CN116445409B - 视杆感光前体细胞的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了视杆感光前体细胞的制备方法及其应用。本发明提供了一种诱导胚胎干细胞或多能干细胞分化为视杆感光前体细胞的培养基，所述培养基由培养基Ⅰ、培养基Ⅱ、培养基Ⅲ、培养基Ⅳ和培养基Ⅴ组成。本发明还提供了一种制备视杆感光前体细胞的方法及其应用，所述方法制备得到的视杆感光前体细胞具备定向分化为视杆感光细胞的潜能。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，涉及视杆感光前体细胞的制备方法及其应用。
背景技术
视网膜变性疾病是全世界无法治愈的低视力和失明的主要原因，会造成严重的社会负担。视网膜退行性疾病是由视网膜感光细胞或邻近支持组织的不可逆凋亡引起的。目前仍缺乏特异性治疗方法，也没有药物阻止视网膜变性进程成为临床迫切解决的问题。干细胞移植替代感光细胞疗法被认为是治疗视网膜变性疾病最具前景的方法之一。人胚胎干细胞（hESCs, human embryonic stem cells）或人诱导多能干细胞（iPSCs, inducedpluripotent stem cells）具备强大的自我更新能力和多向分化潜能，将hESCs/iPSCs特异性诱导分化为视网膜细胞，移植入变性视网膜，分化产生感光细胞，重建视网膜生理结构，恢复视网膜光感受通路，在一定程度上恢复视功能。hESCs/iPSCs分化存在异质性及非同步性，其分化产物不仅包含产生感光细胞的祖细胞，还有能分化为其他类型视网膜细胞的祖细胞。为满足临床使用需求，要求能从hESCs/iPSCs分化产物中高效获取人视杆感光前体细胞。
人视杆感光前体细胞是人视网膜发育过程具备分化为视杆感光细胞潜能的一类短暂存在的过渡态细胞。大量动物实验研究发现，OTX2、CRX和NRL等基因是决定感光细胞命运的关键转录调控因子，其构成的基因调控网络（GRN, gene regulating networks）协调感光细胞发育。前期学者们通过使用普通转录组测序结合形态学观察研究人胚胎视网膜组织也发现，OTX2、VSX2、CRX、NRL等基因与感光细胞发育密切相关。有学者构建了CRX驱动绿色荧光蛋白表达的hESC细胞系，发现FACS分选的CRX阳性的细胞移植入变性视网膜后可分化为感光细胞，改善动物视功能。遗憾的是，由于对人视杆感光前体细胞的发育规律及分子特征的认识不清楚，未能分离、纯化出人视杆感光前体细胞，成为限制干细胞治疗视网膜变性疾病临床转化应用的关键瓶颈问题。因此，迫切需要开发一种能够制备人视杆感光前体细胞的方法。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种诱导胚胎干细胞或多能干细胞分化为视杆感光前体细胞的培养基；本发明的目的之二在于提供一种制备视杆感光前体细胞的方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明第一方面提供了一种诱导胚胎干细胞或多能干细胞分化为视杆感光前体细胞的培养基，所述培养基包括培养基Ⅰ、培养基Ⅱ、培养基Ⅲ、培养基Ⅳ、培养基Ⅴ；
所述培养基Ⅰ包括基础培养基、脂质浓缩物、硫代甘油、血清替代物、ROCK信号抑制剂；
所述培养基Ⅱ包括基础培养基、脂质浓缩物、硫代甘油、血清替代物、ROCK信号抑制剂、TGF-β受体抑制剂；
所述培养基Ⅲ包括基础培养基、血清替代物、GSK-3抑制剂、FGFR抑制剂；
所述培养基Ⅳ包括基础培养基、血清替代物、视黄酸应答性受体激活剂、牛磺酸；
所述培养基Ⅴ包括基础培养基、血清替代物、牛磺酸。
进一步，所述基础培养基包括DMEM、IMDM、DMEM/F12、DMEM/F12-谷氨酰胺、F12、F10、BME、MEM中的一种或几种；
所述硫代甘油包括α-单硫代甘油、1-硫代甘油中的一种或几种；
所述血清替代物包括KOSR CTS、CTS N2添加剂、KOSR、N2添加剂、B-27、PhysiologixTM XF SR、StemSureTM SerumSubstitute Supplement中的一种或几种；
所述ROCK信号抑制剂包括Y-27632、HA-100、H-1152、HA1077、Y-30141、Wf-536、羟基-HA-1077、GSK269962A、SB-772077-B中的一种或几种；
所述TGF-β受体抑制剂包括BMP4、SB431542、A-83-01、Wnt3a/BIO、SMl6、GW6604、SB-505124中的一种或几种；
所述GSK-3抑制剂包括CHIR99021、CHIR98014、CT20026、LY2090314、SU9516、ARA014418、GF109203x、Ro318220、SB216763、SB415286、I5、CGP60474、TWS119中的一种或几种；
所述FGFR抑制剂包括SU5402、PD161570、PD173074、LY2874455、FIN-2、AZD4547、BGJ398、Nintedanib中的一种或几种；
所述视黄酸应答性受体激活剂包括视黄酸。
进一步，所述培养基Ⅰ包括IMDM、F12、脂质浓缩物、α-单硫代甘油、1-硫代甘油、KOSR CTS、Y-27632；和/或
所述培养基Ⅱ包括IMDM、F12、脂质浓缩物、α-单硫代甘油、1-硫代甘油、KOSR CTS、Y-27632、BMP4；和/或
所述培养基Ⅲ包括DMEM/F12-谷氨酰胺、CTS N2补充剂、CHIR99021、SU5402；和/或
所述培养基Ⅳ包括DMEM/F12-谷氨酰胺、KOSR CTS、CTS N2补充剂、视黄酸、牛磺酸；和/或
所述培养基Ⅴ包括DMEM/F12-谷氨酰胺、KOSR CTS、CTS N2补充剂、牛磺酸。
本发明第二方面提供了一种制备视杆感光前体细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
1）使用本发明第一方面所述的培养基对胚胎干细胞或多能干细胞进行诱导分化，获得类视网膜组织；
2）处理步骤1）中所述的类视网膜组织，获得视杆感光前体细胞。
进一步，所述步骤1）包括以下步骤：
a）将胚胎干细胞或多能干细胞置于所述的培养基Ⅰ中诱导分化培养；
b）将步骤a）获得的细胞转入所述的培养基Ⅱ中继续分化培养；
c）将步骤b）获得的类视网膜组织转入所述的培养基Ⅲ中诱导分化培养；
d）将步骤c）获得的类视网膜组织转入所述的培养基Ⅳ中分化培养；
e）将步骤d）获得的类视网膜组织转入所述的培养基Ⅴ中继续分化培养。
进一步，所述步骤a）的具体步骤包括：使用培养基Ⅰ重悬分散状态的胚胎干细胞或多能干细胞，重悬沉淀后进行3D培养，培养至第6天；
所述的步骤b）具体步骤包括：更换为包含BMP4的培养基Ⅱ继续培养步骤a）获得的细胞，每3天更换一次培养基Ⅱ，直到第18天；
所述的步骤c）具体步骤包括：使用培养基Ⅲ洗涤步骤b）获得的类视网膜组织，更换为培养基Ⅲ重悬所述的类视网膜组织，继续诱导分化7天；
所述的步骤d）具体步骤包括：更换为培养基Ⅳ培养步骤c）获得的类视网膜组织，每3天更换一次培养基Ⅳ，直到第60天；和/或
所述的步骤e）具体步骤包括：更换为培养基Ⅴ培养步骤d）获得的类视网膜组织，每3天更换一次培养基Ⅴ。
进一步，所述处理的方法包括将所述的类视网膜组织消化为细胞悬浮液，在细胞悬浮液中分选视杆感光前体细胞。
进一步，所述分选的方法包括使用特异性结合CD44蛋白的结合剂分选视杆感光前体细胞。
进一步，所述结合剂包括特异性结合CD44蛋白的抗体、抗体功能片段、偶联抗体、探针、多肽。
本发明第三方面提供了如下任一项应用：
1）CD44抗体在富集视杆感光前体细胞中的应用；
2）CD44抗体在制备富集视杆感光前体细胞的试剂盒中的应用；
3）CD44作为靶标在富集视杆感光前体细胞中的应用；
4）本发明第二方面所述的方法获得的视杆感光前体细胞在制备治疗视网膜疾病的药物中的应用。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供的培养基及制备方法能够诱导胚胎干细胞或多能干细胞分化为视杆感光前体细胞，并且找到了一个特异性表面标志蛋白CD44，可以有效的代表在分化过程中最早产生的视杆感光前体细胞。因此，可以通过流式细胞分选或者磁珠分选的方法将视杆感光前体细胞从混杂的胚胎干细胞分化产物中分离和纯化出来。且本发明的视杆感光前体细胞具备定向分化为视杆感光细胞的潜能，并能与宿主视网膜进行有效功能整合，改善视功能。
附图说明
图1是类视网膜组织DIC形态学检测的效果图；
图2是免疫荧光检测胚胎期视网膜和类视网膜组织的效果图，其中2A为检测16W胚胎期视网膜的效果图，2B为检测60天类视网膜组织的效果图；
图3是流式检测类视网膜组织组内CD44阳性细胞的效果图，其中3A为检测对照组内CD44阳性细胞的效果图，3B为检测A2组内CD44阳性细胞的效果图；注：对照组代表阴性对照Isotype，A2代表MACS分选细胞的CD44抗体染色组；
图4是电生理功能检测实验的结果图，其中4A为CD44阳性细胞视网膜电图，4B为CD44阴性细胞视网膜电图，4C为PBS组视网膜电图，4D为a波的振幅统计图，4E为b波的振幅统计图；
图5是免疫荧光检测CD44阳性的GFP细胞分化为感光细胞的效果图；
图6是CD44阳性细胞在免疫缺陷动物成瘤安全性评估的效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
在本发明中，术语“培养基”在本领域中是公认的并且一般指用于培养活细胞的任何物质或制剂。如用于提及细胞培养的术语“培养基”包括细胞周围环境的组分。培养基可为固体、液体、气体或相和材料的混合物。培养基包括液体生长培养基以及不维持细胞生长的液体培养基。培养基还包括凝胶状培养基，诸如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原蛋白基质。示例性气态培养基包括气相，在培养皿或其他固体或半固体支持物上生长的细胞暴露于该气相。术语“培养基”还指旨在用于细胞培养的材料，即使该材料尚未与细胞接触。换句话说，准备用于培养的富含营养的液体是培养基。术语“基础培养基”指促进不需要任何特殊营养补充剂的许多类型微生物生长的培养基。大多数基础培养基一般包含四种基本化学组：氨基酸、碳水化合物、无机盐和维生素。基础培养基一般用作更复杂培养基的基础，向其中添加补充剂，诸如血清或血清替代物、缓冲液、促生长因子、脂质浓缩物、硫代甘油等。在一方面中，生长培养基可为具有必需生长因子的复合培养基，以支持本发明细胞的生长和扩增，同时维持其自我更新能力。基础培养基的实施例包括但不限于Eagle基础培养基（BME）、最低必需培养基（MEM）、DuIbecco改良的Eagle培养基（DMEM）、培养基199、营养混合物HamsF10（F10）和HamsF12（F12）、McCoy’s 5A、DuIbecco’s MEM/F-12（DMEM/F12）、DMEM/F12-谷氨酰胺、RPMI 1640、Iscove改良的DuIbecco培养基（IMDM）、L-15培养基。谷氨酰胺包括但不限于L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。
在本发明中，培养基中的脂质浓缩物（Lipid）可以是本领域已知的任何种类的脂质浓缩物。示例性的脂质浓缩物包括以下一种或多种或全部：花生四烯酸、胆固醇、维生素E醋酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、十八烯酸、棕榈酸、棕榈油酸、Pluronic F-68、硬脂酸、吐温80和任选的乙醇。脂质浓缩物的浓度可选自0.1-5％、0.1-4.5％、0.1-4％、0.1-3.5％、0.1-3％、0.1-2.5％、0.1-2％、0.2-2％、0.3-2％、0.4-2％、0.5-2％；在本发明的具体实施例中，脂质浓缩物的浓度为1%。
在本发明中，培养基中的硫代甘油可以是本领域已知的任何种类的硫代甘油。示例性的硫代甘油包括以下一种或多种或全部：α-单硫代甘油、1-硫代甘油。硫代甘油的浓度可选自1-2000μM、1-1500μM、1-1000μM、100-1000μM、200-1000μM、300-1000μM、300-900μM、300-800μM、300-700μM、300-600μM、400-500μM；在本发明的具体实施例中，硫代甘油的浓度为450μM。
在本发明中，培养基中的血清替代物具有本领域技术人员公知的含义，其是指在维持未分化状态的情况下对多能干细胞进行培养的过程中，作为血清替代物而使用的组合物或调配物。也即，血清替代物能够支持胚胎干细胞或未分化多能干细胞的生长而无需补充血清。在某些示例性实施方案中，所述血清替代物包含：一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种微量金属元素。在一些情况下，血清替代物可以进一步包含一种或多种选自下列的成分：白蛋白、还原型谷胱甘肽、转铁蛋白、胰岛素等。血清替代物的非限制性实例包括但不限于KnockOutTM SR（简称为KOSR）、KOSR CTS、N2添加剂、CTS N2添加剂、B-27、PhysiologixTM XF SR、StemSureTM SerumSubstitute Supplement中的一种或多种。在本发明的具体实施例中，血清替代物包括KOSR CTS、CTS N2添加剂。
KOSR CTS的浓度可选自0.1-20％、0.1-15％、1-15％、2-14％、3-13％、4-12％、5-11％、5-10％；在本发明的具体实施例中，KOSR CTS的浓度为5%或10%。CTS N2添加剂的浓度可选自0.1-5％、0.1-4.5％、0.1-4％、0.1-3.5％、0.1-3％、0.1-2.5％、0.1-2％、0.2-2％、0.3-2％、0.4-2％、0.5-2％；在本发明的具体实施例中，CTS N2添加剂的浓度为1%。
在本发明中，培养基中的ROCK抑制剂可用于多能干细胞的培养和传代和/或胚胎干细胞的分化。因此，ROCK抑制剂可存在于胚胎干细胞或多能干细胞在其中生长、解离、形成聚集体或经历分化的任何细胞培养基中，例如粘附培养物或悬浮培养物。ROCK抑制剂的非限制性实例包括：HA-100、Y-27632、H-1152、Fasudil（也称为HA1077）、Y-30141（描述于美国专利5,478,838）、Wf-536、羟基-HA-1077、GSK269962A、SB-772077-B或其衍生物，以及针对ROCK的反义核酸、RNA干扰诱导核酸（例如，siRNA）、竞争性肽、拮抗剂肽、抑制性抗体、抗体-scFv片段、它们的显性阴性变体和表达载体。进一步地，由于已知其他小分子化合物为ROCK抑制剂，因此此类化合物或其衍生物也可用于实施方案中（例如，参考美国专利公开No.20050209261、20050192304、20040014755、20040002508、20040002507、20030125344和20030087919，以及国际专利公开No.2003/062227、2003/059913、2003/062225、2002/076976和2004/039796，其通过引用并入本文）。在本发明的某些方面，也可以使用该ROCK抑制剂中的一种或两种或更多种的组合。在本发明的具体实施例中，ROCK抑制剂为Y-27632。
Y-27632的浓度可选自1-100μM、1-90μM、1-80μM、1-70μM、1-60μM、1-50μM、1-40μM、1-30μM、5-30μM、10-30μM、15-25μM、16-24μM、17-23μM、18-22μM、19-21μM；在本发明的具体实施例中，Y-27632的浓度为20μM。
在本发明中，培养基中的TGF-β受体抑制剂可以包括一般性的TGF信号传导的任何抑制剂或对TGF-β受体有特异性的抑制剂，其可以包括：针对TGF-β受体的抗体、TGF-β受体的显性阴性变体，和抑制TGF-β受体的表达的siRNA和反义核酸。示例性TGF-β受体抑制剂包括但不限于：SB431542（参见，例如，Inman等人，2002）、被称为3-（6-甲基-2-吡啶基）-N-苯基-4-（4-喹啉基）-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺的A-83-01（参见，例如，Tojo等人，2005，可从例如Toicris Bioscience购得）、2-（3-（6-甲基吡啶-2-基）-1H-吡唑-4-基）-1，5-萘啶、Wnt3a/BIO（参见，例如，Dalton，等人，WO2008/094597，通过引用并入本文）、BMP4（参见，Dalton，见上文）、SMl6（参见，例如，Suzuki等人，2007）、IN-1130（3-（（5-（6-甲基吡啶-2-基）-4-（喹噁啉-6-基）-1H-咪唑-2-基）甲基）苯甲酰胺）（参见，例如，Kim等人，2008）、GW6604（2-苯基-4-（3-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-基）吡啶）（参见，例如，de Gouville等人，2006）、SB-505124（2-（5-苯并[1，3]二噁唑-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基）-6-甲基吡啶盐酸盐）（参见，例如，DaCosta等人，2004）和嘧啶衍生物（参见，例如，在Stiefl等人，WO2008/006583中列出的那些，其通过引用并入本文）。在本发明的具体实施例中，TGF-β受体抑制剂为BMP4。
BMP4的终浓度可选自0.1-5nM、0.1-4.5nM、0.1-4nM、0.1-3.5nM、0.1-3nM、0.1-2.5nM、0.1-2nM、0.3-2nM、0.6-2nM、0.8-2nM、1-2nM；在本发明的具体实施例中，BMP4的终浓度为1.5nM。
在本发明中，培养基中的GSK-3抑制剂包括但限于氯化锂、Hymenialdisine、夫拉平度（Flavopiridol）、坎帕罗酮、阿司特帕罗酮（Alsterpaullone）、氮杂坎帕罗酮（Azakenpaullone）、靛红-30-肟、6-溴靛红-30-肟（BIO）、6-溴靛红-30-丙酮肟、AloisineA、Aloisine B、TDZD8、化合物12、吡唑并吡啶18、吡唑并吡啶9、吡唑并吡啶34、CHIR98014、CHIR99021（CT99021）、CT20026、LY2090314、SU9516、ARA014418、星形孢菌素、GF109203x（双吲哚基马来酰亚胺I）、Ro318220（双吲哚基马来酰亚胺IX）、SB216763、SB415286、I5、CGP60474、TWS119、锂原子（与Mg2C竞争）、铍原子（与Mg2C和ATP竞争）和锌原子（非竞争性）。在本发明的具体实施例中，GSK-3抑制剂为CHIR99021。
CHIR99021的浓度可选自1-10μM、1-9μM、1-8μM、1-7μM、1-6μM、1-5μM、1-4μM、1.5-4μM、2-4μM；在本发明的具体实施例中，CHIR99021的浓度为3μM。
在本发明中，培养基中的FGFR抑制剂包括但不限于PD161570、PD173074、LY2874455、SU5402、FIN-2、AZD4547、BGJ398、Nintedanib或其组合。在本发明的具体实施例中，FGFR抑制剂为SU5402。
SU5402的浓度可选自1-20μM、1-15μM、1-10μM、1-9μM、1-8μM、1-7μM、1-6μM、2-6μM、3-6μM、4-6μM；在本发明的具体实施例中，CHIR99021的浓度为5μM。
在本发明中，培养基还包括牛磺酸和/或视黄酸应答性受体激活剂，其中，视黄酸应答性受体激活剂可以结合并激活视黄酸受体（retinoic acid receptor，RAR）和/或类视黄醇X受体（retinoid X receptor，RXR）的任何化合物，例如能够结合并激活RAR和RXR二者的化合物。用于本发明的合适的视黄酸应答性受体的激活剂是视黄酸，例如9-顺式视黄酸（9-cis-retinoic acid）和13-顺式视黄酸，或者其他视黄酸异构体，包括全反式视黄酸，7-顺式视黄酸和11-顺式视黄酸，或者视黄酸的类似物，例如TTNPB、AM580、retilloic酸或CBS-211A，或者类视黄醇。在本发明的具体实施例中，视黄酸应答性受体激活剂为视黄酸。
牛磺酸的浓度可选自1-200μM、1-150μM、1-140μM、1-130μM、1-120μM、1-110μM、10-110μM、20-110μM、30-110μM、40-110μM、50-110μM、60-110μM、70-110μM、80-110μM、90-110μM；在本发明的具体实施例中，牛磺酸的浓度为100μM。
视黄酸的浓度可选自0.1-5μM、0.1-4.5μM、0.1-4μM、0.1-3.5μM、0.1-3μM、0.1-2.5μM、0.1-2μM、0.1-1.5μM、0.1-1μM；在本发明的具体实施例中，视黄酸的浓度为0.5μM。
在本发明中，术语“多能干细胞”是指这样的干细胞，其能够在体外培养并且有能力分化为构成活体（除了胎盘以外）的任何细胞（三胚层（外胚层，中胚层，内胚层）-来源的组织）（多能性），并且胚胎干细胞（ES细胞）包括在多能干细胞中。“多能干细胞”获得自受精卵，克隆胚胎，再生性干细胞，和组织中的干细胞。在将若干种基因引入体细胞后具有与胚胎干细胞的分化多能性类似的人工分化多能性的细胞（也称为人工多能干细胞）也包括在多能干细胞中。多能干细胞可以通过本身已知的方法制备。制备方法的实例包括Cell，2007，131（5）pp.861-872和Cell，2006，126（4）pp.663-676中所述的方法。
在本发明中，“胚胎干细胞（ES细胞）”是指具有自身复制能力和多能性（multipotency）（特别地，“多能性”）的细胞，其是来源于早期胚胎的多能干细胞。胚胎干细胞首先于1981年被创建，并且自1989年起也已被应用于敲除小鼠的产生。在1998年，创建了人胚胎干细胞，其也被用于再生医学。
在本发明中，术语“视网膜组织”表示这样的视网膜组织，其中构成活体视网膜中的各个视网膜层的至少两种类型以上的细胞如光感受器，水平细胞，双极细胞，无长突细胞，视网膜神经节细胞，其前体细胞或其视网膜先祖细胞，在空间上被布置在多个层中。关于每种细胞，哪种细胞构成哪个视网膜层可以通过已知方法确认，例如，通过是否存在细胞标记物的表达或细胞标记物的表达水平等来确认。术语“前体细胞”在这里包括任何形式的增殖性和非增殖性细胞，如干细胞本身和能产生进一步分化的眼睛功能组织的祖细胞。在本发明中，这种前体细胞尤其包括视杆感光前体细胞。
在本申请中，术语“分选”通常是指将某种目标细胞（例如人视杆感光前体细胞）自混合物中分离出来的过程。其不必是100％分离，例如可以是混合物中40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或以上的目标细胞的分离；分离获得的目标细胞也不必是100％纯的，例如可以是基本纯的，例如可以是70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或以上细胞纯度。
在本发明中，术语“结合剂”包括结合抗原或靶蛋白或肽的任何天然存在的、合成的或基因工程化的剂，例如CD44蛋白。结合剂可以衍生自天然存在的抗体或者合成工程化的。结合蛋白或结合剂可以通过结合特定抗原而形成复合体并引发生物反应（例如，激动或拮抗特定的生物活 性）而发挥类似于抗体的功能。结合剂或结合蛋白可以包括分离的片段、 由抗体重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段、其中轻链和重链可变区通 过肽连接体连接的重组单链多肽分子（“scFv蛋白”）、和由模拟高变区的 氨基酸残基组成的最小识别单位。如本文使用的，术语结合剂还可以包括通过完整抗体修饰产生的或者使用重组DNA方法从头合成的抗体功能片段。在一些实施方案中，抗体是单链抗体，例如其中可变重链和可变轻链结合在一起（直接或通过肽连接体）形成连续多肽的单链Fv（scFv）抗体。单链Fv（scFv）多肽是共价连接的VH-VL异二聚体，其可以从包括直接结合或通过肽编码连接体结合的VH-和VL-编码序列的核酸表达（参见例如，Huston等人.（1988）Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85：5879-5883，其全部内容通过引用并入本文）。存在许多结构用于将来自抗体V区的天然聚合但化学分开的多肽轻链和多肽重链转化成scFv分子，其将折叠成基本类似于抗原结合位点结构的三维结构。参见例如，美国专利号5,091,513 和5,132,405和4,956,778。在一些实施方案中，如本文使用的术语结合剂还可以包括抗体、抗体功能片段、偶联抗体、探针、多肽。
在本发明中，术语“治疗”是指（1）防止易感或尚未显示病症的受试者出现症状或疾病；（2）抑制疾病或阻止其发展或复发；或（3）改善或导致疾病或病症消退。如本领域所理解的，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果（包括临床结果）的方法。出于本技术的目的，有益的或期望的结果可以包括但不限于减轻或改善一个或多个症状、病症（包括疾病）程度的减轻、病症（包括疾病）状态的稳定（即，不恶化），病症（包括疾病）的延迟或减缓、病症（包括疾病）、状态和缓解（无论是部分还是全部）的进展、改善或缓解，无论是否可检测。
在本发明中，所要治疗的视网膜疾病的实例包括视网膜色素变性、中心性脉络膜视网膜病、中心性脉络膜视网膜病、高血压性视网膜病、年龄相关性黄斑变性、动脉硬化性视网膜病、肾性视网膜病、糖尿病性视网膜病、视网膜动脉阻断、视网膜静脉闭塞、视网膜剥离、黄斑水肿、早产儿视网膜病、贫血性视网膜病变、白血病性视网膜病、外伤导致的视网膜/脉络膜病症、视神经炎、乳头视网膜炎、眼内视神经炎、视神经视网膜炎、蛛网膜炎、脊髓炎、视神经萎缩（包括视神经萎缩相关疾病（如Leber遗传性视神经病变（包括Lever病）、缺血性视神经病、原发性视神经炎、青光眼性视神经病、视神经外伤等）、眼新血管形成（例如脉络膜新血管形成和视网膜新血管形成），或其它眼底疾病。视网膜色素变性是指一组遗传性视网膜疾病，其中视网膜存在损伤。视网膜色素变性是一种视网膜营养不良，其中视杆细胞、视锥细胞和/或视网膜色素上皮（RPE，紧靠视网膜外面并附着于脉络膜的色素层）的异常导致进行性视力丧失。
实施例1 获得人胚胎干细胞来源的视网膜组织
1、培养基
培养基Ⅰ：IMDM，45%；HamsF12（F12），45%；脂质浓缩物（Lipid），1%；α-单硫代甘油（α-Monothioglycerol）、1-硫代甘油（1-Thioglycerol），450μM；KOSR CTS，5%；Y-27632，20μM。20% O2。
培养基Ⅱ：IMDM，45%；F12，45%；Lipid，1%；α-Monothioglycerol、1-Thioglycerol，450μM；KOSR CTS，5%；Y-27632，20μM，第6天加入BMP4终浓度为1.5nM，每隔3天半量换液。20%O2。
培养基Ⅲ为：DMEM/F12-谷氨酰胺（DMEM/F12-glutamax），99%；CTS N2添加剂（CTSN2 Supplement）；3μM CHIR99021；5μM SU5402。20% O2。
培养基Ⅳ为：DMEM/F12-glutamax，89%；KOSR CTS，10%；CTS N2 Supplement，1%；视黄酸（RA），0.5μM；牛磺酸（Taurine），100μM。40% O2。
培养基Ⅴ为：DMEM/F12-glutamax，89%；KOSR CTS，10%；CTS N2 Supplement，1%；Taurine，100μM。40% O2。
2、实验方法
（1）当人胚胎干细胞（hESCs）H9细胞或者人诱导多能干细胞（iPSCs）融合度达到80%-85%时消化细胞；移除原ES培养液，用DPBS（无Ca2+、Mg2+）洗涤一次临床级hESC细胞后加入Tryple CTS消化液，1ml/孔，37℃消化ES细胞4min，镜下观察ES细胞为分散状态即可；移除Tryple CTS消化液，用培养基Ⅰ将ES细胞重悬后转移至15ml离心管中，100g，离心2min后弃上清；
（2）用1ml培养基Ⅰ重悬细胞沉淀后，台盼蓝染色计数细胞活力，满足细胞活力在90%以上时进行3D培养；调整细胞密度为1×106cells/ml，充分混匀后3D接种培养；接种细胞悬液至96孔“V”型孔板中，100μL/孔，标注3D培养相关信息，于37℃培养；
（3）3D培养至第6天，更换为包含终浓度为1.5nM BMP4因子的培养基为Ⅱ，之后每3天半量更换一次培养基为Ⅱ，直到第18天；
（4）3D培养第18天，将96孔“V”型孔板中形成的类视网膜组织用一次性巴氏管吸出，转移至15ml离心管中，吸出培养液，用培养基Ⅲ洗涤一次类视网膜组织；用10ml培养基Ⅲ重悬类视网膜组织，并转移至直径10cm低粘附度培养皿中，继续诱导分化7天；
（5）3D培养第24天，更换培养基为培养基Ⅳ，每3天更换一次培养基；直至培养到第60天；第60天更换为培养基Ⅴ，每3天更换一次，依据时间点选择拟胚体进行相关实验。
3、实验结果
结果如图1所示，结果显示成功培养出类视网膜组织。
实施例2 获得多能干细胞来源的人视杆感光前体细胞
1、实验方法
使用CD44和OTX2免疫荧光双标染色和DAPI免疫荧光染色检测在16W（16周）胚胎期视网膜中的CD44阳性细胞和在分化60天的类视网膜组织中的CD44阳性细胞。
将实施例1获得的类视网膜组织分化90天后，用2mg/ml胶原酶/木瓜蛋白酶消化后，将细胞悬浮液与APC藕连的CD44抗体（Thermo, USA）在4°C下孵育20分钟。洗涤后，将细胞与抗APC微珠（Miltenyi Biotec, Germany）在4°C下孵育15分钟。最后洗涤后，用MS MACS®柱（Miltenyi Biotec, Germany）对细胞进行磁分离。随后，富集CD44阳性细胞，并将CD44阳性细胞从磁场中去除，重悬于PBS中，调节至1×108个细胞/ml。使用流式检测CD44阳性细胞。
2、实验结果
免疫荧光染色检测结果如图2所示，结果显示，在16W胚胎期视网膜内，CD44阳性细胞主要分布于感光前体细胞所在的外核层，并且与OTX2共表达分布；在分化60天的类视网膜组织内也检测到了CD44阳性细胞，且与OTX2共表达；表明可使用细胞分选策略从60天的类视网膜组织内分选CD44阳性的感光前体细胞。
流式检测结果如图3所示，结果显示类视网膜组织中分选出了CD44阳性细胞，且细胞阳性率高99.9%，纯度高。
实施例3 人视杆感光前体细胞移植后对动物视功能的影响
1、实验方法
1）电生理功能检测实验（ERG）：细胞或PBS的视网膜下移植在rd10小鼠中在P14（生后14天）进行。小鼠的一只眼睛移植了2 μl的CD44阳性PPC细胞（CD44+PPCs）、CD44阴性细胞（CD44-细胞）或PBS（细胞浓度为1×108个细胞/ml），以及妥布霉素和地塞米松眼膏应用于手术眼，持续7天。所有动物均口服环孢菌素A（210 mg/l，Selleck，USA）溶解在饮用水中 移植前48h至术后4W。每周进行一次电生理功能检测，移植后20W取材，进行切片观察细胞分布情况。
在ERG测定之前，rd10小鼠被暗适应12h。rd10小鼠通过皮下注射甲苯噻嗪（15mg/kg）和氯胺酮（110mg/kg）麻醉，用盐酸奥布卡因滴眼液麻醉，用1%托吡卡胺扩瞳，并将动物放在保温垫上以防止体温过低。将活性金电极放置在眼角膜上作为记录电极。参考电极和接地电极分别皮下放置在头部和尾部的额中部区域。以0.5 log（cd·s/m2）的密度进行光刺激。使用RETI端口设备（Roland Consult）记录和处理a波和b波的振幅。
2）免疫荧光染色检测感光细胞
从实施例1中获得的分化60天的类视网膜组织中分选出CD44阳性的GFP细胞，进行rd10小鼠视网膜下腔移植，16W后进行组织取材固定。同时使用感光细胞标记物视紫红质（rhodopsin）和DAPI染色，进行免疫荧光检测。
2、实验结果
电生理功能检测实验结果如图4所示，结果显示，与CD44阴性组和PBS相比较，CD44阳性细胞组的视网膜电生理功能显著改善，且长达16W时间。
免疫荧光检测实验如图5所示，结果显示，外核层可见GFP阳性的细胞，同时表达感光细胞标记物视紫红质，表明CD44阳性细胞移植入视网膜下腔后可分化为成熟的感光细胞，重建视觉通路。
实施例4 裸鼠成瘤实验
1、实验方法
选用8周龄雄性NOG Mice免疫缺陷小鼠，背部皮下注射1×106个/mL的细胞悬液（hESCs组和CD44+hPPCs组），随后进行持续观察，并记录1个月后裸鼠成瘤情况。
2、实验结果
结果如图6所示，结果显示，hESCs组可显著成畸胎瘤，而类视网膜组织内的CD44+hPPCs组均未成瘤，表明本发明制备的人视杆感光前体细胞在体内应用的安全性高。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (4)
1.一种制备视杆感光前体细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1）使用培养基对胚胎干细胞或多能干细胞进行诱导分化，获得类视网膜组织；
2）处理步骤1）中所述的类视网膜组织，获得视杆感光前体细胞；
1）中所述的培养基包括培养基Ⅰ、培养基Ⅱ、培养基Ⅲ、培养基Ⅳ和培养基Ⅴ，具体包括以下步骤：
a）将胚胎干细胞或多能干细胞置于所述的培养基Ⅰ中诱导分化培养；
b）将步骤a）获得的细胞转入所述的培养基Ⅱ中继续分化培养；
c）将步骤b）获得的类视网膜组织转入所述的培养基Ⅲ中诱导分化培养；
d）将步骤c）获得的类视网膜组织转入所述的培养基Ⅳ中分化培养；
e）将步骤d）获得的类视网膜组织转入所述的培养基Ⅴ中继续分化培养；
所述培养基Ⅰ包括IMDM、F12、脂质浓缩物、硫代甘油、KOSR CTS和Y-27632；
所述培养基Ⅱ包括IMDM、F12、脂质浓缩物、硫代甘油、KOSR CTS、Y-27632和BMP4；
所述培养基Ⅲ包括DMEM/F12-谷氨酰胺、CTS N2补充剂、CHIR99021和SU5402；
所述培养基Ⅳ包括DMEM/F12-谷氨酰胺、KOSR CTS、CTS N2补充剂、视黄酸和牛磺酸；
所述培养基Ⅴ包括DMEM/F12-谷氨酰胺、KOSR CTS、CTS N2补充剂和牛磺酸；
2）中处理的方法包括将所述的类视网膜组织消化为细胞悬浮液，在细胞悬浮液中分选视杆感光前体细胞；
所述分选的方法包括使用特异性结合CD44蛋白的结合剂分选视杆感光前体细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫代甘油包括α-单硫代甘油、1-硫代甘油中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a）的具体步骤包括：使用培养基Ⅰ重悬分散状态的胚胎干细胞或多能干细胞，重悬沉淀后进行3D培养，培养至第6天；
所述的步骤b）具体步骤包括：更换为包含BMP4的培养基Ⅱ继续培养步骤a）获得的细胞，每3天半量更换一次培养基Ⅱ，直到第18天；
所述的步骤c）具体步骤包括：使用培养基Ⅲ洗涤步骤b）获得的类视网膜组织，更换为培养基Ⅲ重悬所述的类视网膜组织，继续诱导分化7天；
所述的步骤d）具体步骤包括：更换为培养基Ⅳ培养步骤c）获得的类视网膜组织，每3天更换一次培养基Ⅳ，直到第60天；
所述的步骤e）具体步骤包括：更换为培养基Ⅴ培养步骤d）获得的类视网膜组织，每3天更换一次培养基Ⅴ。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结合剂包括特异性结合CD44蛋白的抗体、抗体功能片段、偶联抗体、探针或多肽。
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