CN114134169A - 一种烟草毛状根遗传转化体系的建立方法 - Google Patents

一种烟草毛状根遗传转化体系的建立方法 Download PDF

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CN114134169A CN202111455264.2A CN202111455264A CN114134169A CN 114134169 A CN114134169 A CN 114134169A CN 202111455264 A CN202111455264 A CN 202111455264A CN 114134169 A CN114134169 A CN 114134169A
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Abstract

本发明公开了一种烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，包括烟草种子消毒获得无菌烟草种子、烟草种子萌发获得烟草无菌苗、农杆菌制备、农杆菌侵染液的制备、侵染、共培养、除菌培养、筛选培养获得可用于基因功能检测的烟草毛状根和毛状根鉴定等步骤。本发明简单易行、周期短，8周即可获得足量毛状根，获得的毛状根可应用于烟草基因的功能鉴定(包括被转化基因表达量的检测；其他目标基因表达量的检测以及烟碱、去甲烟碱、新烟碱等烟草物质含量的检测等)；解决了传统烟草稳定植株转化从遗传转化至可用于基因功能鉴定的T1代植株需时较长，大约1年左右的时间的技术问题；比较而言，本烟草毛状根遗传转化体系显著缩短了研究周期。

Description

一种烟草毛状根遗传转化体系的建立方法
技术领域
本发明涉及遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草毛状根遗传转化体系的建立方法。
背景技术
毛状根作为工具在植物次生代谢生产中被广泛应用，尤其在生产资源植物次生代谢产物方面具有独特的优势和前景。例如，白英毛状根中薯蓣皂苷元含量和积累效率是野生型白英根的4.5及10倍。蒙古黄芪毛状根总黄酮含量极显著高于对照，金铁锁毛状根组织中多种低极性皂苷含量明显高于金铁锁药材。另外，毛状根也可作为基因功能研究的有效工具，例如利用毛状根体系对查尔酮合成酶(CHS)及查尔酮异构酶(CHI)的基因功能进行研究。
烟草是我国重要的经济作物。优良烟草品种为我国烟草行业高质量发展提供了重要支撑。以基因改良为核心的品种培育是烟草品种持续更新的重要动力来源。挖掘调控烟草品质性状关键基因，解析品质形成的分子机理，对烟草品种改良意义重大。目前，烟草基因的功能研究一般都是通过烟株转基因来实现，研究周期较长，通过毛状根可以大大缩小研究周期，因此，有必要研究烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，加速烟草功能基因的研究进程。
鉴于上述情况，有必要研究一种烟草毛状根遗传转化体系的建立方法以解决上述技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，旨在建立一种遗传转化效率高、周期短的烟草毛状根遗传转化体系，获得的烟草毛状根可应用于烟草基因的功能鉴定。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，包括以下步骤：
S1：烟草种子消毒：用75％酒精浸湿烟草种子60～70s，弃酒精；再用50％v/v的次氯酸钠震荡消毒9～11min，最后用无菌水冲洗5～6次，获得无菌烟草种子；
S2：烟草种子萌发：将步骤S1中的无菌烟草种子接种于MS培养基中暗培养2天后放置于光照培养箱中直至无菌烟草种子萌发，待萌发1周后将烟草幼苗移栽至无菌培养瓶中继续培养4～5周，获得烟草无菌苗；
S3：农杆菌制备：将测序验证正确的重组质粒转化进入农杆菌LBA9402感受态细胞，涂布在含卡那霉素和利福平的LB平板上28℃生长2～3天后，进行菌落PCR检测，鉴定出阳性菌斑；如为阳性，则表明重组质粒已转入农杆菌；
S4：农杆菌侵染液的制备：将步骤S3中鉴定出的阳性菌斑克隆后接菌于含有卡那霉素和利福平的MS培养基中，并于28℃、220rpm振荡培养至菌液浓度达到OD＝0.6时，向菌液中加入乙酰丁香酮至终浓度为100μM并继续培养；当培养至OD600达0.8时，将菌液3000rpm离心10min，弃上清液，用重悬液重悬菌体至OD600＝0.6,获得农杆菌侵染液备用；
S5:侵染:取步骤S2中烟草无菌苗的叶片，切至0.5cm*0.5cm大小，用步骤S4中的农杆菌侵染液浸泡19～21min；侵染后，从侵染液中取出叶片，将所述叶片置于两层无菌滤纸中吸干侵染液；
S6:共培养：制备表面具有无菌滤纸的共培养基，待步骤S5中的叶片表面菌液干透后，将叶片置于无菌滤纸上，暗培养3天；
S7:除菌培养：将步骤S6中暗培养3天后的叶片转移至除菌培养基上，暗培养2周直至叶片生长出5～6cm的毛状根；
S8：筛选培养：将步骤S7中的毛状根剪下置于固体筛选培养基上，培养1周；选择生长最快的毛状根接种于液体筛选培养基中70r/min摇培2周，获得可用于基因功能检测的烟草毛状根；
S9：毛状根鉴定：取步骤S8中的可用于基因功能检测的烟草毛状根，提取其DNA进行GUS基因的PCR鉴定。
优选地，步骤S2中，所述MS培养基为：2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，Agrose 8g/L，pH：5.8；所述光照培养箱中，在25℃条件下，每天光照培养6小时，每天黑暗培养18小时。
优选地，步骤S3中，所述测序验证正确的重组质粒为
pCAMBIA1305.1-GUS；所述重组质粒转化进入农杆菌LBA9402感受态细胞采用的方法优选为冻融法。
优选地，步骤S3中，所述农杆菌为LBA9402、K599、R1061中的一种。
所述农杆菌优选为LBA9402
优选地，步骤S4中，所述重悬液优选为2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，pH：5.8。
优选地，步骤S6中，所述共培养基优选为2/3MS2.95g/L，Sucrose 20g/L，AS 100μM，Agrose 8g/L，pH：5.8。
优选地，步骤S7中，所述除菌培养基优选为2/3MS 2.95g/L，Sucrose20g/L，Agrose8g/L，头孢噻腭钠500mg/L。
优选地，步骤S8中，所述固体筛选培养基优选为2/3MS 2.95g/L，Sucrose20g/L，Agrose 8g/L，头孢噻腭钠500mg/L，10mg/L潮霉素；液体筛选培养基优选为2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，头孢噻腭钠500mg/L，10mg/L潮霉素。
优选地，所述烟草毛状根可应用于烟草基因功能鉴定。
综上所述，相比于现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明简单易行、周期短，8周即可获得足量毛状根，获得的毛状根可应用于烟草基因的功能鉴定(包括被转化基因表达量的检测；其他目标基因表达量的检测以及烟碱、去甲烟碱、新烟碱等烟草物质含量的检测等)；解决了传统烟草稳定植株转化从遗传转化至可用于基因功能鉴定的T1代植株需时较长，大约1年左右的时间的技术问题。比较而言，本烟草毛状根遗传转化体系显著缩短了研究周期。
2、本发明所建立的烟草毛状根遗传转化体系，获得了适宜烟草毛状根诱导的无菌苗苗龄、外植体类型、农杆菌菌株、侵染时间及毛状根培养条件等，加速了烟草功能基因的研究进程。
附图说明
图1：图a-c:不同苗龄烟草无菌苗；图d:4周无菌苗叶片作为外植体与农杆菌共培养初期情况；图e-g:不同农杆菌菌株诱导4周无菌苗叶片发根情况；图h:毛状根液体筛选培养初期情况；图i:毛状根液体筛选培养后期生长情况。
图2：不同无菌苗苗龄与不同农杆菌菌株组合实验结果；2W为2周；4W为4周；8W为8周；
图3：图a：毛状根PCR(GUS基因)筛选检测结果；图b：阳性毛状根GUS染色结果。
具体实施方式
以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有开展创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
下面以具体实施例对本发明做进一步说明，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。
实施例1
1.1、烟草无菌苗的获得：包括烟草种子消毒及种子萌发。
1.1.1烟草种子消毒：用75％酒精浸湿种子60s～70s，弃酒精，再用50％(v/v)次氯酸钠震荡消毒9～11min，最后用无菌水冲洗5～6次获得无菌烟草种子。
1.1.2种子萌发：将无菌烟草种子接种于MS培养基中(2/3MS 2.95g/L，Sucrose20g/L，Agrose 8g/L，pH：5.8)，暗培养2天后放置于光照培养箱中(在25℃条件下，每天光照培养6小时，每天黑暗培养18小时)。萌发1周后将幼苗移栽至无菌培养瓶中继续培养；在无菌培养瓶中培养2周，获得2周苗龄的烟草无菌苗，2周苗龄的烟草无菌苗如图1中的a所示。
1.2、外植体的遗传转化：本实施例使用的外植体为烟草无菌苗的叶片。具体地，通过将2周苗龄的烟草无菌苗与农杆菌LBA9402进行实验。
1.2.1将测序验证正确的重组质粒(pCAMBIA1305.1-GUS)采用冻融法转化进入农杆菌LBA9402感受态细胞，涂布在含卡那霉素和利福平的LB平板上28℃生长2～3后，进行菌落PCR检测，检测结果呈阳性，表明重组质粒已转入农杆菌。
1.2.2将阳性菌斑克隆后接菌于含有卡那霉素和利福平的MS培养基中，于28℃，220rpm振荡培养，菌液浓度达到OD＝0.6时向菌液中加入乙酰丁香酮至终浓度100μM继续培养。当OD600达0.8时，菌液3000rpm离心10min，弃上清液，用重悬液(2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，pH：5.8)重悬菌体至OD600＝0.6，获得农杆菌侵染液备用。
1.2.3取无菌苗烟草叶片，切至0.5cm*0.5cm大小，用制备好的菌液浸泡19～21min。侵染后，将叶片置于两层无菌滤纸中吸干菌液。
1.2.4待叶片表面菌液干透，在共培养基(2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，AS 100μM，Agrose 8g/L，pH：5.8)表面放置一层无菌滤纸，将叶片置于无菌滤纸上，暗培养3天。
1.2.5暗培养3天后将叶片转移至除菌培养基(2/3MS 2.95g/L，Sucrose20g/L，Agrose 8g/L，头孢噻腭钠500mg/L)上，暗培养2周至叶片生长出5～6cm的毛状根。
实施例2
本实施例烟草无菌苗的获得：包括烟草种子消毒及种子萌发。
2.1.1烟草种子消毒：用75％酒精浸湿种子60s～70s，弃酒精，再用50％(v/v)次氯酸钠震荡消毒9～11min，最后用无菌水冲洗5～6次获得无菌烟草种子。
2.1.2种子萌发：将无菌烟草种子接种于MS培养基中(2/3MS 2.95g/L，Sucrose20g/L，Agrose 8g/L，pH：5.8)，暗培养2天后放置于光照培养箱中(在25℃条件下，每天光照培养6小时，每天黑暗培养18小时)。萌发1周后将幼苗移栽至无菌培养瓶中继续培养；在无菌培养瓶中培养2周，获得2周苗龄的烟草无菌苗，2周苗龄的烟草无菌苗如图1中的a所示。
2.2、外植体的遗传转化：本实施例使用的外植体为烟草无菌苗的叶片。具体地，通过将2周苗龄的烟草无菌苗与农杆菌K599进行实验。
2.2.1将测序验证正确的重组质粒(pCAMBIA1305.1-GUS)采用冻融法转化进入农杆菌K599感受态细胞，涂布在含卡那霉素和利福平的LB平板上28℃生长2～3后，进行菌落PCR检测，检测结果呈阳性，表明重组质粒已转入农杆菌。
2.2.2将阳性菌斑克隆后接菌于含有卡那霉素和利福平的MS培养基中，于28℃，220rpm振荡培养，菌液浓度达到OD＝0.6时向菌液中加入乙酰丁香酮至终浓度100μM继续培养。当OD600达0.8时，菌液3000rpm离心10min，弃上清液，用重悬液(2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，pH：5.8)重悬菌体至OD600＝0.6，获得农杆菌侵染液备用。
2.2.3取无菌苗烟草叶片，切至0.5cm*0.5cm大小，用制备好的菌液浸泡19～21min。侵染后，将叶片置于两层无菌滤纸中吸干菌液。
2.2.4待叶片表面菌液干透，在共培养基(2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，AS 100μM，Agrose 8g/L，pH：5.8)表面放置一层无菌滤纸，将叶片置于无菌滤纸上，暗培养3天。
2.2.5暗培养3天后将叶片转移至除菌培养基(2/3MS 2.95g/L，Sucrose20g/L，Agrose 8g/L，头孢噻腭钠500mg/L)上，暗培养2周至叶片生长出5～6cm的毛状根。
实施例3
本实施例烟草无菌苗的获得：包括烟草种子消毒及种子萌发。
3.1.1烟草种子消毒：用75％酒精浸湿种子60s～70s，弃酒精，再用50％(v/v)次氯酸钠震荡消毒9～11min，最后用无菌水冲洗5～6次获得无菌烟草种子。
3.1.2种子萌发：将无菌烟草种子接种于MS培养基中(2/3MS 2.95g/L，Sucrose20g/L，Agrose 8g/L，pH：5.8)，暗培养2天后放置于光照培养箱中(在25℃条件下，每天光照培养6小时，每天黑暗培养18小时)。萌发1周后将幼苗移栽至无菌培养瓶中继续培养；在无菌培养瓶中培养2周，获得2周苗龄的烟草无菌苗，2周苗龄的烟草无菌苗如图1中的a所示。
3.2、外植体的遗传转化：本实施例使用的外植体为烟草无菌苗的叶片。具体地，通过将2周苗龄的烟草无菌苗与农杆菌R1061进行实验。
3.2.1将测序验证正确的重组质粒(pCAMBIA1305.1-GUS)采用冻融法转化进入农杆菌R1061感受态细胞，涂布在含卡那霉素和利福平的LB平板上28℃生长2～3后，进行菌落PCR检测，检测结果呈阳性，表明重组质粒已转入农杆菌。
3.2.2将阳性菌斑克隆后接菌于含有卡那霉素和利福平的MS培养基中，于28℃，220rpm振荡培养，菌液浓度达到OD＝0.6时向菌液中加入乙酰丁香酮至终浓度100μM继续培养。当OD600达0.8时，菌液3000rpm离心10min，弃上清液，用重悬液(2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，pH：5.8)重悬菌体至OD600＝0.6，获得农杆菌侵染液备用。
3.2.3取无菌苗烟草叶片，切至0.5cm*0.5cm大小，用制备好的菌液浸泡19～21min。侵染后，将叶片置于两层无菌滤纸中吸干菌液。
3.2.4待叶片表面菌液干透，在共培养基(2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，AS 100μM，Agrose 8g/L，pH：5.8)表面放置一层无菌滤纸，将叶片置于无菌滤纸上，暗培养3天。
3.2.5暗培养3天后将叶片转移至除菌培养基(2/3MS 2.95g/L，Sucrose20g/L，Agrose 8g/L，头孢噻腭钠500mg/L)上，暗培养2周至叶片生长出5～6cm的毛状根。
实施例4
本实施例烟草无菌苗的获得：包括烟草种子消毒及种子萌发。
4.1.1烟草种子消毒：用75％酒精浸湿种子60s～70s，弃酒精，再用50％(v/v)次氯酸钠震荡消毒9～11min，最后用无菌水冲洗5～6次获得无菌烟草种子。
4.1.2种子萌发：将无菌烟草种子接种于MS培养基中(2/3MS 2.95g/L，Sucrose20g/L，Agrose 8g/L，pH：5.8)，暗培养2天后放置于光照培养箱中(在25℃条件下，每天光照培养6小时，每天黑暗培养18小时)。萌发1周后将幼苗移栽至无菌培养瓶中继续培养；在无菌培养瓶中培养4周，获得4周苗龄的烟草无菌苗，4周苗龄的烟草无菌苗如图1中的b所示。
4.2、外植体的遗传转化：本实施例使用的外植体为烟草无菌苗的叶片。具体地，通过将4周苗龄的烟草无菌苗与农杆菌LBA9402进行实验。
4.2.1将测序验证正确的重组质粒(pCAMBIA1305.1-GUS)采用冻融法转化进入农杆菌LBA9402感受态细胞，涂布在含卡那霉素和利福平的LB平板上28℃生长2～3后，进行菌落PCR检测，检测结果呈阳性，表明重组质粒已转入农杆菌。
4.2.2将阳性菌斑克隆后接菌于含有卡那霉素和利福平的MS培养基中，于28℃，220rpm振荡培养，菌液浓度达到OD＝0.6时向菌液中加入乙酰丁香酮至终浓度100μM继续培养。当OD600达0.8时，菌液3000rpm离心10min，弃上清液，用重悬液(2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，pH：5.8)重悬菌体至OD600＝0.6，获得农杆菌侵染液备用。
4.2.3取无菌苗烟草叶片，切至0.5cm*0.5cm大小，用制备好的菌液浸泡19～21min。侵染后，将叶片置于两层无菌滤纸中吸干菌液。
4.2.4待叶片表面菌液干透，在共培养基(2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，AS 100μM，Agrose 8g/L，pH：5.8)表面放置一层无菌滤纸，将叶片置于无菌滤纸上，暗培养3天,无菌苗叶片作为外植体与农杆菌共培养初期情况如图1中的d所示。
4.2.5暗培养3天后将叶片转移至除菌培养基(2/3MS 2.95g/L，Sucrose20g/L，Agrose 8g/L，头孢噻腭钠500mg/L)上，暗培养2周至叶片生长出5～6cm的毛状根。
实施例5
本实施例烟草无菌苗的获得：包括烟草种子消毒及种子萌发。
5.1.1烟草种子消毒：用75％酒精浸湿种子60s～70s，弃酒精，再用50％(v/v)次氯酸钠震荡消毒9～11min，最后用无菌水冲洗5～6次获得无菌烟草种子。
5.1.2种子萌发：将无菌烟草种子接种于MS培养基中(2/3MS 2.95g/L，Sucrose20g/L，Agrose 8g/L，pH：5.8)，暗培养2天后放置于光照培养箱中(在25℃条件下，每天光照培养6小时，每天黑暗培养18小时)。萌发1周后将幼苗移栽至无菌培养瓶中继续培养；在无菌培养瓶中培养4周，获得4周苗龄的烟草无菌苗，4周苗龄的烟草无菌苗如图1中的b所示。
5.2、外植体的遗传转化：本实施例使用的外植体为烟草无菌苗的叶片。具体地，通过将4周苗龄的烟草无菌苗与农杆菌K599进行实验。
5.2.1将测序验证正确的重组质粒(pCAMBIA1305.1-GUS)采用冻融法转化进入农杆菌K599感受态细胞，涂布在含卡那霉素和利福平的LB平板上28℃生长2～3后，进行菌落PCR检测，检测结果呈阳性，表明重组质粒已转入农杆菌。
5.2.2将阳性菌斑克隆后接菌于含有卡那霉素和利福平的MS培养基中，于28℃，220rpm振荡培养，菌液浓度达到OD＝0.6时向菌液中加入乙酰丁香酮至终浓度100μM继续培养。当OD600达0.8时，菌液3000rpm离心10min，弃上清液，用重悬液(2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，pH：5.8)重悬菌体至OD600＝0.6，获得农杆菌侵染液备用。
5.2.3取无菌苗烟草叶片，切至0.5cm*0.5cm大小，用制备好的菌液浸泡19～21min。侵染后，将叶片置于两层无菌滤纸中吸干菌液。
5.2.4待叶片表面菌液干透，在共培养基(2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，AS 100μM，Agrose 8g/L，pH：5.8)表面放置一层无菌滤纸，将叶片置于无菌滤纸上，暗培养3天。
5.2.5暗培养3天后将叶片转移至除菌培养基(2/3MS 2.95g/L，Sucrose20g/L，Agrose 8g/L，头孢噻腭钠500mg/L)上，暗培养2周至叶片生长出5～6cm的毛状根。
实施例6
本实施例烟草无菌苗的获得：包括烟草种子消毒及种子萌发。
6.1.1烟草种子消毒：用75％酒精浸湿种子60s～70s，弃酒精，再用50％(v/v)次氯酸钠震荡消毒9～11min，最后用无菌水冲洗5～6次获得无菌烟草种子。
6.1.2种子萌发：将无菌烟草种子接种于MS培养基中(2/3MS 2.95g/L，Sucrose20g/L，Agrose 8g/L，pH：5.8)，暗培养2天后放置于光照培养箱中(在25℃条件下，每天光照培养6小时，每天黑暗培养18小时)。萌发1周后将幼苗移栽至无菌培养瓶中继续培养；在无菌培养瓶中培养4周，获得4周苗龄的烟草无菌苗，4周苗龄的烟草无菌苗如图1中的b所示。
6.2外植体的遗传转化：本实施例使用的外植体为烟草无菌苗的叶片。具体地，通过将4周苗龄的烟草无菌苗与农杆菌R1061进行实验。
6.2.1将测序验证正确的重组质粒(pCAMBIA1305.1-GUS)采用冻融法转化进入农杆菌R1061感受态细胞，涂布在含卡那霉素和利福平的LB平板上28℃生长2～3后，进行菌落PCR检测，检测结果呈阳性，表明重组质粒已转入农杆菌。
6.2.2将阳性菌斑克隆后接菌于含有卡那霉素和利福平的MS培养基中，于28℃，220rpm振荡培养，菌液浓度达到OD＝0.6时向菌液中加入乙酰丁香酮至终浓度100μM继续培养。当OD600达0.8时，菌液3000rpm离心10min，弃上清液，用重悬液(2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，pH：5.8)重悬菌体至OD600＝0.6，获得农杆菌侵染液备用。
6.2.3取无菌苗烟草叶片，切至0.5cm*0.5cm大小，用制备好的菌液浸泡19～21min。侵染后，将叶片置于两层无菌滤纸中吸干菌液。
6.2.4待叶片表面菌液干透，在共培养基(2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，AS 100μM，Agrose 8g/L，pH：5.8)表面放置一层无菌滤纸，将叶片置于无菌滤纸上，暗培养3天。
6.2.5暗培养3天后将叶片转移至除菌培养基(2/3MS 2.95g/L，Sucrose20g/L，Agrose 8g/L，头孢噻腭钠500mg/L)上，暗培养2周至叶片生长出5～6cm的毛状根。
实施例7
本实施例烟草无菌苗的获得：包括烟草种子消毒及种子萌发。
7.1.1烟草种子消毒：用75％酒精浸湿种子60s～70s，弃酒精，再用50％(v/v)次氯酸钠震荡消毒9～11min，最后用无菌水冲洗5～6次获得无菌烟草种子。
7.1.2种子萌发：将无菌烟草种子接种于MS培养基中(2/3MS 2.95g/L，Sucrose20g/L，Agrose 8g/L，pH：5.8)，暗培养2天后放置于光照培养箱中(在25℃条件下，每天光照培养6小时，每天黑暗培养18小时)。萌发1周后将幼苗移栽至无菌培养瓶中继续培养；在无菌培养瓶中培养8周，获得8周苗龄的烟草无菌苗，8周苗龄的烟草无菌苗如图1中的c所示。
7.2外植体的遗传转化：本实施例使用的外植体为烟草无菌苗的叶片。具体地，通过将8周苗龄的烟草无菌苗与农杆菌LBA9402进行实验。
7.2.1将测序验证正确的重组质粒(pCAMBIA1305.1-GUS)采用冻融法转化进入农杆菌LBA9402感受态细胞，涂布在含卡那霉素和利福平的LB平板上28℃生长2～3后，进行菌落PCR检测，检测结果呈阳性，表明重组质粒已转入农杆菌。
7.2.2将阳性菌斑克隆后接菌于含有卡那霉素和利福平的MS培养基中，于28℃，220rpm振荡培养，菌液浓度达到OD＝0.6时向菌液中加入乙酰丁香酮至终浓度100μM继续培养。当OD600达0.8时，菌液3000rpm离心10min，弃上清液，用重悬液(2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，pH：5.8)重悬菌体至OD600＝0.6，获得农杆菌侵染液备用。
7.2.3取无菌苗烟草叶片，切至0.5cm*0.5cm大小，用制备好的菌液浸泡19～21min。侵染后，将叶片置于两层无菌滤纸中吸干菌液。
7.2.4待叶片表面菌液干透，在共培养基(2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，AS 100μM，Agrose 8g/L，pH：5.8)表面放置一层无菌滤纸，将叶片置于无菌滤纸上，暗培养3天。
7.2.5暗培养3天后将叶片转移至除菌培养基(2/3MS 2.95g/L，Sucrose20g/L，Agrose 8g/L，头孢噻腭钠500mg/L)上，暗培养2周至叶片生长出5～6cm的毛状根。
实施例8
本实施例烟草无菌苗的获得：包括烟草种子消毒及种子萌发。
8.1.1烟草种子消毒：用75％酒精浸湿种子60s～70s，弃酒精，再用50％(v/v)次氯酸钠震荡消毒9～11min，最后用无菌水冲洗5～6次获得无菌烟草种子。
8.1.2种子萌发：将无菌烟草种子接种于MS培养基中(2/3MS 2.95g/L，Sucrose20g/L，Agrose 8g/L，pH：5.8)，暗培养2天后放置于光照培养箱中(在25℃条件下，每天光照培养6小时，每天黑暗培养18小时)。萌发1周后将幼苗移栽至无菌培养瓶中继续培养；在无菌培养瓶中培养8周，获得8周苗龄的烟草无菌苗，8周苗龄的烟草无菌苗如图1中的c所示。
8.2、外植体的遗传转化：本实施例使用的外植体为烟草无菌苗的叶片。具体地，通过将8周苗龄的烟草无菌苗与农杆菌K599进行实验。
8.2.1将测序验证正确的重组质粒(pCAMBIA1305.1-GUS)采用冻融法转化进入农杆菌K599感受态细胞，涂布在含卡那霉素和利福平的LB平板上28℃生长2～3后，进行菌落PCR检测，检测结果呈阳性，表明重组质粒已转入农杆菌。
8.2.2将阳性菌斑克隆后接菌于含有卡那霉素和利福平的MS培养基中，于28℃，220rpm振荡培养，菌液浓度达到OD＝0.6时向菌液中加入乙酰丁香酮至终浓度100μM继续培养。当OD600达0.8时，菌液3000rpm离心10min，弃上清液，用重悬液(2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，pH：5.8)重悬菌体至OD600＝0.6，获得农杆菌侵染液备用。
8.2.3取无菌苗烟草叶片，切至0.5cm*0.5cm大小，用制备好的菌液浸泡19～21min。侵染后，将叶片置于两层无菌滤纸中吸干菌液。
8.2.4待叶片表面菌液干透，在共培养基(2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，AS 100μM，Agrose 8g/L，pH：5.8)表面放置一层无菌滤纸，将叶片置于无菌滤纸上，暗培养3天。
8.2.5暗培养3天后将叶片转移至除菌培养基(2/3MS 2.95g/L，Sucrose20g/L，Agrose 8g/L，头孢噻腭钠500mg/L)上，暗培养2周至叶片生长出5～6cm的毛状根。
实施例9
本实施例烟草无菌苗的获得：包括烟草种子消毒及种子萌发。
9.1.1烟草种子消毒：用75％酒精浸湿种子60s～70s，弃酒精，再用50％(v/v)次氯酸钠震荡消毒9～11min，最后用无菌水冲洗5～6次获得无菌烟草种子。
9.1.2种子萌发：将无菌烟草种子接种于MS培养基中(2/3MS 2.95g/L，Sucrose20g/L，Agrose 8g/L，pH：5.8)，暗培养2天后放置于光照培养箱中(在25℃条件下，每天光照培养6小时，每天黑暗培养18小时)。萌发1周后将幼苗移栽至无菌培养瓶中继续培养；在无菌培养瓶中培养8周，获得8周苗龄的烟草无菌苗，8周苗龄的烟草无菌苗如图1中的c所示。
9.2外植体的遗传转化：本实施例使用的外植体为烟草无菌苗的叶片。具体地，通过将8周苗龄的烟草无菌苗与农杆菌R1061进行实验。
9.2.1将测序验证正确的重组质粒(pCAMBIA1305.1-GUS)采用冻融法转化进入农杆菌R1061感受态细胞，涂布在含卡那霉素和利福平的LB平板上28℃生长2～3后，进行菌落PCR检测，检测结果呈阳性，表明重组质粒已转入农杆菌。
9.2.2将阳性菌斑克隆后接菌于含有卡那霉素和利福平的MS培养基中，于28℃，220rpm振荡培养，菌液浓度达到OD＝0.6时向菌液中加入乙酰丁香酮至终浓度100μM继续培养。当OD600达0.8时，菌液3000rpm离心10min，弃上清液，用重悬液(2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，pH：5.8)重悬菌体至OD600＝0.6，获得农杆菌侵染液备用。
9.2.3取无菌苗烟草叶片，切至0.5cm*0.5cm大小，用制备好的菌液浸泡19～21min。侵染后，将叶片置于两层无菌滤纸中吸干菌液。
9.2.4待叶片表面菌液干透，在共培养基(2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，AS 100μM，Agrose 8g/L，pH：5.8)表面放置一层无菌滤纸，将叶片置于无菌滤纸上，暗培养3天。
9.2.5暗培养3天后将叶片转移至除菌培养基(2/3MS 2.95g/L，Sucrose20g/L，Agrose 8g/L，头孢噻腭钠500mg/L)上，暗培养2周至叶片生长出5～6cm的毛状根。
实施例1-9中的不同无菌苗苗龄与不同农杆菌菌株组合实验结果如图2所示。从图1与图2可知，本发明通过将苗龄为2周、4周及8周无菌苗与农杆菌菌株(LBA9402,K599及R1061)进行组合实验。发现苗龄4周的无菌苗叶片为最佳外植体，农杆菌菌株LBA9402为最优发根农杆菌菌株。
将实施例1-9中获得的烟草毛状根剪下，分别置于固体筛选培养基(2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，Agrose 8g/L，头孢噻腭钠500mg/L，10mg/L潮霉素)上，培养1周。选择生长最快的毛状根接种于液体筛选培养基(2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，头孢噻腭钠500mg/L，10mg/L潮霉素)中70r/min摇培2周，获得可用于基因功能检测的烟草毛状根，其生长情况如图1中的i所示。将烟草毛状根分别提取DNA进行PCR检测(检测引物5’-ACCTCGCATTACCCTTACGCTGAA-3’及5’-ACGCGGTGATACATATCCAGCCAT-3’,PCR产物约570bp)，检测结果如图3所示。由图3可知，14个毛状根中12个转化成功，GUS检测阳性，说明绝大部分毛状根都转化成功。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：烟草种子消毒：用75％酒精浸湿烟草种子60～70s，弃酒精；再用50％v/v的次氯酸钠震荡消毒9～11min，最后用无菌水冲洗5～6次，获得无菌烟草种子；
S2：烟草种子萌发：将步骤S1中的无菌烟草种子接种于MS培养基中暗培养2天后放置于光照培养箱中直至无菌烟草种子萌发，待萌发1周后将烟草幼苗移栽至无菌培养瓶中继续培养2～8周，获得烟草无菌苗；
S3：农杆菌制备：将测序验证正确的重组质粒转化进入农杆菌感受态细胞，涂布在含卡那霉素和利福平的LB平板上28℃生长2～3天后，进行菌落PCR检测，鉴定出阳性菌斑；
S4：农杆菌侵染液的制备：将步骤S3中鉴定出的阳性菌斑克隆后接菌于含有卡那霉素和利福平的MS培养基中，并于28℃、220rpm振荡培养至菌液浓度达到OD＝0.6时，向菌液中加入乙酰丁香酮至终浓度为100μM并继续培养；当培养至OD600达0.8时，将菌液3000rpm离心10min，弃上清液，用重悬液重悬菌体至OD600＝0.6,获得农杆菌侵染液备用；
S5:侵染:取步骤S2中烟草无菌苗的叶片，切至0.5cm*0.5cm大小，用步骤S4中的农杆菌侵染液浸泡19～21min；侵染后，从侵染液中取出叶片，将所述叶片置于两层无菌滤纸中吸干侵染液；
S6:共培养：制备表面具有无菌滤纸的共培养基，待步骤S5中的叶片表面菌液干透后，将叶片置于无菌滤纸上，暗培养3天；
S7:除菌培养：将步骤S6中暗培养3天后的叶片转移至除菌培养基上，暗培养2周直至叶片生长出5～6cm的毛状根；
S8：筛选培养：将步骤S7中的毛状根剪下置于固体筛选培养基上，培养1周；选择生长最快的毛状根接种于液体筛选培养基中70r/min摇培2周，获得可用于基因功能检测的烟草毛状根；
S9：毛状根鉴定：取步骤S8中的可用于基因功能检测的烟草毛状根，提取其DNA进行GUS基因的PCR鉴定。
2.根据权利要求1所述的烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤S2中，所述MS培养基为：2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，Agrose 8g/L，pH：5.8；所述光照培养箱中，在25℃条件下，每天光照培养6小时，每天黑暗培养18小时。
3.根据权利要求1所述的烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤S3中，所述测序验证正确的重组质粒为pCAMBIA1305.1-GUS；所述重组质粒转化进入农杆菌LBA9402感受态细胞采用的方法优选为冻融法。
4.根据权利要求1所述的烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤S3中，所述农杆菌为LBA9402、K599、R1061中的一种。
5.根据权利要求4所述的烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤S3中，所述农杆菌优选为LBA9402。
6.根据权利要求1所述的烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤S4中，所述重悬液优选为2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，pH：5.8。
7.根据权利要求1所述的烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤S6中，所述共培养基优选为2/3MS2.95g/L，Sucrose 20g/L，AS 100μM，Agrose 8g/L，pH：5.8。
8.根据权利要求1所述的烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤S7中，所述除菌培养基优选为2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，Agrose 8g/L，头孢噻腭钠500mg/L。
9.根据权利要求1所述的烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤S8中，所述固体筛选培养基优选为：2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，Agrose8g/L，头孢噻腭钠500mg/L，10mg/L潮霉素；液体筛选培养基优选为2/3MS 2.95g/L，Sucrose 20g/L，头孢噻腭钠500mg/L，10mg/L潮霉素。
10.根据权利要求1所述的烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，所述烟草毛状根可应用于烟草基因功能鉴定。
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