KR20170006949A - 줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물 및 이를 이용한 방법 - Google Patents

줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물 및 이를 이용한 방법 Download PDF

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Abstract

인슐린, 트랜스페린, 소듐 셀레니트, 또는 이들의 조합, 및 DMH1, SB431542, 또는 이들의 조합을 포함하는 줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물 및 이를 이용하는 방법을 제공한다. 이에 따르면, 성분이 간단하고 저비용인 조성물을 사용하여, 줄기 세포를 빠른 시간 내에 효율적으로 신경 전구 세포로 분화시킬 수 있다.

Description

줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물 및 이를 이용한 방법{Composition for differentiating stem cells to neural precursor cells, and method using the same}
줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다.
인간 배아 줄기 세포(human embyonic stem cell: hESC)와 인간 유도 만능 줄기 세포(human induced pluripotent stem cell: hiPSC)는 거의 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 전능성을 갖기 때문에, 그의 특성을 이용하여 부상이나 질병 등으로 조직이 손상되었을 때, 배아 줄기 세포를 원하는 조직으로 분화시켜 그 조직을 재생하는데 이용할 수 있다.
hESC와 hiPSC를 특정 세포 또는 조직으로 분화시키는 경우, hESC 또는 hiPSC 들이 서로 뭉쳐 배아체(embryoid body: EB)를 형성한 다음 세포 또는 조직으로 분화한다. 예를 들어, hESC 또는 hiPSC를 신경 전구 세포(neural precursor cell: NPC)로 분화시키는 경우, hESC 또는 hiPSC들이 뭉쳐서 자란 콜로니를 잘게 부수어 부유 배양(suspension culture)을 하게 되면 둥근 세포 덩어리인 배아체(EB)가 형성되고, 배아체를 다시 배양 용기 바닥에 붙여 부착 배양(adherent culture)하면서 신경 전구 세포로 분화를 유도하게 된다.
그러나, hESC와 hiPSC를 분화시키는데 시간과 노력이 많이 소요되고 다수의 성분, 고비용의 성분, 또는 동물 유래 물질을 포함한 배지 조성물을 사용하기 때문에, hESC와 hiPSC를 임상적으로 사용하기 어려운 문제가 있었다.
따라서, 조성이 간단하고 고비용의 성분 또는 동물 유래 물질의 성분을 포함하지 않는 저비용의 배지를 사용하여 빠르고 고수율로 hESC 또는 hiPSC의 분화를 유도하는 방법을 개발하는 것이 필요하다.
줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물을 제공한다.
줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 키트를 제공한다.
줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
일 양상은 인슐린, 트랜스페린, 소듐 셀레니트, 또는 이들의 조합; 및 DMH1, SB431542, 또는 이들의 조합을 포함하는 줄기 세포의 신경 전구 세포(neural precursor cell: NPC)로의 분화용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 세포 배양용 배지일 수 있다.
상기 조성물은 인슐린, 트랜스페린, 소듐 셀레니트, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 인슐린(insulin)은 이자의 랑게르한스 섬의 β-세포에서 분비되는 펩티드 호르몬이다. 상기 조성물 중 인슐린의 농도는 약 10 ㎍/㎖ 내지 약 200 ㎍/㎖, 약 12 ㎍/㎖ 내지 약 180 ㎍/㎖, 약 14 ㎍/㎖ 내지 약 160 ㎍/㎖, 약 16 ㎍/㎖ 내지 약 140 ㎍/㎖, 약 18 ㎍/㎖ 내지 약 120 ㎍/㎖, 약 20 ㎍/㎖ 내지 약 100 ㎍/㎖, 약 22 ㎍/㎖ 내지 약 100 ㎍/㎖, 약 25 ㎍/㎖ 내지 약 100 ㎍/㎖, 또는 약 25 ㎍/㎖ 내지 약 50 ㎍/㎖일 수 있다. 트랜스페린(transferrin)은 β-글로불린의 일종으로 혈청 속에 흡수된 2 분자의 3가 철 이온과 결합하여 세포 증식이나 헤모글로빈 생산에 필요한 철을 트랜스페린 수용체를 매개로 하여 철을 세포 내로 공급하는 철 운반 단백질이다. 소듐 셀레니트(sodium selenite)는 화학식 Na2SeO3를 갖는 무기 화합물이다.
상기 조성물은 DMH1, SB431542, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. DMH1(4-[6-(4-이소프로폭시페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]퀴놀린)은 골형성 단백질(Bone morphogenetic protein: BMP) 저해제일 수 있다. DMH1은 다른 BMP 저해제와 치환될 수 있다. 예를 들면, DMH1은 도르소모르핀(6-[4-(2-피페리딘-1-일에톡시)페닐]-3-피리딘-4-일피라졸로[1,5-a]피리미딘), LDN-193189(4-(6-(4-(피페라진-1-일)페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일)퀴졸린, Noggin 단백질, 또는 이들의 조합과 치환될 수 있다. 상기 조성물 중 DMH1의 농도는 약 0.5 μM 내지 약 1.25 μM, 약 0.6 μM 내지 약 1.2 μM, 약 0.7 μM 내지 약 1.1 μM, 약 0.8 μM 내지 약 1 μM, 또는 약 1 μM일 수 있다. DSB431542(4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드)는 형질전환 성장 인자 베타(Transforming growth factor beta: TGF-β) I 수용체 키나제의 저해제일 수 있다. 상기 SB431542는 TGF-β 신호전달 저해제와 치환될 수 있다. 상기 조성물 중 SB431542의 농도는 약 5 μM 내지 약 15 μM, 약 6 μM 내지 약 14 μM, 약 7 μM 내지 약 13 μM, 약 7.5 μM 내지 약 12.5 μM, 약 8 μM 내지 약 12 μM, 약 9 μM 내지 약 11 μM, 또는 약 10 μM일 수 있다.
상기 조성물은 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco Modified Eagle Medium: DMEM), Ham's F12 배지, 글루타민, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다. DMEM과 Ham's F12 배지는 DMEM/F12 배지일 수 있다. DMEM/F12 배지는 DMEM과 Ham's F12 배지의 1:1 혼합물일 수 있다.
상기 조성물은 예를 들면, 인슐린, 트랜스페린, 소듐 셀레니트, DMH1, SB431542, DMEM, 및 Ham's F12 배지로 이루어진 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 예를 들면, 인슐린, DMH1, SB431542, DMEM, 및 Ham's F12 배지로 이루어진 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 KnockOut™ 혈청 대체물(KnockOut serum replacement: KSR), N2 보충물, B27 보충물, 또는 이들의 조합을 포함하지 않을 수 있다.
용어 "줄기 세포(stem cell)"는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 전능성 세포(totipotent cell) 또는 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 다능성 세포(pluripotent cell)를 의미하고, 줄기 세포는 미분화 세포로서 특정 조직의 세포로 분화될 수 있다. 줄기 세포는 배아 줄기 세포(embryonic stem cell: ESC), 성체 줄기 세포(adult stem cell), 또는 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)일 수 있다. 상기 배아 줄기 세포는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것을 말한다. 상기 성체 줄기 세포는 신체 각 조직에 극히 소량만이 존재하는 미분화된 세포로서 죽은 세포나 손상된 조직을 대체하는 세포를 말한다. 상기 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)는 분화가 끝난 체세포에 세포 분화 관련 유전자를 주입하여 분화 이전의 세포 단계로 되돌려, 배아 줄기 세포처럼 만능성을 유도한 세포를 말한다. 상기 유도 만능 줄기 세포는 예를 들면 인간 영양 세포 비함유 유도 만능 줄기세포(human feeder free-iPSC: hFF-iPSC) 또는 뇨-유도 만능 줄기세포(urine-iPSC)일 수 있다.
용어 "신경 전구 세포(neural precursor cell: NPC)"는 신경 전구 세포의 바이오마커를 가지며 분화 후에 신경계 세포를 만들 수 있는 세포를 말한다. 상기 신경 전구 세포는 Pax6, Sox1, Otx2, Gbx2, Musashi1, Map2, NeuroD1, Ncam1, Ascl1, Otx1, 또는 이들의 조합을 발현할 수 있다. 상기 신경 전구 세포는 Pou5F1, Nanog, Zfp42, 또는 이들의 조합을 발현하지 않을 수 있다.
용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 말한다. 전능성 또는 다능성 배아줄기세포는 특정 형태의 전구세포로 분화될 수 있고, 그 뒤 특정 세포으로 분화될 수 있다. 상기 배아 줄기 세포는 상기 신경 전구 세포로 분화될 수 있다. 상기 신경 전구 세포는 신경계 세포로 분화될 수 있다. 상기 신경계 세포는 신경 세포(nerve cell) 또는 신경교세포(neuroglia cell)일 수 있다. 신경 세포는 뉴런(neuron)으로도 불리고, 신경계의 자극과 흥분을 전달하는 세포를 말한다. 신경교세포는 신경 세포에 필요한 물질을 공급하고 신경 세포의 활동에 적합한 화학적 환경을 조성하는 세포를 말한다. 상기 신경교세포는 예를 들어, 성상세포(astrocyte), 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte), 소교세포(microglia), 뇌실막 세포(ependymal cell), 또는 슈반 세포(Schwann cell)일 수 있다.
다른 양상은 인슐린, 트랜스페린, 소듐 셀레니트, 또는 이들의 조합, 및 DMH1, SB431542, 또는 이들의 조합을 포함하는 줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물; 및 폴리펩티드가 코팅된 배양 접시를 포함하는 줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 키트를 제공한다.
인슐린, 트랜스페린, 소듐 셀레니트, DMH1, SB431542, 줄기 세포, 신경 전구 세포, 분화, 및 조성물은 전술한 바와 같다.
상기 폴리펩티드는 줄기 세포를 부착 또는 배양하기 위한 폴리펩티드일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 예를 들어 비트로넥틴(vitronectin: VTN) 또는 마트리겔(Matrigel™)일 수 있다.
상기 배양 접시는 세포 배양 용기를 말하고, 배양 접시의 재질, 크기, 및 모양과 관계없이 세포 배양 용기를 포함한다.
다른 양상은 배양 접시에 줄기 세포를 접종하여 세포 배양액을 준비하는 단계; 및 준비된 세포 배양액을 인슐린, 트랜스페린, 소듐 셀레니트, 또는 이들의 조합, 및 DMH1, SB431542, 또는 이들의 조합을 포함하는 줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물의 존재 하에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
상기 방법은 배양 접시에 줄기 세포를 접종하여 세포 배양액을 준비하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 준비된 세포 배양액을 인슐린, 트랜스페린, 소듐 셀레니트, 또는 이들의 조합, 및 DMH1, SB431542, 또는 이들의 조합을 포함하는 줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물의 존재 하에서 배양하는 단계를 포함한다.
배양 접시, 줄기 세포, 인슐린, 트랜스페린, 소듐 셀레니트, DMH1, SB431542, 줄기 세포, 신경 전구 세포, 분화, 및 조성물은 전술한 바와 같다.
상기 방법에서 줄기 세포의 배양 시간은 배양 조건에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어 줄기 세포를 예를 들어 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 또는 약 15일 동안 배양할 수 있다. 상기 방법에서 줄기 세포를 약 30℃ 내지 약 40℃, 약 30℃ 내지 약 37℃, 또는 약 37℃에서 배양할 수 있다.
상기 방법은 줄기 세포를 배양 접시의 바닥에 부착시켜서 배양하는 부착 배양(attachment culture)으로 배양할 수 있다. 줄기 세포를 부유 배양(suspension culture)하는 경우 세포 분열 초기에 줄기 세포들이 공 모양으로 뭉쳐 형성된 세포 덩어리인 배아체(embryoid body)를 형성할 수 있으나, 일 양상에 의한 방법에 따르면 줄기 세포를 부착 배양하므로 배아체를 형성하지 않을 수 있다.
상기 방법으로 배양된 세포 중 신경 전구 세포의 비율은 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상일 수 있다.
일 양상에 따른 인슐린, 트랜스페린, 소듐 셀레니트, 또는 이들의 조합, 및 DMH1, SB431542, 또는 이들의 조합을 포함하는 줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물 및 이를 이용하는 방법에 따르면, 성분이 간단하고 저비용인 조성물을 사용하여 줄기 세포로부터 신경 전구 세포로 효율적으로 분화시킬 수 있다.
도 1은 DMH1, SB431542, 또는 이들의 조합을 포함하는 EB 배지에서 배양된 hESC 중 Sox1을 발현하는 세포의 유세포 분석(flow cytometry) 결과를 나타내는 그래프이다(DM: DMH1, SB: SB431542).
도 2는 DMH1, SB431542, 또는 이들의 조합을 포함하는 NPC 배지에서 배양된 hESC 중 Sox1을 발현하는 세포의 유세포 분석 결과를 나타내는 그래프이다(DM: DMH1, SB: SB431542).
도 3은 DMH1, SB431542, 또는 이들의 조합을 포함하는 ITS 배지에서 배양된 hESC 중 Sox1을 발현하는 세포의 유세포 분석 결과를 나타내는 그래프이다(DM: DMH1, SB: SB431542).
도 4는 DMH1 및 SB431542를 포함하는 여러 배지에서 배양된 hESC 중 Sox1을 발현하는 세포의 유세포 분석 결과를 나타내는 그래프이다(DM: DMH1, SB: SB431542).
도 5는 SB431542의 농도에 따른 Sox1을 발현하는 세포의 비율(%)을 나타내는 그래프이다.
도 6은 DMH1의 농도에 따른 Sox1을 발현하는 세포의 비율(%)을 나타내는 그래프이다.
도 7a 및 도 7b는 DMH1 및 SB431542를 포함하는 ITS 배지에서 배양된 hESC 중 Sox1을 발현하는 세포의 유세포 분석 결과를 나타내는 그래프이다(DM: DMH1, SB: SB431542).
도 8은 배양 기간(일)에 따른 Sox1을 발현하는 세포의 비율(%)을 나타내는 그래프이다.
도 9a 및 도 9b는 각각 Matrigel과 비트로넥틴이 코팅된 배양 용기에서 배양된 hESC 중 Sox1을 발현하는 세포의 유세포 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10a는 ITS 배지에서 배양된 세포의 qRT-PCR 결과를 나타내는 그래프이고, 도 10b는 전장-유전체 유전자 발현 프로파일을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 인슐린 배지에서 배양된 hESC 중 Sox1을 발현하는 세포의 유세포 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인간 만능 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화를 촉진하는 배지 조성물의 확인
1. 배지 종류에 따른 신경 전구 세포 분화 효율
(1) 배아체 배지 조성물
H9 인간 배아 줄기 세포(human embryonic stem cell: hESC)(WiCell Research Institute, Inc. Madison, WI, U.S.A.)를 배양액에서 배양하여 수득한 콜로니를 약 20개의 세포 덩어리로 나누고, 각각의 세포 덩어리를 비트로넥틴(vitronectin)이 코팅된 12-웰 플레이트에 접종하였다. 접종된 세포에 DMEM/F12(Life Technologies), 20%(v/v) KnockOut™ 혈청 대체물(Life Technologies), 1x 비-필수 아미노산(Invitrogen), 0.1 mM β-머캅토에탄올(Invitrogen), 및 1x 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen)을 포함한 배지(이하, 'EB 배지'라고 함)을 가하여 세포 배양액을 준비하였다. 준비된 세포 배양액에 1 μM의 DMH1(Millipore), 10 μM의 SB431542(GlaxoSmithKline: GSK), 또는 이들의 조합을 첨가하였다. 음성 대조군으로 약물 대신에 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide: DMSO)(Sigma-Aldrich)를 사용하였다. 37℃의 온도 및 5% CO2의 조건 하에서 hESC를 약물의 존재에서 5일 동안 배양하였다.
배양된 세포에 accutase(Life Technologies)를 첨가하고, 5 분 동안 인큐베이션하여 세포를 단일 세포로 만들었다. 세포 배양액을 원심분리(200xg, 5 분)하여 세포를 수득하였다. 수득된 세포에 2%(v/v) 파라포름알데히드(Sigma-Aldrich)를 첨가하고 상온에서 10 분 동안 인큐베이션하여 세포를 고정하였다. 0.1%(v/v) TRITON™ X-100(Sigma-Aldrich)을 포함하는 2%(v/v) 정상 혈청/1xPBS(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)를 상기 세포에 첨가하고, 상온에서 30 분 동안 인큐베이션하여 고정을 블로킹하였다. 신경 전구 세포 표지로서 신경외배엽 세포의 표지인 Sox1 단백질을 발현하는 세포(Sox1+ 세포)의 비율을 분석하기 위해서 피코에리트린(phycoerythrin: PE)-표지된 항-Sox1 모노클로날 항체(1:20 희석)(BD Biosciences)를 사용하여 면역염색하였다. 면역염색된 세포는 BD FACSCalibur flow cytometer(BD Biosciences, Sparks, MD, USA)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다.
유세포 분석 결과로서, hESC를 DMH1, SB431542, 또는 DMH1 및 SB431542의 조합의 존재 하에서 배양한 경우, 배양된 hESC 중 Sox1을 발현하는 세포의 비율(%)을 표 1 및 도 1에 나타내었다(DM: DMH1, SB: SB431542).
기본 배지 추가된 배지 성분 Sox1 -양성 세포(%)
EB 배지 DMSO 약 8.52
1 μM DMH1 약 12.5
10 μM SB431542 약 15.3
1 μM DMH1 + 10 μM SB431542 약 27.2
표 1 및 도 1에 나타난 바와 같이, EB 배지에 DMH1, SB431542, 또는 DMH1 및 SB431542의 조합을 첨가한 배지에서 hESC를 배양한 경우, Sox1을 발현하는 세포의 비율이 약 27.2% 이하에 불과하였다. 따라서, DMH1, SB431542, 또는 DMH1 및 SB431542의 조합을 포함한 EB 배지에서 hESC를 배양하는 경우, 신경 전구 세포로의 분화 효율이 낮음을 확인하였다.
(2) 신경 전구 세포 분화 배지 조성물
1.(1)에 기재된 바와 같이, 준비된 H9 hESC를 비트로넥틴이 코팅된 12-웰 플레이트에 접종하였다. 접종된 세포에 DMEM/F12(Life Technologies), 1x N2 보충물(Invitrogen), 1x B27 보충물, 및 1x 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen)을 포함한 신경 전구 세포 분화 배지(이하, 'NPC 배지'라고 함)을 가하여 세포 배양액을 준비하였다. 준비된 세포 배양액에 1.(1)에 기재된 바와 같이, DMH1, SB431542, 또는 DMH1 및 SB431542의 조합을 첨가하고 37℃의 온도 및 5% CO2의 조건 하에서 hESC를 5일 동안 배양하였다. 음성 대조군으로 약물 대신에 DMSO(Sigma-Aldrich)를 사용하였다.
1.(1)에 기재된 바와 같이, 면역염색 및 유세포 분석을 수행하였다. 유세포 분석 결과로서, hESC를 DMH1, SB431542, 또는 DMH1 및 SB431542의 조합의 존재 하에서 배양한 경우, 배양된 hESC 중 Sox1을 발현하는 세포의 비율(%)을 표 2 및 도 2에 나타내었다(DM: DMH1, SB: SB431542).
기본 배지 추가된 배지 성분 Sox1 -양성 세포(%)
NPC 배지 DMSO 약 11.4
1 μM DMH1 약 15.1
10 μM SB431542 약 13.1
1 μM DMH1 + 10 μM SB431542 약 31.8
표 2 및 도 2에 나타난 바와 같이, NPC 배지에 DMH1, SB431542, 또는 DMH1 및 SB431542의 조합을 첨가한 배지에서 hESC를 배양한 경우, Sox1을 발현하는 세포의 비율이 약 31.8% 이하에 불과하였다. 따라서, EB 배지와 유사하게, DMH1, SB431542, 또는 DMH1 및 SB431542의 조합을 포함한 NPC 배지에서 hESC를 배양하는 경우, 신경 전구 세포로의 분화 효율이 낮음을 확인하였다.
(3) ITS 배지 조성물
1.(1)에 기재된 바와 같이, 준비된 H9 hESC를 비트로넥틴이 코팅된 12-웰 플레이트에 접종하였다. 접종된 세포에 DMEM/F12(Life Technologies), 10 ㎍/㎖ 인슐린(Sigma-Aldrich), 9 ㎍/㎖ 트랜스페린(Sigma-Aldrich), 및 14 ng/㎖ 소듐 셀레니트(Sigma-Aldrich)를 포함한 배지(이하, 'ITS 배지'라고 함)을 가하여 세포 배양액을 준비하였다. 준비된 세포 배양액에 1.(1)에 기재된 바와 같이, DMH1, SB431542, 또는 DMH1 및 SB431542의 조합을 첨가하고 37℃의 온도 및 5% CO2의 조건 하에서 hESC를 5일 동안 배양하였다. 음성 대조군으로 약물 대신에 DMSO(Sigma-Aldrich)를 사용하였다.
1.(1)에 기재된 바와 같이, 면역염색 및 유세포 분석을 수행하였다. 유세포 분석 결과로서, hESC를 DMH1, SB431542, 또는 DMH1 및 SB431542의 조합의 존재 하에서 배양한 경우, 배양된 hESC 중 Sox1을 발현하는 세포의 비율(%)을 표 3 및 도 3에 나타내었다(DM: DMH1, SB: SB431542).
기본 배지 추가된 배지 성분 Sox1 -양성 세포(%)
ITS 배지 DMSO 약 26.4
1 μM DMH1 약 89.1
10 μM SB431542 약 98.3
1 μM DMH1 + 10 μM SB431542 약 98.8
표 3 및 도 3에 나타난 바와 같이, DMH1, SB431542, 또는 DMH1 및 SB431542의 조합을 포함한 NPC 배지에서 hESC를 배양하는 경우 hESC에서 신경 전구 세포로의 분화 효율이 유의하게 높았다. 특히 DMH1 및 SB431542의 조합이 배양액에 첨가된 경우, 신경 전구 세포로의 분화 효율이 현저하게 높음을 확인하였다.
(4) 기본 배지 조성물
DMH1 및 SB431542의 조합을 포함하는 여러 기본 배지에서 hESC에서 신경 전구 세포로의 분화 효율을 비교하였다.
1.(1)에 기재된 바와 같이, 준비된 H9 hESC를 비트로넥틴이 코팅된 12-웰 플레이트에 접종하고, 접종된 세포에 ITS 배지를 가하여 세포 배양액을 준비하였다. 준비된 세포 배양액에 1.(1)에 기재된 바와 같이, DMH1 및 SB431542의 조합을 첨가하고 37℃의 온도 및 5% CO2의 조건 하에서 hESC를 5일 동안 배양하였다.
1.(1)에 기재된 바와 같이, 면역염색 및 유세포 분석을 수행하였다. 유세포 분석 결과로서, DMH1 및 SB431542을 포함하는 EB 배지, N2B27 배지, 신경기본 배지, 및 ITS 배지에서 hESC를 배양한 경우, 배양된 hESC 중 Sox1을 발현하는 세포의 비율(%)을 표 4 및 도 4에 나타내었다(DM: DMH1, SB: SB431542).
배지 Sox1 -양성 세포(%)
EB 배지 + 1 μM DMH1 + 10 μM SB431542 약 20.7
N2B27 배지 + 1 μM DMH1 + 10 μM SB431542 약 35.5
신경 기본 배지 + 1 μM DMH1 + 10 μM SB431542 약 58.1
ITS 배지 + 1 μM DMH1 + 10 μM SB431542 약 93.2
표 4 및 도 4에 나타난 바와 같이, DMH1 및 SB431542을 포함하더라도 기본 배지의 종류에 따라 Sox1을 발현하는 세포의 비율이 상이하였다. DMH1 및 SB431542를 포함하는 다른 배지에서 신경 전구 세포로의 분화 효율에 비해, DMH1 및 SB431542를 포함한 ITS 배지에서 신경 전구 세포로의 분화 효율이 약 1.6배 내지 4.5배 우수함을 확인하였다.
2. DMH1 , SB431542 , 또는 이들의 조합을 포함한 ITS 배지에서 신경 전구 세포 분화 효율
(1) SB431542 를 포함한 ITS 배지
SB431542 단독의 농도에 따른 hESC에서 신경 전구 세포로의 분화 효율을 확인하였다.
1.(1)에 기재된 바와 같이, 준비된 H9 hESC를 비트로넥틴이 코팅된 12-웰 플레이트에 접종하였다. 접종된 세포에 ITS 배지를 가하여 세포 배양액을 준비하였다. 준비된 세포 배양액에 최종 농도 5 μM, 7.5 μM, 10 μM, 또는 12.5 μM의 SB431542를 첨가하고 37℃의 온도 및 5% CO2의 조건 하에서 hESC를 5일 동안 배양하였다. 음성 대조군으로 SB431542 대신에 DMSO(Sigma-Aldrich)를 사용하였다.
1.(1)에 기재된 바와 같이, 면역염색 및 유세포 분석을 수행하였다. 유세포 분석 결과로부터 SB431542의 농도에 따른 Sox1을 발현하는 세포의 비율(%)을 산출하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다(▲: SB431542, ◆: DMSO). 도 5에 나타난 바와 같이, 10 μM의 SB431542를 포함한 ITS 배지에서 hESC를 배양한 경우, 신경 전구 세포로의 분화 효율이 약 99.4%였다. 따라서, SB431542 단독의 경우 10 μM의 SB431542에서 신경 전구 세포로의 분화 효율이 유의하게 높음을 확인하였다.
(2) DMH1 를 포함한 ITS 배지
DMH1 단독의 농도에 따른 hESC에서 신경 전구 세포로의 분화 효율을 확인하였다.
1.(1)에 기재된 바와 같이, 준비된 H9 hESC를 비트로넥틴이 코팅된 12-웰 플레이트에 접종하였다. 접종된 세포에 ITS 배지를 가하여 세포 배양액을 준비하였다. 준비된 세포 배양액에 최종 농도 0.25 μM, 0.5 μM, 1 μM, 또는 1.25 μM의 DMH1을 첨가하고 37℃의 온도 및 5% CO2의 조건 하에서 hESC를 5일 동안 배양하였다. 음성 대조군으로 DMH1 대신에 DMSO(Sigma-Aldrich)를 사용하였다.
1.(1)에 기재된 바와 같이, 면역염색 및 유세포 분석을 수행하였다. 유세포 분석 결과로부터 DMH1의 농도에 따른 Sox1을 발현하는 세포의 비율(%)을 산출하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다(▲: DMH1, ◆: DMSO). 도 6에 나타난 바와 같이, 1 μM의 DMH1을 포함한 ITS 배지에서 hESC를 배양한 경우, 신경 전구 세포로의 분화 효율이 약 99.7%였다. 따라서, SB431542 단독의 경우 1 μM의 DMH1에서 신경 전구 세포로의 분화 효율이 유의하게 높음을 확인하였다.
(3) DMH1 및 SB431542 를 포함한 ITS 배지
DMH1 및 SB431542의 농도에 따른 hESC에서 신경 전구 세포로의 분화 효율을 확인하였다.
1.(1)에 기재된 바와 같이, 준비된 H9 hESC를 비트로넥틴이 코팅된 12-웰 플레이트에 접종하였다. 접종된 세포에 ITS 배지를 가하여 세포 배양액을 준비하였다. 준비된 세포 배양액에 1 μM의 DMH1, 및 5 μM, 7.5 μM, 10 μM, 또는 12.5 μM의 SB431542를 첨가하고 37℃의 온도 및 5% CO2의 조건 하에서 hESC를 5일 동안 배양하였다. 한편, 10 μM의 SB431542, 및 0.25 μM, 0.5 μM, 1 μM, 또는 1.25 μM의 DMH1을 첨가하고 37℃의 온도 및 5% CO2의 조건 하에서 hESC를 5일 동안 배양하였다. 음성 대조군으로 DMH1 대신에 DMSO(Sigma-Aldrich)를 사용하였다.
1.(1)에 기재된 바와 같이, 면역염색 및 유세포 분석을 수행하였다. 배양된 hESC 중 Sox1을 발현하는 세포의 비율(%)을 표 5, 도 7a, 및 도 7b에 나타내었다(DM: DMH1, SB: SB431542).
기본 배지 추가된 배지 성분 Sox1 -양성 세포(%)
ITS 배지 1 μM의 DMH1 5 μM SB431542 약 80
7.5 μM SB431542 약 91.9
10 μM SB431542 약 99.9
12.5 μM SB431542 약 99.8
10 μM SB431542 0.25 μM DMH1 약 89.9
0.5 μM DMH1 약 98.7
1 μM DMH1 약 99.7
1.25 μM DMH1 약 98.6
표 5, 도 7a, 및 도 7b에 나타난 바와 같이, 1 μM의 DMH1 및 10 μM의 SB431542를 포함한 ITS 배지에서 hESC를 배양한 경우, 신경 전구 세포로의 분화 효율이 유의하게 높음을 확인하였다.
(4) 배양 기간
1 μM의 DMH1 및 10 μM의 SB431542를 포함한 ITS 배지에서 hESC를 배양한 경우, 배양 기간에 따른 hESC에서 신경 전구 세포로의 분화 효율을 확인하였다.
1.(1)에 기재된 바와 같이, 준비된 H9 hESC를 비트로넥틴이 코팅된 12-웰 플레이트에 접종하였다. 접종된 세포에 ITS 배지를 가하여 세포 배양액을 준비하였다. 준비된 세포 배양액에 1 μM의 DMH1 및 10 μM의 SB431542를 첨가하고 37℃의 온도 및 5% CO2의 조건 하에서 hESC를 3일, 6일, 9일, 또는 12일 동안 배양하였다. 음성 대조군으로 약물 대신에 DMSO(Sigma-Aldrich)를 사용하였다.
1.(1)에 기재된 바와 같이, 면역염색 및 유세포 분석을 수행하였다. 배양 기간에 따른 hESC 중 Sox1을 발현하는 세포의 비율(%)을 도 8에 나타내었다(▲: ITS 배지+DMH1+SB431542, ◆: ITS 배지+DMSO). 도 8에 나타난 바와 같이, hESC를 1 μM의 DMH1 및 10 μM의 SB431542를 포함한 ITS 배지에서 6일 동안 배양한 경우, 신경 전구 세포로의 분화 효율이 유의하게 높음을 확인하였다.
(5) 배양 용기의 코팅 물질
배양 용기의 코팅 물질로서 마트리겔(Matrigel)과 비트로넥틴이 코팅된 배양 용기에서 hESC를 배양한 경우, 코팅 물질의 종류에 따른 hESC에서 신경 전구 세포로의 분화 효율을 확인하였다.
1.(1)에 기재된 바와 같이, 준비된 H9 hESC를 비트로넥틴이 코팅된 12-웰 플레이트(Nalgene Nunc) 또는 마트리겔이 코팅된 12-웰 플레이트(BD Bioscience)에 접종하였다. 접종된 세포에 ITS 배지를 가하여 세포 배양액을 준비하였다. 준비된 세포 배양액에 1 μM의 DMH1 및 10 μM의 SB431542를 첨가하고 37℃의 온도 및 5% CO2의 조건 하에서 hESC를 5일 동안 배양하였다.
1.(1)에 기재된 바와 같이, 면역염색 및 유세포 분석을 수행하였다. 마트리겔과 비트로넥틴이 코팅된 배양 용기에서 배양된 hESC 중 Sox1을 발현하는 세포의 비율(%)을 각각 도 9a 및 도 9b에 나타내었다. 도 9a 및 도 9b에 나타난 바와 같이, 비트로넥틴이 코팅된 배양 용기에 배양한 경우 마트리겔이 코팅된 배양 용기에 배양한 경우보다 신경 전구 세포로의 분화 효율이 유의하게 높음을 확인하였다.
(6) 분화된 세포에서 신경 전구 세포 마커의 확인
비트로넥틴이 코팅된 배양 용기에서 1 μM의 DMH1 및 10 μM의 SB431542를 포함한 ITS 배지에서 배양된 hESC가 신경 전구 세포 마커를 발현하는 신경 전구 세포인지 여부를 확인하였다.
1.(1)에 기재된 바와 같이, 비트로넥틴이 코팅된 배양 용기에서 1 μM의 DMH1, 10 μM의 SB431542, 또는 1 μM의 DMH1과 10 μM의 SB431542를 포함한 ITS 배지에서 5일 동안 hESC를 배양하였다. 음성 대조군으로 약물 대신 DMSO를 사용하였다.
배양된 세포를 수득하고, 수득된 세포로부터 Tirzol (Invitrogen)과 RNeasy Kit(Qiagen)를 이용하여 총 RNA를 수득하였다. 수득된 1 ㎍의 총 RNA를 주형으로 하고, ReverTra Ace qPCR RT Kit (Toyobo, Osaka, Japan)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 Power SYBR® Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, Carlsbad, CA USA)를 사용하여 신경전구세포의 마커인 Pax6, Sox1, Otx2, 및 Gbx2에 대한 정량적 역전사-중합효소 연쇄 반응(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction: qRT-PCR)을 수행하였다. qRT-PCR에 사용된 프라이머는 다음과 같다:
Pax6 정방향 프라이머: 5'-GCTTCACCATGGCAAATAAC-3' (서열번호 1),
Pax6 역방향 프라이머: 5'-GGCAGCATGCAGGAGTATGA-3' (서열번호 2),
Sox1 정방향 프라이머: 5'-GTAGTAAGGCAGGTCCAAG-3' (서열번호 3),
Sox1 역방향 프라이머: 5'-GGTGGTGGTGGTAATCTC-3' (서열번호 4),
Otx2 정방향 프라이머: 5'-CAACCACTGATTGCTTGGATTAT-3' (서열번호 5),
Otx2 역방향 프라이머: 5'-CCACGAGGATGTCTGATCTTT-3' (서열번호 6),
Gbx2 정방향 프라이머: 5'-ACGAGTCAAAGGTGGAAGAC-3' (서열번호 7),
Gbx2 역방향 프라이머: 5'-CTGGCCAGTCAGATTGTCAT-3' (서열번호 8).
DMSO를 포함한 ITS 배지에서 배양된 세포의 발현 수준에 대한 약물을 포함한 ITS 배지에서 배양된 세포의 상대적 발현 수준을 도 10a에 나타내었다(빨간색 막대: ITS 배지+DMH1, 파란색 막대: ITS 배지+SB431542, 녹색 막대: ITS 배지+DMH1+SB431542).
한편, 수득된 RNA를 사용하여 전장-유전체 유전자 발현 프로파일을 조사하였다. 이 실험은 Macrogen 회사에 의뢰하여 실시되었으며 이때 실험에 사용된 칩은 HumanHT-12 v4 Expression BeadChip (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)이다. 전장-유전체 유전자 발현 프로파일의 결과를 도 10b에 나타내었다.
도 10a 및 도 10b에 나타난 바와 같이, 1 μM의 DMH1과 10 μM의 SB431542를 포함한 ITS 배지에서 배양된 세포가 신경 전구 세포의 마커의 발현이 강했고, 배양된 hESC에서 미분화 마커(예: Pou5F1, Nanog, Zfp42)는 발현되지 않는 반면에, 신경 전구 세포의 마커(예: Pxa6, Nestin, Sox1, Musashi1, Map2, Otx2, Gbx2, NeuroD1, Ncam1, Ascl1, Otx1)는 발현됨을 확인하였다.
3. 인슐린 배지에서 신경 전구 세포 분화 효율
ITS 배지 대신에 인슐린을 포함하는 배지에서 hESC를 배양하는 경우에도 신경 전구 세포의 분화가 유도되는지 여부를 확인하였다.
1.(1)에 기재된 바와 같이, 준비된 H9 hESC를 비트로넥틴이 코팅된 12-웰 플레이트에 접종하였다. 접종된 세포에 DMEM/F12(Life Technologies), 및 10 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 또는 100 ㎍/㎖의 인슐린(Sigma-Aldrich)을 포함한 배지(이하, '인슐린 배지'라고 함)을 가하여 세포 배양액을 준비하였다. 준비된 세포 배양액에 1.(1)에 기재된 바와 같이, 1 μM의 DMH1과 10 μM의 SB431542를 첨가하고 37℃의 온도 및 5% CO2의 조건 하에서 hESC를 5일 동안 배양하였다. 음성 대조군으로 약물 대신에 DMSO를 사용하였다.
1.(1)에 기재된 바와 같이, 면역염색 및 유세포 분석을 수행하였다. 유세포 분석 결과로서, 인슐린 배지에서 배양된 hESC 중 Sox1을 발현하는 세포의 비율(%)을 표 6 및 도 11에 나타내었다(DM: DMH1, SB: SB431542).
배지 Sox1 -양성 세포(%)
10 ㎍/㎖ 인슐린 DMSO


 약 61.6
25 ㎍/㎖ 인슐린 약 62.5
50 ㎍/㎖ 인슐린 약 70.7
100 ㎍/㎖ 인슐린 약 71.3
10 ㎍/㎖ 인슐린 1 μM DMH1 및 10 μM SB431542


 약 95.4
25 ㎍/㎖ 인슐린 약 99.3
50 ㎍/㎖ 인슐린 약 98.3
100 ㎍/㎖ 인슐린 약 99.6
표 6 및 도 11에 나타난 바와 같이, 인슐린, 트랜스페린, 및 셀레나이트를 포함하는 ITS 배지 대신에, 인슐린을 포함하는 배지에서도 DMH1과 SB431542의 존재 하에서 신경 전구 세포로의 분화가 고효율로 유도됨을 확인하였다.
<110> College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation <120> Composition for differentiating stem cells to neural precursor cells, and method using the same <130> PN109556 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Pax6 <400> 1 gcttcaccat ggcaaataac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Pax6 <400> 2 ggcagcatgc aggagtatga 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Sox1 <400> 3 gtagtaaggc aggtccaag 19 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Sox1 <400> 4 ggtggtggtg gtaatctc 18 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Otx2 <400> 5 caaccactga ttgcttggat tat 23 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Otx2 <400> 6 ccacgaggat gtctgatctt t 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Gbx2 <400> 7 acgagtcaaa ggtggaagac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Gbx2 <400> 8 ctggccagtc agattgtcat 20

Claims (13)

  1. 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 소듐 셀레니트(sodium selenite), 또는 이들의 조합, 및
    DMH1, SB431542, 또는 이들의 조합을 포함하는 줄기 세포의 신경 전구 세포(neural precursor cell: NPC)로의 분화용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 조성물 중 인슐린의 농도는 10 ㎍/㎖ 내지 200 ㎍/㎖인 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 조성물 중 DMH1의 농도는 0.5 μM 내지 1.25 μM인 것인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 조성물 중 SB431542의 농도는 5 μM 내지 15 μM인 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco Modified Eagle Medium: DMEM), Ham's F12 배지, 글루타민, 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것인 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 인슐린, 트랜스페린, 소듐 셀레니트, DMH1, SB431542, DMEM, 및 Ham's F12 배지로 이루어진 것인 조성물.
  7. 청구항 5에 있어서, 인슐린, DMH1, SB431542, DMEM, 및 Ham's F12 배지로 이루어진 것인 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기 세포는 배아 줄기 세포(embryonic stem cell: ESC), 성체 줄기 세포(adult stem cell), 또는 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)인 것인 조성물.
  9. 청구항 1의 조성물, 및 폴리펩티드가 코팅된 배양 접시를 포함하는 줄기 세포의 NPC로의 분화용 키트.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 폴리펩티드는 비트로넥틴(vitronectin) 또는 마트리겔(Matrigel)인 것인 키트.
  11. 배양 접시에 줄기 세포를 접종하여 세포 배양액을 준비하는 단계; 및
    준비된 세포 배양액을 청구항 1의 조성물의 존재 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화시키는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 줄기 세포를 3일 내지 15일 동안 배양하는 것인 방법.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 줄기 세포를 부착 배양하는 것인 방법.
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