CN115125210B - 从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的培养基与方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的培养基与方法，包括第一诱导培养基：用于第1天对iPSC诱导培养，含Y‑27632，CHIR98014，bFGF和Dorsomorphin；第二诱导培养基：用于第2‑3天对iPSC诱导培养，含CHIR98014，bFGF和Dorsomorphin；第三诱导培养基：用于第4天对iPSC诱导培养，含Y‑27632，SB431542，Dorsomorphin，嘌吗啡胺，bFGF和GDF11；第四诱导培养基：用于第5‑10天对iPSC诱导培养，含SB431542，Dorsomorphin，嘌吗啡胺，bFGF和GDF11。该方法能生成腰骶段神经干细胞。

Description

从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的培养基与方法
技术领域
本发明实施例属于生物医学技术领域，涉及一种从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的培养基与方法。
背景技术
脊髓损伤和脊髓退行性疾病是致残性中枢神经系统疾病，严重影响患者的生活质量。脊髓损伤会损害灰质神经元和白质传导束，使得神经系统传导异常；脊髓退行性变如脊肌萎缩症、肌萎缩侧索硬化症等脊髓前角病变相关疾病，会导致神经元坏死、华勒变性、炎症细胞浸润等。而脊髓损伤修复需要经过轴突和髓鞘再生、神经细胞的挽救过程，其中还提供一个适合损伤细胞再生和修复的微环境。
神经干细胞为脊髓损伤修复提供了一种可能，因为神经干细胞不仅可以分泌免疫调节和神经营养因子，同时也可以产生神经元和神经胶质细胞，直接作为一些受损神经细胞的再生替代品。胎儿来源的神经干细胞已显示在脊髓损伤模型中提供了明显的改善，但是从胚胎中分离神经干细胞的程序效率低下，且在伦理上存在争议，在临床实施上存在很大的局限性。
多能干细胞 (PSC) 代表了一种有前途的干细胞替代来源，主要是因为它们具有很强的自我更新和分化能力，人诱导多能干细胞（iPSC）是从成人体细胞人工诱导的多能干细胞，克服了与使用胚胎干细胞相关的伦理问题。来自 PSC 体外培养的不同类型的神经细胞已在多项研究中进行了脊髓损伤修复测试，并取得了不同程度的成功。尽管不同研究之间的多能干细胞PSC的分化方案可能不同，但一般而言，神经干细胞是通过诱导胚状体(EB) 形成或通过双重SMAD 抑制从PSC 产生的。
不过目前通过iPSC诱导的神经干细胞往往是倾向于前脑的，而由于神经细胞的靶向迁移和分化能力，对于脊髓的修复更倾向于部位特异性脊髓神经干，从而提高脊髓修复潜能。因此，有必要开发一种从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的培养基与方法，使得特异性的生成针对腰骶段的神经干细胞，从而为治疗该部位的脊髓损伤提供了可能性。
发明内容
为了解决所述技术问题，本发明实施例提供了一种从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的培养基与方法，该方法能够特异性的生成针对腰骶段的神经干细胞，从而为治疗不同部位的脊髓损伤提供了可能性。
在本发明实施例的第一方面，提供了一种从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的培养基，包括：
第一诱导培养基：用于第1天对人诱导多能干细胞进行诱导分化培养；含有以下诱导分子：Y-27632，CHIR98014，碱性成纤维生长因子和 Dorsomorphin；
第二诱导培养基：用于第2-3天对人诱导多能干细胞进行诱导分化培养；含有以下诱导分子：CHIR98014，碱性成纤维生长因子和Dorsomorphin；
第三诱导培养基：用于第4天对人诱导多能干细胞进行诱导分化培养；含有以下诱导分子：Y-27632，SB431542，Dorsomorphin，嘌吗啡胺，碱性成纤维生长因子和GDF11；
第四诱导培养基：用于第5-10天对人诱导多能干细胞进行诱导分化培养；含有以下诱导分子：SB431542，Dorsomorphin，嘌吗啡胺，碱性成纤维生长因子和GDF11。
进一步地，所述第一诱导培养基含有以下终浓度的诱导分子：8-12μM Y-27632，2-4μM CHIR98014，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和1-3 μM Dorsomorphin；
所述第二诱导培养基含有以下终浓度的诱导分子：2-4 μM CHIR98014，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和1-3 μM Dorsomorphin；
所述第三诱导培养基含有以下终浓度的诱导分子：8-12μM Y-27632，8-12 μMSB431542，1-3 μM Dorsomorphin，1-3μM 嘌吗啡胺，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和18-22 ng/mL GDF11；
所述第四诱导培养基含有以下终浓度的诱导分子：8-12 μM SB431542，1-3μMDorsomorphin，1-3μM 嘌吗啡胺，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和18-22 ng/mL GDF11。
进一步地，所述第一诱导培养基：在基础培养基中添加终浓度8-12μM Y-27632，2-4μM CHIR98014，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和1-3 μM Dorsomorphin；
所述第二诱导培养基：在基础培养基中添加终浓度2-4 μM CHIR98014，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和1-3 μM Dorsomorphin；
所述第三诱导培养基：在基础培养基中添加终浓度8-12μM Y-27632，8-12 μMSB431542，1-3 μM Dorsomorphin，1-3μM 嘌吗啡胺，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和18-22 ng/mL GDF11；
所述第四诱导培养基：在基础培养基中添加终浓度8-12 μM SB431542，1-3μMDorsomorphin，1-3μM 嘌吗啡胺，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和18-22 ng/mL GDF11；
其中，所述基础培养基选自KOSR培养基或N2B27培养基。
进一步地，所述KOSR培养基的配方为：以DMEM/F12培养基作为基础培养基，添加体积百分含量为10%-25%（优选为20%）的KnockOut™血清替代物、0.5%-2%（优选为1%）的MEMNEAA、85-95μM（优选为90μM）2-巯基乙醇、0.5%-2%（优选为1%）的P/S双抗和0.5-2mM（优选为1mM）GlutaMAX添加剂。
进一步地，所述N2B27培养基的配方为：以体积比为（1-3）：（1-3）的DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基作为基础培养基，且添加体积百分含量为0.3％-0.7%（优选为0.5%）的N-2添加剂、体积百分含量为0.5%-2％（优选为1%）的B27添加剂、体积百分含量为0.5%-2％（优选为1%）的P/S双抗、体积百分含量为0.5%-2％（优选为1%）的MEM NEAA、终浓度为0.05-0.2mM（优选为1mM）2-巯基乙醇和终浓度为0.5-2mM（优选为1mM） GlutaMAX添加剂。
进一步地，所述培养基还包括：神经干细胞扩增培养基，所述神经干细胞扩增培养基的配方为：以DMEM/F12培养基作为基础培养基，添加体积百分含量为0.4-0.6％的N-2添加剂、体积百分含量为0.05-0.2％的B27添加剂、体积百分含量为0.5-2％的P/S双抗、体积百分含量为0.5-2%的MEM NEAA、终浓度为8-12 ng/mL碱性成纤维生长因子和终浓度为8-12ng/mL表皮生长因子。
更进一步地，所述神经干细胞扩增培养基的配方为：以DMEM/F12培养基作为基础培养基，添加体积百分含量为0.5％的N-2添加剂、体积百分含量为0.1％的B27添加剂、体积百分含量为1％的P/S双抗、体积百分含量为1%的MEM NEAA、终浓度为10ng/mL碱性成纤维生长因子和10ng/mL 表皮生长因子。
在本发明实施例的第二方面，提供了一种从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的成套添加产品，包括：
用于配制第一诱导培养基的诱导分子：Y-27632，CHIR98014，碱性成纤维生长因子和 Dorsomorphin；
用于配制第二诱导培养基的诱导分子：CHIR98014，碱性成纤维生长因子和Dorsomorphin；
用于配制第三诱导培养基的诱导分子：Y-27632，SB431542，Dorsomorphin，嘌吗啡胺，碱性成纤维生长因子和GDF11；
用于配制第四诱导培养基的诱导分子：SB431542，Dorsomorphin，嘌吗啡胺，碱性成纤维生长因子和GDF11。
进一步地，所述用于配制第一诱导培养基的诱导分子中各组分的终浓度为：8-12μM Y-27632，2-4μM CHIR98014，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和1-3 μM Dorsomorphin；
所述用于配制第二诱导培养基的诱导分子中各组分的终浓度为：2-4 μMCHIR98014，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和1-3 μM Dorsomorphin；
所述用于配制第三诱导培养基的诱导分子中各组分的终浓度为：8-12μM Y-27632，8-12 μM SB431542，1-3 μM Dorsomorphin，1-3μM 嘌吗啡胺，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和18-22 ng/mL GDF11；
所述用于配制第四诱导培养基的诱导分子中各组分的终浓度为：8-12 μMSB431542，1-3μM Dorsomorphin，1-3μM 嘌吗啡胺，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和18-22 ng/mLGDF11。
在本发明实施例的第三方面，提供了一种从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的制备方法，所述方法采用所述培养基，所述方法包括：
对人多能干细胞进行诱导分化培养以形成腰骶段脊髓神经干细胞，具体包括：第1天使用第一诱导培养基进行诱导培养；第2-3天使用第二诱导培养基进行诱导培养；第4天使用第三诱导培养基进行诱导培养；第5-10天使用第四诱导培养基进行诱导培养。
进一步地，人多能干细胞优选为融合度为70％-80%的人诱导多能干细胞分散而成的单细胞悬液。
进一步地，所述方法还包括：将所述腰骶段脊髓神经干细胞（即所述第10天诱导培养获得的细胞）采用神经干细胞扩增培养基进行维持培养。所述维持培养的时间可以是第11天，也可以是第11-30天，视需要而定。
进一步地，所述诱导分化培养和所述维持培养均于5%CO2，温度37℃的条件下培养。
在本发明实施例的第四方面，提供了一种采用所述的方法制备得到的腰骶段脊髓神经干细胞。
在本发明实施例的第五方面，提供了所述的培养基或所述的成套添加产品或所述的腰骶段脊髓神经干细胞在制备用于治疗脊髓损伤的产品中的应用。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明实施例提供的一种从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的培养基与方法，能够特异性的生成针对腰骶段的神经干细胞；该针对腰骶段的神经干细胞具有多向分化潜能，可分化为分化为星形胶质细胞、GABA能神经元和谷氨酸能神经元；且可以在体外长期扩增。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明实施例的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为实施例1的明场分化状态；其中，图1A为诱导第一天时10X显微镜下图片，图1B为诱导第五天时40X显微镜下图片，图1C为为诱导第九天时40X显微镜下图片。
图2为实施例1的腰骶段脊髓神经干细胞的神经干标记物验证；其中图2A为HOXC10腰骶段标记物，图2B为NESTIN神经干细胞标记物；图2C为DAPI染色后图片，图2D为Merge 融合图片；标尺为100μm。
图3为实施例1的腰骶段脊髓神经干细胞分化为星形胶质细胞的图片；左图为星形胶质细胞标记物GFAP染色，中图为DAPI核染色，右图为Merge融合图；标尺为20μm。
图4为实施例1的腰骶段脊髓神经干细胞分化为GABA能神经元的图片（TUJ1+GABA）；TUJ1标记的泛神经元由488nm激发，GABA标记的GABA能神经元由594nm激发，DAPI标记细胞核。
图5为实施例1的腰骶段脊髓神经干细胞分化为谷氨酸能神经元的图片（TUJ1+VGLUT1）；TUJ1标记的泛神经元由488nm激发，VGLUT1标记的谷氨酸能神经元由594nm激发，DAPI标记细胞核。
图6为Dorsomorphin对腰骶段脊髓神经干细胞NESTIN的表达影响结果。
图7为bFGF对腰骶段脊髓神经干细胞NESTIN的表达影响结果。
图8为Dorsomorphin对腰骶段脊髓神经干细胞HOXC10的表达影响结果。
图9为bFGF对腰骶段脊髓神经干细胞HOXC10的表达影响结果。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明实施例，本发明实施例的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明实施例，而非限制本发明实施例。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明实施例所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明中的术语解释：
iPSC为人诱导性多能干细胞的简称；
Px是指第x代细胞；iPSc-NSC Px即由iPSc诱导形成的NSC的第x代细胞；
Y-27632购买自Merck，货号为Y0503；
CHIR98014简称Chir，购买自Merck，货号为SML1094；
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），购买自Peprotech，货号为100-18B；
表皮生长因子（EGF）购买自Peprotech，货号为AF-100-15；
Dorsomorphin购买自Merck，货号为P5499；
SB431542简称SB，购买自Merck，货号为S4317；
嘌吗啡胺，英文全称morphamine，购买自Merck，货号SML0868；
GDF11购买自Peprotech，货号为120-11；
MEM NEAA为100×非必需氨基酸，购买自Thermo Fisher Scientific，货号为11140050；
GlutaMAX添加剂购买自Thermo Fisher Scientific，货号为35050061；
P/S双抗（青霉素-链霉素）购买自Thermo Fisher Scientific，货号为15140122；
DMEM/F-12培养基购买自Thermo Fisher Scientific，货号为11330032；
Neurobasal培养基购买自Thermo Fisher Scientific，货号为21103049；
KnockOut™血清替代物购买自Thermo Fisher Scientific，货号为10828028；
2-巯基乙醇购买自Thermo Fisher Scientific，货号为21985023；
N-2添加剂购买自Thermo Fisher Scientific，货号为17502048；
B-27添加剂 (50×)（去除维生素 A）；购买自Thermo Fisher Scientific，货号为12587010。
需要说明的是，本发明的“第一”、“第二”等词不代表严格的使用顺序，为了名词的区分使用。
本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
根据本发明实施例的一种典型实施方式，提供了一种从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的培养基，包括：
第一诱导培养基：用于第1天对人诱导多能干细胞进行诱导分化培养；含有以下诱导分子：Y-27632，CHIR98014，碱性成纤维生长因子和 Dorsomorphin；
第二诱导培养基：用于第2-3天对人诱导多能干细胞进行诱导分化培养；含有以下诱导分子：CHIR98014，碱性成纤维生长因子和Dorsomorphin；
第三诱导培养基：用于第4天对人诱导多能干细胞进行诱导分化培养；含有以下诱导分子：Y-27632，SB431542，Dorsomorphin，嘌吗啡胺，碱性成纤维生长因子和GDF11；
第四诱导培养基：用于第5-10天对人诱导多能干细胞进行诱导分化培养；含有以下诱导分子：SB431542，Dorsomorphin，嘌吗啡胺，碱性成纤维生长因子和GDF11。
作为更为优选的实施方式，
所述第一诱导培养基：在基础培养基中添加以下终浓度的诱导分子：8-12μM Y-27632，2-4μM CHIR98014，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和1-3 μM Dorsomorphin；
所述第二诱导培养基：在基础培养基中添加以下终浓度的诱导分子：2-4 μMCHIR98014，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和1-3 μM Dorsomorphin；
所述第三诱导培养基：在基础培养基中添加以下终浓度的诱导分子：8-12μM Y-27632，8-12 μM SB431542，1-3 μM Dorsomorphin ，1-3μM 嘌吗啡胺，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和18-22 ng/mL GDF11；
所述第四诱导培养基：在基础培养基中添加以下终浓度的诱导分子：8-12 μMSB431542，1-3μM Dorsomorphin，1-3μM 嘌吗啡胺，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和18-22 ng/mL GDF11 ；
其中，所述基础培养基选自KOSR培养基或N2B27培养基。
上述技术方案中，
所述KOSR培养基的配方为：以DMEM/F12培养基作为基础培养基，添加体积百分含量为10%-25%（优选为20%）的KnockOut™血清替代物、0.5%-2%（优选为1%）的MEM NEAA、85-95μM（优选为90μM） 2-巯基乙醇、0.5%-2%（优选为1%）的P/S双抗和0.5-2mM（优选为1mM）GlutaMAX添加剂。
所述N2B27培养基的配方为：以体积比为（1-3）：（1-3）的DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基作为基础培养基，且添加体积百分含量为0.3％-0.7%（优选为0.5%）的N-2添加剂、0.5%-2％（优选为1%）的B27添加剂、0.5%-2％（优选为1%）的P/S双抗、0.5%-2％（优选为1%）的MEM NEAA、0.05-0.2mM（优选为1mM）2-巯基乙醇和0.5-2mM（优选为1mM）GlutaMAX添加剂。
作为一种具体的实施方式，所述N2B27培养基为向由DMEM/F-12培养基和Neurobasal培养基等体积混合后的培养基中加入GlutaMAX添加剂、2-巯基乙醇、N-2添加剂、B27、P/S双抗（青霉素-链霉素）和非必需氨基酸后得到的培养基。在所述N2B27培养基中，GlutaMAX添加剂终浓度为1mM；2-巯基乙醇终浓度为0.1mM；N-2添加剂的体积百分含量为0.5%；B27的体积百分含量为1%；所述P/S双抗的体积百分含量为1%（100 单位/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）。所述非必需氨基酸为100×非必需氨基酸；在所述N2B27培养基中，所述100×非必需氨基酸的体积百分含量为1%。
作为一种具体的实施方式，所述KOSR培养基为向DMEM/F-12加入KnockOut™血清替代物（KnockOut Serum Replacement (KOSR)）、非必需氨基酸、2-巯基乙醇、GlutaMAX添加剂中和P/S双抗（青霉素-链霉素）后得到的。在所述KOSR培养基中，所述KnockOut™血清替代物的体积百分含量为20%。所述非必需氨基酸为100×非必需氨基酸；在所述KOSR培养基中，所述100×非必需氨基酸的体积百分含量为1%。在所述KOSR培养基中，2-巯基乙醇的终浓度为90μM。在所述KOSR培养基中，GlutaMAX添加剂的体积百分含量为1%。在所述KOSR培养基中，所述P/S双抗的体积百分含量为1%（100 单位/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）。
作为最为优选的实施方式，
所述第一诱导培养基：以KOSR培养基为基础培养基，添加终浓度10μM Y-27632，3μM CHIR98014，20ng/mL碱性成纤维生长因子和2μM Dorsomorphin；
所述第二诱导培养基：以KOSR培养基为基础培养基，添加终浓度3μM CHIR98014，20ng/mL碱性成纤维生长因子和2μM Dorsomorphin；
所述第三诱导培养基：以N2B27培养基为基础培养基，添加终浓度10μM Y-27632，10μM SB431542 ，2μM Dorsomorphin，2μM 嘌吗啡胺，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和20ng/mL GDF11；
所述第四诱导培养基：以N2B27培养基为基础培养基，添加终浓度10μM SB431542，2μM Dorsomorphin，2μM 嘌吗啡胺，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和20ng/mL GDF11 。
上述最为优选的实施方式下，能最好的诱导获得腰骶段脊髓神经干细胞，诱导率高达97.25%。
本发明上述技术方案获得的腰骶段脊髓神经干细胞可直接应用，若后续再使用可采用神经干细胞扩增培养基维持培养。因此在另一种典型实施方式中，从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的培养基还包括：用于扩增维持培养的神经干细胞扩增培养基，所述神经干细胞扩增培养基的配方为：以DMEM/F12培养基作为基础培养基，添加体积百分含量为0.4-0.6％的N-2添加剂、体积百分含量为0.05-0.2％的B27添加剂、体积百分含量为0.5-2％的P/S双抗、体积百分含量为0.5-2%的MEM NEAA、终浓度为8-12 ng/mL碱性成纤维生长因子和终浓度为8-12 ng/mL表皮生长因子。
作为最为优选的实施方式，所述神经干细胞扩增培养基的配方为：以DMEM/F12培养基作为基础培养基，添加体积百分含量为0.5％的N-2添加剂、0.1％的B27添加剂、1％的P/S双抗、1%的MEM NEAA 、10ng/mL碱性成纤维生长因子和10ng/mL 表皮生长因子。
根据本发明另一种典型的实施方式，提供了一种从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的成套添加产品，包括：
用于配制第一诱导培养基的诱导分子：Y-27632，CHIR98014，碱性成纤维生长因子和 Dorsomorphin；
用于配制第二诱导培养基的诱导分子：CHIR98014，碱性成纤维生长因子和Dorsomorphin；
用于配制第三诱导培养基的诱导分子：Y-27632，SB431542，Dorsomorphin ，嘌吗啡胺，碱性成纤维生长因子和GDF11；
用于配制第四诱导培养基的诱导分子：SB431542，Dorsomorphin，嘌吗啡胺，碱性成纤维生长因子和GDF11。
作为一种优选的实施方式，所述用于配制第一诱导培养基的诱导分子中各组分的终浓度为：8-12μM Y-27632，2-4μM CHIR98014，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和1-3 μMDorsomorphin；
所述用于配制第二诱导培养基的诱导分子中各组分的终浓度为：2-4 μMCHIR98014，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和1-3 μM Dorsomorphin；
所述用于配制第三诱导培养基的诱导分子中各组分的终浓度为：8-12μM Y-27632，8-12 μM SB431542，1-3 μM Dorsomorphin ，1-3μM 嘌吗啡胺，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和18-22 ng/mL GDF11；
所述用于配制第四诱导培养基的诱导分子中各组分的终浓度为：8-12 μMSB431542 ，1-3μM Dorsomorphin，1-3μM 嘌吗啡胺，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和18-22 ng/mL GDF11。
根据本发明另一种典型的实施方式，提供了一种从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的制备方法，所述方法包括：
步骤S1、获得融合度为70％-80％的人诱导多功能干细胞消化分散而成的单细胞悬液；
步骤S2、对所述人诱导多功能干细胞消化分散而成的单细胞悬液进行诱导分化培养以形成腰骶段脊髓神经干细胞，具体包括：第1天使用第一诱导培养基进行诱导培养；第2-3天使用第二诱导培养基进行诱导培养；第4天使用第三诱导培养基进行诱导培养；第5-10天使用第四诱导培养基进行诱导培养。
根据本发明实施例的另一种典型实施方式，提供了所述的培养基或所述的成套添加产品或所述的腰骶段脊髓神经干细胞在制备用于治疗脊髓损伤的产品中的应用。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的效果进行详细说明。本发明以下实施例的N2B27培养基为向由DMEM/F-12培养基和Neurobasal培养基等体积混合后的培养基中加入GlutaMAX添加剂、2-巯基乙醇、N-2添加剂、B27、P/S双抗（青霉素-链霉素）和非必需氨基酸后得到的培养基。在所述N2B27培养基中，GlutaMAX添加剂终浓度为1mM；2-巯基乙醇终浓度为0.1mM；N-2添加剂的体积百分含量为0.5%；B27的体积百分含量为1%；所述P/S双抗的体积百分含量为1%（100 单位/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）。所述非必需氨基酸为100×非必需氨基酸；在所述N2B27培养基中，所述100×非必需氨基酸的体积百分含量为1%。
本发明以下实施例的KOSR培养基为向DMEM/F-12加入KnockOut™血清替代物（KnockOut Serum Replacement (KOSR)）、非必需氨基酸、2-巯基乙醇、GlutaMAX添加剂中和P/S双抗（青霉素-链霉素）后得到的。在所述KOSR培养基中，所述KnockOut™血清替代物的体积百分含量为20%。所述非必需氨基酸为100×非必需氨基酸；在所述KOSR培养基中，所述100×非必需氨基酸的体积百分含量为1%。在所述KOSR培养基中，2-巯基乙醇的终浓度为90μM。在所述KOSR培养基中，GlutaMAX添加剂的体积百分含量为1%。在所述KOSR培养基中，所述P/S双抗的体积百分含量为1%（100 单位/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）。
本发明以下实施例的神经干细胞扩增培养基的配方为：以DMEM/F12培养基作为基础培养基，添加体积百分含量为0.5％的N-2添加剂、体积百分含量为0.1％的B27添加剂、体积百分含量为1％的P/S双抗、体积百分含量为1%的MEM NEAA 、终浓度为10ng/mL碱性成纤维生长因子和终浓度为10ng/mL 表皮生长因子。
实施例1、从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的培养基与方法
1、一种从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的培养基，包括第一诱导培养基、第二诱导培养基、第三诱导培养基和第四诱导培养基、以及神经干细胞扩增培养基；
所述第一诱导培养基：以KOSR培养基为基础培养基，添加终浓度10μM Y-27632，3μM CHIR98014，20ng/mL碱性成纤维生长因子和2μM Dorsomorphin；
所述第二诱导培养基：以KOSR培养基为基础培养基，添加终浓度3μM CHIR98014，20ng/mL碱性成纤维生长因子和2μM Dorsomorphin；
所述第三诱导培养基：以N2B27培养基为基础培养基，添加终浓度10μM Y-27632，10μM SB431542 ，2μM Dorsomorphin ，2μM 嘌吗啡胺，20 ng/mL碱性成纤维生长因子和20ng/mL GDF11；
所述第四诱导培养基：以N2B27培养基为基础培养基，添加终浓度10μM SB431542， 2μM Dorsomorphin，2μM 嘌吗啡胺，20 ng/mL碱性成纤维生长因子和20ng/mL GDF11 ；
神经干细胞扩增培养基的配方为：以DMEM/F12培养基作为基础培养基，添加体积百分含量为0.5％的N-2添加剂、0.05％的B27添加剂、0.5％的P/S双抗、0.5%的MEM NEAA、8ng/mL碱性成纤维生长因子和8 ng/mL 表皮生长因子。
2、一种通过iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的方法，所述方法包括：
S1、获得融合度为70％-80％的人诱导多功能干细胞消化分散而成的单细胞悬液；
S2、对所述人诱导多功能干细胞进行诱导分化培养以形成腰骶段脊髓神经干细胞，具体包括：第1天使用第一诱导培养基进行诱导培养；第2-3天使用第二诱导培养基进行诱导培养；第4天使用第三诱导培养基进行诱导培养；第5-10天使用第四诱导培养基进行诱导培养，获得腰骶段脊髓神经干细胞，计为P10代的腰骶段的人脊髓神经干细胞。
S3、将所述腰骶段脊髓神经干细胞采用神经干细胞扩增培养基进行维持培养。
实施例2、从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的培养基与方法
1、一种从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的培养基，包括第一诱导培养基、第二诱导培养基、第三诱导培养基和第四诱导培养基、以及神经干细胞扩增培养基；
所述第一诱导培养基：以KOSR培养基为基础培养基，添加终浓度8μM Y-27632，2μMCHIR98014，18ng/mL碱性成纤维生长因子和1μM Dorsomorphin；
所述第二诱导培养基：以KOSR培养基为基础培养基，添加终浓度2μM CHIR98014，18ng/mL碱性成纤维生长因子和1μM Dorsomorphin；
所述第三诱导培养基：以N2B27培养基为基础培养基，添加终浓度8μM Y-27632，8μM SB431542，1μM Dorsomorphin ，1μM 嘌吗啡胺，18 ng/mL碱性成纤维生长因子和18 ng/mL GDF11；
所述第四诱导培养基：以N2B27培养基为基础培养基，添加终浓度8 μM SB431542，1μM Dorsomorphin，1μM 嘌吗啡胺，18 ng/mL碱性成纤维生长因子和18 ng/mL GDF11 ；
神经干细胞扩增培养基的配方为：以DMEM/F12培养基作为基础培养基，添加体积百分含量为0.4％的N-2添加剂、0.05％的B27添加剂、0.5％的P/S双抗、0.5%的MEM NEAA、8ng/mL碱性成纤维生长因子和8 ng/mL 表皮生长因子。
2、一种通过iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的方法，所述方法包括：
S1、获得融合度为70％-80％的人诱导多功能干细胞消化分散而成的单细胞悬液；
S2、对所述人诱导多功能干细胞进行诱导分化培养以形成腰骶段脊髓神经干细胞，具体包括：第1天使用第一诱导培养基进行诱导培养；第2-3天使用第二诱导培养基进行诱导培养；第4天使用第三诱导培养基进行诱导培养；第5-10天使用第四诱导培养基进行诱导培养。
S3、将所述腰骶段脊髓神经干细胞采用神经干细胞扩增培养基进行维持培养。
实施例3、从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的培养基与方法
1、一种从iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的培养基，包括第一诱导培养基、第二诱导培养基、第三诱导培养基和第四诱导培养基、以及神经干细胞扩增培养基；
所述第一诱导培养基：以KOSR培养基为基础培养基，添加终浓度12μM Y-27632，4μM CHIR98014，22 ng/mL碱性成纤维生长因子和3μM Dorsomorphin；
所述第二诱导培养基：以KOSR培养基为基础培养基，添加终浓度4μM CHIR98014，22 ng/mL碱性成纤维生长因子和3μM Dorsomorphin；
所述第三诱导培养基：以N2B27培养基为基础培养基，添加终浓度12μM Y-27632，12 μM SB431542 ，3μM Dorsomorphin ，3μM 嘌吗啡胺，22 ng/mL碱性成纤维生长因子和22ng/mLGDF11；
所述第四诱导培养基：以N2B27培养基为基础培养基，添加终浓度12 μMSB431542，3μM Dorsomorphin，3μM 嘌吗啡胺，22 ng/mL碱性成纤维生长因子和22 ng/mLGDF11 ；
神经干细胞扩增培养基的配方为：以DMEM/F12培养基作为基础培养基，添加体积百分含量为0.6％的N-2添加剂、0.2％的B27添加剂、2％的P/S双抗、2%的MEM NEAA、12 ng/mL碱性成纤维生长因子和12 ng/mL 表皮生长因子。
2、一种通过iPSC诱导的腰骶段脊髓神经干细胞的方法，所述方法包括：
S1、获得融合度为70％-80％的人诱导多功能干细胞消化分散而成的单细胞悬液；
S2、对所述人诱导多功能干细胞进行诱导分化培养以形成腰骶段脊髓神经干细胞，具体包括：第1天使用第一诱导培养基进行诱导培养；第2-3天使用第二诱导培养基进行诱导培养；第4天使用第三诱导培养基进行诱导培养；第5-10天使用第四诱导培养基进行诱导培养。
S3、将所述腰骶段脊髓神经干细胞采用神经干细胞扩增培养基进行维持培养。
对比例1、第1-3天不添加Dorsomorphin
该对比例中，仅仅所述第一诱导培养基、第二诱导培养基中均不添加Dorsomorphin，其他比如第三诱导培养基、第四诱导培养基以及其他步骤均同实施例1。
对比例2、第4-10天不添加碱性成纤维生长因子
该对比例中，仅仅所述第三诱导培养基和第四诱导培养基中均不添加碱性成纤维生长因子bFGF，其他比如第一诱导培养基、第二诱导培养基以及其他步骤均同实施例2。
实验例1、诱导效果鉴定
一、免疫荧光验证
对实施例1所得的腰骶段脊髓神经干细胞进行免疫荧光验证，操作步骤如下：
取诱导完成后的神经干细胞行免疫荧光染色鉴定：采用4％多聚甲醛室温固定细胞40分钟，用DPBS缓冲液小心清洗两遍；然后用0.1％Triton X-100透化处理5分钟，用DPBS缓冲液清洗两遍；然后用含10％马血清和0.1％Triton X-100的DPBS缓冲液将细胞4℃孵育过夜；然后加入用DPBS缓冲液稀释的抗体，37℃孵育2小时，用DPBS缓冲液清洗三遍后拍照。所用抗体相关信息如表1所示。
表1
Figure 133328DEST_PATH_IMAGE002
在将诱导多能干细胞诱导为腰骶段脊髓神经干细胞的过程中，本发明分别在诱导培养的第1天、第5天和第10天对培养中的细胞进行了显微镜形态鉴定（40X），明场分化状态结果如图1所示。由图1可知：在分化的第10天，能够看到非常明显的玫瑰花环结构，这是神经干细胞典型的聚集形态。
二、对实施例1所得的腰骶段脊髓神经干细胞进行标记物验证
在上述诱导培养的第10天通过荧光染色进行脊髓神经干细胞标记物相关抗体定性以及定量检测；
结果显示：标记物NESTIN（神经干）阳性细胞比例为97.25%，标记物HOXC10（腰骶段脊髓标记物）（参考文献“Milica Bulajić, et al. Differential abilities to engageinaccessible chromatin diversify vertebrate Hox binding patterns.Development. 2020 Nov 15; 147(22): dev194761.”）的阳性细胞比例为96.69%，如图2所示。可见，本发明从诱导多能干细胞诱导的腰骶段脊髓神经干细胞完全达标。
三、本发明诱导所得腰骶段脊髓神经干细胞具有多向分化潜能：可体外分化为星形胶质细胞、GABA能神经元、谷氨酸能神经元
将4×104个上述实施例1诱导和扩增得到的P10代的腰骶段脊髓神经干细胞，将其接种到D型多聚赖氨酸（Gibco，A3890401）PLO/Laminin包被的24孔板中，使用神经元自分化培养基进行自分化培养，培养期间每隔两天换液一次。所述神经元自分化培养基的配方为：以DMEM/F12培养基作为基础培养基，添加体积比为0.5％的N-2添加剂、0.1％的B27添加剂、1％的P/S双抗、1%的MEM NEAA 。所述神经元自分化培养基为在实施例1所述的神经干细胞扩增培养基的基础上去除EGF和bFGF，这两种物质可抑制神经元分化。
细胞培养条件为37℃，5％二氧化碳。持续培养42天，然后进行免疫荧光染色，检测神经元标志物TUJ1、GABA、VGLUT1，及星形胶质细胞GFAP标志物的表达情况。所用抗体信息参见表1。
结果如图3-图5所示，可知：本发明实施例1诱导和扩增得到P10代的腰骶段脊髓神经干细胞具有明确的神经干性，表现为可在除去bFGF和EGF的扩增培养基中，进行成功的自分化为神经元，如图3的星形胶质细胞（GFAP 阳性细胞）、图4的GABA阳性细胞，及图5的VGLUT1阳性的谷氨酸能神经元。
实验例2、是否添加Dorsomorphin或bFGF对结果的影响
针对Dorsomorphin和bFGF的添加时机，我们进行了2项测试，
测试1：第1-3天是否添加Dorsomorphin，具体设置为：实施例1中第1-3天添加了Dorsomorphin，对比例1中第1-3天均不添加Dorsomorphin作为对比，其他步骤实施例1与对比例1相同。
测试2：第4-10天是否添加碱性成纤维生长因子（bFGF），具体设置为：实施例2中第4-10天添加了bFGF，对比例2中第4-10天均不添加bFGF作为对比，其他步骤实施例2与对比例2相同。
评价指标为NESTIN（神经干）和HOXC10（腰骶脊髓）的表达。即采用实验例1的方法测定实施例1和对比例1-2中NESTIN、HOXC10标记物含量，结果如表2和图6-图9所示。
表2
Figure 593345DEST_PATH_IMAGE004
由表2可知，添加Dorsomorphin有利于神经干细胞NESTIN的表达，有利于腰段标记物HOXC10的表达。添加bFGF有利于HOXC10的表达，对于NESTIN表达无显著差异。
结果如图6-9所示，可知：Dorsomorphin添加后，对最终NESTIN（神经干）和HOXC10（腰骶脊髓）的表达均有显著性差异（P<0.01）。说明添加Dorsomorphin有利于神经干细胞NESTIN的表达，有利于腰段标记物HOXC10的表达。第四天到第十天添加bFGF有利于HOXC10的表达，对于NESTIN表达无显著差异。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明实施例的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明实施例及其等同技术的范围之内，则本发明实施例也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (5)

1.一种将iPSC诱导为腰骶段脊髓神经干细胞的培养基，其特征在于，包括：
第一诱导培养基：用于第1天对人诱导多能干细胞进行诱导分化培养；所述第一诱导培养基：在基础培养基中添加终浓度8-12μM Y-27632，2-4μM CHIR98014，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和1-3 μM Dorsomorphin；
第二诱导培养基：用于第2-3天对人诱导多能干细胞进行诱导分化培养；所述第二诱导培养基：在基础培养基中添加终浓度2-4 μM CHIR98014，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和1-3 μM Dorsomorphin；
第三诱导培养基：用于第4天对人诱导多能干细胞进行诱导分化培养；所述第三诱导培养基：在基础培养基中添加终浓度8-12μM Y-27632，8-12 μM SB431542，1-3 μMDorsomorphin，1-3μM 嘌吗啡胺，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和18-22 ng/mL GDF11；
第四诱导培养基：用于第5-10天对人诱导多能干细胞进行诱导分化培养；所述第四诱导培养基：在基础培养基中添加终浓度8-12 μM SB431542，1-3μM Dorsomorphin，1-3μM 嘌吗啡胺，18-22 ng/mL碱性成纤维生长因子和18-22 ng/mL GDF11；
其中，所述基础培养基选自KOSR培养基或N2B27培养基。
2.根据权利要求1所述的一种将iPSC诱导为腰骶段脊髓神经干细胞的培养基，其特征在于，所述培养基还包括：神经干细胞扩增培养基，所述神经干细胞扩增培养基的配方为：以DMEM/F12培养基作为基础培养基，添加体积比为0.4-0.6％的N-2添加剂、0.05-0.2％的B27添加剂、0.5-2％的P/S双抗、0.5-2%的MEM NEAA、8-12 ng/mL碱性成纤维生长因子和8-12 ng/mL 表皮生长因子。
3.一种将iPSC诱导为腰骶段脊髓神经干细胞的方法，其特征在于，所述方法采用权利要求1或2所述培养基，所述方法包括：
对人诱导多能干细胞进行诱导分化培养以形成腰骶段脊髓神经干细胞，具体包括：第1天使用第一诱导培养基进行诱导培养；第2-3天使用第二诱导培养基进行诱导培养；第4天使用第三诱导培养基进行诱导培养；第5-10天使用第四诱导培养基进行诱导培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将所述腰骶段脊髓神经干细胞采用神经干细胞扩增培养基进行维持培养。
5.权利要求1或2所述的培养基在制备用于治疗脊髓损伤的产品中的应用。
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