CN116162588A - 人源万能干细胞分化为间充质干细胞的方法和培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了诱导人源万能干细胞分化为间充质干细胞的方法，所述方法包括在诱导分化过程的不同阶段分别利用生长因子DKK1和IGF2来协助万能干细胞向间充质干细胞的分化。本发明还提供了间充质干细胞分化的细胞培养基体系。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞培养方法和细胞培养基领域。具体的，本发明提供了一种诱导人源万能干细胞分化为间充质干细胞的培养方法和细胞培养基。
背景技术
间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层。这类干细胞具有向多种间充质系列细胞(如成骨、成软骨和成脂肪细胞等)方向分化的潜能(Deng etal.,2016)。骨髓间充质干细胞具有强大的增殖能力和多向分化潜能、具有免疫调节功能、不存在免疫排斥的特性和异体移植排异性较轻等特性。
间充质干细胞在疾病治疗等领域发挥越来越大的作用。间充质干细胞的分化主要是从胚胎的中胚层分化而来的一类万能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富。万能干细胞可用于分化得到间充质干细胞。万能干细胞起源的间充质干细胞给骨再生医学提供稳定且具有保障的细胞来源(Deng et al.,2016)。
万能干细胞是能够产生所有的胚胎细胞类型的干细胞。万能干细胞包括胚胎干细胞和诱导万能干细胞。胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)起源于早期哺乳动物胚胎的内细胞团(Martin,1981；Thomson et al.,1998)，其具有自我更新的能力，并且能够分化成为三个胚层的典型细胞类型(Medvedev et al.,2010)。1981年，英国科学家马丁·埃文斯首次建立了小鼠胚胎干细胞系，开启了胚胎干细胞领域的研究工作(Evans andKaufman，1981)。
诱导万能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，也称为诱导多能干细胞或人工万能干细胞，是人工制备的具有胚胎干细胞的干性的细胞。诱导万能干细胞由日本科学家山中伸弥(Shinya Yamanaka)于2006年首次制备成功，是利用病毒载体将四个转录因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞和胚胎APSC多能细胞的一种细胞类型。诱导万能干细胞已广泛在生物技术和医学研究领域得到应用。
多个细胞通路调节剂被广泛用于胚胎干细胞向间充质干细胞的分化。已有报道，TGFb抑制剂SB431542显著促进间充质干细胞的分化效率，并通过feeder-free的方法来分化获得间充质干细胞(Chen et al.,2012)。首先，在人胚胎干细胞或者iPSCs生长到较大密度的时候，将细胞培养液替换为KOSR medium(DMEM/F12、20％knockout serumreplacement,1mM L-glutamine和10mM NEAA)，并添加10μM SB431542，然后细胞被消化为单细胞，并重新种于细胞培养板，用MSC medium培养(DMEM、10％FCS和2mM L-Glutamine)，持续传代多次，便可得到间充质干细胞。
本领域还需要对干细胞分化为间充质干细胞的机理有更多的了解，以及开发新的通过干细胞分化得到间充质干细胞制备方法和培养基。
发明内容
本申请提供了新的诱导人源万能干细胞分化为间充质干细胞的培养方法和培养基系统。本申请人的发明人出乎意料地发现在诱导万能干细胞向间充质干细胞分化的过程中在不同生长阶段加入DKK1和生长因子IGF2能够有效地诱导万能干细胞向间充质干细胞分化，并由此提供了含有DKK1和IGF2两种促进因子的诱导万能干细胞向间充质干细胞分化的培养基系统。
具体的，在本发明的其中一个方面，本发明提供了用于万能干细胞向间充质干细胞分化的培养基系统，其包括以下组分：
(a)培养基组合物A，其包括干细胞培养基、TGFβ抑制剂和DKK1。
其中，DKK1工作浓度优选为约2-100ng/ml，更优选为约10-50ng/ml。以及，其中TGFβ抑制剂例如为SB431542，其工作浓度为约2-50μM，优选为约10μM。
在本发明的其中一个方面，上述培养基系统还包括：
(b)培养基组合物B，其包括细胞培养基、TGFβ抑制剂和IGF2。
其中，IGF2工作浓度优选为约10-200ng/ml，更优选为约40-50ng/ml。以及，其中TGFβ抑制剂例如为SB431542，其工作浓度为约2-50μM，优选为约10μM。
在本发明的其中一个方面，上述培养基系统还包括：
(c)培养基组合物C，其包括细胞培养基。
在本发明的其中一个方面，上述培养基系统包括前述培养基组合物A、培养基组合物B和培养基组合物C。
在本发明的其中一个方面，上述培养基系统中的培养基组合物A、培养基组合物B和培养基组合物C在万能干细胞向间充质干细胞分化的培养过程中按培养基组合物A至培养基组合物B至培养基组合物C的次序使用。在本发明的其中又一个方面，上述培养基系统中的培养基组合物A在培养的前6-9天、培养基组合物B在培养基组合物A培养之后的7-9天和再之后的1-3天，以及培养基组合物C在培养基组合物B培养之后使用。
在本发明中，所述万能干细胞可为人源胚胎干细胞、人工制备的人源胚胎干细胞系(如人胚胎干细胞系H1、H7等)或者诱导万能干细胞(iPSCs)等。
在本发明中，培养基组合物A中的干细胞培养基是指适合干细胞的培养的培养基，包括维持干细胞的增殖能力、发育潜能和干性等。优选的，所述干细胞培养基是用于人胚胎干细胞(ES细胞)或诱导多能干细胞(iPSC细胞)的无饲养层培养基可用于本发明的干细胞培养基可以商购的形式提供和获得，例如Gibco Essential8培养基与StemcellTechnologies的mTesR培养基(包括mTeSR1)
在本发明中，培养基组合物B和C中的细胞培养基可以是各种适合培养细胞生长的基础培养基或营养培养基。基础培养基或营养培养基含有促进增殖的营养物的细胞培养介质，一般含有等渗盐水、缓冲液、蛋白质来源(一种或多种添加的蛋白质或氨基酸的形式)和其它外部添加的营养物和生长因子。可用于本发明的基础培养基或营养培养基可以商购的形式提供和获得，例如包括DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)，KO DMEM(Knockout DMEM)，F12/50％DMEM等。
在本发明其中一个方面，其中培养基组合物A中还包括GSK3抑制剂。所述GSK3抑制剂例如为CHIR99021，其工作浓度为约1-15μM，优选为约3μM。在本发明其中又一个方面，其中培养基组合物A中还包括PI3K抑制剂。所述PI3K抑制剂例如为LY294002，其工作浓度为约5-50μM，优选为约20μM。
在本发明其中一个方面，其中培养基组合物B中还包括L-Glutamine，其工作浓度例如为约0.5-10mM，优选为约2mM。在本发明其中一个方面，其中培养基组合物B中还包括FBS，其工作浓度例如为约5-20％，优选为约10％。
在本发明其中一个方面，其中培养基组合物C中还包括L-Glutamine，其工作浓度例如为约0.5-10mM，优选为约2mM。在本发明其中一个方面，其中培养基组合物C中还包括FBS，其工作浓度例如为约5-20％，优选为约10％。
在本发明其中一个方面，用于诱导万能干细胞向间充质干细胞分化的培养基系统中还包括ROCK抑制剂。所述ROCK抑制剂例如为Y27632，其工作浓度为约2-50μM，优选为约10μM。ROCK抑制剂有助于悬浮在溶液中的细胞的贴壁和生长，用于在将细胞培养过程中将分离得到的单细胞重悬在培养液中。通常ROCK抑制剂只是在悬浮的单细胞加入到新的培养板时的培养液中加入和与细胞一起培养(例如约半天到一天)，在后续换液培养中不需要再加入。
本发明还提供了用于体外诱导胚胎干细胞向间充质干细胞分化的方法。在本发明的其中有一个方面，所述方法采用前述本发明提供的培养基系统。
本发明提供的用于体外诱导胚胎干细胞向间充质干细胞分化的方法包括以下步骤：
步骤(1)：将万能干细胞用培养基组合物A进行培养6-9天，例如培养约6天；其中培养基组合物A包括干细胞培养基(例如为mTeSR1培养基)、TGFβ抑制剂(例如为SB431542，其工作浓度为约2-50μM，优选为约10μM)和DKK1(其工作浓度为约2-100ng/ml，优选为约10-50ng/ml)；
步骤(2)：将步骤(1)培养得到的细胞转用培养基组合物B进行培养7-9天，例如培养约9天；其中培养基组合物B包括细胞培养基(例如DMEM)、TGFβ抑制剂(例如为SB431542，其工作浓度为约2-50μM，优选为约10μM)和IGF2(其工作浓度为约10-200ng/ml，优选为约50ng/ml)；
步骤(3)：将步骤(2)培养得到的细胞解离成单细胞，然后在培养基组合物B中培养约1-3天，例如约2天；
步骤(4)：将步骤(3)培养得到的细胞转用培养基组合物C进行培养，例如培养约2-6天，例如培养约2天；其中培养基组合物C包括细胞培养基(例如DMEM)。
在本发明其中一个方面，其中在所述方法的步骤(1)和步骤(2)之间还包括将步骤(1)培养得到的细胞解离后转移到培养基组合物B的步骤，例如通过消化酶(优选为Dispase)将步骤(1)培养得到的细胞解离；
在本发明其中一个方面，其中在所述方法的步骤(3)中通过消化酶(优选为Accutase)将步骤(3)培养得到的细胞解离成单细胞。
在本发明其中一个方面，其中在所述方法的步骤(1)之前，将胚胎干细胞在干细胞培养基中培养。
在本发明其中一个方面，其中在所述方法的步骤(4)中，在用培养基3培养约1-2天后传代培养。
在本发明其中一个方面，其中在前述方法的步骤(3)中将解离的单细胞转移到培养基组合物B中培养时，加入ROCK抑制剂(例如Y27632，其工作浓度为约2-50μM，优选为约10μM)。ROCK抑制剂只是在悬浮的单细胞加入到新的培养板时的培养液中加入和与细胞一起培养(例如约半天到一天)，在后续换液培养中不需要再加入。
在本发明提供的另一个用于体外诱导胚胎干细胞向间充质干细胞分化的方法中，包括以下步骤：
步骤(1)：将万能干细胞用培养基组合物A进行培养6-9天，例如培养约6天；其中培养基组合物A包括干细胞培养基(例如为mTeSR1培养基)、TGFβ抑制剂(例如为SB431542，其工作浓度为约2-50μM，优选为约10μM)和DKK1(其工作浓度为约2-100ng/ml，优选为约10-50ng/ml)；
步骤(2)：将步骤(1)培养得到的细胞转用培养基组合物B进行培养7-9天，例如培养约9天；其中培养基组合物B包括细胞培养基(例如DMEM)、TGFβ抑制剂(例如为SB431542，其工作浓度为约2-50μM，优选为约10μM)；
步骤(3)：将步骤(2)培养得到的细胞解离成单细胞，然后在培养基组合物B中培养约1-3天，例如约2天；
步骤(4)：将步骤(3)培养得到的细胞转用培养基组合物C进行培养，例如培养约2-6天，例如培养约2天；其中培养基组合物C包括细胞培养基(例如DMEM)。
在本发明提供的另一个用于体外诱导胚胎干细胞向间充质干细胞分化的方法中，包括以下步骤：
步骤(1)：将万能干细胞用培养基组合物A进行培养6-9天，例如培养约6天；其中培养基组合物A包括干细胞培养基(例如为mTeSR1培养基)、TGFβ抑制剂(例如为SB431542，其工作浓度为约2-50μM，优选为约10μM)；
步骤(2)：将步骤(1)培养得到的细胞转用培养基组合物B进行培养7-9天，例如培养约9天；其中培养基组合物B包括细胞培养基(例如DMEM)、TGFβ抑制剂(例如为SB431542，其工作浓度为约2-50μM，优选为约10μM)和IGF2(其工作浓度为约10-200ng/ml，优选为约50ng/ml)；
步骤(3)：将步骤(2)培养得到的细胞解离成单细胞，然后在培养基组合物B中培养约1-3天，例如约2天；
步骤(4)：将步骤(3)培养得到的细胞转用培养基组合物C进行培养，例如培养约2-6天，例如培养约2天；其中培养基组合物C包括细胞培养基(例如DMEM)。
在本发明中，术语干细胞是指在单细胞水平上具有自我更新和分化产生子代细胞的能力的未分化细胞。干细胞的特征在于：其具有在体外由多种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成各种细胞谱系的功能细胞以及移植后产生多种胚层的组织和注入胚泡后基本上有助于所有或大部分组织形成的能力。
在本发明中，术语万能干细胞指能够产生所有的胚胎细胞类型的干细胞。
在本发明中，术语间充质干细胞也被称作多潜能间质细胞，主要是从脂肪或者骨髓中获得，能够分化为中胚层起源的多种细胞，例如骨、脂肪、软骨、肌腱和肌肉等。
DKK1(NP_036374.1),全称Dickkopf-related protein 1(Dickkopf相关蛋白1)，它是由DKK1基因(NM_012242.4)编码的蛋白质。在胚胎发育过程中，DKK1主要是通过抑制Wnt信号通路来调控心脏、大脑和四肢的发育。多发性骨髓瘤患者的骨髓、血浆和外周血中DKK1显著升高，与溶骨性病变有关。目前也有研究将DKK1作为药物和牙科治疗策略的目标。
IGF2(NP_000603.1)，即胰岛素样生长因子2(Insulin-like growth factor 2)。胰岛素样生长因子2由基因IGF2(NM_000612.6)编码，其为最早发现的内源性印迹基因之一。IGF2是一种多功能细胞增殖调控因子，在细胞的分化和增殖中具有重要的促进作用。
附图说明
图1显示iPSC的制备。图1A显示用于制备iPSCs的初始细胞-人新生儿真皮成纤维细胞。比例尺，100μm。图1B显示经过重编程后获得的iPSCs。
图2显示采用本发明的方法的示例性实施方式将iPSCs分化为间充质干细胞的过程和细胞变化。如图所示，iPSCs经历了从胚胎干细胞向间充质干细胞的分化过程，细胞形态发生显著变化，到第19天左右，细胞已经呈现明显的间充质干细胞形态。比例尺，100μm。
图3显示采用本发明的方法的示例性实施方式将iPSCs分化得到的间充质干细胞的鉴定。图3A显示流式细胞术检测分化的间充质干细胞有85.9％的CD73阳性细胞和58.2％的CD90阳性细胞。图3B显示qRT-PCR比较iPSCs与分化的间充质干细胞中CD105、CD146和CD73的表达。
图4显示胚胎干细胞向间充质干细胞分化的培养步骤中分别或同时去除培养基1和培养基2中的生长因子DKK1和IGF2的影响。
图4A显示胚胎干细胞向间充质干细胞分化的培养步骤和加入不同培养基(在不同培养阶段和培养基中分别含有生长因子DKK1、IGF2)的时间。图4B显示间充质干细胞形态。比例尺，100μm。图4C显示流式细胞术检测分化得到的间充质干细胞中CD73阳性细胞的比率。图4D显示流式细胞术检测分化得到的间充质干细胞中CD90阳性细胞的比率。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。
实施例1诱导万能干细胞(iPSCs)的制备
人新生儿真皮成纤维细胞(ATCC，PCS-201-010TM)被用来作为制备iPSCs的初始细胞。培养成纤维细胞的培养基为DMEM(GIBCO，11965-092)。
iPSCs的制备过程主要包括以下步骤：
第0天，将episomal质粒(Addgene，27077、27078、27080和27082)通过NEPA21电转染仪器(Nepa Gene)转染106个成纤维细胞。转染好的细胞种板到基底胶Matrigel(CORNING，354277)包被的4孔板。
第1天，将细胞培养基换成mTeSR1培养基(STEMCELL TECHNOLOGIES，85850)。
然后隔天更换新鲜的mTeSR1培养基，持续到第27-30天左右，出现iPSCs。结果如图1所示。
得到的诱导万能干细胞可直接用于进一步实验或在液氮中冻存。
实施例2 iPSCs的培养
以六孔板的一个孔为例。
1.添加1ml Matrigel(CORNING，354277)包被培养板，室温放置半个小时后，去除Matrigel，用PBS清洗一次。
2.把冻存的实施例1制备得到的人iPSCs从液氮中取出，放于37℃水浴中快速解冻，把含有细胞的冻存液转移至含有2ml mTeSR1培养基(STEMCELL TECHNOLOGIES，85850)的离心管中，300×g,3min离心，去除上清液，添加新的mTeSR1重悬细胞，转移至包被好的六孔板中。
3.当细胞长至70％左右，添加1ml分散酶Dispase(STEMCELL TECHNOLOGIES，07923)消化细胞，在细胞培养箱中放置5分钟。
4.吸走Dispase，用PBS清洗一次，添加1ml mTeSR1，将细胞轻柔地刮下来，以最小幅度用枪头轻轻吹打，以适当密度种于Matrigel包被的培养板上，放于37℃细胞培养箱中培养，每天更换新鲜培养基。
实施例3将iPSCs分化为间充质干细胞
培养步骤主要包括(参看图2的流程示意)：
1.第0天，首先将12孔板用Matrigel包被，将实施例2制备得到的iPSCs种于12孔板里，用1ml mTeSR1(STEMCELL TECHNOLOGIES，85850)培养基培养。
2.第1天，将培养基更换为培养基1，该培养基1为在mTeSR1培养基(STEMCELLTECHNOLOGIES，85850)内加入10μM SB431542(Millipore,616464)、3μM CHIR99021(Sigma，SML 1046-5MG)、20μM LY294002(Cell Signal Technologies，9901S)和10ng/ml生长因子DKK1(R&D System，5439-DK)；每天半量更换新鲜的培养基，在培养基1中培养6天(6-9天均可)。
3.第7天，Matrigel预包被12孔板，室温放置半小时，去除Matrigel，用1×PBS清洗一次。
取出步骤2中培养的细胞，去除Medium1，添加0.5ml分散酶Dispase消化细胞，置于37℃培养箱中，5分钟之后，去除Dispase,1×PBS清洗一次。
4.轻柔地把细胞刮下来，转移至15ml离心管，300×g,3min离心。用培养基2重悬细胞，该培养基为在DMEM(Life Technologies，11885)内加入2mM L-Glutamine(LifeTechnologies,25030081)、10％FBS、10μM SB431542(Millipore,616464)和50ng/ml IGF2(R&D Systems，292-G2-050)；在培养基2中培养9天(7-9天均可)，每天半量更换新鲜培养液，
5.第15天，用Matrigel预包被12孔板，室温放置半小时，去除Matrigel，用1×PBS清洗一次。
去除培养基2，加0.5ml 1×PBS洗细胞一次，添加0.5ml StemproAccutase(LifeTechnologies，A1110501)，放于37℃，5min，将细胞消化为单细胞。
6.将细胞收集于15ml离心管，500×g,5min离心。将细胞种于Matrigel包被的细胞培养板里，用培养基2进行培养，在培养基中添加ROCK抑制剂Y27632(Selleckchem，Y-27632)。培养2天，每天半量更换培养基2(换液不再加入Y27632)。
7.第17天，替换成培养基3，该培养基3为在DMEM(Life Technologies，11885)内加入2mM L-Glutamine(Life Technologies,25030081)和10％FBS。培养2天之后，用培养基3传代培养，得到具有明显间充质干细胞特征的间充质干细胞。
图2显示采用本发明的方法的示例性实施方式将iPSCs分化为间充质干细胞的过程和细胞变化。如图所示，iPSCs经历了从胚胎干细胞向间充质干细胞的分化过程，细胞形态发生显著变化，到第19天左右，细胞已经呈现明显的间充质干细胞形态。比例尺，100μm。
利用间充质干细胞鉴定试剂盒鉴定(BD Stemflow,562245)对步骤7得到的间充质干细胞进行鉴定。结果如图3所示。根据流式细胞术检测，制备得到的分化间充质干细胞有85.9％的CD73阳性细胞和58.2％的CD90阳性细胞。通过qRT-PCR比较iPSCs与分化的间充质干细胞中CD105、CD146和CD73的表达，结果显示分化的间充质干细胞中CD105、CD146和CD73的表达有显著提高。结果证明本发明的方法有效地将iPSCs分化为间充质干细胞。
实施例4DKK1和IGF2的影响验证实验
本实施例中进一步验证本发明提供的将iPSCs分化为间充质干细胞过程中DKK1和IGF2的影响。
按实施例3的相同培养步骤和条件，在其中的培养基1和培养基2中分别尝试去除DKK1、IGF2或同时去除二者，观察对间充质干细胞的产生的影响。
具体实验方案和结果参见图4。
图4A显示胚胎干细胞向间充质干细胞分化的培养步骤和加入不同培养基(在不同培养阶段和培养基中分别含有生长因子DKK1、IGF2)的时间。在本发明提供的方法中，培养基1有生长因子DKK1，培养基2含有生长因子IGF2。
图4B显示分别或同时去除培养基1和培养基2中的生长因子DKK1和IGF2，分化得到的间充质干细胞形态。比例尺，100μm。当同时去除DKK1和IGF2时，在培养第19天得到的细胞中具有间充质干细胞特征的细胞数量和比例较少。
图4C显示分别或同时去除培养基1和培养基2中的生长因子DKK1和IGF2，流式细胞术检测分化得到的间充质干细胞中CD73阳性细胞的比率。
图4D显示分别或同时去除培养基1和培养基2中的生长因子DKK1和IGF2，流式细胞术检测分化得到的间充质干细胞中CD90阳性细胞的比率。
结果显示，在本发明提供的将iPSCs分化为间充质干细胞的方法中，与同时在培养基1和培养基2中分别加入生长因子DKK1和IGF2的方案比较，同时不加入培养基1和培养基2的生长因子DKK1和IGF2的方案将显著降低得到的细胞中的CD73和CD90阳性细胞比率。在培养中，分别只在培养基1和培养基2阶段中加入生长因子DKK1和IGF2，与同时在培养基1和培养基2中分别加入生长因子DKK1和IGF2的方案比较，会显著降低得到的细胞中的CD73阳性细胞的比率。
实验方法：
实时定量PCR(qRT-PCR)分析
用Trizol(Invitrogen)分离总RNA，并使用cDNA逆转录试剂盒(AppliedBiosystems)对500ng RNA进行逆转录，使用ΔΔCt方法分析mRNA表达。Gapdh的表达被用于标准化，并对所有定量PCR反应进行重复。
流式细胞术
去除细胞培养基，添加StemproAccutase消化细胞，洗涤细胞并重悬于染色缓冲液(1 x PBS,1％FCS,0.09％叠氮化钠)中。以5x10^6细胞/ml的浓度分装于7个管中，分别添加对应的抗体，参照人间充质干细胞鉴定试剂盒(BD，562245)。
统计分析
所有数据均以平均值±SEM表示。不同基因型的平均值之间差异的统计学显着性通过成对双尾分布Welch's t-检验测量。当p值小于0.05(*)、0.01(**)或0.001(***)时，数据被认为是显著的。
上面是对本发明进行的说明，不能将其看成是对本发明进行的限制。除非另外指出，本发明的实践将使用有机化学、聚合物化学、生物技术等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。
在本发明中，“约”表示±10％，优选为±5％，更优选为±2％，例如为±1％、±0.5％或±0.1％。
Claims (10)
1.用于诱导万能干细胞(例如为人类胚胎干细胞或者诱导万能干细胞(iPSCs))向间充质干细胞分化的培养基系统，其包括以下组分：
(a)培养基组合物A，其包括干细胞培养基(例如为mTeSR1培养基)、TGFβ抑制剂(例如为SB431542，其工作浓度为约2-50μM)和DKK1(其工作浓度为约2-100ng/ml，优选为约10-50ng/ml)，
优选的，所述培养基组合物A中还包括GSK3抑制剂(例如CHIR99021，其工作浓度为约1-15μM，优选为约3μM)和/或PI 3K抑制剂(例如LY294002，其工作浓度为约5-50μM，优选为约20μM)。
2.根据权利要求1所述的培养基系统，其还包括：
(b)培养基组合物B，其包括细胞培养基(例如DMEM)、TGFβ抑制剂(例如为SB431542，其工作浓度为约2-50μM)和IGF2(其工作浓度为约10-200ng/ml，优选为约40-50ng/ml)，
优选的，其中所述培养基组合物B中还包括L-Glutamine(其工作浓度为约0.5-10mM，优选为约2mM)和/或FBS(其工作浓度为约5-20％，优选为约10％)。
3.根据权利要求1或2所述的培养基系统，其还包括：
(c)培养基组合物C，其包括细胞培养基(例如DMEM)，
优选的，其中所述培养基组合物C中还包括L-Glutamine(其工作浓度为约0.5-10mM，优选为约2mM)和FBS(其工作浓度为约5-20％，优选为约10％)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的培养基系统，其中还包括ROCK抑制剂(例如Y27632，其工作浓度为约2-50μM，优选为约10μM)，其用于添加在培养基组合物B中。
5.用于体外诱导万能干细胞(例如为人类胚胎干细胞或者诱导万能干细胞(iPSCs))向间充质干细胞分化的方法，其包括以下步骤：
步骤(1)：将万能干细胞用培养基组合物A进行培养6-9天，例如培养约6天；其中培养基组合物A包括干细胞培养基(例如为mTeSR1培养基)、TGFβ抑制剂(例如为SB431542，其工作浓度为约2-50μM，优选为约10μM)和DKK1(其工作浓度为约2-100ng/ml，优选为约10-50ng/ml)；
优选的，所述培养基组合物A中还包括GSK3抑制剂(例如CHIR99021，其工作浓度为约1-15μM，优选为约3μM)和/或PI 3K抑制剂(例如LY294002，其工作浓度为约5-50μM，优选为约20μM)；
步骤(2)：将步骤(1)培养得到的细胞转用培养基组合物B进行培养7-9天，例如培养约9天；其中培养基组合物B包括细胞培养基(例如DMEM)、TGFβ抑制剂(例如为SB431542，其工作浓度为约2-50μM，优选为约10μM)和IGF2(其工作浓度为约10-200ng/ml，优选为约40-50ng/ml)；
优选的，其中所述培养基组合物B中还包括L-Glutamine(其工作浓度为约0.5-10mM，优选为约2mM)和/或FBS(其工作浓度为约5-20％，优选为约10％)；
步骤(3)：将步骤(2)培养得到的细胞解离成单细胞，然后在培养基组合物B中培养约1-3天，例如约2天；
优选的，其中所述培养基组合物C中还包括L-Glutamine(其工作浓度为约0.5-10mM，优选为约2mM)和FBS(其工作浓度为约5-20％，优选为约10％)；
步骤(4)：将步骤(3)培养得到的细胞转用培养基组合物C进行培养，例如培养约2-6天，例如培养约2天；其中培养基组合物C包括细胞培养基(例如DMEM)
任选的，用培养基3培养约1-2天后传代培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其中步骤(1)之前，将胚胎干细胞在干细胞培养基中培养。
7.权利要求5所述的方法，其中步骤(3)中通过消化酶(优选为Accutase)将步骤(3)培养得到的细胞解离成单细胞。
8.权利要求5所述的方法，其中步骤(3)中将解离的单细胞转移到培养基组合物B中培养时，加入ROCK抑制剂(例如Y27632，其工作浓度为约2-50μM，优选为约10μM)。
9.用于体外诱导万能干细胞向间充质干细胞分化的方法，其包括以下步骤：
步骤(1)：将万能干细胞用培养基组合物A进行培养6-9天，例如培养约6天；其中培养基组合物A包括干细胞培养基(例如为mTeSR1培养基)、TGFβ抑制剂(例如为SB431542，其工作浓度为约2-50μM，优选为约10μM)和DKK1(其工作浓度为约2-100ng/ml，优选为约10-50ng/ml)；
步骤(2)：将步骤(1)培养得到的细胞转用培养基组合物B进行培养7-9天，例如培养约9天；其中培养基组合物B包括细胞培养基(例如DMEM)和TGFβ抑制剂(例如为SB431542，其工作浓度为约2-50μM，优选为约10μM)；
步骤(3)：将步骤(2)培养得到的细胞解离成单细胞，然后在培养基组合物B中培养约1-3天，例如约2天；
步骤(4)：将步骤(3)培养得到的细胞转用培养基组合物C进行培养，例如培养约2-6天，例如培养约2天；其中培养基组合物C包括细胞培养基(例如DMEM)。
10.用于体外诱导万能干细胞向间充质干细胞分化的方法，其包括以下步骤：
步骤(1)：将万能干细胞用培养基组合物A进行培养6-9天，例如培养约6天；其中培养基组合物A包括干细胞培养基(例如为mTeSR1培养基)、TGFβ抑制剂(例如为SB431542，其工作浓度为约2-50μM，优选为约10μM)；
步骤(2)：将步骤(1)培养得到的细胞转用培养基组合物B进行培养7-9天，例如培养约9天；其中培养基组合物B包括细胞培养基(例如DMEM)和TGFβ抑制剂(例如为SB431542，其工作浓度为约2-50μM，优选为约10μM)；
步骤(3)：将步骤(2)培养得到的细胞解离成单细胞，然后在培养基组合物B中培养约1-3天，例如约2天；
步骤(4)：将步骤(3)培养得到的细胞转用培养基组合物C进行培养，例如培养约2-6天，例如培养约2天；其中培养基组合物C包括细胞培养基(例如DMEM)。
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| CN202111403736.XA CN116162588A (zh) | 2021-11-24 | 2021-11-24 | 人源万能干细胞分化为间充质干细胞的方法和培养基 |
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2021
- 2021-11-24 CN CN202111403736.XA patent/CN116162588A/zh active Pending
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