ES2628941T3 - Medio de cultivo para la preparación de células madre neurales y utilización del mismo - Google Patents

Medio de cultivo para la preparación de células madre neurales y utilización del mismo Download PDF

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Abstract

Medio para la preparación de células madre neurales, caracterizado por que comprende: un medio básico para el cultivo de una célula madre, y un inhibidor que consiste en un inhibidor de GSK, un inhibidor de MEK, un inhibidor de TGF-b, un inhibidor de ROCK y un inhibidor de BMP.

Description

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DESCRIPCION
Medio de cultivo para la preparacion de celulas madre neurales y utilizacion del mismo SECTOR TECNICO
Las realizaciones de la presente divulgacion se refieren, en general, a un sector de la biomedicina, mas particularmente, a un medio para la preparacion de una celula madre neural y a la utilizacion del mismo.
ANTECEDENTES
Las celulas madre son una fuente inicial del ser humano y de varios tejidos y celulas del mismo, cuya caracterfstica biologica mas prominente no es solo poseer una probabilidad de autorrenovacion y proliferacion, sino que tambien poseen una probabilidad de pluripotencia. Las celulas madre se clasifican en celulas madre somaticas y celulas madre embrionarias (ES), segun las diferentes fuentes. Entre las celulas madre somaticas se incluyen las celulas madre neurales, las celulas madre mesenquimales y las celulas madre hematopoyeticas, etc. Actualmente, ademas de muchos estudios sobre las celulas madre hematopoyeticas y las celulas madre mesenquimales, tambien son relativamente profundas las investigaciones sobre las celulas madre neurales.
En 1992, Reynolds y Weiss y otros aislaron en primer lugar celulas madre neurales a partir de un cuerpo estriado de un raton adulto, que no solo poseen probabilidades de autorrenovacion, division y proliferacion, sino que tambien pueden diferenciarse en la mayorfa de tipos de celulas del sistema nervioso, que pueden responder a lesiones y enfermedades. En 1998, Okano de Japon y Goldman de la Universidad de Cornell demostraron simultaneamente la presencia de las celulas madre neurales en los tejidos de cerebro humano adulto. El documento WO2010/144696A1 da a conocer composiciones y procedimientos para producir celulas neurales a partir de celulas madre y utilizaciones de las mismas. El documento WO2010/063848A1 da a conocer un medio de cultivo que comprende un inhibidor de la via de senalizacion BMP; y un inhibidor de la via de senalizacion TGF/activina/nodal, y un procedimiento para obtener una poblacion de precursores neurales utilizando dicho medio de cultivo. La publicacion de X. Li y otros: ““ROCK” inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells”, Human reproduction, volumen 24, numero 3, 4 de diciembre de 2008, paginas 580-589, da a conocer que el tratamiento con el inhibidor Y-27632 de la quinasa asociada a Rho junto con acutasa se puede utilizar para mejorar la tasa de supervivencia despues de la descongelacion de celulas hES individuales utilizando protocolos convencionales de congelacion lenta y descongelacion rapida en condiciones de cultivo sin suero y sin alimentador. La publicacion de T. Zhou y otros: “generation of induced pluripotent stem cells from urine”, Journal of the American Society of Nephrology, Williams y Wilkins, Baltimore, mD, Estados Unidos, volumen 22, numero 7, 1 de julio de 2011, paginas 1.221 a 1.228, da a conocer un procedimiento sencillo, reproducible, no invasivo para generar iPSC humanas a partir de celulas tubulares renales presentes en la orina. Actualmente, se ha demostrado la presencia de celulas madre multipotentes en el sistema nervioso a traves de la practica gradual, a continuacion, se ha aislado con exito del mismo, lo cual aporta nuevas esperanzas para la reparacion de lesiones en el sistema nervioso y la terapia de reemplazo celular de trastornos neurodegenerativos. Dado que la caracterfstica de una neurona de no ser regenerativa y no realizar la autorreparacion ha sido un obstaculo insalvable en la ciencia medica, y debido a la vulnerabilidad de la estructura de organizacion del sistema nervioso central y la importancia de la misma en la actividad intelectual, el trastorno adicional del sistema nervioso central y las secuelas del mismo son una de las enfermedades mas cronicas que afectan a la salud humana y a la calidad de vida, el estudio de los mismos en base a celulas madre neurales se ha convertido en un tema de actualidad y se centra parcialmente en el sector de la investigacion de celulas madre, lo cual tiene una perspectiva brillante en la aplicacion clfnica.
Sin embargo, en la actualidad la investigacion relacionada con las celulas madre neurales aun debe mejorarse.
CARACTERISTICAS DE LA INVENCION
Las realizaciones de la presente divulgacion buscan resolver, como mfnimo, uno de los problemas existentes en la tecnica relacionada, como mfnimo, en cierto grado. De este modo, un proposito de la presente divulgacion es dar a conocer medios para la preparacion eficaz de una celula madre neural.
La presente invencion se refiere a un medio para la preparacion de celulas madre neurales, segun la reivindicacion 1. Por consiguiente, el medio comprende: un medio basico para el cultivo de celulas madre y un inhibidor que consiste en un inhibidor de GSK, un inhibidor de MEK, un inhibidor de TGF-b, un inhibidor de ROCK y un inhibidor de BMP. Los inventores de la presente divulgacion han descubierto que utilizando el medio para el cultivo de celulas somaticas, en particular, celulas somaticas que expresan factores de regulacion de la transcripcion, se pueden transdiferenciar de manera eficaz las celulas somaticas en celulas madre neurales (en el presente documento tambien conocidas como “celulas madre neurales inducidas”), mediante lo cual se pueden acortar ampliamente los tiempos para la transdiferenciacion.
Tambien se da a conocer un kit para la preparacion de una celula madre neural, el kit puede incluir el medio mencionado anteriormente. Los inventores de la presente divulgacion han descubierto que utilizando el kit para el
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cultivo de celulas somaticas, en particular, celulas somaticas que expresan factores de regulacion de la transcripcion, se pueden transdiferenciar de manera eficaz las celulas somaticas en celulas madre neurales, lo que puede acortar ampliamente los tiempos para la transdiferenciacion.
Tambien se da a conocer la utilizacion del kit mencionado anteriormente en la preparacion de una celula madre neural. Utilizando el kit, segun las realizaciones de la presente divulgacion, se pueden cultivar de manera eficaz celulas somaticas, en particular, celulas somaticas que expresan factores de regulacion de la transcripcion, que pueden posteriormente transdiferenciar de manera eficaz las celulas somaticas en celulas madre neurales en un tiempo muy acortado.
Tambien se da a conocer la utilizacion del medio mencionado anteriormente en la preparacion de una celula madre neural, que puede transdiferenciar de manera eficaz las celulas somaticas en celulas madre neurales en un tiempo muy acortado mediante el cultivo de las celulas somaticas in vitro, en particular, celulas somaticas que expresan factores de regulacion de la transcripcion.
La presente invencion se refiere, ademas, a un procedimiento para la preparacion de una celula madre neural, segun la reivindicacion 4. Por consiguiente, el procedimiento comprende: cultivar una celula somatica utilizando el medio mencionado anteriormente, en el que la celula somatica comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un factor de celulas madre pluripotentes para inducir una transdiferenciacion desde la celula somatica a la celula madre neural, siendo el factor de celula madre pluripotente, como mfnimo, uno seleccionado entre el grupo que comprende Oct4, Sox2, Klf4 y miR302 y en el que las celulas somaticas son celulas exfoliativas de orina humana. Los inventores de la presente divulgacion han descubierto que utilizando el medio, segun las realizaciones de la presente divulgacion, para cultivar las celulas somaticas que contienen la secuencia de acido nucleico del factor de celulas madre pluripotentes codificado por factores de transcripcion especfficos, se pueden transdiferenciar de manera eficaz las celulas somaticas en celulas madre neurales en un tiempo muy acortado.
Tambien se da a conocer una celula madre neural o un derivado de la misma. Segun las realizaciones de la presente divulgacion, la celula madre neural se obtiene mediante el procedimiento mencionado anteriormente. Ademas, las celulas madre neurales o derivados de las mismas, segun las realizaciones de la presente divulgacion, pueden diferenciarse de manera eficaz en celulas neurales en condiciones apropiadas.
Tambien se da a conocer la utilizacion de la celula madre neural o el derivado de la misma, mencionados anteriormente, para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inducida por el dano en celulas neurales. Dado que la celula madre neural y el derivado de la misma, segun las realizaciones de la presente divulgacion, se pueden diferenciar de manera eficaz en celulas neurales en condiciones apropiadas, la celula madre neural y el derivado de la misma pueden prepararse posteriormente como un medicamento, que puede utilizarse para el tratamiento de la enfermedad inducida por el dano en celulas neurales.
Las celulas madre neurales se pueden utilizar en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad inducida por el dano en celulas neurales. El procedimiento puede comprender: introducir la celula madre neural o el derivado de la misma, mencionados anteriormente, en un paciente. Mediante la introduccion en el paciente de la celula madre neural o el derivado de la misma, mencionados anteriormente, las celulas madre neurales pueden diferenciarse de manera eficaz en celulas neurales, que pueden curar posteriormente un dano corporal inducido por el dano en celulas neurales.
Tambien se da a conocer un procedimiento para la preparacion de una celula madre neural. El procedimiento puede comprender: cultivar la celula madre neural mencionada anteriormente en condiciones adecuadas para la diferenciacion. Utilizando el procedimiento, segun las realizaciones de la presente divulgacion, pueden diferenciarse de manera eficaz las celulas madre neurales en celulas neurales, con lo que pueden prepararse de manera eficaz las celulas neurales.
Tambien se da a conocer un sistema para la preparacion de una celula madre neural. El sistema puede comprender: un aparato de aislamiento, para aislar celulas exfoliativas de orina humana de la orina humana, un aparato de transformacion, conectado al aparato de aislamiento y equipado con un vector de una secuencia de acido nucleico que codifica un factor de celulas madre pluripotentes para transformar las celulas exfoliativas de orina humana, siendo el factor de celulas madre pluripotentes, como mfnimo, uno seleccionado entre el grupo que comprende Oct4, Sox2, Klf4 y miR302; y un aparato de transdiferenciacion, conectado al aparato de transformacion y equipado con el medio mencionado anteriormente, para someter las celulas exfoliativas de orina humana transformadas a transdiferenciacion, para inducir la transdiferenciacion de celulas exfoliativas de orina humana transformadas en celulas madre neurales. Utilizando el sistema se puede aplicar el procedimiento de manera eficaz para la preparacion de la celula neural mencionada anteriormente, con lo que pueden prepararse de manera eficaz las celulas madre neurales.
Tambien se da a conocer un procedimiento de cribado de un compuesto para inducir la diferenciacion de una celula madre neural. El procedimiento puede comprender: poner en contacto la celula madre neural mencionada anteriormente con un compuesto candidato y determinar la pluripotencia de la celula madre neural antes y despues
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Las celulas madre neurales se pueden utilizar en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa o de una enfermedad inducida por el dano en celulas neurales. El procedimiento puede comprender: aislar una celula somatica de un paciente; preparar una celula madre neural basada en la celula somatica, segun el procedimiento mencionado anteriormente; e introducir la celula madre neural en el paciente. Utilizando el procedimiento para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa o de una enfermedad inducida por el dano en celulas neurales, se pueden introducir de manera eficaz las celulas madre neurales obtenidas en un paciente, que posteriormente pueden diferenciarse de manera eficaz en celulas neuronales en el paciente y curar un dano en el organismo inducido por la neurodegeneracion y el dano en celulas neurales, con las cuales se puede tratar la enfermedad neurodegenerativa y la enfermedad inducida por el dano en celulas neurales.
Tambien se da a conocer un procedimiento para la determinacion de si un medicamento afecta al sistema nervioso. El procedimiento puede comprender: poner en contacto el medicamento con la celula madre neural, segun las realizaciones de la presente divulgacion, y determinar la celula madre neural antes y despues de la etapa de puesta en contacto del medicamento con la celula madre neural, determinando asf si el medicamento afecta al sistema nervioso basandose en un cambio de la celula madre neural. Utilizando el procedimiento se puede determinar de manera eficaz si el medicamento afecta al sistema nervioso.
Los aspectos y ventajas adicionales de las realizaciones de la presente divulgacion se proporcionan, en parte, en las siguientes descripciones, seran evidentes, en parte, a partir de las siguientes descripciones o se aprenderan a partir de la practica de las realizaciones de la presente divulgacion.
DESCRIPCION BREVE DE LOS DIBUJOS
Estos y otros aspectos y ventajas de las realizaciones de la presente divulgacion seran evidentes y se entenderan mas facilmente a partir de las siguientes descripciones realizadas con referencia a los dibujos adjuntos, en los que: la figura 1 es un diagrama de flujo que muestra un procedimiento para la preparacion de una celula madre neural, segun una realizacion de la presente divulgacion;
la figura 2 es un diagrama esquematico que muestra un sistema para la preparacion de una celula madre neural, segun una realizacion de la presente divulgacion;
la figura 3 es un diagrama de flujo que muestra un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa o de una enfermedad inducida por el dano en celulas neurales, segun una realizacion de la presente divulgacion;
la figura 4 es una imagen que muestra la morfologfa celular de diferentes fases durante la induccion de celulas madre neurales inducidas, segun una realizacion de la presente divulgacion;
la figura 5 es una imagen que muestra un nivel de expresion de un gen marcador en celulas madre neurales en celulas madre neurales inducidas determinado mediante inmunofluorescencia y PCR en tiempo real, segun una realizacion de la presente divulgacion; y
la figura 6 es una imagen que muestra las expresiones de diferentes marcadores especfficos para diferentes tipos de neuronas y celulas de la neuroglia entre productos de diferenciacion in vitro que derivan de celulas madre neurales inducidas determinadas mediante inmunofluorescencia, segun una realizacion de la presente divulgacion.
DESCRIPCION DETALLADA
Se hara referencia en detalle a realizaciones de la presente divulgacion. Las realizaciones descritas en el presente documento con referencia a los dibujos son explicativas, ilustrativas y se utilizan para entender, en general, la presente divulgacion. Las realizaciones no se interpretaran como limitativas de la presente divulgacion. Los mismos elementos o elementos similares y los elementos que tienen las mismas funciones o funciones similares se designan mediante numeros de referencia del mismo tipo a lo largo de las descripciones.
La presente invencion se refiere a un medio para la preparacion de una celula madre neural, caracterizado por que comprende: un medio basico para el cultivo de celulas madre y un inhibidor que consiste en un inhibidor de GSK, un inhibidor de MEK, un inhibidor de TGF-b, un inhibidor de ROCK y un inhibidor de BMP. Los inventores de la presente divulgacion han descubierto que utilizando el medio para el cultivo de celulas somaticas, en particular, celulas somaticas que expresan factores de regulacion de la transcripcion, se pueden transdiferenciar de manera eficaz las celulas somaticas en celulas madre neurales, mediante lo cual se pueden acortar ampliamente los tiempos para la transdiferenciacion.
Segun las realizaciones de la presente divulgacion, los tipos del medio basico no estan sometidos a restricciones especiales. Segun una realizacion de la presente divulgacion, el medio basico es mTeSRI (se puede adquirir de la companfa Stem Cell). Segun una realizacion de la presente divulgacion, el inhibidor puede comprender el inhibidor
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de GSK, CHIR99021, el inhibidor PD0325901 de MEK, el inhibidor A83-01 de TGF-b, el inhibidor tiazovivina de ROCK y el inhibidor DMH1 de BMP. Todos estos inhibidores estan disponibles en el mercado, mediante lo cual se puede mejorar adicionalmente la eficacia de la diferenciacion de las celulas somaticas en celulas madre neurales. Las concentraciones de cada uno de los inhibidores en el medio para la preparacion de celulas madre neurales no estan sometidas a restricciones especiales. Segun una realizacion de la presente divulgacion, el inhibidor puede comprender: de aproximadamente 0,3 pMI a aproximadamente 30 p.M de inhibidor CHIR99021 de GSK; de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 10 pMI de inhibidor PD0325901 de MEK; de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 5 pMI de inhibidor A83-01 de TGF-b; de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 5 pMI de inhibidor tiazovivina de ROCK; y de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 2 pMI de inhibidor DMH1 de BMP. De manera preferente, segun una realizacion de la presente divulgacion, el inhibidor puede comprender: aproximadamente 3 mM de inhibidor CHIR99021 de GSK, aproximadamente 1 mM de inhibidor PD0325901 de MEK, aproximadamente 0,5 p.M de inhibidor A83-01 de TGF-b, aproximadamente 0,5 p.M de inhibidor tiazovivina de ROCK, y aproximadamente 0,2 mM de inhibidor DMH1 de BMP, mediante el cual se puede mejorar adicionalmente la eficacia de la diferenciacion de las celulas somaticas en celulas madre neurales.
Tambien se da a conocer un kit para la preparacion de una celula madre neural. El kit puede comprender: un inhibidor que consiste en un inhibidor de GSK, un inhibidor de MEK, un inhibidor de TGF-b, un inhibidor de ROCK y un inhibidor de BMP. Los inventores de la presente divulgacion han descubierto que utilizando el kit para el cultivo de celulas somaticas, en particular, celulas somaticas que expresan factores de regulacion de la transcripcion, se pueden transdiferenciar de manera eficaz las celulas somaticas en celulas madre neurales, mediante lo cual se pueden acortar ampliamente los tiempos para la transdiferenciacion. Segun realizaciones de la presente divulgacion, los tipos de inhibidores no estan sometidos a restricciones especiales. Segun una realizacion de la presente divulgacion, el inhibidor puede comprender el inhibidor CHIR99021de GSK, el inhibidor PD0325901de MEK, el inhibidor A83-01 de TGF-b, el inhibidor tiazovivina de ROCK y el inhibidor DMH1 de BMP. Todos estos inhibidores estan disponibles en el mercado, lo cual puede mejorar adicionalmente la eficacia de la diferenciacion de las celulas somaticas en celulas madre neurales. Las concentraciones de cada uno de los inhibidores en el medio para la preparacion de celulas madre neurales no estan sometidas a restricciones especiales. Segun una realizacion de la presente divulgacion, el inhibidor CHIR99021 de GSK, el inhibidor PD0325901 de MEK, el inhibidor A83-01 de TGF-b, el inhibidor tiazovivina de ROCK y el inhibidor DMH1 de BMP, estan contenidos en diferentes recipientes, respectivamente. De este modo, el kit se puede utilizar de manera conveniente en la transdiferenciacion de las celulas somaticas en celulas madre neurales. Segun una realizacion de la presente divulgacion, el kit puede comprender, ademas, un medio basico, en el que el medio basico es mTeSR1 (se puede adquirir de la companfa Stem Cell).
En el kit, el inhibidor esta disuelto en el medio basico. De este modo, el kit se puede utilizar de manera conveniente en la transdiferenciacion de las celulas somaticas en celulas madre neurales. Segun una realizacion de la presente divulgacion, en el kit, el inhibidor disuelto en el medio basico puede comprender el inhibidor CHIR99021 de GSK, que tiene una concentracion de aproximadamente 3 mM, el inhibidor PD0325901 de MEK, que tiene una concentracion de aproximadamente 1 mM, el inhibidor A83-01 de TGF-b, que tiene una concentracion de aproximadamente 0,5 mM, el inhibidor tiazovivina de ROCK, que tiene una concentracion de aproximadamente 0,5 mM, y el inhibidor DMH1 de BMP, que tiene una concentracion de aproximadamente 0,2 mM. De este modo, se puede mejorar adicionalmente la eficacia de la transdiferenciacion de las celulas somaticas en celulas madre neurales utilizando el kit mencionado anteriormente.
Ademas, el kit puede incluir el medio. Los inventores de la presente divulgacion han descubierto que utilizando el kit para el cultivo de celulas somaticas, en particular, celulas somaticas que expresan factores de regulacion de la transcripcion, se pueden transdiferenciar, de manera eficaz, las celulas somaticas en celulas madre neurales, mediante lo cual se pueden acortar considerablemente los tiempos para la transdiferenciacion. El medio para la preparacion de celulas madre neurales se ha descrito en detalle anteriormente, por lo cual se omite por razones de brevedad. El kit mencionado anteriormente se puede utilizar en la preparacion de una celula madre neural. Utilizando el kit se pueden cultivar, de manera eficaz, celulas somaticas, en particular, celulas somaticas que expresan factores de regulacion de la transcripcion, que posteriormente pueden transdiferenciar, de manera eficaz, las celulas somaticas en celulas madre neurales en un tiempo muy acortado. El kit se ha descrito en detalle anteriormente, por lo cual se omite por razones de brevedad. El medio mencionado anteriormente se puede utilizar en la preparacion de una celula madre neural, mediante lo cual se pueden transdiferenciar, de manera eficaz, las celulas somaticas en celulas madre neurales en un tiempo muy acortado mediante el cultivo de las celulas somaticas in vitro, en particular las celulas somaticas que expresan factores de regulacion de la transcripcion. El medio para la preparacion de las celulas madre neurales se ha descrito en detalle anteriormente, por lo cual se omite por razones de brevedad.
La presente invencion se refiere, ademas, a un procedimiento para la preparacion de una celula madre neural, segun la reivindicacion 4. Por consiguiente, el procedimiento comprende: cultivar una celula somatica utilizando el medio mencionado anteriormente, en el que la celula somatica comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un factor de celulas madre pluripotentes para inducir la transdiferenciacion desde la celula somatica a la celula madre neural, siendo el factor de celulas madre pluripotentes, como mfnimo, uno seleccionado entre el grupo
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que comprende Oct4, Sox2, Klf4 y miR302, y en el que las celulas somaticas son celulas exfoliativas de orina humana. Los inventores de la presente divulgacion han descubierto que utilizando el medio, segun las realizaciones de la presente divulgacion, para el cultivo de celulas somaticas que contienen la secuencia de acido nucleico del factor de celulas madre pluripotentes codificado por factores de transcripcion especfficos, se pueden transdiferenciar, de manera eficaz, las celulas somaticas en celulas madre neurales en un tiempo muy acortado. De este modo, se puede obtener de manera conveniente una celula inicial, que puede mejorar adicionalmente la eficacia de la preparacion de celulas madre neurales, reducir los costes para la preparacion de celulas madre neurales y ahorrar en costes de mano de obra y de materiales para la obtencion de celulas iniciales utilizando cirugfa invasiva.
Ademas, segun las realizaciones de la presente divulgacion, la celula somatica comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un factor de celulas madre pluripotentes, en el que el factor de celulas madre pluripotentes es, como mfnimo, uno seleccionado entre el grupo que comprende Oct4, Sox2, Klf4 y miR302, tambien se puede obtener sometiendo la celula somatica sin el factor de celulas madre pluripotentes a un tratamiento biologico. De manera especffica, segun las realizaciones de la presente divulgacion, la celula somatica que comprende la secuencia de acido nucleico que codifica el factor de celulas madre pluripotentes, en el que el factor de celulas madre pluripotentes es, como mfnimo, uno seleccionado entre el grupo que comprende Oct4, Sox2, Klf4 y miR302, se puede obtener mediante las siguientes etapas:
en primer lugar, centrifugar orina humana para obtener un precipitado,
en segundo lugar, cultivar el precipitado utilizando un medio para el cultivo de orina para obtener una celula exfoliativa de orina humana primaria, y
finalmente, transformar la celulas exfoliativa de orina humana primaria utilizando un vector que contiene una secuencia de acido nucleico que codifica un factor de celulas madre pluripotentes para obtener la celula somatica, en el que el factor de celulas madre pluripotentes es, como mfnimo, uno seleccionado entre el grupo que comprende Oct4, Sox2, Klf4 y miR302. Segun una realizacion de la presente divulgacion, el vector contiene la secuencia de acido nucleico que codifica Oct4, Sox2, Klf4 y miR302. Segun una realizacion de la presente divulgacion, el vector comprende plasmidos que contienen la secuencia de acido nucleico que codifica Oct4, Sox2, Klf4 y miR302, respectivamente. Segun una realizacion de la presente divulgacion, la celula exfoliativa de orina humana primaria se transforma mediante una transduccion electrica.
Despues de la obtencion de la celula madre neural, esta se puede someter posteriormente a un cultivo proliferativo. Segun las realizaciones de la presente divulgacion, los procedimientos para someter la celula madre neural al cultivo proliferativo no estan sometidos a restricciones especiales. Segun una realizacion de la presente divulgacion, el procedimiento para la preparacion de la celula madre neural puede comprender, ademas, las siguientes etapas para someter la celula madre neural al cultivo proliferativo:
en primer lugar, precultivar la celulas madre neural utilizando un medio basico para obtener una celula madre neural adherente, en el que el medio basico puede ser mTeSRI,
en segundo lugar, cultivar la celula madre neural adherent en un medio para celulas madre neurales, en el que el medio para celulas madre neurales comprende un medio DMEM/F2 complementado con aproximadamente el 1% de suplemento de N2, aproximadamente el 1% de aminoacidos no esenciales, aproximadamente el 0,1% de heparina, aproximadamente 20 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos basico y aproximadamente 20 ng/ml de factor de crecimiento epidermico.
Tambien se da a conocer una celula madre neural o un derivado de la misma. La celula madre neural se obtiene mediante el procedimiento mencionado anteriormente. Ademas, las celulas madre neurales o derivados de las mismas se pueden diferenciar, de manera eficaz, en celulas neurales en condiciones apropiadas. La celula madre neural o el derivado de la misma, mencionados anteriormente, se pueden utilizar en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inducida por el dano en celulas neurales. Como la celula madre neural y el derivado de la misma se pueden diferenciar, de manera eficaz, en celulas neurales en condiciones apropiadas, la celula madre neural y el derivado de la misma se pueden preparar posteriormente como un medicamento, el cual puede utilizarse para el tratamiento de la enfermedad inducida por el dano en celulas neurales. Las celulas madre neurales se pueden utilizar en un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad inducida por dano en celulas neurales. Dicho procedimiento puede comprender: introducir la celula madre neural o el derivado de la misma, mencionados anteriormente, en un paciente. Mediante la introduccion de la celula madre neural o el derivado de la misma, mencionados anteriormente, en el paciente, las celulas madre neurales pueden diferenciarse de manera eficaz en celulas neurales, que pueden curar posteriormente un dano corporal inducido por el dano en celulas neurales.
Tambien se da a conocer un procedimiento para la preparacion de una celula madre neural. El procedimiento puede comprender: cultivar la celula madre neural mencionada anteriormente en condiciones adecuadas para la diferenciacion. Utilizando el procedimiento, segun las realizaciones de la presente divulgacion, se pueden diferenciar, de manera eficaz, las celulas madre neurales en celulas neurales, mediante lo cual se pueden preparar, de manera eficaz, las celulas neuronales. Segun realizaciones de la presente divulgacion, los procedimientos para someter la celula madre neural al cultivo diferencial no estan sometidos a restricciones especiales. Segun una
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realizacion de la presente divulgacion, la celula madre neural se cultiva en medio DMEM/F12 complementado con aproximadamente el 1% de suplemento de N2, aproximadamente el 1% de aminoacidos no esenciales, aproximadamente el 0,1% de heparina y neurotrofina, para obtener diferentes tipos de neuronas y celulas de la neuroglia, en el que la neurotrofina consiste en aproximadamente 10 ng/ml de BDNF, aproximadamente 10 ng/ml de GDNF, aproximadamente 10 ng/ml de CNTC y aproximadamente 10 ng/ml de IGF.
Tambien se da a conocer un sistema para la preparacion de una celula madre neural. Con referencia a la figura 2, el sistema -1000- puede comprender: el aparato de aislamiento -100-, el aparato de transformacion -200- y el aparato de transdiferenciacion -300-, en el que el aparato de aislamiento -100- se utiliza para aislar celulas exfoliativas de orina humana de la orina humana. El aparato de transformacion -200-, conectado al aparato de aislamiento -100- y equipado con un vector que contiene una secuencia de acido nucleico que codifica un factor de celulas madre pluripotentes, en el que el factor de celulas madre pluripotentes es, como mfnimo, uno seleccionado ente el grupo que comprende Oct4, Sox2, Klf4 y miR302, se utiliza para transformar las celulas exfoliativas de orina humana recibidas del aparato de aislamiento -100-. El aparato de transdiferenciacion -300-, conectado al aparato de transformacion y equipado con el medio mencionado anteriormente, para someter las celulas exfoliativas de orina humana transformadas recibidas del aparato de transformacion -200- a la transdiferenciacion, se utiliza para inducir la transdiferenciacion de celulas exfoliativas de orina humana transformadas en celulas madre neurales. Utilizando el sistema se puede aplicar, de manera eficaz, el procedimiento para la preparacion de la celula neural mencionada anteriormente, mediante lo cual se pueden preparar, de manera eficaz, celulas madre neurales. Tambien se da a conocer un procedimiento de cribado de un compuesto para inducir la diferenciacion de celulas madre neurales. El procedimiento puede comprender: poner en contacto la celula madre neural mencionada anteriormente con un compuesto candidato y determinar la pluripotencia de la celula madre neural antes y despues de la etapa de contacto de la celula madre neural con el compuesto candidato, respectivamente, en el que la disminucion de la pluripotencia despues de poner en contacto la celula madre neural con el compuesto candidato es un indicador de que el compuesto candidato tiene la capacidad de inducir la diferenciacion de una celula madre neural. Utilizando el procedimiento se puede realizar un cribado, de manera eficaz, para obtener el compuesto para inducir la diferenciacion de la celula madre neural. Las celulas madre neurales se pueden utilizar para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa o una enfermedad inducida por el dano en celulas neurales. Con referencia a la figura 3, dicha utilizacion puede comprender las siguientes etapas:
en primer lugar, aislar una celula somatica de un paciente,
en segundo lugar, preparar una celula madre neural basada en la celula somatica segun el procedimiento anterior; e introducir la celula madre neural en el paciente.
Utilizando dicho procedimiento para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa o una enfermedad inducida por el dano en celulas neurales, se pueden introducir, de manera eficaz, las celulas madre neurales obtenidas en un paciente, que pueden diferenciarse posteriormente, de manera eficaz, en celulas neurales en el paciente, y curar un dano en el organismo inducido por la neurodegeneracion y el dano en celulas neurales, con las cuales se puede tratar la enfermedad neurodegenerativa y la enfermedad inducida por el dano en celulas neurales.
Tambien se da a conocer un procedimiento para la determinacion de si un medicamento afecta al sistema nervioso. El procedimiento puede comprender: poner en contacto el medicamento con la celula madre neural, segun las realizaciones de la presente divulgacion; y determinar la celula madre neural antes y despues de la etapa de contacto del medicamento con la celula madre neural, determinando asf si el medicamento afecta al sistema nervioso basandose en un cambio de la celula madre neural. Utilizando el procedimiento se puede determinar, de manera eficaz, si el medicamento afecta al sistema nervioso.
Cabe senalar que el medio para la preparacion de la celula madre neural y la utilizacion del mismo se han alcanzado a traves de un trabajo muy creativo y un lenguaje optimo de los inventores de la presente divulgacion. Ademas, las caracterfsticas descritas en cada aspecto de la presente divulgacion pueden referirse mutuamente entre si, lo cual se omite en el presente documento por conveniencia.
Se hara referencia en detalle a los ejemplos de la presente divulgacion. Los expertos en la materia entenderan que los siguientes ejemplos son explicativos y no se pueden interpretar como limitativos del alcance de la presente divulgacion. Si la tecnologfa o condiciones especfficas no estan especificados en los ejemplos, se realizara una etapa, segun las tecnicas o condiciones descritas en la bibliograffa en la tecnica o segun las instrucciones del producto. Si no se especifican los fabricantes de los reactivos o instrumentos, los reactivos o instrumentos pueden estar disponibles en el mercado.
EJEMPLO 1: Preparacion de celula madre neural
1. Aislamiento de una celula exfoliativa de orina humana (celulas de orina, UC)
El aislamiento de una celula exfoliativa de orina humana se lleva a cabo segun las siguientes etapas:
(1) recoger 150-200 ml de la parte media de la corriente de orina en un recipiente esteril que contiene penicilina/estreptomicina;
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(2) transferir la orina a un tubo de centrffuga de 50 ml y centrifugar a 400 g durante 10 min;
(3) descartar el sobrenadante para conservar aproximadamente 5 ml de la orina;
(4) anadir aproximadamente de 10 a 30 ml de PBS que contiene la penicilina/estreptomicina a la orina obtenida en la etapa (3) y centrifugar a 400 g durante 10 min despues de mezclar con suavidad;
(5) descartar el sobrenadante hasta que el lfquido restante es inferior a 0,5 ml;
(6) anadir 1 ml de medio para el cultivo de orina al lfquido restante de la orina para resuspender el precipitado obtenido y recoger las celulas;
(7) sembrar las celulas recogidas en una placa de cultivo de 60 mm (o una placa de seis pocillos) recubiertas con gelatina al 0,1% con 1 ml adicional de medio para el cultivo de orina, en el que el medio para el cultivo de orina se obtuvo mediante la mezcla en partes iguales de DMEM con un alto contenido de glucosa (medio Eagle modificado por Dulbecco, de Hyclone) complementado con suero bovino fetal (FBS, de PAA) al 10% y penicilina/estreptomicina, con medio del kit SingleQuot CC-4127 REGM (de Lonza);
(8) colocar la placa de cultivo sembrada con celulas en una incubadora a 37°C, 5% de CO2, durante 3 dfas;
(9) observar si las celulas se unieron al fondo de la placa y anadir con suavidad 1 ml adicional del medio a la orina de cultivo, colocar la placa de cultivo sembrada con celulas en la incubadora a 37°C, 5% de CO2, para el cultivo continuo;
(10) descartar el medio en la placa de cultivo en el dfa 5 a 7 desde el dfa de la siembra, anadir medio fresco para el cultivo de orina (sin antibiotico) a la placa de cultivo despues de lavarse con PBS una vez, mediante lo cual se pudo observar el crecimiento de celulas adherentes;
(11) anadir o cambiar el medio dependiendo de las condiciones de crecimiento celular, que se podrfa subcultivar utilizando tripsina al 0,25%;
(12) recoger las celulas exfoliativas de orina humana primarias de la 2a generacion y congelar y almacenar en nitrogeno lfquido utilizando un lfquido congelado (90% de FBS + 10% de DMSO) para su utilizacion.
2. Induccion de celulas madre neurales inducidas (iNSC)
El experimento de induccion de celulas madre neurales inducidas incluyo: la preparacion de celulas, la transduccion electrica de plasmido, la induccion de la siembra de celulas, la seleccion de clones de celulas, la amplificacion de iNSC y asf sucesivamente. En detalle:
(1) descongelar las celulas exfoliativas de orina humana primarias congeladas, sembrar en una placa de 10 cm (o una placa de seis pocillos);
(2) digerir las celulas adherentes utilizando tripsina al 0,25% cuando la confluencia de las celula exfoliativas de orina humana primarias adherentes fue aproximadamente del 90% en la placa de 10 cm y, a continuacion, recoger y contar las celulas digeridas;
(3) transferir las celulas digeridas que tienen un numero apropiado de celulas (el numero de celulas vario de 500.000 a 1.500.000 en todos los sistemas de transduccion electrica) a un tubo de EP de 1,5 ml y, a continuacion, centrifugar a 200 g durante 5 minutos;
(4) descartar el sobrenadante obtenido en la etapa (3) y recoger el precipitado celular obtenido en una copa de transduccion electrica;
(5) preparar un sistema transformante de plasmidos: anadir 82 ml de solucion Basic Nucleofector® para celulas epiteliales de mamffero y 18 ml de suplemento 1 (Lonza) en esta secuencia, seguido de mezcla suave y, a continuacion, anadir 5 mg de plasmidos con mezclado suficiente, para obtener el sistema transformante de plasmidos, en el que los plasmidos inclufan pCEP4-O2SET2K (3 mg) y pCEP4-miR-302 (2 mg);
(6) colocar la copa mencionada en la etapa (4) sobre un electroporador Amaxa (Lonza) y realizar la transduccion electrica mediante la seleccion del procedimiento T-013 (o T-020); (7) transferir las celulas transducidas electricamente a una placa de seis pocillos (o una placa de 10 cm) recubierta con Matrigel con una densidad de siembra de 100.000 a 300.000 celulas por pocillo, que se podrfan ajustar dependiendo de las condiciones de las celulas y, a continuacion, anadir el medio para el cultivo de celulas de orina; (8) cambiar el medio para el cultivo de celulas de orina por medio mTeSR1 que contenfa 3 mM de CHIR99021, 1 mM de PD0325901, 0,5 mM de A83-01 (Tocris Bioscience), 0,5 mM de tiazovivina y 0,2 mM de DMH1 (Tocris Bioscience) en el segundo dfa desde la siembra en la etapa (7) (o el segundo dfa despues de la transfeccion), en el que el medio mTeSR1 era el medio para la preparacion de celulas madre neurales de la presente divulgacion, que se utilizo para el cultivo de celulas y se cambio cada dos dfas.
(9) seleccionar un clon de celulas y dividir en trozos pequenos mediante un procedimiento mecanico y, a continuacion, sembrar las celulas seleccionadas en una placa de seis pocillos (o una placa de doce pocillos) recubierta con Matrigel y cultivar las celulas sembradas con medio mTeSR1 convencional, en la que el clon de celulas se obtuvo despues de 12 a 15 dfas desde la transduccion electrica, y el clon de celulas estaba en una forma con un tamano apropiado, un borde nftido y una disposicion compacta que se desarrollo a partir de celulas transducidas electricamente.
(10) cambiar el medio fresco cuando se observaron celulas adherentes y cultivar las celulas adherentes durante otros tres a cinco dfas cambiando el medio cada dos dfas, mediante lo cual se observo un gran numero de grupos de celulas del tipo de celulas madre neurales dispuestas en una estructura neural de tipo Rosette o con forma de polaridad. (11) seleccionar el grupo de celulas del tipo de celulas madre neurales mediante un procedimiento mecanico y pipetear suavemente el grupo de celulas del tipo de celulas madre neurales con una pipeta de 1 ml, para
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pipetear el grupo de celulas del tipo de celulas madre neurales en trozos pequenos o celulas individuales, a continuacion, transferir las celulas individuales obtenidas a un matraz T25 que contema el medio para el cultivo de celulas madre neurales, en la que el medio para el cultivo de celulas madre neurales inclma medio DMEM/F2 complementado con un 1% de suplemento de N2 (Gibco), un 1% de aminoacidos no esenciales (NEAA, Gibco), un 0,1% de heparina (Sigma), 20 ng/ml del factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF, Invitrogen) y 20 ng/ml del factor de crecimiento epidermico (EGF, R&D System);
(12) obtener esferas neurales con un lfmite mtido a partir de las celulas individuales en suspension cultivadas en el matraz T25 durante una semana (las esferas neurales en el presente documento se definieron como esferas neurales de la generacion P1), a partir de lo cual se cambio el medio cada dos o tres dfas con medio volumen en comparacion con el del medio original.
(13) pasar las esferas neurales cuando las celulas individuales se cultivaron durante 7 a 14 dfas y teman un tamano de esferas neurales, a saber, del 7° al 14° dfa desde el dfa de la transferencia de las celulas individuales al matraz T25, y cultivarlas con el medio para el cultivo de celulas madre neurales, seleccionar y transferir las esferas neurales que tienen un diametro de mas de 300 mm a un tubo de centnfuga de 15 ml, sedimentar las esferas neurales o centrifugar a 50 g durante 1 minuto o 2 minutos, digerir a 37°C durante 3 min a 5 min con 1 ml de acutasa despues de descartar el sobrenadante obtenido;
(14) anadir el medio para el cultivo de celulas madre neurales (en la que el medio para el cultivo de celulas madre neurales inclma medio DMEM/F2 complementado con un 1% de suplemento N2 (Gibco), un 1% de aminoacidos no esenciales (NEAA, Gibco), un 0,1 % de heparina (Sigma), 20 ng/ml del factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF, Invitrogen) y 20 ng/ml del factor de crecimiento epidermico (EGF, R&D System)) al tubo de centnfuga anterior hasta que el sistema de reaccion en el mismo tema un volumen de 10 ml, a continuacion, centrifugar a 200 g durante 5 minutos,
(15) anadir una pequena cantidad del medio para cultivar celulas madre (aproximadamente 500 ml) despues de descartar el sobrenadante obtenido en la etapa (14) y seguido de una mezcla suave, y pipetear suavemente el grupo de celulas en trozos pequenos utilizando una pipeta de 1 ml, anadir 1 ml del medio para el cultivo de celulas madre neurales al tubo de centnfuga, sembrar las celulas obtenidas despues de mezclarse uniformemente en un nuevo matraz, para obtener la segunda generacion de esferas neurales.
Opcionalmente, se utilizo un microscopio invertido (Olympus, BX51) para observar y fotografiar la morfologfa de las celulas en diferentes fases celulares durante la preparacion de la celula madre neural mediante la induccion de las celulas exfoliativas de orina humana primarias, un resultado de esto puede encontrarse en la figura 4. La figura 4 es una imagen que muestra la morfologfa celular de diferentes fases durante la induccion de celulas madre neurales inducidas, segun una realizacion de la presente divulgacion.
Tal como se muestra en la figura 4, A representaba las celulas exfoliativas de orina humana primarias; B representaba el clon de celulas inducido al someter las celulas a transduccion electrica; C es la morfologfa del clon de celulas adherentes seleccionado; D eran esferas neurales de iNSC, el factor de ampliacion era de 100.
EJEMPLO 2: Determinacion del fenotipo de celulas madre inducidas (iNSC)
1 Determinacion de la expresion del marcador de NSC en iNSC mediante inmunofluorescencia
(1) colocar un portaobjetos recubierto con Matrigel en una placa de 24 pocillos, uniendo de 5 a 10 de esferas neurales de iNSC con un pequeno volumen preparado en el ejemplo 1 al portaobjetos y, a continuacion, anadir 100 ml del medio para el cultivo de celulas madre neurales sobre el mismo, a continuacion, anadir 500 ml del medio para el cultivo de celulas madre neurales a cada pocillo de la placa de 24 pocillos en el dfa siguiente, a continuacion, cultivar durante 1 a 2 dfas;
(2) dejar que se fijen las celulas cultivadas obtenidas en la etapa (1) durante 20 minutos a temperatura ambiente en paraformaldetndo al 4%;
(3) aclarar las celulas fijadas tres veces con PBS durante 5 minutos cada vez;
(4) incubar las celulas obtenidas en la etapa (3) en PBS al que se anade un anticuerpo primario (Pax6, nestina, Sox1 o Sox2), BSA al 1%, suero de cabra normal al 10%, Triton-X al 0,3%, a 4°C durante la noche;
(5) aclarar las celulas obtenidas en la etapa (4) tres veces con PBS durante 5 minutos cada vez;
(6) incubar las celulas obtenidas en la etapa (5) con el anticuerpo secundario (Invitrigen) marcado con Alexa 568 o 488 durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad;
(7) aclarar las celulas obtenidas en la etapa (6) tres veces con PBS durante 5 minutos cada vez;
(8) incubar las celulas obtenidas en la etapa (7) con DAPI (Sigma) durante 3 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad;
(9) aclarar las celulas obtenidas en la etapa (8) tres veces en PBS durante 5 minutos cada vez;
(10) montar el portaobjetos que tiene las celulas obtenidas en la etapa (9) y observar las muestras mediante fotograffa, un resultado de la misma puede observase en la figura 5.
2. Determinacion de la expresion de los genes marcadores de celulas madre neurales en celulas madre neurales inducidas (iNSC) mediante PCR en tiempo real
En primer lugar, se utilizo el reactivo Trizol (Takara) para extraer el ARN total de las celulas madre neurales
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inducidas preparadas en el ejemplo 1, manual segun la especificacion proporcionada por el fabricante. A continuacion, se utilizo el kit M-MLV (Takara) para someter el ARN total extrafdo a transcripcion inversa, para obtener ADNc, y se utilizaron el kit SYBR® Premix Ex Taq® (Takara) y el instrumento PCR de cuantificacion fluorescente ABI 7300 para someter el ADNc obtenido a PCR en tiempo real para determinar la expresion de los genes marcadores de celulas madre neurales, el resultado del cual se observa en la figura 5, en la que las secuencias de cebadores en la PCR en tiempo real se indican a continuacion.
Nombre del cebador
Secuencia del cebador (SEQ ID NO:)
PAX6-F
F ATGTGTGAGTAAAATTCTGGGCA (1)
PAX6-R
R GCTTACAACTTCTGGAGTCGCTA (2)
SOX1-F
F CAGTACAGCCCCATCTCCAAC (3)
SOX1-R
R GCGGGCAAGTACATGCTGA (4)
NESTIN-F
F CTGGAGCAGGAGAAACAGG (5)
NESTIN-R
R TGGGAGCAAAGATCCAAGAC (6)
SOX2-F
F CCCAGCAGACTTCACATGT (7)
SOX2-R
R CCTCCCATTTCCCTCGTTTT (8)
Nota: F: directo; R: inverso
La figura 5 es una imagen que muestra el nivel de expresion de un gen marcador en celulas madre neurales en celulas madre neurales inducidas determinado mediante inmunofluorescencia y PCR en tiempo real, segun una realizacion de la presente divulgacion. Tal como se muestra en la figura 5, A y B son los resultados de la tincion de la inmunofluorescencia, A indica que las expresiones de Pax6 y nestina fueron positivas en iNSC, B indica que la expresion de Sox1 (B) fue positiva en iNSC; C es el resultado de la deteccion de la PCR en tiempo real, que muestra, respectivamente, los niveles de expresion de Sox2, Pax6, Sox1 y nestina en iNSC, en la que UC representa las celulas de orina, iPS son las celulas madre pluripotentes inducidas a partir de celulas exfoliativas de orina humana primaria.
3. Determinacion de la capacidad de diferenciacion de iNSC in vitro
Se coloco el portaobjetos recubierto con Matrigel en una placa de 24 pocillos, se unieron las esferas neurales de iNSC preparadas en el ejemplo 1 (celulas madre neurales inducidas) sobre el portaobjetos colocado en cada pocillo de la placa de 24 pocillos, se anadieron sobre las mismas 100 ml del medio para el cultivo de celulas madre neurales, se anadio 1 ml de un medio para la diferenciacion neural a cada pocillo de la placa de 24 pocillos en el dfa siguiente, a continuacion, las celulas se cultivaron durante 1 a 2 dfas, en el que el medio para la diferenciacion neural comprende un medio DMEM/F2 complementado con el 1% de suplemento de N2 (Gibco), el 1% de aminoacidos no esenciales (NEAA, Gibco), el 0,1% de heparina (Sigma) y neurotrofina basica (Peprotech), en el que la neurotrofina basica consistfa en BDNF 10 ng/ml, GDNF 10 ng/ml, CNTC 10 ng/ml e IGF10 ng/ml. El medio para el cultivo de diferenciacion neural se cambio cada dos dfas por la mitad del volumen en comparacion con el del medio original para el cultivo de diferenciacion neural. Se obtuvieron productos diferenciados in vitro de las celulas madre neurales inducidas despues del cultivo de 2 semanas descrito anteriormente. A continuacion, se detectaron mediante inmunofluorescencia las expresiones de los productos diferenciados obtenidos in vitro de las celulas madre neurales inducidas, tales como las protemas Tuj, Map2, Dcx, TH, GABA, glutamina y GFAP, el resultado de la cual se puede observar en la figura 6. En detalle, las protemas TH, GABA, glutamina y GFAP eran marcadores espedficos para diferentes tipos de neuronas y celulas de la neuroglia, mediante los cuales se podfan determinar los diferentes tipos de neuronas y celulas de la neuroglia obtenidos a partir de las celulas madre neurales inducidas a traves de la diferenciacion in vitro mediante la deteccion de las expresiones de las protemas Tuj, Map2, Dcx, TH, GABA, glutamina y GFAP, respectivamente, en los productos diferenciados in vitro de las celulas madre neurales inducidas, mediante lo cual se puede determinar posteriormente la capacidad diferencial in vitro de celulas madre neurales inducidas.
La figura 6 es una imagen que muestra las expresiones de diferentes marcadores espedficos para diferentes tipos de neuronas y celulas de la neuroglia entre los productos de diferenciacion in vitro derivados de las celulas madre neurales inducidas determinadas mediante inmunofluorescencia, segun una realizacion de la presente divulgacion. Tal como se muestra en la figura 6, A indica que las iNSC formaron espontaneamente una gran cantidad de neuronas y celulas de la neuroglia; B indica que las expresiones de Map2 y GABA fueron positivas en los productos diferenciados in vitro de las celulas madre neurales inducidas; C indica que las expresiones de Map2 y glutamina fueron positivas en los productos diferenciados in vitro de las celulas madre neurales inducidas; D indica que la expresion de TH fue positiva en los productos diferenciados in vitro de las celulas madre neurales inducidas; E indica que las expresiones de Tuj y GFAP (un marcador de astrocitos) fueron positivas en los productos diferenciados in vitro de las celulas madre neurales inducidas; F indica que las expresiones de Dcx y Tuj fueron positivas en los productos diferenciados in vitro de las celulas madre neurales inducidas.
Aplicacion industrial
Un medio para la preparacion de celulas madre neurales de la presente divulgacion se puede aplicar para la
preparacion, de manera eficaz, de la celula madre neural. Utilizando el medio para el cultivo de una celula somatica, en particular, una celula somatica que expresa un factor de regulacion de la transcripcion, se puede transdiferenciar, de manera eficaz, la celula somatica en una celula madre neural en un tiempo muy acortado.

Claims (9)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Medio para la preparacion de celulas madre neurales, caracterizado por que comprende: un medio basico para el cultivo de una celula madre, y
    un inhibidor que consiste en un inhibidor de GSK, un inhibidor de MEK, un inhibidor de TGF-b, un inhibidor de ROCK y un inhibidor de BMP.
  2. 2. Medio, segun la reivindicacion 1, en el que el medio basico es mTeSRI.
  3. 3. Medio, segun la reivindicacion 1, en el que el inhibidor comprende:
    de aproximadamente 0,3 pMI a aproximadamente 30 pMI de inhibidor CHIR99021 de GSK, de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 10 pMI de inhibidor PD0325901 de MEK, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 5 pMI de inhibidor A83-01 de TGF-b,
    de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 5 pMI de inhibidor tiazovivina de ROCK, y
    de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 2 pMI de inhibidor DMH1 de BMP.
  4. 4. Procedimiento para la preparacion de celulas madre neurales, caracterizado por que comprende:
    cultivar celulas somaticas utilizando el medio, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,
    en el que las celulas somaticas comprenden una secuencia de acido nucleico que codifica un factor de celulas madre pluripotentes para inducir una transdiferenciacion desde las celulas somaticas a las celulas madre neurales, siendo el factor de celulas madre pluripotentes, como mfnimo, uno seleccionado entre el grupo que comprende Oct4, Sox2, Klf4 y miR302, y
    en el que las celulas somaticas son celulas exfoliativas de orina humana.
  5. 5. Procedimiento, segun la reivindicacion 4, en el que las celulas somaticas se obtienen mediante: la centrifugacion de orina humana para obtener un precipitado,
    el cultivo del precipitado utilizando un medio para el cultivo de orina para obtener celulas exfoliativas de orina humana primarias, y
    la transformacion de las celulas exfoliativas de orina humana primarias utilizando un vector que contiene una secuencia de acido nucleico que codifica el factor de celulas madre pluripotentes para obtener celulas somaticas, siendo el factor de celulas madre pluripotentes, como mfnimo, uno seleccionado entre el grupo que comprende Oct4, Sox2, Klf4 y miR302.
  6. 6. Procedimiento, segun la reivindicacion 5, en el que el vector contiene la secuencia de acido nucleico que codifica Oct4, Sox2, Klf4 y miR302.
  7. 7. Procedimiento, segun la reivindicacion 6, en el que el vector comprende plasmidos que contienen la secuencia de acido nucleico que codifica cada uno de Oct4, Sox2, Klf4 y miR302, respectivamente.
  8. 8. Procedimiento, segun la reivindicacion 5, en el que las celulas exfoliativas de orina humana primarias se transforman mediante transduccion electrica.
  9. 9. Procedimiento, segun la reivindicacion 4, que comprende, ademas:
    precultivar las celulas madre neurales utilizando un medio basico para obtener celulas madre neurales adherentes, y cultivar las celulas madre neurales adherentes en un medio para celulas madre neurales, en el que el medio para celulas madre neurales comprende un medio DMEM/F2 complementado con aproximadamente el 1% de suplemento de N2, aproximadamente el 1% de aminoacidos no esenciales, aproximadamente el 0,1% de heparina, aproximadamente 20 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos basico y 20 ng/ml de factor de crecimiento epidermico.
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