KR20140138221A

KR20140138221A - 신경줄기세포 제조를 위한 배지와 그의 용도

Info

Publication number: KR20140138221A
Application number: KR1020147026996A
Authority: KR
Inventors: 광진 판; 돤칭 페이; 리후이 왕; 린리 왕; 옌팅 수에
Original assignee: 광저우 인스티튜트 오브 바이오메디신 앤드 헬스, 차이니즈 아카데미 오브 사이언스즈
Priority date: 2012-02-29
Filing date: 2013-02-06
Publication date: 2014-12-03
Also published as: JP6080871B2; US10011819B2; WO2013127293A1; EP2821481A1; KR101686722B1; CN102604894B; CN102604894A; EP2821481B1; ES2628941T3; EP2821481A4; US20150030570A1; JP2015509719A; CA2865817C; CA2865817A1

Abstract

본 발명은 신경줄기세포 제조를 위한 배양 배지 및 그의 용도를 제공하는 것으로, 상기 신경줄기세포 제조를 위한 배양 배지는, 줄기세포의 성장을 위하여 적합한 기본 배지 및 GSK억제제, MEK억제제, TGF-β억제, ROCK 억제제 및 BMP억제제로 구성되는 그룹에서 선택되는 적어도 한 가지의 세포신호회로 억제제를 포함한다.

Description

신경줄기세포 제조를 위한 배지와 그의 용도{CULTURE MEDIUM FOR PREPARING NEURAL STEM CELL AND USE THEREOF}

본 발명의 실시예는 일반적으로 생의학 분야에 관한 것이며, 더욱 특히, 신경줄기세포의 제조를 위한 배지와 그의 용도에 관한 것이다.

본 출원은 2012년 2월 29일 중국 특허청(state intellectual property office)에 출원된 중국 특허 출원 No.201210051095.0의 우선권을 주장하는 것이며, 그것의 전체 내용이 여기에 참고로 합체된다.

줄기세포는 인체 및 그것의 다양한 조직과 세포의 근원이다. 그것의 가장 강력한 생물학적인 특징은 자가-재생 및 증식의 가능성을 갖는 것뿐만 아니라, 다능성(pluripotency)의 가능성 또한 갖는 것이다. 줄기세포는 구분되는 소스(source)들에 따라 성체 줄기세포와 배아 줄기세포(ES)로 나뉜다. 성체 줄기세포는 신경 줄기세포, 중간엽 줄기세포 및, 조혈모 줄기세포 등을 포함한다. 최근, 조혈모 줄기세포와 중간엽 줄기세포에 관한 많은 연구들 이외에도, 신경 줄기세포에 대한 연구도 상대적으로 깊다.

1992년 Reymolds와 Weiss 등은 성숙한 쥐의 선조체(corpus striatum)에서 신경줄기세포를 최초로 분리해냈는데, 이것은 자가-재생, 분화 및 증식의 가능성을 갖는 것뿐만 아니라, 손상과 질병에 반응하는 신경계 세포의 대부분의 종류로 분화할 수 있는 것이다. 1998년 일본의 Okano와 코넬 대학의 Goldman은 성인의 뇌 조직에서 신경줄기세포의 존재를 함께 입증하였다. 최근 들어, 지속적인 실험을 통해 신경계에서 다능 줄기세포(multipotent stem cells)의 존재가 증명되었고, 이어서 그로부터 성공적으로 분리되었는데, 이것은 신경계 손상에 대한 회복과 퇴행성 신경질환의 세포대체 치료요법에 있어서 새로운 희망을 가져 왔다.

비재생성(non-regenerative) 및 비자기 회복성(non-self-repairing)의 뉴런의 특성이 의학에서 극복하기 어려운 장애였고, 나아가 중추 신경계의 조직 구조의 취약성 및 그것의 지적 활동에 대한 중요성 때문에, 중추 신경계 질환 및 그것의 후유증은 인간의 건강과 삶의 질에 영향을 미치는 가장 만성적인 질병 중 하나이다. 신경 줄기세포에 대한 그러한 연구는 가장 중요한 토픽이 되었고, 줄기세포 연구 분야에 집중하게 되었는데, 이것은 임상 적용에서 밝은 전망을 갖는다.

그러나, 현재 신경 줄기세포와 관련된 연구는 더 개선될 필요가 있다.

본 발명의 실시 예들은 적어도 어느 정도는 종래 기술에 존재하는 문제점 중 적어도 하나를 해결하고자 한다. 따라서, 본 발명의 하나의 목적은 효율적으로 신경 줄기세포의 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 첫번째 광범위한 관점에서의 실시예는 신경줄기세포를 제조하기 위한 배지를 제공한다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 배지는 줄기세포를 배양하기 위한 기본 배지와 GSK 억제제, MEK 억제제, TGF-β억제제, ROCK 억제제 및 BMP 억제제로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 한 가지의 억제제를 포함할 수 있다. 본 발명의 발명자들은 체세포(somatic cells), 특히 전사제어인자(transcriptional regulation factors)를 발현하는 체세포를 배양하기 위하여 상기 배지를 사용하는 것이 효율적으로 상기 체세포를 신경줄기세포(여기서 “유도된 신경줄기세포”로 또한 알려짐)로 전환분화(transdifferentiate)할 수 있으며, 그것은 전환분화에 대한 시간을 크게 단축할 수 있음을 밝혀냈다.

본 발명의 두번째 광범위한 관점에서의 실시예는 신경줄기세포를 제조하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 키트는 GSK 억제제, MEK 억제제, TGF-β억제, ROCK 억제제 및 BMP 억제제로 구성되는 그룹에서 적어도 한 가지의 억제제를 포함할 수 있다. 본 발명의 발명자들은 체세포(somatic cells), 특히 전사제어인자(transcriptional regulation factors)를 발현하는 체세포를 배양하기 위하여 상기 키트를 사용하는 것이, 효율적으로 상기 체세포를 신경줄기세포로 전환분화(transdifferentiate)할 수 있으며, 그것은 전환분화에 대한 시간을 크게 단축할 수 있음을 밝혀냈다.

본 발명의 세번째 광범위한 관점에서의 실시예는 신경줄기세포를 제조하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 앞서 설명된 배지를 포함한다. 본 발명의 발명자들은 체세포(somatic cells), 특히 전사제어인자(transcriptional regulation factors)를 발현하는 체세포를 배양하기 위하여 상기 키트를 사용하는 것이, 효율적으로 상기 체세포를 신경줄기세포로 전환분화(transdifferentiate)할 수 있으며, 그것은 전환분화에 대한 시간을 크게 단축할 수 있음을 밝혀냈다.

본 발명의 네번째 광범위한 관점에서의 실시예는, 신경줄기세포의 제조에 있어서의 상기 언급된 키트의 용도에 대해 제공한다. 본 발명의 개시에 따르는 상기 키트를 사용하는 것은, 상기 체세포(somatic cells), 특히 전사제어인자(transcriptional regulation factors)를 발현하는 체세포를 효율적으로 배양할 수 있으며, 그것은 나아가 크게 단축된 시간과 함께 상기 체세포를 신경줄기세포로 전환분화할 수 있다.

본 발명의 다섯번째 광범위한 관점에서의 실시예는, 생체 외에서 체세포, 특히 전사제어인자(transcriptional regulation factors)를 발현하는 체세포(somatic cells)를 배양하는 것에 의하여, 크게 시간을 단축함과 함께, 상기 체세포를 신경줄기세포로 효율적으로 전환분화할 수 있는, 신경줄기세포의 제조에 있어서의 앞서 설명된 배지의 용도에 대해 제공한다.

본 발명의 여섯번째 광범위한 관점에서의 실시예는, 신경줄기세포의 제조를 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은 앞서 언급된 배지를 사용하여 체세포를 배양하는 것을 포함하며, 상기 체세포는 상기 체세포로부터 상기 신경줄기세포로의 전환분화를 유도하는 다능성 줄기세포 인자를 인코딩(encoding)하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 다능성 줄기세포 인자는 Oct4, Sox2, Klf4 및 miR302로 구성되는 그룹에서 선택되는 적어도 한 가지이다. 본 발명의 발명자들은 특이적인 전사 인자에 의하여 코드(coded)된 다능성 줄기세포 인자의 핵산서열을 가지고 있는 체세포를 배양하기 위하여 본 발명의 실시예에 따르는 상기 배지를 사용함으로써, 시간이 크게 단축됨과 함께 효율적으로 체세포를 신경줄기세포로 전환분화할 수 있다는 것을 밝혀냈다.

본 발명의 일곱번째 광범위한 관점에서의 실시예는, 신경줄기세포 또는 이의 유도체를 제공한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 앞서 언급한 상기 방법에 의하여 상기 신경줄기세포가 얻어진다. 이에 더하여, 본 발명의 실시예에 따른 상기 신경줄기세포 또는 이의 유도체는 적절한 조건하에서 효율적으로 신경세포로 분화할 수 있다.

본 발명의 여덟번째 광범위한 관점에서의 실시예는, 신경세포 손상으로 인해 유도된 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 앞서 언급한 상기 신경줄기세포 또는 이의 유도체의 용도에 관해 제공한다. 본 발명의 실시예에 따른 신경줄기세포 또는 이의 유도체는 적절한 조건 하에서 효율적으로 신경세포로 분화될 수 있기 때문에, 따라서 나아가 상기 신경줄기세포 또는 이의 유도체는 약제로 만들어질 수 있으며, 그것은 신경세포 손상으로 유도된 질병을 치료하는 데에 사용될 수 있다.

본 발명의 아홉번째 광범위한 관점에서의 실시예는, 신경세포의 손상으로 유도된 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은 앞서 언급한 신경줄기세포 또는 이의 유도체를 환자에게 도입하는 것을 포함할 수 있다. 앞서 언급한 신경줄기세포 또는 이의 유도체를 환자에게 도입함으로써, 상기 신경줄기세포는 신경세포로 효율적으로 분화할 수 있으며, 그것은 나아가 신경세포의 손상으로 인해 유도된 신체의 손상에 대한 치료법이 될 수 있다.

본 발명의 열번째 광범위한 관점에서의 실시예는, 신경줄기세포의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은 분화를 위하여 적합한 조건 하에서 앞서 언급한 신경줄기세포를 배양하는 것을 포함한다. 본 발명의 실시예에 따른 상기 방법을 사용하는 것은 신경줄기세포를 신경세포로 효율적으로 분화할 수 있으며, 그것은 효율적으로 신경세포를 제조할 수 있다.

본 발명의 열한번째 광범위한 관점에서의 실시예는, 신경줄기세포를 제조하는 시스템을 제공한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 시스템은 사람의 소변에서 인체의 소변 탈락세포(urine exfoliative cell)를 분리하는데 사용되는 분리장치, 상기 분리장치에 연결되어 있으며, 상기 인체의 소변탈락세포를 변형시키기 위하여 다능성 줄기세포인자를 인코딩(encoding)하는 핵산서열을 가지고 있는 담체(vector)가 장착되어 있는 변형장치, 여기서 상기 다능성 줄기세포인자는 Oct4, Sox2, Klf4 및 miR302로 구성되는 그룹에서 선택되는 적어도 한 가지이고, 및 상기 변형장치와 연결되어 있으며 상기 언급된 배지가 장착되어 있고, 변형된 인체의 소변탈락세포가 전환분화하는데 적용되고, 변형된 인체의 소변탈락세포를 신경줄기세포로 전환분화하는 것을 유도하기 위한 전환분화장치를 포함한다. 상기 시스템을 사용하는 것은 앞서 언급한 상기의 신경줄기세포를 제조하는 방법을 효율적으로 향상시킬 수 있으며, 그것은 신경줄기세포를 효율적으로 제조할 수 있다.

본 발명의 열두번째 광범위한 관점에서의 실시예는, 신경줄기세포의 분화를 유도하기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은 후보 화합물과 앞서 언급된 상기 신경줄기세포를 접촉시키는 것, 및 상기 후보 화합물과 신경줄기세포를 접촉시키는 단계 이전 및 이후에 신경줄기세포의 다능성(pluripotency)을 각각 확인하는 것을 포함하고, 여기서 상기 후보 화합물과 신경줄기세포를 접촉시킨 후에, 상기 다능성의 감소는 신경줄기세포의 분화를 유도하는 능력을 갖고 있는 후보 화합물의 지표가 된다. 상기 방법을 사용하는 것은 신경줄기세포의 분화를 유도하는 화합물을 얻기 위한 스크리닝을 효율적으로 할 수 있다.

본 발명의 열세번째 광범위한 관점에서의 실시예는, 신경세포 손상으로 유도되는 질병이나 퇴행성신경질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시예에 따르면 상기 방법은, 환자에게서 체세포를 분리하고 상기의 방법에 따라 상기 체세포에 기초하여 신경줄기세포를 제조하고, 및 상기 신경줄기세포를 환자에게 도입하는 것을 포함한다. 신경세포 손상으로 유도되는 질병이나 퇴행성신경질환을 치료하는 상기 방법을 사용하는 것은, 환자에게 얻어진 신경줄기세포를 효율적으로 도입할 수 있으며, 그것은 나아가 환자에서 신경세포로 분화할 수 있고, 또한 신경세포손상과 신경퇴화에 의하여 유도된 신체의 손상을 치료할 수 있으며, 그것은 신경세포 손상으로 유도되는 질병이나 퇴행성신경질환의 치료를 가능하게 할 수 있다.

본 발명의 열네번째 광범위한 관점에서의 실시예는, 신경시스템에 영향을 미치는 약제인지 아닌지를 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기의 방법은 본 발명의 실시예에 따르는 신경줄기세포를 약제에 적용시키는 것, 신경줄기세포에 약제를 적용시키기 이전 및 이후에 신경줄기세포를 확인하는 것, 상기 신경줄기세포의 변화에 기초하여 신경시스템에 영향을 미치는 약제인지 아닌지를 확인하는 것을 포함한다. 상기의 방법을 사용하는 것은 신경시스템에 영향을 미치는 약제인지 아닌지를 효율적으로 확인할 수 있다.

본 발명의 추가적인 측면과 실시예의 장점들은 이후의 상세한 설명을 통해 세부적으로 제공되며, 다음의 상세한 설명으로부터 부분적으로 명백해질 것이며 또는 본 발명의 실시예의 실행으로부터 얻어질 것이다.

본 발명의 신경줄기세포 제조에 대한 배지는 신경줄기세포를 효율적으로 제조하는데 응용될 수 있다. 체세포, 특히 전사제어인자(transcriptional regulation factor)를 발현하는 체세포를 배양하기 위하여 배지를 사용하는 것은, 매우 큰 시간적 단축과 함께 체세포를 신경줄기세포로 효율적으로 분화시킬 수 있다.

본 발명의 실시예에 대한 장점 및 다른 측면들은 첨부되는 도면을 참조하여 다음의 설명으로부터 명백하게 될 것이며 보다 손쉽게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 신경 줄기세포의 제조의 방법을 보여주는 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 신경 줄기세포의 제조의 시스템을 보여주는 구성도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 신경세포의 손상으로 유도되는 질병이나 퇴행성신경질환을 치료하는 방법을 보여주는 흐름도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 유도된 신경 줄기세포가 유도되는 도중에서의 다른 단계의 세포 형태를 보여주는 그림이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 RT-PCR(Real-Time PCR)과 면역형광법에 의해 결정된 유도 신경 줄기세포에서 신경 줄기세포의 표지유전자가 발현된 정도를 나타낸 그림이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 유도된 신경줄기세포로부터 유래하는 생체 외 분화산물 중에서 면역형광법에 의하여 결정되는 신경세포와 신경교세포의 다양한 종류에 대하여 특이적인 다른 종류의 표지들의 발현을 보여주는 그림이다.

참조 문헌들은 본 발명의 실시예를 상세하게 설명한다. 도면을 참조하여 이곳에 기재된 실시 예들은 일반적으로, 본 발명을 이해하기 위하여 사용되며 예시적이며 설명적이다. 실시 예는 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 동일하거나 유사한 구성 요소와 동일 또는 유사한 기능을 갖는 요소는 기재 전반에 걸쳐 동일한 참조 부호로 표시된다.

본 발명의 첫번째 광범위한 관점에서의 실시예는 신경줄기세포를 제조하기 위한 배지를 제공한다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 배지는 줄기세포를 배양하기 위한 기본 배지, 및 GSK 억제제, MEK 억제제, TGF-β억제제, ROCK 억제제 및 BMP 억제제로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 한 개의 억제제로 구성된다. 본 발명의 발명자들은 체세포, 특히 전사제어인자(transcriptional regulation factors)를 발현하는 체세포를 배양하기 위하여 상기 배지를 사용하는 것이 효율적으로 상기 체세포를 신경줄기세포로 전환분화할 수 있으며, 그것은 전환분화에 대한 시간을 크게 단축할 수 있음을 밝혀냈다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 기본 배지의 종류는 특히 제한적이지는 않다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 기본 배지는 mTeSR1이다(Stem Cell company에서 구매될 수 있다). 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 억제제의 종류 역시, 세포신호회로 억제제의 다양한 종류일 수 있으며 제한적이지 않다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 억제제는 GSK억제제 CHIR99021, MEK억제제 PD0325901, TGF-β억제제 A83-01, ROCK 억제제 thiazovivin 및 BMP억제제 DMH1를 포함할 수 있다. 상기 모든 억제제들은 상업적으로 입수 가능하며, 나아가 체세포에서 신경줄기세포로의 분화 과정의 효율성을 향상시킬 수 있는 것이다. 신경줄기세포 제조를 위한 배지에서의 상기 억제제 각각의 농도는 특히 제한적이지 않다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 억제제는 약 0.3μM에서 약 30μM의 GSK억제제 CHIR99021; 약 10nm에서 약 10μM의 MEK억제제 PD0325901; 약 50nm에서 약 5μM의 TGF-β억제제 A83-01; 약 50nm에서 약 5μM의 ROCK 억제제 thiazovivin; 및 약 20nm에서 약 2μM의 BMP억제제 DMH1를 포함할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 억제제는 약 3μM의 GSK억제제 CHIR99021, 약 1μM의 MEK억제제 PD0325901, 약 0.5μM의 TGF-β억제제 A83-01, 약 0.5μM의 ROCK 억제제 thiazovivin, 및 약 0.2μM의 BMP억제제 DMH1를 포함할 수 있으며, 이것에 의해 체세포에서 신경줄기세포로의 분화에 대한 효율성을 더욱 향상시킬 수 있다.

본 발명의 두번째 광범위한 관점에서의 실시예는 신경줄기세포를 제조하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 키트는 GSK억제제, MEK억제제, TGF-β억제제, ROCK 억제제 및 BMP억제제로 구성되는 그룹에서 선택되는 적어도 한가지의 억제제를 포함할 수 있다. 본 발명의 발명자들은 체세포, 특히 전사제어인자(transcriptional regulation factors)를 발현하는 체세포를 배양하기 위하여 상기 키트를 사용하는 것이, 효율적으로 체세포를 신경줄기세포로 전환분화하며, 그것은 전환분화에 대한 시간을 크게 단축할 수 있음을 밝혀냈다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 억제제의 종류가 특히 제한적이지는 않다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 억제제는 GSK억제제 CHIR99021, MEK억제제 PD0325901, TGF-β억제제 A83-01, ROCK 억제제 thiazovivin 및 BMP억제제 DMH1를 포함할 수 있다. 상기 모든 억제제들은 상업적으로 입수 가능하며, 나아가 체세포에서 신경줄기세포로의 분화과정의 효율성을 향상시킬 수 있다. 신경줄기세포 제조를 위한 배지에서의 억제제 각각의 농도는 특히 제한적이지 않다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 GSK억제제 CHIR99021, MEK억제제 PD0325901, TGF-β억제제 A83-01, ROCK 억제제 thiazovivin 및 BMP억제제 DMH1는 바람직하게 각기 다른 용기에 보관된다. 이에 따라, 상기 키트는 체세포에서 신경줄기세포로의 전환분화에 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 키트는 나아가 기본배지를 포함하고, 여기서 상기 기본배지는 mTeSR1이다(Stem Cell company에서 구매될 수 있다).

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 억제제의 존재는 특히 제한적이지 않다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 키트에 있어, 상기 억제제는 기본 배지에 용해되어있다. 이에 따라, 상기 키트는 체세포에서 신경줄기세포로의 전환분화에 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명의 실시예의 따르면, 상기 키트에 있어, 기본 배지에 용해되어 있는 상기 억제제는 약 3μM의 농도를 가진 GSK억제제 CHIR99021, 약 1μM의 농도를 가진 MEK억제제 PD0325901, 약 0.5μM의 농도를 가진 TGF-β억제제 A83-01, 약 0.5μM의 농도를 가진 ROCK 억제제 thiazovivin, 및 약 0.2μM의 농도를 가진 BMP억제제 DMH1로 구성된다. 이에 따라, 앞서 언급한 상기 키트를 사용하는 체세포에서 신경줄기세포로의 전환분화의 효율성은 나아가 향상될 수 있다.

본 발명의 세번째 광범위한 관점에서의 실시예는 신경줄기세포를 제조하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 기본 배지를 포함한다. 본 발명의 발명자들은 체세포(somatic cells), 특히 전사제어인자(transcriptional regulation factors)를 발현하는 체세포를 배양하기 위하여 상기 키트를 사용하는 것이, 효율적으로 상기 체세포를 신경줄기세포로 전환분화(transdifferentiate)할 수 있으며, 그것은 전환분화에 대한 시간을 크게 단축할 수 있음을 밝혀냈다. 신경줄기세포의 제조를 위한 상기 배지는 앞서 상세히 설명되어, 간결함을 위하여 설명을 배제한다.

본 발명의 네번째 광범위한 관점에서의 실시예는, 신경줄기세포의 제조에 있어서의 상기 언급된 키트의 용도에 대해 제공한다. 본 발명의 실시예에 따라 상기 키트를 사용하는 것은 체세포, 특히 전사제어인자(transcriptional regulation factors)를 발현하는 체세포를 효율적으로 배양할 수 있으며, 그것은 나아가 크게 단축된 시간과 함께 체세포를 신경줄기세포로 효율적으로 전환분화할 수 있다. 상기 키트에 관해서는 앞서 자세하게 설명되었으므로, 간결함을 위해 설명을 배제한다.

본 발명의 다섯번째 광범위한 관점에서의 실시예는, 생체 외에서 체세포, 특히 전사제어인자(transcriptional regulation factors)를 발현하는 체세포를 배양하는 것에 의하여 크게 단축된 시간과 함께, 체세포를 신경줄기세포로 효율적으로 전환분화할 수 있도록 하는, 신경줄기세포의 제조에 있어서의 앞서 언급된 상기 배지의 용도에 대해 제공한다. 상기 배지에 관해서는 앞서 자세하게 설명되었으므로 간결함을 위해 설명을 배제한다.

본 발명의 여섯번째 광범위한 관점에서의 실시예는, 신경줄기세포의 제조를 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은 앞서 언급된 배지를 사용하여 체세포를 배양하는 것을 포함하며, 여기서 상기 체세포는 체세포에서 신경 줄기세포로의 전환분화를 유도하는 다능성 줄기세포 인자를 인코딩(encoding)하는 핵산 서열을 포함하며, 상기 다능성 줄기세포인자는 Oct4, Sox2, Klf4 및 miR302로 구성되는 그룹에서 선택되는 적어도 한 가지이다. 본 발명의 발명자들은 특이적인 전사인자에 의하여 코드(coded)된 다능성 줄기세포인자의 핵산 서열을 가지고 있는 체세포를 배양하는데 있어서 본 발명의 실시예에 따르는 상기 배지를 사용함으로써, 시간이 크게 단축됨과 함께 효율적으로 체세포를 신경줄기세포로 전환분화할 수 있음을 밝혀냈다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 체세포의 종류는 특히 제한적이지는 않다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 체세포는 인체의 소변탈락세포(human urine exfoliative cell)이다. 이에 따라, 초기의 세포들은 통상적으로 얻어질 수 있으며, 나아가 이것은 신경줄기세포 제조의 효율성을 향상시킬 수 있어, 신경줄기세포의 제조에 대한 비용을 절감시키고, 또한 외과적인 수술을 통해 얻어지는 초기 세포획득에 대한 인력과 물질적 비용을 절약할 수 있다.

뿐만 아니라 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 체세포는 Oct4, Sox2, Klf4 및 miR302로 구성되는 그룹에서 선택되는 적어도 한 가지인 상기 다능성 줄기세포인자를 인코딩하는 핵산서열을 포함하며, 또한 생물학적 처리에 대하여 다능성 줄기세포인자 없이 체세포를 적용하는 것에 의해 얻어질 수 있다. 특이적으로, 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 체세포는 Oct4, Sox2, Klf4 및 miR302로 구성되는 그룹에서 선택되는 적어도 한 가지인 상기 다능성 줄기세포인자를 인코딩하는 핵산서열을 포함하며, 다음의 단계를 통해 얻어질 수 있다:

첫번째로, 침전물을 얻기 위해 사람의 소변을 원심분리한 뒤,

두번째로, 초대 인체의 소변탈락세포를 얻기 위하여, 소변의 배양을 위한 배지를 사용하여 침전물을 배양시키며,

마지막으로, 체세포를 얻기 위하여, Oct4, Sox2, Klf4 및 miR302로 구성되는 그룹에서 선택되는 적어도 한 가지인 다능성 줄기세포인자를 인코딩(encoding)하는 핵산 서열을 가지고 있는 담체(vector)를 사용하여 초대 인체의 소변탈락세포를 변형시킨다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 담체(vector)는 Oct4, Sox2, Klf4 및 miR302를 인코딩(encoding)하는 핵산서열을 가지고 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 담체(vector)는 각각 Oct4, Sox2, Klf4 및 miR302를 인코딩(encoding)하는 핵산서열을 가지고 있는 플라즈미드를 포함한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 초대 인체의 소변탈락세포는 전기적인 형질도입(electrical transduction)의 방법으로 인해 변형된다.

신경줄기세포를 얻은 후, 신경줄기세포는 나아가 증식성 배양에 적용시킨다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 신경줄기세포를 증식성 배양에 적용시키는 방법들은 특히 제한적이지는 않다. 본 발명의 실시예에 따르면, 신경줄기세포 제조의 방법은 나아가 다음의 상기 신경줄기세포를 증식성 배양에 적용시키는 단계들을 포함할 수 있다:

첫번째로, 부착신경줄기세포(adherent neural stem cell)를 얻기 위해 기본 배지를 사용하여 상기 신경줄기세포를 전배양하고, 여기서 상기 기본 배지는 mTeSR1이다.

두번째로, 신경줄기세포를 위한 배지에서 부착성 신경줄기세포를 배양하며, 여기서 신경줄기세포를 위한 상기 배지는 약 1% 질소(N2) 보충물과, 약 1% 비필수아미노산, 약 0.1% 헤파린(heparin), 약 20ng/ml 기본 FGF(fibroblast growth factor), 및 약 20ng/ml EGF(epidermal growth factor)가 보충된 DMEM/F2 배지를 포함한다.

본 발명의 일곱번째 광범위한 관점에서의 실시예는, 신경세포나 이의 유도체를 제공한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 앞서 언급한 상기 방법에 의하여 신경줄기세포가 얻어진다. 더하여, 본 발명의 실시예에 따른 상기 신경줄기세포 또는 이의 유도체는 적절한 조건하에서 효율적으로 신경세포로 분화할 수 있다.

본 발명의 여덟번째 광범위한 관점에서의 실시예는, 신경세포 손상으로 인해 유도된 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 앞서 언급한 상기 신경줄기세포 또는 이의 유도체의 용도를 제공한다. 본 발명의 실시예에 따른 신경줄기세포 또는 이의 유도체는 적절한 조건 하에서 효율적으로 신경세포로 분화될 수 있기 때문에, 이에 따라 신경줄기세포 또는 이의 유도체는 나아가 약제로 만들어질 수 있으며, 그것은 신경세포 손상으로 유도된 질병을 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 아홉번째 광범위한 관점에서의 실시예는, 신경세포의 손상으로 유도된 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은 앞서 언급한 신경줄기세포 또는 이의 유도체를 환자에게 도입하는 것을 포함할 수 있다. 앞서 언급한 신경줄기세포 또는 이의 유도체를 환자에게 도입함으로써, 상기 신경줄기세포는 신경세포로 효율적으로 분화할 수 있으며, 나아가 신경세포의 손상으로 인해 유도된 신체의 손상에 대한 치료법이 될 수 있다.

본 발명의 열번째 광범위한 관점에서의 실시예는, 신경줄기세포의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은 분화를 위하여 적합한 조건 하에서 앞서 언급한 신경줄기세포를 배양하는 것을 포함한다. 본 발명의 실시예에 따른 상기 방법을 사용하는 것은 신경줄기세포를 신경세포로 효율적으로 분화할 수 있으며, 그것은 효율적으로 신경세포를 제조할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 분화성 배양(differential culture)에 신경줄기세포를 적용시키는 방법들은 특히 제한적이지는 않다. 본 발명의 실시예에 따르면, 다른 종류의 신경세포와 신경교세포를 얻기 위하여, 약 1% 질소(N2) 보충물과, 약 1% 비필수아미노산, 약 0.1% 헤파린(heparin)과 뉴트로핀이 보충된 DMEM/F2 배지에서 신경줄기세포가 배양되고, 여기에서 상기 뉴트로핀의 구성은 약 10ng/ml BDNF, 약 10ng/ml GDNF, 약 10ng/ml CNTC, 약 10ng/ml IGF 이다.

본 발명의 열한번째 광범위한 관점에서의 실시예는, 신경줄기세포를 제조하는 시스템을 제공한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 도2에 따라, 시스템 1000은 분리장치 100, 변형장치 200, 전환분화장치 300을 포함한다. 여기서, 상기 장치 100은 사람의 소변에서 인체의 소변탈락세포를 분리하는데 사용된다. 변형장치 200은 상기 분리장치 100에 연결되어 있으며, Oct4, Sox2, Klf4 및 miR302로 구성되는 그룹에서 선택되는 적어도 한 가지인 다능성 줄기세포인자를 인코딩(encoding)하는 핵산서열을 가지고 있는 담체(vector)가 장착되어 있어, 분리장치 100에서 얻어진 인체의 소변탈락세포를 변형시키는데 사용된다. 전환분화장치 300은 상기 변형장치와 연결되어 있으며, 변형된 인체의 소변탈락세포가 신경줄기세포로 전환분화되는 것을 유도하기 위해, 상기 변형장치 200에서 얻어진 변형된 인체의 소변탈락세포를 전환분화에 적용하기 위하여, 앞서 언급한 상기의 배지가 장착된다. 상기 시스템을 사용하는 것은 앞서 언급한 상기의 신경줄기세포를 제조하는 방법을 효율적으로 향상시킬 수 있으며, 그것은 신경줄기세포를 효율적으로 제조할 수 있다.

본 발명의 열두번째 광범위한 관점에서의 실시예는, 신경줄기세포의 분화를 유도하기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은 후보 화합물과 앞서 언급된 상기 신경줄기세포를 접촉시키는 것과 후보 화합물과 신경줄기세포를 접촉시키는 단계 이전 및 이후에 각각 신경줄기세포의 다능성을 확인하는 것을 포함하고, 여기서 후보 화합물과 신경줄기세포가 접촉된 후, 상기 다능성의 감소는 신경줄기세포의 분화를 유도하는 능력을 갖는 후보 화합물의 지표가 된다. 상기 방법을 사용하는 것은 신경줄기세포의 분화를 유도하는 화합물을 얻기 위한 스크리닝을 효율적으로 할 수 있다.

본 발명의 열세번째 광범위한 관점에서의 실시예는, 신경세포 손상으로 유도되는 질병이나 퇴행성신경질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 도3을 참조하여, 상기 방법은 다음의 단계들을 포함할 수 있다: 첫번째로, 환자에게서 체세포를 분리한다. 두번째로, 상기의 방법에 따라 체세포에 기초하여 신경줄기세포를 제조한다. 그리고 상기 신경줄기세포를 환자에게 도입한다. 신경세포 손상으로 유도되는 질병이나 퇴행성신경질환을 치료하는 상기 방법을 사용하는 것은 환자에게 얻어진 신경줄기세포를 효율적으로 도입할 수 있으며, 이것은 나아가 환자에게 신경세포를 분화할 수 있도록 하고 신경세포손상과 신경퇴화로 유도된 신체의 손상을 치료할 수 있으며, 신경세포 손상으로 유도되는 질병이나 퇴행성신경질환을 치료하는 것을 가능하게 할 수 있다.

본 발명의 열네번째 광범위한 관점에서의 실시예는, 신경 시스템에 영향을 미치는 약제인지 아닌지를 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은 본 발명의 실시예에 따른 신경줄기세포를 약제와 접촉시키는 것과 신경줄기세포와 약제를 접촉시키기 이전 및 이후에 신경줄기세포를 확인하는 것, 신경줄기세포의 변화에 기초하여 신경 시스템에 영향을 미치는 약제인지 아닌지를 확인하는 것을 포함한다. 상기의 방법을 사용하는 것은 신경 시스템에 영향을 미치는 약제인지 아닌지 효율적으로 확인할 수 있다.

신경줄기세포 제조를 위한 배지와 이의 용도는 본 발명의 발명자들에 의해 힘든 창조적 노동과 최적의 용어를 통해 수행된다는 점에 유의해야 한다. 이에 더하여, 본 발명의 모든 측면에서 기술된 특징들은 각각 상호간에 참조되었으나 여기서 편의를 위해 배제되었다.

참조 문헌들은 본 발명의 실시예를 상세하게 설명한다. 하기 기재된 실시예들은 본 기술 분야에서 숙련된 자들에 의하여 예시적인 것으로 인식될 것이며, 또한 실시 예는 본 발명을 범위를 제한하는 것으로 해석될 수는 없다. 만약 특정 기술 또는 조건이 예시들에서 지정되지 않은 경우, 공정은 당 분야에서의 문헌에 기재된 기술 또는 조건에 따라, 또는 제품의 지침에 따라 수행될 것이다. 만약 시약이나 기기의 제조업체가 특정되지 않았으면, 시약 또는 기구는 상업적으로 입수 가능한 것이다.

실시예 1. 신경줄기세포의 제조

1.인체의 소변탈락세포(Urine cells, UC)를 분리함

소변탈락세포를 분리하는 것은 다음 단계들을 따랐다:

(1) 페니실린(Penicilin)/스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가한 살균용기에 소변의 중간뇨 150-200 mL를 모았다.

(2) 소변을 50 mL 원심분리 튜브에 옮기고 400 g 에서 10분간 원심분리하였다.

(3) 상등액을 제거하여 약 5 mL 정도의 소변을 남겼다.

(4) 페니실린(Penicilin)/스트렙토마이신(streptomycin)을 포함하는 약 10에서 30 mL의 PBS를 (3)단계에서 얻어진 소변에 첨가하고, 살살 섞어준 뒤 400 g에서 10분간 원심분리 시켰다.

(5) 남은 액체가 0.5 mL보다 적어질 때까지 상등액을 제거했다.

(6) 얻어진 침전물을 다시 현탁시키기 위해 소변의 남겨진 액체에 대하여 소변을 배양하기 위한 1 mL의 배지를 첨가하고 세포를 모았다.

(7) 0.1% 젤라틴에 의해 코팅되고 10% 소태아혈청(fetal bovine serum) (FBS, From PAA)과 페니실린(Penicilin)/스트렙토마이신(streptomycin)이 보충된 고-글루코스(high-glucose) DMEM (Dulbcco’s Modified Eagle Medium, From HyClone)을 균일하게 섞음으로써 얻어진 소변을 배양하기 위한 배지 1 mL와 SingleQuot Kit CC-4127 REGM Medium (From Lonza)가 가해진 60 mm 배양접시(또는 six-well plat)에 모은 세포를 접종했다.

(8) 세포가 접종된 배양접시를 37℃, 5% CO₂의 인큐베이터에 3일간 두었다.

(9) 세포가 접시의 바닥에 붙었는지 아닌지를 관찰하고, 소변 배양을 위한 배지 1mL를 살살 첨가하며, 지속적인 배양을 위하여 상기 세포가 접종된 배양접시를 37℃, 5% CO₂의 인큐베이터에 두었다.

(10) 접종일로부터 5일에서 7일 째 되었을 때에, 배양접시의 배지를 제거하고, 부착성 세포의 성장이 관찰되기 위하여 PBS로 한번 세척한 뒤, 소변을 배양하기 위한 신선한 배지를 배양접시에 첨가했다(항생제 없이).

(11) 세포의 성장 조건에 따라 배지를 바꿔주거나 첨가하였으며, 이때 0.25% 트립신(trypsin)을 이용하여 서브-배양(sub-culture)되는 것이 가능하다.

(12) 2번째 세대에서 초대 인체의 소변탈락세포를 수확하며, 동결시키고 사용을 위하여 액체질소 내에 동결 액체(frozen liquid) (90%FBS+10%DMSO)을 이용하여 저장했다.

2. 유도된 신경줄기세포(iNSC)의 유도

유도된 신경줄기세포의 유도를 위한 실험은 세포 제조, 플라즈미드의 전기적 형질도입, 세포 접종 유도, 세포 클론 선별, iNSC 증폭 및 기타를 포함했다.

상세하게는,

(1) 동결된 초대 인체 소변탈락세포를 융해하고, 10 cm dish (또는 six-well plate)에 접종하였다.

(2) 부착성 초대 인체소변탈락세포의 밀도(confluency)가 10 cm dish 내에서 약 90%가 될 때, 0.25% 트립신을 사용하여 부착성 세포를 용해시키고, 그런 다음 용해된 세포(digested cell)를 수확하고 숫자를 계산했다.

(3) 적합한 세포의 개수(모든 전기적인 형질도입(electrical transduction)시스템에서 세포의 개수 범위는 500,000에서 1,500,000이다.)를 갖고 있는 용해된 세포(digested cell)를 1.5mL 의 EP 튜브에 옮기고 200 g에서 5분간 원심분리 시켰다.

(4) (3)단계에서 얻어진 상등액을 버리고, 전기적인 형질도입(electrical transduction)의 컵(cup)안으로 얻어진 세포 침전물을 거둬들였다.

(5) 플라즈미드 변형 시스템 준비: 82μL의 포유류의 상피세포(Mammalian Epithelial Cells)를 위한 Basic Nucleofector® Solution과 18μL의 보충액 1 (Lonza)을 순서대로 첨가하고 살살 섞은 후에, 플라즈미드 변형 시스템을 얻기 위해 5μg의 플라즈미드를 충분하게 섞는 것과 함께 첨가하였으며, 이때 상기 플라즈미드는 pCEP4-O2SET2K (3μg) 와 pCEP4-miR-302 (2μg)를 포함한다.

(6) (4)단계에서 언급되었던 컵(cup)을 Amaxa electroporator (Lonza) 에 위치시키고 T-013(또는 T-020) 과정을 선택하여 전기적인 형질도입(electrical transduction)을 시행하였다.

(7) 전기적으로 형질도입(electrical transduction)된 세포를 한 웰(well)당 100,000에서 300,000의 세포의 접종 밀도로 Matrigel로 코팅된 six-well plate(또는 10 cm dish)안으로 이동시키고, 세포의 상태에 따라 조정하며 그리고 소변을 배양하는 세포(culturing urine cell)를 위한 배지를 첨가했다.

(8) 소변을 배양하는 세포를 위한 배지를 3μM의 CHIR99021, 1μM의 PD0325901, 0.5μM의 A83-01 (Tocris Bioscience), 0.5μM의 thiazovivin 및 0.2μM의 DMH1 (Tocris Bioscience)을 포함하고 있는 mTeSR1배지로 (7)단계의 접종한 날로부터 2일 되었을 때(또는 형질도입 후 2일) 갈아주며, 여기서 상기 mTeSR1배지는 본 발명의 신경줄기세포의 제조를 위해 사용되는 것으로, 세포 배양에 사용되고 또한 매 2일마다 갈아주었다.

(9) 세포 클론을 선별하고 기계적인 방법에 의해 작은 조각들로 분배하였다. 그리고 선별된 세포들을 Matrigel가 코팅된 six-well plate(또는 twelve-well plate)에 접종하고, 접종된 세포들을 종래의 mTeSR1 배지에서 배양하며, 여기서 전기적으로 형질도입(electrical transduction)된 세포에서부터, 적당한 사이즈, 뚜렷한 가장자리 그리고 촘촘한 배열을 갖는 형상의 세포 클론이 전기적 형질도입(electrical transduction)으로부터 12 에서 15일 되었을 때 얻어졌다.

(10) 부착성 세포가 관찰되면 새로운 배지로 갈아주고, 부착성 세포를 3일에서 5일 가량 더 배양하고, 매일 배지를 갈아주며 그것에 의하여, 로제트와 같은 신경구조체 또는 극성 모양으로 배열된, 많은 숫자의 신경줄기세포와 같은 세포 무리가 관찰되었다.

(11) 기계적인 방법으로 신경줄기세포와 같은 세포무리를 선별하며, 1mL 피펫으로 신경줄기세포와 같은 세포무리를 살살 파이펫팅(pipetting)하여, 신경줄기세포와 같은 세포무리를 작은 조각들이나 단세포들로 파이펫팅(pipetting)하고, 다음으로 신경줄기세포를 배양하기 위한 배지가 들어있는 T25 flask로 얻어진 단세포들을 옮겼으며, 이때 신경줄기세포를 배양하기 위한 상기 배지는 약 1% 질소(Gibco) 보충물과, 약 1% 비필수아미노산(NEAA, Gibco), 약 0.1% heparin(Sigma), 약 20ng/ml 기본 FGF(fibroblast growth factor, (bFGF, Invitrogen)), 약 20ng/ml EGF(epidermal growth factor, R&D System)가 보충된 DMEM/F2 배지를 포함하는 것이다.

(12) T25 flask에서 1주일 동안 배양이 중단된 단세포에서, 뚜렷한 경계선을 가지고 있는 신경세포 영역을 얻고 (상기 신경세포의 영역은 P1세대의 신경세포영역으로 정의된다.), 원래 있었던 배지 반 정도의 부피를 매 2~3일마다 갈아주었다.

(13) 단세포들이 7일에서 14일 정도 배양되고 신경세포영역의 크기를 가질 때, 즉 다시 말해, T25 flask로 단일세포들을 이동한 날로부터 7번째에서 14번째 날이 되었을 때, 신경세포의 영역을 계대하고, 신경줄기세포의 배양을 위한 배지에서 배양하고, 직경이 300 μm 을 초과하는 신경세포영역들을 선별하고 15 mL의 원심분리 튜브에 이동시켜, 상기 신경세포영역을 침전시키거나 50 g에서 1분에서 2분 가량 원심분리시키고, 얻어진 상등액을 제거한 후, 37℃에서 3분에서 5분 동안 1 mL의 Accutase와 함께 용해시켰다.

(14) 신경줄기세포를 배양하기 위한 배지를 반응시스템이 10mL의 부피를 가질 때까지 상기 원심분리 튜브에 첨가하고 200g 에서 5분간 원심분리했다. (여기서 상기 신경줄기세포를 배양하기 위한 배지는 약 1% 질소(Gibco) 보충물과, 약 1% 비필수아미노산(NEAA, Gibco), 약 0.1% heparin(Sigma), 20ng/ml 기본 fibroblast growth factor (bFGF, Invitrogen) 및 20ng/ml 소태아혈청(epidermal growth factor)(EGF, R&D System)이 보충된, DMEM/F2배지를 포함한다.)

(15) (14)단계에서 얻어진 상등액을 제거하고, 줄기세포를 배양하기 위한 적은 양의 배지(약 500μL)를 넣고 살살 섞어주었다. 그리고 세포 덩어리를 1 mL 파이펫을 이용하여 작은 조각이 될 때까지 살살 파이펫팅(pipetting) 해주고, 신경줄기세포를 배양하기 위한 1ml의 배지를 원심분리 튜브에 첨가하고, 두번째 세대의 신경세포영역을 얻기 위해 새로운 플라스크에서 균일하게 섞어준 다음 얻어진 세포들을 접종했다.

선택적으로, 도립형 현미경(Olympus, BX51)은 관찰 및 도4에서 보여지는 바와 같이, 초대 인체의 소변탈락세포에서 유도된 신경줄기세포의 제조과정 동안 다양한 세포의 단계들에서의 세포 형태를 촬영하기 위해 사용되었다.

도 4는 본 발명의 실시예에 따라 유도된 신경줄기세포를 유도하는 동안 다양한 단계들의 세포 형태를 보여주는 그림이다.

도 4에서 보여지는 바와 같이, A는 초대 인체의 소변탈락세포를 보여주고; B는 전기적 형질도입이 적용됨으로써 셀 클론이 유도되는 것을 보여주며; C 는 선별된 부착성 셀 클론의 형태이다; D 는 줌율(zoom factor) 100에서 iNSC 의 신경세포영역이다.

실시예 2. 유도된 줄기세포(iNSC)의 Phenotype 확인

1.면역형광법을 이용한 iNSC에서의 NSC 마커의 발현확인

(1) 24-well plate에 Matrigel로 코팅된 슬라이드를 놓고, 실시예 1에서 준비된 소량의 iNSC의 신경세포 영역을 5개에서 10개 슬라이드에 부착했다. 그리고 100 μL의 상기의 신경줄기세포 배양을 위한 배지를 첨가하고, 다음날 각각의 24-well plate에 신경줄기세포 배양을 위한 배지 500 μL를 첨가하고 1일에서 2일 배양했다.

(2) (1)단계에서 얻어진 배양된 세포를 고정시키기 위해 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 실온에서 20분간 두었다.

(3) 각 횟수마다 5분씩 PBS로 고정된 세포를 3번 씻어냈다.

(4) (3)단계에서 얻어진 세포를 초대 항체(Pax6, Nestin, Sox1 or Sox2), 1% BSA, 10% normal goat serum, 0.3% Triton-X이 첨가된 PBS에 4℃에서 밤새 인큐베이팅 시켰다.

(5) (4)단계에서 얻어진 세포를 각 횟수마다 5분씩 PBS로 3번 씻어냈다.

(6) (5)단계에서 얻어진 세포를 Alexa 568 또는 488로 표지된 두번째 항체(Invitrigen) 와 함께 실온에서 암전 하에, 1시간 동안 인큐베이팅 시켰다.

(7) (6)단계에서 얻어진 세포를 각 횟수마다 5분씩 PBS로 3번 씻어냈다.

(8) (7)단계에서 얻어진 세포에 DAPI (Sigma)를 넣고 3분간 실온에서 암전 하에, 인큐베이팅 시켰다.

(9) (8)단계에서 얻어진 세포를 각 횟수마다 5분씩 PBS로 3번 씻어냈다.

(10) (9)단계에서 얻어진 세포를 가진 슬라이드를 고정시키고, 사진기로 샘플을 관찰했다. 그의 결과는 도5에 보이는 바와 같다.

2.Real-Time PCR로 유도된 신경줄기세포(iNSC)에서 신경줄기세포 표지의 발현확인

첫번째로, Trizol reagent (Takara)은 생산자에 의해 제공되는 세부사항에 따라 실시예1의 메뉴얼에서 제조된 유도된 신경줄기세포의 총 RNA를 추출하기 위해 사용되었다. 그리고 M-MLV kit (Takara)는 cDNA를 얻기 위해 추출된 총 RNA를 역전사시키기 위해 사용되었고, SYBR® Premix Ex TaqTM kit (Takara)과 ABI 7300 형광정량 PCR기계는 얻어진 cDNA을 Real-Time PCR하여 신경줄기세포의 표지유전자의 발현을 확인하기 위해 사용되었으며, 그의 결과는 도 5에 보이는 바와 같다. Real-Time PCR 프라이머의 서열은 아래와 같다.

프라이머 명칭 (Primer name)	프라이머의 염기서열 Sequence of primer (SEQ ID NO：)
PAX6-F	ATGTGTGAGTAAAATTCTGGGCA (1)
PAX6-R	GCTTACAACTTCTGGAGTCGCTA (2)
SOX1-F	CAGTACAGCCCCATCTCCAAC (3)
SOX1-R	GCGGGCAAGTACATGCTGA (4)
NESTIN-F	CTGGAGCAGGAGAAACAGG (5)
NESTIN-R	TGGGAGCAAAGATCCAAGAC (6)
SOX2-F	CCCAGCAGACTTCACATGT (7)
SOX2-R	CCTCCCATTTCCCTCGTTTT (8)

주: F: 정방향(forward); R: 역방향(reverse).

도5는 본 발명의 실시예에 따라서 Real-Time PCR과 면역형광법에 의해 확인된 유도된 신경줄기세포에서 신경줄기세포의 표지유전자의 발현 정도를 보이는 그림이다. 도5에서 보이는 바와 같이, A와 B는 면역형광법에 의한 염색결과이고, A는 iNSC에서 Pax6 Nestin 모두 발현되었음을 나타내며, B는 iNSC에서 Sox1(B)이 발현되었음을 나타낸다; C는 Real-Time PCR 검출 결과로서, 이것은 각각 iNSC에서 Sox2, Pax6, Sox1 및 Nestin의 발현 정도를 보여주고, 여기서 UC는 소변세포, iPS는 초대 인체의 소변탈락세포에서 유도된 다능성 줄기세포를 나타낸다.

3. 생체외 Incs의 분화능 확인

Matrigel로 코팅된 슬라이드를 24 well-plate 에 놓고, 실시예 1에서 얻어진 iNSC 신경영역(유도된 신경세포)을 슬라이드에 부착하여 24 well-plate의 각각의 well 놓고, 100 μL의 신경줄기세포 배양을 위한 배지를 그것에 첨가하고, 1 mL의 신경세포분화를 위한 배지를 24-well plate의 각 well에 다음날 첨가했다. 그리고 세포들을 1일에서 2일정도 배양하였으며, 여기서 상기 신경의 분화를 위한 배지는 약 1% 질소(Gibco) 보충물과, 약 1% 비필수아미노산(NEAA, Gibco), 약 0.1% 헤파린(Sigma) 및 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 10 ng/mL CNTC 및 10 ng/mL IGF로 이루어진 neurotrophinbasic (Peprotech) 가 보충된 DMEM/F2 배지를 포함하는 것이다.

신경분화배양을 위한 배지는 매 2일마다 신경분화를 위한 원래 배지의 양의 절반의 부피 정도를 갈아주었다. 유도된 신경줄기세포의 생체외 분화 생성물은 앞서 언급한 배양의 2주 뒤에 얻어졌다. 그리고 Tuj, Map2, Dcx, TH, GABA, Glutamine, GFAP proteins 과 같은 유도된 신경줄기세포의 생체 외 분화 생성물의 발현은 면역형광법에 의해 측정되었으며, 이의 결과는 도 6에 참조 되어진다.

상세하게, TH, GABA, Glutamine 및 GFAP proteins들은 신경세포와 신경교세포의 다양한 종류에 대한 특이적인 마커이며, 생체 내/외 분화에서의 유도된 신경줄기세포에서 얻어진 신경세포와 신경교세포는 각각, 유도된 신경줄기세포의 생체 외 분화 생성물에서의 Tuj, Map2, Dcx, TH, GABA, Glutamine 및 GFAP proteins의 발현을 측정함으로써 확인할 수 있으며, 나아가 유도된 신경줄기세포의 생체 외 분화능을 확인할 수 있다.

도 6은 본 발명의 실시예에 따른 면역형광법에 의한, 유도된 신경줄기세포에서의 생체 외 분화 생성물 중, 신경세포와 신경교세포의 다양한 종류에 대한 다른 특이적인 마커의 발현을 보여준다.

도 6에서 보이는 것과 같이, A는 iNSC가 자연스럽게 다량의 신경세포와 신경교세포로 형성된 것을 보여준다; B는 유도된 신경줄기세포의 생체 외 분화 생성물에 있어서 Map2와 GABA가 발현되었음을 보여준다. C는 유도된 신경줄기세포의 생체 외 분화 생성물에서 Map2와 Glutamine가 발현되었음을 보여준다; D는 유도된 신경줄기세포의 생체 외 분화 생성물에서 TH가 발현되었음을 보여준다; E는 유도된 신경줄기세포의 생체 외 분화 생성물에서 Tuj와 GFAP (astrocyte marker)가 발현되었음을 보여준다; F는 유도된 신경줄기세포의 생체외 분화 생성물에서 Dcx와 Tuj 가 발현되었음을 보여준다;

이 명세서를 통해 참조 해야 할 것은, “실시 예”, “어떠한 실시 예들”,”하나의 실시 예 “, “ 또 다른 예”,”한 예”,“ 상세한 예들” 또는 “ 어떠한 예들”은, 상기 실시예 또는 예에 연관된 특정한 형태, 구조, 물질, 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시예 또는 예에 포함되어 있음을 의미한다.

따라서, 이 명세서를 통해 다양한 곳에서, “어떠한 실시 예에서”, “하나의 실시 예에서”. “실시 예에서”, “ 또 다른 예에서”, ‘한 예에서’, “특정한 예시에서”, 또는 “ 어떠한 실시 예에서”과 같은 문구의 표현은 본 발명의 동일한 실시 예 또는 예시를 필수적으로 참조하지는 않는다. 나아가, 특정한 형태, 구조, 물질, 또는 특성들은 하나 또는 초과의 실시예들 또는 예들과 어떤 적당한 방법으로 결합될 수 있다.

설명하기 위한 실시 예가 설명되고 보여지지만, 앞의 실시예들이 본 발명을 한정하는 것이 될 수 없음은 당 기술 분야의 숙련된 자들에게 이해될 수 있을 것이며, 변형물, 대체물 및 수정물은 본 발명의 취지, 원리 및 범위에서 벗어나지 않고 상기 실시 예들에서 만들어질 수 있다.

Claims

GSK 억제제, MEK 억제제, TGF-β억제제, ROCK 억제제 및 BMP 억제제로 구성된 그룹에서 선택되는 적어도 한 가지인 억제제, 및
줄기세포의 배양을 위한 기본배지를 포함하는 신경줄기세포의 제조를 위한 배지.
제1항에 있어서,
상기 기본 배지는 mTeSR1인 것을 특징으로 하는 배지.
제1항에 있어서,
상기 억제제는 GSK억제제 CHIR99021, MEK억제제 PD0325901, TGF-β억제제 A83-01, ROCK 억제제 thiazovivin 및 BMP억제제 DMH1을 포함하는 것을 특징으로 하는 배지.
제3항에 있어서,
상기 억제제는,
농도가 0.3μM 내지 약 30μM인 GSK억제제 CHIR99021,
농도가 10nm 내지 약 10μM인 MEK억제제 PD0325901,
농도가 50nm 내지 약 5μM인 TGF-β억제제 A83-01,
농도가 50nm 내지 약 5μM인 ROCK 억제제 thiazovivin, 및
농도가 20nm 내지 약 2μM인 BMP억제제 DMH1을 포함하는 것을 특징으로 하는 배지.
제3항에 있어서,
상기 억제제는,
농도가 3μM인 GSK억제제 CHIR99021,
농도가 1μM인 MEK억제제 PD0325901,
농도가 0.5μM인 TGF-β억제제 A83-01,
농도가 0.5μM인 ROCK 억제제 thiazovivin, 및
농도가 0.2μM인 BMP억제제 DMH1을 포함하는 것을 특징으로 하는 배지.
GSK억제제, MEK억제제, TGF-β억제, ROCK 억제제 및 BMP억제제로 구성되는 그룹에서 선택되는 적어도 한 가지인 억제제를 포함하는 신경세포를 제조하기 위한 키트.
제6항에 있어서,
상기 억제제는 GSK억제제 CHIR99021, MEK억제제 PD0325901, TGF-β억제제 A83-01, ROCK 억제제 thiazovivin 및 BMP억제제 DMH1을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제7항에 있어서,
상기 GSK억제제 CHIR99021, MEK억제제 PD0325901, TGF-β억제제 A83-01, ROCK 억제제 thiazovivin 및 BMP억제제 DMH1는 각각 다른 용기에 담겨있는 것을 특징으로 하는 키트.
제6항에 있어서,
상기 키트는 추가로 mTeSR1인 기본 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제9항에 있어서,
상기 억제제는 상기 기본 배지에 용해되는 것을 특징으로 하는 키트.
제10항에 있어서,
상기 억제제는 3μM의 농도를 가진 GSK억제제 CHIR99021, 1μM의 농도를 가진 MEK억제제 PD0325901, 0.5μM의 농도를 가진 TGF-β억제제 A83-01, 0.5μM의 농도를 가진 ROCK 억제제 thiazovivin, 및 0.2μM의 농도를 가진 BMP억제제 DMH1를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 배지를 포함하는 신경줄기세포 제조를 위한 키트.
신경줄기세포의 제조에 있어서의 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항의 키트의 용도.
신경줄기세포의 제조에 있어서의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 배지의 용도.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 배지를 사용하여 체세포를 배양하는 것을 포함하는 신경줄기세포의 제조 방법으로, 상기 체세포는 상기 체세포에서 상기 신경 줄기세포로의 전환분화를 유도하는 다능성 줄기세포 인자를 인코딩(encoding)하는 핵산 서열을 포함하며, 상기 다능성 줄기세포 인자는 Oct4, Sox2, Klf4 및 miR302로 구성되는 그룹에서 선택되는 적어도 한 가지인 것을 특징으로 하는 신경줄기세포의 제조 방법.
제15항에 있어서,
상기 체세포는 인체의 소변탈락세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서,
상기의 체세포는:
인체의 소변을 원심분리하여 침전물을 획득하고,
초대 인체의 소변탈락세포를 얻기 위하여 소변 배지를 사용하여 상기 침전물을 배양하며, 및
상기 체세포를 얻기 위하여 다능성 줄기세포인자를 인코딩(encoding)하는 핵산서열을 가지고 있는 담체(vector)를 사용하여 초대 인체의 소변탈락세포를 변형하며, 상기 다능성 줄기세포인자는 Oct4, Sox2, Klf4 및 miR302로 구성되는 그룹에서 선택되는 적어도 한 가지인 것을 특징으로 하는 방법.
제17항에 있어서,
상기 담체(vector)는 Oct4, Sox2, Klf4 및 miR302을 인코딩(encoding)하는 핵산서열을 가진 것임을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,
상기 담체(vector)는 각각 Oct4, Sox2, Klf4 및 miR302의 각각을 인코딩하는 핵산서열을 가지고 있는 플라즈미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제17항에 있어서,
상기 초대 인체의 소변탈락세포는 전기적인 형질도입(electrical transduction)에 의하여 변형되는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서,
부착신경줄기세포를 얻기 위해 기본배지를 사용하여 상기 신경줄기세포를 전배양하고,
1% 질소(N2) 보충물과, 1% 비필수아미노산, 0.1% 헤파린(heparin), 20ng/ml 염기성 섬유아세포성장촉진인자(fibroblast growth factor), 20ng/ml 표피성장인자(epidermal growth factor)가 보충된 DMEM/F2 배지를 포함하는, 신경줄기세포를 위한 배지에서 부착신경줄지세포를 배양하는 것을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
신경줄기세포 또는 그의 유도체로서, 상기 신경줄기세포는 제 15항 내지 제21항 중 어느 한 항의 방법으로 얻어지는 것인 신경줄기세포 또는 그의 유도체.
신경세포의 손상으로 인해 유도된 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 제22항의 신경줄기세포 또는 그의 유도체의 용도.
환자에게 제22항의 신경줄기세포 또는 그의 유도체를 도입하는 것을 포함하는, 신경세포의 손상으로 인해 유도된 질병을 치료하는 방법.
분화를 위한 적합한 환경 하에서 제22항의 신경줄기세포를 배양하는 것을 포함하는, 신경세포의 제조방법.
제25항에 있어서,
다른 종류의 신경세포와 신경교세포를 얻기 위하여, 1% 질소(N2) 보충물과 1% 비필수아미노산, 0.1% 헤파린과 뉴로트로핀(neurotrophin), 상기 뉴트로핀은 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 10 ng/mL CNTF 및 10 ng/mL IGF으로 구성된 것으로 보충된 DMEM/F12 배지에서 상기 신경줄기세포를 배양하는 것을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
신경줄기세포를 제조하는 시스템으로서:
사람의 소변에서 인체의 탈락세포를 분리하기 위한 분리장치,
상기 분리장치에 연결되어 있으며, Oct4, Sox2, Klf4 및 miR302로 구성되는 그룹에서 선택되는 적어도 한 가지인 다능성 줄기세포인자를 인코딩(encoding)하는 핵산서열을 가지고 있는 담체(vector)가 장착되어 상기 인체의 소변탈락세포를 변형시키는데 사용되는 변형장치, 및
상기 변형장치와 연결되어 있으며, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 배지가 장착되어, 변형된 인체의 소변탈락세포를 전환분화하는데 적용되고, 변형을 거친 상기 인체의 소변탈락 세포가 상기 신경줄기세포로 전환분화하는 것을 유도하기 위한 전환분화장치를 포함하는 시스템.
신경줄기세포의 분화를 유도하는 화합물을 스크리닝하는 방법으로서,
후보 화합물과 제22항의 신경줄기세포를 접촉시키는 단계, 및
상기 후보 화합물과 신경줄기세포를 접촉시키는 단계 이전 및 이후에 신경줄기세포의 다능성을 확인하는 단계를 포함하되,
여기서 후보 화합물과 신경줄기세포가 접촉된 후, 상기 다능성이 감소하는지 아닌지에 기초하여 상기 후보 화합물이 신경줄기세포의 분화를 유도하는 능력을 갖는지 아닌지를 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
신경세포의 손상으로 유도되는 질병이나 퇴행성신경질환을 치료하는 방법으로서:
환자에서 성체줄기세포를 분리하고,
제15항 내지 제21항 중 어느 한 항의 방법에 따라 체세포에 기초하여 신경줄기세포를 제조하고, 및
환자에게 신경줄기세포를 도입하는 것을 포함하는 방법.
신경 시스템에 영향을 미치는 제제인지 아닌지 판단하는 방법으로서:
제22항의 신경줄기세포와 제제를 접촉시키고, 및
신경줄기세포와 제제를 접촉시키는 단계 이전 및 이후에 신경줄기세포를 확인하고,
신경줄기세포의 변화에 기초하여 신경시스템에 영향을 미치는 제제인지 아닌지 판단하는 단계를 포함하는 방법.