CN108277233A - 水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养方法 - Google Patents

水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养方法：1)选取饱满、无霉变成熟水稻种子，用手工脱去谷壳；2)在超净工作台上，加入无菌水进行清洗；3)弃水，倒入适量75％酒精，摇动搅拌，表面消毒1‑3min；4)弃酒精，加无菌水进行清洗；5)弃水，加入1～3％NaClO，摇动搅拌，震荡灭菌20‑30min；6)弃1～3％NaClO，用无菌水清洗4‑5次，每次停留1‑2分钟；7)倒去无菌水，用灭菌后的无菌滤纸将种子表面的水分吸干。本发明方法通过改变培养温度和培养时间，缩短农杆菌介导转化水稻的进程，并提高了水稻愈伤组织的诱导率和转化率。

Description

水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养方法
技术领域
本发明分子生物学组织培养和转基因技术交叉技术领域，特别涉及一种水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养方法。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)不仅是主要的粮食作物也是单子叶植物基础研究的模式植物。随着世界人口的不断增长以及人们生活水平的提高，从而对水稻产量和品质提出了更高的要求。传统育种具有育种年限长，需连续自交才能选育出需要的优良性状已经很难满足需求，通过现代生物技术与传统育种技术相结合来提高水稻的产量和质量已成为今后主要的发展趋势。
随着分子生物学的发展，越来越多的参与植物抗病有关的基因被分离出来，如防卫反应有关的基因、参与抗病信号传导的基因，参与对病原物识别的基因等，要鉴定这些基因在植物抗病性中的作用和地位，就要构建转化植物的双元载体如超量表达、反义和RNA干涉的双元载体转化植物，来明确该基因在植物抗病中的作用。
水稻上常用的遗传转化方法分为DNA直接导入法和农杆菌介导的转化法。DNA直接导入法主要包括PEG(polyethylene glycol)介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。其中PEG法、电穿孔法以原生质体为受体，由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。
基因枪法优点是受体广泛，不受寄主范围的限制，转化率较高，但和其它DNA直接导入法一样存在共同的缺点：外源DNA的整合方式复杂，常常是多拷贝插入，较易出现转基因沉默现象，转化的外源基因片断不能太大(上限是16-20kb)，转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。
同DNA直接导入法相比，农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培养，简便易行，能有效地转入较大的外源DNA片断；转化效率高，转化的外源基因整合位点比较稳定(一般在T-DNA 25bp处与植物基因组整合)，整合的外源基因基本上保持其结构的完整性；整合的外源基因多为单拷贝或低拷贝；整合的外源基因在转基因植株中的显性表达率较高，共抑制现象相对较少；转入的外源基因通常以孟德尔遗传规律遗传。所以农杆菌介导转化法已成为转化单子叶植物的首选方法。
目前，在现有技术水稻愈伤组织诱导培养中，其培养温度为26℃培养9-12天，农杆菌介导转化水稻共培养的时间为2天，在愈伤组织诱导培养阶段采取低温处理培养时间长，水稻愈伤组织的出愈率和愈伤组织质量较差，愈伤组织的诱导率和转化率低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供了一种农杆菌介导水稻遗传转化方法。本发明方法通过改变培养温度和培养时间，缩短农杆菌介导转化水稻的进程，并提高了水稻愈伤组织的诱导率和转化率。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养方法，包括以下步骤：
1)选取饱满、无霉变成熟水稻种子，用手工脱去谷壳；
2)在超净工作台上，加入无菌水进行清洗；
3)弃水，倒入适量75％酒精，摇动搅拌，表面消毒1-3min；
4)弃酒精，加无菌水进行清洗；
5)弃水，加入1～3％NaClO，摇动搅拌，震荡灭菌20-30min；
6)弃1～3％NaClO，用无菌水清洗4-5次，每次停留1-2分钟；
7)倒去无菌水，用灭菌后的无菌滤纸将种子表面的水分吸干；
8)用镊子、解剖刀取出灭菌种子的成熟胚，将其接种于愈伤组织诱导培养基上，18～28℃暗培养7天；
9)培养结束后，剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织，转入继代培养基上，在相同条件下继代培养；以后每两周继代培养一次；挑选色泽淡黄、结构致密的愈伤组织继代培养6-7d后，用于农杆菌转化受体。
所述步骤5)弃水，加入2％NaClO，摇动搅拌，震荡灭菌20-30min。
所述步骤8)用镊子、解剖刀取出灭菌种子的成熟胚，将其接种于愈伤组织诱导培养基上，每皿30粒，均匀摆放，20～25℃暗培养7天。
所述步骤8)用镊子、解剖刀取出灭菌种子的成熟胚，将其接种于愈伤组织诱导培养基上，均匀摆放，22～24℃暗培养7天。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种根癌农杆菌的培养方法，包括以下步骤：将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含有50mg/L Kan和50mg/L Rif的YEB平板上划线，28℃黑暗培养2d，用接种环挑取农杆菌单菌落，将其接种于新鲜的YEB液体培养基中，28℃，220rpm摇床培养48h，然后将农杆菌加入含100umol/L AS的共培养基中，调整菌体浓度OD600至0.1-0.2左右，即为共培养转化的农杆菌悬浮液。
为解决上述技术问题，本发明又提供了一种水稻愈伤组织与农杆菌的共培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
挑选色泽淡黄、结构致密的愈伤组织放入无菌的三角瓶中，加入农杆菌悬浮液，室温，120rpm条件下侵染20min；
侵染完成后静置10min，然后将愈伤组织转移至无菌的滤纸上吸去多余的农杆菌菌液，并在超净工作台里吹2-3h，直至表面无肉眼可见菌体；
然后将其转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上；
20℃条件下分别黑暗培养12h～48h。
所述挑选色泽淡黄、结构致密的愈伤组织放入无菌的三角瓶中，加入农杆菌悬浮液，需要保证有足够的菌液与材料接触。
所述共培养基，为NB+100umol/LAS。
为解决上述技术问题，本发明再提供了一种如权利要求1～4中任一项诱导培养的水稻成熟胚愈伤组织。
为解决上述技术问题，本发明另提供了一种如权利要求5所述方法培养的根癌农杆菌。
本发明有益效果包括：本发明农杆菌介导水稻遗传转化方法在愈伤组织诱导培养阶段采取低温处理并缩短培养时间，水稻愈伤组织的出愈率和愈伤组织质量相较常规方法较好，在共培养阶段降低培养温度，缩短培养时间获得相对常规方法较好的转化率，本发明在缩短农杆菌介导转化水稻进程的同时还提高了愈伤组织的诱导率和转化率。
附图说明
图1为本发明实施例所述20℃培养时水稻愈伤组织的诱导情况照片；
图2为本发明实施例所述26℃培养时水稻愈伤组织的诱导情况照片；
图3为本发明实施例所述实验组抗性苗生根2天时生长情况照片；
图4为本发明实施例所述PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例详述本发明。为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明，但本发明并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本发明的实施例中的原料和催化剂均通过商业途径购买。本发明选用水稻品种日本晴为实验材料，农杆菌菌株为含目的基因载体的农杆菌EHA105。如表1所示，为本发明试剂说明：
表1本发明试剂说明
在本发明一实施例中，提供了一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，其实验操作步骤为：
1)诱导：水稻种子去壳消毒后，将成熟胚接种于诱导培养基中，诱导胚性愈伤组织；
2)侵染：将步骤1)所得愈伤组织与胚乳、芽分离，接种于农杆菌悬浮液中侵染，之后晾干待用；
3)共培养：将晾干的愈伤组织转到共培养基中，培养至愈伤组织表面出现菌体；
4)筛选：将共培养后的愈伤组织清洗后接种到筛选培养基中进行抗性筛选，获得抗性愈伤组织；
5)分化：将获得的抗性愈伤组织接种到分化培养基上培养至分化出幼苗；
6)生根：将幼苗接种到生根培养基上生根，并进行PCR检测，选择检测为阳性的植株作为转化得到的粳稻植株；
所涉培养基的具体配方如下：
YEB培养基：酵母提取物0.8-1.2g/L；蛋白胨4.5-5.0g/L；牛肉膏4.5-5.0g/L；蔗糖4.0-6.0g/L；硫酸镁0.3-0.5g/L；琼脂12-15g/L；pH 6.8-7.2；
诱导培养基：NB；2，4-D 1.8-2.0mg/mL；6-BA 0.1-0.2mg/mL；琼脂粉10-15g/L；
继代培养基：NB；2，4-D1.8-2.0mg/mL；CH 0.2-0.3g/L；蔗糖28-30g/L；琼脂粉10-15g/L；
共培养培养基：NB；AS 100-200umol/L；
筛选培养基：NB；2，4-D 1.8-2.0mg/mL；6-BA 0.1-0.2mg/mL；Hyg20-25mg/L，Timentin 200-400mg/L，琼脂粉10-15g/L；
分化培养基：NB；Pro 0.3-0.5g/L；CH 0.2-0.3g/L；6-BA 1.8-2.0mg/mL；KT 0.8-1.0mg/mL；NAA 0.3-0.5mg/mL，IAA 0.4-0.5mg/mL；Hyg 20-25mg/L；Timentin 200-400mg/L；蔗糖25-30g/L；琼脂粉10—15g/L；
生根培养基：NB；NAA 0.4-0.7mg/L；蔗糖25—30g/L；琼脂粉10—15g/L
在本发明的另一实施例中，提供了本发明方法在不同温度条件下水稻成熟胚愈伤组织诱导情况。
每组各20皿，接种600粒水稻成熟胚，共六组。将各组分别放置于18℃，20℃，22℃，24℃，26℃，28℃的恒温培养室内，其中26℃组为愈伤诱导常用温度，作为对照组，培养7天后统计愈伤组织诱导个数。结果如表2所示，培养温度为18℃，20℃，22℃，24℃，26℃，28℃时，其愈伤组织的诱导率分别为57.67％，91.17％，85.67％，86.67％，87.33％，84.67％。其中当培养温度为18℃时愈伤组织的诱导率最低，仅为57.67％，当培养温度为20℃时，其遇上组织诱导率最高，达91.17％，比对照组高3.84％。据研究报道，当培养温度为26℃，培养时间为10天时，日本晴的愈伤组织诱导率为85％-88％，由表3可知，结果与研究报道相符，本研究不仅缩短了培养时间还提高了愈伤组织的诱导率。
表2实验组，培养时间为7天时不同培养温度下的愈伤组织诱导情况
表3对照组，培养时间为10天时不同培养温度下愈伤组织诱导情况
培养温度 18℃ 20℃ 22℃ 24℃ 26℃ 28℃
愈伤诱导个数 336 447 464 512 504 498
愈伤诱导率 56％ 74.5％ 77.3％ 85.33％ 84％ 83％
在农杆菌介导转化水稻共培养阶段，以培养温度20℃为实验组，培养温度26℃为对照组，两组分别共培养12h，24h，36h,48h,然后进行抗性愈伤筛选，抗性愈伤组织分化培养，PCR检测，观察愈伤组织转化情况。如表4，表5所示，当培养温度为20℃时，转化率随着培养时间的延长呈先增长后下降趋势，最适培养时间为24h,转化率达42.3％，培养48h时转化率为39.2％；当培养温度为26℃时，转化率也随着培养时间的延长呈增长趋势，最适培养时间为48h，转化率为39％。农杆菌介导转化水稻共培养时，培养温度和培养时间影响愈伤组织的转化效率，由表4和表5可知，共培养温度为20℃，培养时间为24h时，愈伤组织的转化效率较高。
表4实验组，暗培养温度为20℃，愈伤组织的转化情况
表5实验组，暗培养温度为26℃时，愈伤组织的转化情况
在本发明的再一实施例中，提供了配置水稻愈伤诱导培养基、继代培养基、分化培养基，其培养基配方如下：
YEB培养基：酵母提取物0.8—1.2g/L；蛋白胨4.5—5.0g/L；牛肉膏4.5—5.0g/L；蔗糖4.0-6.0g/L；硫酸镁0.3—0.5g/L；琼脂12—15g/L；pH 6.8-7.2；
诱导培养基：NB；2,4-D 1.8-2.0mg/mL；6-BA 0.1—0.2mg/mL； 琼脂粉10—15g/L；
继代培养基：NB；2,4-D 1.8-2.0mg/mL；CH 0.2-0.3g/L；蔗糖28-30g/L；琼脂粉10—15g/L；
共培养培养基：NB；AS 1 00-200umol/L；
筛选培养基：NB；2,4-D 1.8-2.0mg/mL；6-BA 0.1—0.2mg/mL；Hyg20-25mg/L，Timentin 200-400mg/L，琼脂粉1 0—1 5g/L；
分化培养基：NB；Pro 0.3—0.5g/L；CH 0.2-0.3g/L；6-BA 1.8-2.0mg/mL；KT0.8—1.0mg/mL；NAA 0.3—0.5mg/mL，IAA 0.4-0.5mg/mL；Hyg 20-25mg/L；Timentin 200-400mg/L；蔗糖25-30g/L；琼脂粉1 0—1 5g/L；
在本发明的另一实施例中，提供了一种水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养方法：
1)选取饱满、无霉变成熟水稻种子，用手工脱去谷壳(注意保持胚完整)；
2)在超净工作台上，加入适量无菌水(以没过种子为准，下同)进行清洗；
3)弃水，倒入适量75％酒精，摇动搅拌，表面消毒1-3min；
4)弃酒精，加适量无菌水进行清洗；
5)弃水，加入适量2％NaClO，摇动搅拌，震荡灭菌20-30min；
6)弃2％NaClO，用无菌水清洗4-5次，每次停留1-2分钟；
7)倒去无菌水，用灭菌后的无菌滤纸将种子表面的水分吸干；
8)用镊子、解剖刀取出灭菌种子的成熟胚，将其接种于愈伤组织诱导培养基上(每皿30粒，均匀摆放)，此部分分为两组实验组为18℃，20℃，22℃，24℃，26℃，28℃暗培养7天；对照组为18℃，20℃，22℃，24℃，26℃，28℃暗培养10天；
9)培养结束后，剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织，转入继代培养基上，在相同条件下继代培养。以后每两周继代培养一次。挑选色泽淡黄、结构致密的愈伤组织继代培养6-7d后，用于农杆菌转化受体。
在本发明的又一实施例中，提供了一种根癌农杆菌的培养方法：
将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含有50mg/L Kan和50mg/L Rif的YEB平板上划线，28℃黑暗培养2d，用接种环挑取农杆菌单菌落，将其接种于新鲜的YEB液体培养基中，28℃，220rpm摇床培养48h，然后将农杆菌加入含100umol/L AS的共培养基中，调整菌体浓度OD600至0.1-0.2左右，即为共培养转化的农杆菌悬浮液。
在本发明的另一实施例中，提供了一种水稻愈伤组织与农杆菌的共培养方法：
仔细挑选无菌、状态较好(色泽淡黄、结构致密)的愈伤组织放入无菌的三角瓶中，加入适量的农杆菌悬浮液(保证有足够的菌液与材料接触即可)，室温，120rpm条件下侵染20min，侵染完成后静置10min，然后将愈伤组织转移至无菌的滤纸上吸去多余的农杆菌菌液，并在超净工作台里吹2-3h，直至表面无肉眼可见菌体，然后将其转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上(NB+100umol/LAS)，实验组为20℃条件下分别黑暗培养12h，24h，36h，48h；对照组为26℃条件下分别黑暗培养12h，24h，36h，48h。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养方法，包括以下步骤：
1)选取饱满、无霉变成熟水稻种子，用手工脱去谷壳；
2)在超净工作台上，加入无菌水进行清洗；
3)弃水，倒入适量75％酒精，摇动搅拌，表面消毒1-3min；
4)弃酒精，加无菌水进行清洗；
5)弃水，加入1～3％NaClO，摇动搅拌，震荡灭菌20-30min；
6)弃1～3％NaClO，用无菌水清洗4-5次，每次停留1-2分钟；
7)倒去无菌水，用灭菌后的无菌滤纸将种子表面的水分吸干；
8)用镊子、解剖刀取出灭菌种子的成熟胚，将其接种于愈伤组织诱导培养基上，18～28℃暗培养7天；
9)培养结束后，剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织，转入继代培养基上，在相同条件下继代培养；以后每两周继代培养一次；挑选色泽淡黄、结构致密的愈伤组织继代培养6-7d后，用于农杆菌转化受体。
所述步骤5)弃水，加入2％NaClO，摇动搅拌，震荡灭菌20-30min。
所述步骤8)用镊子、解剖刀取出灭菌种子的成熟胚，将其接种于愈伤组织诱导培养基上，每皿30粒，均匀摆放，20～25℃暗培养7天。
所述步骤8)用镊子、解剖刀取出灭菌种子的成熟胚，将其接种于愈伤组织诱导培养基上，均匀摆放，22～24℃暗培养7天。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种根癌农杆菌的培养方法，包括以下步骤：将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含有50mg/L Kan和50mg/L Rif的YEB平板上划线，28℃黑暗培养2d，用接种环挑取农杆菌单菌落，将其接种于新鲜的YEB液体培养基中，28℃，220rpm摇床培养48h，然后将农杆菌加入含100umol/L AS的共培养基中，调整菌体浓度OD600至0.1-0.2左右，即为共培养转化的农杆菌悬浮液。
为解决上述技术问题，本发明又提供了一种水稻愈伤组织与农杆菌的共培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
挑选色泽淡黄、结构致密的愈伤组织放入无菌的三角瓶中，加入农杆菌悬浮液，室温，120rpm条件下侵染20min；
侵染完成后静置10min，然后将愈伤组织转移至无菌的滤纸上吸去多余的农杆菌菌液，并在超净工作台里吹2-3h，直至表面无肉眼可见菌体；
然后将其转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上；
20℃条件下分别黑暗培养12h～48h。
所述挑选色泽淡黄、结构致密的愈伤组织放入无菌的三角瓶中，加入农杆菌悬浮液，需要保证有足够的菌液与材料接触。
所述共培养基，为NB+100umol/LAS。
为解决上述技术问题，本发明再提供了一种如权利要求1～4中任一项诱导培养的水稻成熟胚愈伤组织。
为解决上述技术问题，本发明另提供了一种如权利要求5所述方法培养的根癌农杆菌。
在本发明的又一实施例中，提供了一种抗性愈伤组织的筛选方法：
然后挑取介导转化后的愈伤组织于培养皿中，愈伤组织表面若无菌体存在则可不用无菌水进行冲洗，若有菌体存在则用无菌水于120rpm条件下冲洗3-5次，最后一次用含500mg/L Cef的无菌水静置1h，然后置于无菌滤纸上干燥30min，直至愈伤组织表面无可见农杆菌存在。然后将愈伤组织转移至含Hyg 20-25mg/L和200-400mg/L Timentin的筛选培养基进行筛选抗性愈伤，28℃暗培养，15d筛选一次，共筛选两次。
在本发明的另一实施例中，提供了一种抗性愈伤组织的分化方法：
从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有Hyg 20-25mg/L和200-400mg/L Timentin的分化培养基上，先暗培养7d，然后转至15h/d光照条件下培养，一般经过15d左右长出新的抗性愈伤并且出现绿点。然后挑选乳黄色致密有绿点的抗性愈伤组织转接于新的分化培养基上，于25d后进一步分化出小苗。需定期在超净工作台通风干燥抗性愈伤，防止分化的抗性愈伤水化。
在本发明的又一实施例中，提供了一种PCR抗性检测方法：
将步骤6的幼苗在生根培养基中生根，每个株系取3株小苗，两周后从每株苗中取些许叶片，提取DNA，进行PCR检测，将检测为阳性的小苗进行炼苗、移栽到泥土中。
DNA提取：随机抽取3株日本晴水稻抗性植株和一株非转基因水稻品种日本晴，分别提取基因组DNA。DNA提取步骤如下：取约2cm长的水稻叶片置于2ml离心管中；在研钵中加入800μL 1.5XCTAB，研磨叶片至匀浆并倒回离心管内；65℃水浴20-30min，每5min颠倒混匀1次；加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，上下颠倒混匀，持续10min；10000rpm离心10min；吸取400μL上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰预冷的95％乙醇，-20℃冰置20min；12000rpm离心15min；弃上清，加入500μL 75％乙醇，颠倒漂洗，12000rpm离心5min；弃上清，置于超净台吹干或自然晾干，加100μL ddH2O溶解DNA。
以Hyg基因设计引物序列：F1：5′-GGACTTCGGGGCAGTCCT-3′；R1：5′-CGATGTAGGAGGGCGTGG-3′为引物，分别以日本晴水稻抗性植株基因组DNA(样品)，转化所用质粒DNA(阳性对照)，非转基因日本晴基因组DNA(阴性对照)为模板，进行PCR检测。PCR反应程序和体系如下：程序：94℃预变性5min，94℃变性45s，55℃退火45s；72℃延伸1.5min；30个循环；72℃再延伸10min；16℃结束。反应在20μL体系中进行，其中包括：10×EasyTaqBuffer(+Mg2+)2μL，DNA模板1μL，2mM dNTPs 2μL，10μM/L的正向，反向引物各1μL，5U/μLTaq DNA聚合酶1μL，ddH2O补足至20μL。
以上所述，仅是本发明的几个实施例，并非对本发明做任何形式的限制，虽然本发明以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于本发明技术方案保护范围内。

Claims (10)

1.一种水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)选取饱满、无霉变成熟水稻种子，用手工脱去谷壳；
2)在超净工作台上，加入无菌水进行清洗；
3)弃水，倒入适量75％酒精，摇动搅拌，表面消毒1-3min；
4)弃酒精，加无菌水进行清洗；
5)弃水，加入1～3％NaClO，摇动搅拌，震荡灭菌20-30min；
6)弃1～3％NaClO，用无菌水清洗4-5次，每次停留1-2分钟；
7)倒去无菌水，用灭菌后的无菌滤纸将种子表面的水分吸干；
8)用镊子、解剖刀取出灭菌种子的成熟胚，将其接种于愈伤组织诱导培养基上，18～28℃暗培养7天；
9)培养结束后，剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织，转入继代培养基上，在相同条件下继代培养；以后每两周继代培养一次；挑选色泽淡黄、结构致密的愈伤组织继代培养6-7d后，用于农杆菌转化受体。
2.根据权利要求1所述水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养方法，其特征在于，所述步骤5)弃水，加入2％NaClO，摇动搅拌，震荡灭菌20-30min。
3.根据权利要求1所述水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养方法，其特征在于，所述步骤8)用镊子、解剖刀取出灭菌种子的成熟胚，将其接种于愈伤组织诱导培养基上，每皿30粒，均匀摆放，20～25℃暗培养7天。
4.根据权利要求1所述水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养方法，其特征在于，所述步骤8)用镊子、解剖刀取出灭菌种子的成熟胚，将其接种于愈伤组织诱导培养基上，均匀摆放，22～24℃暗培养7天。
5.一种根癌农杆菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含有50mg/L Kan和50mg/L Rif的YEB平板上划线，28℃黑暗培养2d，用接种环挑取农杆菌单菌落，将其接种于新鲜的YEB液体培养基中，28℃，220rpm摇床培养48h，然后将农杆菌加入含100umol/LAS的共培养基中，调整菌体浓度OD600至0.1-0.2左右，即为共培养转化的农杆菌悬浮液。
6.一种水稻愈伤组织与农杆菌的共培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
挑选色泽淡黄、结构致密的愈伤组织放入无菌的三角瓶中，加入农杆菌悬浮液，室温，120rpm条件下侵染20min；
侵染完成后静置10min，然后将愈伤组织转移至无菌的滤纸上吸去多余的农杆菌菌液，并在超净工作台里吹2-3h，直至表面无肉眼可见菌体；
然后将其转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上；
20℃条件下分别黑暗培养12h～48h。
7.根据权利要求6所述水稻愈伤组织与农杆菌的共培养方法，其特征在于，所述挑选色泽淡黄、结构致密的愈伤组织放入无菌的三角瓶中，加入农杆菌悬浮液，需要保证有足够的菌液与材料接触。
8.根据权利要求6所述水稻愈伤组织与农杆菌的共培养方法，其特征在于，所述共培养基，为NB+100umol/LAS。
9.一种如权利要求1～4中任一项诱导培养的水稻成熟胚愈伤组织。
10.一种如权利要求5所述方法培养的根癌农杆菌。
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