CN106554971A - 表达基因重组人血清白蛋白的转基因黑麦草的制备方法 - Google Patents

表达基因重组人血清白蛋白的转基因黑麦草的制备方法 Download PDF

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Abstract

表达基因重组人血清白蛋白的转基因黑麦草的制备方法，涉及基因重组人类血清白蛋白在黑麦草基因组中的整合以及转基因植株的筛选。目的是解决目前人血清白蛋白来源有限切价格昂贵的问题。方法：一、以黑麦草成熟胚为外植体诱导愈伤组织；二、菌液的活化与重悬；三、将愈伤组织浸泡于农杆菌重悬液；四、将浸泡后的愈伤组织转入培养基上共培养；五、将愈伤组织转入筛选分化培养基中培养，诱导出抗性再生植物，鉴定为阳性的即为转基因黑麦草。本发明用于制备表达基因重组人血清白蛋白的转基因黑麦草。

Description

表达基因重组人血清白蛋白的转基因黑麦草的制备方法
技术邻域
本发明涉及一种转基因黑麦草的制备方法。
技术背景
人血白蛋白(human serum albumin，HSA)是由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子质量为66.5kD，等电点在4.7-4.9之间。它是人血液中的主要蛋白质，占血浆总蛋白的60％左右，每升人血中含有人血白蛋白约40g。除了血浆之外，人血白蛋白还存在于组织、身体的分泌液、皮肤和淋巴腔中。HSA前体(preproHSA)在肝脏中合成，并且在高尔基体中被加工剪切，形成成熟的HSA分子，释放到血液中，对保持血液的正常渗透压具有重要作用；它在血液中作为多种疏水性分子的载体，其中包括脂肪酸、胆色素、激素、生物学活性物质及药物等，从而调节人体内的多种生理功能。在体外，它作为多种药物的稳定剂被广泛用于多种疾病的治疗、药物载体、动物细胞培养、血浆替代物等。因此，人血白蛋白是一种重要的医用蛋白质，在临床上主要用于治疗因失血、烧伤、烫伤、整形外科手术及脑损伤引起的低蛋白血症以及肝硬化、肾水肿等。在国际市场上具有巨大的需求，每年的需求量高达500吨以上。
目前，临床使用的人血白蛋白主要是从人源血浆中提取和分离制得。然而，血浆来源受到限制，即有限的血液来源难以满足生产HSA和其相关制剂的需求。另一方面血液自身也可能含有危险的传染病原体如肝炎病毒、HIV病毒等，使得人们对于使用血浆中提取的人血白蛋白存在巨大的担忧。随着基因工程和分子生物学的发展，人们已经试图利用各种不同的表达系统来大批量生产重组人血白蛋白，例如利用原核生物如大肠杆菌(MartinLatta,Michael Knapp,et al.Nature Biotechnology,1309-1314(1987))、枯草芽抱杆菌(Charles W,Saunders CW,et al.Journal of Bacteriology,169:2917-2925(1987))，真核生物如酵母(Kaoru Kobayashi.Biologicals.34:55-59(2006))、转基因动物培养(ShaniM,Barash I,et al.Transgenic Res,1:195-208(1992))等生产人血白蛋白，但这些方法因表达水平较低或生产成本较高，不能用于工业化生产。此外，已有研究表明在转基因水稻(He Y,Ning T,et al.Proc Natl Acad Sci.U.S.A.108 19078–19083(2011))表达的重组人血白蛋白在理化性质及其功能与人源血清白蛋白相似，但水稻的生长周期相对较长，所以在产业化生产中有一定的局限。
发明内容
本发明是针对现有原核与真核生物为生物反应器的表达量低、无生物活性和不安全等特点，为解决目前人血白蛋白来源有限及价格昂贵的问题，提供一种表达重组人血白蛋白基因的转基因黑麦草的制备方法。
本发明表达重组人血白蛋白基因的转基因黑麦草的制备方法，按以下步骤进行：
一、将黑麦草种子置于50％H2SO4浸泡处理20-30min去皮，纯水漂洗3-5次，至无多余杂质悬浮，吹干去皮后的种子备用；
二、选择饱满的去皮种子进行消毒处理，先将籽粒饱满的种子于75％的乙醇中消毒1min，然后用无菌水漂洗一次，再用30％(v/v)次氯酸钠溶液消毒5-10min，无菌水冲洗5-6次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，纵切为两半接种于愈伤组织诱导培养基中，25℃暗培养；
三、两周后将愈伤组织分离，转入继代培养基，每两周继代一次，培养至愈伤组织转变为胚性愈伤组织；
四、将基因重组人血清白蛋白转基因工程菌划线培养于含利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L的YEP固体培养基上，在28℃培养2d，挑取单克隆加入到5ml含卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L的YEP培养基中，在28℃、180rpm摇床培养24h后，按体积百分比1:50-1:100的接种量接种到100mL含AS 100uM/L的YEP培养基中，28℃、180rpm摇床培养至OD600达0.6-0.8，获得活化菌液；
五、取活化后的菌液4000g离心10min，将菌体用愈伤组织诱导培养基中重悬稀释至OD600为0.5-0.6，将步骤二中预培养后的胚性愈伤组织至于重悬菌液中，在恒温摇床上于28℃，180rpm浸泡10-20min，然后取出外愈伤组织吸干表面菌液，转入不定芽诱导分化培养基中，于24-26℃黑暗条件下共培养3d；
六、将共培养3d后的愈伤组织用含100mg/L羧苄青霉素的无菌水清洗3次，用无菌滤纸吸干表面水分后，转入不定芽诱导分化培养基中恢复培养1周，然后转入筛选分化培养基中光照节律培养，2周继代一次，至愈伤组织分化出抗性芽；再将抗性芽转接至生根培养基中培养，待再生植株形成后炼苗、移栽，并对再生植株进行鉴定，获得阳性植株即为转基因黑麦草。
人血清白蛋白具有相对稳定的结构特性，相对于原核表达体系和酵母表达体系，采用转基因黑麦草作为生物反应器能更好的进行转录翻译后的修饰，以保证基因重组人血清白蛋白能正确折叠形成具有生物活性的功能蛋白。黑麦草是重要的禾本科牧草，其分蘖多，产量高，质地软，绿期长，是良好的绿色饲料。此外，黑麦草根系发达，适生性强，有耐盐碱潜力等特点，使它成为了外源蛋白物质表达的良好媒介。
本发明采用农杆菌介导的植物基因转化技术将基因重组人血清白蛋白基因导入黑麦草基因组中，经筛选鉴定后获得含基因重组人血清白蛋白基因的转基因黑麦草植株。目的在于通过以转基因黑麦草为生物反应器规模化生产基因重组人血清白蛋白，从而解决人血白蛋白的来源短缺和价格昂贵的问题。
附图说明
图1.抗性植株基因组DNA PCR检测结果，+所用PCR模板为含目的基因片段的转基因工程菌株质粒，-所用PCR模板为野生型黑麦草基因组DNA，1-14分别为对卡那霉素具有抗性的再生黑麦草植株基因组DNA的PCR扩增产物。其中编号2、5、10、12及13泳道没有与阳性对照一致的条带，为抗生素假阳性植株，予以剔除；其余泳道均有与阳性对照一致的条带，初步证明其对应植株的基因组中成功转入基因重组人血清白蛋白的基因序列。
图2.转基因黑麦草基因组DNA PCR产物第1位至第300位核苷酸测序峰图。
图3.转基因黑麦草基因组DNA PCR产物第301位至第600位核苷酸测序峰图。
图4.转基因黑麦草基因组DNA PCR产物第601位至第900位核苷酸测序峰图。
图5.转基因黑麦草基因组DNA PCR产物第901位至第1200位核苷酸测序峰图。
图6.转基因黑麦草基因组DNA PCR产物第1201位至第1500位核苷酸测序峰图。
图7.转基因黑麦草基因组DNA PCR产物第1501位至第1761位核苷酸测序峰图。
图8.转基因黑麦草蛋白质粗提物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。M为分子标记，+为阳性对照(人血清白蛋白)，-为空白对照，1-7分别是PCR检测呈阳性的黑麦草叶片蛋白粗提物，其中编号4对应的植株没有出现与阳性对照一致的蛋白条带。
图9.转基因黑麦草中表达的基因重组人血清白蛋白的Western Blot结果。M为分子标记，+为阳性对照(人血清白蛋白)，-为空白对照，1-7分别是PCR检测呈阳性的黑麦草叶片蛋白粗提物，其中编号4对应的植株没有出现与阳性对照一致的蛋白质印记条带。
具体实施方式
一种表达基因重组人血清白蛋白的转基因黑麦草的制备方法，用于本发明的进一步说明，但不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式表达基因重组人血清白蛋白的转基因黑麦草的制备方法，按以下步骤进行：
一、将黑麦草种子置于50％H2SO4浸泡处理20-30min去皮，纯水漂洗3-5次，至无多余杂质悬浮，吹干去皮后的种子备用；
二、选择饱满的去皮种子进行消毒处理，先将籽粒饱满的种子于75％的乙醇中消毒1min，然后用无菌水漂洗一次，再用30％(v/v)次氯酸钠溶液消毒5-10min，无菌水冲洗5-6次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，纵切为两半接种于愈伤组织诱导培养基中，25℃暗培养；
三、两周后将愈伤组织分离，转入继代培养基，每两周继代一次，培养至愈伤组织转变为胚性愈伤组织；
四、将基因重组人血清白蛋白转基因工程菌划线培养于含利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L的YEP固体培养基上，在28℃培养2d，挑取单克隆加入到5ml含卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L的YEP培养基中，在28℃、180rpm摇床培养24h后，按体积百分比1:50-1:100的接种量接种到100mL含AS 100uM/L的YEP培养基中，28℃、180rpm摇床培养至OD600达0.6-0.8，获得活化菌液；
五、取活化后的菌液4000g离心10min，将菌体用愈伤组织诱导培养基中重悬稀释至OD600为0.5-0.6，将步骤二中预培养后的胚性愈伤组织至于重悬菌液中，在恒温摇床上于28℃，180rpm浸泡10-20min，然后取出外愈伤组织吸干表面菌液，转入不定芽诱导分化培养基中，于24-26℃黑暗条件下共培养3d；
六、将共培养3d后的愈伤组织用含100mg/L羧苄青霉素的无菌水清洗3次，用无菌滤纸吸干表面水分后，转入不定芽诱导分化培养基中恢复培养1周，然后转入筛选分化培养基中光照节律培养，2周继代一次，至愈伤组织分化出抗性芽；再将抗性芽转接至生根培养基中培养，待再生植株形成后炼苗、移栽，并对再生植株进行鉴定，获得阳性植株即为转基因黑麦草。
本实施方式步骤一中黑麦草种子为多花黑麦草(Lolium multiflourum Lamk.)，购自百绿(天津)国际草业有限公司。
本实施方式步骤四中YEP培养基成分为：10g/L蛋白胨、10g/L酵母浸膏、10g/L氯化钠和蒸馏水组成，pH值为7.0，固体培养基添加琼脂粉15g/L，常规高温高压灭菌。
本实施方式步骤四中基因重组人血清白蛋白转基因工程菌已在专利文献《用于植物表达重组人血白蛋白基因的转基因农杆菌株》中公开，申请号为201610306847.1。所述基因重组人血清白蛋白转基因工程菌转入了基因重组人血清白蛋白基因。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中愈伤组织诱导培养基MS基本培养基附加5mg/L 2，4-D,，0.1mg/L 6-BA和0.5g/L水解酪蛋白。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤三中愈伤组织继代培养基MS基本培养基附加3mg/L 2，4-D，0.1mg/L 6-BA和0.5g/L水解酪蛋白。其他与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：步骤三中的培养条件为：温度24-26℃，光周期为16小时光/8小时暗，光照强度1600Lx。其他与具体实施方式一至三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四不同的是步骤五和步骤六中的不定芽诱导分化培养基为MS基本培养基附加2mg/L 6-BA，0.1mg/LNAA和0.5g/L水解酪蛋白。其他与具体实施方式一至四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五不同的是步骤六中的筛选分化培养基为MS基本培养基附加3mg/L 2，4-D，0.1mg/L 6-BA，50mg/L卡那霉素，250mg/L羧苄青霉素和0.5g/L水解酪蛋白。其他与具体实施方式一至五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六不同的是步骤六中的生根培养基为1/2MS基本培养基附加0.1mg/L IBA。其他与具体实施方式一至六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七不同的是步骤六中筛选分化培养和生根培养的条件为：温度24-26℃，光周期为16小时光/8小时暗，光照强度1600Lx。其他与具体实施方式一至七相同。
具体实施方式九：本实施方式表达重组人血白蛋白基因的转基因黑麦草的制备方法，按以下步骤进行：
一、将黑麦草种子置于50％H2SO4浸泡处理30min去皮，纯水漂洗5次，至无多余杂质悬浮，吹干去皮后的种子备用；
二、选择饱满的去皮种子进行消毒处理，先将籽粒饱满的种子于75％的乙醇中消毒1min，然后用无菌水漂洗一次，再用30％(v/v)次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水冲洗6次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，纵切为两半接种于愈伤组织诱导培养基中，25℃暗培养；
三、两周后将愈伤组织分离，转入继代培养基，每两周继代一次，培养至愈伤组织转变为胚性愈伤组织；
四、将基因重组人血清白蛋白转基因工程菌划线培养于含利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L的YEP固体培养基上，在28℃培养2d，挑取单克隆加入到5ml含卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L的YEP培养基中，在28℃、180rpm摇床培养24h后，按体积百分比1:100的接种量接种到100mL含AS 100uM/L的YEP培养基中，28℃、180rpm摇床培养至OD600达0.6，获得活化菌液；
五、取活化后的菌液4000g离心10min，将菌体用愈伤组织诱导培养基中重悬稀释至OD600为0.6，将步骤二中预培养后的胚性愈伤组织至于重悬菌液中，在恒温摇床上于28℃，180rpm浸泡15min，然后取出外愈伤组织吸干表面菌液，转入不定芽诱导分化培养基中，于24-26℃黑暗条件下共培养3d；
六、将共培养3d后的愈伤组织用含100mg/L羧苄青霉素的无菌水清洗3次，用无菌滤纸吸干表面水分后，转入不定芽诱导分化培养基中恢复培养1周，然后转入筛选分化培养基中光照节律培养，2周继代一次，至愈伤组织分化出抗性芽；再将抗性芽转接至生根培养基中培养，待再生植株形成后炼苗、移栽，并对再生植株进行鉴定，获得阳性植株即为转基因黑麦草。
具体实施步骤中所用的培养基如下：
本实施方式中基因重组人血清白蛋白转基因工程菌株在构建时加有抗卡那霉素基因，对卡那霉素具有抗性，因此筛选培养和生根培养后可初步证明目的基因(基因重组人血清白蛋白基因)导入到受体植物中。但为了进一步排除假阳性植株的存在，需进一步鉴定，对抗性再生植株鉴定方法包括PCR检测、PCR产物测序以及Western Blot检测。具体步骤如下：
使用Sangon Biotech公司Dzup(植物)基因组DNA快速抽提试剂盒提取步骤六中获得的抗性再生黑麦草的基因组DNA；以再生黑麦草gDNA作为模板，以P1、P2为引物进行PCR扩增(同时设置阳性对照为含目的基因片段的转基因工程菌株质粒，空白对照为非转基因黑麦草基因组DNA)，反应体系如下：
PCR反应条件：预变性95℃，5min，变性95℃，10sec，退火55℃，30sec，延伸72℃，2min，共30个循环，延伸72℃，10min，4℃保存。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，将PCR检测呈阳性的植株的PCR产物委托上海生物工程技术服务有限公司进行DNA测序，测序结果与目的基因序列保持一致。
对PCR检测呈阳性的植株进行总蛋白的提取。首先用液氮将黑麦草叶片冷冻，每克组织加入3mL蛋白提取缓冲液(0.1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，10mmol/L MgCl2，18％(w/v)sucrose，40mmol/L 2-Mercaptoethanol)，于研钵中充分研磨；转至离心管中置于4℃离心机10000g离心20min；不同抗性植株的蛋白粗提液经10％的SDS-PAGE聚丙烯凝胶电泳(同时设置阳性对照为人血清白蛋白，空白对照为非转基因黑麦草蛋白粗提物)，考马斯亮蓝染色和蛋白质印记法(Western Blot)检测，除编号4对应的泳道，其余植株对应的泳道都具有与阳性对照(人血清白蛋白)相同分子量的条带，蛋白质印迹中所显示的带型与阳性对照一致，说明转基因黑麦草中特异蛋白质条带是基因重组人血清白蛋白。
SEQUENCE LISTING
<110> 王大勇
<120> 表达基因重组人血清白蛋白的转基因黑麦草的制备方法
<130> 2017
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列-DNA PCR上游引物
<400> 1
gcgtctagag ccaccatgga tgcacacaag 30
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列－DNA PCR下游引物
<400> 2
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<210> 3
<211> 1758
<212> DNA
<213> 基因重组人血清白蛋白cDNA序列
<400> 3
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cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta 1380
tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc 1440
ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa 1500
gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag 1560
agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagctcgtga aacacaagcc caaggcaaca 1620
aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag 1680
gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa 1740
gctgccttag gcttataa 1758
<210> 4
<211> 585
<212> PRT
<213> 基因重组人血清白蛋白氨基酸序列
<400> 4
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585

Claims (8)

1.利用转基因黑麦草表达人血清白蛋白的方法，其特征在于植物基因组中整合了人类血清白蛋白基因的转基因黑麦草的制备和筛选方法，按以下步骤进行：
（一）将黑麦草种子置于50% H2SO4浸泡处理20-30分钟去皮，纯水漂洗3-5次，至无多余杂质悬浮，吹干去皮后的种子备用；
（二）选择饱满的去皮种子进行消毒处理，先将籽粒饱满的种子于75%的乙醇中消毒1min，然后用无菌水漂洗一次，再用30%(v/v)次氯酸钠溶液消毒5-10min，无菌水冲洗5-6次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，纵切为两半接种于愈伤组织诱导培养基中，25℃暗培养；
（三）两周后将愈伤组织分离，转入继代培养基，每两周继代一次，培养至愈伤组织转变为胚性愈伤组织；
（四）将基因重组人血清白蛋白转基因工程菌划线培养于含利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L的YEP固体培养基上，在28℃培养2d，挑取单克隆加入到5ml含卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L的YEP培养基中，在28℃、180rpm摇床培养24h后，按体积百分比1:50-1:100的接种量接种到100mL含AS 100uM/L的YEP培养基中，28℃、180rpm摇床培养至OD600达0.6-0.8，获得活化菌液；
（五）取活化后的菌液4000g离心10min，将菌体用愈伤组织诱导培养基中重悬稀释至OD600为0.5-0.6，将步骤二中预培养后的胚性愈伤组织至于重悬菌液中，在恒温摇床上于28℃，180rpm浸泡10-20min，然后取出外愈伤组织吸干表面菌液，转入不定芽诱导分化培养基中，于24-26℃黑暗条件下共培养3d；
（六）将共培养3d后的愈伤组织用含100mg/L 羧苄青霉素的无菌水清洗3次，用无菌滤纸吸干表面水分后，转入不定芽诱导分化培养基中恢复培养1周，然后转入筛选分化培养基中光照节律培养，2周继代一次，至愈伤组织分化出抗性芽；再将抗性芽转接至生根培养基中培养，待再生植株形成后炼苗、移栽，并对再生植株进行鉴定，获得阳性植株即为转基因黑麦草。
2.根据权利要求1所述的一种表达基因重组人血清白蛋白的转基因黑麦草的制备方法，其特征在于步骤二中的愈伤组织诱导培养基为MS基本培养基附加5mg/L 2,4-D,0.1mg/L 6-BA和0.5g/L水解酪蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种表达基因重组人血清白蛋白的转基因黑麦草的制备方法，其特征在于步骤三中的愈伤组织继代培养基为MS基本培养基附加3mg/L 2,4-D,0.1mg/L 6-BA和0.5g/L水解酪蛋白。
4.根据权利要求1所述的一种表达基因重组人血清白蛋白的转基因黑麦草的制备方法，其特征在于步骤三中的培养条件为：温度24-26℃，光周期为16小时光/8小时暗，光照强度1600Lx。
5.根据权利要求1所述的一种表达基因重组人血清白蛋白的转基因黑麦草的制备方法，其特征在于步骤五和步骤六中的不定芽诱导分化培养基为MS基本培养基附加2mg/L 6-BA，0.1mg/LNAA和0.5g/L水解酪蛋白。
6.根据权利要求1所述的一种表达基因重组人血清白蛋白的转基因黑麦草的制备方法，其特征在于步骤六中的筛选分化培养基为MS基本培养基附加3mg/L 2,4-D, 0.1mg/L6-BA，50mg/L卡那霉素,250mg/L羧苄青霉素和0.5g/L水解酪蛋白。
7.根据权利要求1所述的一种表达基因重组人血清白蛋白的转基因黑麦草的制备方法，其特征在于步骤六中的生根培养基为1/2MS基本培养基附加0.1mg/L IBA。
8.根据权利要求1所述的一种表达基因重组人血清白蛋白的转基因黑麦草的制备方法，其特征在于步骤六中筛选分化培养和生根培养的条件为：温度24-26℃，光周期为16小时光/8小时暗，光照强度1600Lx。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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