화된 세포에서 NPC의 모양을 가진 세포(예, 신경 "로제트"라 불리우는 구조)를 분리한 후 bFGF가 함유된 NPC 배지에서 고밀도로 배양하는 단계;를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 배양 조건에서 NPC는 배양기 내 최대 밀도로 증식되었을 때 아큐타제(accutase)를 통한 해리로 계대배양될 수 있다. 이때 계대배양은 장기간, 예컨대 5계대 이상 배양하지 않는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 최적의 신경교세포 분화 수율을 위해 5계대 이내의 NPC를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, SOX1 마커 발현을 기준으로 80% 이상의 순도를 보이는 NPC를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

상기 분화 유도 방법에 있어서, hPSC, NFIB, NPC 및 신경교세포 등에 대한 모든 내용은 앞서 기술한 내용을 그대로 적용할 수 있다.

상기 분화 유도 방법은, NFIB 단백질을 암호화하는 유전자를 벡터를 통해 NPC에 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 이후, NFIB가 도입된 NPC를 배양하여 분화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 분화 유도 방법은

(i) NPC를 bFGF가 함유된 기본배지에서 배양시킨 후, NFIB를 도입하는 단계;

(ii) NFIB가 도입된 NPC를 CNTF 및 BPM4가 함유된 기본배지에서 1 내지 3일간 배양하는 단계; 및

(iii) (ii)에서 배양된 NPC를 신경교세포 분화용 배지에서 9 내지 18일간 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 (i) 단계에 있어서, NPC는 bFGF가 함유된 기본배지에서 15 내지 24시간동안 배양한 후 NFIB를 도입시킬 수 있다. NPC에 NFIB를 도입시키는 방법은 NFIB 단백질을 암호화하는 유전자를 벡터를 통해 NPC에 도입시키는 방법을 이용할 수 있다.

상기 (ii) 단계에 있어서, NFIB 도입시 사용된 벡터의 종류에 따라 NFIB의 발현을 위한 on-off 조절제를 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 NFIB의 발현을 위한 on-off 조절제로는 독시사이클린을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 (iii) 단계에 있어서, NPC의 신경교세포로의 분화 과정에서 사용된 신경교세포 분화용 배지는 신경교세포로의 분화에 사용되는 배지라면 시판중인 어느 것도 사용할 수 있다.

이때, 상기 (i) 및 (ii) 단계에서, 기본배지는 DMEM/F12 배지를 사용할 수 있으며, (i) 단계는 DMEM/F12 기본 배지에 1Х N2 supplement, 1Х B27 supplement와 10 내지 30ng/ml의 bFGF(basic fibroblast growth factor; 염기성 섬유모세포생장인자)가 포함된 배양 배지에서 수행될 수 있으나, 상기 기본배지의 종류가 이에 제한되지 않는다. 상기 배양 배지는 통상적으로 사용되는 분화용 배지를 제한없이 사용할 수 있다.

한 구체예에서, 상기 기본배지는 EGF(epidermal growth factor; 표피증식인자)가 첨가되지 않은 배지일 수 있다.

상기 (ii) 및 (iii) 단계에서, 총 배양일은 3주 이내인 것이 바람직하며, 예를 들어 2주 이내일 수 있다.

본 발명에 따른 분화 유도 방법은, 시작 세포를 hPSC 유래 NPC (이하 hPSC-NPC라 함)로 사용하고, NFIB의 단독 도입을 통해 3주 이내, 특히 2주 이내에 약 75% 이상의 세포가 신경교세포로 분화될 수 있다. 이와 관련하여, 종래의 연구에서는 신경교세포로의 분화 기간이 인간 전분화능줄기세포로부터 짧게는 4주 이상, 길게는 1년 이상 소요되는데 반해, 본 발명에서는 이러한 분화 기간을 3주 이내로 단축시켰다는 점에서 종래 연구에 비해 유리한 이점이 있다.

이러한 고순도 및 고효율 분화는 세포 자체에 대한 발생, 분화 및 기능성에 관련한 기초 연구뿐만 아니라, 향후 적용될 가능성이 있는 세포이식을 통한 치료제 개발 등에 필수적인 요소이므로, 본 발명의 높은 기술 가치를 보여주었다고 판단된다.

본 발명에 있어서, 본 발명에 따라 NPC로부터 분화된 "신경교세포(astrocyte)"는 아쿠아포린 4(aquaporin 4; AQP4), GFAP(glial fibrillary acidic protein), RYR3(ryanodine receptor 3), IGFBP7(insulin like growth factor binding protein 7), S100β(S100 calcium-binding protein β), ALDH1L1(aldehyde dehydrogenase 1 family member L1) 및 CD44 중 하나 이상의 마커 유전자를 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 GFAP, ALDH1L1, CD44 및 S100β 등의 마커 유전자는 신경교세포 마커로, 신경교세포로의 분화가 진행될수록 발현 정도가 점점 증가하는 유전자이므로, 본 발명에 따른 분화 유도 방법에 의해 hPSC-NPC가 신경교세포로 분화되었음을 확인할 수 있는 지표로서 작용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 분화 유도 방법에서 분화 2주 후 GFAP 양성 세포가 분화된 세포 전체에 대해 80% 이상일 수 있다.

하기 실시예에서는, GFAP 및 S100β 발현 수준을 면역화학 분석으로 확인하여 분화 정도를 분석한 결과(도 4), 분화 2주만에 GFAP 및 S100β에 대해 양성을 보인 세포가 각각 84.48% 및 84.77%로 나타났음을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 아쿠아포린 4(AQP4) 마커는 신경교세포에 존재하는 이온채널 마커로, 신경교세포 막에 위치하는 이온 채널들의 존재 유무를 분석하여 분화된 신경교세포의 성숙(maturation)을 확인할 수 있다.

본 발명의 분화된 신경교세포가 뉴런 기능 유지를 도와주는 등의 주요 역할을 제대로 수행하기 위해서는, 신경교세포의 성숙이 중요하다. 나아가, 성숙한 신경교세포는 뉴런이 방출한 글루타메이트를 제거하는 글루타메이트 흡수(glutamate uptake) 기능이 제대로 수행되어야 한다.

본 발명에 있어서, 상기 신경교세포는 글루타메이트를 흡수하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 신경교세포는 성숙 신경교세포임을 확인할 수 있다. 특히 기존 기술(비특허문헌 2)에 비해 글루타메이트를 일정 수준 흡수하는 능력이 1주일 가량 빠른 시점에 도래함으로써 본 기술에 의한 분화가 좀 더 신속하게 이루어진다는 점을 시사하고 있다(도 7A).

앞서 기술한 바와 같이, 본 발명에 따라 분화된 신경교세포는 인간 뇌에서 분리한 신경교세포와 가장 유사한 특성을 갖는다.

하기 실시예에서는 성인의 뇌 조직에서 분리한 신경교세포와 본 발명에 따라 분화된 신경교세포의 유전자 발현 패턴, 세포 내 칼슘이온 농도 변화 및 글루타메이트 흡수 정도를 확인 및 분석함으로써 실제 뇌에서 분리한 신경교세포와 유사한 특성을 갖는 세포임을 확인하였다. 특히, 글루타메이트에 의해 칼슘 이온의 흐름이 유도되는 성질에 있어, 본 발명에 의해 생산된 대다수의 신경교세포는 실제 성인의 뇌 조직에서 관찰되는 All-or-None 양상의 반응성이 보이는 최초의 보고이다(도 6F). 이 사실은 본 발명이 실제 성인의 뇌 조직에 존재하는 신경교세포와 유사한 생리학적 성숙도에 도달하였다는 점을 증명하고 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실험예 및 제조예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실험예 및 제조예에 한정되는 것이 아니라, 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

본 발명에 따른 신경전구세포의 신경교세포로의 분화 방법은 NPC를 시작세포로 사용하면서, NFIB라는 전사인자를 단독으로 과발현시키면 2주 내에 성인의 뇌에서 분리한 세포와 유사한 수준의 성숙도를 보이는 신경교세포로 분화되며, 이 과정은 실제 생체 내의 신경교세포의 분화 과정과 유사한 분자적 및 기능적 변화 과정을 모사할 수 있다. 따라서 본 발명은 단기간에 효율적으로 신경교세포를 생산할 수 있는 기술을 제공할 뿐 아니라, 인간 신경교세포 발생 과정을 연구할 수 있는 효과적인 연구 플랫폼을 제공한다.

도 1은 분화에 사용된 NPC의 특성을 면역형광 염색을 통해 나타낸 것이다. A는 NPC에서 발현하는 대표적인 마커인 SOX1과 PLZF의 발현을 보여주며; B는 다른 마커인 NESTIN과 SOX2의 발현을 보여준다. 각 마커에 양성인 세포의 수를 전체 세포수에 대한 백분율로 정량화 하기 위해 모든 세포의 핵은 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 염색되어 있다 (스케일바: 50 ㎛). C는 신경교세포 분화에 사용된 NPC에 대한 순도를 확인하기 위해 NPC에 대한 확정적 마커인 SOX1 양성세포의 백분율을 확인하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 hPSC-NPC에서 NFIB의 단독 과발현이 신경교세포의 운명을 유도하기에 충분하다는 것을 보여준다. 도 2a의 A는 hPSC-NPC에서 신경교세포의 생성을 위한 개략도를 나타낸 것이고(BC: BMP4 및 CNTF); 도 2b의 B는 표시된 전사인자 혹은 그 조합의 과발현에 의해 유도된 분화 14일째에 GFAP 및 SOX1 양성 세포에 대한 형광 이미지를 나타낸 것이며(스케일바: 20 ㎛); 도 2c의 C 및 D는 분화 14일째에 표시된 마커에 대한 양성 세포의 정량화를 나타낸 것이다. 특히 도 2b 및 2c의 B 내지 D번 결과는 NFIB를 단독으로 도입한 경우가 NFIB 및 SOX9을 동시에 도입한 경우가 보다 14일이후 남아있는 미분화된 신경전구세포(SOX1 양성세포)의 수가 더 적으므로 신경교세포 분화의 관점에서 더 유리하다는 사실을 보여준다. 도 2d의 E는 hPSC 및 hPSC-NPC에서 SOX9 발현에 대한 정량적 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이며; 도 2e의 F는 무작위 현미경 필드를 통해 정량화한 hPSC 및 hPSC-NPC에서 SOX9 양성 세포의 평균 수를 나타낸 것이고; 도 2f는 hPSC 및 hPSC-NPC에서 SOX9 양성 세포에 대한 면역형광염색 결과 대표이미지를 나타낸 것이며(스케일바: 20 ㎛); 도 2g의 H는 NFIB 과발현 유무에 따라 세포에서의 SOX9 발현에 대한 정량적 RT-PCR 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다(n.s.: 유의하지 않음; * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001).
도 3은 인간 배아줄기세포주(H1)으로부터 분화된 NPC에 NFIB를 도입하여 신경교세포를 분화시킨 결과에 대한 것이다. A는 분화 14일째 GFAP와 S100β에 양성인 세포를; B는 CD44에 양성인 세포를 면역형광염색을 통해 나타낸 결과이다. C는 A와 B의 결과에서 각 마커에 양성인 세포의 백분율을 나타낸 것이다.
도 4는 NFIB 유도 신경교세포의 세포 및 분자 특성을 나타낸 것이다. 도 4a의 A, B 및 D는 분화 14일째에 표시된 마커(각각 GFAP, S100β, CD44 및 hALDH1L1, hALDH1L1의 경우는 EGFP-리포터 시스템을 통한 확인임)에 대한 형광 이미지를 나타낸 것이고(스케일바: 50 ㎛); 도 4a의 C는 분화 14일째에 표시된 마커에 대한 양성인 세포의 정량화를 나타낸 것이며; 도 4b의 E는 신경교세포(GFAP, ALDHL1, CD44 및 IGFBP7), 신경세포(MAP2), 희소돌기아교세포 전구체(PDGFRα) 및 NPC(SOX1)의 유전자에 대한 정량적 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이고; 도 4c의 F 및 도 4d의 G는 NFIB 유도 신경교세포 대 1차 인간 신경교세포, 다른 기술로 제작된 hPSC-유래 신경교세포, 및 신경교세포 이외의 다른 신경계 세포의 전사체 (transcriptome)를 RNA sequencing을 통해 비교한 것이다. 특히 도 4c의 F는 PCA 분석 결과를 나타낸 것이며, 점선의 원은 NFIB 유도 신경교세포를 나타낸 것이고; 도 4d의 G는 NFIB 유도 신경교세포 대 이전 문헌(참고문헌 2, 3 및 비특허문헌 3)들에서 제공하는 신경교세포 정체성과 관련된 유전자를 비교하여 정규화된 판독 카운트의 히트맵을 나타낸 것이다. 가까운 열에 위치할수록 그룹간 유전자 발현 양상이 유사함을 나타낸다. 특히, 검은색 상자로 표시된 그룹은 NFIB 유도 신경교세포의 유전자 발현 히트맵을 나타내며, 이는 이전 문헌에서 인간 성인 뇌 조직에서 분리한 신경교세포의 유전자 발현과 가장 근접하여 클러스터링 되어 있다.
도 5는 NFIB에 의한 분화 유도 과정 동안 신경교세포 특이적 유전자들의 발현 역학을 나타낸 것으로, 도 5a의 A는 분화 과정에서 신경교세포를 대표하는 유전자(GFAP, ALDH1L1, CD44 및 IGFBP7)의 RT-PCR 분석을 통한 발현 역학 조사 결과를 나타낸 것이고; 도 5b의 B는 신경세포 및 신경교세포에 대한 유전자를 나타내는 정규화된 판독 카운트의 히트맵을 나타낸 것이며; 도 5c의 C는 성인 또는 태아 유래 신경교세포에서 특이적으로 발현하는 유전자들의 발현이 어떠한 양상으로 변화하는지 나타내는 정규화된 판독 카운트의 히트맵을 나타낸 것이고; 도 5d의 D는 선택된 성인(ALDH1L1, IGFBP7 및 AGXT2L1) 및 태아 신경교세포 유전자(TOP2A, TMSB15A, 및 HIST1H3B)의 발현 역학을 기존에 보고된 590여일에 걸친 3D-인간 대뇌피질 스페로이드 형태로 진행된 신경교세포 분화과정에서 관찰된 동일 유전자 발현 역학 결과(참고문헌 5)와 비교한 결과이다. 특히, 이 결과는 NFIB에 의해 14일에 걸쳐 변화하는 유전자 증감 양상이 기존 590여일에 걸쳐 변화하는 유전자 증감 양상과 매우 유사함을 보여주는 결과로서, 이는 NFIB에 의한 신경교세포 분화가 실제 신경교세포의 발달과정을 잘 모사하고 있음을 보여주는 동시에 그 기간을 획기적으로 단축되었음을 보여준다.
도 6은 신경교세포가 시험관 내 연령(분화기간)이 증가함에 따라 생리적 자극제에 대한 칼슘 반응에서 기능적 성숙을 나타낸다는 결과를 보여주는 것으로, 도 6a의 A는 분화 0일째와 분화 14일째 사이의 GSEA 분석 결과로 분화가 진행됨에 따라 칼슘 매개 신호전달과 관련된 유전자의 농축을 보여주는 결과를 나타낸 것이고; 도 6b의 B는 칼슘 매개 신호전달과 관련된 유전자의 발현 변화에 대한 히트맵을 나타낸 것이며(GO: 0019722); 도 6c의 C 및 도 6d의 D는 각각 분화 7일째 및 분화 14일째에 분화된 신경교세포에서 30 μM의 ATP 및 100 μM의 글루타메이트에 대한 칼슘 반응에 대한 이미지를 나타낸 것이고(스케일바: 50 ㎛); 도 6e의 E 및 도 6f의 F는 도 6c의 C 및 도 6d의 D에서 얻은 기록된 세포의 형광비(F/F0)의 일부를 나타낸 것이며, 각 추적은 단일 세포 내에서 세포 내 Ca²⁺ 수준의 변화를 나타낸 것이다; 도 6g의 G는 분화 7일째 및 분화 14일째에 분화된 신경교세포에서 30 μM의 ATP 처리 하에 3(F/F0) 이상의 칼슘 반응을 나타내는 세포의 백분율을 나타낸 것이며; 도 6h의 H는 분화 7일째 및 분화 14일째에 분화된 신경교세포에서 100 μM의 글루타메이트의 처리 하에 10(F/F0) 이상의 칼슘 반응을 나타내는 세포의 백분율을 나타낸 것이다. 특히, 도 6f의 F의 분화 14일(day 14)째 칼슘 변화 추적 그래프에서 다수의 세포들이 글루타메이트 자극에 의해 단일 곡선(혹은 일부에서 이중곡선) 을 그리는 양상(all-or-none 양상)을 보여주는데, 이러한 현상은 참고문헌 3에 따르면 오직 인간 성인 뇌조직의 신경교세포에서만 발견되는 현상이다. 이 결과는 신경교세포의 대표적인 생리학적 기능인 칼슘 반응이 분화 14일째에 이르러 분자적, 기능적으로 실제 성인 뇌의 신경교세포 수준까지 성숙해 감을 보여주고 있다.
도 7은 글루타메이트 흡수 및 시냅토좀 탐식(혹은 식작용: phagocytosis) 에 대한 기능적 성숙을 나타낸 것으로, 도 7a의 A는 분화 7일째 및 분화 14일째에 신경교세포에서 글루타메이트 흡수에 대한 분석이 분화가 진행됨에 따라 배양 배지에서 글루타메이트를 제거하는 능력의 상당한 향상을 나타내었음을 보여주는 결과이고; 도 7b의 B는 신경전달물질 제거와 관련된 유전자의 히트맵을 나타낸 것으로, SLC1A3, ARL6IP5 및 GLUL이 신경교세포에서 글루타메이트 흡수와 직접적으로 관련된 유전자임을 보여주며; 도 7c의 C는 분화 7일째 및 분화 14일째에 pHrodo-Red가 접합된 시냅토좀을 탐식한 세포의 이미지를 나타낸 것이고(스케일바: 50㎛); 도 7d의 D는 분화가 진행됨에 따라 pHrodo-Red가 접합된 시냅토좀을 삼키는 능력이 크게 증가했음을 보여주는 결과이며; 도 7e의 E는 0일째 대 14일째의 GSEA가 식 작용과 관련된 유전자의 명확한 농축을 나타내었음을 보여주고(GO: 0006909); 도 7f의 F는 식작용과 관련된 유전자(GO: 0006909)의 히트맵이 대부분의 유전자에서 점진적인 상향 조절을 보여줌을 나타내는 것이다. 특히, 시냅스 제거에서 중요한 역할을 한다고 알려진 몇 가지 유전자(MERTK 및 C3)는 붉은 상자와 별표로 표시하였다. 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 표시되었다(n=6(A), n=5(D))(* p<0.05, ** p<0.01)
도 8은 NFIB의 과발현을 통한 방법이 단기간에 신경교세포의 분화를 유도하므로 이를 활용하여 인간 신경교세포 발달 과정 중에 중요한 세포신호 전달기전들을 찾아내거나 이를 연구할 수 있는 플랫폼으로 활용될 수 있다는 사실을 보여준다. 도 8a의 A는 NFIB를 이용한 분화 과정에서 차별적으로 발현된 유전자(Differentially Expressed Gene, DEG)에 대한 클러스터링 및 스케일링된 발현 패턴을 나타내는 것으로, 특히 붉은 상자로 표시된 유전자 그룹들(그룹 6, 11, 14)은 GFAP 및 ALDH1L1과 유사한 발현 역학을 가진 유전자 그룹을 나타낸 것이고; 도 8b의 B는 그룹 6, 11 및 14의 유전자들에 대한 온톨로지(Gene Ontology, GO) 분석이 막 관통 수용체 단백질 키나아제 신호 전달 및 MAPK 신호 전달 경로에 대한 농축을 나타내어, 이들 신호가 신경교세포 발생 과정에 중요한 역할을 할 것이라는 점을 암시하며; 도 8c의 C는 신경교세포 분화 동안 MAPK 신호전달 기전의 상위 효소인 MEK1/2의 억제제(U0126)를 처리하기 위한 실험 설계의 개략도를 나타낸 것이고; 도 8d의 D는 C의 실험 설계에 따라 분화를 수행한 후 GFAP 및 SOX1에 대한 형광 이미지로, MAPK 신호전달경로의 약제학적 억제에 의한 신경교세포 분화의 강력한 억제를 보여주며(스케일바: 50 ㎛); 도 8e의 E 및 도 8f의 F는 분화 14일째에 표시된 각 마커에 대해 양성인 세포의 백분율을 정량화한 것이다. 이 결과는 신경교세포 분화는 MAPK 신호전달 기전의 억제에 민감하게 감소되며, 따라서 MAPK 신호전달기전은 신경교세포 분화에 필요한 세포신호전달 기전임을 보여준다. 결과적으로 본 데이터는 NFIB에 의한 신경교세포 분화 기술이 신경교세포의 발달과정에 대한 분자적 연구를 위한 플랫폼으로 활용될 수 있음을 보여준다. 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 표시되었다(n=3)(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. hPSC-NPC의 제작 및 신경교세포로의 분화

1-1. hPSC-NPC 구축

WiCell 사(USA)로부터 얻은 인간배아줄기세포주 (H1; WiCell, Madison, WI, USA) 및 hiPSC 세포주인 NL1를 신경교세포 분화에 사용하였다. 이들 hPSC는 StemMACS™ iPS-Brew XF 배지에서 Matrigel이 코팅된 6-웰 플레이트에서 배양하였고, ROCK(Rho-associated kinase) 억제제인 Y27632를 처리(10 μM)하여 해리 유도 세포사멸을 방지하였다. NPC로의 분화를 위해, 이중 SMAD 억제(dual-SMAD inhibition) 전략을 약간 변형하여 사용하였다(참고문헌 1). 요약하면, hPSC를 단일세포로 분리하고, 분리된 1 × 10⁴ cells/cm²의 단일세포를 10 μM의 Y27632를 함유하는 StemMACS™ iPS-Brew XF 배지에서 Matrigel이 코팅된 플레이트에 두었다. NPC로의 분화 1일째에, 세포를 골형성단백질(Bone morphogenetic protein, BMP) 신호 억제를 위한 250 nM의 LDN193189(Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canada) 및 변형성장인자(Transforming growth factor-beta, TGF-β) 신호 억제를 위한 10 μM의 SB431542(Millipore Sigma)를 포함하는 StemMACS™ iPS-Brew XF 배지로 옮기고, 8일동안 배양하였다. 분화 8일째에, 세포를 아큐타제(accutase)(Thermo Fisher Scientific)로 해리시키고, 20 ng/ml bFGF(Pepro Tech, Rocky Hill, NJ, USA)를 함유하는 NPC 배지(1 × N2, 1 × B27이 보충된 DMEM/F12 배지, 모두 Thermo Fisher Scientific에서 구입)에 재현탁시켰으며, 자발적 분화를 방지하기 위해 상대적으로 고밀도(3.5 × 10⁵ cells/cm²)로 다시 두었다. 이렇게 제작된 hPSC-NPC는 동일한 밀도로 유지하기 위해 아큐타제를 통한 계대배양이 가능하였고, 면역화학 분석을 통해 세포가 NPC의 결정적 마커인 SOX1에 대해 80% 이상 양성을 보일 때, 신경교세포로의 분화에 활용 가능하다고 판단하였다. 신경교세포로의 분화에 사용한 계대수는 5이하이다. 배지는 격일로 보충하였다.

1-2. 렌티바이러스 시스템 생산

하기 실험예에서, hPSC-NPC에 대한 최적의 전사인자 조합을 확인하기 위해, NFIB, SOX 및 hALDH1L1-EGFP 발현을 위한 플라스미드를 제작하였다.

NFIB 발현을 위한 플라스미드를 클로닝하기 위해, T7-VEE-GFP 플라스미드(#58977, Addgene)를 제한효소(Xbal)(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)로 절단하여 IRES-Puro^R 단편을 얻었다. TetO-FUW-NfiB(#64900, Addgene)를 동일한 제한효소로 절단한 다음, IRES-Puro^R 단편을 통상의 결찰(traditional ligation) 방법을 사용하여 삽입하고, TetO-FUW-NfiB- IRES-Puro^R을 생성하였다.

SOX9 발현을 위한 플라스미드를 클로닝하기 위해, TetO-FUW-DLX2-IRES-hygro^R(#97330, Addgene)을 제한효소(EcoRI 및 BamHI, 모두 New England Biolabs)로 절단하여, DLX2의 오픈리딩프레임(ORF)을 제거한 다음; NPCs 유래 hPSC에서 클로닝된 SOX9의 ORF를 통상의 결찰 방법을 사용하여 삽입하고 TetO-FUW-SOX9-IRES-hygro^R이라 불리는 플라스미드를 생성하였다. 렌티바이러스 벡터를 포함하는 rtTA(reverse tetracycline controlled transactivator)는 Addgene(#20342)에서 구입하였다.

hALDH1L1-EGFP에 대한 플라스미드를 클로닝하기 위해, 인간 ALDH1L1 프로모터 영역은 먼저 인간 게놈 DNA에서 클로닝되었다. pcDH-pigGFAP-EGFP-EF1a-Puro^R의 플라스미드를 제한효소(Spel 및 BamHI)(New England Biolabs)로 절단한 다음; 복제된(cloned) 인간 ALDH1L1 프로모터 영역을 통상의 결찰 방법을 사용하여 삽입하였다. NFIB, SOX9, hALDH1L1-EGFP 또는 rtTA, 패키징 벡터 pMDLg/pRRE, pRSV-Rev 및 외피 pMD2.G(각각 #12251, #1225, #12259, 모두 Addgene에서 구입)를 함유하는 플라스미드를 293FT 세포(Thermo Fisher Scientific)에 형질감염시켰다. 바이러스를 함유하는 배양 배지는 형질감염 후 72시간째에 수확하고, 렌티-X 농축기(Takara, Nojihigashi, Kusatsu, Japan)를 사용하여 농축하였다. 적정 후, 바이러스 입자의 농축된 현탁액을 추가 사용을 위해 분취하였다.

1-3. hPSC-NPC로부터 신경교세포의 분화

바이러스 감염을 위해, 계대 수가 5 미만인 hPSC-NPC를 Matrigel이 코팅된 6-웰 플레이트에 3 × 10⁴ cells/cm²로 접종하여 모든 세포가 플레이트 바닥에 골고루 완전히 부착되도록 하루 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 바이러스(접종바이러스양/세포수, multiplicity of infection (MOI): 1.0) 및 1 ㎍/ml 폴리브렌(polybrene)(Millipore Sigma) 으로 감염시켰다. 바이러스 감염시 형질도입 효율을 개선시키기 위해 세포가 부착된 플레이트를 원심분리(실온(RT)에서 1시간동안 1000 g으로)하였다. 배양 18시간 후, 바이러스-함유 배지를 10 ng/ml 섬모신경영양인자(CNTF), 10 ng/ml BMP4(Peprotech), 및 2.5 ㎍/ml 독시사이클린(Millipore Sigma)를 함유하는 신선한 NPC 배지(DMEM/F12 배지)로 교체하여, NFIB 발현을 유도하였다. 이때 독시사이클린이 첨가된 날을 분화 0일로 지정하였다(도 1A). 분화 2일 째에, NPC 배지를 시판중인 신경교세포 배지(Astrocyte Medium (AM); ScienCell, Carlsbad, CA, USA)로 교체하고, 이 배지를 분화 14일까지 사용하였다. 바이러스에 감염된 세포에 대한 양성 선별은 1일 내지 5일까지 1.25 ㎍/ml의 퓨로마이신 및/또는 200 ㎍/ml의 하이그로마이신(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 수행되었다.

실험예 1. hPSC-NPC의 신경교세포로의 분화 효율 확인

1-1. 분화에 사용된 NPC의 특성 확인

본 발명에서 신경교세포로의 분화에 사용된 NPC의 기본 특성을 면역형광염색을 통해 확인하였다.

도 1에서 보는 바와 같이, NPC에서 발현하는 대표적인 마커인 SOX1 및 PLZF가 발현되는 것을 확인할 수 있었으며(도 1A), NESTIN 및 SOX2가 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 1B). 또한, SOX1 양성세포의 수를 전체 세포수에 대한 백분율로 정량화하였다(도 1C).

1-2. 최적의 전사인자 조합 도출

최근 연구(비특허문헌 2)에서 특정 전사인자의 과발현을 통해 줄기세포에서 목적하는 신경세포를 빠르고 효율적으로 생성하는 것이 가능함이 증명되었다. 유사한 개념의 연구 결과로, 참고문헌 6 및 비특허문헌 2에서는 SOX9, NFIA, NFIB 및 이들 인자를 조합하여 과발현하면 단 몇주 내에 인간 섬유아세포(참고문헌 6) 혹은 hPSC에서 신경교세포(비특허문헌 2)가 유도되었다. 다른 최근 연구(비특허문헌 3)에서는 hPSC 유래 LTNSC에 NFIA를 도입하여 약 8주에 걸쳐 신경교세포를 유도하고, 이 시스템을 사용하여 신경교세포 발생(astrogliogenesis)의 분자 메커니즘을 분석하였다. 이러한 사실은 NFIB(단독 혹은 SOX9와의 조합)가 hPSC를, 그리고 NFIA가 LTNSC를 신경교세포로 분화시킬 수 있는 전사인자임을 명확히 보여주었다.

그러나, NFIB와 NFIA가 hPSC 및 LTNSC의 신경교세포로의 분화에 관여하는 전사인자임이 알려진 것과는 반대로, 최근 연구들에 따르면 NPC 혹은 신경줄기세포에서 NFIB의 상승 발현이 신경교세포가 아닌 희소돌기아교세포로의 분화를 촉진한다는 보고가 있었다 (참고문헌 7, 8). 하지만 hPSC-NPC가 hPSC와 달리 이미 신경계 세포로 운명이 결정되어 내/중배엽의 세포로 분화할 가능성이 없다는 점에서 hPSC에 비해 신경세포를 생산하기 위한 시작세포로 유리한 이점이 있다고 판단하였다. 따라서 본 발명자들은 hPSC-NPC에 NFIB의 과발현이 신경교세포를 분화시킬 수 있는지, 다른 인자들의 도움이 필요한지 먼저 확인할 필요가 있었다. 동시에, hPSC-NPC를 시작세포로 하여 기존 방법들보다 훨씬 빠르고 효율적인 방법으로 신경교세포를 생산할 수 있는 최적의 전사인자 혹은 그 조합을 알아내고자 하였다.

먼저, hPSC 세포주(NL1)로부터 분화된 NPC의 경우, 기존에 hPSC-NPC에서 사용되지 않았던 SOX9, NFIB 및 그 조합을 독시사이클린 유도성 렌티바이러스 시스템을 사용하여 도입하였다(도 2a의 A). 그 결과, NFIB 단독과 SOX9 및 NFIB 조합의 과발현이 2주만에 NPC에서 신경교세포 마커인 GFAP를 발현하는 세포를 효율적으로 유도할 수 있음을 확인하였다(전체 세포 중 각각 75.89% 및 75.40%)(도 2b 및 2c의 B-C). 하지만 흥미롭게도, 기존에 hPSC에 도입하였을 때 가장 효과적으로 신경교세포를 분화하였던 SOX9/NFIB의 조합을 도입한 실험군에서 NFIB를 단독으로 도입한 실험군에 비해 더 많은 미분화 NPC(SOX1 양성세포)가 분화 2주 후에 남아있음을 보여주었다(도 2c의 D).

다음으로, 인간 배아줄기세포주(H1)로부터 분화된 NPC에도 hPSC 세포주(NL1)로부터 분화된 NPC에서와 동일한 방법으로 NFIB를 도입하여 신경교세포로 분화시켰다. 그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, hPSC 세포주(NL1)에서와 마찬가지로, 모든 마커(GFAP, S100β 및 CD44)에서 양성을 보였으며(도 3A 및 B), 상기 마커에 대해 약 90%의 세포 수율을 보여주었다(도 3C).

참고문헌 9에 따르면 SOX9은 신경줄기세포의 자기재생능 유지에 필요한 인자라고 알려져 있다. 이는 NPC에 SOX9가 과발현되었을 때 세포를 교세포로의 운명으로 유도하는 것 뿐 아니라, 미분화 상태를 유지하게도 하여, SOX1 양성 세포가 더 많이 남아있게 하는 결과를 야기하였다고 유추할 근거가 된다. 하지만, 참고문헌 10에서와 같이, SOX9이 신경교세포 분화에 필요하다는 점은 이미 밝혀진 사실이다. 따라서 본 발명자들은 아마도 hPSC-NPC에서 SOX9의 기본 발현양이 존재하며, 이것이 NFIB의 과발현에 의해 신경교세포로의 분화 유도에 역할을 할 수 있을 것이다라고 가정하였다. 실제로 도 2d의 E, 도 2e의 F 및 도 2f에서 알 수 있듯이, hPSC-NPC에서 hPSC에 비해 SOX9의 기본 발현이 더 높음이 확인되었다. 이와 더불어, hPSC-NPC에 NFIB를 과발현시키면 기 존재하던 SOX9의 기본 발현양이 더욱 증가함도 확인하였다 (도 2g의 H). 이러한 결과를 미루어 볼 때, hPSC-NPC는 SOX9를 기본적으로 발현하며, 여기에 NFIB의 과발현을 더해주면 원래 기본 발현되던 양에 더해 증가된 SOX9의 내재 발현양이, 미분화 상태를 유지하는 효과없이, hPSC-NPC로부터 신경교세포를 유도하기에 충분할 것임을 시사한다. 따라서, hPSC-NPC에서의 NFIB의 단독 과발현을 통해 신경교세포를 분화시키는 발명 개념을 완성하였다.

1-3. hPSC-NPC 유래 신경교세포의 특성 분석

NFIB 도입에 의해 유도된 GFAP 양성 세포는 정상적인 인간 1차 신경교세포의 형태와 유사한 가느다란 세포체와 여러 돌기를 가진 별모양을 나타내었다(도 4a의 A).

분화된 GFAP 세포가 진정한 신경교세포 임을 검증하기 위하여 다양한 신경교세포 마커를 대상으로 면역형광 염색을 수행하였다. 면역형광 염색은 유리 커버 슬립에서 배양된 세포를 실온(RT)에서 15분동안 4% 파라포름알데하이드(PFA)에 고정하고 인산염완충식염수(PBS)로 세척하였다. PBS에서 0.05% Triton X-100으로 10분동안 세포막을 투과화시킨 후, 커버 슬립의 세포 시료를 2% 소혈청알부민 용액 또는 5% 당나귀혈청 용액(모두 PBS로 희석됨)을 사용하여 적어도 1시간동안 블록킹한 다음, 1차 항체(이하 참조)와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 배양된 세포 시료를 PBS로 완전히 세척한 후, 형광 염료(Alexa fluor® 488 또는 594, Thermo Fisher Scientific)와 접합된 적절한 2차 항체와 함께 실온(RT)에서 30분동안 배양하였다. 커버 슬립을 DAPI가 함유된 마운팅 용액(Vector Laboratory, Burlingame, CA, USA)을 사용하여 유리 슬라이드에 부착시킴으로써 형광현미경 관찰용 시료를 완성하였다. 디지털 카메라(DP71)가 장착된 형광 현미경(IX71)(모두 Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan)을 사용하여 분석을 위한 세포 사진을 수득하였다. 이 연구에 사용된 1차 항체는 다음과 같다:

SOX1(Goat, 1:200; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), SOX9(Rabbit, 1:200; Abcam, Cambridge, United Kingdom), GFAP(Rabbit, 1:1000; Dako, Santa Clara, CA, USA), S100B(Mouse, 1:1000; Millipore Sigma), CD44(Rat, 1:100; Thermo Fisher Scientific), MAP2(Mouse, 1:1000, Thermo Fisher Scientific), O4(Mouse, 1:400; R&D Systems).

면역형광염색 결과, 전체 세포의 84.48%, 87.67%, 및 84.77%가 각각 GFAP, S100β, 및 CD44에 대해 양성이었으며, 이 결과를 통해 대부분의 세포가 신경교세포 운명을 획득했음을 재확인할 수 있었다(도 4a의 A-C). 성숙한 신경교세포의 마커로 사용되는 ALDH1L1의 발현을 관찰하기 위하여 ALDH1L1의 유전자가 발현되면 초록색 형광(EGFP)을 나타내는 ALDH1L1 리포터 렌티바이러스(hALDH1L1-EGFP, "h"는 인간(human) 유전자임을 나타내는 약자임)를 제작하여 분화된 세포에 도입한 결과, 다수의 GFAP 양성 세포가 강력하게 녹색 형광을 띈 것을 확인하였다. 이러한 결과는 ALDH1L1을 발현하는 성숙한 신경교세포가 NFIB 발현 후 단 2주만에 나타났음을 보여주었다(도 4a의 D). 본 분화 전략이 신경교세포만을 선택적으로 분화시키는지 확인하기 위해 신경계에 존재하는 다양한 세포(즉, 신경세포, 희소돌기아교세포, 신경교세포 및 NPC)에 대한 다양한 마커를 대상으로 정량적인 유전자 발현 분석을 수행하였다. GFAP, ALDH1L1, CD44 및 IGFBP7과 같은 신경교세포 마커 유전자의 상향 조절은 면역형광 염색 결과와 일치하여 예상대로 분명하게 나타났다(도 4b의 E). 하지만 NPC(SOX1 양성) 및 신경세포(MAP2 양성)에 대한 마커의 발현은 크게 감소하였다(도 4b의 E). 이는 대부분의 세포들이 신경교세포로 유도되었음을 나타낸다.

신경교세포로서의 정체성을 추가로 확인하고, NFIB 유도 신경교세포가 다른 연구에서 얻은 인간 1차 신경교세포 및 hPSC 유도 신경교세포와 얼마나 분자적 특성을 공유하는지 확인하기 위해 분화 2주째 신경교세포에서 RNA sequencing(RNA-seq)을 통해 전사체 데이터를 얻은 후 기존 다양한 문헌들(비특허문헌 3 및 참고문헌 2, 3)에서 보고하여 공개된 그들의 신경교세포 전사체와 비교 분석을 수행하였다. RNA-seq 분석을 위해 먼저 NFIB 도입을 통해 2주동안 분화시킨 신경교세포에서 TRIzol®(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 그 다음 총 RNA를 E-biogen Inc.(서울, 한국)에 의뢰하여 RNA-seq raw 데이터를 수집하였다. Raw FASTQ 파일은 BBDuk(참고문헌 4)를 사용하여 어댑터를 제거한 후, STAR(2.7.2a)를 사용하여 ENSEMBL GRCh38 게놈 빌드에 정렬시켰다. 정렬된 파일에서 매트릭스를 생성하고, 생성된 매트릭스는 표준 파이프라인을 사용하여 추가 분석을 위해 DESeq2(1.27.12)로 가져왔다. 기존 문헌에 의해 공개된 hPSC 유래 신경교세포 및 인간 1차 신경교세포의 raw RASTQ 파일은 GEO 데이터베이스에서 얻은 후(수탁번호 GSE73721, GSE97904 및 GSE104232), 앞서 언급한 동일한 파이프라인으로 전처리 과정을 거쳤다. 이후 ggplot2(v3.3.0)을 사용하여 상관관계 플롯을 준비하고, pheatmap(v1.0.)을 사용하여 히트맵을 그렸다. 이후 필요시 Metascape를 사용하여 유전자 온톨로지(GO) 농축 분석을 수행하였다. 유전자 세트 농축 분석(GSEA)은 GSEA v4.0.3(Broad Institute, Cambridge, MA, USA)을 사용하여 수행되었다.

기존에 보고된 신경교세포의 전사체와의 유사성을 직관적으로 비교 확인하기 위하여 전체 전사체를 사용한 주성분 분석(principal component analysis, PCA)을 우선 실시하였다. 그 결과 NFIB 도입에 의해 분화된 신경교세포의 전사체는 인간 성인 혹은 태아의 뇌 조직으로부터 HepaCAM-매개분리법으로 정제된 1차 신경교세포의 전사체와는 여전히 구별되어 클러스터링 되었으나, 다른 문헌에서 보고한 인간 태아 유래 1차 신경교세포 및 다른 방법으로 분화된 hPSC 유래 신경교세포와 밀접한 클러스터링을 나타내고 있음을 보여주었다(도 4c의 F, 검은 점선 타원으로 표시된 부분). 더불어 본 업계에서 자주 사용되는 또 다른 전사체 비교분석 기법으로 신경교세포와 관련된 모든 유전자군을 대상으로 RNA의 발현 정도를 비교하여 각 세포 그룹들의 유사성을 계층적 클러스터링으로 보여주는 분석을 수행하였다. 앞선 PCA 분석과 마찬가지로 NFIB 도입을 통해 분화한 신경교세포가 인간 태아유래 1차 신경교세포 및 다른 방법으로 분화된 hPSC 유래 신경교세포와 밀접하게 위치하여 있음을 보여주었다(도 4d의 G). 예상대로, 신경세포, 희소돌기아교세포, 뇌혈관 내피세포, 뇌실막세포와 같은 신경조직에서 분리될 수 있는 다양한 세포 유형은 NFIB로 유도된 신경교세포와 낮은 상관관계를 나타냈다. 이는 NFIB 도입을 통해 유도된 신경교세포가 기존에 알려진 방법에 의해 분화된 신경교세포와 분자적 수준에서 매우 유사함을 드러내었다.

여기서 가장 주목할 점은, NFIB 도입을 통해 분화된 신경교세포가 인간 뇌조직에 존재하는 정상적 신경교세포의 분자/생리학적 성질을 가장 잘 반영한다고 알려진 HepaCAM-매개분리법을 통해 인간 뇌 조직으로부터 얻은 성인 신경교세포와 가장 가깝게 클러스터링 되었다는 점이다(도 4d의 G, 검은색 상자로 표시). 이러한 결과는 hPSC-NPC에서 NFIB의 도입을 통해 분화된 신경교세포가 앞서 보고된 그 어떤 hPSC 유래 신경교세포보다 실제 인간 성인의 뇌 조직에서 분리된 신경교세포와 가장 유사한 분자적 특성을 보인다는 점을 시사한다.

1-4. hPSC-NPC 유래 신경교세포의 분자적 발달과정 분석

기존의 문헌과 본 발명이 제시하는 근거들을 미루어 보아 전사인자의 강제 발현을 통한 분화는 신경교세포를 생성하는데 있어서 빠르고 강력한 방법인 것이 입증되었다. 그러나, 이 접근 방법이 실제 신경교세포의 생체 내 분화 프로그램을 따르는지 여부는 여전히 잘 알려져 있지 못하다. 여러 신경발달질환 연구에서 신경교세포 분화 과정의 이상이 질환의 원인이 됨을 보이고 있다. 따라서, 해당 질환 연구를 위한 목적으로 신경교세포를 생산하는 경우 본 분화 방법이 실제 분화 프로그램을 따라 이루어지는지 그렇지 않은지는 매우 중요한 의미를 가진다. 본 발명이 제시하는 분화 유도 방법이 생체에서 일어나는 신경교세포의 분화 과정을 따라 진행되는지 확인하기 위해, 먼저 정량적 RT-PCR을 사용하여 분화하는 동안 대표적인 신경교세포 마커 유전자의 발현 역학을 평가하였다. 도 5a의 A에 나타난 바와 같이, 모든 신경교세포 마커 유전자는 분화 2주의 기간동안 점진적으로 증가하였다. 특히 CD44의 발현은 NFIB의 유도에 따라 즉시 증가한 반면, GFAP 및 ALDH1L1은 다소 지연된 양상으로 증가됨을 보였고, 4일 후에 더욱 두드러진 양상을 보였다. 이는 참고문헌 11에도 개시된 바와 같이, CD44의 발현이 발달 중인 신경계에서 GFAP의 발현보다 앞서기 때문인 것으로, 본 방법에 의해 분화되는 세포가 실제 발생과정과 유사한 양상으로 진행된다는 초기 단서를 제공해 주었다. 테스트된 모든 유전자의 발현은 10일째에 최대에 도달했고, 그 후 정체되었다. 이 발현 패턴은 신경교세포 운명의 획득이 NFIB의 과발현 직후에 시작되고 약 10일째에 완료되며, 그 후 기능적 성숙이 발생할 수 있음을 시사한다.

세포 분화과정을 분자 수준에서 좀 더 심도있게 분석하기 위해 신경교세포 분화가 일어나는 2주 동안 전사체 변화를 RNA-seq 데이터 분석을 통해 다양한 시점에서 관찰하였다. 먼저 신경세포 또는 신경교세포에 특이적인 유전자 세트의 발현을 조사했을 때, GFAP 및 아쿠아포린 4(AQP4)와 같은 신경교세포 특이적 유전자는 상향 조절된 반면, 특정 AT-부유 서열-결합 단백질 2(specific AT-rich sequence-binding protein2, SATB2), 시냅신 1(synapsin 1, SYN1), 스타스민-2(stathmin 2, STMN2), 및 L1 세포 부착 분자(L1 cell adhesion molecule, L1CAM)과 같은 신경세포 특이적 유전자는 하향 조절되었다(도 5B). 이 결과는 NFIB에 의한 분화과정이 신경세포가 아닌 신경교세포로의 편향된 유전적 프로그래밍에 의함이라는 사실을 보여주었다.

이후, 분석을 위한 유전자 세트를 신경교세포에 특이적인 것으로 확장하였다: 태아 신경교세포에서 특이적으로 발현되는 상위 50개 유전자와 성인의 성숙한 신경교세포에 특이적인 다른 상위 50개 유전자를 대상으로 테스트하였다. 정규화된 판독 카운트(read-counts)의 히트맵을 구성해 본 결과 대부분의 태아 신경교세포 특이적 유전자가 점차적으로 하향 조절되는 반면, 성숙한 신경교세포 유전자는 현저하게 상향 조절된다는 명확한 경향성을 보여주었다(도 5c의 C). 특정 유전자 발현에서 흥미로운 변화가 발견되었는데, 예를 들어, 태아 신경교세포 유전자 중 하나인 EZH2(enhancer of zeste homolog 2)의 발현이 하향 조절되었다. EZH2는 NFIB의 직접적인 하류 표적인 것으로 알려져 있는 유전자로, 피질 신경전구세포의 분화와 신경교세포 유전자의 발현을 조절한다고 알려져 있다(참고문헌 12). 또한 성숙한 신경교세포 특이적 유전자인 라이노딘 수용체 3(ryanodine receptor 3, RYR3)의 상향 조절도 흥미로웠는데, 이는 인간 신경교세포와 마우스 신경교세포를 구별하는 유전자 중 하나이기 때문이다.

참고문헌 5에서 3D 대뇌 피질 스페로이드(오가노이드 유사한 구조) 형성을 통해 약 590여일 가량 분화되는 신경교세포는 인간 신경교세포 발달의 분자적, 생리학적 특성을 매우 잘 모사한다고 보고하였다. 참고문헌 5에서 공개한 3D 대뇌 피질 스페로이드를 통해 분화된 신경교세포에서 얻어진 560여일 동안의 전사체 변화 데이터를 기반으로, NFIB 도입을 통해 분화된 신경교세포의 전사체 역학의 변화가 이와 얼마나 유사한가 직접 비교를 시도하였다. 이를 위해, 여러 유전자의 발현 패턴을 인위적으로 동일한 시간 프레임 내의 변화로 맞추어 중첩한 후 비교하였다(도 5d의 D). 절대적인 시간차에도 불구하고(본 발명에서의 14일째 대 참고문헌 5에서의 590일째), 정렬된 발현 패턴은 전사체 역학에서 놀랍도록 유사한 경향을 보였으며, 이는 hPSC-NPC에서 NFIB의 과발현에 의한 분화가 3D 대뇌 피질 스페로이드에서 이루어지는 분화와 분자적으로 매우 유사하게 일어나고 있음을 시사하였다. 더욱이, 신경교세포 분화를 위한 1년 이상의 분자적 변화 양상이 NFIB 과발현을 통한 강제 분화에 의해 단 2주로 획기적으로 압축되었다는 점까지도 입증하였다(도 5d의 D). 아울러, 세포 증식 마커인 DNA TOP2A(topoisomerase 2-α)의 점진적인 하향 조절은 신경교세포로의 분화과정 동안 세포분열이 지속적으로 감소하고 있다는 사실을 나타내며, 이는 신경교세포 분화 과정에서 일어나는 일반적인 현상임이 이미 여러 연구에서 입증된 바 있다. 일련의 증거들은 NFIB에 의해 유도된 분화는 단순한 세포 형질의 급격한 변화의 결과물이 아니라 원래 세포의 정상적인 발달 프로그램을 그대로 따르면서 NPC로부터 신경교세포를 특이적이고 빠르게 생성한다는 것을 종합적으로 보여주는 것이다.

1-5. hPSC-NPC 유래 신경교세포의 기능적 성숙 확인

1) 칼슘 농도 분석

정상적인 신경교세포의 생리학적 특징 중 하나는 세포외 자극에 반응하여 세포 내 칼슘 농도를 변화시키는 능력을 보유하는 것이다. 특히 이 기능은 신경교세포가 신경계에서 시냅스 전달과 혈류를 조절하는데 중요하다.

세포가 세포 내 칼슘 농도를 변화시키는 능력을 획득했는지 확인하기 위해, 먼저 특정 기능과 관련된 유전자 발현 양상을 확인하는데 사용하는 GSEA(gene set enrichment analysis) 분석법을 통해 0일째 세포 대 14일째 세포의 순위 유전자 특징을 칼슘 매개 신호와 관련된 유전자와 비교하여 수행하였다(GO:0019722). 분석 결과, 칼슘 매개 신호 전달과 관련된 유전자 세트의 주요 변화가 나타났다(도 6A). 더욱이, 이들 유전자의 발현에 대한 히트맵은 분화 동안 점진적인 상향 조절을 보였다(도 6b의 B). 이러한 결과를 바탕으로 ATP 및 글루타메이트에 대한 NFIB 유도 신경교세포의 반응, 즉 생리적 자극에 대한 신경교세포의 칼슘 증가 여부를 조사하였다. 구체적으로 칼슘 지표인 Fluo-4를 사용하여 분화 7일째와 분화 14일째에 세포로 칼슘 이미징을 수행하고, 두 시점 사이의 세포내 칼슘 유입 현상을 비교하였다. 칼슘 이미징을 위해 분화된 신경교세포를 12 mm 커버 슬립에 준비하였다. 세포 배양 배지를 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS, 칼슘과 마그네슘 미포함)(Thermo Fisher Scientific)으로 교체한 후 분화된 신경교세포를 5 μM Fluo-4 AM(Thermo Fisher Scientific)으로 30분 동안 37℃에서 배양한 다음, 칼슘 이미징 전에 HBSS 용액으로 두 번 세척하였다. 이후 공촛점 현미경(Fluoview FV1000, Olympus)를 사용하여, Fluo-4 AM 형광 염료 검출 방법에 의해 세포 내 칼슘 수준을 분석하였다. 이를 위해, 535 nm 파장의 강도 이미지는 488 nm 여기 파장에서 2초당 한 프레임의 속도로 촬영되었다. 세포 내 칼슘 수준은 형광비(F/F0)로 표현되었으며, 이는 휴지시 초기 형광 강도(F0)와 비교하여, 30 μM ATP 또는 100 μM 글루타메이트 처리 후 형광 강도(F)의 변화로 계산되었다.

도 6c의 C 및 6d의 D의 왼쪽 이미지에서 볼 수 있듯이, 세포는 분화 7일째와 분화 14일째에 외부 자극 없이도 자발적인 칼슘 유입을 나타내었다. 하지만, ATP에 노출되면 세포 내 칼슘 수치는 거의 모든 세포에서 즉시 상승했으며, 시료 세포의 분화 기간과 상관없이 50초 이상 지속되었다(도 6c의 C 및 6e의 E). 형광비 F/F0로 표현되는 칼슘 유입 현상의 진폭은 분화 7일째에 대부분의 세포에서 3 미만이었으나(전체 세포 중 84.3%, n=70); 분화 14일째에 테스트된 모든 세포(n=80)에서 3 이상으로 증가하였다(도 6e의 E 및 6g의 G). 이 결과는 세포가 시간이 경과함에 따라 성숙하면서 ATP에 대한 반응성이 증가했음을 나타낸다. 그 후, 글루타메이트에 대한 세포의 반응성을 동일한 방법으로 테스트하였다.

글루타메이트에 노출되었을 때, 분화 7일째에 대부분의 세포는 100초 미만의 비동기 진동(asynchronous oscillations)으로 세포 내 칼슘 농도의 즉각적인 상승을 보였으며, 평균 진폭은 4.92±0.32(n=19)이였다(도 6f의 F). 이에 비해 분화 14일째에 신경교세포에서는 글루타메이트 자극은 훨씬 더 큰 진폭(9.63±1.07, n=26)을 갖는 단일(대부분의 경우) 또는 이중 세포 내 칼슘 피크를 생성하였고(도 6f의 F), 검사한 전체 세포의 약 1/3(32.4%)은 10보다 큰 진폭을 나타냈다(도 6h의 H). 글루타메이트 자극에 대한 이러한 "전부 또는 없음(all-or-none)"-유사 반응은 놀랍게도 기존에 인간 성인 신경교세포에서만 보고되었으며, 임신 중반 이전의 인간 태아 신경교세포에서는 보고되지 않았다(참고문헌 3). 또한 이는 이전 그 어떠한 hPSC 유래 신경교세포 분화 문헌에서 분화된 다수의 세포가 보유하고 있다고 보고되지 않은 결과이며, NFIB에 의해 유도된 신경교세포가 성인의 신경교세포 수준의 성숙도에 도달할 수 있다는 놀라운 사실을 보여준다. 결과적으로 우리의 결과는 NFIB에 의해 유도된 신경교세포가 일주일만에 칼슘 반응성과 같은 생리적 기능을 이미 획득하였으며, 이러한 기능적 속성은 일주일 간의 추가 분화에 의해 더욱 성숙됨을 뚜렷하게 보여주었다.

2) 글루타메이트 흡수 분석

글루타메이트와 같은 흥분성 신경전달물질의 흡수는 신경계에서 신경교세포의 또 다른 중요한 기능이다. 과도한 글루타메이트 농도는 신경조직에 흥분 독성 손상을 일으켜 신경퇴화를 유발할 수 있기 때문이다. 유전자 발현 조사 과정에서 신경전달물질 재활용 단백질인 GLUL의 점진적인 상향 조절이 있었기 때문에(도 5c의 C, 별표가 있는 붉은 상자로 표시함), NFIB 유도 신경교세포가 글루타메이트를 흡수하는 능력이 분화 전반에 걸쳐 향상되었는지 평가되었다. 7일째와 14일째 신경교세포를 100 μM의 글루타메이트에 노출시키고 배지에 남아있는 글루타메이트의 농도를 3시간 후 측정하였다. 그 결과, 7일째 신경교세포가 12.34±1.17%의 흡수량을 보이는 데 비해, 14일째 세포는 거의 두 배(21.39±2.19%)에 가까운 글루타메이트 흡수량을 보였다(p=0.007, n=5)(도 7a의 A). 이러한 증가된 흡수는 SCL1A3(GLAST라고도 알려진 흥분성 아미노산 수송체 1을 암호화하는 유전자) 및 ARL6IP5(글루타메이트 수송체 EEAC1-상호작용 단백질을 암호화하는 유전자)를 포함하여 신경전달물질 흡수와 관련된 다양한 유전자(GO: 0001504)의 점진적인 증가와 좋은 연관관계를 보인다. 따라서, 본 결과는 NFIB에 의해 유도된 신경교세포가 분화가 진행됨에 따라 글루타메이트를 흡수하는 능력이 점진적으로 성숙화되고 있음을 강력하게 보여준다.

3) 시냅토좀 탐식능 분석

포유류 뇌에서 신경교세포는 시냅스의 형성, 성숙 및 제거를 직접 제어한다. 특히 발달 중에 신경교세포는 중복된 시냅스 연결을 식작용을 통해 제거한다. 신경교세포의 이러한 속성은 신경회로의 성숙에 필수적이며, 신경정신질환의 발병과 밀접한 관련이 있다. NFIB 유도 신경교세포의 시냅스 제거 능력 여부를 평가하기 위해 시냅토좀(synaptosome) 탐식능 분석을 수행하였다. 이를 위해, 제조사의 지침에 따라 Syn-PER® Synaptic Protein 추출 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 출생 1일에 마우스 해마 조직으로부터 시냅토좀을 분리하였다. 분리된 시냅토좀은 pHrodo-Red (pHrodo^®-Red Microscale Labeling Kit, Thermo Fisher Scientific)와 결합된 후 NFIB에 의해 분화가 유도된 7일 및 14일째 신경교세포에 0.35 ㎕의 농도로 24시간동안 노출되었다. 다음 날, 6-웰 플레이트의 무작위 영역에서 웰당 적어도 5개의 이미지를 캡처하고, 세포 수로 정규화된 시냅토좀(형광 신호)의 면적을 측정하여 흡수(engulfment) 정도를 계산하였다. 이때, pHrodo-Red에 존재하는 pH 민감성 형광 덱스트란은 식포(phagosome)에서와 같은 산성 환경에 노출되었을 때만 - 즉, 세포 표면에 단순한 결합이 아닌 식작용를 통해 세포 내로 유입되었을 때만 - 적색 형광을 방출한다.

분석 결과, 14일째의 세포가 7일째보다 훨씬 더 많은 시냅토좀을 흡수하고 더 센 적색 형광을 방출하는 것으로 나타났다(각각 임의의 단위에서 1.17±0.21 및 0.83±0.21)(도 7C 및 D). 분화 0일째와 14일째 사이에 GSEA 분석은 식작용과 관련된 유전자(GO:0006909)가 높은 수준으로 발현이 증가됨을 보임으로써 해당 기능이 성숙화되고 있음을 분자적 수준에서 증명해주었다 (도 7e의 E). 흥미롭게도 상향 조절된 유전자 중 일부 유전자는 출생 후 및 성인 뇌에서만 발현되지만, 태아에서는 발현되지 않는 것으로 보고된 바 있다. 여기에는 시냅스 제거에 결정적으로 관여하는 원암 유전자(proto-oncogene), 티로신-단백질 키나아제 MER(MERTK) 및 시냅스 가지치기와 관련된 보체 단백질 C3가 포함된다. 이러한 결과는 NFIB에 의해 유도된 신경교세포가 7일 이내에 시냅토좀에 대한 식작용이 가능하고, 이후 추가 분화를 통해 더 많은 세포가 성숙에 도달하여 증가된 식세포 활성을 획득할 수 있음을 나타낸다.

종합적으로, 이러한 기능적 분석은 NFIB에 의해 유도된 신경교세포가 단기간 내 태아에서 성체 신경교세포로 전사체 프로파일의 전이와 상관관계가 있는 기능적 성숙을 겪는다는 것을 보여준다.

1-6. 인간 신경교세포 발생 연구를 위한 플랫폼으로써의 가능성 확인

이제까지의 데이터들은 NFIB 도입에 의한 신경교세포 분화방법이 생체 내 신경교세포 발생(astrogliogenesis)의 유전자 발현 변화와 기능적 성숙을 잘 모사함을 보여주었다. 특히 1년 여에 걸쳐 일어나는 실제 신경교세포의 분화를 2주로 단축하였고, 더불어 실제 신경교세포 분화 과정과 대단히 유사한 분자적/생리학적 변화를 그대로 모사한다는 점을 고려하면, 본 분화 방법을 신경교세포 발생에 필수적인 분자적 기전을 연구하기 위한 유용한 플랫폼으로써의 활용성을 생각해 볼 수 있다. 이 가능성을 확인해 보기 위해, 우선 분화 과정 중 중요하게 변화하는 유전자군을 다시 한번 검토해 보았다. RNA-seq 데이터를 재평가하고 우도비(likelihood ratio) 테스트(padj<0.05)를 사용한 분화 과정 중 유의한 변화를 보이는 유전자군(Differential expressed gene, DEG)을 일차적으로 선별 및 분류하였다. 이 분석은 샘플에서 어떠한 생물학적 변화 과정을 따라 특정 발현 패턴을 나타내는 유전자 클러스터를 식별하는데 주로 사용된다. 이 분석을 통해 분류된 8개의 그룹 중 3개의 그룹은 대표적인 신경교세포 마커인 GFAP 및 ALDH1L1과 유사한 발현 역학을 보여주었다(도 5a의 A 및 8a의 A). 흥미롭게도, 세 그룹의 GO term 분석을 수행한 결과 단백질 키나아제 신호전달경로 및 MAPK cascade의 조절에 대한 수용체와 관련된 유전자의 유의미한 농축을 보여주었다(도 8b의 B).

과연 신경교세포 분화에서 MAPK 신호전달 기전이 중요한 기여를 하는지 확인하기 위해, MAPK 신호전달경로의 상류 구성 요소인 MEK1/2의 억제제인 U0126를 20 μM의 농도로 다양한 시간대에서 처리해 보았다(도 8C). 본 실험에서 U0126의 20 μM 농도는 유의한 세포사멸을 유도하지 않았으나; 세포 증식은 다소 감소시키는 경향을 보여주었다. 하지만, 도 8d의 D 및 8e의 E에 나타난 바와 같이, 면역형광 염색에 이은 정량적 분석 결과, U0126에 대한 짧은 노출(처리조건 3; 분화 12일에서부터 14일까지 이틀간 처리)이 여전히 상당한 수의 신경교세포를 생성했지만(총 세포의 26.88%), U0126을 긴 시간동안 처리한 조건에서는 (처리조건 1 혹은 2) MAPK 신호전달경로가 억제에 의해 GFAP 양성 세포의 수를 크게 감소시키는 것으로 나타났다. 대조군 세포와 달리, U0126의 영향으로 생성된 GFAP 양성 세포는 일반적으로 적은 수의 짧은 돌기를 가진 작은 세포체를 보였으며, 이러한 형태학적 변화는 U0126 노출시간과 상관관계가 있었다(도 8d의 D). SOX1 양성 세포의 수는 그룹 간에 크게 다르지 않았으며, 이는 대부분의 세포가 미분화되지 않았음을 나타낸다(도 8d의 D 및 8f의 F). 이 데이터는 신경교세포 분화에 활성화된 MAPK 신호전달이 필요함을 시사한다.

[고찰]

본 발명에서, 발명자들은 hPSC-NPC에서 NFIB의 도입을 통한 과발현이 2주만에 기능성 신경교세포를 효율적으로 생성한다는 것을 보여주었다. 비교전사체 분석은 NFIB 유도 신경교세포가 이전에 보고된 인간 태아 유래 신경교세포 및 hPSC-유래 신경교세포와 유사한 유전자 발현 패턴을 나타냄을 보여주었다. NFIB 과발현은 즉시 신경교세포 운명에 편향된 유전자 발현 프로그램을 유발하여 태아 신경교세포의 유전자 발현을 점차 감소시키고 성숙한 성인의 신경교세포 유전자 발현을 증가시켰다. 본 방법에 의해 분화하는 신경교세포 특이적 유전자의 발현 역학은 3D 피질 대뇌 스페로이드에서 590여일에 걸쳐 천천히 분화하는 신경교세포의 것과 거의 유사하였다. 또한, NFIB 과발현에 의한 2주 분화는 칼슘 유입 반응, 글루타메이트 흡수, 및 시냅토좀의 흡수에서 기능적 성숙을 보여주었다. 이러한 결과는 NFIB의 과발현이 신경교세포 발생의 분자 및 세포 프로그램을 모방하는 점진적인 전사체 및 기능적 변화와 함께 빠르고 강력한 신경교세포 분화를 유도함을 보여주었다.

NFIB는 CAATT 요소 결합 전사인자(NFIA, NFIC 및 NIFX 포함)의 패밀리 중 하나이고, 발달 및 줄기세포 분화에 중요한 역할을 한다. 발달 중인 배아에서 NFIB의 발현과 잠재적 기능은 20여년 전에 처음으로 입증되었고, 그 후 모낭에서 뇌와 폐, 근육 및 멜라닌 줄기세포를 포함한 여러 조직의 발달에서 전사 조절자 역할을 한다는 점이 알려져 있다. 중추신경계(CNS)의 발달에서 NFIB의 역할은 유전적 불활성화를 가진 설치류 모델에서 다양한 뇌 결함이 관찰되었기 때문에 크게 주목받았으며; 예를 들어, 상기 뇌 결함으로는 해마의 형태 형성 결함 및 뇌량이형성이 있다. 이 증거는 NFIB가 단순히 특정 영역의 발달에 한정적으로 작용하는 전사 조절자가 아니라, CNS의 다양한 영역의 발달에 관여하는 중요한 조절인자일 수 있음을 시사하였다. 나중에, NFIA 및 NFIB의 발현은 GLAST를 유도하는 척수 영역(즉, 뇌실영역)에서 검출되었으며, 닭과 마우스 척추 모두에서 신경교세포 형성의 시작을 직접적으로 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 이들 선행 연구는 신경교세포 발생에서 NFIB의 역할보다 NFIA의 역할에 더 중점을 두었으나, 결과는 두 요인이 신경교세포 발생에 동일한 정도로 기여할 것이라는 점도 지적하고 있다. 하지만 최근 참고문헌 13에 따르면, 두 유전자가 유사한 생물학적 기능을 공유하고 중복되지 않으나 부가적, 혹은 상보적으로 작용하여 유사한 유전자 세트를 표적으로 삼는 것으로 나타났다. 결론적으로 아직 두 유전자에 대한 정확한 기능적 차이에 대한 근거는 명확히 제시되지 않았다.

본 발명에서 제시하는 신경교세포 분화 방법은 다음과 같은 이유로 인해 비특허문헌 2와 같은 종래 방법에 비해 유리하다. 첫째, 본 발명은 미분화 hPSC가 아닌 hPSC-NPC을 시작세포로 사용하였다. 신경교세포 마커에 대해 양성인 세포의 수 만을 고려하여 동일 분화 기간(2주) 후의 분화 효율을 비교해 보면, hPSC를 시작세포로 사용한 방법과 hPSC-NPC를 시작세포로 사용한 본 방법에서 비슷한 결과를 보여준다. 그러나, 2주령의 신경교세포가 글루타메이트를 흡수하는 능력(NFIB로 유도된 신경교세포 사이에서만 비교했을 때)은 비특허문헌 2의 결과(약 12-13%)보다 현재 발명의 결과(약 21%)에서 훨씬 크게 나타났다(도 7a의 A). 이 수치는 본 발명을 통해 7일간 분화한 신경전구세포와 비슷한 수준이다. 본 분석이 열량분석(calorimetric assay) 키트의 공급업체를 제외하고는 이전 문헌과 동일한 방법을 따랐기 때문에, 글루타메이트 흡수 능력을 측정하는 기술적 요인의 차이에 의한 가능성은 배제할 수 있다. 더욱이, 본 방법에 의해 분화된 2주차 신경교세포는 이전에 한번도 제시된 적 없는 글루타메이트에 대한 "All-or-None" 반응을 보여주고 있다. 이러한 세포 성숙도의 차이는 아마도 시작세포의 발달 단계의 차이에 의해 나타났을 가능성이 높다. 즉, 발달 단계가 조금 더 진전된 hPSC-NPC에서 NFIB의 발현이 hPSC에서보다 좀 더 빠르고 성숙한 신경교세포의 더 빠른 생성을 유발하는 것으로 보는 것이 합리적 추론일 것이다.

둘째, 그럼에도 불구하고 단순히 발달 단계가 진전된 hPSC-NPC를 사용하는 것이 분화 과정을 단축시킨 요인이 아니며, 이는 기존의 지식으로 쉽게 예상 가능한 사실은 아님은 다음의 근거들로 증명될 수 있다. hPSC-LTNSC에 NFIA 과발현을 사용한 이전 전략(비특허문헌 3)과 본 발명의 결과를 비교해 보면 본 발명에서 제시한 방법에서 여전히 신경교세포가 더 빠르게 유도되는 것으로 나타났다. 비특허문헌 3에서 GFAP 양성 세포의 60% 이상을 얻기 위해서는 hPSC-LTNSC에 NFIA를 과발현시킨 후 약 8주 가량이 소요되었으나, 본 발명에서는 2주만에 달성되었다. 2주 대 8주의 분화 시간의 차이에도 불구하고 분화된 두 그룹의 신경교세포 전사체는 밀접하게 클러스터링 되어있고, 더욱이 본 분화 방법에 의해 분화된 신경교세포의 전사체가 오히려 인간 성인 뇌 조직에서 1차 배양한 신경교세포와 좀 더 가깝게 클러스터링이 되어 있다 (도 4d의 G). 따라서 단순히 hPSC보다 발달이 진전된 hPSC-NPC를 사용한 것 전략이 분화시간을 단축시킨 단순한 이유가 아님은 명확히 증명된다.

비특허문헌 3의 연구에서 hPSC-LTNSC를 사용하였음에도 분화 기간이 본 발명에서 제시한 것보다 긴 연유로 다음의 내용을 추정해 볼 수 있다. 우선 NFIA의 신경교세포 분화 능력이 NFIB에 비해 낮을 수 있다. 하지만 이것 보다 더 중요한 사실은, 비특허문헌 3에서 사용된 hPSC-LTNSC는 장기 배양을 위해 특정 조건에서 배양된 세포로, 장기 인간 다능성줄기세포 유래 신경줄기세포(long-term human embryonic stem cell-derived neural stem cells; LT-hESNSCs 혹은 LTNSCs)라고 불리우며, 특히 신경교세포 또는 희소돌기아교세포보다 신경세포에 대한 분화 성향이 훨씬 더 강한 것으로 보고되었다(참고문헌 14). LTNSC의 이러한 "신경세포 선호(neurogenic)" 경향은 NFIA에 의한 신경교세포로의 분화 진행을 방해할 수 있다. 결과적으로, 비특허문헌 3은 현재 연구보다 높은 비율의 GFAP 양성 세포를 달성하는데 더 많은 시간을 필요로 했을 것이다.

마지막으로, 2개 이상의 전사인자(SOX9/NFIA)를 조합한 방법을 제시한 이전 문헌연구(비특허문헌 2)와 비교하여, 본 방법은 신경교세포를 유도하기 위해 단일인자 NFIB만의 과발현이 필요했다. 렌티바이러스는 효율적이고 널리 사용되는 유전자 전달 시스템이지만 숙주 게놈으로의 무작위 통합이 문제가 되었다. 특히 렌티바이러스 도입 세포가 유전질환 또는 재생 의학 모델링에 사용될 때 문제가 발생했다. 따라서, 최소 유전자 세트를 사용하는 것이 둘 이상의 사용하는 것보다 실질적으로 더 유익하다. 본 발명은 hPSC와 달리 NPC가 이미 상당한 수준에서 SOX9을 발현한다는 점을 밝혀냈기 때문에 NFIB만으로 신경교세포의 효율적인 유도를 달성할 수 있었다는 사실을 확인하였다. 아울러, NFIB 과발현이 SOX9의 내인성 발현 수준을 더욱 상승 유도한 것도 매우 흥미로운 사실이다. 따라서, 본 발명에서 확인한 NFIB 과발현에 의한 SOX9의 상승 발현은 SOX9와 NFI가 긍정적인 피드백 루프에 참여하여 서로의 표현을 변조할 수 있는 흥미로운 가능성을 제기할 수 있다.

본 발명은 기능성 신경교세포 생성을 위한 빠르고 효율적인 프로토콜을 제공할 뿐만 아니라, 인간 신경교세포 형성의 분자 메커니즘을 조사하기 위한 플랫폼을 제공하는 것이다. 최근 뇌 오가노이드 기술은 hPSC에서 파생된 3D 대뇌 피질 스페로이드가 인간 신경교세포 발생의 분자 및 생리학적 측면을 요약하는 인간 발달 연구를 위한 탁월한 모델 시스템을 제공하였다. 하지만 놀라운 신뢰성에도 불구하고, 긴 과정(1년 이상 소요)과 후속 세포 정제로 인해 적용이 어려웠다. 반대로, 본 발명에 따른 방법은 생체 내에서 발생하는 것과 유사한 분화 동안의 전사적 및 생리학적 변화를 갖는 고농축 신경교세포 집단을 얻기 위해 단 2주가 필요하다. 가장 중요한 것은, 본 발명자들은 이 분화 기술을 이용하여 MAPK 신호전달경로가 신경교세포 운명의 획득에 필요하다는 것을 확인할 수 있었다. 신경교세포 발생의 주요 조절자로서, MAPK 신호전달의 역할은 이미 기존 연구에 의해 보고된 적이 있기 때문에, 아마 이것은 놀라운 일이 아닐 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이 발견은 본 발명의 분화 방법이 신경교세포 발생의 발달 프로그램을 충실히 따를 수 있다는 또 다른 강력한 증거를 제공했기 때문에 여전히 그 중요한 의미가 유효하다. 따라서, 본 발명은 인간 신경교세포 형성의 기전을 연구하기 위한 시험관 내 모델 시스템으로 작용할 수 있다.

결론적으로, hPSC-NPC에서 NFIB의 과발현은 단기간에 높은 수율로 기능성 신경교세포를 생성하여 생체 내 신경교세포 형성의 주요 특징을 보여줄 수 있다. 따라서, 이 시스템은 알렉산더병, Rett 증후군, 및 Fragile X 증후군과 같은 신경교세포의 발달 결함 또는 기능 장애로 인해 발생하는 인간 신경교세포 및 신경학적 장애의 발생을 연구하기 위한 유망한 세포 플랫폼으로 작용할 수 있다. 즉, 환자별 iPSC를 생성하는 기술과 결합된 이러한 차별화된 패러다임은 빠르고 효율적이며, 확장가능하고 난치성 신경질환에 대한 치료법에 유용하게 활용될 수 있다.

[참고문헌]

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8: Rolando C, Erni A, Grison A, Beattie R, Engler A, Gokhale PJ, Milo M, Wegleiter T, Jessberger S, Taylor V. (2016). Multipotency of Adult Hippocampal NSCs In Vivo Is Restricted by　Drosha/NFIB. Cell Stem Cell. 2016 Nov 3;19(5):653-662. doi: 10.1016/j.stem.2016.07.003.

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10: Deneen, B., Ho, R., Lukaszewicz, A., Hochstim, C. J., Gronostajski, R. M., & Anderson, D. J. (2006). The transcription factor NFIA controls the onset of gliogenesis in the developing spinal cord. Neuron, 52(6), 953-968. doi:10.1016/j.neuron.2006.11.019

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13: Bunt, J., Osinski, J. M., Lim, J. W., Vidovic, D., Ye, Y., Zalucki, O., Piper, M. (2017). Combined allelic dosage of Nfia and Nfib regulates cortical development. Brain Neurosci Adv, 1, 2398212817739433. doi:10.1177/2398212817739433

14: Philipp Koch, Thoralf Opitz, Julius A. Steinbeck, Julia Ladewig, and Oliver Brustle. (2009). A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic intergration. Proc Natl Acad Sci. 106(9), 3225-3230

Claims (16)

1. NFIB 단백질; 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, SOX9을 내재적으로 발현하는 신경전구세포로부터 신경교세포의 분화 유도용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 NFIB 단백질을 암호화하는 유전자는 벡터에 의해 신경전구세포에 도입되는 것인 신경전구세포로부터 신경교세포의 분화 유도용 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 및 에피조말(episomal) 벡터로 이루어진 군에서 선택된 벡터인 신경전구세포로부터 신경교세포의 분화 유도용 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 신경전구세포는 전분화능줄기세포부터 유래한 것인 신경전구세포로부터 신경교세포의 분화 유도용 조성물.
5. 삭제
6. 제1항에 있어서,
   상기 신경전구세포에서의 SOX9의 내재적 발현은 NFIB의 도입에 의해 상승조절되는 것인 신경교세포의 분화 유도용 조성물.
7. 제1항에 있어서,
   상기 분화는 3주 이내에 수행되는 것인 신경전구세포로부터 신경교세포의 분화 유도용 조성물.
8. NFIB 단백질; 또는 이를 암호화하는 유전자를 신경전구세포에 도입하는 단계를 포함하는, SOX9을 내재적으로 발현하는 신경전구세포로부터 신경교세포의 분화 유도 방법.
9. 제8항에 있어서,
   NFIB 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 신경전구세포에 도입하기에 앞서, 전분화능줄기세포를 신경전구세포로 분화시키는 단계를 수행하는 것을 포함하는, 신경전구세포로부터 신경교세포의 분화 유도 방법.
10. 제8항에 있어서,
    상기 NFIB 단백질을 암호화하는 유전자는 벡터에 의해 신경전구세포에 도입되는 것인 신경전구세포로부터 신경교세포의 분화 유도 방법.
11. 제10항에 있어서,
    상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 및 에피조말(episomal) 벡터로 이루어진 군에서 선택된 벡터인 신경전구세포로부터 신경교세포의 분화 유도 방법.
12. 제8항에 있어서,
    상기 신경전구세포는 전분화능줄기세포로부터 분화된 것인, 신경전구세포로부터 신경교세포의 분화 유도 방법.
13. 삭제
14. 제8항에 있어서,
    상기 신경전구세포에서의 SOX9의 내재적 발현은 NFIB의 도입에 의해 상승조절되는 것인 신경전구세포로부터 신경교세포의 분화 유도 방법.
15. 제8항에 있어서,
    상기 분화는 3주 이내에 수행되는 것인 신경전구세포로부터 신경교세포의 분화 유도 방법.
16. 제15항에 있어서,
    상기 분화 유도 방법에서, 분화 3주 내에 GFAP 양성 세포가 분화된 세포 전체에 대해 80% 이상인 신경전구세포로부터 신경교세포의 분화 유도 방법.

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