CN115612667B - 一种诱导多能干细胞来源的前脑少突胶质细胞的制备方法 - Google Patents

一种诱导多能干细胞来源的前脑少突胶质细胞的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种诱导多能干细胞来源的前脑少突胶质祖细胞和少突胶质细胞的制备方法。所述分化培养基包括基础培养基和添加剂；所述添加剂包括转化生长因子β信号传导抑制剂、骨形态发生蛋白信号传导抑制剂、Wnt信号通路调控因子肝素、成纤维细胞生长因子FGF2、视黄酸、音猬因子信号通路激活剂、三碘甲状腺素、生物素、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1和神经营养素3中的至少一种。本发明通过优化分化培养基的配方，以及Olig2+前脑少突胶质祖细胞和O4/MBP前脑少突胶质细胞的制备方法，可以高效制备高纯度端脑亚型的少突胶质祖细胞和成熟少突胶质细胞。

Description

一种诱导多能干细胞来源的前脑少突胶质细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种诱导多能干细胞来源的前脑少突胶质祖细胞和前脑少突胶质细胞的制备方法。
背景技术
少突胶质细胞，作为脊椎动物的中枢神经系统细胞，形成层状髓鞘以覆盖神经元轴突，从而产生局部电绝缘区段以使动作电位在神经元之间的传导速度最大化。更重要的是，少突胶质细胞产生的髓磷脂对于神经元轴突的完整性和存活也至关重要。目前研究已证明少突胶质细胞异常导致的脱髓鞘或髓鞘功能异常可导致一系列神经系统退化和病变相关的疾病，例如多发性硬化症(MS)、肾上腺脑白质营养不良、白质消融性疾病、佩利措伊斯-梅茨巴赫病和脑白质营养不良，和肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病、精神分裂症。针对这些疾病。如此关键的形成髓鞘的少突胶质细胞在中枢神经系统发育过程中主要由少突胶质祖细胞(oligodendrocyte progenitor cells,OPCs)分化而来。而且OPCs还广泛分布于大脑不同结构中，是成人大脑中的主要增殖细胞。因此作为细胞补充疗法的来源，OPCs已被证明可以在其移植的动物体内产生新髓鞘，从而挽救少突胶质细胞缺失和功能紊乱的各种疾病表型。更为关键的是从人诱导多潜能干细胞(hiPSC)分化制备人少突胶质祖细胞(hOPC)的方法为解决OPC来源，进一步开发扩大细胞疗法提供了解决方案。
2006年日本科学家山中伸弥在世界著名学术期刊《细胞》上率先发表了关于成功制备诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，简称iPS细胞)的技术方法，并在2012年凭借此技术获得了诺贝尔生理医学奖。具体来说，iPSC技术利用特定的转录因子，可以将终末分化的体细胞(如外周血细胞、尿液细胞、皮肤细胞等)逆转为具有全能性的干细胞，即诱导性多能干细胞，这一逆转的过程即为细胞的重编程(Cell reprogramming)。由于iPS细胞具有与胚胎干细胞类似的全能性，可以分化为人体多种组织和器官细胞，如神经元、胶质细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛细胞、免疫细胞等，实现了对这些难以获取、难以扩增的细胞的大量制备，为相关疾病的机理机制研究提供了全新平台。自从2007年山中伸弥及其团队建立了第一个人的诱导多能干细胞系(hiPSC)以来，科学家们已开发了分化制备多种功能细胞的方法。但是由于神经系统发育过程复杂，各种神经细胞亚型众多功能各异，目前神经细胞分化方案多面临制备时间繁长，需要基质细胞共培养，终产品细胞纯度不高以及不同细胞亚型功能有差异的问题。现有的iPSC分化制备人少突胶质祖细胞(OPC)的技术主要有两种路径(Wang,2013,Cell Stem Cell和Douvaras,2014,Stem Cell Reports)，制备olig2+O4+的hiOPC，并证明此种OPC移植到小鼠脑部能产生新的髓鞘组织。
但是，文献1(Wang,2013,Cell Stem Cell)以及基于此文章的的OPC分化技术(US2020/0048605A1)的主要缺点为：1).iPSC培养阶段使用了滋养层细胞，不利于临床转化生产；2).分化时间长，从iPSCs分化到hiOPCs需要160天，生产效率低下，时间成本高，特别是在临床转化生产中如此长的分化制备时间会极大增加环境控制成本与风险。文献2(Douvaras,2014,Stem Cell Reports)以及一列相关专利(CN 106456672 B；CN 113564122A)的OPC分化计划的主要缺点为：1).在分化起点iPSC阶段就加入Retinoic Acid(RA)加速了iPSC的分化，能使OPC很快成熟，缩短分化制备时间。但是此阶段Retinoic Acid本身会导致神经干细胞的迅速脊髓化(caudalize)，所以最终制备hiOPC是脊髓亚型的OPC，功能和前脑的OPC有差异，用以治疗前脑(包括端脑和间脑，分为四个脑叶，即枕叶、顶叶、颞叶和额叶)的少突胶质细胞异常疾病时作用有限。2).终产品hiOPC纯度较低，不同iPS细胞系制备的OPC纯度从40％-60％。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种分化培养基及诱导多能干细胞来源的少突胶质祖细胞和少突胶质细胞的制备方法。本申请选用特定分化因子组合及其浓度和时间窗口，可以达到高效制备高纯度前脑Foxg1/Olig2阳性少突胶质祖细胞的目标，该Foxg1/Olig2阳性少突胶质祖细胞适用于少突胶质细胞的发育学的研究，新药开发(比如利用神经细胞和胶质细胞共同培养类器官)，以及再生医学，特别是前脑少突胶质细胞异常疾病的细胞补充疗法。在分化过程中，检测前脑少突胶质祖细胞的标记物Foxg1，在分化第9天，检测出Foxg1呈阳性，从而验证采用本发明的分化培养基可以分化出前脑少突胶质祖细胞。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一目的，本发明提供了一种分化培养基，所述分化培养基包括基础培养基和添加剂；
所述基础培养基包括以下基础培养基1、基础培养基2、基础培养基3和基础培养基4中的任意一种：
基础培养基1包括以下组分：DMEM/F12、血清替代物、GlutaMAX、β-巯基乙醇和非必需氨基酸；
基础培养基2包括以下组分：DMEM/F12、N2、非必需氨基酸和GlutaMAX；
基础培养基3包括以下组分：DMEM/F12、N2、B27、非必需氨基酸和GlutaMAX；
基础培养基4包括以下组分：DMEM/F12、N1、B27和GlutaMAX；
所述添加剂包括转化生长因子β信号传导抑制剂、骨形态发生蛋白信号传导抑制剂、Wnt信号通路调控因子肝素、成纤维细胞生长因子FGF2、视黄酸、音猬因子信号通路激活剂、三碘甲状腺素、生物素、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1和神经营养素3中的至少一种。
本申请的发明人经过大量研究及试验发现，在基础培养基中加入上述添加剂形成优选地分化培养基，可以高纯度的制备少突胶质祖细胞。
作为本发明所述分化培养基的优选实施方式，所述添加剂包括1-5μM转化生长因子β信号传导抑制剂、1-5μM骨形态发生蛋白信号传导抑制剂、1-5μg/ml Wnt信号通路调控因子肝素、10-50μg/ml成纤维细胞生长因子FGF2、5-20ng/ml成纤维细胞生长因子FGF2、5-200nM视黄酸、1-5μM音猬因子信号通路激活剂、30-60ng/ml三碘甲状腺素、20-100ng/ml生物素、2-10ng/ml血小板源性生长因子、5-10ng/ml胰岛素样生长因子1和5-10ng/ml神经营养素3中的至少一种。
本申请通过加入特定的添加剂及其浓度，使得制备的少突胶质祖细胞具有较高的纯度(大于80％)，确保诱导多能干细胞向前脑亚型的少突胶质祖细胞分化，而不是向脊髓亚型少突胶质祖细胞分化，并最终分化为成熟的少突胶质细胞(O4/MPB阳性细胞)。
作为本发明所述分化培养基的优选实施方式，所述分化培养基包括分化培养基1-6中的至少一种：
分化培养基1包括以下浓度的组分：基础培养基1、1-5μM转化生长因子β信号传导抑制剂和1-5μM骨形态发生蛋白信号传导抑制剂；
分化培养基2包括以下浓度的组分：基础培养基2、1-5μg/ml Wnt信号通路调控因子肝素和10-50μg/ml成纤维细胞生长因子FGF2；
分化培养基3包括以下浓度的组分：基础培养基2和5-200nM视黄酸；
分化培养基4包括以下浓度的组分：基础培养基3、5-200nM视黄酸和1-5μM音猬因子信号通路激活剂；
分化培养基5包括以下浓度的组分：基础培养基3、1-5μM音猬因子信号通路激活剂和5-20ng/ml成纤维细胞生长因子FGF2；
分化培养基6包括以下浓度的组分：基础培养基4、1-5μM音猬因子信号通路激活剂、30-60ng/ml三碘甲状腺素、20-100ng/ml生物素、2-10ng/ml血小板源性生长因子、5-10ng/m胰岛素样生长因子1和5-10ng/ml神经营养素3。
作为本发明所述分化培养基的优选实施方式，所述分化培养基包括分化培养基1-6中的至少一种：
分化培养基1包括以下浓度的组分：基础培养基1、2μM转化生长因子β信号传导抑制剂和2μM骨形态发生蛋白信号传导抑制剂；
分化培养基2包括以下浓度的组分：基础培养基2、2μg/ml Wnt信号通路调控因子肝素和20μg/ml成纤维细胞生长因子FGF2；
分化培养基3包括以下浓度的组分：基础培养基2和100nM视黄酸；
分化培养基4包括以下浓度的组分：基础培养基3、100nM视黄酸和1μM音猬因子信号通路激活剂；
分化培养基5包括以下浓度的组分：基础培养基3、1μM音猬因子信号通路激活剂和10ng/ml成纤维细胞生长因子FGF2；
分化培养基6包括以下浓度的组分：基础培养基4、1μM音猬因子信号通路激活剂、60ng/ml三碘甲状腺素、100ng/ml生物素、10ng/ml血小板源性生长因子、10ng/ml胰岛素样生长因子1和10ng/ml神经营养素3。
本申请配制的分化培养基1-6在特定的培养段内，可以在50天高效制备高纯度(＞80％)端脑亚型的少突胶质祖细胞(Foxg1+/Olig2+)。
作为本发明所述分化培养基的优选实施方式，所述GlutaMAX为1XGlutaMAX；所述N2为1X N2；所述B27为1X B27。
优选地，所述血清替代物的浓度为20％；非必需氨基酸的浓度为0.1mM；所述β-巯基乙醇的浓度为0.1mM。
第二目的，本发明提供了一种诱导多能干细胞来源的少突胶质祖细胞的制备方法，所述制备方法利用上述分化培养基培养获得前脑少突胶质祖细胞。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，包括以下步骤：
1)胚状体悬浮培养阶段：消化诱导多能干细胞，克隆诱导多能干细胞，培养第0天至第4天，将克隆的诱导多能干细胞转入分化培养基1；培养第5天至第9天，加入分化培养基2培养；培养至第9天时，诱导多能干细胞分化为往前脑少突胶质祖细胞方向发育的神经干细胞；
2)少突胶质祖细胞贴壁分化培养阶段：培养第10天至第13天，将贴壁的神经干细胞在分化培养基3中培养，培养第14天至第22天，将贴壁的神经干细胞在分化培养基4中培养，然后将神经干细胞进行悬浮；
3)少突胶质祖细胞悬浮分化培养阶段：培养第23天至第34天，将悬浮的神经干细胞在分化培养基5中培养，获得细胞聚集物；培养第35天至第50天，将细胞聚集物悬浮在分化培养基6中培养；培养第51天至第60天，最终分化为成熟少突胶质细胞。
本申请通过优化分化培养基的配方和少突胶质祖细胞的制备方法，使得可以高效(50天)制备高纯度(＞80％)端脑亚型的少突胶质祖细胞。本申请的制备方法展示了在无饲养细胞培养的单层诱导多能干细胞可直接和完全的分化为神经外胚层的关键的信号通路。并且，在分化早期(第1天至第9天)，通过不含视黄酸(RA)的分化培养基促进诱导多能干细胞的成熟制备Foxg1阳性的端脑神经干细胞(神经干细胞)；当分化为第9天时，检测前脑干细胞的标记物Foxg1，检测出Foxg1呈阳性，在第9天后通过特定时间段加入特定分化培养基3-6，可以制备出高纯度的oilg2阳性前脑少突胶质祖细胞(＞80％)，而且该方法制备的oilg2阳性前脑少突胶质祖细胞进一步成熟分化为成熟少突胶质细胞的时间也大大缩短，在分化第60天成熟为O4/MBP阳性的成熟少突胶质细胞。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述少突胶质祖细胞呈Foxg1/Olig2阳性。
优选地，诱导多能干细胞来源于外周血。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，第9天，诱导多能干细胞分化为往前脑少突胶质祖细胞方向发育的神经干细胞的阳性率大于90％。
第三目的，本发明提供了上述分化培养基在定向分化前脑少突胶质祖细胞和少突胶质细胞中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本申请提供了一种分化培养基，还提供了一种诱导多能干细胞来源的少突胶质祖细胞和少突胶质细胞的制备方法，通过优化分化培养基的配方和少突胶质祖细胞的制备方法，使得可以高效制备高纯度端脑亚型的少突胶质祖细胞。在分化早期(第1天至第9天)，通过不含视黄酸(RA)的分化培养基促进诱导多能干细胞的成熟制备神经干细胞；在第9天后通过特定时间段加入特定分化培养基3-6，可以制备出高纯度的Olig2阳性少突胶质祖细胞(＞80％)，而且该方法制备的Olig2阳性少突胶质祖细胞进一步成熟分化为成熟少突胶质细胞的时间也大大缩短，在分化第60天成熟为O4/MBP阳性的成熟少突胶质细胞。
附图说明
图1为本申请诱导多能干细胞来源的少突胶质祖细胞的制备方法的流程图；
图2为第9天检往前脑少突胶质祖细胞方向分化的Foxg1阳性神经干细胞的结果图；
图3为第50天检测Olig2阳性细胞少突胶质祖细胞的结果图；
图4为第60天检测O4/MBP阳性的少突胶质细胞的结果图；
图5为采用对比例1的分化培养基和实施例1的分化培养基对Olig2阳性少突胶质前体细胞的阳性率的结果图(-P，对比例1Purmorphamine；+P，实施例1添加最适Purmorphamine)。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中：
基础培养基1的配方：DMEM/F12、20％血清替代物(KOSR)、GlutaMAX(1X)、0.1mMβ-巯基乙醇(β-ME)和0.1mM非必需氨基酸NEAA；
基础培养基2的配方：DMEM/F12、N2(1X)、0.1mM非必需氨基酸NEAA和GlutaMAX(1X)；
基础培养基3的配方：DMEM/F12、N2(1X)、B27(1X)、0.1mM非必需氨基酸NEAA和GlutaMAX(1X)；
基础培养基4包括以下组分：DMEM/F12、N1(1X)、B27(1X)和GlutaMAX(1X)。
在以下实施例中，转化生长因子β(TGFβ)信号传导抑制剂RepSox来源于STEMCELLTechnologies Inc.；骨形态发生蛋白(BMP)信号传导抑制剂Dorsomorphin来源于Bio-Techne Corporation；Wnt信号通路调控因子肝素来源于Sigma Corporation；成纤维细胞生长因子FGF2来源于PeproTech,Inc.；音猬因子信号通路激活剂Purmorphamine来源于Miltenyi Biotec；血小板源性生长因子来源于eproTech,Inc.；胰岛素样生长因子1来源于eproTech,Inc.。
实施例1、一种分化培养基
本实施例的分化培养基包括分化培养基1-6，分化培养基1-6的具体配方如下：
分化培养基1包括以下浓度的组分：基础培养基1、2μM转化生长因子β(TGFβ)信号传导抑制剂RepSox和2μM骨形态发生蛋白(BMP)信号传导抑制剂Dorsomorphin；
分化培养基2包括以下浓度的组分：基础培养基2、2μg/ml Wnt信号通路调控因子肝素和20μg/ml成纤维细胞生长因子FGF2；
分化培养基3包括以下浓度的组分：基础培养基2和100nM视黄酸(RA)；
分化培养基4包括以下浓度的组分：基础培养基3、100nM视黄酸(RA)和1μM音猬因子信号通路激活剂Purmorphamine；
分化培养基5包括以下浓度的组分：基础培养基3、1μM音猬因子信号通路激活剂Purmorphamine和10ng/ml成纤维细胞生长因子FGF2；
分化培养基6包括以下浓度的组分：基础培养基4、1μM音猬因子信号通路激活剂Purmorphamine、60ng/ml三碘甲状腺素(T3)、100ng/ml生物素biotin、10ng/ml血小板源性生长因子(PDGF-AA)、10ng/ml胰岛素样生长因子1(IGF-1)和10ng/ml神经营养素3(NT3)。
实施例2、一种分化培养基
本实施例的分化培养基包括分化培养基1-6，分化培养基1-6的具体配方如下：
分化培养基1包括以下浓度的组分：基础培养基1、1μM转化生长因子β(TGFβ)信号传导抑制剂RepSox和1μM骨形态发生蛋白(BMP)信号传导抑制剂Dorsomorphin；
分化培养基2包括以下浓度的组分：基础培养基2、1μg/ml Wnt信号通路调控因子肝素和10μg/ml成纤维细胞生长因子FGF2；
分化培养基3包括以下浓度的组分：基础培养基2和5nM视黄酸(RA)；
分化培养基4包括以下浓度的组分：基础培养基3、5nM视黄酸(RA)和1μM音猬因子信号通路激活剂Purmorphamine；
分化培养基5包括以下浓度的组分：基础培养基3、1μM音猬因子信号通路激活剂Purmorphamine和5ng/ml成纤维细胞生长因子FGF2；
分化培养基6包括以下浓度的组分：基础培养基4、1μM音猬因子信号通路激活剂Purmorphamine、30ng/ml三碘甲状腺素(T3)、20ng/ml生物素biotin、2ng/ml血小板源性生长因子(PDGF-AA)、5ng/ml胰岛素样生长因子1(IGF-1)和5ng/ml神经营养素3(NT3)。
实施例3、一种分化培养基
本实施例的分化培养基包括分化培养基1-6，分化培养基1-6的具体配方如下：
分化培养基1包括以下浓度的组分：基础培养基1、5μM转化生长因子β(TGFβ)信号传导抑制剂RepSox和5μM骨形态发生蛋白(BMP)信号传导抑制剂Dorsomorphin；
分化培养基2包括以下浓度的组分：基础培养基2、5μg/ml Wnt信号通路调控因子肝素和50μg/ml成纤维细胞生长因子FGF2；
分化培养基3包括以下浓度的组分：基础培养基2和200nM视黄酸(RA)；
分化培养基4包括以下浓度的组分：基础培养基3、200nM视黄酸(RA)和5μM音猬因子信号通路激活剂Purmorphamine；
分化培养基5包括以下浓度的组分：基础培养基3、5μM音猬因子信号通路激活剂Purmorphamine和20ng/ml成纤维细胞生长因子FGF2；
分化培养基6包括以下浓度的组分：基础培养基4、5μM音猬因子信号通路激活剂Purmorphamine、60ng/ml三碘甲状腺素(T3)、100ng/ml生物素biotin、10ng/ml血小板源性生长因子(PDGF-AA)、10ng/ml胰岛素样生长因子1(IGF-1)和10ng/ml神经营养素3(NT3)。
实施例4、一种诱导多能干细胞来源的前脑少突胶质祖细胞的制备方法
一种诱导多能干细胞来源的前脑少突胶质祖细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)诱导多能干细胞(iPSC)培养(具体可参考CN110760476B)：诱导多能干细胞来源于外周血，在使用StemAdhere基底膜基质培养条件下用TeSRTM2或Essential 8等无血清无动物来源细胞培养液培养。iPSC每7天使用ReLeSR进行传代(1：6)。在做少突胶质细胞分化之前确定iPSC克隆具有多能性(镜下观察，iPSC克隆形态均一，有清晰边界，没有明显的分化区域。未分化多能干细胞通常表达SSEA3、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-81、Oct4、NANOG，可通过免疫荧光染色及RT-PCR进行鉴定)，如果iPSC有分化，应当用1毫升移液枪刮掉分化区域。当克隆生长密度达到79％-90％，培养基中培养所述多潜能干细胞集落至汇合，进行少突胶质细胞的分化，其中所述培养的首日是第0天。
然后消化诱导多能干细胞，克隆诱导多能干细胞，具体步骤为：
a.弃掉培养板中旧的Essential 8培养液或者TeSRTM2培养液。
b.每孔加入1毫升胶原酶IV，放于37℃的含5％的CO2培养箱中消化15min，光学显微镜下可观察到细胞克隆变卷曲脱落。
c.将脱落的克隆转移至15毫升的含有10毫升DMEM/F12的离心管中。放置在室温使克隆自然沉降。
d.弃上清，用食指轻弹离心管底部，使细胞团块变的松散，滴加3毫升的分化培养基1(实施例1制备的)培养0至4天重悬细胞团块并将其转移至未经处理的细胞培养板中。
e.将培养板放于37℃的含有5％的CO2培养箱中十字摇晃5至10次使细胞均匀分布生长。
2)胚状体悬浮培养阶段：培养第0天至第4天，将克隆的诱导多能干细胞转入分化培养基1(实施例1制备的)；培养第5天至第9天，去掉旧的培养基，加入分化培养基2(实施例1制备的)培养；其中，培养至第7天时，将悬浮培养EB转移至新的15毫升的离心管中，使细胞自然沉降，去掉旧的培养液，加入分化培养基2重悬细胞后将其接种在用Matrigel包被的培养板中开始贴壁培养。培养至第9天时，进行Foxg1阳性细胞检测，此时，诱导多能干细胞分化为往前脑少突胶质祖细胞方向发育的神经干细胞；
3)少突胶质祖细胞贴壁分化培养阶段：整个培养阶段隔半天换一次分化培养基，同一培养基阶段内，每天去掉一半旧分化培养基，加入等量新鲜分化培养基。更换分化培养基的日子，完全去掉旧的分化培养基，加入下一阶段的分化培养基。
培养第10天至第13天，将贴壁的神经干细胞在分化培养基3(实施例1制备的)中培养，培养第14天至第22天，将贴壁的神经干细胞在分化培养基4(实施例1制备的)中培养；
4)少突胶质祖细胞悬浮分化培养阶段：整个培养阶段隔半天换一次分化培养基，同一培养基阶段内，每天去掉一半旧分化培养基，加入等量新鲜分化培养基。更换分化培养基的日子，完全去掉旧的分化培养基，加入下一阶段的分化培养基。
培养第23天至第34天时，首先，弃掉旧的分化培养基4，用分化培养基5将神经干细胞吹起，并转移到未经处理的6孔板中悬浮培养。然后将悬浮的神经干细胞在分化培养基5(实施例1制备的)中培养，获得细胞聚集物；培养第35天至第50天，将细胞聚集物悬浮在分化培养基6(实施例1制备的)中培养；第50天检测Olig2阳性细胞少突胶质祖细胞，此时得到纯度最高(>80％)的Olig2阳性细胞少突胶质祖细胞；第50天开始出现O4阳性的少突胶质细胞，继续悬浮培养在分化培养基6中，直至细胞分化为O4/MBP阳性的少突胶质细胞(具体流程图如图1所示)，第60天检测O4/MBP阳性的成熟少突胶质细胞。
其中，培养至第9天时，进行Foxg1阳性细胞检测分化为往前脑少突胶质祖细胞方向发育的神经干细胞，结果如图2所示。第50天检测Olig2阳性少突胶质祖细胞，结果如图3所示。第60天检测O4/MBP阳性的成熟少突胶质细胞，结果如图4所示。
当上述制备方法采用上述实施例2-3中的分化培养基时，获得的Olig2阳性少突胶质祖细胞的阳性率与实施例4相似。
对比例1
与实施例1的分化培养基相比，区别在于，分化培养基4-6不含有音猬因子信号通路激活剂Purmorphamine，其余分化培养基的组分及含量与实施例1相同。
对比例2
与实施例1的分化培养基相比，区别在于，音猬因子信号通路激活剂Purmorphamine的浓度为20μM，其余分化培养基的组分及含量与实施例1相同。
对比例3
与实施例1的分化培养基相比，区别在于，分化培养基2添加100nm视黄酸(RA)，其余分化培养基的组分及含量与实施例1相同。
对比例4
与实施例1的分化培养基相比，区别在于，分化培养基2、5不含有成纤维细胞生长因子FGF2，其余分化培养基的组分及含量与实施例1相同。
试验例一、分化培养基对少突胶质祖细胞Olig2阳性率的影响
采用实施例4的制备方法(含有实施例1，实施例2，实施例3的分化培养基)与采用实施例4的制备方法(分别含有对比例1-4的分化培养基)，检测分化至第9天的少突胶质祖细胞中Foxg1的阳性率，以及分化至第50天的Olig2阳性少突胶质祖细胞的阳性率(结果如表1所示)。
结果显示：音猬因子信号通路激活剂Purmorphamine在分化过程中起关键作用，大大提高了制备Olig2阳性少突胶质祖细胞的阳性率(从～40％提高为>90％，表1)。
表1
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (4)

1.一种诱导多能干细胞来源的前脑少突胶质祖细胞和前脑少突胶质细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）胚状体悬浮培养阶段：消化诱导多能干细胞，克隆诱导多能干细胞，培养第0天至第4天，将克隆的诱导多能干细胞转入分化培养基1；培养第5天至第9天，加入分化培养基2培养；培养至第9天时，诱导多能干细胞分化为往前脑少突胶质祖细胞方向发育的神经干细胞；
2）少突胶质祖细胞贴壁分化培养阶段：培养第10天至第13天，将贴壁的神经干细胞在分化培养基3中培养，培养第14天至第22天，将贴壁的神经干细胞在分化培养基4中培养，然后将神经干细胞进行悬浮；
3）少突胶质祖细胞悬浮分化培养阶段：培养第23天至第34天，将悬浮的神经干细胞在分化培养基5中培养，获得细胞聚集物；培养第35天至第50天，将细胞聚集物悬浮在分化培养基6中培养；培养第51天至第60天，最终分化为成熟少突胶质细胞；
分化培养基1为以下浓度的组分：基础培养基1、1-5μM转化生长因子β信号传导抑制剂RepSox和1-5μM 骨形态发生蛋白信号传导抑制剂Dorsomorphin；
分化培养基2为以下浓度的组分：基础培养基2、1-5μg/ml Wnt信号通路调控因子肝素和10-50μg/ml 成纤维细胞生长因子FGF2；
分化培养基3为以下浓度的组分：基础培养基2和5-200nM 视黄酸；
分化培养基4为以下浓度的组分：基础培养基3、5-200nM 视黄酸和1-5μM 音猬因子信号通路激活剂Purmorphamine；
分化培养基5为以下浓度的组分：基础培养基3、1-5μM 音猬因子信号通路激活剂Purmorphamine和5-20ng/ml 成纤维细胞生长因子FGF2；
分化培养基6为以下浓度的组分：基础培养基4、1-5μM 音猬因子信号通路激活剂Purmorphamine、30-60ng/ml 三碘甲状腺素、 20-100ng/ml 生物素、2-10ng/ml 血小板源性生长因子、5-10ng/m 胰岛素样生长因子1和5-10ng/ml神经营养素3；
基础培养基1为以下组分：DMEM/F12、血清替代物、GlutaMAX、β-巯基乙醇和非必需氨基酸；
基础培养基2为以下组分：DMEM/F12、N2、非必需氨基酸和GlutaMAX；
基础培养基3为以下组分：DMEM/F12、N2、B27、非必需氨基酸和GlutaMAX；
基础培养基4为以下组分：DMEM/F12、N1、B27和GlutaMAX；
所述少突胶质祖细胞呈Foxg1/Olig2阳性。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述分化培养基1为以下浓度的组分：基础培养基1、2μM转化生长因子β信号传导抑制剂RepSox和2μM 骨形态发生蛋白信号传导抑制剂Dorsomorphin；
分化培养基2为以下浓度的组分：基础培养基2、2μg/ml Wnt信号通路调控因子肝素和20μg/ml 成纤维细胞生长因子FGF2；
分化培养基3为以下浓度的组分：基础培养基2和100 nM 视黄酸；
分化培养基4为以下浓度的组分：基础培养基3、100 nM 视黄酸和1μM 音猬因子信号通路激活剂Purmorphamine；
分化培养基5为以下浓度的组分：基础培养基3、1μM 音猬因子信号通路激活剂Purmorphamine和10ng/ml 成纤维细胞生长因子FGF2；
分化培养基6为以下浓度的组分：基础培养基4、1μM 音猬因子信号通路激活剂Purmorphamine、60 ng/ml 三碘甲状腺素、 100 ng/ml 生物素、10 ng/ml 血小板源性生长因子、10 ng/ml 胰岛素样生长因子1和10 ng/ml神经营养素3。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述GlutaMAX为1X GlutaMAX；所述N2为1X N2；所述B27为1X B27。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，成熟少突胶质细胞呈O4/MPB阳性。
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