JP7088005B2 - 神経幹細胞の製造方法、培地、サプリメント、サプリメントセット、培地キット、及び細胞培養装置 - Google Patents

Description

本発明は、神経幹細胞の製造方法、培地、サプリメント、サプリメントセット、培地キット、及び細胞培養装置に関する。
本願は、２０１６年５月２６日に、日本に出願された特願２０１６－１０５０２２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

近年、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を分化誘導して、様々な種類の組織や細胞を製造することが試みられている。例えば、特許文献１、特許文献２、及び非特許文献１には、胚性幹細胞の浮遊培養を行い、浮遊凝集体を形成させて、神経幹細胞を得たことが報告されている。
また、ストローマ細胞上で胚性幹細胞を培養して分化させる方法（SDIA法）が知られている（非特許文献２参照）。

一方、細胞の培養過程において、培養中の細胞の状態を把握することは重要である。培養細胞の状態の把握や評価のハイスループット化を目的とし、培養細胞を対象としたイメージング技術の開発が進められている。

米国特許第７５８８９３７号明細書 国際公開第２００５／１２３９０２号

Watanabe K, Kamiya D, Nishiyama A, Katayama T, Nozaki S, Kawasaki H, Watanabe Y, Mizuseki K, Sasai Y. "Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells." Nat Neurosci. 2005 Mar;8(3):288-96. Epub 2005 Feb 6. Kawasaki H, Mizuseki K, Nishikawa S, Kaneko S, Kuwana Y, Nakanishi S, Nishikawa SI, Sasai Y. "Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity." Neuron. 2000 Oct;28(1):31-40. Krug AK, Kolde R, Gaspar JA, Rempel E, Balmer NV, Meganathan K, Vojnits K, Baquie M, Waldmann T, Ensenat-Waser R, Jagtap S, Evans RM, Julien S, Peterson H, Zagoura D, Kadereit S, Gerhard D, Sotiriadou I, Heke M, Natarajan K, Henry M, Winkler J, Marchan R, Stoppini L, Bosgra S, Westerhout J, Verwei M, Vilo J, Kortenkamp A, Hescheler J, Hothorn L, Bremer S, van Thriel C, Krause KH, Hengstler JG, Rahnenfuehrer J, Leist M, Sachinidis A. "Human embryonic stem cell-derived test systems for developmental neurotoxicity: a transcriptomics approach." Arch Toxicol. 2013 Jan;87(1):123-43.

特許文献１等に挙げられている方法では、細胞を浮遊培養して胚様体をつくり、それから神経幹細胞を誘導していた。この方法によれば神経幹細胞を製造することはできるものの、培養中の細胞が凝集体を形成し、一つ一つの細胞を観察することは困難である。
また、非特許文献３に挙げられている方法では、「ＤＭＥＭ－Ｆ１２にＫｎｏｃｋ－Ｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）を添加した培地」を用いて細胞を培養しているが、これらの培地には数多くの成分が配合されており、これらの成分が観察用の光を吸収してしまう等して、イメージングに用いるには不都合な場合があった。

本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、神経幹細胞の誘導に用いることができるとともに、イメージングにも適した、サプリメント、神経幹細胞誘導用サプリメントセット、神経幹細胞誘導用培地キット、培地、神経幹細胞の製造方法、及び細胞培養装置の提供を課題とする。

すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る多能性幹細胞から神経幹細胞への分化誘導のための培地用サプリメントは、ＴＧＦ－β受容体阻害物質及びプロテインキナーゼＣ阻害物質を含み、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含まず、培地中の前記ＴＧＦ－β受容体阻害物質の濃度が５～１５μｍｏｌ／Ｌ、前記プロテインキナーゼＣ阻害物質の濃度が１．５～５μｍｏｌ／Ｌとなるように添加される。

本発明の第２態様に係る多能性幹細胞から神経幹細胞への分化誘導に用いられる培地用サプリメントのセットは、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含む第一のサプリメントと、ＴＧＦ－β受容体阻害物質及びプロテインキナーゼＣ阻害物質を含み、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含まない第二のサプリメントと、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体と、ＴＧＦ－β受容体阻害物質と、プロテインキナーゼＣ阻害物質とを含む第三のサプリメントと、を含み、培地中の前記ＴＧＦ－β受容体阻害物質の濃度が５～１５μｍｏｌ／Ｌ、前記プロテインキナーゼＣ阻害物質の濃度が１．５～５μｍｏｌ／Ｌとなるように添加される。

本発明の第３態様に係る多能性幹細胞から神経幹細胞への分化誘導培地は、５～１５μｍｏｌ／ＬのＴＧＦ－β受容体阻害物質及び１．５～５μｍｏｌ／ＬのプロテインキナーゼＣ阻害物質を含み、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含まない。

本発明の第４態様に係る神経幹細胞の製造方法は、５～１５μｍｏｌ／ＬのＴＧＦ－β受容体阻害物質及び１．５～５μｍｏｌ／ＬのプロテインキナーゼＣ阻害物質を含み、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含まない培地を用いて、細胞を培養する工程を含み、前記細胞は、多能性幹細胞である。

本発明の第５態様に係る培地キットは、基礎培地と、上記第１態様に係る培地用サプリメント、又は、上記第２態様に係る培地用サプリメントのセットと、を含む。

（１）本発明の一実施態様における神経幹細胞誘導用第二サプリメントは、
略単層状態の細胞を培養する培地に添加される第一サプリメントを含有する培地を用いて培養された略単層状態の細胞を、さらに培養する培地に添加されて使用され、前記細胞から略単層状態の神経幹細胞を誘導可能なものである。
（２）本発明の一実施態様における神経幹細胞誘導用サプリメントセットは、
略単層状態の細胞を培養する培地に添加されて使用される第一サプリメントと、
先に記載の神経幹細胞誘導用第二サプリメントと、を備える。
（３）本発明の一実施態様における第三サプリメントは、
略単層状態の細胞を培養する培地に添加される第一サプリメントを含有する培地を用いて培養された略単層状態の細胞を、
先に記載の神経幹細胞誘導用第二サプリメントを含有する培地でさらに培養して得られた略単層状態の神経幹細胞を、
更に培養する培地に添加されて使用されるものである。
（４）本発明の一実施態様における神経幹細胞誘導用サプリメントセットは、
先に記載の神経幹細胞誘導用サプリメントセットが、
先に記載の第三サプリメント、を更に備えるものである。
（５）本発明の一実施態様における神経幹細胞誘導用培地キットは、
先に記載の神経幹細胞誘導用第二サプリメント、先に記載のサプリメントセット、先に記載の第三サプリメント、又は先に記載のサプリメントセットと、
基礎培地と、を備えるものである。
（６）本発明の一実施態様における第二培地は、基礎培地、及び先に記載の第二サプリメント、を含有するものである。
（７）本発明の一実施態様における第三培地は、
略単層状態の細胞を培養する培地に添加される第一サプリメントを含有する第一培地を用いて培養された略単層状態の細胞を、
先に記載の第二培地でさらに培養して得られた略単層状態の神経幹細胞を、さらに培養するのに使用され、
基礎培地、及び先に記載の第三サプリメント、を含有するものである。
（８）本発明の一実施態様における神経幹細胞の製造方法は、
略単層状態の細胞を培養する培地に添加される第一サプリメント、を含有する第一培地を用いて、略単層状態の多能性幹細胞を培養する第一培養工程と、
前記第一培養工程で培養された細胞を、先に記載の第二培地を用いて培養し、略単層状態の神経幹細胞を得る第二培養工程と、を含む。
（９）本発明の一実施態様における細胞培養装置は、
多能性幹細胞を培養するインキュベータと、
前記インキュベータ内で培養される細胞を撮像する撮像手段と、
前記インキュベータ内の、略単層状態の細胞を培養する培地に添加される第一サプリメント、を含有する第一培地と先に記載の第二培地とを交換する培地交換手段と、を備える。

実施形態の神経幹細胞の製造方法における工程を示す図である。 実施形態の神経幹細胞の製造方法における、多能性維持培養工程の手順を示す模式図である。 実施形態の神経幹細胞の製造方法における、第一培養工程及び第二培養工程の手順を示す模式図である。 実施形態の神経幹細胞の製造方法における、第三培養工程及び第二培養工程の手順を示す模式図である。 実施形態の細胞培養装置の構成の一例を示す模式図である。 実施例において、サプリメントの候補成分の細胞への影響を検討した結果を示すグラフである。 実施例において、サプリメントの候補成分の細胞への影響を検討した結果を示すグラフである。 実施例において、サプリメントの候補成分の細胞への影響を検討した結果を示すグラフである。 実施例において、サプリメントの候補成分の細胞への影響を検討した結果を示す位相差顕微鏡写真である。 実施例において、サプリメントの候補成分の細胞への影響を検討した結果を示す位相差顕微鏡写真である。 実施例において取得された、培養中の細胞における各種マーカーの発現を示す免疫染色写真である。 実施例において取得された、培地の吸光度の値を示すグラフである。 実施例において取得された、培地の吸光度の値を示すグラフである。

≪サプリメント、神経幹細胞誘導用サプリメントセット、神経幹細胞誘導用培地キット、神経幹細胞誘導用培地セット≫
以下、実施形態のサプリメント、神経幹細胞誘導用サプリメントセット、神経幹細胞誘導用培地キット、培地、及び神経幹細胞誘導用培地セットについて説明する。これらは、神経幹細胞の製造等に使用できる。

＜サプリメント＞
まず、略単層状態の細胞を培養する培地に添加される実施形態の第一サプリメントを含有する培地で、略単層状態の細胞を培養できる。該細胞を、実施形態の第二サプリメントを含有する培地を用いてさらに培養することで、略単層状態の神経幹細胞に誘導可能である。
実施形態の第一、第二、及び第三サプリメントは、培養工程において、互いに一部共通する物質を含むことが好ましい。また、実施形態の第一、第二、及び第三サプリメントは、神経幹細胞誘導する際に使用する培地に添加するサプリメントをベースに使用されることが好ましい。また、サプリメントとしては化合物を含むことが好ましい。

実施形態の第一サプリメントは、インスリン、セレン酸、塩基性線維芽細胞増殖因子、及びアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含んでよい。
実施形態の第二サプリメントは、インスリン、セレン酸、塩基性線維芽細胞増殖因子、ＴＧＦ－β受容体阻害物質、及びプロテインキナーゼＣ阻害物質を含んでよい。第二サプリメントは、さらにヘパラン硫酸を含んでもよい。
実施形態の第三サプリメントは、インスリン、セレン酸、塩基性線維芽細胞増殖因子、ＴＧＦ－β受容体阻害物質、プロテインキナーゼＣ阻害物質、及びアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含んでよい。第三サプリメントは、さらにヘパラン硫酸を含んでもよい。

第二サプリメントは、第一サプリメントを含有する培地を用いて培養された細胞を、さらに培養する培地に添加されて使用可能である。
第三サプリメントは、前記第一サプリメントを含有する培地で培養された細胞を、
前記第二サプリメントを含有する培地でさらに培養して得られた神経幹細胞を、
さらに培養する培地に添加されて使用可能である。

本発明の一実施態様における神経幹細胞誘導用サプリメントセットは、第一サプリメントと、第二サプリメントと、を備える。
本発明の一実施態様における神経幹細胞誘導用サプリメントセットは、第一サプリメントと、第二サプリメントと、第三サプリメントと、を備える。

＜培地キット＞
本実施形態において、第一サプリメント、第二サプリメント、第三サプリメントは、それぞれ、細胞を培養可能な基礎培地に添加されて、細胞の培養に用いることができる。
したがって、上記各サプリメント及び基礎培地は、キット化して提供されてもよい。
本発明の一実施態様における神経幹細胞誘導用培地キットは、基礎培地と、第一サプリメントと、第二サプリメントと、を備える。
本発明の一実施態様における神経幹細胞誘導用培地キットは、基礎培地と、第一サプリメントと、第二サプリメントと、第三サプリメントと、を備える。

＜培地、培地セット＞
基礎培地及び第一サプリメントを含む第一培地、基礎培地及び第二サプリメントを含む第二培地、基礎培地及び第三サプリメントを含む第三培地は、それぞれ、神経幹細胞の製造に使用できる。
したがって、上記各サプリメント及び基礎培地は、予め各々が混合された培地として提供されてもよい。
実施形態の第一培地は、基礎培地及び第一サプリメントを含む。
実施形態の第二培地は、基礎培地及び第二サプリメントを含む。
実施形態の第三培地は、基礎培地及び第三サプリメントを含む。

第二培地は、第一培地を用いて培養された細胞を、さらに培養するのに使用可能である。
第二培地は、第一培地を用いて培養された細胞を、第二培地でさらに培養して得られた神経幹細胞を、さらに培養するのに使用可能である。

本発明の一実施態様における神経幹細胞誘導用培地セットは、基礎培地及び第一サプリメントを含む第一培地と、基礎培地及び第二サプリメントを含む第二培地と、を備える。
本発明の一実施態様における神経幹細胞誘導用培地セットは、基礎培地及び第一サプリメントを含む第一培地と、基礎培地及び第二サプリメントを含む第二培地と、基礎培地及び第三サプリメントを含む第三培地と、を備える。

また、実施形態の第一培地、第二培地、第三培地の各培地によれば、略単層状態の細胞を培養できる。実施形態の第一培地及び第二培地によれば、略単層状態の神経幹細胞を製造できるため、精度よく個々の細胞のイメージを取得でき、細胞状態を把握できるので、効率よく神経幹細胞を製造できる。

本明細書中において「単層状態」の細胞とは、細胞が、培養容器又は器具の底面又は壁面に付着し、細胞同士が互いに重なっていない状態をいう。
細胞は単層状態であることが最も好ましいが、一部領域において細胞が重なっている部分がある略単層状態であってもよい。この場合、重なる細胞の個数の最大値としては、約１０個以下であることが好ましく、約５個以下がより好ましい。「略単層状態」の細胞とは、培養中の細胞集合において、細胞層の厚みの平均値が、１つ分の細胞の厚みの平均値の５倍未満、好ましくは２倍未満、より好ましくは１．５倍未満の状態をいう。１つ分の細胞の厚みの平均値、及び細胞層の厚みの平均値は、培養中の細胞集合から無作為に抽出された１０箇所以上における算術平均として求められる。
細胞の状態、すなわち多能性幹細胞であるか神経幹細胞であるかによって、多少の差異が生じる場合があるが、略単層状態の条件が好ましい。また、観察条件、例えば位相差観察か蛍光観察かによっても、観察に適した画像の条件が多少の差異は生じる場合があるが、略単層状態の条件が好ましい。
本明細書中において「単層培養」とは、上記単層状態又は略単層状態で、細胞を培養することをいう。

以下、実施形態に係る上記の各成分について説明する。

（インスリン）
インスリンとしては、ブタ由来インスリン、ウシ由来インスリン、ヒト由来インスリン等の天然由来のインスリンであってもよい。また、前記第一培地、第二培地、第三培地において神経幹細胞誘導に使用可能な範囲において、ウシ型、ブタ型、又はヒト型等の遺伝子組換え体のインスリン等であってもよく、特にヒト型の遺伝子組換え体インスリン（リコンビナントヒトインスリン）を好適に例示することができる。
第一培地、第二培地、第三培地において、インスリンは、終濃度で、１～２０ｍｇ／Ｌ含有されてもよく、５～１５ｍｇ／Ｌ含有されてもよく、７．５～１２．５ｍｇ／Ｌ含有されてもよく、９～１１ｍｇ／Ｌ含有されてもよい。

（セレン酸）
セレン酸としては、セレン酸とその誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物を含むことができ、常法により化学合成されたセレン酸、セレン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム、亜セレン酸水素ナトリウム等を例示することができ、亜セレン酸ナトリウムが好ましい。
第一培地、第二培地、第三培地において、セレン酸は、終濃度で、１～１００ｎｍｏｌ／Ｌ含有されてもよく、５～５０ｎｍｏｌ／Ｌ含有されてもよく、１０～４０ｎｍｏｌ／Ｌ含有されてもよく、１０～２５ｎｍｏｌ／Ｌ含有されてもよい。

（塩基性線維芽細胞増殖因子）
塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）は、ＦＧＦ－２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－２）とも呼ばれる。ｂＦＧＦとしては、ブタ由来ＦＧＦ－２、ウシ由来ＦＧＦ－２、ヒト由来ＦＧＦ－２等の天然由来のＦＧＦ－２であってもよい。また、前記第一培地、第二培地、第三培地において神経幹細胞誘導に使用可能な範囲において、ウシ型、ブタ型、又はヒト型等の遺伝子組換え体のリコンビナントヒトＦＧＦ-２等であってもよく、特にヒト型の遺伝子組換え体ＦＧＦ－２（リコンビナントヒトＦＧＦ－２(ｒｈＦＧＦ－２)）を好適に例示することがでる。また、神経幹細胞誘導に使用可能な範囲において、そのアミノ酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸により置換されていたり、他のアミノ酸配列が一部挿入されていたり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸が結合していたり、あるいは糖鎖が欠失又は置換されている誘導体を含めることができる。
第一培地、第二培地、第三培地において、ｂＦＧＦは、終濃度で、０．１～２００μｇ／Ｌ含有されてもよく、１～１００μｇ／Ｌ含有されてもよく、１～５０μｇ／Ｌ含有されてもよく、３～２０μｇ／Ｌ含有されてもよい。
第二培地、第三培地にヘパラン硫酸が含有される場合、第二培地、第三培地において、ｂＦＧＦは、終濃度で、１～５０μｇ／Ｌ含有されてもよく、３～２０μｇ／Ｌ含有されてもよい。

（アスコルビン酸）
アスコルビン酸としては、アスコルビン酸の他、前記第一培地、第三培地において神経幹細胞誘導に使用可能な範囲において、アスコルビン酸２－リン酸エステル（Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸硫酸ナトリウム、リン酸アスコルビルアミノプロピル、アスコルビン酸リン酸ナトリウム等のアスコルビン酸誘導体であってもよい。
第一培地、第三培地において、アスコルビン酸は、終濃度で、０．００１～５ｇ／Ｌ含有されてもよく、０．０１～１ｇ／Ｌ含有されてもよく、０．０５～０．５ｇ／Ｌ含有されてもよく、０．０７～０．３ｇ／Ｌ含有されてもよい。

（ＴＧＦ‐β受容体阻害物質）
ＴＧＦ－β受容体阻害物質とは、ＴＧＦ－β受容体の機能を阻害する物質であり、ＴＧＦ－β受容体に作用してＴＧＦ－β受容体の機能を阻害する物質であってもよい。ＴＧＦ－β受容体は、ＴＧＦ－βのＴＧＦ－β１型受容体であってもよく、ＴＧＦ－βのＴＧＦ－β１型受容体のＡＬＫ５であってもよい。ＴＧＦ－β受容体阻害物質はＳｍａｄシグナル経路のシグナル伝達を阻害するものであってもよい。物質がＴＧＦ－β受容体の機能を阻害するかどうかは、公知の方法により評価可能である。例えば、被験物質が投与された細胞と、被験物質が投与されていない細胞とを比較し、被験物質が投与された細胞のほうが、ＴＧＦ－β受容体の機能が阻害されていた場合、当該被験物質はＴＧＦ－β受容体阻害物質であると判断できる。
ＴＧＦ－β受容体阻害物質としては、市販の化合物を用いてもよく、例えば、商品名：ＳＢ ４３１５４２（ケイマン ケミカル、分子式：Ｃ_２２Ｈ_１６Ｎ_４Ｏ_３，ＣＡＳ Ｎｏ：３０１８３６－４１－９）、商品名：Ｄ４４７６（和光純薬工業株式会社、分子式：Ｃ_２３Ｈ_１８Ｎ_４Ｏ_３，ＣＡＳ Ｎｏ：３０１８３６－４３－１）、商品名：ＬＹ２１５７２９９（和光純薬工業株式会社、分子式：Ｃ_２２Ｈ_１９Ｎ_５Ｏ，ＣＡＳ Ｎｏ：７００８７４－７２－２）などを例示できる。
第二培地、第三培地において、ＴＧＦ－β受容体阻害物質は、終濃度で、０．１～１００μｍｏｌ／Ｌ含有されてもよく、０．５～５０μｍｏｌ／Ｌ含有されてもよく、１～２０μｍｏｌ／Ｌ含有されてもよく、５～１５μｍｏｌ／Ｌ含有されてもよい。

（プロテインキナーゼＣ阻害物質）
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害物質とは、ＰＫＣの機能を阻害する物質であり、ＰＫＣに作用してＰＫＣの機能を阻害する物質であってもよい。物質がＰＫＣの機能を阻害するかどうかは、公知の方法により評価可能である。例えば、被験物質が投与された細胞と、被験物質が投与されていない細胞とを比較し、被験物質が投与された細胞のほうが、ＰＫＣの機能が阻害されていた場合、当該被験物質はＰＫＣ阻害物質であると判断できる。
ＰＫＣ阻害物質としては、市販の化合物を用いてもよく、具体的には、ミリストイル化プロテインキナーゼＣペプチドインヒビター（プロメガ社製）や、スタウロスポリン又はスタウロスポリン誘導体であるカルホスチン、４’－Ｎ－ベンゾイルスタウロスポリンや、ＧＦ１０９２０３Ｘ等のビスインドリルマレイミド類、例えば、ビスインドリルマレイミドＩ、イソキノリンスルホニル)－２－メチルピペラジン二塩酸塩 (Ｈ－７)、Ｎ－[２－(メチルアミノ)エチル]－５－イソキノリンスルホンアミド（Ｈ－８）、Ｎ－(２－アミノエチル)－５－イソキノリンスルホンアミド(Ｈ－９)などを例示できる。
第二培地、第三培地において、ＰＫＣ阻害物質は、終濃度で、０．１～１００μｍｏｌ／Ｌ含有されてもよく、０．５～５０μｍｏｌ／Ｌ含有されてもよく、１～１０μｍｏｌ／Ｌ含有されてもよく、１．５～５μｍｏｌ／Ｌ含有されてもよい。

（ヘパラン硫酸）
ヘパラン硫酸としては、ウロン酸とD-グルコサミンの重合体のグリコサミノグリカンであり、抗血液凝固作用を有する因子であるヘパリンを挙げることができ、天然物、合成品にかかわらず、前記第二培地、第三培地において神経幹細胞誘導に使用可能な範囲において、ヘパラン硫酸の誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物を含むことができ、常法により化学合成されたヘパリンナトリウム塩やヘパリンカルシウム塩を好適に例示することができる。
第二培地、第三培地において、ヘパラン硫酸は、終濃度で、１０～５００００μｇ／Ｌ含有されてもよく、３０～１０００μｇ／Ｌ含有されてもよく、５０～５００μｇ／Ｌ含有されてもよく、８０～２００μｇ／Ｌ含有されてもよい。

（基礎培地）
実施形態に用いられる基礎培地としては、第一培地及び第二培地に配合されて、多能性幹細胞から神経幹細胞を誘導できる培地であり、第三培地に配合されて、神経幹細胞を培養できる培地であれば特に制限されないが、１又は２種類以上の糖（類）と、１又は２種類以上の無機塩（類）、１又は２種類以上のアミノ酸（類）、１又は２種類以上のビタミン（類）、及び１又は２種類以上の微量成分（類）を含むことが好ましく、また、薬剤感受性試験に使用するためにカナマイシン等の抗生物質を適宜含むこともできる。

上記糖類としては、具体的には、グルコース、ラクトース、マンノース、フルクトース、ガラクトース等の単糖類や、スクロース、マルトース、ラクトース等の二糖類を挙げることができるが、中でもグルコースが使用されてもよく、これら糖類は、基礎培地に１又は２以上含まれていてもよい。

上記無機塩類としては、具体的には、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、硫酸銅五水和物、硝酸鉄（ＩＩＩ）九水和物、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物、塩化マグネシウム六水和物、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム二水和物、硫酸亜鉛七水和物を含む組合せを挙げることができ、これら無機塩類は、基礎培地に１又は２以上含まれていてもよい。

上記アミノ酸類としては、具体的には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シスチン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン等の好ましくはＬ－体のアミノ酸とそれらの誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物を含めることができ、例えば、上記アルギニンとしては、Ｌ－塩酸アルギニン、Ｌ－アルギニン一塩酸塩等のアルギニンの派生物を含めることができ、上記アスパラギン酸としては、Ｌ－アスパラギン酸ナトリウム塩一水和物、Ｌ－アスパラギン酸一水和物、Ｌ－アスパラギン酸カリウム、Ｌ－アスパラギン酸マグネシウム等のアスパラギン酸の派生物を含めることができ、上記システインとしては、Ｌ－システイン二塩酸塩、Ｌ-システイン塩酸塩一水和物等のシステインの派生物や、Ｌ－リジン塩酸塩等のリジンの派生物を含めることができ、上記グルタミン酸としては、Ｌ－グルタミン酸一ナトリウム塩等のグルタミンの派生物を含めることができ、上記アスパラギンとしては、Ｌ－アスパラギン一水和物等のアスパラギンの派生物を含めることができ、上記チロシンとしては、Ｌ－チロシン二ナトリウム二水和物等のチロシンの派生物を含めることができ、上記ヒスチジンとしては、ヒスチジン塩酸塩、ヒスチジン塩酸塩一水和物等のヒスチジンの派生物を含めることができ、上記リジンとしては、Ｌ－リジン塩酸塩等のリジンの派生物を含めることができる。これらアミノ酸類は、基礎培地に１又は２以上含まれていてもよい。

上記ビタミン類としては、具体的には、アスコルビン酸、ビオチン、コリン、葉酸、イノシトール、ナイアシン、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）から選択される１以上のビタミン類と、これらの成分各々の誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物を含めることができ、例えば、上記アスコルビン酸としては、アスコルビン酸２－リン酸エステル（Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸硫酸ナトリウム、リン酸アスコルビルアミノプロピル、アスコルビン酸リン酸ナトリウム等のアスコルビン酸の派生物を含めることができ、コリンとしては、塩化コリン等のコリンの派生物を含めることができ、ナイアシンとしては、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ニコチニックアルコール等のナイアシンの派生物を含めることができ、パントテン酸としては、パントテン酸カルシウム、パントテン酸ナトリウム、パンテノール等のパントテン酸の派生物を含めることができ、ピリドキシンとしては、ピリドキシン塩酸塩、ピリドキサール塩酸塩、リン酸ピリドキサール、ピリドキサミン等のピリドキシンの派生物を含めることができ、チアミンとしては、塩酸チアミン、硝酸チアミン、硝酸ビスチアミン、チアミンジセチル硫酸エステル塩、塩酸フルスルチアミン、オクトチアミン、ベンフォチアミン等のチアミンの派生物等を含めることができる。これらビタミン類は、基礎培地に１又は２以上含まれていてもよい。

基礎培地には上記アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体が含まれていてもよい。しかし一方で、第一サプリメント及び第三サプリメントは、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含むこと、更には、第二サプリメント及び第二培地にはアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体が含まれていないことが好ましいことから、基礎培地には上記アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体が含まれていないことが好ましい。

上記微量成分としては、グルタチオン、ヒポキサンチン、リポ酸、リノレン酸、フェノールレッド、プトレシン、ピルビン酸、チミジン、ＮａＨＣＯ_３等通常培地成分として用いられている成分及びその誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物を含めることができ、例えば、プトレシン二塩酸、ピルビン酸ナトリウム等を挙げることができる。これら微量成分は、基礎培地に１又は２以上含まれていてもよい。

上記基礎培地の具体例としては、市販のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆ１２培地等の公知の化学合成培地などの培地、ＲＤ培地（ＲＰＭＩ１６４０培地とＤＭＥＭを１：１で混合した培地）、及びＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＤＭＥＭとＦ１２培地を１：１で混合した培地）等が挙げられ、これらの培地のいずれか２以上を適当な割合で混合した培地であってもよい。基礎培地は多能性幹細胞用培地であることが好ましい。多能性幹細胞用培地とは、必要により未分化を維持するための添加因子が添加されて、多能性幹細胞の未分化性を維持して増殖培養可能な培地のことをいう。好ましい多能性幹細胞用培地の例として、後述の実施例に示す基礎培地（ｍＥＳＦ）の他、ｈＥＳＦ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を例示できる。

前記第一サプリメント、第二サプリメント、第三サプリメントにおいて、インスリン、セレン酸、塩基性線維芽細胞増殖因子、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体、ヘパラン硫酸の各成分が重複して配合されている場合があるが、これら各成分は各サプリメント間で互いに同一のものであってもよく、異なるものであってもよい。

前記第一培地、第二培地、第三培地において、基礎培地が重複して配合されているが、これら基礎培地は、各培地間で互いに同一のものであってもよく、異なるものであってもよい。

前記神経幹細胞誘導用培地キットが備える基礎培地は、１種類であってもよく、複数種類であってもよい。基礎培地を複数種類備える場合の一例として、各サプリメントに対して、夫々の混合用の基礎培地を備えることが挙げられる。例えば、神経幹細胞誘導用培地キットが、サプリメントとして、第一サプリメントと、第二サプリメントと、第三サプリメントとを備える場合、前記基礎培地は、第一サプリメントと混合される第一の基礎培地と、第二サプリメントと混合される第二の基礎培地と、第三サプリメントと混合される第三の基礎培地とを有してもよい。

上記に挙げた第一サプリメント、第一培地、第二サプリメント、第二培地、第三サプリメント、及び第三培地は、アルブミンを含まないことが好ましい。従来、神経幹細胞誘導培地は、アルブミンを２０００ｍｇ／Ｌ程度含むことが通常である。一方、本実施形態の上記培地は、アルブミンを含まずとも良好な神経幹細胞の誘導が達成可能である。
第一培地、第二培地、及び第三培地は、アルブミンの含有量が０～１０００ｍｇ／Ｌであってもよく、０～１００ｍｇ／Ｌであってもよく、０～２０ｍｇ／Ｌであってもよく、アルブミンを実質的に含まなくともよい。
アルブミンとしては、卵白アルブミン、ブタ由来アルブミン、ウシ由来アルブミン、ヒト由来アルブミン等の天然由来のアルブミンや、アニマルプロダクトフリーグレードのアルブミンとしてウシ型、ブタ型、又はヒト型等の遺伝子組換え体のアルブミンなどが挙げられる。
培地のアルブミンの量が低減されていることで、培地の吸光度の値を低くすることができるので、培地成分が画像取得に影響するおそれが少なく、安定した観察が可能となり、イメージングにも適する。

上記に挙げた第一サプリメント、第一培地、第二サプリメント、第二培地、第三サプリメント、及び第三培地は、２－メルカプトエタノール（２－ＭＥ）を含まないことが好ましい。従来、幹細胞の培養に用いられる培地は、２－ＭＥを含むことがある。一方、本実施形態の上記培地は、２－ＭＥを含まないことで、より良好な神経幹細胞の誘導が達成可能である。
第一培地、第二培地、及び第三培地は、２－ＭＥの含有量が０～５μｍｏｌ／Ｌであってもよく、０～１μｍｏｌ／Ｌであってもよく、０～０．１μｍｏｌ／Ｌであってもよく、２－ＭＥを実質的に含まなくともよい。
培地の２－ＭＥの量が低減されていることで、より良好な神経幹細胞の誘導につながる。

上記に挙げた第一サプリメント、第一培地、第二サプリメント、第二培地、第三サプリメント、及び第三培地は、トランスフェリンを含まないことが好ましい。従来の培地は、トランスフェリンを含むことがある。一方、本実施形態の上記培地は、トランスフェリンを含まないことで、より良好な神経幹細胞の誘導が達成可能である。
第一培地、第二培地、及び第三培地は、トランスフェリンの含有量が０～２００ｍｇ／Ｌであってもよく、０～１００ｍｇ／Ｌであってもよく、０～１０ｍｇ／Ｌであってもよく、トランスフェリンを実質的に含まなくともよい。
培地のトランスフェリンの量が低減されていることで、より良好な神経幹細胞の誘導につながる。

上記に挙げた第一サプリメント、第一培地、第二サプリメント、第二培地、第三サプリメント、及び第三培地は、エタノールアミンを含まないことが好ましい。従来の培地は、エタノールアミンを含むことがある。一方、本実施形態の上記培地は、エタノールアミンを含まないことで、より良好な神経幹細胞の誘導が達成可能である。
第一培地、第二培地、及び第三培地は、エタノールアミンの含有量が０～１００μｍｏｌ／Ｌであってもよく、０～５０μｍｏｌ／Ｌであってもよく、０～２０μｍｏｌ／Ｌであってもよく、エタノールアミンを実質的に含まなくともよい。
培地のエタノールアミンの量が低減されていることで、より良好な神経幹細胞の誘導につながる。

第一サプリメントは、有効成分として、インスリン、セレン酸、塩基性線維芽細胞増殖因子、及びアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体からなるものであってもよい。
第一サプリメントは、有効成分として、インスリン、セレン酸、塩基性線維芽細胞増殖因子、及びアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体からなり、さらに溶媒を含むものであってもよい。
第二サプリメントは、有効成分として、インスリン、セレン酸、塩基性線維芽細胞増殖因子、ＴＧＦ－β受容体阻害物質、及びプロテインキナーゼＣ阻害物質からなるものであってもよい。
第二サプリメントは、有効成分として、インスリン、セレン酸、塩基性線維芽細胞増殖因子、ＴＧＦ－β受容体阻害物質、及びプロテインキナーゼＣ阻害物質からなり、さらに溶媒を含むものであってもよい。第二サプリメントは、さらに有効成分としてヘパラン硫酸を含んでもよい。
第三サプリメントは、有効成分として、インスリン、セレン酸、塩基性線維芽細胞増殖因子、ＴＧＦ－β受容体阻害物質、プロテインキナーゼＣ阻害物質、及びアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体からなるものであってもよい。
第三サプリメントは、有効成分として、インスリン、セレン酸、塩基性線維芽細胞増殖因子、ＴＧＦ－β受容体阻害物質、プロテインキナーゼＣ阻害物質、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体からなり、さらに溶媒を含むものであってもよい。第三サプリメントは、さらに有効成分としてヘパラン硫酸を含んでもよい。
有効成分とは、本実施形態の培地に配合されて、神経幹細胞の誘導又は神経幹細胞の維持に寄与する成分である。
溶媒としては、水、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒が挙げられる。

第一培地、第二培地、及び第三培地の吸光度は、３５０～７００ｎｍの波長における吸光度の最大値が０．７以下であってよく、０．６以下であってよく、０．５以下であってよい。
第一培地、第二培地、及び第三培地の吸光度は、５００～７００ｎｍの波長における吸光度の最大値が０．７以下であってよく、０．６以下であってよく、０．５以下であってよい。

第一培地と、第二培地又は第三培地と、の３５０～７００ｎｍの波長における吸光度の最大値の差は、０．４以下であってよく、０．３以下であってよく、０．２以下であってよい。

培地の吸光度は、純水を対照として測定し、市販の分光光度計により測定できる。

従来神経幹細胞の誘導に使用されている培地では、非常に多種多様な成分が配合されており、それらが培地の吸光度の値を高め、イメージング画像の取得の障害となる場合があった。また、神経幹細胞の誘導に用いる一連の培地の吸光度の値が一定でなく、安定した条件での画像の取得が困難となる場合があった。
一方、上記に挙げたサプリメントが基礎培地に添加された培地は、従来の神経幹細胞の誘導に使用されている培地成分と比べて、非常にシンプルな組成でありながら、神経幹細胞の誘導に用いることができる。尚且つ、シンプルな組成であるため、培地成分が画像取得に影響するおそれが少なく、イメージング画像を高精度に取得することも可能である。
更には、神経幹細胞の誘導に用いる第一～第三培地の吸光度の値がほぼ一定であるので、安定した条件での画像の取得が可能である。また、シンプルな組成であるため、スクリーニング等に用いられた場合の被験物質の影響が検出されやすく、再現性の高い被験物質のアッセイが可能である。

多能性幹細胞は、前記第一培地を用いて培養され、その後当該培養された細胞を、前記第二培地を用いて培養されて、神経幹細胞に分化誘導できる。

第一サプリメントに含まれる各成分は、多能性幹細胞の未分化性をある程度維持したまま、多能性幹細胞を神経幹細胞へと分化誘導する前処理の培養に使用できる。また、第一サプリメントに含まれるアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体の作用により、播種作業、継代作業による細胞のダメージを低減させ、低い致死率で細胞を分化誘導できる。

第二サプリメントに含まれる各成分は、多能性幹細胞を神経幹細胞へと分化誘導する培養に使用できる。第二サプリメントには、上記に挙げた第一サプリメントの各成分の他に、ＴＧＦ－β受容体阻害物質、及びプロテインキナーゼＣ阻害物質を含む。ＴＧＦ－β受容体阻害物質、プロテインキナーゼＣ阻害物質は、神経幹細胞への分化に作用するものと考えられる。

なお、第二サプリメント及び第二培地は、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含まないことが好ましい。第二サプリメント又は第二培地は、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含まないことで、神経幹細胞の分化誘導効率を向上可能である。

第二培地を用いて培養された多能性幹細胞は、第三培地を用いてさらに培養されてもよい。
第三サプリメントは、神経幹細胞の継代用培地用のサプリメントとして提供されていもよい。第三培地は、神経幹細胞の継代用培地として提供されていもよい。
第三培地の第三サプリメントに含まれるアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体の作用により、播種作業、継代作業による細胞のダメージを低減させ、低い致死率で神経幹細胞を維持できる。

≪神経幹細胞の製造方法≫
本実施形態の神経幹細胞の製造方法は、多能性維持培養工程と、第一培養工程と、第二培養工程と、第三培養工程とを含む。
本実施形態の神経幹細胞の製造方法は、多能性維持培養工程、第一培養工程、第二培養工程、第三培養工程の順に行う。
図１に示すように、多能性幹細胞は第一培養工程及び第二培養工程を経て神経幹細胞に分化誘導され、神経幹細胞を製造できる。当該多能性幹細胞及び神経幹細胞は、略単層状態の状態とすることが可能である。
製造された神経幹細胞を継代する場合などには、第三培養工程及び第二培養工程を経て、神経幹細胞を維持培養できる。

本明細書において、「多能性幹細胞」とは、少なくとも神経幹細胞に分化できる未分化性を備えた未分化細胞であればよい。多能性幹細胞はヒトの多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞としては、初期胚より単離される胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）や、胎児期の始原生殖細胞から単離される胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌｓ：ＥＧ細胞）（例えばProc Natl AcadSci U S A. 1998, 95:13726-31参照）や、出生直後の精巣から単離される生殖細胞系列幹細胞（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＧＳ細胞）（例えば、Nature. 2008, 456:344-9参照）や、腸骨骨髄、顎骨骨髄等の骨髄由来の幹細胞、脂肪組織由来の幹細胞などの間葉系幹細胞、及び皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子を導入することで、被検体自身の体細胞の脱分化を誘導し、ＥＳ細胞同様の多能性を有する体細胞由来人工多能性幹細胞（若しくは、誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞））を挙げることができるが、具体的には、ヒトＥＳ細胞Ｈ１株（ＷＡ０１）（ウィスコンシン大学樹立、ＷＩＳＣ Ｂａｎｋより分譲可能）、ヒトＥＳ細胞Ｈ９株（ＷＡ０９）（ウィスコンシン大学、ＷＩＳＣ Ｂａｎｋより分譲可能）、や、ＫｈＥＳ－１株、ＫｈＥＳ－２株及びＫｈＥＳ－３株（いずれも京大再生研付属幹細胞医学研究センター樹立、理化学研究所バイオリソースセンターセルバンクより分譲可能）や、ＨＥＳ３株、ＨＥＳ４株、及びＨＥＳ６株（モナッシュ大学樹立、ＷＩＳＣ Ｂａｎｋより分譲可能）などのヒトＥＳ細胞や、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、Ｃ－Ｍｙｃ遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（京都大学ｉＰＳ細胞研究所）や、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Nat Biotechnol 2008; 26: 101-106）（京都大学ｉＰＳ細胞研究所）、２０１Ｂ７株（ＨＰＳ００６３）（京都大学ｉＰＳ細胞研究所樹立、理化学研究所バイオリソースセンターセルバンクより分譲可能）、２０１Ｂ２株（京都大学iPS細胞研究所樹立）、２５３Ｇ１株（ＨＰＳ０００２） （京都大学ｉＰＳ細胞研究所樹立、理化学研究所バイオリソースセンターセルバンクより分譲可能）、ｉＰＳ－ＴＩＧ－１２０－４ｆ１株（ＪＣＲＢ１３４１）（京都大学ｉＰＳ細胞研究所樹立、医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンクより分譲可能）、ｉＰＳ－ＴＩＧ１１４－４ｆ１株（ＪＣＲＢ１４３７）（京都大学ｉＰＳ細胞研究所樹立、医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンクより分譲可能）、Ｔｉｃ（ＪＣＲＢ１３３１）株、Ｄｏｔｃｏｍ株（ＪＣＲＢ１３２７)、Ｓｑｕｅａｋｙ（ＪＣＲＢ１３２９）株、及びＴｏｅ株（ＪＣＲＢ１３３８)、 Ｌｏｌｌｉｐｏｐ（ＪＣＲＢ１３３６株)（以上成育医療センター樹立、医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンクより分譲可能）や、ＵＴＡ－１株（東京大学樹立）及びＵＴＡ－１－ＳＦ－２－２株（東京大学樹立、医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンクより分譲可能）、ｉＰＳ ＤＦ１９－９－７Ｔ株（ウィスコンシン大学樹立、ＷＩＳＣ Ｂａｎｋより分譲可能）等のｉＰＳ細胞を例示することができる。
本明細書において「培養」とは、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で細胞を生育させることをいう。培地を用いて細胞を培養することとは、培地中で細胞を培養することや、培地上で細胞を培養することなど、培地と細胞とが接触した状態で、細胞を培養することをいう。
培地は、液状の他、ゲル状であってもよく、液状であってもよい。

以下、実施形態の神経幹細胞の製造方法における、各工程について説明する。

（多能性維持培養工程）
多能性維持培養工程は、多能性幹細胞を、多能性維持培地を用いて培養する工程である。多能性維持培地は、多能性幹細胞を、少なくとも神経幹細胞に分化できる未分化性を備えた状態で培養可能な培地である。係る培地は、従来公知の多能性幹細胞の培養に用いられる培地を用いることができる。
多能性維持培地としては、従来報告されているものや、市販のものを用いることができ、ｈＥＳＦ９培地や（既報：doi: 10.1073/pnas.0806136105、特許第５２２７３１８号公報）、ｈＥＳＦ９ａ培地（既報：Stem Cell Res. 2010 Sep;5(2):157-69. doi: 10.1016/j.scr.2010.06.002）、ｈＥＳＦ９ａ２ｉ培地（既報：PLoS One. 2013; 8(1): e54122.Published online 2013 Jan 21.doi:10.1371/journal.pone.0054122）、ｈＥＳＦ－ＦＸ培地（既報：国際公開第2012/104936号「ヒト多能性幹細胞の培養方法」）、ＴｅＳＲ―Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）、ｈＰＳＣ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ＤＸＦ等が挙げられる。

図２は、多能性維持培養工程の手順を示す模式図である。まず、冷凍保存された未分化細胞を公知の方法により調整した後に、アクチビンＡを含むｈＥＳＦ－ＦＸ培地[ｈＥＳＦ－ＦＸ（＋Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ）培地]（多能性維持培地）に播種して培養する。ｈＥＳＦ－ＦＸ（＋Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ）培地での培養開始から２～３日目に、ｈＥＳＦ－ＦＸ培地にアクチビンＡが添加されていないｈＥＳＦ－ＦＸ（－Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ）培地（多能性維持培地）へと培地交換を行い、細胞を培養する。培養開始から５～６日目に培地交換を行い、ひきつづきｈＥＳＦ－ＦＸ（－Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ）培地で培養を行う。
多能性維持培養工程によれば、少なくとも神経幹細胞に分化できる未分化性を備えた状態で多能性幹細胞を培養できる。また、多能性幹細胞の供給元で調整された培地成分が洗浄される。

前記調整の方法としては、例えば、１）前記多能性維持培養工程で培養された多能性幹細胞を、ダルベッコのＣａ^２＋及びＭｇ^２＋不含リン酸緩衝生理食塩水に溶解したＥＤＴＡ中で遊離する方法や、２）トリプシン、遺伝子組換体トリプシン、トリプシン／ＥＤＴＡ、コラゲナーゼ、コラゲナーゼ／トリプシン、ディスパーゼ、アキュターゼ、あるいは、機械的に剥離させ、該遊離された細胞を上記第一培地に回収して細胞懸濁液を調製し、かかる細胞懸濁液を３００～１０００ｒｐｍ程度にて細胞を沈降させて回収後、細胞懸濁液を再び調製することを１又は複数回繰り返す方法、３）ゼラチン被覆プレート上に、ウシ胎仔血清、ＤＭＥＭ又はＤＭ／Ｆ１２に、ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、ＧＩＢＣＯ社製）、Ｌ－グルタミン、２－メルカプトエタノール、非必須アミノ酸（類）、及びｂＦＧＦを補充した培地、及び／又は支持細胞（フィーダー細胞）共存下で培養する方法等を挙げることができる。

（第一培養工程・第二培養工程）
本実施形態の第一培養工程は、前記多能性維持培養工程で得られた多能性幹細胞を、第一培地を用いて培養する工程である。
本実施形態の第二培養工程は、前記第一培養工程で培養された細胞を、前記第二培地を用いて培養し、神経幹細胞を得る工程である。
図３は第一培養工程及び第二培養工程の手順を示す模式図である。前記多能性維持培養工程で培養された後、多能性幹細胞は第一培地に播種される。播種に先立ち、前記多能性維持培養工程で培養された多能性幹細胞は、公知の方法により調整されることが好ましい。前記調整の方法としては、前記多能性維持培養工程において説明したものが挙げられる。第一培地としては、上記に例示した、実施形態の前記第一培地が挙げられる。
播種後、第一培地での培養開始から２日目に培地交換を行い、再び第二培地で細胞を培養する。ここでの培地交換は、第一培地から第二培地への交換である。第二培地としては、上記に例示した、実施形態の前記第二培地が挙げられる。次いで、第二培地での培養開始から３日後に培地交換を行い、ひきつづき第二培地で細胞を培養する。培地交換後にさらに２～４日培養を継続すると、多能性幹細胞から神経幹細胞が得られる。
第一培養工程及び第二培養工程によれば、未分化細胞から神経幹細胞を製造できる。

（第三培養工程・第二培養工程）
上記の第二培養工程で得られた神経幹細胞は、さらに継代して維持させたり、増殖させたりすることができる。
本実施形態の第三培養工程は、前記第二培養工程で培養された神経幹細胞を、第三培地を用いて培養する工程である。本実施形態の第三培養工程は、前記第二培養工程で培養された神経幹細胞を、第三培地を用いて継代培養する工程でもある。
図４は第三培養工程及び第二培養工程の手順を示す模式図である。前記第三培養工程で培養された後、得られた神経幹細胞は、第三培地に播種される。播種に先立ち、前記第三培養工程で培養された神経幹細胞は、公知の方法により調整されることが好ましい。前記調整の方法としては、前記多能性維持培養工程において説明したものが挙げられる。第三培地としては、上記に例示した、実施形態の前記第三培地が挙げられる。
播種後、第三培地での培養開始から２日目に培地交換を行い、第二培地で細胞を培養する。ここでの培地交換は、第三培地から第二培地への交換である。次いで、第二培地での培養開始から３日後に培地交換を行い、ひきつづき第二培地で細胞を培養する。
第三培養工程及び第二培養工程によれば、神経幹細胞を継代して維持させたり、増殖させたりすることができる。
図１に示すように、第一培養工程及び第二培養工程を経た後には、第三培養工程及び第二培養工程を繰り返し行い、神経幹細胞の培養を継続できる。
第二培養工程の後、神経幹細胞は、凍結保存等の公知の方法で保存してもよい。

本実施形態において、培養される細胞は、上記のいずれの工程においても、３３～４０℃、好ましくは３４～３９℃、特に好ましくは３７℃にて、１～２０％、好ましくは３～１５％、特に好ましくは８～１０％の二酸化炭素の存在下で、７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９５％、特に好ましくは１００％の高湿度下で培養されることが好ましい。

本実施形態において、培養される細胞は、単層培養されてよい。単層培養は二次元細胞培養ともいう。細胞を単層培養する方法としては、内壁が細胞接着分子でコートされた培養容器で細胞を培養する方法が挙げられる。細胞接着分子としては、フィブロネクチン、ポリリジン、ヒアルロン酸、ラミニン、コラーゲン、ビトロネクチン、エラスチン等が挙げられ、１又は２種以上の細胞接着分子を組み合わせて用いてもよい。
単層培養は上記の各工程で行うことが好ましく、以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれか一以上の条件で培養を行ってもよい。
（Ａ）前記第一培養工程において、前記多能性幹細胞を単層培養する。
（Ｂ）前記第二培養工程において、前記第一培養工程で培養された細胞を単層培養する。
（Ｃ）前記第三培養工程において、前記第二培養工程で得られた神経幹細胞を単層培養する。

本実施形態に係る神経幹細胞の製造方法は、下記のイメージング工程を更に含んでもよい。本実施形態に係る神経幹細胞の製造方法は、上記第一～第三培養工程が、下記のイメージング工程を更に含んでもよい。
イメージング工程：前記第一培地、第二培地、又は第三培地にて培養中の細胞の画像を取得するイメージング工程。

本実施形態に係る神経幹細胞の製造方法は、イメージング工程として、例えば、以下に示す工程（ｉ１）～（ｉ３）のいずれか１又は２以上を含んでもよい。
工程（ｉ１）前記第一培養工程において、前記第一培地にて培養中の細胞の画像を取得する第一イメージング工程。
工程（ｉ２）前記第二培養工程において、前記第二培地にて培養中の細胞の画像を取得する第二イメージング工程。
工程（ｉ３）前記第三培養工程において、前記第三培地にて培養中の細胞の画像を取得する第三イメージング工程。

本実施形態に係る神経幹細胞の製造方法は、前記工程（ｉ１）～（ｉ３）のいずれか２以上を含むことが好ましい。例えば、工程（ｉ１）並びに工程（ｉ２）及び／又は工程（ｉ３）を含んでもよい。本実施形態に係る第一～第三培地は、吸光度のばらつきが低減されているので、前記工程（ｉ１）～（ｉ３）のいずれか２以上を含んだ場合でも、安定した画像の取得が可能である。

画像は光学的に取得することが好ましい。一例として、波長が３５０～７００ｎｍの光を含む画像を取得することが好ましく、波長が５００～７００ｎｍの光を含む画像を取得することが好ましく、波長が６００～７００ｎｍの光を含む画像を取得することが好ましい。
実施例において示されるように、本実施形態に係る培地は、３５０～７００ｎｍの波長の領域全体にわたり、従来の培地よりも吸光度が低減されている。そのため、幅広い波長の光を含む画像データを安定的に取得できる。また、本実施形態に係る培地は、３５０～５００ｎｍの波長の領域で、従来の培地よりも顕著に吸光度が低減され、３５０～４００ｎｍの波長の領域で吸光度が特に低減されている。そのため、一例として、波長が３５０～５００ｎｍの光を含む画像を取得することが好ましく、波長が３５０～４００ｎｍの光を含む画像を取得することが好ましい。

本実施形態に係る神経幹細胞の製造方法が、イメージング工程を有することにより、上記第一～第三培養工程における細胞の状態の情報を取得でき、より精度よく神経幹細胞を製造できる。細胞の状態の情報としては、細胞形態、各種マーカー等が挙げられる。
第一培地、第二培地、又は第三培地を用いて培養中の細胞の画像を取得すると、該細胞とともに培地の画像も取得される。本実施形態に係るこれらの培地は、培地成分が画像取得に影響するおそれが少なく、安定した観察が可能となる。

細胞が未分化性を維持している細胞であるか否か、細胞が神経幹細胞としての性質を有する細胞であるか否かを確認する方法としては、各種マーカー（タンパク質）に対する抗体を用いて、未分化マーカーの発現の検出及び／又は分化マーカーの発現の不検出により判定する方法、神経細胞マーカーの発現の検出及び／又は神経細胞マーカーの発現の不検出により判定する方法、各種マーカー（遺伝子）の発現の検出により判定する方法、細胞の形態学的特徴を観察する方法や、特定の分化誘導因子の刺激により特定の細胞に分化する能力を発揮できるか否かを判定する方法を例示することができる。

上記マーカーを用いて判定する方法においては、例えば、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－２－５４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８０、ＣＤ９０、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ－３/４、アルカリホスファターゼ等の未分化マーカーが発現している場合は、細胞が未分化性を維持していると判断することができ、ＳＳＥＡ－１、ＣＤ１０５、ＣＤ５６、Ａ２Ｂ５等の分化マーカーが発現していない場合にも、細胞が未分化性を維持していると判断することができる。

上記マーカーを用いて判定する方法においては、例えば、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２等の神経幹細胞マーカーが発現している場合は、細胞が神経幹細胞に誘導されたと判断することができる。（このとき、神経幹細胞マーカーの発現の確認に加え、上記未分化マーカーが低下している、あるいは、発現していないことの確認も併せて、細胞が神経幹細胞に誘導されたと判断してもよい。）また、神経幹細胞マーカーの発現の確認に加え、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２、ＡｎｋＧ等の神経マーカーがわずかに発現していること、また、その後の培養でＴｕｊ１、ＭＡＰ２、ＡｎｋＧ等の神経マーカーが高く発現したことの確認も併せて、細胞が神経幹細胞に誘導されたと判断してもよい。

以上のように、実施形態の神経幹細胞製造方法によれば、実施形態の第一培地及び第二培地を用いて多能性幹細胞を培養することで、神経幹細胞を製造可能である。

第一培地には、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体が含まれているので、これらの作用により、播種作業、継代作業による細胞のダメージを低減させ、低い致死率で細胞を分化誘導できる。
また、第一培地で培養した後に、第二培地で培養することにより、低い致死率で細胞を分化誘導できる。ＴＧＦ－β受容体阻害物質及びプロテインキナーゼＣ阻害物質は、神経幹細胞への分化を誘導する作用が認められるが、仮に、播種作業、継代作業を経た多能性幹細胞を、第一培地を経ず直ぐに第二培地で培養した場合、ＴＧＦ－β受容体阻害物質及びプロテインキナーゼＣ阻害物質の暴露により、細胞の致死率が高まってしまう。しかし、第一培地で培養した後に、第二培地で培養することにより、良好な状態で神経幹細胞を誘導できる。

また、実施形態の神経幹細胞製造方法によれば、第三培地を用いて神経幹細胞を継代培養できる。第三培地には、第二培地の成分に加え、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体が含まれているので、これらの作用により、播種作業、継代作業による細胞のダメージを低減させ、低い致死率で細胞を継代できる。

また、本実施形態に用いられる第一培地、第二培地、第三培地の各培地によれば、光の吸収が低減されているので、精度よく細胞のイメージを取得できる。

また、本実施形態に用いられる第一培地、第二培地、第三培地の各培地によれば、細胞を単層培養した状態で、略単層状態の神経幹細胞を製造できる。
従来、神経幹細胞の誘導では、細胞を浮遊培養して胚様体や、ニューロスフェアを形成させ、神経幹細胞を誘導する方法が一般的であった、しかし、この方法によれば神経幹細胞を製造することはできるものの、培養中の細胞が凝集体を形成しているので、一つ一つの細胞を観察することは困難であった。
一方、本実施形態に用いられる各培地によれば、細胞を単層培養した状態で、略単層状態の神経幹細胞を製造できるので、精度よく個々の細胞のイメージを取得でき、細胞状態を把握できるので、効率よく神経幹細胞を製造できる。

＜培養方法＞
本発明の一実施態様における細胞培養方法として、細胞を、前記第一培地を用いて培養する細胞の培養方法を提供する。当該細胞は多能性幹細胞であってもよい。
本発明の一実施態様における細胞培養方法として、細胞を、前記第二培地を用いて培養する細胞の培養方法を提供する。
本発明の一実施態様における細胞培養方法として、細胞を、前記第三培地を用いて培養する細胞の培養方法を提供する。当該細胞は神経幹細胞であってもよい。

≪細胞培養装置≫
図５は、本実施形態の細胞培養装置の構成の一例を示す模式図である。
本実施形態の細胞培養装置１は、先に記載の実施形態の神経幹細胞の製造方法に用いることができる。
細胞培養装置１は、多能性幹細胞を培養するインキュベータ１０と、インキュベータ１０内で培養される細胞Ｃを撮像する撮像手段２０と、インキュベータ１０内の、前記第一培地Ｍ１、前記第二培地Ｍ２、前記第三培地Ｍ３を交換する培地交換手段３０と、制御装置４０とを備える。

インキュベータ１０内は、細胞の培養に適した環境に維持されている。当該環境としては、上記の神経幹細胞の製造方法で例示した条件が挙げられる。
インキュベータ１０内には、細胞を培養する培養容器１１が配置され、培養容器１１内には、細胞Ｃ（多能性幹細胞）と第一培地Ｍ１が収容されている。第一培地Ｍ１中で、多能性幹細胞である細胞Ｃを培養することで、上記実施形態の第一培養工程を実施できる。

第一培養工程において細胞を培養した後、培地交換手段３０によって、培養容器１１内の第一培地Ｍ１を第二培地Ｍ２へと交換する。培地交換手段３０は、培地吸引ノズル３１と、培地吐出ノズル３２を有しており、培地吸引ノズル３１によって培養容器１１内から第一培地Ｍ１を吸引して除去し、培地吐出ノズル３２によって培養容器１１内へと第二培地Ｍ２を供給する。すると、培養容器１１内には、第一培地Ｍ１で培養された細胞Ｃと、第二培地Ｍ２が収容される。第二培地Ｍ２中で、第一培地Ｍ１で培養された細胞Ｃを培養することで、上記実施形態の第二培養工程を実施できる。

培地交換手段３０は、細胞吸引ノズル３３をさらに有している。培養容器１１内で第二培養工程を経た細胞Ｃは、細胞吸引ノズル３３によって採取され、培養容器１２へと移送される。培養容器１２には第三培地Ｍ３が収容されている。第三培地Ｍ３中で、第二培養工程を経た細胞Ｃを培養することで、上記実施形態の第三培養工程を実施できる。

第三培養工程において細胞を培養した後、培地交換手段３０によって、培養容器１２内の第三培地を第二培地Ｍ２へと交換してもよい。交換は培地吸引ノズル３１によって培養容器１２内から第三培地を吸引して除去し、培地吐出ノズル３２によって培養容器１２内へと第二培地Ｍ２を供給する。すると、培養容器１２内には、第三培地で培養された細胞Ｃと、第二培地Ｍ２が収容されるので、これを培養することで、上記実施形態の第二培養工程を実施できる。

細胞培養装置１は、さらに制御装置４０を備えている。制御装置４０は、ＣＰＵ４１及び記憶部４２を有している。
細胞培養装置１は、撮像手段２０を備える。撮像手段２０は、顕微光学系２１及びイメージセンサ２２を備えている。イメージセンサ２２によって取得された画像データは、制御装置４０へと送られ、ＣＰＵ４１で処理され、細胞状態が判定される。
制御装置４０は培地交換手段３０と接続し、制御装置４０は、判定した細胞状態に応じて、培地交換手段３０による培地の交換動作を制御する。
イメージセンサ２２によって取得された画像データは、制御装置４０へと送られ、記憶部４２で記憶される。

本実施形態の培養装置によれば、実施形態の神経幹細胞の製造方法を実施できる。インキュベータ内で培養された細胞は、撮像手段によってイメージングされ、細胞の状態が取得及び判定されるので、適切なタイミングで培地交換を行うことができる。このとき、本実施形態に用いられる第一培地、第二培地、第三培地の各培地によれば、光の吸収が低減されているので、精度よく細胞のイメージを取得でき、高品質の神経幹細胞が効率よく得られる。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

特に記載のない限り、細胞の培養は３７℃、１０％ＣＯ_２濃度のインキュベータ内で行い、下記プレートコーティングされたプレートでの単層培養により行った。

（プレートコーティング）
特に記載のない限り、細胞の培養は、６ウェルプレート（住友ベークライト社製、型番ＭＳ－８００６０）をＰｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ（ＰＬＬ） （ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ，Ｐ４８３２，ＰＯＬＹ－Ｌ－ＬＹＳＩＮＥ５５ｎｇ／ｃｍ^２）、及び、２μｇ／ｃｍ^２ ＦＮ（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ，Ｆ１１４１－５ＭＧ，Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｐｌａｓｍａ ＞ １ｍｇ／ｍＬ）にてコーティングを行ったプレートを使用した。

（試薬類）
以下、実施例で使用した試薬は以下のとおりである。
・ｍＥＳＦ基礎培地（製造元：Ｗａｋｏ、型番：１３６‐１７８０５）
・インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｈｕｍａｎ、製造元：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、型番：Ｉ９２７８）
・トランスフェリン（Ａｐｏ－ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、製造元：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、型番：Ｔ２２５２）
・亜セレン酸ナトリウム（製造元：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、型番：Ｓ９１３３）
・エタノールアミン（２－Ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｏｌ、製造元：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ, 型番：Ｅ０１３５）
・アスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、製造元：Ｗａｋｏ、型番：０１３‐１９６４１）
・ＦＧＦ２（ｒｈＦＧＦ－２（ｂＦＧＦ）、製造元：片山化学）
・ヘパラン硫酸（Ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ， 製造元：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、 型番：Ｈ７６４０）
・ＳＢ４３１５４２（製造元：Ｔｏｃｒｉｓ、型番：１６１４）
・ＧＦ１０９２０３Ｘ（製造元：Ｔｏｃｒｉｓ、型番：０７４１）
・Ｕ０１２６（製造元：Ｐｒｏｍｅｇａ、型番：Ｖ１１２１）
・ＬＹ２９４００２（製造元：Ｗａｋｏ、型番：１２９－０４８６１）
・Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、製造元：Ｒ＆Ｄ、型番：３３８－ＡＣ）
・２－ＭＥ（２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、製造元：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、型番：Ｍ７５２２）
・ｒＨＳＡ (ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ａｌｂｕｍｉｎ、 製造元：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、型番：Ａ７７３６)
・Ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ (オレイン酸、製造元：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、型番：Ｏ１３８３)
・ＢＳＡ（製造元：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、型番：Ａ８８０６）

＜１．培地の検討＞
（サプリメント成分の検討（１））
ミニマムで必須なサプリメントのみからなる分化誘導条件を開発するために、基礎培地mESF培地に加える無血清培養条件で、添加するサプリメント7成分の組み合わせを、下記表１に示す３４条件を検討した。

上記表１で示す３４種の培地を用いて、播種濃度が均等になるよう、各培地にヒトＥＳ細胞Ｈ９を培養し、ＤＡＰＩ染色により細胞数を計測した。
結果を図６に示す。図６のグラフから明らかなように、インスリンと亜セレン酸ナトリウムの組み合わせが、ヒトＥＳ細胞Ｈ９の培養に非常に良好な結果をもたらすことが明らかとなった。

（サプリメント成分の検討（２））
次に、上記検討結果で得られたｍＥＳＦ、インスリン、及び亜セレン酸ナトリウムからなる培地（ｍＥＳＦｉｓ）に、表２に示す４条件で各種インヒビターを添加して、ヒトＥＳ細胞Ｈ９を培養し、神経細胞のマーカーであるＴｕｊ１抗体を用いて、免疫染色を行い、神経細胞への分化誘導効果を検討した。各種インヒビターは、それぞれ表２に記載の終濃度となるようｍＥＳＦｉｓに添加した。

結果を図７に示す。各種インヒビターの溶媒として用いたＤＭＳＯでも、Ｔｕｊ１陽性細胞が上昇することもあるが、ＧＦ１０９２０３ＸとＳＢ４３１５４２との組み合わせでＴｕｊ１陽性細胞数が高く、神経細胞への分化誘導効果が高かった。

（サプリメント成分の検討（３））
次に、ｍＥＳＦｉｓに添加され得る、その他の成分の影響について検討した。
表３に示す４条件でｍＥＳＦｉｓに各種成分を添加して、ヒトＥＳ細胞Ｈ９を培養し、神経細胞のマーカーであるＴｕｊ１抗体を用いて、免疫染色を行い、神経細胞への分化誘導効果を検討した。また、細胞の神経線維の長さを計測した。各種成分は、それぞれ表３に記載の終濃度となるようｍＥＳＦｉｓに添加した。

結果を図８に示す。ｍＥＳＦｉｓにトランスフェリン、エタノールアミンがあると神経線維の伸長が阻害されることが明らかとなった。ＢＳＡの影響は特に観察されなかった。ＳＢ４３１５４２とＧＦ１０９２０３Ｘとの組み合わせは、Ｔｕｊ１陽性細胞数ならびに神経線維の進展を促進することが判明した。

（サプリメント成分の検討（４））
次に、ＦＧＦ―２とＨｅｐａｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｓａｌｔ（ヘパラン硫酸ナトリウム塩）との併用について検討した。
ヒトＥＳ細胞Ｈ９を、後述の培地１において１日間培養した。その後、それぞれ表４に示す条件の培地に交換して培養を継続した。ＦＧＦ－２の０～１００ｎｇ／ｍＬとは、ＦＧＦ－２が０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、又は１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含まれるよう培地を調製した。その後、位相差生細胞画像を取得し、細胞生存率、細胞形態を判定した。

結果を図９及び図１０に示す。図の左上の数値は、培地に含まれるＦＧＦ－２の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。図９は培地がヘパラン硫酸ナトリウム塩を含まない条件（上記の表４の１）であり、図１０は、ヘパラン硫酸ナトリウム塩を含む条件（上記の表４の２）の結果である。図９及び図１０の比較から、ＦＧＦ－２とヘパラン硫酸ナトリウム塩との併用により、低濃度ＦＧＦ－２で安定に神経幹細胞分化を誘導することが出来ることが示された。

＜２．神経幹細胞の培養＞
（多能性維持培地の調整）
多能性維持培地として、培地中の濃度が下記表５に示す終濃度となるよう、ｍＥＳＦに各成分を加え、ｈＥＳＦ－ＦＸを調製した。

（第一培地、第二培地、第三培地の調整）
上記の＜１．培地の検討＞の結果を踏まえ、神経幹細胞の製造に用いる培地を調製した。
mESF基礎培地中の濃度が下記表６の終濃度となるよう、ｍＥＳＦにサプリメント成分を加えた。下記表６に示す組成でｍＥＳＦ培地に各成分が配合された、培地１（第一培地）、培地２（第二培地）、及び培地３（第三培地）を得た。

（神経幹細胞誘導）
次いで、ヒトｉＰＳ細胞Ｔｉｃ株（ＪＣＲＢ１３３１）をｈＥＳＦ－ＦＸ培地に懸濁し、コートされた前記６ウェルプレートに（播種密度０．５～５×１０^４／ウェル）で播種し、２～３日に一回の頻度でｈＥＳＦ－ＦＸ培地で培地交換を行いながら、ＥＳＦ－ＦＸ培地で７～８日間培養した。

ｈＥＳＦ－ＦＸ培地で培養された前記細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ♯ＳＦ００６）で剥離して前記フラスコから回収し、上記と同様にしてＦＮ及びＰＬＬでコートされた6ウェルプレートに播種密度０．５～５×１０^４／ウェルで播種し、培地１で２日間培養した後、培地２へ培地交換し、２～３日に一回の頻度で培地交換を行いながら、培地２で７～９日間培養した。

培地２にて培養中の細胞について、図１１に示す各種マーカーのタンパク質の発現を蛍光顕微鏡により観察した。図１１中、Ｄａｙ２が培地２で培養開始した日にあたる。
培地２での培養が進むにつれ、未分化マーカーであるＯｃｔ３／４、Ｏｔｘ２の発現が消失していった。また神経幹細胞マーカーであるＮｅｓｔｉｎ、神経マーカーであるＴｕｊ１、ＭＡＰ２、ＡｎｋＧの発現が観察された。なお、ＰＡＸ６は前方マーカーとして、ＧＦＡＰはネガティブコントロールとして用いた。
図１１に示す結果から、当該培養によって神経幹細胞が誘導できたことが示された。
また、本発明の実施形態に係る培地を用いて培養中の細胞の画像を、良好に取得できた。

上記培地２で培養された細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅで剥離してマイクロプレートから回収し、培地３に懸濁し、上記と同様にしてＦＮ及びＰＬＬでコートされた６ウェルプレートに、播種密度０．５～５×１０^４／ウェルで播種し、培地３で２日間培養した後、培地２へ培地交換し、２～３日に一回の頻度で培地交換を行いながら、培地２で８日間培養した。
培地３で細胞を播種した後に、培地２で細胞を培養することで、神経幹細胞の継代培養が可能であることが示された。

＜３．培地の吸光度＞
非特許文献３のプロトコール（ＵＫＮ １）で示されているように、未分化維持から神経細胞分化誘導の一連の工程では「ＤＭＥＭ－Ｆ１２ にＫＳＲを添加した培地」と「Ｎ２サプリメント添加培地」との組成比を各工程に応じて変えた培地が一般的に使用される事がある。これら一連の分化誘導過程において培地の上清の吸光度を、分光光度計（製造元：日本分光株式会社、機種：Ｖ－６３０、測定モード：Ａｂｓ）で測定した結果を図１２に示す。
図１２のグラフでは、各工程における培地の吸光度が大きくバラついている事が示された。これは培地成分の違いによる影響が関与しているだけではなく、培養の過程において細胞から生じる代謝物等の各種成分の違いによる影響も考えられる。顕微鏡観察においてこのような吸光度のバラつきは一定の観察条件で観察した場合に明るさが安定しないため、より吸光度のバラつきの少ない培地が望ましい。

本実施形態に係る神経幹細胞への分化誘導用のサプリメントを加えたｍＥＳＦ培地（上記の培地２）について、分化誘導過程において培地の上清の吸光度を測定した結果を図１３に示す。
本実施形態に係る培地は、図１２で示す培地と比べて吸光度のバラつきが少なく、より観察に適した培地であることが判明した。

以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、及びその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。

１…細胞培養装置、１０…インキュベータ、１１，１２…培養容器、２０…撮像手段、２１…顕微光学系、２２…イメージセンサ、３０…培地交換手段、３１…培地吸引ノズル、３２…培地吐出ノズル、３３…細胞吸引ノズル、４０…制御装置、４２…記憶部、Ｍ１…第一培地、Ｍ２…第二培地、Ｍ３…第三培地、Ｃ…細胞

Claims (17)

1. ＴＧＦ－β受容体阻害物質及びプロテインキナーゼＣ阻害物質を含み、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含まず、
   培地中の前記ＴＧＦ－β受容体阻害物質の濃度が５～１５μｍｏｌ／Ｌ、前記プロテインキナーゼＣ阻害物質の濃度が１．５～５μｍｏｌ／Ｌとなるように添加される、多能性幹細胞から神経幹細胞への分化誘導のための培地用サプリメント。
2. さらに、インスリン、セレン酸、塩基性繊維芽細胞増殖因子、及びヘパラン硫酸からなる群より選択される少なくとも一つの物質を含む、請求項１に記載の培地用サプリメント。
3. アルブミン、２－メルカプトエタノール、トランスフェリン、又はエタノールアミンを含まない、請求項１又は２に記載の培地用サプリメント。
4. アスコルビン酸及びアスコルビン酸誘導体を含まない基礎培地に添加される、請求項１～３のいずれか一項に記載の培地用サプリメント。
5. アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含む第一のサプリメントと、
   ＴＧＦ－β受容体阻害物質及びプロテインキナーゼＣ阻害物質を含み、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含まない第二のサプリメントと、
   アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体と、ＴＧＦ－β受容体阻害物質と、プロテインキナーゼＣ阻害物質と、を含む第三のサプリメントと、
   を含み、
   培地中の前記ＴＧＦ－β受容体阻害物質の濃度が５～１５μｍｏｌ／Ｌ、前記プロテインキナーゼＣ阻害物質の濃度が１．５～５μｍｏｌ／Ｌとなるように添加される、多能性幹細胞から神経幹細胞への分化誘導に用いられる培地用サプリメントのセット。
6. 前記第一のサプリメントは、さらに、インスリン、セレン酸、及び塩基性繊維芽細胞増殖因子からなる群より選択される少なくとも一つの物質を含む、請求項５に記載の培地用サプリメントのセット。
7. 前記第二のサプリメントは、さらに、インスリン、セレン酸、塩基性繊維芽細胞増殖因子、及びヘパラン硫酸からなる群より選択される少なくとも一つの物質を含む、請求項５又は６に記載の培地用サプリメントのセット。
8. 前記第三のサプリメントは、さらに、インスリン、セレン酸、塩基性繊維芽細胞増殖因子、及びヘパラン硫酸からなる群より選択される少なくとも一つの物質を含む、請求項５～７のいずれか一項に記載の培地用サプリメントのセット。
9. ５～１５μｍｏｌ／ＬのＴＧＦ－β受容体阻害物質及び１．５～５μｍｏｌ／ＬのプロテインキナーゼＣ阻害物質を含み、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含まない、多能性幹細胞から神経幹細胞への分化誘導培地。
10. さらに、インスリン、セレン酸、塩基性繊維芽細胞増殖因子、及びヘパラン硫酸からなる群より選択される少なくとも一つの物質を含む、請求項９に記載の多能性幹細胞から神経幹細胞への分化誘導培地。
11. アルブミン、２－メルカプトエタノール、トランスフェリン、又はエタノールアミンを含まない、請求項９又は１０に記載の多能性幹細胞から神経幹細胞への分化誘導培地。
12. ５～１５μｍｏｌ／ＬのＴＧＦ－β受容体阻害物質及び１．５～５μｍｏｌ／ＬのプロテインキナーゼＣ阻害物質を含み、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含まない培地を用いて、細胞を培養する工程を含み、
    前記細胞は、多能性幹細胞である、神経幹細胞の製造方法。
13. 前記培地は、さらに、インスリン、セレン酸、塩基性繊維芽細胞増殖因子、及びヘパラン硫酸からなる群より選択される少なくとも一つの物質を含む、請求項１２に記載の神経幹細胞の製造方法。
14. 前記５～１５μｍｏｌ／ＬのＴＧＦ－β受容体阻害物質及び１．５～５μｍｏｌ／ＬのプロテインキナーゼＣ阻害物質を含み、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含まない培地を用いて細胞を培養する工程の前に、アスコルン酸又はアスコルビン酸誘導体を含む培地を用いて前記細胞を培養する工程を含む、請求項１２又は１３に記載の神経幹細胞の製造方法。
15. 前記アスコルン酸又はアスコルビン酸誘導体を含む培地は、さらに、インスリン、セレン酸、及び塩基性繊維芽細胞増殖因子からなる群より選択される少なくとも一つの物質を含む、請求項１４に記載の神経幹細胞の製造方法。
16. 前記５～１５μｍｏｌ／ＬのＴＧＦ－β受容体阻害物質及び１．５～５μｍｏｌ／ＬのプロテインキナーゼＣ阻害物質を含み、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含まない培地を用いて、細胞を培養する工程の後に、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体と、ＴＧＦ－β受容体阻害物質と、プロテインキナーゼＣ阻害物質とを含む培地を用いて、前記細胞を培養する工程を含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の神経幹細胞の製造方法。
17. 基礎培地と、請求項１～４のいずれか一項に記載の培地用サプリメント、又は、請求項５～８のいずれか一項に記載の培地用サプリメントのセットと、を含む、培地キット。

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