CN110684735A - 一种快速增殖神经干细胞培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种快速增殖神经干细胞培养基，包括以下组成：以DMEM/F12培养基为基材，表皮细胞生长因子的含量为15～25ng/mL、转铁蛋白的含量为10～15μg/mL、碱性成纤维细胞生长因子的含量为15～25ng/mL、纤连蛋白的含量为15～25ng/mL、四型胶原蛋白组的含量为50～70ng/mL、抗生素的含量为0.05～0.13mg/mL、牛血清白蛋白的含量为40～60μg/mL、非必需氨基酸的含量为8～10μmol/mL以及B27细胞培养添加剂。通过非必需氨基酸为神经干细胞所必须的营养物质，避免因为营养物质吸收不完全造成的细胞分化现象，同时抗生素的添加减少分类过程中毒素影响的分裂速度。

Description

一种快速增殖神经干细胞培养基
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种快速增殖神经干细胞培养基。
背景技术
随着社会的发展与科技的提升，美容从内容到形式上都有着不断的变化和提升。根据美容内涵的不同，现代美容可分为生活美容和医学美容两大部分。一般意义上生活美容是通过专业的护肤化妆品和专业的美容仪器作为辅助器械，对人体的面部肌肤进行全方位的护理和保养，但是这种保养的期限有限，需要经常性维护，以便更好的维护面部肌肤。还有一种通过医学治疗手段对面部肌肤进行一系列手术治疗，以便长时间来维护面部肌肤，但这种方法存在一定的手术危险性，并且使用的药物会长时间残留于人体皮肤内，会导致对人体的二次伤害。
神经干细胞(neural stem cell)是指存在于神经系统中，具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，从而能够产生大量脑细胞组织，并能进行自我更新，并足以提供大量脑组织细胞的细胞群。同时他也是一类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞。
但是由于神经干细胞的分裂能力强，在进行培养时，需要长时间存在于培养基中进行生长，但神经干细胞在生长过程中需要多种营养物质进行生长，同时在神经干细胞生长过程中，不同时期所需要的营养物质需求存在一定区别，需要对培养基的选材更加严格，但大多数培养基的营养成分单一，严重影响了神经干细胞的增殖速度，在一定的时间内难以获得足够的细胞数量。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速增殖神经干细胞培养基，解决了现有技术中存在培养基成分单一，影响神经干细胞的增殖速度。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种快速增殖神经干细胞培养基，包括以下组成：以DMEM/F12培养基为基材，表皮细胞生长因子的含量为15～25ng/mL、转铁蛋白的含量为10～15μg/mL、碱性成纤维细胞生长因子的含量为15～25ng/mL、纤连蛋白的含量为15～25ng/mL、四型胶原蛋白组的含量为50～70ng/mL、抗生素的含量为0.05～0.13mg/mL、牛血清白蛋白的含量为40～60μg/mL、非必需氨基酸的含量为8～10μmol/mL以及B27细胞培养添加剂。
进一步的，所述抗生素由含量为90～110U/mL青霉素、0.05～0.13mg/mL链霉素、200～300ng/mL两性霉素混合而成。
进一步的，所述非必需氨基酸为谷氨酸、酪氨酸、脯氨酸、甘氨酸、胱氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸或丝氨酸的其中一种或混合。
进一步的，所述B27细胞培养添加剂的体积含量占DMEM/F12培养基的2～3％。
快速增殖神经干细胞培养基的使用方法，包括以下操作步骤：
于35～39℃温度环境下、空气CO2含量3～8％下，将神经干细胞培养基置于无菌环境下，随后将神经干细胞贴壁培养，每2～3d更换培养基，待神经干细胞细胞达到90％融合度后消化，按1:4比例传代。
进一步的，所述培养的神经干细胞密度为5×104～1×105/mL。
进一步的，所述接种密度为2-5×104/cm2。
进一步的，所述培养基新添加的量为原培养基量的2/3。
本发明的有益效果：
1、本发明通过将DMEM/F12培养基为基础培养基，胰岛素，转铁蛋白，碱性成纤维细胞生长因子能够为神经干细胞提供充足的营养物质，即便后期神经干细胞呈对数增长，其中的非必需氨基酸能够提供神经干细胞的生长需要，有助于建立稳定、可靠的神经干细胞体培养模型，避免神经干细胞的由于分裂过快造成营养缺失细胞生长出现局部分化。
2、本发明的原料中添加的抗生素可减少神经干细胞在分裂时毒素对分裂的新生细胞的影响。而抗生素由青霉素、链霉素、两性霉素混合而成，在减少毒素影响的同时浓度较低的抗生素并不影响神经干细胞分裂时的自身免疫错乱，以便提高其整体的分裂速度。
3、本发明的干细胞培养基的使用方法，培养的肪干细胞经测试未发现分化和生长减慢的现象，在自然无菌环境下培养，无需额外的费用支出，可减少培养成本。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本发明实施例提供一种快速增殖神经干细胞培养基，包括以下组成：以DMEM/F12培养基为基材，表皮细胞生长因子的含量为20ng/mL，转铁蛋白的含量为10μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的含量为20ng/mL，纤连蛋白的含量为25ng/mL，四型胶原蛋白组的含量为50ng/mL，抗生素由抗生素由含量为90U/mL青霉素、0.13mg/mL链霉素、300ng/mL两性霉素混合而成，牛血清白蛋白的含量为60μg/mL，非必需氨基酸的含量为9μmol/mL以及体积含量占DMEM/F12培养基的2％的B27细胞培养添加剂。
其中，非必需氨基酸为谷氨酸、酪氨酸、脯氨酸、甘氨酸、胱氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸或丝氨酸的其中一种或混合。
一种快速增殖神经干细胞培养基的使用方法，包括以下操作步骤：
接种密度为2-5×104/cm2，于39℃温度环境下、空气CO2含量8％下，将神经干细胞培养基置于无菌环境下，随后将神经干细胞贴壁培养，每3d更换培养基，培养基新添加的量为原培养基量的2/3，待神经干细胞细胞达到90％融合度后消化，按1:4比例传代。培养的神经干细胞密度为5×104～1×105/mL。
实施例2：
本发明实施例提供一种快速增殖神经干细胞培养基，包括以下组成：以DMEM/F12培养基为基材，表皮细胞生长因子的含量为15ng/mL，转铁蛋白的含量为15μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的含量为25ng/mL，纤连蛋白的含量为15ng/mL，四型胶原蛋白组的含量为60ng/mL，抗生素由抗生素由含量为95U/mL青霉素、0.05mg/mL链霉素、250ng/mL两性霉素混合而成，牛血清白蛋白的含量为40μg/mL，非必需氨基酸的含量为8μmol/mL以及体积含量占DMEM/F12培养基的3％的B27细胞培养添加剂。
其中，非必需氨基酸为谷氨酸、酪氨酸、脯氨酸、甘氨酸、胱氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸或丝氨酸的其中一种或混合。
一种快速增殖神经干细胞培养基的使用方法，包括以下操作步骤：
接种密度为2-5×104/cm2，于39℃温度环境下、空气CO2含量8％下，将神经干细胞培养基置于无菌环境下，随后将神经干细胞贴壁培养，每3d更换培养基，培养基新添加的量为原培养基量的2/3，待神经干细胞细胞达到90％融合度后消化，按1:4比例传代。培养的神经干细胞密度为5×104～1×105/mL。
实施例3：
本发明实施例提供一种快速增殖神经干细胞培养基，包括以下组成：以DMEM/F12培养基为基材，表皮细胞生长因子的含量为25ng/mL，转铁蛋白的含量为12μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的含量为15ng/mL，纤连蛋白的含量为20ng/mL，四型胶原蛋白组的含量为70ng/mL，抗生素由抗生素由含量为110U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、200ng/mL两性霉素混合而成，牛血清白蛋白的含量为50μg/mL，非必需氨基酸的含量为10μmol/mL以及体积含量占DMEM/F12培养基的2％的B27细胞培养添加剂。
其中，非必需氨基酸为谷氨酸、酪氨酸、脯氨酸、甘氨酸、胱氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸或丝氨酸的其中一种或混合。
一种快速增殖神经干细胞培养基的使用方法，包括以下操作步骤：
接种密度为2-5×104/cm2，于39℃温度环境下、空气CO2含量8％下，将神经干细胞培养基置于无菌环境下，随后将神经干细胞贴壁培养，每3d更换培养基，培养基新添加的量为原培养基量的2/3，待神经干细胞细胞达到90％融合度后消化，按1:4比例传代。培养的神经干细胞密度为5×104～1×105/mL。
综上所述，本发明提供的将DMEM/F12培养基为基础培养基，胰岛素，转铁蛋白，碱性成纤维细胞生长因子能够为神经干细胞提供充足的营养物质，即便后期神经干细胞呈对数增长，其中的非必需氨基酸能够提供神经干细胞的生长需要，有助于建立稳定、可靠的神经干细胞体培养模型，避免神经干细胞的由于分裂过快造成营养缺失细胞生长出现局部分化，同时抗生素可减少神经干细胞在分裂时毒素对分裂的新生细胞的影响，并不影响细胞自身的免疫错乱。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (8)

1.一种快速增殖神经干细胞培养基，其特征在于，包括以下组成：以DMEM/F12培养基为基材，表皮细胞生长因子的含量为15～25ng/mL、转铁蛋白的含量为10～15μg/mL、碱性成纤维细胞生长因子的含量为15～25ng/mL、纤连蛋白的含量为15～25ng/mL、四型胶原蛋白组的含量为50～70ng/mL、抗生素的含量为0.05～0.13mg/mL、牛血清白蛋白的含量为40～60μg/mL、非必需氨基酸的含量为8～10μmol/mL以及B27细胞培养添加剂。
2.根据权利要求1所述的快速增殖神经干细胞培养基，其特征在于，所述抗生素由含量为90～110U/mL青霉素、0.05～0.13mg/mL链霉素、200～300ng/mL两性霉素混合而成。
3.根据权利要求1所述的快速增殖神经干细胞培养基，其特征在于，所述非必需氨基酸为谷氨酸、酪氨酸、脯氨酸、甘氨酸、胱氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸或丝氨酸的其中一种或混合。
4.根据权利要求1所述的快速增殖神经干细胞培养基，其特征在于，所述B27细胞培养添加剂的体积含量占DMEM/F12培养基的2～3％。
5.根据权利要求1-4任一项所述的快速增殖神经干细胞培养基的使用方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
于35～39℃温度环境下、空气CO2含量3～8％下，将神经干细胞培养基置于无菌环境下，随后将神经干细胞贴壁培养，每2～3d更换培养基，待神经干细胞细胞达到90％融合度后消化，按1:4比例传代。
6.根据权利要求5所述的快速增殖神经干细胞培养基的使用方法，其特征在于，所述培养的神经干细胞密度为5×104～1×105/mL。
7.根据权利要求5所述的快速增殖神经干细胞培养基的使用方法，其特征在于，所述接种密度为2-5×104/cm2。
8.根据权利要求5所述的快速增殖神经干细胞培养基的使用方法，其特征在于，所述培养基新添加的量为原培养基量的2/3。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200114

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