CN116555260A - 一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法、由该方法得到的神经干细胞以及其培养或者维持神经干性方法。通过敲除人iPSCs BCOR的MLLT3binding、ANK repeats、PCGF1‑interacting PUFD结构域编码序列(BCOR‑MAP)及PLSCR1基因，获得一种新型NSCs，命名为2K‑iNSCs。与传统方法相比，2K‑iNSCs诱导和维持不依赖添加小分子化合物或蛋白因子的NSCs培养基，仅在iPSCs培养基中即可持续传代并维持其神经干性。本发明还提供了一种用于敲除iPSCs的BCOR‑MAP、PLSCR1基因的sgRNA、质粒及其应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法。
背景技术
NSCs(Neural Stem Cells,神经干细胞)具有自我复制及分化为多种神经元和神经胶质细胞的能力，因而在体外疾病模型研究，药物筛选，再生医学领域都有巨大的应用价值。目前NSCs的获得方式主要有三种：从原代组织中分离获得，从体细胞转分化获得，从多能干细胞诱导分化获得。从人多能干细胞诱导获得尤其是从人iPSCs诱导分化获得NSCs具有细胞来源不受限制，并可进行自体移植等优点。以往的神经分化会经历多能干细胞(Pluripotent Stem Cell,PSC)的聚集或拟胚体的形成，而这个过程易导致不同批次实验之间的差异(Tao and Zhang,2016)。传统的解决方案是通过加入SB431542和Noggin来抑制SMAD依赖的TGFβ(Transforming growth factor beta)和BMP信号通路，进而阻止额外的胚体和中胚层组织的分化，这种方法的诱导效率可达到80％左右(Chambers et al.,2009)。将iPSCs诱导成NSCs普遍的方法是加入小分子化合物的NSC诱导培养基进行诱导，而这种方法不能完全将iPSCs转化为NSCs，NSCs细胞异质性大，有成瘤风险等缺点。
目前，由人iPSCs诱导分化获得的NSCs在传代培养中需要通过特定的培养基维持NSCs的特性。不同于传统的NSCs诱导和维持方法，我们通过敲除iPSCs的PLSCR1基因以及编码BCOR的MLLT3 binding、ANK repeats、PCGF1-interacting PUFD结构域序列(BCOR-MAP)获得的NSCs，仅需要使用iPSCs培养基即可维持其NSCs特性不变，具有纯度高，细胞异质性低、增殖能力强、可在体外长期培养以及不易发生自发分化等优点。
从人体组织中分离获得NSCs的方法具有来源受限，分离出的NSCs异质性大，数量及扩增能力有限等缺点。从体细胞转分化获得NSCs的方法，由于体细胞增殖能力比较弱，增殖代数有限，细胞数量会受到限制，转分化效率比较低。利用商业化的添加小分子化合物或蛋白因子的培养基获得的NSCs具有异质性较高，有自发分化及成瘤风险等缺点。此外，诱导和维持NSCs的培养基需要添加不同组分的小分子化合物或蛋白因子，限制了NSCs的基础研究及临床应用。因此，传统方法中，培养基的成分对于iPSCs诱导为NSCs的效率及其神经干性维持具有关键作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法，本发明还提供了由该方法得到的神经干细胞以及其培养或者维持神经干性方法。通过敲除人iPSCs BCOR的MLLT3 binding、ANK repeats、PCGF1-interacting PUFD结构域(BCOR-MAP)编码序列及PLSCR1基因，获得一种新型NSCs，命名为2K-iNSCs。与传统方法相比，2K-iNSCs诱导和维持不依赖添加小分子化合物或蛋白因子的NSCs培养基，仅在iPSCs培养基中即可持续传代并维持其神经干性。本发明还提供了一种用于敲除iPSCs的BCOR-MAP、PLSCR1基因的sgRNA、质粒及其应用。
为实现上述目的，所采取的技术方案：
本发明提供了一种用于敲除iPSCs的BCOR-MAP、PLSCR1基因的sgRNA，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4所示。BCOR-MAP是指BCOR的MLLT3 binding、ANK repeats和PCGF1-interacting PUFD结构域。
本发明提供了一种用于敲除iPSCs的BCOR-MAP、PLSCR1基因的质粒，所述质粒是将上述所述的sgRNA连接到基础质粒上而得到的。
优选地，所述基础质粒为PX330质粒。
本发明提供了上述所述的sgRNA或上述所述的质粒在制备神经干细胞中的应用。
本发明提供了一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法，所述方法是将人iPSCs的BCOR-MAP、PLSCR1基因敲除而得到所述NSCs。
优选地，所述人iPSCs的BCOR-MAP、PLSCR1基因敲除是采用上述所述的sgRNA或上述所述的质粒进行的。
本发明提供了一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法，包含以下步骤：
(1)将上述所述的sgRNA连接到基础质粒上；
(2)将构建好的质粒转入人iPSCs中，用hiPSCs培养基进行培养；
(3)用Puromycin对所述步骤(3)获得的细胞进行筛选；
(4)挑取单克隆并鉴定BCOR-MAP和PLSCR1基因是否被敲除，筛选BCOR-MAP和PLSCR1基因被敲除的细胞，得到NSCs。
优选地，所述步骤(4)还包括检测BCOR-MAP和PLSCR1基因被敲除的细胞是否表达NSC标志物，挑选表达NSC标志物的细胞，从而得到NSCs。
优选地，所述步骤(1)中基础质粒为PX330质粒；所述步骤(2)中转入方式为电转；所述步骤(2)中人iPSCs为培养状态良好的人iPSCs；所述步骤(2)中hiPSCs培养基是mTesR1培养基。
本发明提供了一种神经干细胞，所述神经干细胞是由上述所述的方法制备而成的。
本发明提供了一种上述所述的神经干细胞的培养或者维持神经干性方法，所述方法包括采用hiPSCs培养基培养所述神经干细胞。
优选地，所述hiPSCs培养基是mTesR1培养基。
有益效果：
本发明提供了一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法以及由该方法得到的神经干细胞NSCs,且该NSCs不依赖传统的NSC培养基，仅在hiPSCs培养基(如mTesR1培养基)中培养即可，可在hiPSCs培养基中进行多次传代并保持其特性不变。这种细胞将来可以用于构建神经细胞疾病模型，用于神经系统疾病的治疗等。
附图说明
图1：本发明的流程示意图；
图2：BCOR及PLSCR1基因CRISPR-Cas9切割位点示意图；
图3：PLSCR1敲除PCR鉴定结果；
图4：BCOR-MAP敲除测序结果；
图5：2K-iNSCs的形态特征及其形成的Neural Sphere(神经球)；
图6：2K-iNSCs表达神经干细胞标记基因；
图7：2K-iNSCs可分化为神经元，星型胶质细胞和少突胶质细胞；
图8:畸胎瘤实验结果。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
现有的将hiPSCs转变为NSCs的方法是利用添加特有的小分子的培养基对hiPSCs进行诱导分化获得，而我们的方法是通过将hiPSCs的BCOR-MAP,PLSCR1同时敲除。现有的培养NSCs的培养基为单独配制特定的培养基，而利用我们的方法获得的NSCs可直接利用hiPSCs的培养基进行培养，无需单独配制特定培养基进行培养，简化了培养复杂度。
实施例1
1.实验材料：
PX330质粒(Addgene,42230)；iPSCs(CELLAPY)；mTesR1培养基(Stemcell,85850)；电转仪(Lonza,2B,AAB-1001)；Human Stem Cell Nucleofector kit 2(Lonza,VPH-5022)；Matrigel(corning，354277)。
神经细胞自发分化培养基(Shi et al.,2012)：
少突胶质细胞诱导培养基：
第一周诱导时，加入10ng/ml bFGF,后面3周诱导时，加入10ng/ml IGF1
2.实验方法：
本发明提供了一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法，所述方法包含以下步骤(图1)：
(1)构建用于敲除PLSCR1基因、BCOR-MAP的CRISPR-Cas9质粒：利用常用的sgRNA设计网站设计针对BCOR-MAP、PLSCR1基因敲除的sgRNA(表1),并将其连接到PX330质粒上；
表1 BCOR-MAP及PLSCR1敲除sgRNA序列
| sgRNA名称 | sgRNA序列 |
| BCOR-MAP-sgRNA-1 | CTCACCGACTCTGTCTACGG |
| BCOR-MAP-sgRNA-2 | GGACAGGAGATGTGGATGTG |
| PLSCR1-sgRNA-1 | TACTGAGGAGGATACCCAAC |
| PLSCR1-sgRNA-2 | CGGAAACAAACTTGCCAGTT |
(2)培养状态良好的人iPSCs并将构建好的PX330质粒电转进入细胞中。敲除BCOR-MAP、PLSCR1基因的方法有多种，可以利用下列不同的方法达到同样目的：
a)利用化学试剂转染的方法将构建的BCOR-MAP、PLSCR1基因敲除质粒导入iPSCs中。
b)将BCOR-MAP、PLSCR1基因敲除的sgRNA序列构建到病毒载体上，包装病毒,用包装好的病毒感染iPSCs。
c)将CRISPR-Cas9及BCOR-MAP、PLSCR1基因的sgRNA转录为RNA,再利用电转或化学转染等方法将其导入细胞中。
d)合成BCOR-MAP、PLSCR1基因的sgRNA的RNA,将其与Cas9蛋白一起导入到细胞。
e)利用ZFN(锌指核酸酶)、TALEN(转录激活样效应因子核酸酶)等对BCOR-MAP、PLSCR1基因进行敲除。
(3)用Puromycin对细胞进行筛选。
(4)挑取单克隆并进行PCR、测序鉴定目的基因是否被敲除，免疫荧光检测NSC标志物。
(5)对获得的NSCs进行传代培养、鉴定并冷冻保存。
(6)对获得的NSCs进行诱导分化，以鉴定其分化潜能。
(7)对获得的NSCs进行畸胎瘤实验，以验证其移植安全性。
实验结果：
(1)获得的2K-iNSCs具有NSC的形态特征及可以形成神经球(图5),高表达NSC标志物NESTIN,FABP7，SOX2(图6)。
(2)2K-iNSCs可进一步分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞(图7)。
(3)将2K-iNSCs注射到NOD-SCID后肢根部肌肉中，未形成畸胎瘤(图8)。
下面以“敲除BCOR-MAP、PLSCR1基因将iPSCs诱导分化为2K-iNSCs”为实施例详细描述本发明的具体过程与细节。
(一)BCOR-MAP、PLSCR1基因敲除质粒的构建
1、利用网站https://www.benchling.com/crispr设计用于敲除BCOR-MAP、PLSCR1基因的sgRNA，选取评分较高的sgRNA序列发送给引物合成公司进行合成。
2、利用限制性内切酶BbsI对从Addgene上购买的质粒PX330(Addgene,42230)进行切割，切胶回收。
3、将合成的sgRNA正反链进行退火，然后与酶切后的PX330进行连接。
(二)对iPSCs的BCOR-MAP、PLSCR1基因进行敲除及鉴定
1、培养状态良好的iPSCs(使用mTesR1培养基)细胞，密度约为70-80％；
2、用Matrigel包被六孔板；
3、拿出mTesR1培养基，电转试剂进行预热；
4、将包被的六孔板中的Matrigel吸掉，加入2ml加了1uM Thiazovizin的mTesR1放到37度培养箱中预热；
5、打开电转仪，调好程序，使用B-016程序；
6、将PX330质粒加到电转液中混匀备用；
7、将培养了人iPSCs细胞的孔中加入700ul Accutase，37度消化约5min；
8、加入800ul DMEM/F12中和后，将细胞吹散后吸到1.5ml EP中，200g离心5min；
9、吸掉上清，用质粒电转液混合液重悬细胞后加入电转杯中，尽量不要有气泡；
10.电转；
11.将电转后的细胞用1ml mTesR1重悬后，加入到一个Matrigel包被的六孔板孔中；
12.第二天更换培养基；
13.待细胞长到一定密度后，加入puromycin筛选细胞；
14.每天更换一次培养基；
15.继续养到细胞形成适当大小的克隆后，挑起克隆到24孔板中培养；
16.当细胞长到一定数量时，收取部分细胞并提取基因组，在同源臂两端设计引物(表2)对PLSCR1敲除情况进行PCR、测序鉴定，纯合敲除(Homozygous，2033bp)杂合敲除(Heterozygous，2033bp,663bp)，野生型(WT,663bp)，结果显示2K-iNSC的PLSCR1基因已被敲除(图3)。测序结果显示2K-iNSC的BCOR基因插入了可造成移码突变的7bp序列，BCOR-MAP的编码序列已被敲除(图4)。免疫荧光鉴定结果显示2K-iNSCs高表达NSC的标志物NESTIN、FABP7及SOX2(图6)。
表2 PCR引物序列
| 引物名称 | 引物序列(5'-3') |
| PLSCR1-F | CCATAATTCTACCATCTTCACATCCCATT |
| PLSCR1-R | CTAGCTTTCTTTATACCTTTACTGTCCTCTA |
| BCOR-F | TAATGCCCTCTTGTCTCCCCTC |
| BCOR-R | GCTGTCACCTGAGACTTTGCGT |
(三)体外鉴定2K-iNSC的分化潜能
1.自发分化
1)在24孔板中放入细胞爬片，加入Matrigel进行包被，将2K-iNSCs
种到孔里，加mTesR1培养基培养过夜。
2)第二天将培养基更换为神经细胞自发分化培养基，每两天更换一次培养基。
3)分化20天后通过免疫荧光对诱导分化的神经细胞进行鉴定。鉴定结果显示2K-iNSCs分化后的细胞高表达神经元的标志物MAP2、NEUN及TUJ1(图7A)，神经胶质细胞的标志物GFAP(图7B)。
2.少突胶质细胞诱导分化
1)在24孔板中放入细胞爬片，加入Matrigel进行包被，将2K-iNSCs
种到孔里，加mTesR1培养基培养过夜。
2)第二天将培养基更换为少突胶质细胞分化培养基，每两天更换一次培养基。
3)第一周诱导时，加入10ng/ml bFGF，后面3周诱导时，加入10ng/ml IGF1。
4)诱导结束后，通过免疫荧光对诱导分化的神经细胞进行鉴定。鉴定结果显示2K-iNSCs分化后的细胞高表达少突胶质细胞的标志物O4(图7C)。
(四)畸胎瘤实验验证2K-iNSC的移植安全性
1、吸去培养基，向每个孔(六孔板)中加入500ul Accutase置于37℃培养箱中消化3min。
2、加入等体积的DMEM/F12终止Accutase消化，200g离心5min，去上清。
3、将融化的Matrigel合同冷的DMEM/F12等体积混合，吸取150ul重悬细胞。
4、将重悬的细胞注射到NOD-SCID鼠后肢根部肌肉中，结果显示注射iPSCs细胞的小鼠形成了畸胎瘤，而注射2K-iNSCs的小鼠没有形成畸胎瘤(图8)。
与现有技术相比较，本发明获得的2K-iNSCs稳定性好，仅需使用iPSCs的培养基mTesR1进行诱导和神经干性维持等优点。这些优点是因为我们采用敲除hiPSCs的BCOR-MAP,PLSCR1的方法获得NSCs，而不是传统的利用诱导培养基进行诱导获得NSCs。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
参考文献：
Chambers,S.M.,Fasano,C.A.,Papapetrou,E.P.,Tomishima,M.,Sadelain,M.,and Studer,L.(2009).Highly efficient neural conversion of human ES and iPScells by dual inhibition of SMAD signaling.Nature biotechnology 27,275-280.
Shi,Y.,Kirwan,P.,and Livesey,F.J.(2012).Directed differentiation ofhuman pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neuralnetworks.Nat Protoc 7,1836-1846.
Tao,Y.,and Zhang,S.C.(2016).Neural Subtype Specification from HumanPluripotent Stem Cells.Cell stem cell 19,573-586.
Claims (10)
1.一种用于敲除iPSCs的BCOR-MAP和PLSCR1基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4所示。
2.一种用于敲除iPSCs的BCOR-MAP和PLSCR1基因的质粒，其特征在于，所述质粒是将如权利要求1所述的sgRNA连接到基础质粒上而得到的；优选地，所述基础质粒为PX330质粒。
3.如权利要求1所述的sgRNA或如权利要求2或3所述的质粒在制备神经干细胞中的应用。
4.一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法，其特征在于，所述方法是将人iPSCs的BCOR-MAP和PLSCR1基因敲除而得到所述NSCs。
5.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述人iPSCs的BCOR-MAP、PLSCR1基因敲除是采用如权利要求1所述的sgRNA或如权利要求2或3所述的质粒进行的。
6.一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)将如权利要求1所述的sgRNA连接到基础质粒上；
(2)将构建好的质粒转入人iPSCs中，用hiPSCs培养基进行培养；
(3)用Puromycin对所述步骤(3)获得的细胞进行筛选；
(4)挑取单克隆并鉴定BCOR-MAP和PLSCR1基因是否被敲除，筛选BCOR-MAP和PLSCR1基因被敲除的细胞，得到NSCs。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)还包括检测BCOR-MAP和PLSCR1基因被敲除的细胞是否表达NSC标志物，挑选表达NSC标志物的细胞，从而得到NSCs。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中基础质粒为PX330质粒；所述步骤(2)中转入方式为电转；所述步骤(2)中人iPSCs为培养状态良好的人iPSCs；所述步骤(2)中hiPSCs培养基是mTesR1培养基。
9.一种神经干细胞，其特征在于，所述神经干细胞是由如权利要求4-8任一所述的方法制备而成的。
10.一种如权利要求9所述的神经干细胞的培养或者维持神经干性方法，其特征在于，所述方法包括采用hiPSCs培养基培养所述神经干细胞。
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Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090035284A1 (en) * | 2007-07-30 | 2009-02-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Derivation of neural stem cells from embryonic stem cells and methods of use thereof |
| CN104419661A (zh) * | 2013-08-28 | 2015-03-18 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 神经干细胞的制备方法 |
| KR20150050961A (ko) * | 2013-11-01 | 2015-05-11 | 건국대학교 산학협력단 | 체세포에서 신경줄기세포로 직접 리프로그래밍된 세포를 분리하는 방법 |
| WO2016103269A1 (en) * | 2014-12-23 | 2016-06-30 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Populations of neural progenitor cells and methods of producing and using same |
| CN107435050A (zh) * | 2017-06-20 | 2017-12-05 | 向孟清 | 一种将人或动物体细胞诱导为神经干细胞的方法 |
| CN110499364A (zh) * | 2019-07-30 | 2019-11-26 | 北京凯昂医学诊断技术有限公司 | 一种用于检测扩展型遗传病全外显子的探针组及其试剂盒和应用 |
| CN110769835A (zh) * | 2017-01-06 | 2020-02-07 | 皮勒戈有限公司 | 用于基因组编辑的核酸和方法 |
| US20200208114A1 (en) * | 2018-12-10 | 2020-07-02 | The Broad Institute, Inc. | Taxonomy and use of bone marrow stromal cell |
| US20200224172A1 (en) * | 2017-09-19 | 2020-07-16 | The Broad Institute, Inc. | Methods and systems for reconstruction of developmental landscapes by optimal transport analysis |
| US20200362301A1 (en) * | 2019-05-17 | 2020-11-19 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Efficient, scalable production of human retinal progenitors in vitro |
| TW202307203A (zh) * | 2021-07-15 | 2023-02-16 | 日商富士軟片股份有限公司 | 特定細胞的品質管理方法及製造特定細胞之方法 |
| TW202307215A (zh) * | 2021-07-15 | 2023-02-16 | 日商富士軟片股份有限公司 | 細胞的品質管理方法及製造細胞之方法 |
-
2023
- 2023-04-24 CN CN202310452767.7A patent/CN116555260B/zh active Active
Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090035284A1 (en) * | 2007-07-30 | 2009-02-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Derivation of neural stem cells from embryonic stem cells and methods of use thereof |
| CN104419661A (zh) * | 2013-08-28 | 2015-03-18 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 神经干细胞的制备方法 |
| KR20150050961A (ko) * | 2013-11-01 | 2015-05-11 | 건국대학교 산학협력단 | 체세포에서 신경줄기세포로 직접 리프로그래밍된 세포를 분리하는 방법 |
| WO2016103269A1 (en) * | 2014-12-23 | 2016-06-30 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Populations of neural progenitor cells and methods of producing and using same |
| CN110769835A (zh) * | 2017-01-06 | 2020-02-07 | 皮勒戈有限公司 | 用于基因组编辑的核酸和方法 |
| CN107435050A (zh) * | 2017-06-20 | 2017-12-05 | 向孟清 | 一种将人或动物体细胞诱导为神经干细胞的方法 |
| US20200224172A1 (en) * | 2017-09-19 | 2020-07-16 | The Broad Institute, Inc. | Methods and systems for reconstruction of developmental landscapes by optimal transport analysis |
| US20200208114A1 (en) * | 2018-12-10 | 2020-07-02 | The Broad Institute, Inc. | Taxonomy and use of bone marrow stromal cell |
| US20200362301A1 (en) * | 2019-05-17 | 2020-11-19 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Efficient, scalable production of human retinal progenitors in vitro |
| CN110499364A (zh) * | 2019-07-30 | 2019-11-26 | 北京凯昂医学诊断技术有限公司 | 一种用于检测扩展型遗传病全外显子的探针组及其试剂盒和应用 |
| TW202307203A (zh) * | 2021-07-15 | 2023-02-16 | 日商富士軟片股份有限公司 | 特定細胞的品質管理方法及製造特定細胞之方法 |
| TW202307215A (zh) * | 2021-07-15 | 2023-02-16 | 日商富士軟片股份有限公司 | 細胞的品質管理方法及製造細胞之方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| LUO WEIYU等: "Phospholipid scramblase 1 interacts with influenza A virus NP, impairing its nuclear import and thereby suppressing virus replication", PLOS PATHOGENS, vol. 14, no. 1, 19 January 2018 (2018-01-19), pages 1 - 26 * |
| MOLLY OHAINLE等: "A virus-packageable CRISPR screen identifies host factors mediating interferon inhibition of HIV", ELIFE, vol. 7, 6 December 2018 (2018-12-06), pages 1 - 32 * |
| SHUICHI KUSANO等: "Interaction of phospholipid scramblase 1 with the Epstein-Barr virus protein BZLF1 represses BZLF1-mediated lytic gene transcription", J. BIOL. CHEM., vol. 294, no. 41, 31 December 2019 (2019-12-31), pages 15104 - 15116 * |
| 董格红等: "靶向BCOR基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立与基因编辑", 中国医刊, vol. 53, no. 10, 31 December 2018 (2018-12-31), pages 1147 - 1151 * |
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| Publication number | Publication date |
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