JP2024050597A - 免疫改変された多能性細胞から分化させた細胞 - Google Patents

免疫改変された多能性細胞から分化させた細胞 Download PDF

Info

Publication number
JP2024050597A
JP2024050597A JP2024001947A JP2024001947A JP2024050597A JP 2024050597 A JP2024050597 A JP 2024050597A JP 2024001947 A JP2024001947 A JP 2024001947A JP 2024001947 A JP2024001947 A JP 2024001947A JP 2024050597 A JP2024050597 A JP 2024050597A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
gene
cells
cell
hypoimmune
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2024001947A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2024050597A5 (ja
Inventor
シュレプファー ソニヤ
デュース トバイアス
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of JP2024050597A publication Critical patent/JP2024050597A/ja
Publication of JP2024050597A5 publication Critical patent/JP2024050597A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/36—Skin; Hair; Nails; Sebaceous glands; Cerumen; Epidermis; Epithelial cells; Keratinocytes; Langerhans cells; Ectodermal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/04—Artificial tears; Irrigation solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C12N9/1211—Thymidine kinase (2.7.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/235—Leukemia inhibitory factor [LIF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/602—Sox-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/603—Oct-3/4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/604—Klf-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/606—Transcription factors c-Myc
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/608—Lin28
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

【課題】普遍的に許容可能な「容易に入手可能である」低免疫原性多能性細胞及びその分化した心臓、内皮、神経、膵島又は網膜色素細胞を提供する。【解決手段】細胞は、免疫応答を惹起する主要免疫抗原を欠き、食作用性のエンドサイトーシスを回避するために改変されており、例えば、内在性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性が低下しているか又は排除されており、内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が低下しているか又は排除されており、ＣＤ４７発現が上昇している。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本願は、全てその全体において本明細書中で参照により組み込まれる、２０１８年７月
１７日に提出の米国仮特許出願第６２／６９８，９６５号明細書、２０１８年７月１７日
に提出の同第６２／６９８，９７３号明細書、２０１８年７月１７日に提出の同第６２／
６９８，９７８号明細書、２０１８年７月１７日に提出の同第６２／６９８，９８１号明
細書及び２０１８年７月１７日に提出の同第６２／６９８，９８４号明細書の優先権を主
張する。
再生細胞療法は、損傷臓器及び組織を再生させるための重要で有望な処置である。移植
用の臓器は入手が困難であり、待機時間が長いことから、当然のことだが、容易に入手可
能な細胞株を患者に移植することによって組織を再生可能であることは好ましい。再生細
胞療法は、動物モデル（例えば心筋梗塞後）での移植後に障害組織を回復させるための有
望な最初の結果を示した。しかし、移植レシピエントの免疫系が同種物質を拒絶する傾向
があることにより、治療の潜在的効果が大きく低下し、このような処置の周囲の起こり得
るプラス効果が低下する。
従って、本発明は、普遍的に許容可能な「容易に入手可能である」低免疫原性多能性細
胞及びその分化した心臓、内皮、神経、膵島又は網膜色素細胞を提供する。このような低
免疫細胞が、それを必要とする患者を処置するために使用される。これらの細胞は、免疫
応答を惹起する主要免疫抗原を欠き、食作用性のエンドサイトーシスを回避するように改
変される。
再生細胞療法は、損傷臓器及び組織を再生させるための重要で有望な治療である。移植
用の臓器は入手が困難であり、待機時間が長いことから、当然のことだが、容易に入手可
能な細胞株を患者に移植することによって組織を再生可能であることは好ましい。再生細
胞療法は、動物モデル（例えば心筋梗塞後）での移植後に障害組織を回復させるための有
望な最初の結果を示した。しかし、移植レシピエントの免疫系が同種物質を拒絶する傾向
があることにより、治療の潜在的効果が大きく低下し、このような処置の周囲の起こり得
るプラス効果が低下する。
自己誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は理論的に患者特異的な細胞に基づく臓器修復スト
ラテジーのための無限の細胞供給源を構成する。しかし、それらの作製は、技術及び製造
の面で困難な点があり、何らかの急性処置モダリティーを概念的に妨げる冗長な工程であ
る。同種ｉＰＳＣに基づく治療法は、製造の観点からより容易であり、十分にスクリーニ
ングされ、標準化された高品質の細胞生成物の作製を可能にする。しかし、それらが同種
起源であるため、このような細胞生成物は拒絶される。細胞の抗原性の低下又は排除によ
り、普遍的に許容可能な細胞生成物が作製され得る。多能性幹細胞は３つ胚葉のあらゆる
細胞タイプに分化し得るので、幹細胞療法の適用の可能性は幅広い。移植部位の臓器環境
で分化及び成熟を継続する祖先細胞を移植することによって、エクスビボ又はインビボで
分化が行われ得る。エクスビボ分化によって、研究者又は医師が手順を密に監視すること
が可能になり、細胞の適正な集団が移植前に作製されることが確実になる。
しかし、殆どの場合、臨床移植療法において、未分化多能性幹細胞は、それらが奇形腫
を形成する傾向ゆえに回避される。むしろ、このような治療法は、分化した細胞（例えば
心不全に罹患している患者の心筋に移植する幹細胞由来心筋細胞）を使用する傾向がある
。このような多能性細胞又は組織の臨床適用は、それらの移植後の細胞の増殖及び生存を
制御する「安全機能」から利益を得る。
本技術は、疾患又は欠損細胞を再生させるか又は置き換えるために使用される細胞を作
製することが可能な幹細胞を追求する。迅速に増殖し、多くの可能な細胞タイプに分化す
るので、多能性幹細胞（ＰＳＣ）が使用され得る。
今まで、ＰＳＣに基づくアプローチの前臨床での成功は、免疫抑制又は免疫欠損モデル
でのみ、又は細胞が封入され、宿主の免疫系から保護される場合にのみ、達成されている
。しかし、同種臓器移植で使用されるような全身的な免疫抑制は、再生アプローチに正当
なものではない。免疫抑制薬は、重い副作用があり、感染及び悪性腫瘍のリスクを顕著に
上昇させる。
当技術分野において、再生医学で使用され得る、低免疫原性多能性幹細胞から作製され
る細胞が求められている。
いくつかの態様では、低免疫多能性幹細胞（ＨＩＰ細胞）から分化した、単離された改
変低免疫心臓、内皮、神経、膵島又は網膜色素細胞が本明細書中で提供される。ＨＩＰ細
胞は、例えば、内在性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性が低下しているか又
は排除されており、内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が低
下しているか又は排除されており、ＣＤ４７発現が上昇している。
一部の実施形態では、ＨＩＰ細胞はヒト改変誘導多能性幹細胞（ヒト改変ｉＰＳＣ）で
あり、Ｂ２Ｍ遺伝子はヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、ＣＩＩＴＡ遺伝子はヒトＢ２Ｍ遺伝子で
あり、ＣＤ４７発現上昇は、プロモーターの制御下でヒトＣＤ４７遺伝子の少なくとも１
コピーを細胞に導入した結果である。ある一定の実施形態では、ＨＩＰは、マウス改変誘
導多能性幹細胞（マウス改変ｉＰＳＣ）であり、Ｂ２Ｍ遺伝子はマウスＢ２Ｍ遺伝子であ
り、ＣＩＩＴＡ遺伝子はマウスＢ２Ｍ遺伝子であり、ＣＤ４７発現上昇は、プロモーター
の制御下でマウスＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを細胞に導入した結果である。一
部の例では、Ｂ２Ｍ遺伝子活性の排除は、Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルを破壊するクラスター
化された規則的配置の短回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ
Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）（Ｃ
ＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９反応の結果である。一部の例では、ＣＩＩＴＡ遺伝子活性の排除
は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルを破壊するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９反応の結果である。
一部の実施形態では、本方法は、ＨＩＰ細胞を死に誘導するトリガー物質により活性化
される自殺遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、自殺遺伝子は単純ヘルペスウイル
スチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であり、トリガー物質はガンシクロビルであ
る。一部の例では、ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列
同一性を含むタンパク質をコードする。他の例では、ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子は、配列番号４
のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。
他の実施形態では、自殺遺伝子はエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子であり、トリガー物質は５－フルオロシトシ
ン（５－ＦＣ）である。一部の例では、ＣＤ遺伝子は、配列番号５に対して少なくとも９
０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする。他の例では、ＣＤ遺伝子は、配列番号
５のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。
他の実施形態では、自殺遺伝子は誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードし、トリガー
物質は二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である。一部の例では、誘導型カスパーゼ９タンパク
質は、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。他の例では、誘導型カ
スパーゼ９タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。一部の例では、ＣＩＤは化
合物ＡＰ１９０３である。
一部の実施形態では、単離低免疫心臓細胞は、心筋細胞、結節心筋細胞、伝導性心筋細
胞、作業心筋細胞、心筋細胞前駆体、心筋細胞祖先細胞、心臓幹細胞及び心臓筋肉細胞か
らなる群から選択される。
一部の態様では、心臓状態又は疾患に罹患している患者を処置する方法が本明細書中で
提供される。本方法は、治療的有効量の、本明細書中に記載の単離された改変低免疫心臓
細胞の何れか１つの集団を含む組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、本組
成物は、治療的に有効な担体をさらに含む。
一部の実施形態では、投与は、患者の心臓組織への移植、静脈内注射、動脈内注射、冠
動脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、心筋内注射、経心内膜注射、経心外膜注射又は点
滴を含む。
一部の実施形態では、心臓状態又は疾患は、小児心筋症、加齢性心筋症、拡張型心筋症
、肥大型心筋症、拘束型心筋症、慢性虚血性心筋症、周産期心筋症、炎症性心筋症、他の
心筋症、心筋炎、心筋虚血性再灌流障害、心室機能不全、心不全、うっ血性心不全、冠動
脈疾患、末期心疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血、高血圧、再狭窄、狭心症、リウマ
チ性心臓、動脈炎又は循環器疾患からなる群から選択される。
一部の態様では、インビトロ分化により低免疫多能性細胞（ＨＩＰ細胞）集団から低免
疫心臓細胞集団を作製する方法が本明細書中で提供され、ＨＩＰ細胞において、内在性β
－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（
ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇している。本方法は、（ａ）Ｇ
ＳＫ阻害剤を含む培地中でＨＩＰ細胞集団を培養し；（ｂ）前駆心臓細胞集団を作製する
ために、ＷＮＴアンタゴニスを含む培地中でＨＩＰ細胞集団を培養し；（ｃ）低免疫心臓
細胞集団を作製するために、インスリンを含む培地中で前駆心臓細胞集団を培養すること
を含む。
一部の実施形態では、ＧＳＫ阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体又はその変
異体である。一部の例では、ＧＳＫ阻害剤は、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である
。一部の実施形態では、ＷＮＴアンタゴニスは、ＩＷＲ１、その誘導体又はその変異体で
ある。一部の例では、ＷＮＴアンタゴニスは、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である
。
一部の実施形態では、本方法は、ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を
含む培地中で段階（ｃ）の前駆心臓細胞集団を培養することをさらに含み、自殺遺伝子が
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子である場合、トリガー物
質はガンシクロビルであるか、自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、トリガー物質は５－フ
ルオロシトシン（５－ＦＣ）であるか、又は自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質
をコードする場合、トリガー物質は二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である。ある一定の実施
形態では、本方法は、ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で
段階（ｄ）の低免疫心臓細胞集団を培養することをさらに含み、自殺遺伝子が単純ヘルペ
スウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子である場合、トリガー物質はガンシ
クロビルであるか、自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、トリガー物質は５－フルオロシト
シン（５－ＦＣ）であるか、又は自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードす
る場合、トリガー物質は二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である。
一部の実施形態では、本方法は、非心臓細胞から低免疫心臓細胞集団を単離することを
さらに含む。他の実施形態では、本方法は、単離した低免疫心臓細胞集団を凍結保存する
ことをさらに含む。
一部の実施形態では、単離された改変低免疫内皮細胞は、毛細血管内皮細胞、血管内皮
細胞、大動脈内皮細胞、脳内皮細胞及び腎臓内皮細胞からなる群から選択される。
一部の態様では、血管状態又は疾患に罹患している患者を処置する方法が本明細書中で
提供される。一部の実施形態では、本方法は、単離された改変低免疫内皮細胞集団の治療
的有効量を含む組成物を投与することを含む。
本方法は、本明細書中に記載の単離された改変低免疫内皮細胞のうち何れか１つの集団
の治療的有効量を含む組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、本組成物は、
治療的に有効な担体をさらに含む。一部の実施形態では、投与は、患者の心臓組織への移
植、静脈内注射、動脈内注射、冠動脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、心筋内注射、経
心内膜注射、経心外膜注射又は点滴を含む。
一部の実施形態では、血管状態又は疾患は、血管損傷、循環器疾患、血管疾患、虚血性
疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、高血圧、虚血性組織損傷、虚血肢、脳卒中、神経障害
及び脳血管疾患からなる群から選択される。
一部の態様では、インビトロ分化によって低免疫原性多能性幹細胞（ＨＩＰ細胞）の集
団から低免疫内皮細胞集団を作製する方法が本明細書中で提供され、ＨＩＰ細胞において
、内在性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活
性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除されており、ＣＤ４７発現が上昇している。本
方法は、（ａ）ＧＳＫ阻害剤を含む第１の培地中でＨＩＰ細胞集団を培養し；（ｂ）前駆
内皮細胞集団を作製するために、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを含む第２の培地中でＨＩＰ細胞
集団を培養し；（ｃ）低免疫内皮細胞集団を作製するために、ＲＯＣＫ阻害剤及びＡＬＫ
阻害剤を含む第３の培地中で前駆内皮細胞集団を培養することを含む。
一部の実施形態では、ＧＳＫ阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体又はその変
異体である。一部の例では、ＧＳＫ阻害剤は約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。
一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２、その誘導体又はその変異体で
ある。一部の例では、ＲＯＣＫ阻害剤は約１μＭ～約２０μＭの範囲の濃度である。一部
の実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体又はその変異体であ
る。一部の例では、ＡＬＫ阻害剤は約０．５μＭ～約１０μＭの濃度範囲である。
一部の実施形態では、第１の培地は２μＭ～約１０μＭのＣＨＩＲ－９９０２１を含む
。一部の実施形態では、第２の培地は、５０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ及び１０ｎｇ／ｍＬ
ｂＦＧＦを含む。他の実施形態では、第２の培地はＹ－２７６３２及びＳＢ－４３１５４
２をさらに含む。様々な実施形態では、第３の培地は１０μＭ Ｙ－２７６３２及び１μ
Ｍ ＳＢ－４３１５４２を含む。ある一定の実施形態では、第３の培地はＶＥＧＦ及びｂ
ＦＧＦをさらに含む。特定の例では、第１の培地及び／又は第２の培地はインスリンを欠
く。
一部の実施形態では、本方法は、低免疫内皮細胞集団を非内皮細胞から単離することを
さらに含む。一部の実施形態では、本方法は、単離した低免疫内皮細胞集団を凍結保存す
ることをさらに含む。
一部の実施形態では、単離低免疫ドーパミン作動性ニューロンは、神経幹細胞、神経祖
先細胞、未熟ドーパミン作動性ニューロン及び成熟ドーパミン作動性ニューロンからなる
群から選択される。
一部の態様では、神経変性疾患又は状態に罹患している患者を処置する方法が本明細書
中で提供される。一部の実施形態では、本方法は、単離低免疫ドーパミン作動性ニューロ
ンの何れか１つの集団の治療的有効量を含む組成物を投与することを含む。一部の実施形
態では、本組成物は、治療的に有効な担体をさらに含む。一部の実施形態では、単離低免
疫ドーパミン作動性ニューロンの集団は生体分解性足場上にある。投与は移植又は注入を
含み得る。一部の実施形態では、神経変性疾患又は状態は、パーキンソン病、ハンチント
ン病及び多発性硬化症からなる群から選択される。
一部の態様では、インビトロ分化によって低免疫誘導多能性幹細胞（ＨＩＰ細胞）集団
から低免疫ドーパミン作動性ニューロン集団を作製する方法が本明細書中で提供され、Ｈ
ＩＰ細胞において、内在性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラ
スＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇し
ている。一部の実施形態では、本方法は、（ａ）未熟ドーパミン作動性ニューロンの集団
を作製するために、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ｆ
ＧＦ８、ＷＮＴ１、レチノイン酸、ＧＳＫ３β阻害剤、ＡＬＫ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤
からなる群から選択される１つ以上の因子を含む第１の培地中でＨＩＰ細胞集団を培養し
；（ｂ）ドーパミン作動性ニューロン集団を作製するために、第１の培地とは異なる第２
の培地中で未熟ドーパミン作動性ニューロン集団を培養することを含む。
一部の実施形態では、ＧＳＫβ阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体又はその
変異体である。一部の例では、ＧＳＫβ阻害剤は、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度で
ある。一部の実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体又はその
変異体である。一部の例では、ＡＬＫ阻害剤は、約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度であ
る。一部の実施形態では、第１の培地及び／又は第２の培地は動物血清を欠く。
一部の実施形態では、本方法は、ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を
含む培地中で段階（ａ）の未熟ドーパミン作動性ニューロン集団を培養することをさらに
含み、自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であ
る場合、トリガー物質はガンシクロビルであるか、自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、ト
リガー物質は５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）であるか、又は自殺遺伝子が誘導型カス
パーゼ９タンパク質をコードする場合、トリガー物質は二量体誘導化合物（ＣＩＤ）であ
る。
一部の実施形態では、本方法は、非ドーパミン作動性ニューロンから低免疫ドーパミン
作動性ニューロン集団を単離することも含む。
一部の実施形態では、単離低免疫膵島細胞は、膵島祖先細胞、未熟膵島細胞及び成熟膵
島細胞からなる群から選択される。
一部の態様では、糖尿病に罹患している患者を処置する方法が本明細書中で提供される
。本方法は、本明細書中に記載の単離低免疫膵島細胞の何れか１つの集団の治療的有効量
を含む組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、本組成物は、治療的に有効な
担体をさらに含む。一部の実施形態では、単離低免疫膵島細胞集団は生体分解性足場上に
ある。一部の例では、投与は移植又は注入を含む。
一部の態様では、インビトロ分化により低免疫多能性細胞（ＨＩＰ細胞）の集団から低
免疫膵島細胞集団を作製する方法が本明細書中で提供され、ＨＩＰ細胞において、内在性
β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子
（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇している。本方法は、（ａ）
未熟膵島細胞集団を作製するために、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、トランスフォー
ミング増殖因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）及び血管内皮胞増殖因子（
ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦβ）スーパーファミリー、骨形
成タンパク質－２（ＢＭＰ２）、骨形成タンパク質－７（ＢＭＰ７）、ＧＳＫ３β阻害剤
、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ１型受容体阻害剤及びレチノイン酸からなる群から選択される１
つ以上の因子を含む第１の培地中でＨＩＰ細胞集団を培養し；（ｂ）低免疫膵島細胞集団
を作製するために、第１の培地とは異なる第２の培地中で未熟膵島細胞集団を培養するこ
とを含む。
一部の実施形態では、ＧＳＫ阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体又はその変
異体である。一部の例では、ＧＳＫ阻害剤は、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である
。一部の実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体又はその変異
体である。一部の例では、ＡＬＫ阻害剤は、約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。
一部の実施形態では、第１の培地及び／又は第２の培地は動物血清を欠く。
一部の実施形態では、本方法は、ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を
含む培地中で段階（ａ）の未熟膵島細胞集団を培養することをさらに含み、自殺遺伝子が
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子である場合、トリガー物
質はガンシクロビルであるか、自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、トリガー物質は５－フ
ルオロシトシン（５－ＦＣ）であるか、又は自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質
をコードする場合、トリガー物質は二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である。
特定の実施形態では、本方法は、ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を
含む培地中で段階（ｂ）の膵島細胞集団を培養することをさらに含み、自殺遺伝子が単純
ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子である場合、トリガー物質は
ガンシクロビルであるか、自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、トリガー物質は５－フルオ
ロシトシン（５－ＦＣ）であるか、又は自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコ
ードする場合、トリガー物質は二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である。
一部の実施形態では、本方法は、非膵島細胞から低免疫膵島細胞集団を単離することも
含む。一部の実施形態では、本方法は、単離した低免疫膵島細胞集団を凍結保存すること
をさらに含む。
一部の実施形態では、単離低免疫ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ祖先細胞、未熟ＲＰＥ細胞、成
熟ＲＰＥ細胞及び機能的ＲＰＥ細胞からなる群から選択される。
一部の態様では、眼科状態に罹患している患者を処置する方法が本明細書中で提供され
る。本方法は、本明細書中に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞集団の何れか１つの集団の治療
的有効量を含む組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、本組成物は、治療的
に有効な担体をさらに含む。一部の実施形態では、単離低免疫ＲＰＥ細胞集団は生体分解
性足場上にある。一部の実施形態では、投与は、患者の網膜への移植又は注入を含む。一
部の実施形態では、眼科状態は、滲出型黄斑変性、萎縮型黄斑変性、若年性黄斑変性、レ
ーバー先天黒内障、網膜色素変性症及び網膜剥離からなる群から選択される。
一部の態様では、インビトロ分化により低免疫多能性細胞（ＨＩＰ細胞）集団から低免
疫網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞集団を作製する方法が本明細書中で提供され、ＨＩＰ細胞
において、内在性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩト
ランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇している。
本方法は、（ａ）前駆ＲＰＥ細胞集団を作製するために、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、ＢＭ
Ｐ４／７、ＤＫＫ１、ＩＧＦ１、ノギン、ＢＭＰ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤
及びＶＥＧＦＲ阻害剤からなる群から選択される因子の何れか１つを含む第１の培地中で
ＨＩＰ細胞集団を培養し；（ｂ）低免疫ＲＰＥ細胞集団を作製するために、第１の培地と
は異なる第２の培地中で前駆ＲＰＥ細胞集団を培養することを含む。
一部の実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体又はその変異
体である。一部の例では、ＡＬＫ阻害剤は、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。
一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２、その誘導体又はその変異体で
ある。一部の例では、ＲＯＣＫ阻害剤は、約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。
一部の実施形態では、第１の培地及び／又は第２の培地は動物血清を欠く。
一部の実施形態では、本方法は、ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を
含む培地中で段階（ａ）の前駆ＲＰＥ細胞集団を培養することをさらに含み、自殺遺伝子
が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子である場合、トリガー
物質はガンシクロビルであるか、自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、トリガー物質は５－
フルオロシトシン（５－ＦＣ）であるか、又は自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク
質をコードする場合、トリガー物質は二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である。
一部の実施形態では、本方法は、ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を
含む培地中で段階（ｂ）のＰＲＥ細胞集団を培養することをさらに含み、自殺遺伝子が単
純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子である場合、トリガー物質
はガンシクロビルであるか、自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、トリガー物質は５－フル
オロシトシン（５－ＦＣ）であるか、又は自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質を
コードする場合、トリガー物質は二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である。
一部の実施形態では、本方法は、非ＲＰＥ細胞から低免疫ＲＰＥ細胞集団を単離するこ
とをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、単離した低免疫ＲＰＥ細胞集団を凍結
保存することをさらに含む。
図１は、マウスＮＫ細胞（およそ９５％ＮＫ細胞及び５％マクロファージ）と温置したマウスＢ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣのＥｌｉｓｐｏｔの結果を示す。 図２は、ヒトＮＫ細胞（およそ９５％ＮＫ細胞及び５％マクロファージ）と温置したヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣのＥｌｉｓｐｏｔの結果を示す。 図３は、ヒトＮＫ細胞（およそ９５％ＮＫ細胞及び５％マクロファージ）と温置したマウスＢ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣのＥｌｉｓｐｏｔの結果を示す。 図４は、マウスＮＫ細胞（およそ９５％ＮＫ細胞及び５％マクロファージ）と温置したヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣのＥｌｉｓｐｏｔの結果を示す。 図５は、ヒトマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼ標識ヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。 図６は、マウスマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼ標識マウスＢ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。 図７は、マウスマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼ標識ヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。 図８は、ヒトマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼ標識マウスＢ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。 図９は、分化方法のダイアグラムを提供する。 図１０は、分化開始直前にマトリゲル（商標）上で培養したヒトｉＰＳＣを示す（１００ｘ拡大率）。 図１１は、培地交換前の分化第２日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。 図１２は、培地交換前の分化第３日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。 図１３は、培地交換前の分化第５日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。 図１４は、培地交換前の分化第７日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。 図１５は、培地交換前の分化第９日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。 ＨＩＰ－ＣＭ細胞を分化させ、ｒｔＰＣＲにより示されるように濃縮した。 図１７は、移植後２８日にｈｉＣＭが拒絶されず、他の臓器に移動しなかったことを示す。 図１８は、心筋梗塞２８日後のレシピエント心臓の組織病理学及びトリクローム染色を示す。ｈｉＣＭの同種レシピエントにおける梗塞サイズが顕著に縮小し、左心室のサイズも顕著に縮小した。 図１９Ａは、左心室パラメーターの顕著な改善を表す詳細なＰＶ－ｌｏｏｐ分析を示す。 図１９Ｂは、駆出率（ＥＦ、拡張期の最後のその心室中の血液の体積に対する、拍あたりの心室から駆出される血液体積の比）及び１回拍出量（ＳＶ、１回の収縮において心室により駆出される血液の体積）により測定した場合に、ｈｉＣＭが心臓機能を回復させたことを示す。 図１９Ｃは、心室１回仕事係数（ＳＷ、大動脈への１回拍出量を駆出するために左心室により行われる仕事）及び心臓出力（ＣＯ、単位時間に心室により汲み出される血液量）により測定した場合に、ｈｉＣＭが心臓機能を回復させたことを示す。 図２０は、野生型又はＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＣＭが同種ヒト化マウスに筋肉内移植された分析の結果を示す。 図２１は、低免疫ｈｉＣＭ細胞も心筋梗塞後の移植後に生存したことを示す。 図２２は、分割前のＭＥＦ上のマウス低ＩＰＳＣコロニーを示す（１００ｘ拡大率）。 図２３は、分化開始直前のゼラチン上のＥＳＣマウス低ＩＰＳＣを示す（１００ｘ拡大率）。 図２４は、５μＭ ＣＨＩＲから２μＭ ＣＨＩＲに分化培地を交換する前の、分化第２日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。 図２５は、培地を交換する前の、ＥＣ分化第４日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。 図２６は、分化第７日のＥＣ細胞を示す（１００ｘ拡大率）。 図２７は、第１２及び１４日後及びＭＡＣＳ選別前の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。 図２８は、ｍｉＰＳＣ及びＨＩＰ細胞の両方からのＥＣ細胞が、ＶＥ－カドヘリン発現を含め、分化した遺伝子発現プロファイルを示し、親細胞はその発現プロファイルを示さなかったことを示すｒｔＰＣＲを示す。 図２９は、後肢虚血マウスモデルに移植された野生型及び低免疫誘導内皮細胞の生体発光分析を示す（Ａ．フェモラリス（大腿輪、Ａ．ｆｅｍｏｒａｌｉｓ）の除去後）。全動物のＢＬＩ値をプロットした。Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇの移植片が全て生き残った一方で、非常に免疫原性が高いｗｔ ｍＥＣは１５日以内に拒絶され、経時的なＢＬＩシグナル低下を示した。 ＮＫ細胞殺傷時のＣｄ４７過剰発現の阻害効果を評価した。Ｂ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－ｍｉＰＳＣ又はＢ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｍｉＰＳＣ由来のｍｉＥＣを用いて、ＮＫ細胞でのＩＦＮ－γ Ｅｌｉｓｐｏｔを行った。Ｂ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－ｍｉＰＳＣからの派生物のみがＮＫ細胞殺傷に感受性があった。 図３１は、Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＰＳＣが対応するｈｉＥＣ派生物に首尾よく分化したことを示す。ｒｔＰＣＲは、全派生物が多能性遺伝子発現を失ったことを示す。 野生型又はＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＥＣ移植片を同種ヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスに注入した。５日後にＩＦＮ－γ Ｅｌｉｓｐｏｔを行った。低免疫細胞はＩＦＮ－γ応答を誘発しなかったが、野生型は誘発した。
Ａ．導入
本発明は、低免疫原性多能性（ＨＩＰ）細胞由来の（から分化した）心臓細胞の作製及
び最終的にはそれを必要とする患者への移植を提供する。
ＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書に記載のように、低免疫原性多能性（ＨＩＰ）
細胞は、免疫反応を惹起し得る主要免疫抗原を欠き、食作用を回避するように改変される
。これにより、特異的な組織及び臓器を生成させるための「容易に入手可能な」細胞生成
物の誘導が可能になる。ヒト患者においてヒト同種ＨＩＰ細胞派生物を使用可能であるこ
との利点により、一般に同種移植で見られる長期の補助免疫抑制療法及び薬物使用を回避
することができるようになることを含め、顕著な有益性が得られる。細胞療法は、各患者
に対する個々の処置を必要とせずに使用し得るので、コストも顕著に削減される。
自己細胞供給源から作製される細胞生成物は、数個又は１個の単一の抗原性突然変異で
さえも免疫拒絶に対する対象になり得ることが示されている。従って、自己細胞生成物は
、本質的に非免疫原性ではない。また、細胞操作及び品質管理は非常に労力及びコストが
かかるので、自己細胞は、急性処置の選択肢に対しては容易に利用可能となり得ない。従
って、様々なヒト疾患を処置するために使用するための、普遍的に許容可能な多くのタイ
プの細胞に分化し得るＨＩＰ細胞などの普遍的な細胞供給源が当技術分野で必要とされる
。
本願は、それらの全体において本開示が参照により本明細書中に組み込まれる２０１８
年１月１４日提出の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書及び２０１７年１
月１３日提出の米国仮特許出願第６２／４４５，９６９号明細書に関連し、特に実施例、
図面、図面の説明及び低免疫原性多能性幹細胞を作製すること及び他の細胞タイプへこの
ような細胞を分化させることについての説明に関する。
Ｂ．定義
「多能性細胞」という用語は、未分化状態に留まりながら自己更新及び増殖し得、適正
な条件下で特別な細胞タイプに分化するように誘導され得る細胞を指す。「多能性細胞」
という用語は、本明細書中で使用される場合、胚性幹細胞及び、胎児、羊膜又は体細胞の
幹細胞を含め、他のタイプの幹細胞を包含する。代表的なヒト幹細胞株はＨ９ヒト胚性幹
細胞株を含む。さらなる代表的な幹細胞株は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ
ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇ
ｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｈｏｗａｒｄ Ｈｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔ
ｉｔｕｔｅ ＨＵＥＳ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（その全体において本明細書中で参照によ
り組み込まれるＣｏｗａｎ，Ｃ．Ａ．ｅｔ．ａｌ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ
．３５０：１３．（２００４）に記載のとおり）を通じて利用可能にされるものを含む。
「多能性幹細胞」は、本明細書中で使用される場合、３つの胚葉：内胚葉（例えば胃関
連、消化管、肺など）、中胚葉（例えば筋肉、骨、血液、泌尿生殖器組織など）又は外胚
葉（例えば表皮組織及び神経系組織）の何れかに分化する能力を有する。「多能性幹細胞
」という用語は、本明細書中で使用される場合、「誘導多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」
、非多能性細胞由来の多能性幹細胞のタイプも包含する。親細胞の例は、様々な手段によ
り多能性の未分化表現型を誘導するように初期化されている体細胞を含む。このような「
ｉＰＳ」又は「ｉＰＳＣ」細胞は、ある特定の制御遺伝子の発現を誘導することにより、
又はある特定のタンパク質の外因性適用により、作製され得る。ｉＰＳ細胞の誘導のため
の方法は当技術分野で公知であり、以下でさらに記載する（例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２７（１１）：２６６７－７４（２００９）；Ｈｕａｎｇ
ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（７）：７９５（２０
０８）；Ｗｏｌｔｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５８（７２３９）：７６６－
７７０（２００９）；及びＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８
：３８１－３８４（２００９）；これらのそれぞれはそれらの全体において本明細書中に
参照により組み込まれる）。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の作製を以下で概説する。本
明細書中で使用される場合、「ｈｉＰＳＣ」は、ヒト誘導多能性幹細胞であり、「ｍｉＰ
ＳＣ」はマウス誘導多能性幹細胞である。
「多能性幹細胞の特徴」は、他の細胞から多能性幹細胞を区別する細胞の特徴を指す。
適切な条件下で、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）の全てからの細胞系列と関連
する特徴をまとめて示す細胞タイプへの分化が起き得る子孫を生じさせる能力は、多能性
幹細胞の特徴である。分子マーカーのある特定の組み合わせの発現又は非発現も多能性幹
細胞の特徴である。例えば、ヒト多能性幹細胞は、少なくとも数個及び一部の実施形態で
は、次の非限定リスト：ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－
８１、ＴＲＡ－２－４９／６Ｅ、ＡＬＰ、Ｓｏｘ２、Ｅ－カドヘリン、ＵＴＦ－１、Ｏｃ
ｔ４、Ｒｅｘ１及びＮａｎｏｇからのマーカーの全てを発現する。多能性幹細胞に関連す
る細胞形態学も多能性幹細胞の特徴である。本明細書中で記載のように、細胞は、内胚葉
性の祖先細胞及び／又は肝細胞へと初期化されるという多能性を経る必要はない。
本明細書中で使用される場合、「多能性」又は「多能性細胞」は、限定数の他の特定の
細胞タイプを生じさせ得る細胞タイプを指す。例えば、誘導多能性細胞は、内胚葉性細胞
を形成可能である。さらに、多能性血液幹細胞は、リンパ球、単球、好中球などを含め、
血液細胞のいくつかのタイプにそれ自身分化し得る。
本明細書中で使用される場合、「少能性」という用語は、成体幹細胞が数種類の異なる
細胞タイプにしか分化する能力がないことを指す。例えば、リンパ系又は骨髄幹細胞は、
それぞれリンパ系又は骨髄系列の何れかの細胞を形成させることが可能である。
本明細書中で使用される場合、「単能性」という用語は、１つの細胞タイプを形成する
細胞の能力を意味する。例えば、精原幹細胞が形成可能であるのは精子細胞のみである。
本明細書中で使用される場合、「全能性」という用語は、細胞が生物全体を形成させる
能力を意味する。例えば哺乳動物において、全能性であるのは、接合体及び第１の卵割段
階の卵割球のみである。
本明細書中で使用される場合、「非多能性細胞」は、多能性細胞ではない哺乳動物細胞
を指す。このような細胞の例としては、分化した細胞並びに祖先細胞が挙げられる。分化
した細胞の例としては、骨髄、皮膚、骨格筋肉、脂肪組織及び末梢血液から選択される組
織からの細胞が挙げられるが限定されない。代表的な細胞タイプとしては、線維芽細胞、
肝細胞、筋芽細胞、ニューロン、骨芽細胞、破骨細胞及びＴ細胞が挙げられるが限定され
ない。誘導多能性細胞、内胚葉性祖先細胞及び肝細胞を作製するために使用される出発細
胞は非多能性細胞であり得る。
分化した細胞としては、多能性細胞、少能性細胞、単能性細胞、祖先細胞及び最終分化
した細胞が挙げられるが限定されない。特定の実施形態では、能力が低い細胞は、より強
力な細胞に対して「分化している」とみなされる。
「体細胞」は、生物の体を形成する細胞である。体細胞は、生物において、臓器、皮膚
、血液、骨及び結合組織を構成する細胞を含むが、生殖細胞は含まない。
細胞は、例えば、ヒト又は非ヒト哺乳動物由来であり得る。代表的な非ヒト哺乳動物と
しては、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ブタ
、ウマ、ウシ及び非ヒト霊長類が挙げられるが限定されない。一部の実施形態では、細胞
は、成人ヒト又は非ヒト哺乳動物由来である。一部の実施形態では、細胞は新生児ヒト、
成人又は非ヒト哺乳動物由来である。
本明細書中で使用される場合、「対象」又は「患者」という用語は、何らかの動物、例
えば家畜化された動物、動物園の動物又はヒトを指す。「対象」又は「患者」は、イヌ、
ネコ、鳥、家畜又はヒトのような哺乳動物であり得る。「対象」及び「患者」の具体例と
しては、肝臓、心臓、肺、腎臓、膵臓、脳、神経組織、血液、骨、骨髄などに関連する疾
患又は障害がある個体（特にヒト）が挙げられるが限定されない。
哺乳動物細胞は、ヒト又は非ヒト哺乳動物由来であり得る。代表的な非ヒト哺乳動物と
しては、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ブタ
、ウマ、ウシ及び非ヒト霊長類（例えばチンパンジー、マカク及び類人猿）が挙げられる
が限定されない。
「低免疫原性多能性細胞」、「低免疫多能性細胞」又は「ＨＩＰ細胞」は、本明細書中
で、その多能性の特徴を保持し、また同種宿主に移植したときに免疫学的拒絶応答の低下
が起こる多能性細胞を意味する。好ましい実施形態では、ＨＩＰ細胞は免疫応答を生じさ
せない。従って、「低免疫原性」又は「低免疫」は、本明細書中で概説されるように免疫
改変前の親（即ち「野生型」又は「ｗｔ」）細胞の免疫応答と比較した場合、免疫応答が
顕著に低下しているか又は排除されていることを指す。多くのケースで、ＨＩＰ細胞は、
免疫学的にサイレントであり、また多能性の可能性を保持する。ＨＩＰの特徴に対するア
ッセイを以下で概説する。
「ＨＬＡ」又は「ヒト白血球抗原」複合体は、ヒトにおいて主要組織適合遺伝子複合体
（ＭＨＣ）タンパク質をコードする遺伝子複合体である。ＨＬＡ複合体を構成するこれら
の細胞表面タンパク質は、抗原に対する免疫応答の制御に関与する。ヒトにおいて、２つ
のＭＨＣ、クラスＩ及びクラスＩＩ、「ＨＬＡ－Ｉ」及び「ＨＬＡ－ＩＩ」がある。ＨＬ
Ａ－Ｉは、細胞内部からペプチドを提示する３つのタンパク質、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ
及びＨＬＡ－Ｃを含み、ＨＬＡ－Ｉ複合体により提示される抗原は、キラーＴ細胞（ＣＤ
８＋Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞としても知られる）を引き付ける。ＨＬＡ－Ｉタンパク
質はβ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）と会合する。ＨＬＡ－ＩＩは、５つのタンパク質
、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＲを含み
、これらはＴリンパ球に対して細胞の外側から抗原を提示する。これはＣＤ４＋細胞（Ｔ
ヘルパー細胞としても知られる）を刺激する。遺伝子がヒト（ＨＬＡ）由来であるか又は
マウス（ＭＨＣ）由来であるかに依存するので、「ＭＨＣ」又は「ＨＬＡ」の何れかの使
用は限定することを意味しないことを理解されたい。従って、これは哺乳動物細胞に関す
るので、これらの用語は本明細書中で交換可能に使用され得る。
「遺伝子ノックアウト」は、本明細書中で、それが存在する宿主細胞において特定の遺
伝子を不活性にして、その結果、関心のあるタンパク質が産生されないか又は不活性形態
になるかの何れかになる工程を意味する。当業者により理解されるように、及び下でさら
に記載されるように、これは、遺伝子から核酸配列を除去するか又はその配列を他の配列
で妨害するか、読み枠を変更するか又は核酸の制御因子を変更することを含め、多くの様
々な方法により遂行され得る。例えば関心のある遺伝子のコード領域の全て又は一部を除
去し得るか、又は「ナンセンス」配列で置き換え得、プロモーターなどの制御配列の全て
又は一部を除去し得るか又は置き換え得、翻訳開始配列を除去し得るか又は置き換え得る
などである。
「遺伝子ノックイン」は、本明細書中で、宿主細胞に遺伝子機能を追加する工程を意味
する。これにより、コードされるタンパク質のレベル上昇が起こる。当業者により理解さ
れるように、これは、遺伝子の１つ以上のさらなるコピーを宿主細胞に付加するか又はタ
ンパク質発現を向上させる内在性遺伝子の制御因子を変化させることを含め、いくつかの
方法で遂行され得る。これは、プロモーターを修飾するか、異なるプロモーターを付加す
るか、エンハンサーを付加するか又は他の遺伝子発現配列を修飾することにより遂行され
得る。
「β－２ミクログロブリン」又は「β２Ｍ」又は「Ｂ２Ｍ」タンパク質は、以下で示さ
れるアミノ酸及び核酸配列を有するヒトβ２Ｍタンパク質を指し；このヒト遺伝子は受入
番号ＮＣ＿００００１５．１０：４４７１１４８７－４４７１８１５９を有する。
「ＣＤ４７タンパク質」タンパク質は、下で示されるアミノ酸及び核酸配列を有するヒ
トＣＤ４７タンパク質を指し；このヒト遺伝子は受入番号ＮＣ＿０００００３．１２：１
０８０４３０９４－１０８０９４２００を有する。
「ＣＩＩＴＡタンパク質」タンパク質は、下で示されるアミノ酸及び核酸配列を有する
ヒトＣＩＩＴＡタンパク質を指し；ヒト遺伝子は受入番号ＮＣ＿００００１６．１０：１
０８６６２０８－１０９４１５６２を有する。
細胞との関連での「野生型」は、天然で見出される細胞を意味する。しかし多能性幹細
胞との関連で、本明細書中で使用される場合、これは、多能性を生じさせる核酸変化を含
有し得るが、低免疫原性を達成するための本発明の遺伝子編集手順を経なかったｉＰＳＣ
も意味する。
「同系」は、本明細書中で、宿主生物の遺伝学的類似性又は同一性及び免疫学的適合性
がある細胞移植を指し；例えば免疫応答は生じない。
「同種」は、本明細書中で、免疫応答が生じる宿主生物及び細胞移植物の遺伝学的相違
を指す。
「Ｂ２Ｍ－／－」は、本明細書中で、二倍体細胞において両染色体でＢ２Ｍ遺伝子が不
活性化されていることを意味する。本明細書中で記載のように、これは様々な方法で行わ
れ得る。
「ＣＩＩＴＡ－／－」は、本明細書中で、二倍体細胞において両染色体でＣＩＩＴＡ遺
伝子が不活性化されていることを意味する。本明細書中で記載のように、これは様々な方
法で行われ得る。
「ＣＤ４７ｔｇ」（「導入遺伝子」を表す）又は「ＣＤ４７＋」）は本明細書中で、一
部の例ではＣＤ４７遺伝子の少なくとも１個のさらなるコピーを有することにより、宿主
細胞がＣＤ４７を発現することを意味する。
「Ｏｃｔポリペプチド」は、転写因子のオクタマーファミリーの天然のメンバー又は、
最も近縁な天然ファミリーメンバーと比較して類似の（少なくとも５０％、８０％又は９
０％活性以内）転写因子活性を維持するそれらの変異体又は、天然のファミリーメンバー
の少なくともＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドの何れかを指し、転写活性化ドメイ
ンをさらに含み得る。代表的なＯｃｔポリペプチドとしては、Ｏｃｔ－１、Ｏｃｔ－２、
Ｏｃｔ－３／４、Ｏｃｔ－６、Ｏｃｔ－７、Ｏｃｔ－８、Ｏｃｔ－９及びＯｃｔ－１１が
挙げられる。Ｏｃｔ３／４（本明細書中で「Ｏｃｔ４」と呼ぶ）は、ＰＯＵドメイン、Ｐ
ｉｔ－１、Ｏｃｔ－１、Ｏｃｔ－２及びｕｒｉｃ－８６で保存される１５０アミノ酸配列
、を含有する（その全体において参照により本明細書中に組み込まれる、Ｒｙａｎ，Ａ．
Ｋ．＆ Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ｇ．，Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ．１１：１２０７－１２２５
（１９９７）を参照）。一部の実施形態では、変異体は、天然のＯｃｔポリペプチドファ
ミリーメンバーと、例えば上記で列挙されるものなど又はＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ－
００２６９２．２（ヒトＯｃｔ４）又はＮＰ－０３８６６１．１（マウスＯｃｔ４）で列
挙されるものなどと比較して、それらの配列全体にわたり、少なくとも８５％、９０％又
は９５％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｏｃｔポリペプチド（例えばＯｃｔ３／４又は
Ｏｃｔ４）は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ又は他の動物由来であり得る。一般に
、操作される細胞の種と同じ種のタンパク質が使用される。Ｏｃｔポリペプチドは、非多
能性細胞において多能性を誘導するのを助け得る多能性因子であり得る。
「Ｋｌｆポリペプチド」は、Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子（Ｋｌｆ）のファミリーの天然のメ
ンバー、ショウジョウバエ胚パターン調節因子Ｋｒｕｐｐｅｌのものと同様のアミノ酸配
列を含有するジンクフィンガータンパク質又は、最も近縁な天然のファミリーメンバーと
比較して類似の（少なくとも５０％、８０％又は９０％活性以内）転写因子活性を維持す
る天然メンバーの変異体、又は天然のファミリーメンバーの少なくともＤＮＡ結合ドメイ
ンを含むポリペプチドの何れかを指し、転写活性化ドメインをさらに含み得る。（その全
体において本明細書中で参照により組み込まれる、Ｄａｎｇ，Ｄ．Ｔ．，Ｐｅｖｓｎｅｒ
，Ｊ．＆Ｙａｎｇ，Ｖ．Ｗ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３２：１１０３－１１２１（２００
０）を参照）。代表的なＫｌｆファミリーメンバーとしては、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌ
ｆ３、Ｋｌｆ－４、Ｋｌｆ５、Ｋｌｆ６、Ｋｌｆ７、Ｋｌｆ８、Ｋｌｆ９、Ｋｌｆ１０、
Ｋｌｆ１１、Ｋｌｆ１２、Ｋｌｆ１３、Ｋｌｆ１４、Ｋｌｆ１５、Ｋｌｆ１６及びＫｌｆ
１７が挙げられる。Ｋｌｆ２及びＫｌｆ－４は、マウスにおいてｉＰＳ細胞を作製可能な
因子であることが分かり、関連する遺伝子Ｋｌｆ１及びＫｌｆ５もそうであったが、効率
は低かった（その全体において本明細書中で参照により組み込まれる、Ｎａｋａｇａｗａ
，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：１０１－１０６（
２００７）参照）。一部の実施形態では、変異体は、天然のＫｌｆポリペプチドファミリ
ーメンバー、例えば上で列挙されるものなど又はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＸ１６０８
８（マウスＫｌｆ４）若しくはＣＡＸ１４９６２（ヒトＫｌｆ４）で列挙されるものなど
と比較して、それらの全配列にわたり少なくとも８５％、９０％又は９５％のアミノ酸配
列同一性を有する。Ｋｌｆポリペプチド（例えばＫｌｆ１、Ｋｌｆ４及びＫｌｆ５）は、
ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ又は他の動物由来であり得る。一般に、操作される細
胞の種と同じ種のタンパク質が使用される。Ｋｌｆポリペプチドは、多能性因子であり得
る。Ｋｌｆ４遺伝子又はポリペプチドの発現は、開始細胞又は開始細胞集団において多能
性の誘導を助け得る。
「Ｍｙｃポリペプチド」は、Ｍｙｃファミリーの天然メンバーの何れかを指す（例えば
その全体において本明細書中で参照により組み込まれるＡｄｈｉｋａｒｙ，Ｓ．＆Ｅｉｌ
ｅｒｓ，Ｍ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６：６３５－６４５（２
００５）を参照）。これは、最も近縁な天然のファミリーメンバーと比較した場合に類似
の（即ち少なくとも５０％、８０％又は９０％活性以内）転写因子活性を維持する変異体
も含む。これは、天然のファミリーメンバーの少なくともＤＮＡ結合ドメインを含むポリ
ペプチドをさらに含み、転写活性化ドメインをさらに含み得る。代表的なＭｙｃポリペプ
チドは、例えばｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ及びＬ－Ｍｙｃを含む。一部の実施形態では、変
異体は、天然のＭｙｃポリペプチドファミリーメンバー、例えば上で列挙されるものなど
、又はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ２５０１５（ヒトＭｙｃ）で列挙されるものなど、
と比較して、それらの全配列にわたり、少なくとも８５％、９０％又は９５％のアミノ酸
配列同一性を有する。Ｍｙｃポリペプチド（例えばｃ－Ｍｙｃ）は、ヒト、マウス、ラッ
ト、ウシ、ブタ又は他の動物由来であり得る。一般に、操作される細胞の種と同じ種のタ
ンパク質が使用される。Ｍｙｃポリペプチドは多能性因子であり得る。
「Ｓｏｘポリペプチド」は、ＳＲＹ関連ＨＭＧ－ｂｏｘ（Ｓｏｘ）転写因子の天然メン
バーの何れかを指し、最も近縁な天然のファミリーメンバーと比較した場合に類似の（即
ち少なくとも５０％、８０％又は９０％活性以内）転写因子活性を維持する高移動度群（
ＨＭＧ）ドメイン又はそれらの変異体の存在を特徴とする。これは、天然のファミリーメ
ンバーの少なくともＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドも含み、転写活性化ドメイン
をさらに含み得る（例えばその全体において本明細書中で参照により組み込まれるＤａｎ
ｇ，Ｄ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３２：
１１０３－１１２１（２０００）を参照）。代表的なＳｏｘポリペプチドとしては、例え
ばＳｏｘ１、Ｓｏｘ－２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ４、Ｓｏｘ５、Ｓｏｘ６、Ｓｏｘ７、Ｓｏｘ
８、Ｓｏｘ９、Ｓｏｘ１０、Ｓｏｘ１１、Ｓｏｘ１２、Ｓｏｘ１３、Ｓｏｘ１４、Ｓｏｘ
１５、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ１８、Ｓｏｘ－２１及びＳｏｘ３０が挙げられる。Ｓｏｘ１は
、Ｓｏｘ２と同様の効率でｉＰＳ細胞をもたらすことが示されており、遺伝子Ｓｏｘ３、
Ｓｏｘ１５及びＳｏｘ１８もｉＰＳ細胞を産生させることが示されているが、Ｓｏｘ２よ
りも幾分効率が低い（その全体において本明細書中で参照により組み込まれるＮａｋａｇ
ａｗａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：１０１－１
０６（２００７）を参照）。一部の実施形態では、変異体は、天然のＳｏｘポリペプチド
ファミリーメンバー、例えば上で列挙されるものなど又はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ
８３４３５（ヒトＳｏｘ２）に挙げられるものなどと比較して、それらの全配列にわたり
少なくとも８５％、９０％又は９５％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｓｏｘポリペプチ
ド（例えばＳｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５又はＳｏｘ１８）は、ヒト、マウ
ス、ラット、ウシ、ブタ又は他の動物由来であり得る。一般に、操作される細胞の種と同
じ種のタンパク質が使用される。Ｓｏｘポリペプチドは多能性因子であり得る。本明細書
中で論じるように、ＳＯＸ２タンパク質はｉＰＳＣの作製において特定の用途がある。
「分化した低免疫原性多能性細胞」又は「分化したＨＩＰ細胞」又は「ｄＨＩＰ細胞」
は、本明細書中で、低免疫原性を保持するように改変されているｉＰＳ細胞を意味し（例
えばＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡのノックアウト及びＣＤ４７のノックイン）、次に対象への最
終的な移植のための細胞タイプに分化させられる。従って、例えばＨＩＰ細胞は、肝細胞
（「ｄＨＩＰ肝細胞」）、ベータ様膵臓細胞又は膵島オルガノイド（「ｄＨＩＰベータ細
胞」）、内皮細胞（「ｄＨＩＰ内皮細胞」）などへと、分化させられ得る。
パーセント「同一性」という用語は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列という観点
で、以下に記載の配列比較アルゴリズム（例えばＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ又は当業
者にとって利用可能な他のアルゴリズム）の１つを使用して、又は目視検査によって測定
した場合、比較し、一致が最大となるように並べたとき、同じであるヌクレオチド又はア
ミノ酸残基が指定のパーセンテージとなる２つ以上の配列又はサブ配列を指す。適用に依
存して、パーセント「同一性」は、比較される配列の領域にわたり、例えば機能的ドメイ
ンにわたり存在し得るか又は、或いは、比較しようとする２つの配列の全長にわたり存在
し得る。配列比較の場合、一般的には１つの配列を、試験配列が比較される参照配列とす
る。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列をコンピューターに入力し
、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定
する。次に、配列比較アルゴリズムが、指定されるプログラムパラメーターに基づき、参
照配列に対する試験配列についてパーセント配列同一性を計算する。
比較のための配列の最適アライメントは、例えばＳｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，
Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによっ
て、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１
９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａ
ｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の
類似性方法（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｍｅｔｈｏｄ）に対する検索によって、これらのア
ルゴリズムのコンピュータライズドインプリメンテーション（ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ
ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ
，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．の、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦ
ＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）又は目視検査（一般にＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ
．，以下を参照）によって、遂行され得る。
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適切なアルゴリズムの一例はＢＬ
ＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うた
めのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じ
て公開されている。
「阻害剤」、「活性化因子」及び「修飾因子」は、生物学的関連分子の機能又は発現に
影響を及ぼす。「修飾因子」という用語は、阻害剤及び活性化因子の両方を含む。これら
は、標的分子の発現又は活性に対するインビトロ及びインビボアッセイを用いて同定され
得る。
「阻害剤」は、例えば発現を阻害するか又は標的分子又はタンパク質に結合する物質で
ある。これらは、部分的又は全体的に刺激を遮断し得るか又はプロテアーゼ阻害剤活性を
有し得る。これらは、記載される標的タンパク質の活性の不活性化、脱感作又は下方制御
を含め、活性化を軽減、低下、防止又は遅延させ得る。修飾因子は、標的分子又はタンパ
ク質のアンタゴニストであり得る。
「活性化因子」は、例えば標的分子又はタンパク質の機能又は発現を誘導又は活性化す
る物質である。これらは、結合して、標的分子活性を刺激し得るか、上昇させ得るか、開
き得るか、活性化し得るか、又は促進し得る。活性化因子は標的分子又はタンパク質のア
ゴニストであり得る。
「相同体」は、ヌクレオチド配列、ペプチド配列、機能又は構造レベルで参照分子と同
様である生理活性分子である。相同体は、参照配列とある一定のパーセント同一性を共有
する配列誘導体を含み得る。従って、一実施形態では、相同又は誘導体配列は、少なくと
も７０パーセントの配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同又は誘導体配列は
、少なくとも８０又は８５パーセントの配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相
同又は誘導体配列は、少なくとも９０パーセントの配列同一性を共有する。特定の実施形
態では、相同又は誘導体配列は、少なくとも９５パーセントの配列同一性を共有する。よ
り具体的な実施形態では、相同又は誘導体配列は、少なくとも５０、５５、６０、６５、
７０、７５、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９
６、９７、９８又は９９パーセントの配列同一性を共有する。相同又は誘導体核酸配列は
また、高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件下で参照核酸配列に結合し続けるそれ
らの能力によっても定められ得る。参照分子に対して構造又は機能的類似性を有する相同
体は、参照分子の化学誘導体であり得る。構造及び機能的相同体並びに誘導体について検
出し、作製し、スクリーニングする方法は当技術分野で公知である。
「ハイブリッド形成」は一般に、相補鎖がそれらの融解温度を下回る環境で存在すると
きに変性ＤＮＡが再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配
列との間の所望の相同性の度合いが高いほど、使用され得る相対温度は高くなる。結果と
して、より高い相対温度はよりストリンジェンシーの高い反応条件を作る傾向があり、一
方でより低い温度はストリンジェンシーがより低くなるということになる。ハイブリッド
形成反応のストリンジェンシーのさらなる詳細及び説明については、その全体において本
明細書中で参照により組み込まれるＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅ
ｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９５）を参照。
ハイブリッド形成反応の「ストリンジェンシー」は、当業者により容易に決定可能であ
り、一般にプローブの長さ、洗浄温度及び塩濃度に依存する経験的計算である。一般に、
正確なアニーリングのためには、プローブが長いほど高い温度が必要となり、一方でプロ
ーブが短いほど必要な温度は低くなる。
「ストリンジェントな条件」又は「高ストリンジェンシー条件」は、本明細書中で定義
される場合、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温、例えば５０℃で０．０１５Ｍ塩
化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを
使用するもの；（２）ハイブリッド形成中にホルムアミドなどの変性剤、例えば４２℃で
、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン
／Ｐｈ６．５の５０Ｍｍリン酸ナトリウム緩衝液、７５０Ｍｍ 塩化ナトリウム、７５Ｍ
ｍクエン酸ナトリウム入りの５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、を使用するもの；又は（３
）４２℃で、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍク
エン酸ナトリウム）、５０Ｍｍリン酸ナトリウム（Ｐｈ６．８）、０．１％ピロリン酸ナ
トリウム、５ｘデンハート溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｌ／ｍＬ）、０．１
％ＳＤＳ及び１０％硫酸デキストランを使用し、０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエ
ン酸ナトリウム）中で４２℃で１０分間洗浄し、続いて５５℃でＥＤＴＡ含有０．１ｘＳ
ＳＣからなる１０分間の高ストリンジェンシー洗浄を行う、溶液中での一晩のハイブリッ
ド形成により同定され得る。
本願全体を通じて与えられる全ての最大の数値制限は、全てのより低い数値制限が本明
細書中で明らかに書かれているかのように、全てのより低い数値制限を含むものとする。
本願全体を通じて与えられる全ての最小の数値制限は、全てのより高い数値制限が本明細
書中で明らかに書かれているかのように、全てのより高い数値制限を含むものとする。本
願全体を通じて与えられる全ての数値範囲は、全てのより狭い数値範囲が全て本明細書中
で明らかに書かれているかのように、このようなより広い数値範囲内に入る全てのより狭
い数値範囲を含む。
本明細書中で使用される場合、「修飾」という用語は、親分子から修飾された分子を物
理的に区別する変化を指す。一実施形態では、本明細書中に記載の方法に従い調製される
ＣＤ４７、ＨＳＶｔｋ、ＥＣ－ＣＤ又はｉＣａｓｐ９変異体ポリペプチド中のアミノ酸変
化は、野生型タンパク質、天然の突然変異体タンパク質又はこのような変異体ポリペプチ
ドの修飾を含まない別の改変タンパク質など、本明細書中に記載の方法に従い修飾されて
いない対応する親とそれを区別する。別の実施形態では、変異体ポリペプチドは、未修飾
ポリペプチドと変異体ポリペプチドの機能を区別する１つ以上の修飾を含む。例えば、変
異体ポリペプチド中のアミノ酸変化は、その受容体結合プロファイルに影響を及ぼす。他
の実施形態では、変異体ポリペプチドは、置換、欠失又は挿入修飾又はそれらの組み合わ
せを含む。別の実施形態では、変異体ポリペプチドは、未修飾ポリペプチドの親和性と比
較して、受容体に対してその親和性を向上させる１つ以上の修飾を含む。
一実施形態では、変異体ポリペプチドは、対応するネイティブ又は親配列と比較して、
１つ以上の置換、挿入又は欠失を含む。ある一定の実施形態では、変異体ポリペプチドは
、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３
０、３１～４０、４１～５０又は５１個以上の修飾を含む。
「エピソームベクター」は、本明細書中で、細胞の細胞質に存在し得、自律的に複製し
得る遺伝子ベクターを意味し；例えば、これは宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれない
。多くのエピソームベクターが当技術分野で公知であり、下で記載する。
遺伝子との関連での「ノックアウト」は、ノックアウトを有する宿主細胞が遺伝子の機
能的タンパク質産物を産生しないことを意味する。本明細書中で概説するように、ノック
アウトは、様々な方法で、コード配列の全て又は一部を除去し、機能的タンパク質が産生
されないように（短縮又はナンセンス配列の何れか）フレームシフト突然変異を導入し、
遺伝子が転写されないように調節因子（例えばプロモーター）を除去又は改変し、ｍＲＮ
Ａなどへの結合を通じて翻訳を妨害することによる結果であり得る。一般に、ノックアウ
トは、細胞の子孫も永久的にノックアウトを保有するようにゲノムＤＮＡレベルでもたら
される。
遺伝子の文脈において、「ノックイン」は、ノックインを有する宿主細胞が細胞におい
て活性のあるより機能的なタンパク質を有することを意味する。本明細書中で概説するよ
うに、ノックインは、様々な方法で、通常はタンパク質をコードする導入遺伝子（ｔｇ）
の少なくとも１コピーの細胞への導入により、行われ得るが、これはまた、調節コンポー
ネントを置き換えることによっても、例えば内在性遺伝子に構成的プロモーターを付加す
ることによって、行われ得る。一般に、ノックイン技術の結果、宿主細胞への導入遺伝子
のさらなるコピーの組み込みが起こる。
ＶＩＩ．低免疫原性多能性細胞
本発明は、マウス及びヒトＨＩＰ細胞を作製し、野生型細胞を用いて開始し、それらを
多能性にし（例えば誘導多能性幹細胞又はｉＰＳＣを作製）、次いでｉＰＳＣ集団からＨ
ＩＰ細胞を作製するための、組成物及び方法を提供する。
内在性Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルを不活性化する１つ以上の変化；内在性ＣＩＩＴＡ遺伝
子の両アレルを不活性化する１つ以上の変化；及びヒトＨＩＰ幹細胞においてＣＤ４７遺
伝子の発現上昇を引き超す１つ以上の変化を含む、低免疫原性多能性（ＨＩＰ）幹細胞が
本明細書中で提供され；ヒトＨＩＰ幹細胞は、前記Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの変化を含むが
前記ＣＤ４７遺伝子発現上昇を含まない誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）により発揮される
第２のＮＫ細胞応答よりも低い第１のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答をもたらし、第
１及び第２のＮＫ細胞応答は、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの変化を含むがＣＤ４７遺伝子発現
上昇を含まないヒトＨＩＰ又はｉＰＳＣの何れかとともにインビトロで温置されるＮＫ細
胞からのＩＦＮ－γレベルを決定することによって測定される。ＨＩＰ幹細胞はマウスＨ
ＩＰ幹細胞であり得る。一部の実施形態では、ＨＩＰ幹細胞はヒトＨＩＰ幹細胞である。
低免疫原性多能性細胞は、ＨＬＡ－Ｉ機能低下、ＨＬＡ－ＩＩ機能低下及びＮＫ細胞殺
傷に対する感受性の低下の結果として、対象への移植時に、より拒絶されにくくなり得る
。
一部の実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、β－２ミクログロブリンタンパク質発
現が低下しているか又はそれを欠く。好ましい実施形態では、β－２ミクログロブリンタ
ンパク質をコードする遺伝子が削除されるか又はノックアウトされる。より好ましい実施
形態では、β－２ミクログロブリンタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも９０％
（例えば９１％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％又は１００％）の配列同一性を有する。より好ましい実施形態では、β－２ミクロ
グロブリンタンパク質は配列番号１の配列を有する。
一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ａタンパク質発現の低下によりＨＬＡ－Ｉ機能が低下す
る。好ましい実施形態では、ＨＬＡ－Ａタンパク質をコードする遺伝子は削除又はノック
アウトされる。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｂタンパク質発現低下によってＨＬＡ－Ｉ
機能が低下する。好ましい実施形態では、ＨＬＡ－Ｂタンパク質をコードする遺伝子が削
除又はノックアウトされる。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｃタンパク質発現低下によっ
てＨＬＡ－Ｉ機能を低下させる。好ましい実施形態では、ＨＬＡ－Ｃタンパク質をコード
する遺伝子が削除又はノックアウトされる。別の実施形態では、低免疫原性多能性細胞は
ＨＬＡ－Ｉ機能を含まない。
一部の実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、ＣＩＩＴＡタンパク質発現が低下して
いるか又はそれを欠く。好ましい実施形態では、ＣＩＩＴＡタンパク質をコードする遺伝
子が削除又はノックアウトされる。より好ましい実施形態では、ＣＩＩＴＡタンパク質は
、配列番号２に対して少なくとも９０％（例えば９１％、９１％、９２％、９３％、９４
％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有する。よ
り好ましい実施形態では、ＣＩＩＴＡタンパク質は配列番号２の配列を有する。
一部の実施形態では、ＨＬＡ－ＤＰタンパク質発現の減少によりＨＬＡ－ＩＩ機能が低
下する。好ましい実施形態では、ＨＬＡ－ＤＰタンパク質をコードする遺伝子が削除又は
ノックアウトされる。一部の実施形態では、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質発現低下によりＨＬ
Ａ－ＩＩ機能が低下する。好ましい実施形態では、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質をコードする
遺伝子が削除又はノックアウトされる。一部の実施形態では、ＨＬＡ－ＤＱタンパク質発
現低下によりＨＬＡ－ＩＩ機能が低下する。好ましい実施形態では、ＨＬＡ－ＤＱタンパ
ク質をコードする遺伝子が削除又はノックアウトされる。本発明は、ＨＬＡ－ＩＩ機能を
含まない低免疫原性多能性細胞を提供する。
本発明は、マクロファージ食作用又はＮＫ細胞殺傷に対する感受性が低下した低免疫原
性多能性細胞を提供する。感受性の低下は、ＣＤ４７タンパク質の発現上昇により起こる
。一部の実施形態では、ＣＤ４７発現上昇は、内在性ＣＤ４７遺伝子遺伝子座に対する修
飾の結果である。他の実施形態では、ＣＤ４７発現上昇は、ＣＤ４７導入遺伝子によるも
のである。好ましい実施形態では、ＣＤ４７タンパク質は、配列番号３に対して少なくと
も９０％（例えば９１％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、
９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有する。より好ましい実施形態では、ＣＤ
４７タンパク質は配列番号３の配列を有する。
本方法の別の実施形態では、マクロファージ食作用に対する多能性細胞の感受性を低下
させるタンパク質の発現上昇は、内在性遺伝子遺伝子座に対する修飾の結果である。好ま
しい実施形態では、内在性遺伝子遺伝子座はＣＤ４７タンパク質をコードする。別の実施
形態では、タンパク質発現上昇は、導入遺伝子の発現の結果である。好ましい実施形態で
は、導入遺伝子はＣＤ４７タンパク質をコードする。より好ましい実施形態では、ＣＤ４
７タンパク質は、配列番号３に対して少なくとも９０％（例えば９１％、９１％、９２％
、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一
性を有する。より好ましい実施形態では、ＣＤ４７タンパク質は配列番号３の配列を有す
る。
一部の実施形態では、ＨＩＰ細胞におけるＣＤ４７タンパク質のレベルは、対応する多
能性幹細胞、例えば胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞でのレベルよりも高い。一部の例で
は、マウスＨＩＰ細胞でのマウスＣＤ４７タンパク質のレベルは、対応するマウス多能性
幹細胞でのレベルよりも高い（例えば少なくとも０．５倍高い、少なくとも１．０倍高い
、少なくとも１．５倍高い、少なくとも２倍高い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍
高い、少なくとも５倍高い、少なくとも６倍高い、少なくとも７倍高い、少なくとも８倍
高い、少なくとも８倍以上高い）。ある特定の例では、ヒトＨＩＰ細胞でのヒトＣＤ４７
タンパク質のレベルは、対応するヒト多能性幹細胞のレベルよりも高い（例えば少なくと
も０．５倍高い、少なくとも１．０倍高い、少なくとも１．５倍高い、少なくとも２倍高
い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い、少なくとも６倍高
い、少なくとも７倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも８倍以上高い）。
本方法の別の実施形態は、低免疫原性多能性又は分化した子孫細胞の死滅を引き起こす
トリガーにより活性化される自殺遺伝子を発現させることをさらに含む。好ましい実施形
態では、自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ－ｔｋ）
であり、トリガーはガンシクロビルである。より好ましい実施形態では、ＨＳＶ－ｔｋ遺
伝子は、配列番号４に対して少なくとも９０％（例えば９１％、９１％、９２％、９３％
、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有す
るタンパク質をコードする。より好ましい実施形態では、ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子は、配列番
号４の配列を有するタンパク質をコードする。
本方法の別の実施形態では、自殺遺伝子は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ遺伝子（ＥＣ－ＣＤ）であり、トリガーは５－フ
ルオロシトシン（５－ＦＣ）である。好ましい実施形態では、ＥＣ－ＣＤ遺伝子は、配列
番号５に対して少なくとも９０％（例えば９１％、９１％、９２％、９３％、９４％、９
５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有するタンパク質
をコードする。より好ましい実施形態では、ＥＣ－ＣＤ遺伝子は、配列番号５の配列を有
するタンパク質をコードする。
本方法の別の実施形態では、自殺遺伝子は誘導性カスパーゼタンパク質をコードし、ト
リガーは特異的な二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である。本方法の好ましい実施形態では、
本遺伝子は、配列番号６に対してなくとも９０％（例えば９１％、９１％、９２％、９３
％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を含
む誘導性カスパーゼタンパク質をコードする。より好ましい実施形態では、本遺伝子は、
配列番号６の配列を含む誘導性カスパーゼタンパク質をコードする。より好ましい実施形
態では、ＣＩＤはＡＰ１９０３である。
Ａ．遺伝子変化のための方法
本方法は、多能性細胞及びＨＩＰ細胞の両方を作製するために細胞内又は無細胞条件下
で核酸配列を修飾する方法を含む。代表的な技術としては、相同組み換え、ノックイン、
ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクター
ヌクレアーゼ）、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的配置の短回文配列リピート（
ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａ
ｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ））／Ｃａｓ９及び他の部位特異的なヌクレアーゼ
技術が挙げられる。これらの技術により、所望の遺伝子座部位での２本鎖ＤＮＡ破壊が可
能になる。これらの制御された２本鎖破壊は、特異的な遺伝子座部位で相同組み換えを促
進する。この工程は、配列を認識し結合するエンドヌクレアーゼでの、染色体など、核酸
分子の特異的な配列を標的とすることに焦点を当て、核酸分子での２本鎖破壊を誘導する
。２本鎖破壊は、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組み換え（ＨＲ）
の何れかにより修復される。
当業者により認められるように、本発明の多能性細胞を改変するために多くの様々な技
術を使用し得、本明細書中で概説するように低免疫原性になるようにｉＰＳＣを改変する
。
一般に、これらの技術は、個々に又は組み合わせて使用され得る。例えばＨＩＰ細胞の
作製において、ＣＤ４７の機能性をノックインするためのウイルス技術（例えばレンチウ
イルス）とともに、改変細胞での活性Ｂ２Ｍ及び／又はＣＩＩＴＡタンパク質の発現を低
下させるためにＣＲＩＳＰＲが使用され得る。また、当業者により認められるように、一
実施形態は、ＣＤ４７機能性をノックインするためのレンチウイルスの最終段階とともに
、Ｂ２ＭをノックアウトするためのＣＲＩＳＰＲ段階、続いてＣＩＩＴＡをノックアウト
するためのＣＲＩＳＰＲ段階を連続的に利用したが、これらの遺伝子は様々な技術を使用
して様々な順序で操作され得る。
下でより詳細に論じるように、初期化遺伝子の一過性発現は一般に多能性幹細胞を作製
／誘導するために行われる。
ａ．ＣＲＩＳＰＲ技術
一実施形態では、当技術分野で公知のように、クラスター化された規則的配置の短回文
配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓ
ｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）／Ｃａｓ（「ＣＲＩＳＰＲ」）技
術を使用して、細胞を操作する。開始ｉＰＳＣを作製するため又はｉＰＳＣからＨＩＰ細
胞を作製するために、ＣＲＩＳＰＲを使用し得る。ＣＲＩＳＰＲに基づく多数の技術があ
り、例えば参照により本明細書によって組み込まれるＤｏｕｄｎａ ａｎｄ Ｃｈａｒｐ
ｅｎｔｉｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２５８０
９６を参照。ＣＲＩＳＰＲ技術及びキットは市販されている。
ｂ．ＴＡＬＥＮ技術
一部の実施形態では、本発明のＨＩＰ細胞は、転写活性化因子様エフェクターヌクレア
ーゼ（ＴＡＬＥＮ）法を使用して作製される。ＴＡＬＥＮは、実際に何らかの所望のＤＮ
Ａ配列に結合し、切断するように改変され得るヌクレアーゼと組み合わせられた制限酵素
である。ＴＡＬＥＮキットは市販されている。
ｃ．ジンクフィンガー技術
一実施形態では、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ技術を使用して細胞を操作する。Ｚｎフ
ィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに
融合させることにより作製される人工的制限酵素である。ジンクフィンガードメインは特
異的な所望のＤＮＡ配列を標的とするために改変され得、これにより、ジンクフィンガー
ヌクレアーゼが複雑なゲノム内でユニークな配列を標的とすることが可能になる。内在性
ＤＮＡ修復機構の長所により、ＣＲＩＳＰＲ及びＴＡＬＥＮと同様に、より高等な生物の
ゲノムを適正に改変するためにこれらの試薬を使用し得る。
ｄ．ウイルスに基づく技術
レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びセン
ダイウイルスベクターの使用を含むが限定されない、本発明のＨＩＰ細胞を作製するため
に（並びにｉＰＳＣのオリジナル作製（ｏｒｉｇｉｎａｌ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）のた
め）使用し得る多岐にわたるウイルス技術がある。ｉＰＳＣの作製において使用されるエ
ピソームベクターを下で記載する。
ｅ．干渉ＲＮＡを使用した遺伝子の下方制御
他の実施形態では、ＨＬＡ分子で使用されるタンパク質をコードする遺伝子は、ＲＮＡ
ｉ技術により下方制御される。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、しばしば特異的なｍＲＮＡ分
子の分解を引き起こすことにより、ＲＮＡ分子が遺伝子発現を阻害する過程である。２つ
のタイプのＲＮＡ分子－マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮ
Ａ）－がＲＮＡ干渉の中心となる。これらは、標的ｍＲＮＡ分子に結合し、それらの活性
を上昇又は低下させる。ＲＮＡｉは、ウイルス及びトランスポゾン由来のものなどの寄生
性の核酸に対する細胞防御を助ける。ＲＮＡｉは発生にも影響を与える。
ｓｄＲＮＡ分子は、１９～２１塩基のガイド（アンチセンス）鎖を含む非対称ｓｉＲＮ
Ａのクラスである。これらは、５’ホスフェート、２’Ｏｍｅ又は２’Ｆ修飾ピリミジン
及び６個のホスホチオエートを３’位置に含有する。これらは、３’複合化ステロール部
分、２個のホスホチオエートを３’位置に、及び２’Ｏｍｅ修飾ピリミジンを含有するセ
ンス鎖も含有する。両鎖は、３を超えない長さの未修飾プリンの連続ストレッチとともに
２’Ｏｍｅプリンを含有する。ｓｄＲＮＡは、その全体において参照により本明細書中に
組み込まれる米国特許第８，７９６，４４３号明細書で開示される。
これらの技術の全てに対して、本明細書中で概説するように組み換え核酸を作製するた
めに周知の組み換え技術が使用される。ある一定の実施形態では、組み換え核酸（所望の
ポリペプチド、例えばＣＤ４７又は破壊配列の何れかをコードする）は、発現コンストラ
クト中で１つ以上の制御ヌクレオチド配列に操作可能に連結され得る。制御ヌクレオチド
配列は、一般に処置しようとする宿主細胞及び対象に適切である。様々な宿主細胞に対し
て、多くのタイプの適切な発現ベクター及び適切な調節配列が当技術分野で公知である。
一般的には、１つ以上の調節ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダー又
はシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列及
びエンハンサー又は活性化因子配列が挙げられ得るが限定されない。当技術分野で公知の
ような構成的又は誘導性プロモーターも企図される。プロモーターは、天然のプロモータ
ー又は複数のプロモーターのエレメントを組み合わせるハイブリッドプロモーターの何れ
かであり得る。発現コンストラクトは、プラスミドなど、エピソーム上で細胞中に存在し
得るか、又は発現コンストラクトは染色体に挿入され得る。特定の実施形態では、発現ベ
クターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために選択可能マーカー遺伝子を
含む。ある一定の実施形態は、少なくとも１個の調節配列に操作可能に連結される変異体
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。本明細書中での
使用のための調節配列は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメントを含
む。ある一定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換しようとする宿主細胞の選択、
発現させようと所望する特定の変異体ポリペプチド、ベクターのコピー数、そのコピー数
を制御するための能力又はベクターによりコードされる何らかの他のタンパク質、例えば
抗生物質マーカーなど、の発現のために設計される。
適切なプロモーターの例としては、例えば次の遺伝子からのプロモーター：ハムスター
のユビキチン／Ｓ２７ａプロモーター（国際公開第９７／１５６６４号パンフレット）、
サル空胞化ウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモ
ーター、マウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の末
端反復配列領域、マウス乳癌ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）、モロニーマウス白血病
ウイルス末端反復配列領域及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーター
が挙げられる。他の異種哺乳動物プロモーターの例は、アクチン、免疫グロブリン又は熱
ショックプロモーターである。一部の実施形態では、伸長因子１－アルファプロモーター
が使用される。
さらなる実施形態では、哺乳動物宿主細胞での使用のためのプロモーターは、ポリオー
マウイルス、鶏痘ウイルス（英国特許第２，２１１，５０４号明細書、１９８９年７月５
日公開）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロ
ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノム
から得られ得る。さらなる実施形態では、異種哺乳動物プロモーターが使用される。例と
しては、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター及び熱ショックプロモータ
ーが挙げられる。ＳＶ４０の初期及び後期プロモーターは、都合よく、ＳＶ４０ウイルス
複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として得られる。Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａ
ｔｕｒｅ ２７３：１１３－１２０（１９７８）。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プ
ロモーターは、都合よく、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として得られる。Ｇｒｅｅｎａｗａ
ｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８：３５５－３６０（１９８２）。前述の参考
文献はそれらの全体において参照により組み込まれる。
Ｂ．多能性細胞の作製
本発明は、多能性細胞から非免疫原性多能性細胞を作製する方法を提供する。従って、
第１段階は多能性幹細胞を提供することである。
マウス及びヒト多能性幹細胞（一般にｉＰＳＣと呼ばれ；マウス細胞の場合はｍｉＰＳ
Ｃ又はヒト細胞の場合はｈｉＰＳＣ）の作製は一般に当技術分野で公知である。当業者に
より認められるように、ｉＰＣＳの作製のために様々な異なる方法がある。４つの転写因
子、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ及びＫｌｆ４のウイルス導入を使用して、マウ
ス胚又は成体線維芽細胞から最初の誘導が行われた；その全体において、及び具体的には
文献中で概説される技術に対して、参照により本明細書によって組み込まれるＴａｋａｈ
ａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ Ｃｅｌｌ １２６：６６３－６７６（２００６）
を参照。そのときから、多くの方法が開発された；両者ともそれらの全体において、及び
特にｈｉＰＳＣを作製するための方法について、参照により本発明により明確に組み込ま
れる、概説に対するＳｅｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ
７（１）：１１６－１２５（２０１５）及びＬａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙ ａｎｄ Ｖｅｒ
ｍｕｒｉ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ：Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ２０１３を参照（例えば後者の参考文献の第３章を参
照）。
一般に、ｉＰＳＣは、通常はエピソームベクターを使用して導入される、宿主細胞中で
の１つ以上の「初期化因子」の一過性発現により作製される。これらの条件下で少量の細
胞がｉＰＳＣになるように誘導される（選択マーカーが使用されないので一般にこの段階
の効率は低い）。細胞が「初期化」され、多能性になると、これらはエピソームベクター
を失い、内在遺伝子を使用して因子を産生する。このエピソームベクターの喪失の結果、
「ゼロフットプリント（ｚｅｒｏ ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）」細胞と呼ばれる細胞が得られ
る。（特に宿主細胞のゲノムにおいて）遺伝子修飾が少ないほど良いのでこれは望ましい
。従って、得られるｈｉＰＳＣに永久的な遺伝子修飾がないことが好ましい。
また当業者により認識されるように、使用され得るか又は使用される多くの初期化因子
が変動し得る。一般に、より少ない初期化因子が使用される場合、多能性状態への細胞の
形質転換の効率が低下し、「多能性」も低下し、例えばより少ない初期化因子では、十分
に多能性ではないが、より少ない細胞タイプにのみ分化可能であり得る細胞が得られ得る
。
一部の実施形態では、１個の初期化因子、ＯＣＴ４が使用される。他の実施形態では、
２つの初期化因子、ＯＣＴ４及びＫＬＦ４が使用される。他の実施形態では、３つの初期
化因子、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４及びＳＯＸ２が使用される。他の実施形態では、４つの初期
化因子、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びｃ－Ｍｙｃが使用される。他の実施形態では
、ＳＯＫＭＮＬＴ；ＳＯＸ２、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＮＡＮＯ
Ｇ、ＬＩＮ２８及びＳＶ４０Ｌ Ｔ抗原から選択される、５、６又は７個の初期化因子が
使用され得る。
一般に、当技術分野で公知のもの及び市販のものなど、エピソームベクターにおいてこ
れらの初期化因子遺伝子が提供される。例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ／Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎは、ｈｉＰＳＣのゼロフットプリント（ｚｅｒｏ ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）作製
のためのセンダイウイルス初期化キットを販売しており、カタログ番号Ａ３４５４６を参
照。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒは、ＥＢＮＡに基づく系も販売しており、カタログ番号Ａ
１４７０３を参照。
さらに、利用可能な多くの市販ｈｉＰＳＣ株がある；例えばゼロフットプリント（ｚｅ
ｒｏ ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）、ウイルス組み込みのないヒトｉＰＳＣ細胞株であるＧｉｂ
ｃｏ（登録商標）エピソームｈｉＰＳＣ株、Ｋ１８９４５を参照（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅ
ｔ ａｌ．，２０１１、上出も参照）。
一般に、当技術分野で公知のように、ｉＰＳＣは、本明細書中で記載のように初期化因
子を一過性に発現させることにより、ＣＤ３４＋臍帯血細胞、線維芽細胞など、非多能性
細胞から作製される。
例えば、成功したｉＰＳＣはまた、初期化効率が低下するものの、Ｃ－Ｍｙｃを省略し
てＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４のみを使用して作製された。
一般に、ｉＰＳＣは、ＫＬＦ４、Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＥＳＲＲＢ、ＴＢ
Ｘ３、ｃ－Ｍｙｃ及びＴＣＬ１を含むある一定の因子の発現を特徴とする。本発明の目的
のためのこれらの因子の新しい発現又は発現上昇は、内在遺伝子座の誘導若しくは調整を
介し得るか又は導入遺伝子からの発現からのものであり得る。
例えば、マウスｉＰＳＣは、その全体において、及び具体的にはｍｉＰＳＣの作製のた
めの方法及び試薬に対して、参照により本明細書によって組み込まれるＤｉｅｃｋｅ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５，Ｊａｎ．２８；５：８０８１（ｄｏｉ：１０．
１０３８／ｓｒｅｐ０８０８１）の方法を使用して作製され得る。また、例えば全体にお
いて及び具体的には本明細書中で概説される方法に対して、参照により本明細書によって
組み込まれるＢｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１１ ６（４）
：１８２９３も参照。
一部の例では、細胞の多能性は、一般にＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書で示さ
れるように、又は本明細書中で概説されるように、及び実施例で分化反応を遂行すること
により、例えば初期化因子についてアッセイすることにより、本明細書中で概説されるよ
うに測定されるか又は確認される。
Ｃ．低免疫原性多能性細胞の作製
本発明は、本明細書中で定められるように、患者への低免疫原性細胞の作製、操作、増
殖及び移植を対象とする。多能性細胞からのＨＩＰ細胞の作製は３個という少ない遺伝子
変化により行われ、その結果、細胞活性の破壊が最小限となるが、細胞に対して免疫サイ
レンシングを与える。
本明細書中で論じられるように、一実施形態は、ＭＨＣＩ及びＩＩ（細胞がヒトである
場合はＨＬＡＩ及びＩＩ）のタンパク質活性の低下又は排除を利用する。これは、それら
の構成成分をコードする遺伝子を変化させることにより行われ得る。一実施形態では、遺
伝子のコード領域又は調節配列は、ＣＲＩＳＰＲを使用して破壊される。別の実施形態で
は、干渉ＲＮＡ技術を使用して、遺伝子翻訳を減少させる。第３の変化は、ＣＤ４７など
、マクロファージ食作用に対する感受性を調節する遺伝子における変化であり、これは一
般的にウイルス技術を使用した遺伝子の「ノックイン」である。
低免疫多能性細胞（ＨＩＰ細胞）のさらなる説明は、２０１８年１月１４日提出の国際
出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書及び２０１７年１月１３日提出の米国仮特
許出願第６２／４４５，９６９号明細書で見出され得、その全体におけるこれらの開示は
本明細書中で、参照により、特に実施例、図面、図面の説明及び低免疫原性多能性幹細胞
の作製及び他の細胞タイプへのこのような細胞の分化の説明が組み込まれる。
一部の例では、ＣＲＩＳＰＲは遺伝子修飾のために使用されており、細胞株の高効率編
集を可能にするＣａｓ９コンストラクトを含有するｈｉＰＳＣ細胞が使用され得；例えば
Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＨｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ Ｃａｓ９
ｉＰＳＣ細胞株、Ａ３３１２４を参照。
１．ＨＬＡ－Ｉ低下
本発明のＨＩＰ細胞は、ＭＨＣＩ機能（細胞がヒト細胞由来である場合はＨＬＡ Ｉ）
の低下を含む。
当業者により認められるように、機能の低下は、遺伝子から核酸配列を除去するか、配
列を他の配列で妨害するか、又は核酸の調節コンポーネントを変化させることを含め、多
くの方法において遂行され得る。例えば、関心のある遺伝子のコード領域の全て又は一部
を除去し得るか、又は「ナンセンス」配列で置換し得、フレームシフト突然変異を作製し
得、プロモーターなどの調節配列の全て又は一部を除去又は置換し得、翻訳開始配列を除
去又は置換し得るなどである。
当業者により認められるように、多能性細胞におけるＭＨＣＩ機能（細胞がヒト細胞で
ある場合はＨＬＡ Ｉ）の良好な低下は、当技術分野で公知の技術を使用して、及び下に
記載のように；例えば、ＨＬＡ複合体に結合する標識される抗体を使用したＦＡＣＳ技術
；例えばヒト主要組織適合ＨＬＡクラスＩ抗原のアルファ鎖に結合する市販のＨＬＡ－Ａ
、Ｂ、Ｃ抗体を使用して、測定され得る。
Ｂ２Ｍ変化
一実施形態では、多能性幹細胞、本明細書中で開示されるヒト配列、におけるＨＬＡ－
Ｉ活性の低下は、β－２ミクログロブリン遺伝子の発現を破壊することにより行われる。
この変化は一般に本明細書中で、遺伝子「ノックアウト」と呼び、本発明のＨＩＰ細胞に
おいて、これは宿主細胞において両アレル上で行われる。一般に、両破壊を行うための技
術は同じである。
特に有用な実施形態は、遺伝子を破壊するためにＣＲＩＳＰＲ技術を使用する。一部の
例では、遺伝子のコード領域に小さい欠失／挿入を導入するためにＣＲＩＳＰＲ技術が使
用され、機能的タンパク質が産生されないようになり、しばしば、フレームシフト突然変
異の結果、停止コドンが生じ、短縮された非機能的タンパク質が作製されるようになる。
従って、有用な技術は、マウスでのＢ２Ｍ遺伝子又はヒトでのＢ２Ｍ遺伝子のコード配
列を標的とするために設計されるＣＲＩＳＰＲ配列を使用することである。遺伝子編集後
、遺伝子移入したｉＰＳＣ培養物を単一細胞に解離させる。単一細胞をフルサイズのコロ
ニーになるように増殖させ、ＣＲＩＳＰＲ切断部位からの異常な配列の存在についてスク
リーニングすることによりＣＲＩＳＰＲ編集について試験する。両アレルで欠失があるク
ローンを拾う。このようなクローンは、ＰＣＲにより示されるようにＢ２Ｍを発現せず、
ＦＡＣＳ分析により示されるようにＨＬＡ－Ｉを発現しなかった（例えば実施例１及び６
参照）。
Ｂ２Ｍ遺伝子が不活性化されているか否かを試験するためのアッセイは公知であり、本
明細書中に記載されている。一実施形態では、本アッセイは、Ｂ２Ｍタンパク質に対する
抗体で探索する、細胞溶解物のウエスタンブロットである。別の実施形態では、リコンビ
ナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）又は逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ
）は、不活性変化の存在を確認する。
さらに、ＨＬＡ Ｉ複合体が細胞表面上で発現されないことを確認するために細胞を試
験し得る。これは、上で論じるような１つ以上のＨＬＡ細胞表面構成成分に対する抗体を
使用して、ＦＡＣＳ分析によりアッセイされ得る。
両アレルでＢ２Ｍ遺伝子を抑制しようとする場合、他のものでは不良な結果であったこ
とは注目すべきことである。例えばＧｏｒｎａｌｕｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｂｔ．３８６０）を参照。
２．ＨＬＡ－ＩＩ低下
ＨＬＡ Ｉの低下に加えて、本発明のＨＩＰ細胞は、ＭＨＣ ＩＩ機能（細胞がヒト由
来の場合はＨＬＡ ＩＩ）も欠く。
当業者により認められるように、機能の低下は、遺伝子からの核酸配列の除去、遺伝子
への核酸配列の付加、読み枠の破壊、配列を他の配列で妨害すること又は核酸の調節コン
ポーネントの変化を含む、多くの方法で遂行され得る。一実施形態では、関心のある遺伝
子のコード領域の全て又は一部を除去し得るか又は「ナンセンス」配列で置換し得る。別
の実施形態では、プロモーターなどの調節配列を除去又は置換し得、翻訳開始配列を除去
又は置換し得るなどである。
多能性細胞又はそれらの派生物におけるＭＨＣ ＩＩ機能（細胞がヒト由来の場合はＨ
ＬＡ ＩＩ）の低下の成功は、タンパク質に対する抗体を使用してウエスタンブロッティ
ング、ＦＡＣＳ技術、ＲＰＡ技術、ＲＴ－ＰＣＲ技術などの当技術分野で公知の技術を使
用して測定され得る。
ＣＩＩＴＡの変化
一実施形態では、ＨＬＡ－ＩＩ活性の低下は、多能性幹細胞においてＣＩＩＴＡ遺伝子
の発現を破壊することにより行われ、そのヒト配列は本明細書中で示す。この変化は一般
に、本明細書中で遺伝子「ノックアウト」と呼ばれ、本発明のＨＩＰ細胞において、宿主
細胞中の両アレル上で行われる。
ＣＩＩＴＡ遺伝子が不活性化されているか否かを試験するためのアッセイは公知であり
、本明細書中に記載される。一実施形態では、本アッセイは、ＣＩＩＴＡタンパク質に対
する抗体で探索する細胞溶解物のウエスタンブロットである。別の実施形態では、リコン
ビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）又は逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣ
Ｒ）は、不活性化する変化の存在を確認する。
さらに、ＨＬＡ ＩＩ複合体が細胞表面上で発現されないことを確認するために、本細
胞を試験し得る。再び、このアッセイは当技術分野で公知のように行われ（ＰＣＴ／ＵＳ
１８／１３６８８号明細書、例えばＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書の図２１参照
）、一般に、下で概説されるようなヒトＨＬＡクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ及び殆ど
のＤＱ抗原に結合する市販抗体に基づいて、ウエスタンブロット又はＦＡＣＳ分析の何れ
かを使用して行われる。
特に有用な実施形態は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を破壊するためにＣＲＩＳＰＲ技術を使用す
る。全てのＭＨＣ ＩＩ分子に対する必須の転写因子である、マウスにおけるＣｉｉｔａ
遺伝子又はヒトにおけるＣＩＩＴＡ遺伝子のコード配列を標的とするためにＣＲＩＳＰＲ
を設計した。遺伝子編集後、遺伝子移入したｉＰＳＣ培養物を単一細胞に解離させた。こ
れらをフルサイズのコロニーに増殖させ、ＣＲＩＳＰＲ切断部位からの異常な配列の存在
についてスクリーニングすることによりＣＲＩＳＰＲ編集の成功について試験した。欠失
のあるクローンは、ＰＣＲにより判定した場合、ＣＩＩＴＡを発現せず、ＦＡＣＳ分析に
より判定した場合、ＭＨＣ ＩＩ／ＨＬＡ－ＩＩを発現しなかった。
３．マクロファージ食作用及び／又はＮＫ細胞殺傷の低下
ＨＬＡ Ｉ及びＩＩ（又はＭＨＣ Ｉ及びＩＩ）の減少に加えて、一般的にはＢ２Ｍ及
びＣＩＩＴＡノックアウトを使用して、本発明のＨＩＰ細胞は、マクロファージ食作用及
びＮＫ細胞殺傷に対する感受性が低下している。得られたＨＩＰ細胞は、１つ以上のＣＤ
４７トランス遺伝子により、免疫マクロファージ及び自然経路を「回避する」。
ＨＩＰ細胞及びＨＩＰ細胞由来の細胞がＮＫ細胞殺傷及び／又はマクロファージ食作用
を逃れるか又は回避するための能力は、ＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書の図１４
Ａ～１４Ｃ及び３４Ａ～３４Ｃで示され、その内容、特に図面、図面の説明及び実施例が
本明細書中で参照により組み込まれる。例えば、図１４Ｂ～１４Ｃは、マウスＨＩＰ細胞
（例えばＢ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－ＣＤ４７トランスジェニックマウスｉＰＳＣ）が
ＮＫ細胞によるＣＤ１０７ａ発現の誘導ができず、従ってＮＫ細胞応答を惹起しなかった
ことを示す。さらに、このようなマウスＨＩＰ細胞がＮＫ細胞の活性化又はＩＦＮγの放
出を誘導しなかったことが示された。ＮＫ細胞をＨＩＰ細胞由来の分化細胞（内皮細胞、
平滑筋細胞及び心筋細胞など）と温置した場合、ＮＫ細胞応答は誘導されなかった（例え
ばＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書の図３４Ａ～３４Ｃ）を参照。
ＣＤ４７発現上昇
一部の実施形態では、マクロファージ食作用及びＮＫ細胞殺傷感受性の低下は、ＨＩＰ
細胞表面上でのＣＤ４７上昇によるものである。これは、「ノックイン」又はトランスジ
ェニック技術を使用して当業者により認められるように、いくつかの方法で行われる。一
部の例では、ＣＤ４７発現上昇は、１つ以上のＣＤ４７導入遺伝子によるものである。
従って、一部の実施形態では、ＣＤ４７遺伝子の１コピー以上をＨＩＰ細胞に誘導性又
は構成的プロモーターの制御下で付加するが、後者が好ましい。一部の実施形態では、レ
ンチウイルスコンストラクトが本明細書中で記載のように使用されるか、又は当技術分野
で公知である。ＣＤ４７遺伝子は、当技術分野で公知のような適切なプロモーターの制御
下で、宿主細胞のゲノムに組み込み得る。
Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＰＳＣからＨＩＰ細胞株を作製した。ブラストサイジ
ンマーカーを使用して、ＣＤ４７を発現するレンチウイルスベクターを含有する細胞を選
択した。ＣＤ４７遺伝子配列を合成し、ブラストサイジン耐性があるプラスミドレンチウ
イルスｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５にＤＮＡをクローニングした（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）。
一部の実施形態では、内在性ＣＤ４７遺伝子の調節配列を変化させることにより、例え
ば構成的プロモーターへと、又は異なる誘導性プロモーターへと、内在性プロモーターを
交換することにより、ＣＤ４７遺伝子の発現を上昇させ得る。これは一般にＣＲＩＳＰＲ
などの公知の技術を使用して行われ得る。
変化させたら、抗ＣＤ４７抗体を使用した、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ
又はＦＡＣＳアッセイなど、実施例に記載のものなどの公知の技術を使用して、十分なＣ
Ｄ４７発現の存在をアッセイし得る。一般に、「十分」は、この文脈において、ＮＫ細胞
殺傷及び／又はマクロファージ食作用を抑制するＨＩＰ細胞表面上でのＣＤ４７の発現の
上昇を意味する。それらのＭＨＣ Ｉが排除されると、細胞上の天然発現レベルが低すぎ
てＮＫ細胞溶解からそれらを保護できない。
４．自殺遺伝子
一部の実施形態では、本発明は、「自殺遺伝子」又は「自殺スイッチ」を含む低免疫原
性多能性細胞（ＨＩＰ細胞）を提供する。これらは、望ましくない方式で増殖し、分裂す
る場合に低免疫原性多能性細胞の死を引き起こし得る「安全スイッチ」として機能するよ
うに組み込まれる。「自殺遺伝子」消失アプローチは、特異的な化合物により活性化され
た場合のみ細胞死滅を引き起こすタンパク質をコードする遺伝子移入ベクターにおいて自
殺遺伝子を含む。自殺遺伝子は、選択的に無毒性化合物を強毒性代謝産物に変換する酵素
をコードし得る。この結果は、酵素を発現する細胞を特異的に除去している。一部の実施
形態では、自殺遺伝子はヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であ
り、トリガーはガンシクロビルである。他の実施形態では、自殺遺伝子はエシェリキア・
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＥＣ－ＣＤ）遺伝子
であり、トリガーは５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）である（両者ともそれらの全体に
おいて参照により本明細書中で組み込まれる、Ｂａｒｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔ
ｈｅｒａｐ．２０（１０）：１９３２－１９４３（２０１２），Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃ
ｅｌｌ Ｒｅｓ．８：７３－８（１９９８））。
他の実施形態では、自殺遺伝子は誘導性カスパーゼタンパク質である。誘導性カスパー
ゼタンパク質は、アポトーシスを誘導可能なカスパーゼタンパク質の少なくとも一部を含
む。一実施形態では、カスパーゼタンパク質の一部は配列番号６で例示される。好ましい
実施形態では、誘導性カスパーゼタンパク質はｉＣａｓｐ９である。これは、ヒトカスパ
ーゼ９をコードする遺伝子に一連のアミノ酸を通じて連結される、Ｆ３６Ｖ突然変異があ
る、ヒトＦＫ５０６－結合タンパク質、ＦＫＢＰ１２の配列を含む。ＦＫＢＰ１２－Ｆ３
６Ｖは、低分子二量体化剤ＡＰ１９０３に高い親和性で結合する。従って本発明でのｉＣ
ａｓｐ９の自殺機能は二量体誘導化合物（ＣＩＤ）の投与により惹起される。一部の実施
形態では、ＣＩＤは低分子薬ＡＰ１９０３である。二量体化はアポトーシスの迅速な誘導
を引き起こす。（それぞれがそれらの全体において本明細書中に参照により組み込まれる
、国際公開第２０１１１４６８６２号パンフレット；Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅ
ｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ３６５；１８（２０１１）；Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｂ
ｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１３：９１３－９２４（２００７）参
照）。
５．ＨＩＰ細胞表現型に対するアッセイ及び多能性の保持
ＨＩＰ細胞が作製されたら、一般に本明細書中に及び実施例に記載のように、これらを
それらの低免疫原性及び／又は多能性保持についてアッセイし得る。
例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書の図１３及び図１５で例示されるよう
な多くの技術を使用して、低免疫原性をアッセイし得る。これらの技術には、同種宿主へ
の移植及び宿主免疫系を回避するＨＩＰ細胞増殖（例えば奇形腫）についての監視が含ま
れる。ルシフェラーゼを発現させるために、ＨＩＰ派生物に対して形質導入を行い、次に
生体発光イメージングを使用して追跡し得る。同様に、ＨＩＰ細胞が宿主動物において免
疫反応を引き起こさないことを確認するために、ＨＩＰ細胞に対する宿主動物のＴ細胞及
び／又はＢ細胞応答を試験する。Ｅｌｉｓｐｏｔ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＰＣＲ又はマ
スサイトメトリー（ＣＹＴＯＦ）によってＴ細胞機能を評価する。ＦＡＣＳ又はルミネッ
クスを使用して、Ｂ細胞応答又は抗体応答を評価する。さらに又は或いは、一般にＰＣＴ
／ＵＳ１８／１３６８８号明細書の図１４Ａ～１４Ｃで示されるように、自然免疫応答、
例えばＮＫ細胞殺傷を回避するためのその能力について細胞をアッセイし得る。インビト
ロ又はインビボでＮＫ細胞リトリティック（ｌｙｔｏｌｙｔｉｃ）活性を評価する（図１
５で示されるように）。
同様に、多くの方法で多能性の保持が試験される。一実施形態では、一般に本明細書中
に記載され、ＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書の図２９で示されるように、ある種
の多能性特異的な因子の発現によって、多能性をアッセイする。さらに又は或いは、多能
性の指標としてＨＩＰ細胞を１つ以上の細胞タイプに分化させる。
Ｄ．ＨＩＰ細胞の好ましい実施形態
ＨＩＰ細胞として又はＨＩＰ細胞の分化産物としての何れかでヒト患者などの同種宿主
に移植された場合に多能性を示すが宿主免疫応答を生じさせない低免疫原性多能性幹細胞
（「ＨＩＰ細胞」）が本明細書中で提供される。
一実施形態では、ヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）は、ａ）各アレルでのＢ２Ｍ遺伝子
の破壊（例えばＢ２Ｍ－／－）、ｂ）各アレルでのＣＩＩＴＡ遺伝子の破壊（例えばＣＩ
ＩＴＡ－／－）及びｃ）ＣＤ４７遺伝子の過剰発現（ＣＤ４７＋、例えばＣＤ４７遺伝子
の１つ以上のさらなるコピーを導入すること又はゲノム遺伝子を活性化することを通じて
）により低免疫原性が付与される。これにより、ｈｉＰＳＣ集団Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ
－／－ＣＤ４７ｔｇが付与される。好ましい実施形態では、細胞は非免疫原性である。別
の実施形態では、ＨＩＰ細胞に、上記のようであるが、必要なときにインビボで細胞を死
滅させるために誘導される誘導性自殺遺伝子を含むことによりさらに修飾される非免疫原
性Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇが与えられる。
Ｅ．ＨＩＰ細胞の維持
作製されたら、ｉＰＳＣの維持のために知られているようにＨＩＰ細胞を未分化状態に
維持し得る。例えば分化を防ぎ、多能性を維持する培地を使用してマトリゲル上でＨＩＰ
細胞を培養する。
一部の実施形態では、ＨＩＰ細胞を凍結保存する。異なる細胞タイプへの分化前に細胞
を凍結保存し得る。言い換えると、分化前に、本明細書中に記載のＨＩＰ細胞を凍結融解
し、分化方法に供する前に培養する。他の実施形態では、ＨＩＰ細胞は分化前に凍結保存
しない。一部の実施形態では、分化したＨＩＰ細胞を患者への投与前に凍結保存する。他
の実施形態では、分化したＨＩＰ細胞を患者への投与前に凍結保存しない。
Ｆ．ＨＩＰ細胞の分化
本発明は、対象への続く移植のために異なる細胞タイプに分化させるＨＩＰ細胞を提供
する。当業者により認められるように、分化のための方法は、公知の技術を使用して所望
の細胞タイプに依存する。懸濁液中で細胞を分化させ、次に細胞生存を促進するためにマ
トリゲル、ゼラチン又はフィブリン／トロンビン形態などのゲルマトリクス形態に入れる
。当技術分野で公知のように、例えば、一般に細胞特異的マーカーの存在を評価すること
によって分化をアッセイする。
一部の実施形態では、肝細胞機能の喪失又は肝臓の肝硬変に対処するために、ＨＩＰ細
胞を肝細胞に分化させる。ＨＩＰ細胞を肝細胞に分化させるために使用され得る多くの技
術がある；例えばそれらの全体において、及び特に分化のための方法及び試薬に対して、
参照により本明細書により明確に全て組み込まれる、Ｐｅｔｔｉｎａｔｏ ｅｔ ａｌ．
，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｐｒｅ３２８８８，Ｓｎｙｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６９８：３０５－３１４（２０１１），Ｓｉ－Ｔａｙｅ
ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５１：２９７－３０５（２０１０）及びＡｓ
ｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ（：４９３－５０４（２０１３）
を参照。一般に関連する肝細胞及び／又はアルブミン、アルファフェトプロテイン及びフ
ィブリノーゲンを含むが限定されない特異的なマーカーの存在を評価することによって、
当技術分野で公知のように分化をアッセイする。アンモニアの代謝、ＬＤＬ貯蔵及び取り
込み、ＩＣＧ取り込み及び放出及びグリコーゲン貯蔵など、分化は機能面でも測定され得
る。
一部の実施形態では、Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）に対処するための移植用にＨＩＰ細胞を
ベータ様細胞又は膵島オルガノイドに分化させる。細胞系はＴ１ＤＭに対処するための有
望な方法であり、例えば参照により本明細書中で組み込まれるＥｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．
，ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｒｇａｓｔｒｏ．２０１７．９３を参照。さらにＰａｇｌ
ｉｕｃａ ｅｔ ａｌ．は、ｈｉＰＳＣからのβ細胞分化の成功について報告している（
その全体において、及び特にヒト多能性幹細胞からの機能的ヒトβ細胞の大規模産生につ
いてそこで概説される方法及び試薬に対して、参照により本明細書によって組み込まれる
ｄｏｉ／１０．１０６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０４０を参照）。さらに、Ｖｅ
ｇａｓ ｅｔ ａｌ．は、ヒト多能性幹細胞からのヒトβ細胞の産生と、その後の宿主に
よる免疫拒絶を回避するための封入を示す；（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４０３０
、その全体において、特にヒト多能性幹細胞からの機能的ヒトβ細胞の大規模産生につい
てそこで概説される方法及び試薬に対して、参照により本明細書によって組み込まれる）
。
一般に、インスリンを含むが限定されないβ細胞関連の又は特異的なマーカーの存在を
評価することによって、当技術分野で公知のように分化をアッセイする。グルコース代謝
の測定など、分化はまた機能面でも測定され得、一般的にはその全体において、及び具体
的にはそこで概説されるバイオマーカーに対して、参照により本明細書によって組み込ま
れるＭｕｒａｒｏ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｓ．２０１６．
０９．００２を参照。
ｄＨＩＰベータ細胞を作製したら、門脈／肝臓、網、胃腸粘膜、骨髄、筋肉又は皮下嚢
にこれらを移植し得る（細懸濁液として、又は本明細書中で論じるようなゲルマトリクス
内の何れかで）。
一部の実施形態では、視力を脅かす眼疾患に対処するために、ＨＩＰ細胞を網膜色素上
皮（ＲＰＥ）に分化させる。その全体において、及び特に分化技術及び試薬についてそこ
で概説される方法及び試薬に対して、参照により本明細書によって組み込まれるＫａｍａ
ｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１４：２：２０５－１８
で概説される技術を使用して、ヒト多能性幹細胞をＲＰＥ細胞に分化させた；ＲＰＥ細胞
のシート作製のための技術及び患者への移植に対してその全体においてまた組み込まれる
Ｍａｎｄａｉ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１６０８３６８も
参照。
当技術分野で公知のように、一般的には、ＲＰＥ関連及び／又は特異的なマーカーの存
在を評価することにより、又は機能性を測定することにより、分化をアッセイし得る。例
えばその全体において、及び具体的には結果セクションの第１段落で概説されるマーカー
に対して、参照により本明細書によってまた組み込まれるＫａｍａｏ ｅｔ ａｌ．，ｄ
ｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍｃｒ．２０１３．１２．００７も参照。
一部の実施形態では、心血管系疾患に対処するためにＨＩＰ細胞を心筋細胞に分化させ
る。カーディオミオクト（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｔｅ）のｈｉＰＳＣの分化について、技
術は当技術分野で公知であり、実施例で論じる。当技術分野で公知のように、一般に心筋
細胞関連の又は特異的なマーカーの存在を評価することによって、又は機能面を測定する
ことによって分化をアッセイし得る；例えばその全体において、及び具体的に心筋細胞を
含む幹細胞を分化させる方法に対して、参照により本明細書によって組み込まれるＬｏｈ
ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．Ｃｅｌｌ．２０１６．０６．００１を参
照。
一部の実施形態では、新しい血管を形成させて末梢動脈性疾患に対処するために、内皮
コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ）へとＨＩＰ細胞を分化させる。内皮細胞を分化させるため
の技術は公知である。例えば、その全体において、及び具体的にはヒト多能性幹細胞から
の内皮細胞の作製のため、及びまた移植技術のための方法及び試薬に対して、参照により
組み込まれるＰｒａｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０４
８を参照。一般に内皮細胞関連又は特異的マーカーの存在を評価することにより、又は機
能面で測定することにより、当技術分野で公知のように分化をアッセイし得る。
一部の実施形態では、自己免疫甲状腺炎に対処するために、甲状腺祖先細胞及び甲状腺
ホルモンを分泌し得る甲状腺濾胞オルガノイドへとＨＩＰ細胞を分化させる。甲状腺細胞
を分化させるための技術は当技術分野で公知である。例えばその全体において、及び具体
的にはヒト多能性幹細胞からの甲状腺細胞作製のための方法及び試薬に対して、及びまた
移植技術に対して、参照により本明細書によって明確に組み込まれる、Ｋｕｒｍａｎｎ
ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１５．０９．００４を参照。
一般的に、甲状腺細胞に関連するか又は特異的なマーカーの存在を評価することにより、
又は機能面で測定することにより、当技術分野で公知のように分化をアッセイし得る。
ＶＩＩＩ．ＨＩＰ細胞由来の低免疫心臓細胞
一部の実施形態では、心臓細胞は、本明細書中に記載のＨＩＰ細胞由来である。例えば
ヒト心臓細胞は、ヒトＨＩＰ細胞を分化させることによって作製され得る。同様に、マウ
ス心臓細胞はマウスＨＩＰ細胞を分化させることによって作製され得る。このような心臓
細胞は低免疫心臓細胞である。
誘導又は胚性多能性幹細胞を心臓細胞に分化させるための有用な方法が、例えば米国特
許第２０１７０１５２４８５号明細書、同第２０１７００５８２６３号明細書、同第２０
１７０００２３２５号明細書、同第２０１６０３６２６６１号明細書、同第２０１６００
６８８１４号明細書、同第９０６２２８９号明細書、同第７８９７３８９号明細書及び同
第７４５２７１８号明細書に記載される。
誘導又は胚性多能性幹細胞から心臓細胞を作製するためのさらなる方法は、例えばＸｕ
ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００６，
１５（５）：６３１－９、Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅ
ｌｌ，２０１２，１０：１６－２８及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ
Ｒｅｓ，２０１５，１５（２）：３６５－３７５に記載される。
様々な実施形態において、ＨＩＰ細胞（例えばマウスＨＩＰ細胞及びヒトＨＩＰ細胞）
は、ＢＭＰ経路阻害剤、ＷＮＴシグナル伝達活性化因子、ＷＮＴシグナル伝達阻害剤、Ｗ
ＮＴアゴニスト、ＷＮＴアンタゴニス、Ｓｒｃ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＰＣＫ活性化因
子、サイトカイン、増殖因子、心臓作用物質、化合物などを含む培地中で培養され得る。
ＷＮＴシグナル伝達活性化因子としてはＣＨＩＲ９９０２１が挙げられるが限定されな
い。ＰＣＫ活性化因子としてはＰＭＡが挙げられるが限定されない。ＷＮＴシグナル伝達
阻害剤としては、ＫＹ０２１１１、ＳＯ３０３１（ＫＹ０１－Ｉ）、ＳＯ２０３１（ＫＹ
０２－Ｉ）及びＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）及びＸＡＶ９３９から選択される化合物が
挙げられるが限定されない。Ｓｒｃ阻害剤としてはＡ４１９２５９が挙げられるが限定さ
れない。ＥＧＦＲ阻害剤としてはＡＧ１４７８が挙げられるが限定されない。
ｉＰＳＣから心臓細胞を作製するための物質の非限定例としては、アクチビンＡ、ＢＭ
Ｐ－４、Ｗｎｔ３ａ、ＶＥＧＦ、可溶性ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質、シクロスポリンＡ
、アンジオテンシンＩＩ、フェニレフリン、アスコルビン酸、ジメチルスルホキシド、５
－アザ－２’－デオキシシチジンなどが挙げられる。
本発明の細胞は、心臓細胞へのＨＩＰ細胞の分化を支持及び／又は促進するために、合
成面などの面上で培養され得る。一部の実施形態では、この面は、選択される１つ以上の
アクリラート単量体のホモポリマー又はコポリマーを含むが限定されないポリマー物質を
含む。アクリラート単量体及びメタクリラート単量体の非限定例としては、テトラ（エチ
レングリコール）ジアクリラート、グリセロールジメタクリラート、１，４－ブタンジオ
ールジメタクリラート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリラート、ジ（エチレングリ
コール）ジメタクリラート、テトラ（エチレングリコール）ジメタクリラート、１，６－
ヘキサンジオールプロポキシラートジアクリラート、ネオペンチルグリコールジアクリラ
ート、トリメチロールプロパンベンゾアートジアクリラート、トリメチロールプロパンエ
トキシラート（１ＥＯ／ＯＨ）メチル、トリシクロ［５．２．１．０２，６］デカン－ジ
メタノールジアクリラート、ネオペンチルグリコールエトキシラートジアクリラート及び
トリメチロールプロパントリアクリラートが挙げられる。アクリラートは、当技術分野で
公知のように合成されるか又はＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｉｇｍａ Ａｌ
ｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．及びＳａｒｔｏｍｅｒ，Ｉｎｃなどの市販業者から入手される。
ポリマー性物質は、支持物質の表面上に分散され得る。細胞を培養するのに適切な有用
な支持物質は、セラミック物質、ガラス、プラスチック、ポリマー又はコポリマー、それ
らの何らかの組み合わせ又は別の物質上のある物質のコーティングを含む。一部の例では
、ガラスとしては、ソーダ石灰ガラス、パイレックスガラス、ｖｙｃｏｒガラス、石英ガ
ラス、ケイ素又はこれらの誘導体などが挙げられる。
一部の例では、プラスチック又は樹状ポリマーを含むポリマーとしては、ポリ（塩化ビ
ニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メチルメタクリラート）、ポリ（ビニル酢酸
－マレイン酸無水物）、ポリ（ジメチルシロキサン）モノメタクリラート、環状オレフィ
ンポリマー、フルオロカーボンポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン
イミン又はこれらの誘導体などが挙げられる。一部の例では、コポリマーとしては、ポリ
（ビニル酢酸－コ－マレイン酸無水物）、ポリ（スチレン－コ－マレイン酸無水物）、ポ
リ（エチレン－コ－アクリル酸）又はこれらの誘導体などが挙げられる。
本発明の改変心臓細胞としては、心筋細胞、結節心筋細胞、伝導性心筋細胞、作業心筋
細胞、心筋細胞前駆体、心筋細胞祖先細胞、心臓幹細胞及び心臓筋肉細胞が挙げられるが
限定されない。一部の実施形態では、心筋細胞前駆体は、成熟（最終段階）心筋細胞を含
む子孫を生じさせることが可能である（脱分化又は初期化なし）細胞を指す。心筋細胞前
駆細胞は、ＧＡＴＡ－４、Ｎｋｘ２．５及び転写因子のＭＥＦ－２ファミリーから選択さ
れる１つ以上のマーカーを使用して同定され得ることが多い。一部の例では、心筋細胞は
、次のリストからの１つ以上のマーカー（時として少なくとも３又は５個のマーカー）を
発現する未熟心筋細胞又は成熟心筋細胞を指す：心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、心臓ト
ロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、サルコメアミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＧＡＴＡ－４、Ｎｋｘ２
．５、Ｎ－カドヘリン、β１－アドレノセプター（β１－ＡＲ）、ＡＮＦ、転写因子のＭ
ＥＦ－２ファミリー、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ－ＭＢ）、ミオグロビン又は心房性
ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）。一部の実施形態では、改変心臓細胞は自発的な周期的収
縮活性を示す。一部の例では、適切なＣａ２＋濃度及び電解質バランスである適切な組織
培養環境中で心臓細胞を培養する場合、培地に何らかさらなる構成成分を添加することな
く、細胞が細胞の１つの軸を横断して周期的に収縮し、次いで収縮から解放されることが
観察され得る。一部の実施形態では、心臓細胞は低免疫心臓細胞である。
処置なしで左心室壁組織の５５％を瘢痕組織にする心臓クライオインジャリーに対する
動物モデルにおいて、本明細書中で記載のように調製される心臓細胞の有効性を評価し得
る（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６２：６５４，１９９６；
Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．８：２０７４，１９９９
，Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１
１８：７１５，１９９９）。処置の成功によって、瘢痕の面積が減少し、瘢痕の拡大が制
限され、収縮期、拡張期及び最大圧により判定した場合、心臓機能が改善し得る。心臓損
傷はまた、左前下行枝動脈の遠位部分で塞栓形成コイルを使用してモデルを作製し得（Ｗ
ａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．７：２３９，１９９
８）、処置の有効性を組織学及び心臓機能により評価し得る。
一部の実施形態では、改変心臓細胞（例えば低免疫心臓細胞）を患者、例えばそれを必
要とするヒト患者に投与する。小児心筋症、加齢性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症
、拘束型心筋症、慢性虚血性心筋症、周産期心筋症、炎症性心筋症、他の心筋症、心筋炎
、心筋虚血性再灌流障害、心室機能不全、心不全、うっ血性心不全、冠動脈疾患、末期心
疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血、高血圧、再狭窄、狭心症、リウマチ性心臓、動脈
炎又は循環器疾患に罹患している患者に心臓細胞を投与し得る。一部の例では、患者は心
筋梗塞になっている。特定例では、患者は冠動脈バイパス術を受けている。
組織及び／又は単離細胞を心臓に移植するために、周知の外科手術技術を使用して患者
に改変心臓細胞を移植し得る。一部の実施形態では、注射（例えば心筋内注射、冠動脈内
注射、経心内膜注射、経心外膜注射、経皮的注射）、点滴及び移植によって細胞を患者の
心臓組織に導入する。
改変心臓細胞の投与（送達）としては、皮下又は、静脈内、動脈内（例えば冠動脈内）
、筋肉内、腹腔内、心筋内、経心内膜、経心外膜、鼻腔内投与並びにクモ膜下腔を含む非
経口及び点滴技術が挙げられるが限定されない。
一部の実施形態では、改変心臓細胞を投与された患者に心臓薬も投与する。併用療法で
の使用に適切な心臓薬の代表的な例としては、増殖因子、増殖因子をコードするポリヌク
レオチド、血管新生剤、カルシウムチャネル遮断剤、降圧剤、有糸分裂阻害薬、イノトロ
ピック剤（ｉｎｏｔｒｏｐｉｃ ａｇｅｎｔ）、抗アテローム剤、抗凝固薬、ベータブロ
ッカー、抗不整脈剤、抗炎症剤、血管拡張薬、血栓溶解剤、心臓グリコシド、抗生物質、
抗ウイルス剤、抗真菌剤、原虫阻害物質、ナイトレート、アンジオテンシン変換酵素（Ａ
ＣＥ）阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、脳ナトリウム利尿ペプチド
（ＢＮＰ）；抗悪性腫瘍薬、ステロイドなどが挙げられるが限定されない。
様々な方法において本発明の方法による治療の効果を監視し得る。例えば、処置の有効
性を判定するために心電図（ＥＣＧ）又はホルターモニターを利用し得る。ＥＣＧは、心
臓リズム及び電気インパルスの目安であり、治療が対象の心臓で電気的状態の崩壊を改善
又は維持したか、予防したか又は遅延させたか否かを判定するための非常に有効な非侵襲
的方法である。心臓の異常、不整脈障害などを監視するために長時間にわたり装着され得
るホルター心電図、携帯型ＥＣＧの使用も、治療の有効性を評価するための信頼性の高い
方法である。心室機能の改善を判定するためにＥＣＧ又は核研究を使用し得る。
当業者により認められるように、細胞タイプ及びこれらの細胞の最終的な用途の両方に
依存する当技術分野で公知の技術を使用して、分化させたＨＩＰ派生物を移植する。一般
に、患者において静脈内で又は特定の位置での注射の何れかにより、本発明の分化したＨ
ＩＰ細胞を移植する。特定の位置に移植した場合、それらを維持しながら分散を防ぐため
にゲルマトリクス中で細胞を懸濁し得る。
ＩＸ．ＨＩＰ細胞由来の内皮細胞
一部の実施形態では、内皮細胞は本明細書中に記載のＨＩＰ細胞由来である。例えば、
ヒトＨＩＰ細胞を分化させることによりヒト内皮細胞を作製し得る。同様に、マウスＨＩ
Ｐ細胞を分化させることによりマウス内皮細胞を作製し得る。このような内皮細胞は低免
疫内皮細胞である。
誘導又は胚性多能性幹細胞を内皮細胞に分化させるための有用な方法は、例えば米国特
許出願公開第２００４／０００９５８９号明細書、国際公開第２０１１／０９０６８４号
パンフレット及び同第２０１２／００６４４０号パンフレットに記載される。
様々な実施形態で、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＲＯＣＫ阻害
剤、ＷＮＴシグナル伝達活性化因子、ＷＮＴシグナル伝達阻害剤、ＷＮＴアゴニスト、Ｗ
ＮＴアンタゴニス、Ｓｒｃ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＰＣＫ活性化因子、サイトカイン、
増殖因子、内皮細胞分化化合物、内皮細胞促進化合物などを含む培地中でＨＩＰ細胞（例
えばマウスＨＩＰ細胞及びヒトＨＩＰ細胞）を培養し得る。
ＷＮＴシグナル伝達活性化因子（例えばＧＳＫ３阻害剤）としてはＣＨＩＲ－９９０２
１が挙げられるが限定されない。ＰＣＫ活性化因子としてはＰＭＡが挙げられるが限定さ
れない。ＷＮＴシグナル伝達阻害剤としては、ＫＹ０２１１１、ＳＯ３０３１（ＫＹ０１
－Ｉ）、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２－Ｉ）及びＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）及びＸＡＶ９
３９から選択される化合物が挙げられるが限定されない。Ｓｒｃ阻害剤としてはＡ４１９
２５９が挙げられるが限定されない。ＥＧＦＲ阻害剤としてはＡＧ１４７８が挙げられる
が限定されない。
ｉＰＳＣから内皮細胞を作製するための物質の非限定例としては、アクチビンＡ、ＢＭ
Ｐ－４、Ｗｎｔ３ａ、ＶＥＧＦ、可溶性ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質、シクロスポリンＡ
、アンジオテンシンＩＩ、フェニレフリン、アスコルビン酸、ジメチルスルホキシド、５
－アザ－２’－デオキシシチジンなどが挙げられる。
ＨＩＰ細胞の低免疫内皮細胞への分化を支持及び／又は促進するための合成面など、面
上で本発明の細胞を培養し得る。一部の実施形態では、この面は、選択される１つ以上の
アクリラート単量体のホモポリマー又はコポリマーを含むが限定されないポリマー材料を
含む。アクリラート単量体及びメタクリラート単量体の非限定例としては、テトラ（エチ
レングリコール）ジアクリラート、グリセロールジメタクリラート、１，４－ブタンジオ
ールジメタクリラート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリラート、ジ（エチレングリ
コール）ジメタクリラート、テトラ（エチレングリコール）ジメタクリラート、１，６－
ヘキサンジオールプロポキシラートジアクリラート、ネオペンチルグリコールジアクリラ
ート、トリメチロールプロパンベンゾアートジアクリラート、トリメチロールプロパンエ
トキシラート（１ ＥＯ／ＯＨ）メチル、トリシクロ［５．２．１．０２，６］デカン－
ジメタノールジアクリラート、ネオペンチルグリコールエトキシラートジアクリラート及
びトリメチロールプロパントリアクリラートが挙げられる。アクリラートは当技術分野で
公知のように合成されるか又はＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｉｇｍａ Ａｌ
ｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．及びＳａｒｔｏｍｅｒ，Ｉｎｃ．などの市販業者から得られる。
一部の実施形態では、ポリマーマトリクス上に内皮細胞を播種し得る。一部の例では、
ポリマーマトリクスは生体分解性である。適切な生体分解性マトリクスは当技術分野で周
知であり、コラーゲン－ＧＡＧ、コラーゲン、フィブリン、ＰＬＡ、ＰＧＡ及びＰＬＡ／
ＰＧＡコポリマーが挙げられる。さらなる生体分解性物質としては、ポリ（無水物）、ポ
リ（ヒドロキシ酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（プロピルフメラート）、ポリ（カ
プロラクトン）、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、生体分解性ポリシアノア
クリラート、生体分解性ポリウレタン及び多糖類が挙げられる。
非生体分解性ポリマーも使用され得る。他の非生体分解性、また生体適合性ポリマーと
しては、ポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェン、ポリスチレン、ポリエステル、
非生体分解性ポリウレタン、ポリ尿素、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ポリプロピレン、
ポリメタクリラート、ポリエチレン、ポリカーボネート及びポリ（エチレンオキシド）が
挙げられる。ポリマーマトリクスは、例えば粒子、スポンジ、チューブ、球、鎖、コイル
状鎖、毛細管ネットワーク、フィルム、繊維、メッシュ又はシートとして、何らかの形状
で形成され得る。天然又は合成細胞外マトリクス材料及び因子を含むようにポリマーマト
リクスを修飾し得る。
支持材料の面上にポリマー性物質を分散させ得る。細胞培養に適切な有用な支持材料と
しては、セラミック物質、ガラス、プラスチック、ポリマー又はコポリマー、それらの何
らかの組み合わせ又は別の物質上のある物質のコーティングが挙げられる。一部の例では
、ガラスとしては、ソーダ石灰ガラス、パイレックスガラス、ｖｙｃｏｒガラス、石英ガ
ラス、ケイ素又はこれらの誘導体などが挙げられる。
一部の例では、樹状ポリマーを含むプラスチック又はポリマーとしては、ポリ（塩化ビ
ニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メチルメタクリラート）、ポリ（ビニル酢酸
－マレイン酸無水物）、ポリ（ジメチルシロキサン）モノメタクリラート、環状オレフィ
ンポリマー、フルオロカーボンポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン
イミン又はこれらの誘導体などが挙げられる。一部の例では、コポリマーとしては、ポリ
（ビニル酢酸－コ－マレイン酸無水物）、ポリ（スチレン－コ－マレイン酸無水物）、ポ
リ（エチレン－コ－アクリル酸）又はこれらの誘導体などが挙げられる。
本発明の改変内皮細胞は１つ以上の内皮細胞マーカーを発現し得る。このようなマーカ
ーの非限定例としては、ＶＥ－カドヘリン（ＣＤ１４４）、ＡＣＥ（アンジオテンシン変
換酵素）（ＣＤ１４３）、ＢＮＨ９／ＢＮＦ１３、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ５４（ＩＣ
ＡＭ－１）、ＣＤ６２Ｅ（Ｅ－セレクチン）、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＣＤ１４６
、エンドカン（ＥＳＭ－１）、Ｅｎｄｏｇｌｙｘ－１、エンドムチン、エオタキシン－３
．ＥＰＡＳ１（内皮ＰＡＳドメインタンパク質１）、第ＶＩＩＩ因子関連抗原、ＦＬＩ－
１、Ｆｌｋ－１（ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ－２）、ＦＬＴ－１（ＶＥＧＦＲ－１）、ＧＡＴＡ
２、ＧＢＰ－１（グアニル酸－結合タンパク質－１）、ＧＲＯ－アルファ、ＨＥＸ、ＩＣ
ＡＭ－２（細胞間接着分子２）、ＬＭ０２、ＬＹＶＥ－１、ＭＲＢ（マジックラウンドア
バウト）、ヌクレオリン、ＰＡＬ－Ｅ（パソロジスク・アナトミー・ライデン－エンドセ
リウム（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｃｈｅ ａｎａｔｏｍｉｅ Ｌｅｉｄｅｎ－ｅｎｄｏｔｈ
ｅｌｉｕｍ））、ＲＴＫ、ｓＶＣＡＭ－１、ＴＡＬＩ、ＴＥＭ１（腫瘍内皮マーカー１）
、ＴＥＭ５（腫瘍内皮マーカー５）、ＴＥＭ７（腫瘍内皮マーカー７）、トロンボモジュ
リン（ＴＭ、ＣＤ１４１）、ＶＣＡＭ－１（血管細胞接着分子－１）（ＣＤ１０６）、Ｖ
ＥＧＦ（血管内皮胞増殖因子）、ｖＷＦ（フォン・ヴィルブランド因子）、ＺＯ－１、内
皮細胞－選択的接着分子（ＥＳＡＭ）、ＣＤ１０２、ＣＤ９３、ＣＤ１８４、ＣＤ３０４
及びＤＬＬ４が挙げられる。
内皮細胞としては、内皮祖先細胞、毛細血管内皮細胞、動脈内皮細胞、静脈内皮細胞、
リンパ血管内皮細胞、他の血管内皮細胞、大動脈内皮細胞、脳血管関門の内皮細胞、心臓
内皮細胞、腎臓内皮細胞及び肝臓内皮細胞が挙げられるが限定されない。異なる内皮細胞
のタイプ及び特徴は、Ａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ
，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１，３１
：１４７６－１４８４及び米国特許第５，９８０，０８８号明細書に記載されている。一
部の実施形態では、本発明の単離改変内皮細胞は、血管内皮細胞、脳内皮細胞、腎臓内皮
細胞及び大動脈内皮細胞からなる群から選択される。好ましい実施形態では、内皮細胞は
毛細血管内皮細胞である。
一部の実施形態では、障害／状態を処置するか若しくは障害／状態の症状を回復させる
のに有用な、酵素、ホルモン、受容体、リガンド又は薬物などであるが限定されない関心
のあるタンパク質をコードする外因性遺伝子を発現させるために、改変内皮細胞が遺伝子
修飾される。内皮細胞を遺伝子修飾するための標準的方法は例えば米国特許第５，６７４
，７２２号明細書に記載されている。
このような内皮細胞は、疾患の予防又は処置に有用なポリペプチド又はタンパク質の構
成的合成及び送達を提供するために使用され得る。このように、ポリペプチドは個体の血
流又は身体の他の領域（例えば中枢神経系）に直接分泌される。一部の実施形態では、イ
ンスリン、血液凝固因子（例えば第ＶＩＩＩ因子又はフォン・ヴィルブランド因子）、ア
ルファ－１抗トリプシン、アデノシンデアミナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、
インターロイキン（例えばＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３）などを分泌させるために、内
皮細胞が修飾され得る。
ある一定の実施形態では、移植される移植片との関連でそれらの性能を改善する方法で
改変内皮細胞を修飾し得る。非限定的代表例としては、腔内血餅形成を防ぐための血小板
溶解薬の分泌又は発現、平滑筋肥大による管腔狭窄を防ぐための平滑筋増殖の阻害剤の分
泌及び内皮細胞増殖を刺激するための内皮細胞分裂促進因子又は自己分泌因子の発現及び
／又は分泌及び移植片管腔の内皮細胞の裏打ちの広がり又は持続時間の改善が挙げられる
。
一部の実施形態では、特異的な臓器又は肢への分泌生成物の治療レベルの送達のために
改変内皮細胞を利用する。例えば、インビトロで改変された（形質転換された）内皮細胞
で裏打ちされた血管移植物を特異的な臓器又は肢に移植し得る。形質導入された内皮細胞
の分泌生成物は、灌流される組織に対して高濃度で送達され、それにより標的とされる解
剖学的位置に所望の効果を到達させる。
他の実施形態では、血管形成する腫瘍において内皮細胞により発現されるときに血管形
成を破壊又は阻害する遺伝子を含有させるために、改変内皮細胞を遺伝子修飾する。一部
の例では、腫瘍処置の完了時に移植された内皮細胞の負の選択を可能にする、本明細書中
に記載の選択可能な自殺遺伝子の何れか１つを発現させるためにも内皮細胞を遺伝子修飾
し得る。
一部の実施形態では、改変内皮細胞を患者、例えばそれを必要とするヒト患者に投与す
る。循環器疾患、血管疾患、末梢血管疾患、虚血性疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、末
梢血管閉塞性疾患、脳卒中、再灌流障害、虚血肢、神経障害（例えば末梢神経障害又は糖
尿病性神経障害）、臓器不全（例えば肝不全、腎不全など）、糖尿病、関節リウマチ、骨
粗しょう症、血管損傷、組織損傷、高血圧、冠動脈疾患による狭心症及び心筋梗塞、腎臓
血管高血圧、腎臓動脈狭窄による腎不全、下肢の跛行などであるが限定されない疾患又は
状態に罹患している患者に内皮細胞を投与し得る。ある一定の実施形態では、患者は、一
部の例では脳血管疾患によるものであり得る一過性虚血性発作又は脳卒中に罹患したこと
があるか又は罹患している。一部の実施形態では、例えばアテローム性動脈硬化症、心筋
梗塞及び虚血肢で起こるような組織虚血を処置するために、及び損傷血管を修復するため
に、改変内皮細胞を投与する。一部の例では、移植片の生体工学で細胞を使用する。
例えば、虚血性組織の修復、血管及び心臓弁の形成、人工血管の改変、損傷のある血管
の修復及び改変組織での血管形成の誘導（例えば移植前）のための細胞療法において改変
内皮細胞を使用し得る。さらに、腫瘍を標的とし、処置するための薬剤を送達するために
内皮細胞をさらに修飾し得る。
具体的な実施形態では、血管細胞又は血管新生を必要とする組織に対する修復又は置換
の方法が本明細書中で提供される。この方法は、このような組織での血管新生を促進する
ために、このような処置を必要とするヒト患者に単離内皮細胞を含有する組成物を投与す
ることを含む。血管細胞又は血管新生を必要とする組織は、とりわけ、心臓組織、肝臓組
織、膵臓組織、腎臓組織、筋肉組織、神経組織、骨組織であり得、これらは、損傷があり
、過剰な細胞死を特徴とする組織、損傷のリスクがある組織又は人工的に改変された組織
であり得る。
ある一定の実施形態では、血管再建術で使用される人工移植物（例えばＤａｃｒｏｎ及
びＧｏｒｔｅｘなどの合成物質から形成される血管）を改善するために改変内皮細胞を使
用する。例えば、人工動脈移植物は、生体臓器又は肢を灌流する疾患のある動脈を置換す
るために使用されることが多い。他の実施形態では、人工心臓弁の表面をカバーして弁の
表面の血栓形成性を低下させることにより塞栓形成のリスクを低下させるために改変内皮
細胞を使用する。
組織及び／又は単離細胞を血管に移植するための周知の外科的技術を使用して、改変内
皮細胞を患者に移植し得る。一部の実施形態では、注射（例えば心筋内注射、冠動脈内注
射、経心内膜注射、経心外膜注射、経皮的注射）、点滴、埋め込み及び移植によって、患
者の心臓組織に細胞を導入する。
改変内皮細胞の投与（送達）としては、静脈内、動脈内（例えば冠動脈内）、筋肉内、
腹腔内、心筋内、経心内膜、経心外膜、鼻腔内投与並びにくも膜下腔内及び点滴技術を含
む皮下又は非経口が挙げられるが限定されない。
当業者により認められるように、細胞タイプ及びこれらの細胞の最終的な用途の両方に
依存する当技術分野で公知の技術を使用して、分化したＨＩＰ派生物を移植する。一般に
、静脈内で又は患者の特定の位置での注射によるかの何れかで本発明の分化したＨＩＰ細
胞を移植する。特定の位置で移植する場合、それらが定着する一方で分散を防ぐためにゲ
ルマトリクス中で細胞を懸濁し得る。
Ｘ．ＨＩＰ細胞由来の低免疫ドーパミン作動性ニューロン
一部の実施形態では、ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンは本明細書中に記載のＨＩ
Ｐ細胞由来である。例えば、ヒトＨＩＰ細胞を分化させることによりヒトＤＡニューロン
を作製し得る。同様に、マウスＨＩＰ細胞を分化させることによりマウスＤＡニューロン
を作製し得る。このようなＤＡニューロンは低免疫ＤＡニューロンである。
多能性幹細胞をＤＡニューロンに分化させるための有用な方法は、例えば米国特許第９
，９６８，６３７号明細書及び同第７，６７４，６２０号明細書に記載されており、この
開示は、本願を含めそれらの全体において、本明細書中で参照により組み込まれる。ヒト
多能性幹細胞からＤＡ細胞を作製するためのさらなる方法は、例えばＫｉｍ，Ｊ．－Ｈ．
，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１８，５０－５６；Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ，
Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００２，９９（４），２３４４－２３４９；Ｇｒ
ｏｗ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１６
，５（９）：１１３３－４４及びＣｈｏ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００８
，１０５：３３９２－３３９７で見出され得る。
「ドーパミン作動性ニューロン」という用語は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、
ドーパミン合成に対する律速酵素を発現する神経細胞を指す。好ましくは、ドーパミン作
動性ニューロンは神経伝達物質ドーパミンを分泌し、ドーパミン－β－ヒドロキシラーゼ
の発現は僅かであるか又はない。ドーパミン作動性ニューロンは、次のうち１つ以上を発
現し得る：ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、１－芳香族アミノ酸デカルボキシラ
ーゼ、小胞モノアミン輸送体２、ドーパミン輸送体、Ｎｕｒｒ－１及びドーパミン－２受
容体（Ｄ２受容体）。ドーパミン作動性ニューロンは、神経幹細胞、神経祖先細胞、未熟
ドーパミン作動性ニューロン及び成熟ドーパミン作動性ニューロンを含む。
「神経幹細胞」という用語は、神経細胞経路に沿って部分的に分化し、例えばネスチン
を含むいくつかの神経マーカーを発現する多能性細胞のサブセットを指す。神経幹細胞は
、ニューロン又はグリア細胞（例えば星状細胞及び乏突起膠細胞）に分化し得る。「神経
祖先細胞」という用語は、ＦＯＸＡ２及び低レベルのβ－チューブリンを発現するが、チ
ロシンヒドロキシラーゼを発現しない（即ちＦＯＸＡ２＋／β－チューブリンＬＯ／ＴＨ
－表現型を有する）培養された細胞を指す。このような神経祖先細胞は、例えば本明細書
中に記載のものなど、適切な因子の培養時に、様々な神経サブタイプ；特に様々なドーパ
ミン作動性神経サブタイプを分化させる能力を有する。
増殖培地中でＨＩＰ細胞及びＨＩＰ細胞由来のＤＡニューロンを培養し得る。例示的な
増殖培地としては、ヒト胚性幹細胞培地（ｈＥＳＣ培地）、ダルベッコ改変イーグル培地
哺乳動物細胞培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）（Ｔｈ
ｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｒ（ＫＯＳＲ
）、最小必須培地イーグル－アルファ改変（アルファＭＥＭ）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭ
ＥＭ（ＫＯ－ＤＭＥＭ）、Ｎ－２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＭＳ－５間質性細胞培
地などが挙げられるが限定されない。
ＤＡニューロンの分化、増殖、拡大、維持及び／又は成熟を促進する有用な添加物とし
ては、Ｗｎｔ１、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８ａ、ソニック
ヘッジホッグ（ＳＨＨ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、トランスフォーミング増殖
因子α（ＴＧＦ－α）、ＴＧＦ－β３、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１β）、グリア
細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＧＳＫ－３阻害剤（例えばＣＨＩＲ－９９０２１
）、ＴＧＦ－β阻害剤（例えばＳＢ－４３１５４２）、Ｂ－２７サプリメント、ドルソモ
ルフィン、プルモルファミン、ノギン、レチノイン酸、ｃＡＭＰ、アスコルビン酸、Ｇｌ
ｕｔａＭａｘ（商標）、ニュールツリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃ
ｅｍｅｎｔ、Ｎ－アセチルシステイン、ｃ－キットリガンド、その修飾形態、その模倣物
、その類似体及びその変異体が挙げられるが限定されない。一部の実施形態では、ＷＮＴ
経路、ＮＯＴＣＨ経路、ＳＨＨ経路、ＢＭＰ経路、ＦＧＦ経路、ＴＧＦβ経路などを活性
化又は阻害する１つ以上の因子の存在下でＤＡニューロンを分化させる。分化プロトコー
ル及びその詳細な記載は、例えば米国特許第９，９６８，６３７号明細書及び同第７，６
７４，６２０号明細書、Ｋｉｍ，Ｊ．－Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，
４１８，５０－５６；Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００
２，９９（４），２３４４－２３４９；Ｇｒｏｗ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ
Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１６，５（９）：１１３３－４４及びＣｈｏ，
Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００８，１０５：３３９２－３３９７で提供され
、発明を実施するための形態、実施例、方法、オンライン方法及び結果を含むそれらの全
体での開示が本明細書中で参照により組み込まれる。
ＤＡ分化の特徴を調べ、監視し、ＤＡ表現型を評価するために、分子及び遺伝子マーカ
ーの何れかの数の発現が評価され得る。例えば遺伝子マーカーの存在は、当業者にとって
公知の様々な方法により決定され得る。分子マーカー発現は、ｑＰＣＲに基づくアッセイ
、免疫アッセイ、免疫細胞化学アッセイ、免疫ブロッティングアッセイなどであるが限定
されない定量法によって決定され得る。
ＤＡニューロンのための代表的なマーカーとしては、ＴＨ、β－チューブリン、ペアー
ドボックスタンパク質（Ｐａｘ６）、インスリン遺伝子エンハンサータンパク質（ＩＳＬ
１）、ネスチン、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、Ｇタンパク質活性化内向き整流カリウ
ムチャネル２（ＧＩＲＫ２）、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ－２）、核内受容体関連
１タンパク質（ＮＵＲＲ１）、ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）、フォークヘッドボックスタ
ンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＦＯＸ３、ダブルコルチン及びＬＩＭホメオボックス転写
因子１－ベータ（ＬＭＸ１Ｂ）などが挙げられる。
ＤＡニューロンは、細胞電気生理学的メーカー（ｍａｋｅｒ）によっても評価され得る
。細胞の電気生理学は、当業者にとって公知のアッセイを使用することによって評価され
得る。例えば、全細胞及び穿孔処理パッチクランプ、細胞の電気生理学的活性を検出する
ためのアッセイ、細胞の活動電位の大きさ及び持続時間を測定するためのアッセイ及びＤ
Ａ細胞のドーパミン産生を検出するための機能アッセイである。
一部の実施形態では、ＤＡニューロン分化は、自発的な律動的活動電位及び脱分極電流
の注入時のスパイク周波数順応（ｓｐｉｋｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｄａｐｔｉｏｎ）
を伴う高周波活動電位を特徴とする。他の実施形態では、ＤＡ分化はドーパミン産生を特
徴とする。産生されるドーパミンのレベルは、その最大振幅の半分に到達した点の活動電
位の幅（スパイクの最大幅の半分）を測定することにより計算される。
一部の実施形態では、神経変性疾患又は状態を処置するために、ＨＩＰ細胞由来のＤＡ
ニューロンを患者、例えばヒト患者に投与する。一部の例では、神経変性疾患又は状態は
パーキンソン病、ハンチントン病及び多発性硬化症からなる群から選択される。他の実施
形態では、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、トゥレット症候群（ＴＳ）、統合失調症、
精神病及びうつなどの精神神経障害の１つ以上の症状を処置するか又は寛解させるために
ＤＡニューロンを使用する。また他の実施形態では、ＤＡニューロン障害がある患者を処
置するためにＤＡニューロンを使用する。
患者において静脈内で又は特定の位置への注射よるかの何れかで、分化したＤＡニュー
ロンを移植し得る。一部の実施形態では、変性によりパーキンソン病（ＰＤ）が起こるＤ
Ａニューロンを置き換えるために、分化したＤＡ細胞を脳の、黒質（特に緻密な領域に又
はその隣）、腹側被蓋野の領域（ＶＴＡ）、尾状核、被殻、側坐核、視床下核又は何らか
のそれらの組み合わせに移植する。分化したＤＡ細胞を細胞懸濁液として標的領域に注入
し得る。或いは、このような送達装置に含有される場合、分化したＤＡ細胞を支持マトリ
クス又は足場に埋め込み得る。一部の実施形態では、足場は生体分解性である。他の実施
形態では、足場は生体分解性ではない。足場は天然又は合成（人工）材料を含み得る。
細胞組成物の治療処方物の一般的な原理は、参照により本明細書中で具体的に組み込ま
れるＣｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ
，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ
，Ｇ．Ｍｏｒｓｔｙｎ ＆ Ｗ．Ｓｈｅｒｉｄａｎ ｅｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６及びＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ
Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｅ．Ｂａｌｌ，Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ ＆ Ｐ．Ｌａｗ，Ｃｈｕ
ｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，２０００で見出される。一部の実施形態では、
分化したＤＡニューロンは医薬組成物の形態で供給される。リポソーム、微粒子又はマイ
クロカプセルなどであるが限定されない適切なビヒクルを使用することにより、ＤＡニュ
ーロンの送達を達成し得る。他の実施形態では、分化したＤＡニューロンは、等張賦形剤
を含む医薬組成物中で投与される。本医薬組成物は、ヒト投与のために十分に無菌的な条
件下で調製される。
当業者により認められるように、分化したＨＩＰ派生物は、細胞タイプ及びこれらの細
胞の最終的な用途の両方に依存する当技術分野で公知の技術を使用して移植されるか又は
植え込まれる。一般に、患者の特定の位置に本発明の分化したＨＩＰ細胞を移植又は注入
する。特定の位置に移植した場合、それらが定着する一方で分散を防ぐために細胞をゲル
マトリクス中で懸濁し得る。
ＸＩ．ＨＩＰ細胞由来の低免疫膵島細胞
一部の実施形態では、膵島細胞（膵臓ベータ細胞とも呼ばれる）は本明細書中に記載の
ＨＩＰ細胞由来である。例えば、ヒトＨＩＰ細胞を分化させることによりヒト膵島細胞を
作製し得る。同様に，マウスＨＩＰ細胞分化させることによりマウス膵島細胞を作製し得
る。このような膵島細胞は低免疫膵島細胞である。
一部の実施形態では、膵島細胞は、本明細書中に記載のＨＩＰ細胞由来である。膵島細
胞への多能性幹細胞の分化に有用な方法は、例えば米国特許第９，６８３，２１５号明細
書、同第９，１５７，０６２号明細書及び同第８，９２７，２８０号明細書に記載される
。
一部の実施形態では、本明細書中で開示されるような方法により作製される膵島細胞は
インスリンを分泌する。一部の実施形態では、膵島細胞は、例えば限定されないがグルコ
ースに応答したインスリン分泌及びベータ細胞マーカーの発現など、内在性膵島細胞の少
なくとも２つの特徴を示す。
代表的なベータ細胞マーカー又はベータ細胞前駆マーカーとしては、ｃ－ペプチド、Ｐ
ｄｘ１、グルコース輸送担体２（Ｇｌｕｔ２）、ＨＮＦ６、ＶＥＧＦ、グルコキナーゼ（
ＧＣＫ）、プロホルモンコンバターゼ（ＰＣ１／３）、Ｃｄｃｐ１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｎｇ
ｎ３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ６．２、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、Ｐｔｆｌａ、
Ｉｓｌ１、Ｓｏｘ９、Ｓｏｘ１７及びＦｏｘＡ２が挙げられるが限定されない。
一部の実施形態では、単離膵島細胞は、グルコース上昇に応答してインスリンを産生す
る。様々な実施形態では、単離膵島細胞は、グルコース上昇に応答してインスリンを分泌
する。一部の実施形態では、細胞は、玉石細胞形態及び／又は約１７μｍ～約２５μｍの
直径などの個別の形態を有する。
一部の実施形態では、低免疫膵島細胞にＨＩＰ細胞を分化させる方法は、ＦＧＦ１０を
含む培地中でＨＩＰ幹細胞を培養することを含む。一部の例では、培地は、角化細胞増殖
因子（ＫＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子－α（ＴＧＦ
α）、トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦβ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、Ｗ
ｎｔ３ａ、アクチビンＡ、Ｎｏｄａｌ、ＫＡＡＤ－ＣＹＣ、（塩基性線維芽細胞増殖因子
（ｂＦＧＦ）、ニコチンアミド、インドラタム（ｉｎｄｏｌａｔａｍ）Ｖ、ＨＤＡＣ阻害
剤、ＩＤＥ１及びＩＤＥ２からなる群から選択される１つ以上の分化因子を含む。一部の
実施形態では、次の：インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子
（ＴＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子
（ＨＧＦ）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）及び血管内皮胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ト
ランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦβ）スーパーファミリー、骨形成タンパク質－
２（ＢＭＰ２）、骨形成タンパク質－７（ＢＭＰ７）、ＧＳＫ３β阻害剤、ＡＬＫ阻害剤
、ＢＭＰ１型受容体阻害剤、レチノイン酸及び何らかのそれらの組み合わせのうち１つ以
上を含む培地中で細胞を培養することにより、ＨＩＰ細胞を膵島細胞に分化させ得る。
一部の実施形態では、単独で本明細書中で記載のように、低免疫多能性幹細胞（ＨＩＰ
細胞）集団を式（Ｉ）の化合物の１つ以上、例えばＩＤＥ１又はＩＤＥ２に接触させ得る
か又は曝露し得、他の実施形態では、多能性幹細胞集団は、米国特許第８，９２７，２８
０号明細書に開示されるような式（Ｉ）の化合物と多能性細胞を接触させるのと同時に（
例えばそれと組み合わせて）、それに続いて又はその前の何れかで、少なくとも１個のさ
らなる物質と接触させ得る。
一部の実施形態では、米国特許第８，９２７，２８０号明細書で開示されるような式（
Ｉ）の化合物と組み合わせた使用のためのさらなる化合物としては、トランスフォーミン
グ増殖因子－β（ＴＧＦβ）ファミリーメンバー（例えばＮｏｄａｌ又はアクチビンＡ）
、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーメンバー（例えばＦＧＦ１０）、Ｗｎｔ増殖
因子ファミリーメンバー（例えばＷｎｔ３ａ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及び／又は
ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路のメンバーの物質が挙げられ得るが限定されない。ＴＧＦ－ベータ
３／ＢＭＰ経路の定義及び詳細は、当技術分野、例えばＫａｗａｂａｔａ Ｍ．及びＭｉ
ｙａｚｏｎｏ Ｋ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），１２５，９－１６（１９９
９）；Ｗｒａｎａ Ｊ．Ｌ．，Ｍｉｎｅｒ．Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ Ｍｅｔａｂ．，２
４，１２０－１３０（１９９８）；及びＭａｒｋｏｗｉｔｚ Ｓ．Ｄ．及びＲｏｂｅｒｔ
ｓ Ａ．Ｂ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．，７，９３－
１０２（１９９６）で開示される。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、シクロパミン
、ＴＧＦファミリーメンバー（ＴＧＦ－アルファ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＴＧＦ
－β－１、ＴＧＦ－ベータ－３）、エキセンディン４、ニコチンアミド、ｎ－ブチラート
、ＤＭＳＯ、全トランス型レチノイン酸、ＧＬＰ－Ｉ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－２、
ＢＭＰ－５、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－７）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ－Ｉ、ＩＧＦ－
ＩＩ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ４）、他の増殖
因子（ＥＧＦ、ベータセルリン、成長ホルモン、ＨＧＦ）、他のホルモン（プロラクチン
、コレシトキニン（ｃｈｏｌｅｃｙｔｏｋｉｎｉｎ）、ガストリンＩ、胎盤性ラクトゲン
）、ＴＧＦ－βファミリーアンタゴニスト（ノギン、フォリスタチン、コーディン）、Ｉ
ＢＭＸ、ワートマニン、デキサメタゾン、Ｒｅｇ、ＩＮＧＡＰ、ｃＡＭＰ又はｃＡＭＰ活
性化因子（フォルスコリン）及び／又は細胞外マトリクス構成成分（ラミニン、フィブロ
ネクチン）を含むが限定されない、少なくとも１つのさらなる化合物又は因子と組み合わ
せて式（Ｉ）の化合物、例えばＩＤＥ１及び／又はＩＤＥ２、に曝露され得る。
一部の実施形態では、細胞を膵島細胞に分化させるために、ＨＩＰ細胞を少なくとも１
つのヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤（例えばクラスＩ／ＩＩ ＨＤＡＣ阻害
剤）と接触させる。ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、アセチル基をヒストンにお
いてｅ－Ｎ－アセチルリジンアミノ酸から除去する酵素のクラスである。代表的なＨＤＡ
Ｃとしては、クラスＩ ＨＤＡＣ：ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８；
及びクラスＩＩ ＨＤＡＣ：ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７Ａ、ＨＤ
ＡＣ９、ＨＤＡＣ１０が挙げられる。Ｉ型哺乳動物ＨＤＡＣとしては、ＨＤＡＣ１、ＨＤ
ＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８及びＨＤＡＣ１１が挙げられる。ＩＩ型哺乳動物ＨＤＡ
Ｃとしては、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９及びＨＤＡ
Ｃ１が挙げられる。
多くのＨＤＡＣの負の制御因子の構造クラス（例えばＨＤＡＣ阻害剤）が開発され、例
えば低分子量カルボキシラート（例えば約２５０ａｍｕ未満）、ヒドロキサミン酸、ベン
ズアミド、エポキシケトン、環状ペプチド及びハイブリッド分子である（例えばその全体
において参照により本明細書によって組み込まれるＤｒｕｍｍｏｎｄ Ｄ Ｃ，Ｎｏｂｌ
ｅ Ｃ Ｏ，Ｋｉｒｐｏｔｉｎ Ｄ Ｂ，Ｇｕｏ Ｚ，Ｓｃｏｔｔ Ｇ Ｋ，ｅｔ ａｌ
．（２００５）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄ
ｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｓ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎ
ｔｓ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ４５：４９５－５２８
，（本明細書中の具体例を含む）を参照）。Ｉ／ＩＩ型ＨＤＡＣの負の制御因子の非限定
例としては、ヒドロキサム酸スベロイルアニリド（ＳＡＨＡ（例えばＭＫ０６８３、ボリ
ノスタット）及び他のヒドロキサム酸）、ＢＭＬ－２１０、デプデシン（例えば，（－）
－デプデシン）、ＨＣトキシン、Ｎｕｌｌｓｃｒｉｐｔ（４－（１，３－ジオキソ－１Ｈ
，３Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン－２－イル）－Ｎ－ヒドロキシブタンアミド）、フ
ェニルブチラート（例えばフェニル酪酸ナトリウム）及びバルプロ酸（（ＶＰＡ）及び他
の短鎖脂肪酸）、スクリプタイド、スラミンナトリウム、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、
ＡＰＨＡ化合物８、アピシジン、酪酸ナトリウム、酪酸ピバロイルオキシメチル（Ｐｉｖ
ａｎｅｘ、ＡＮ－９）、トラポキシンＢ、クラミドシン、デプシペプチド（ＦＲ９０１２
２８又はＦＫ２２８としても知られる）、ベンズアミド（例えばＣＩ－９９４（即ちＮ－
アセチルジナリン）及びＭＳ－２７－２７５）、ＭＧＣＤ０１０３、ＮＶＰ－ＬＡＱ－８
２４、ＣＢＨＡ（ｍ－カルボキシケイ皮酸ビスヒドロキサミン酸）、ＪＮＪ１６２４１１
９９、ツバシン、Ａ－１６１９０６、プロキサミド、オキサムフラチン、３－Ｃｌ－ＵＣ
ＨＡ（即ち６－（３－クロロフェニルウレイド）カプロンヒドロキサム酸）、ＡＯＥ（２
－アミノ－８－オキソ－９，１０－エポキシデカン酸）、ＣＨＡＰ３１、ＣＨＡＰ５０、
ＩＤＥ１及びＩＤＥ２が挙げられる。他の阻害剤としては、例えばＨＤＡＣのドミナント
ネガティブ形態（例えば触媒的に不活性な形態）、ＨＤＡＣのｓｉＲＮＡ阻害剤及びＨＤ
ＡＣに特異的に結合する抗体が挙げられる。阻害剤は、例えばＢＩＯＭＯＬ Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ、Ｆｕｋａｓａｗａ、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｖａ
ｒｔｉｓ、Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ａｔｏｎ Ｐｈａ
ｒｍａ、Ｔｉｔａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ、Ｐｈ
ａｒｍｉｏｎ、ＭｅｔｈｙｌＧｅｎｅ及びＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されてい
る。一部の実施形態では、ＩＤＥ１又はＩＤＥ２は好ましいヒストンデアセチラーゼ阻害
剤である。
例えば細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の１つ又は複数の構成成分とＨＩＰ細胞の単層を重
ねて接触させることにより、ＨＩＰ細胞の分化を達成し得る。一部の実施形態では、ラミ
ニン、例えばラミニン１；コラーゲン、例えばコラーゲンＩＶ；エンタクチン；ヘパリン
硫酸プロテオグリカン；ナイドジェンの１つ以上である細胞外マトリクス構成成分とＨＩ
Ｐ細胞の層を接触させる。細胞外マトリクス構成成分は、基底膜由来物質、例えば、細胞
、例えば腫瘍細胞、例えばＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）腫瘍
細胞、が沈着した基底膜であり得る。一部の実施形態では、細胞外マトリクス構成成分は
、Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎから市販されているマトリゲル（商標）である。細
胞外構成成分は、１つ以上の増殖因子、１つ以上のマトリクスメタロプロテイナーゼ（Ｍ
ＭＰ）、例えばＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３及びそれらの組み合わせをさらに含み得る。
少なくとも１、２、３、５、７、１０、１２、１４、１６、１８、２１、２５、２８、
３０、３５、４０、４２、４８、５０日又はそれを超える期間にわたり、細胞外マトリク
ス又は細胞外マトリクスの１つ又は複数の構成成分の存在下でＨＩＰ細胞を培養し得る。
一部の実施形態では、ＨＩＰ由来膵島細胞は、患者、例えばそれを必要とするヒト患者
に投与され得る。一部の例では、患者は、このような細胞を使用して処置され得る疾患、
障害又は状態を有する。言い換えると、ＨＩＰ由来膵島細胞の投与は、当技術分野で周知
のように、インスリン代謝に付随する少なくとも１つの有害作用又は症状を軽減又は緩和
し得る。一部の実施形態では、患者は、インスリン機能異常のためにグルコース利用が異
常である疾患を含み得る不十分なインスリン活性を特徴とする疾患を有する。インスリン
機能異常は、インスリン産生（例えば発現及び／又は細胞小器官を通じた輸送、例えばβ
細胞喪失の結果起こるインスリン欠乏など）；分泌（例えばインスリン分泌応答の障害）
；インスリン分子そのものの形態（例えば一次、二次又は三次構造）；標的細胞における
インスリンの効果（例えば末梢組織を含む体の組織でのインスリン抵抗性）；及びインス
リンに対する標的細胞の応答における何らかの異常性又は機能障害を含み得る。
対象、特にヒト対象に膵島細胞を投与する一般的方法が本明細書中に記載されている。
例えば、対象における標的部位への細胞の注入又は移植によって膵島細胞を対象に投与し
得る。さらに、対象において細胞の注入又は移植により導入を促進する送達装置に細胞を
挿入し得る。このような送達装置としては、チューブ、例えばレシピエント対象の身体に
細胞及び液体を注入するためのカテーテルが挙げられる。好ましい実施形態では、チュー
ブはさらに、対象に所望の位置で本発明の細胞が導入され得る針、例えばシリンジを有す
る。異なる形態で、このような送達装置、例えばシリンジに膵島細胞を挿入し得る。例え
ば、このような送達装置中に含有される場合、溶液中で細胞を懸濁し得るか又は支持マト
リクス中に埋め込まれ得る。
本明細書中で使用される場合、「溶液」という用語は、本発明の細胞が生存可能なまま
である薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含む。薬学的に許容可能な担体及び希釈剤と
しては、生理食塩水、水性緩衝液、溶媒及び／又は分散媒体が挙げられる。このような担
体及び希釈剤の使用は当技術分野で周知である。溶液は好ましくは、無菌性であり、細胞
及び溶液をシリンジに通し得る程度に流動性である。一部の実施形態では、溶液は、製造
及び保管の条件下で安定であり、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アス
コルビン酸、チメロサールなどの使用を通じて細菌及び真菌などの微生物の混入作用から
防御される。このような溶液は、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤中で本明細書中に記
載の膵島細胞を組み込み、続いて滅菌ろ過することにより調製され得る。
膵島細胞が組み込まれ得るか又は埋め込まれ得る支持マトリクスとしては、レシピエン
ト適合性であり、レシピエントにとって有害ではない生成物に分解するマトリクスが挙げ
られる。天然及び／又は合成生体分解性マトリクスは、このようなマトリクスの例である
。天然の生体分解性マトリクスとしては、例えば哺乳動物由来の凝固血漿及びコラーゲン
マトリクスが挙げられる。合成の生体分解性マトリクスとしては、ポリ酸無水物、ポリオ
ルトエステル及びポリ乳酸などの合成ポリマーが挙げられる。合成ポリマーの他の例及び
細胞をマトリクスに組み込むか又は埋め込む方法は当技術分野で公知である。例えば米国
特許第４，２９８，００２号明細書及び同第５，３０８，７０１号明細書を参照。マトリ
クスは、インビボで脆弱な膵臓細胞に対する支持及び／又は保護を提供する。
当業者により認められるように、細胞タイプ及びこれらの細胞の最終的用途の両方に依
存する当技術分野で公知の技術を使用して、分化したＨＩＰ派生物を移植するか又は植え
込む。一般に患者の特定の位置に本発明の分化したＨＩＰ細胞を移植又は注入する。特定
の位置に移植した場合、それらが定着する一方で分散を防ぐためにゲルマトリクス中で細
胞を懸濁し得る。
ＸＩＩ．ＨＩＰ細胞由来の低免疫網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞
一部の実施形態では、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞は、本明細書中に記載のＨＩＰ細胞
由来である。例えばヒトＲＰＥ細胞は、ヒトＨＩＰ細胞を分化させることにより作製し得
る。同様にマウスＲＰＥ細胞はマウスＨＩＰ細胞を分化させることにより作製し得る。こ
のようなＲＰＥ細胞は低免疫ＲＰＥ細胞である。
本明細書中に記載のＨＩＰ細胞は、ＲＰＥ祖先細胞、未熟ＲＰＥ細胞、成熟ＲＰＥ細胞
及び機能的ＲＰＥ細胞を含む網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に分化し得る。
胚性多能性幹細胞をＲＰＥ細胞に分化させるための有用な方法は、例えば米国特許第９
，４５８，４２８号明細書及び同第９，８５０，４６３号明細書に記載され、それらの全
体における開示は、明細書を含め、参照により本明細書中に組み込まれる。ヒト胚又は誘
導多能性幹細胞からＲＰＥ細胞を作製するためのさらなる方法は、例えばＬａｍｂａ ｅ
ｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００６，１０３（３４）：１２７６９－１２７７４；Ｍｅｌｌ
ｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２０１２，３０（４）：６７３－６８
６；Ｉｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２００９，５（４
）：３９６－４０８；Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ
ｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１２，２２７（２）：４５７－４６６，Ｂｕｃｈ
ｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ，２０１３，２（
５）：３８４－３９３及びｄａ Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２
０１８，３６：３２８－３３７で見出され得る。
「ＲＰＥ」細胞という用語は、ネイティブＲＰＥ細胞と同様又は実質的に同様である遺
伝子発現プロファイルを有する色素網膜上皮細胞を指す。多能性幹細胞由来のこのような
ＲＰＥ細胞は、平面基質上で密集するまで増殖させる場合、ネイティブＲＰＥ細胞の多角
形の平面シート形態を保持し得る。
増殖培地中でＨＩＰ細胞及びＨＩＰ細胞由来のＲＰＥ細胞を培養し得る。例示的な増殖
培地としては、Ｘ－ＶＩＶＯ １０（商標）（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、
Ｘ－ＶＩＶＯ １５（商標）（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＭＴＥＳＲ２（
商標）（幹細胞技術）、ＮＵＴＲＩＳＴＥＭ（商標）（ＳｔｅｍＧｅｎｔ）及びＨＥＳＣ
ＧＲＯ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が挙げられるが限定されない。５～４０％ゼノフ
リーＫｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＸＦ－ＫＯＳＲ（商標）
、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補給したＬｏｎｚａ Ｘ－ＶＩＶＯ １０（商標）、ＭＸ－
３０２（Ｂ－２７サプリメント入りのイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ））、Ｅｓ
ｓｅｎｔｉａｌ ８（商標）培地、ダルベッコ改変イーグル培地哺乳動物細胞培地（ＤＭ
ＥＭ）、ハムＦ１２培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、最少必須培地イー
グル（ＭＥＭ）、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培
地１６４０（ＲＰＭＩ－１６４０）、ＭＣＤＢ培地など。
ＲＰＥ細胞の分化、増殖、拡大、維持及び／又は成熟を促進する有用な添加物としては
、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤（例えばＬＤＮ－１９３１８９、ドルソモルフィン、コー
ディン、セルブルス（ｃｅｒｂｕｒｕｓ）及びノギン）、ＷＮＴシグナル伝達の阻害剤（
例えばＤｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質（ＤＫＫ１）、ＩＷＰ－２、ＩＷＰ－３、ＩＷＰ
－４、ＸＡＶ９３９、デクリーテッド（ｄｅｃｒｅｔｅｄ）ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパ
ク質（ＳＦＲＰ１及びＳＦＲＰ２）及びＷｎｔ阻害因子１（ＷＩＦ－１））、ＦＧＦシグ
ナル伝達の阻害剤（例えばＳＵ５４０２、ＡＺＤ４５４７及びＰＤ１７３０７４）、イン
スリン様増殖因子（ＩＧＦ１）、ニコチンアミド、安息香酸、３－アミノ安息香酸、６－
アミノニコチンアミド、ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の阻害剤（
例えば３－アミノベンズアミド、イニパリブ（ＢＳＩ ２０１）、オラパリブ（ＡＺＤ－
２２８１）及びルカパリブ（ＡＧ０１４６９９、ＰＦ－０１３６７３３８）、ベリパリブ
（ＡＢＴ－８８８）、ＣＥＰ９７２２、ＭＫ４８２７及びＢＭＮ－６７３）、ＲＯＣＫ阻
害剤（例えばＹ－２７６３２、チアゾビビン、ＧＳＫ４２９２８６Ａ及びファスジル）、
塩基性線維芽細胞増殖因子１（ｂＦＧＦ１）、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４
、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＳＵＮ１３８３７
、Ｆ２Ａ４－Ｋ－ＮＳ、トリコスタチンＡ、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビン
Ｂ、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－７、ＴＧＦ－β１、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）、フォル
スコリン、ロリプラム、Ｂ－２７サプリメント、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐ
ｌａｃｅｍｅｎｔ、Ｎ２サプリメント、タウリン、プロゲステロン、ビタミンＡ、ブレビ
スタチン、その修飾形態、その模倣物、その類似体及びその変異体が挙げられるが限定さ
れない。分化プロトコール及びその詳細な説明は、例えばそれらの全体におけるその開示
が発明を実施するための形態、実施例、方法、オンライン法及び結果を含め、本明細書中
に参照により組み込まれる、米国特許第９，４５８，４２８号明細書及び同第９，８５０
，４６３号明細書及びｄａ Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０１
８，３６：３２８－３３７で提供される。
一部の実施形態では、低免疫ＲＰＥ細胞を分化させるか、増殖させるか又は細胞培養基
質上に固定化する。代表的な細胞培養基質は、次のもの、マトリゲル（商標）（Ｃｏｒｎ
ｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの一般的に使用される基質、マウス胚性線維
芽細胞フィード細胞層、ヒト胚性線維芽細胞、ヒト卵管上皮又はヒト包皮線維芽細胞フィ
ーダー層である。Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ）、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＧＥＬｓｔａｒｔ（
商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＳｔｅｍＡｄｈｅｒｅ（商標）（Ｐｒｉｍｏｒｉｇ
ｅｎ）などであるが限定されない、ゼノフリー基質も使用され得る。さらなる細胞培養基
質は、精製ヒトビトロネクチン、組み換えヒトビトロネクチン、組み換えヒトフィブロネ
クチン（例えばＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）；Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）、精製ヒ
トラミニン、組み換えラミニン、組み換えラミニン５１１、組み換えラミニン５２１、ポ
リ－Ｄ－リジンなどを含むものの１つ以上を含み得る。
ある一定の実施形態では、ＲＰＥ細胞を合成基質などの生体適合性基質上に分化、増殖
又は固定させる。非限定基質としては、ポリマー性基質、ポリエステル膜、ポリエチレン
テレフタラート（ＰＥＴ）膜、ポリ（ＤＬ－乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）膜、
延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）膜、ポリカプロラクトン膜、メチルメタ
クリラート及びポリ（エチレングリコール）から作製されるエレクトロスピニング人工足
場などが挙げられる。代表的な基質は、例えばその全体における開示が本明細書中で参照
により組み込まれる米国特許第８，８０８，６８７号明細書に記載される。基質のための
適切な材料の代表例としては、パリレンポリプロピレン、ポリイミド、ガラス、ニチノー
ル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、コラーゲン、化学的に処理したコラ
ーゲン、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリ（グリセロール－セバシン酸）ＰＧＳ、
ポリ（スチレン－イソブチル－スチレン）、ポリウレタン、エチル酢酸ビニル（ＥＶＡ）
、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、Ｋｙｎａｒ（ポリビニリデンフルオリド；
ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリメチルメタクリラート（Ｐ
ＭＭＡ）、Ｐｅｂａｘ、アクリリック、ポリオレフィン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤ
ＭＳ）及び他のシリコーンエラストマー、ポリプロピレン、ヒドロキシアペタイト（ｈｙ
ｄｒｏｘｙａｐｅｔｉｔｅ）、チタン、金、銀、白金、他の金属及び合金、セラミック、
プラスチック及びそれらの混合物又は組み合わせが挙げられるが限定されない。基質を構
築するために使用されるさらなる適切な材料としては、ポリ－パラ－キシレン（例えばパ
リレンＡ、パリレンＡＭ、パリレンＣ、アンモニア処理パリレン、ポリドーパミンで処理
したパリレンＣを含むが限定されないパリレン）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリエチレ
ン－酢酸ビニル、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチ
ド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－トリメチレンカーボネート）、コラーゲン、ヘパリ
ン処理コラーゲン、変性コラーゲン、修飾コラーゲド（ｃｏｌｌａｇｅｄ）（例えばゼラ
チンを伴うシリコーン）、他の細胞増殖マトリクス（ＳＹＮＴＨＥＭＡＸ（商標）など）
、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（グリコール酸）及び／又は他のポリマー、コポリマー
又はブロックコポリマー、環状アルギニン－グリシン－アスパラギンを含有するポリ（カ
プロラクトン）、環状又は直鎖状アルギニン－グリシン－アスパラギン酸、ポリカプロラ
クトン及びポリエチレングリコールのブレンド物（ＰＣＬ－ＰＥＧ）、熱可塑性ポリウレ
タン、シリコーン修飾ポリエーテルウレタン、ポリ（カーボネートウレタン）又はポリイ
ミドが挙げられるが限定されない。代表的な熱可塑性ポリウレタンは、脂肪族ポリウレタ
ン、芳香族ポリウレタン、ポリウレタンハイドロゲル形成物質、親水性ポリウレタン又は
それらの組み合わせを含み得るポリマー又はコポリマーである。非限定例としては、エラ
スタン（ポリ（エーテルウレタン））、例えばエラスタン（商標）８０Ａ、Ｌｕｂｒｉｚ
ｏｌ、Ｔｅｃｏｐｈｉｌｉｃ．（商標）、Ｐｅｌｌｅｔｈａｎｅ（商標）、Ｃａｒｂｏｔ
ｈａｎｅ（商標）、Ｔｅｃｏｔｈａｎｅ（商標）、Ｔｅｃｏｐｌａｓｔ（商標）及びＥｓ
ｔａｎｅ（商標）などが挙げられる。シリコーン修飾ポリエーテルウレタンとしては、Ｃ
ａｒｂｏｓｉｌ（商標）２０又はＰｕｒｓｉｌ（商標）２０ ８０Ａなどが挙げられ得る
。ポリ（カーボネートウレタン）としては、Ｂｉｏｎａｔｅ（商標）８０Ａ又は同様のポ
リマーが挙げられ得る。
一部の実施形態では、基質は生体分解性である。他の実施形態では、基質は非生体分解
性である。特定の実施形態では、基質は、１つ以上の生体分解性構成成分及び１つ以上の
非生体分解性構成成分を含む。
ＲＰＥ分化の特徴を調べ、監視し、ＲＰＥ表現型を評価するために、分子及び遺伝子マ
ーカーのいくつかの数の発現を評価し得る。例えば、当業者にとって公知の様々な方法に
より、遺伝子マーカーの存在を判定し得る。ｑＰＣＲに基づくアッセイ、免疫アッセイ、
免疫細胞化学アッセイ、免疫ブロッティングアッセイなどであるが限定されない定量法に
より分子マーカーの発現を判定し得る。
ＲＰＥ細胞に対する代表的なマーカーとしては、ペアードボックスタンパク質（Ｐａｘ
６）、Ｒａｘホメオボックスタンパク質（Ｒａｘ）、ＬＩＭ／ホメオボックスタンパク質
２（Ｌｈｘ２）、ホメオボックスタンパク質ＳＩＸ３、チロシナーゼ酵素（ＴＹＲ）、小
眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）、細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢ
Ｐ）、トリプシン－１（陽イオン性トリプシノーゲン、ＴＹＲＰ１）、トリプシン－２（
陰イオン性トリプシノーゲン、ＴＹＲＰ２）、プレメラノソームタンパク質（ＰＭＥＬ１
７）、シルバー遺伝子座タンパク質相同体（ＳＩＬＶ）、ｃｅｈ－１０ホメオドメイン含
有相同体（Ｃｈｘ１０）、ベストロフィン－１（ＢＥＳＴ）及び網膜色素上皮特異的な６
５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）が挙げられる。
ＲＰＥ細胞はまた、細胞生理学的マーカー及び形態学的マーカーによっても評価し得る
。細胞の形態を調べるために、免疫細胞化学及び電子顕微鏡を使用し得る。当業者にとっ
て公知の機能アッセイを使用してＲＰＥ細胞を評価し得る。例えば、ＨＩＰ細胞由来のＲ
ＰＥ細胞の特徴を調べるために、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）分泌プロファイリング、
杆体外節（ＲＯＳ）食作用アッセイ、１１－シスレチノールへのトランスレチノール変換
に対するアッセイ、増殖因子の極性分泌を調べるためのアッセイ及び電子障壁を作るタイ
トジャンクションを検出するためのアッセイを使用し得る。
分化の一部の実施形態では、多能性幹細胞は神経誘導を受け、１つ以上の網膜前駆細胞
マーカー、Ｐａｘ６、Ｒａｘ、Ｌｈｘ２、Ｓｉｘ３又は何らかの他の分子、神経誘導の生
理学的又は形態学的マーカーを発現する。他の実施形態では、分化している細胞は、ＲＰ
Ｅ特異化を受け、及び／又はロゼット構造を形成する。細胞が分化し続けているので、ロ
ゼット構造は平坦になり未熟ＲＰＥ細胞の層又はシートになり得る。未熟ＲＰＥ細胞の層
は、多角形及び／又は六角形の形状の平面状の細胞を含み得る。
一部の実施形態では、低免疫ＲＰＥを、必要とする患者に移植する。黄斑変性罹患患者
又はＲＰＥ細胞損傷患者にＲＰＥ細胞を移植し得る。一部の実施形態では、患者は、加齢
性黄斑変性（ＡＭＤ）、早期ＡＭＤ、中期ＡＭＤ、後期ＡＭＤ、非血管新生加齢性黄斑変
性、萎縮型黄斑変性（萎縮型加齢性黄斑変性）、滲出型黄斑変性（滲出型加齢性黄斑変性
）、若年性黄斑変性（ＪＭＤ）（例えばシュタルガルト病、ベスト病及び若年性網膜分離
症）、レーバー先天黒内障又は網膜色素変性症を有する。他の実施形態では、患者は網膜
剥離に罹患している。
必要とする患者に移植され得るＲＰＥパッチを作製するために、本明細書中に記載の基
質の何れかにＲＰＥ細胞を固定化し得る。ＲＰＥ細胞の１つ以上の層を含むパッチを眼の
組織に外科手術により投与するか又は送達し得る。一部の例では、神経網膜又は網膜下の
空間にパッチを送達する。ある一定の実施形態では、内視鏡により、カテーテルに基づく
方法を介して、血管内に、筋肉内に、又は特定の眼組織のための当技術分野で公知の他の
手段により、パッチを送達する。パッチの配置は、立体生物顕微鏡、眼底写真、スペクト
ルドメイン光干渉断層撮影（ＳＤ－ＯＣＴ）及び当業者により認められる他の方法を使用
して決定され得る。
当業者により認められるように、細胞タイプ及びこれらの細胞の最終的用途の両方に依
存する当技術分野で公知の技術を使用して、分化したＨＩＰ派生物を移植するか又は埋め
込む。一般に、患者の特定の位置に本発明の分化したＨＩＰ細胞を移植又は注入する。特
定の位置に移植する場合、それらが定着する一方で分散することを防ぐために、ゲルマト
リクス中で細胞を懸濁し得る。
本明細書中に記載の本発明がより詳細に理解され得るように、次の実施例を説明する。
これらの実施例は単なる例示目的であり、何ら本発明を限定するものとして解釈されるも
のではないことを理解されたい。
ＸＩＩＩ．実施例
実施例１：マウス誘導多能性幹細胞の作製
本明細書中に記載の方法の出典はＤｉｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，２０
１５，８０８１である。
マウスのマウス尾部先端の線維芽細胞を分離し、ＩＶ型コラゲナーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）で単離し、１０％胎
児ウシ血清（ＦＢＳ）、Ｌ－グルタミン、４．５ｇ／Ｌグルコース、１００Ｕ／ｍＬペニ
シリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地
（ＤＭＥＭ）とともに、加湿インキュベーター中、３７℃、２０％Ｏ２及び５％ＣＯ２で
維持した。
次にＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ系を使用し、４個の初期化因子、Ｏｃｔ４、
ＫＬＦ４、Ｓｏｘ２及びｃ－Ｍｙｃを発現する新規コドン最適化ミニイントロン（ｍｉｎ
ｉ－ｉｎｔｒｏｎｉｃ）プラスミド（ｃｏ－ＭＩＰ）（ＤＮＡ１０～１２μｍ）を使用し
て、１ｘ１０６個のマウス線維芽細胞を初期化した。遺伝子移入後、マウス胚性線維芽細
胞（ＭＥＦ）フィーダー層上に線維芽細胞を播種し、酪酸ナトリウム（０．２ｍＭ）及び
５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸の添加により線維芽細胞培地中で維持した。
ＥＳＣ様コロニーが出現したとき、ＤＭＥＭ、２０％ＦＢＳ、Ｌ－グルタミン、非必須
アミノ酸（ＮＥＡＡ）、β－メルカプトエタノール及び１０ｎｇ／ｍＬ白血病阻害因子（
ＬＩＦ）を含有するマウスｉＰＳＣ培地に培地を変えた。２回の継代後、マウスｉＰＳＣ
を０．２％ゼラチンコーティングプレートに移し、さらに増殖させた。全ての継代で、磁
気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を使用して、マウス多能性マーカーＳＳＥＡ－１について
ｉＰＳＣを選別した。
上記方法によりマウス低免疫原性ｉＰＳＣを作製するために単離マウスｉＰＳＣを使用
し得る。
実施例２：ヒト誘導多能性幹細胞の作製
Ｇｉｂｃｏ（商標）ヒトエピソームｉＰＳＣ株（カタログ番号Ａ１８９４５、Ｔｈｅｒ
ｍｏＦｉｓｈｅｒ）は、３プラスミド、７因子（ＳＯＫＭＮＬＴ；ＳＯＸ２、ＯＣＴ４（
ＰＯＵ５Ｆ１）、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８及びＳＶ４０Ｌ Ｔ抗原）
ＥＢＮＡに基づくエピソーム系を使用して、ＣＤ３４＋臍帯血から得た。このｉＰＳＣ株
は、初期化事象からのゲノムへの組み込みがなかったので、ゼロフットプリント（ｚｅｒ
ｏ ｆｏｏｔ－ｐｒｉｎｔ）であるとみなされる。全ての初期化遺伝子不含であることが
示された。ヒトｉＰＳＣを凍結融解し、培養し、継代するためのプロトコールは製品マニ
ュアルで提供される。
インビボ奇形腫アッセイ及びインビトロ多能性遺伝子発現アッセイ（例えばＰＣＲ及び
アレイ）によって又は多能性マーカーに対する蛍光染色によってヒトｉＰＳＣの多能性を
判定し得る。
Ｇｉｂｃｏ（商標）ヒトエピソームｉＰＳＣ株は、正常な核型及び、ＯＣＴ４、ＳＯＸ
２及びＮＡＮＯＧ（ＲＴ－ＰＣＲにより示されるように）及びＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、Ｔ
ＲＡ－１－６０及びＴＲＡ－１－８１（ＩＣＣにより示されるように）のような多能性マ
ーカーの内在性発現を有する。全ゲノム発現及びエピジェネティックプロファイリング分
析から、このエピソームｈｉＰＳＣ株がヒト胚性幹細胞株とは分子的に区別できないこと
が示される（Ｑｕｉｎｔａｎｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，２０１４，９
（１）：ｅ８５４１９）。定方向分化及び奇形腫分析で、これらのｈｉＰＳＣは外胚葉性
、内胚葉性及び中胚葉性の系列に対するそれらの分化能を保持した（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ
ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１１，６（４）：ｅ１８２９３）。さらに血管、
造血系、神経及び心臓系列が安定的な効率で導かれた（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．
，上出）。
上記方法によりヒト低免疫原性ｉＰＳＣ（ＨＩＰ細胞）を作製するために単離ヒトｉＰ
ＳＣを使用し得る。
実施例３：低免疫原性多能性細胞は、ＮＫ細胞殺傷及びマクロファージ食作用に対してよ
り感受性が低かった。
低免疫原性多能性細胞（例えばマウスｂ２ｍ－／－ｃｉｉｔａ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉ
ＰＳＣ及びヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣ）の能力及び免疫
自然応答経路を逃れるための能力を評価するために、実施例を行った。
特に、酵素結合免疫スポット（Ｅｌｉｓｐｏｔ）アッセイを行った。マウスＨＩＰ細胞
又はヒトＨＩＰ細胞（マウスＢ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣ又は
ヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣ）とＮＫ細胞を同時培養し、
ＩＦＮγ放出を測定した（例えばＥｌｉｓｐｏｔプレートリーダーを使用して自然ＩＦＮ
γスポット頻度を測定した）。一部の例において、抗ＣＤ４７抗体を使用することによっ
てＣＤ４７を遮断した。
およそ９５％ＮＫ細胞及び５％マクロファージなどのマウスＮＫ細胞と同時培養したマ
ウスＢ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣは、ＮＫ細胞活性化を刺激で
きなかった（図１）。ＥｌｉｓｐｏｔアッセイにおいてマウスＢ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－
／－ｉＰＳＣは、ＮＫ細胞によるＩＦＮγ放出を惹起し、一方でマウスＢ２ｍ－／－Ｃｉ
ｉｔａ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣは惹起しなかった。ＣＤ４７の遮断（例えば抗ＣＤ
４７抗体の使用）は、マウスＢ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－ｉＰＳＣにおいて効果がなか
った。しかし、ＣＤ４７遮断は、Ｂ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣ
が有した防御を完全に消失させた。ＮＫ細胞を活性化し、従ってＩＦＮγを放出させるこ
とが知られているＹＡＣ－１細胞を対照とした。
ヒトＮＫ細胞と同時培養したヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳ
ＣもＮＫ細胞活性化を刺激できなかった。図２は、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにおいてヒト
Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＰＳＣがＮＫ細胞によるＩＦＮγ放出を惹起し、一方で
ヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣは惹起しなかったことを示す
。ＣＤ４７の遮断は、ヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＰＳＣにおいて効果がなかっ
たが、これはヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣが有した保護を
消失させた。ＮＫ細胞を活性化し、従ってＩＦＮγを放出することが知られているＫ５６
２細胞を対照とした。
図３は、ヒトＮＫ細胞（およそ９５％ＮＫ細胞及び５％マクロファージ）とともに温置
したマウスＢ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣのＥｌｉｓｐｏｔの結
果を示す。マウスＢ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－ｉＰＳＣ及びマウスＢ２ｍ－／－Ｃｉｉ
ｔａ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣは、ヒトＮＫ細胞によるＩＦＮγ放出を惹起した。Ｃ
Ｄ４７の遮断は、ＮＫ細胞応答に対して効果がなかった。ＹＡＣ－１細胞は、ヒトＮＫ細
胞による強いＩＦＮγ放出を誘発し、これを対照とした。
図４は、マウスＮＫ細胞（およそ９５％ＮＫ細胞及び５％マクロファージ）とともに温
置したヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣのＥｌｉｓｐｏｔの結
果を示す。ヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＰＳＣ及びヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ
－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣは、マウスＮＫ細胞によるＩＦＮγ放出を惹起した。ＣＤ
４７の遮断はＮＫ細胞応答に対して効果がなかった。ヒトＫ５６２細胞は、マウスＮＫ細
胞による強いＩＦＮγ放出を誘導し、これを対照とした。
本発明のＨＩＰ細胞がマクロファージ食作用に対して感受性であるか否かを判定するた
めに、マクロファージ食作用アッセイも行った。簡潔に述べると、本明細書中に記載のＨ
ＩＰ細胞を蛍ルシフェラーゼで標識し、マクロファージと同時培養した。ルシフェラーゼ
レポーターアッセイにより、ＨＩＰ細胞の生存能又は存在を分析した。
図５は、ヒトマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼで標識されるヒトＢ２Ｍ
－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。マクロ
ファージと温置した場合、ヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＰＳＣの生存能シグナル
は顕著に減弱した。一方で、ヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣ
の生存能シグナルはヒトマクロファージの存在下で変化しなかった。全てのＨＩＰ細胞を
死滅させたＴｒｉｔｏｎＸ－１００を対照として使用した。ＣＤ４７の遮断によって、ヒ
トＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣの防御特性が排除され、それら
がマクロファージ食作用又は排除に対して感受性になった。
図６は、マウスマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼ標識マウスＢ２ｍ－／
－Ｃｉｉｔａ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。
マクロファージと温置した場合、マウスＢ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－ｉＰＳＣの生存
能シグナルが顕著に低下した。一方で、マウスマクロファージの存在下でマウスＢ２ｍ－
／－Ｃｉｉｔａ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣの生存能シグナルは変化しなかった。全て
のＨＩＰ細胞を死滅させたＴｒｉｔｏｎＸ－１００を対照として使用した。ＣＤ４７の遮
断によって、マウスＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣの保護機能が
排除され、それらがマクロファージ食作用又は排除に対して感受性になった。全てのＨＩ
Ｐ細胞を死滅させたＴｒｉｔｏｎＸ－１００を対照として使用した。
図７は、マウスマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼ標識ヒトＢ２Ｍ－／－
ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。ヒトＢ２Ｍ－
／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＰＳＣ及びヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉ
ＰＳＣの両方の生存能シグナルは、マウスマクロファージと同時培養した場合、顕著に低
下した。全てのＨＩＰ細胞を死滅させたＴｒｉｔｏｎＸ－１００を対照として使用した。
図８は、ヒトマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼ標識マウスＢ２ｍ－／－
Ｃｉｉｔａ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。ヒトマクロフ
ァージと同時培養した場合、マウスＢ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－ｉＰＳＣ及びマウスＢ
２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣの両方の生存能シグナルが顕著に低
下した。全てのＨＩＰ細胞を死滅させたＴｒｉｔｏｎＸ－１００を対照として使用した。
本明細書中で提供される結果から、マウスＢ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－ＣＤ４７ｔｇ
ｉＰＳＣ及びヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣは、ＮＫ細胞
活性化及びマクロファージ食作用など、自然免疫応答を逃れることが可能であったことが
示される。
実施例４：ヒト誘導多能性幹細胞由来の心筋細胞の作製
ヒトＨＩＰ細胞由来心筋細胞（ＣＭ）を作製するための方法を本明細書中で提供する。
代表的な実施形態では、ヒトＨＩＰ細胞を心筋細胞のインビトロ単層に分化させた。本明
細書中に記載の代表的な手順の出典は、その全体において、及び具体的には細胞を分化さ
せるための技術に対して、参照により本明細書によって組み込まれる、Ｓｈａｒｍａ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ，２０１５，９７，ｄｏｉ：１０．３７９１／５２６２
８であった。
６ウェルプレート中で希釈マトリゲル（３５６２３１，Ｃｏｒｎｉｎｇ）上にヒトＨＩ
Ｐ細胞を播種し、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８Ｆｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）
中で維持した。培地を２４時間ごとに交換した。
細胞が９０％～１００％培養密度になった後、分化を開始させ（図１０）、第０日のＣ
Ｍ分化培地から、２％Ｂ－２７マイナスインスリン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１８９
５６０１）及び２μＭ～８μＭ ＣＨＩＲ－９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍ、カ
タログ番号Ｓ１２６３）を含有する５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番
号６１８７０）に交換した。一部の例では、ＣＨＩＲ－９９０２１の濃度は６μＭであっ
た。分化第０日～第２日には培地交換を行わなかった。
第２日（図１１）に、ＣＨＩＲ－９９０２１なしで２％Ｂ－２７マイナスインスリンを
含有するＲＰＭＩ１６４０へとＣＭ分化培地を交換した。細胞を撹拌しないように注意し
た。
第３日（図１２）に、ＣＭ分化培地から、２％Ｂ－２７マイナスインスリン及び５μＬ
ＩＷＲ１（ＷＮＴ阻害剤、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍ、カタログ番号Ｓ７０８６）を含
有するＲＰＭＩ１６４０へと交換した。細胞を撹拌しないように注意した。培地交換した
後、３７℃インキュベーター中で４８時間、細胞を乱さないようにした。分化第３日～第
５日には培地交換を行わなかった。
第５日（図１３）に、培地交換してＣＭ分化培地から２％Ｂ－２７マイナスインスリン
を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に戻し、４８時間温置した。第５日のＣＭ分化培地は、
第２日の培地と同じであった。培地交換後、３７℃インキュベーター中で４８時間、細胞
を乱さないようにした。
第７日（図１４）に、ＣＭ分化培地から、Ｂ２７プラスインスリン（Ｇｉｂｃｏ、カタ
ログ番号１７５０４０４４）を含有するＲＰＭＩ１６４０へと交換し、その後１日ごとに
同じ培地で培地交換した。およそ第８日～第１０日で最初に心筋細胞の自発的拍動が見ら
れた。
分化の１０日後（図１５）、細胞面積の５０％超が拍動した。枝様構造は非常に明白で
あった。一部の例では、細胞は最終分化し、もはや増殖しなかった。細胞が拍動してから
、第７日のＣＭ分化培地中で心筋細胞の培養を維持した。培地を１日おきに交換した。
一部の例では、分化した細胞が拍動しなかった場合又は小さな拍動領域があった場合、
細胞をグルコース飢餓に供した。グルコース飢餓によって非心筋細胞が培養プレートから
剥がれた。分化第１０日に、Ｂ－２７プラスインスリン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１７
５０４０４４）を含有するグルコースなしのＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番
号１１８７９）を含む精製培地へと培地交換した。精製培地中で細胞を３日間にわたり維
持した（分化第１３日まで）。
第１３日に、培養中で心筋細胞を維持するために第７日のＣＭ分化培地へと培地交換し
た。一部の例では、第１４日に精製手順（グルコース飢餓）を反復し、第１７日に培地を
ＣＭ分化培地に交換するようにした。残りの細胞は高度に精製された心筋細胞であった。
第７日の第７日ＣＭ分化培地中で単離及び精製心筋細胞を維持した。培地を１日おきに
交換した。一部の実施形態では、１枚の６ウェルプレートにおいて約１ｘ１０６個の心筋
細胞を播種した。
凍結培地中で拍動する心筋細胞を凍結し、液体窒素中で保管した。一部の例では、凍結
培地は、９０％熱不活性化ＦＣＳ及び１０％ＤＭＣＯ又はゼノフリー同等物を含んだ。凍
結融解後、心筋細胞は拍動し続けた。
図９は分化方法のダイアグラムを提供する。図１０は、分化開始直前のマトリゲル（商
標）上で培養したヒトｉＰＳＣを示す（１００ｘ拡大率）。図１１は、培地交換前の分化
第２日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。単層に細胞が残り、およそ１０％が浮遊細胞で
あった。培地交換前に分化培地が黄色味を帯びた。図１２は、培地交換前の分化第３日の
細胞を示す（１００ｘ拡大率）。単層に細胞が残り、およそ２０％が浮遊細胞であった。
分化第２日と比較して培地の黄色味は少なかった。一部の小胞様構造が単層で見られた。
図１３は、培地交換前、分化第５日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。単層に細胞が残り
、およそ１５％が浮遊細胞であった。心筋細胞は他の細胞クラスターの上に出現した。図
１４は、培地交換前、分化第７日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。単層に細胞が残り、
およそ１５％が浮遊細胞であった。枝様構造が見えた。図１５は、培地交換前、分化第９
日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。拍動する心筋細胞が見え、写真でより暗く見えた。
実施例５：誘導心筋細胞に分化させたマウスＨＩＰ細胞
ｍＨＩＰ細胞をマウス誘導心筋細胞（ｈｍｉＣＭ）に分化させた。分化前に、フィーダ
ー細胞を除去するために、ゼラチンコーティングディッシュ上でｍＨＩＰ細胞及びｍｉＰ
ＳＣを２回継代した。第０日に、コーティングのない１０ｃｍプレートで２日間、ＩＭＥ
Ｍ／ハムＦ１２（３：１、両方ともＣｏｒｎｉｎｇ）＋０．５％Ｎ２－サプリメント、１
％Ｂ２７レチノイン酸、０．０５％ＢＳＡ、１％ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ、１％グルタミン（
Ｇｉｂｃｏ）、５ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸及び４０ｎＬ／ｍＬ ＭＴＧ（両方ともＳｉ
ｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で細胞８０，０００個／ｍＬを用いて分化を開始させた。第
２日に、コーティングのない１０ｃｍプレートにおいて２日間、０．５％Ｎ２－サプリメ
ント、１％Ｂ２７レチノイン酸、０．０５％ＢＳＡ、１％ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ、１％グル
タミン（全てＧｉｂｃｏ）、５ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸及び４０ｎＬ／ｍＬ ＭＴＧ（
Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）入りのＩＭＥＭ／ハムＦ１２（３：１、両方ともＣｏｒｎ
ｉｎｇ）中に細胞を移した。第４日に、１％グルタミン、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸
、５ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ、５００μｇ／ｍＬ ｈＦＧＦｂ及び２５ｎｇ／ｍＬ ｈＦＧ
Ｆ１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有するＳＰ３４培地中でゼラチンコーティング６
ウェルプレートに細胞を播種した。第７日に、１％グルタミン及び５０μｇ／ｍＬアスコ
ルビン酸を含有するＳＰ３４培地へと培地交換し、１日おきに交換した。第１１～１４日
前後に細胞拍動が開始し、それらの機能を示した。
陰性選択のために抗ＣＤ１５ ｍＡｂコーティング磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎ
ｙｉ）を使用して、製造者のプロトコールに従いＭＡＣＳを使用した分離によって細胞を
濃縮した。ｈｉＣＭｓ及びｍｉＣＭを含有するフロースルーを再び播種し、異なるアッセ
イに使用した。Ｇａｔａ４及びＭｈｙ６に対するｒｔＰＣＴによって分化を確認した（図
１６）。Ｇａｔａ４フォワードプライマー（配列番号７は、
５’－ＣＴＧＴＣＡＴＣＴＣＡＣＴＡＴＧＧＧＣＡ－３’
リバースプライマー（配列番号８は、
５’－ＣＣＡＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＡＴＴＴ－３’
Ｍｈｙ６フォワードプライマー（配列番号９）は、
５’－ＡＴＣＡＴＴＣＣＣＡＡＣＧＡＧＣＧＡＡＡＧ－３’
リバースプライマー（配列番号１０）は、
５’－ＡＡＧＴＣＣＣＣＡＴＡＧＡＧＡＡＴＧＣＧＧ－３’であった。
分化は免疫蛍光（ＩＦ）によっても確認した。一次抗体は、α－サルコメアアクチニン
（ＥＡ－５３、Ａｂｃａｍ）又はトロポニンＩ（ａｂ４７００３、Ａｂｃａｍ）に対する
ものであり、続いて対応する二次抗体はＡＦ４８８又はＡＦ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）と複合化したものであった（データは示さない）。
実施例６：移植した低ｍＣＭは同種レシピエントにおいて長期生存する。
同種レシピエントマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）の梗塞境界域にｈｉＣＭ及びｍｉＣＭを移植
した。細胞株は、ルシフェラーゼ（＋）であり、ｌｕｃ（＋）ＣＭを生じさせ、インビボ
で生体発光（ＢＬＩ）により追跡した。
ルシフェラーゼを発現させるためのＨＩＰ細胞及びｉＰＳＣ形質導入。Ｆｌｕｃを発現
させるために細胞に対して形質導入を行った。１００，０００個のｍＨＩＰ細胞又はｍｉ
ＰＳＣをゼラチンコーティング６ウェルプレートに播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で一晩
温置した。翌日、培地を交換し、再改変ＥＦ１ａプロモーター（ＧｅｎＴａｒｇｅｔ，Ｓ
ａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）下でルシフェラーゼＩＩ遺伝子を発現する１バイアルのＦｌｕ
ｃレンチウイルス粒子を１．５ｍＬ培地に添加した。３６時間後、１ｍＬの培地を添加し
た。さらに２４時間後、完全培地交換を行った。２日後、Ｄ－ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を添加することにより、ルシフェラーゼ発現を確認した。
ＩＶＩＳ ２００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）により最大光子
ｓ－１ｃｍ－２／ステラジアンでシグナルを定量した。
ｈｉＣＭは拒絶されず、移植後２８日で他の臓器に移動しなかった（図１７）。ｈｉＣ
Ｍは、同種移植後、免疫認識を逃れ、長期生存を示した。注入は心臓筋肉へのものだった
ので、移植細胞を光学的にマッピングした。ｈｉＣＭの結果、「スーパー細胞」生着が起
こったが、ｍｉＣＭではなかった（データを示さない）。
光学的マッピング：
全心臓ランゲンドルフ標本。手術から４～５週間後、マウスを頸椎脱臼により安楽死さ
せた。ヒアス（ｈｅａｒｓ）を素早く切除し、組成（ｍｍｏｌ／Ｌ）９３ＮａＣｌ、２０
ＮａＨＣＯ３、１Ｎａ２ＨＰＯ４、１ＭｇＳＯ４、５ＫＣｌ、１．８ＣａＣｌ２、２０酢
酸Ｎａ、２０グルコースの氷冷改変タイロード液に入れた。カニューレに大動脈を介して
心臓を組み込み、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２ガス混合物を通気させることによりｐＨを７．
４に維持しながら３７℃にて同じタイロード液を使用して９ｍＬ／ｍｉｎで逆行性に灌流
した。次に、収縮を阻害し、動きの人為現象を最小限にするために１０ｍｍｏｌ／Ｌ ２
，３－ブタンジオンモノオキシム（ＢＤＭ）及び１０μｍｏｌ／Ｌブレビスタチン（Ｅｎ
ｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅｘｅｔｅｒ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を
含有するタイロード液へと灌流液を切り替えた。左心室（ＬＶ）のイメージングを可能に
するために特注のＰｅｒｓｐｅｘチャンバーに心臓を水平に置いた。心臓の近くに置いた
２Ａｇ／ＡｇＣｌディスク電極を使用して、実験の間中、偽性心電図（ＥＣＧ）を監視し
、参照電極は灌流浴槽中に置いた。２００ｍｓ（５Ｈｚ）のサイクル長で生理学的心内膜
から心外膜の伝導経路を介して心臓のペーシングを可能にするために、単独の刺激装置に
接続される２本の白金電極を右心房（ＲＡ）付属器上に置いた。
以前に詳述されるように光学的測定を行った（その全体において参照により本明細書中
に組み込まれるＫｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ Ｅｌｅｃ
ｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ ６：８０９－１７（２０１３））。簡潔に述べると、１０分間に
わたり２ｍＭ電圧感受性色素（ジ－４－ＡＮＥＰＰＳ）の５０μＬボーラスを心臓に負荷
した。５９０ｎｍのロングパス発光フィルターとともにＣａｒｄｉｏＣＭＯＳ－ＳＭ１２
８カメラ（Ｒｅｄｓｈｉｒｔ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＧＡ）を使用して、Ｌ
Ｖからの広視野の単一光子落射蛍光記録を作製した。４７０ｎｍのＬＥＤ光により励起が
もたらされた。画像解像度は１２８ｘ１２８ピクセル／フレームであり、２．５ｋＨｚの
フレーム率で記録を行った。Ｔｉ：Ｓａｐｐｈｉｒｅ ６９０～１０８０ｎｍ波長可変レ
ーザー（Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ Ｕｌｔｒａ ＩＩ，Ｃｏｈｅｒｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌ
ａｒａ，ＣＡ）を備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０ ＮＬＯ正立顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚ
ｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して２光子（２Ｐ）レーザー走査顕微鏡（
２ＰＬＳＭ）を遂行した。これらの２Ｐ測定は、高度の深さ分解能をもたらし、電気的活
性を示す別々の組織層の同定を可能にする（Ｒｕｂａｒｔ，２００４）。ジ－４－ＡＮＥ
ＰＰＳを９２０ｎｍで励起し、それぞれ５１０～５６０ｎｍ及び５９０～６５０ｎｍの２
つのバイアルカリＰＭＴ検出器によって発光を回収し、比率計測による測定を行うことが
可能になる。心外膜表面で観察される細胞配向の方向で、短いスキャンの場合は０．３９
ｍｓのスキャン時間及び長いスキャンの場合は１．９３ｍｓのスキャン時間でラインスキ
ャンを行った。トリガー心拍の到着後にラインスキャンを開始し、心臓のペースを調整す
るために使用される電気刺激心拍により同調させた。
ＮＺで梗塞瘢痕から離れた心筋において、可視的な瘢痕の端部のＢＺで、ＮＺに隣接し
て、及び瘢痕の中心に向かってＩＺ内で、連続的広視野及び２Ｐ電圧記録を作成した。Ｂ
Ｚ及びＩＺ内でレムナント電気活性の領域を同定するために１０ｘ／０．３ＮＡ対物レン
ズ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した広視野の電気的マッ
ピングを最初に使用した。次に、電気活性領域をさらに局在化させるために、４０ｘ／０
．８ＮＡ対物（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて電気シグナ
ルを示す領域で、広視野の電気的マッピングを反復した。最後に、フレームスキャンモー
ドで２Ｐ励起を使用して光軸面の構造をイメージングし、次に、心外膜表面の下方で個別
の深さでラインスキャンモードを使用して電気シグナルを記録した。面の下方で５０μｍ
で開始し、シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）が低すぎて明らかな活動電位（ＡＰ）シグナル
を区別できなくなるまで、深度を深めて（５０～１００μｍ段階）一連の記録を行った。
明確な構造を可視化する能力は深い層ほど低下し；識別可能な画像が得られ得る最大深度
はゾーンに依存し得るが、ラインスキャン記録からの電気シグナルは常に、構造が画像化
され得る層を超えて記録され得る。従って、より深い層での組織構造の画像から直接電気
活性の源を同定することは可能ではなかった。１対の高感度ＧａＡｓＰ ＰＭＴ検出器を
利用し、ＦｌｕｏＶｏｌｔ及びＲｈｏｄ２ＡＭの組み合わせを使用し、８４０ｎｍで励起
して、改変正立２Ｐレーザー走査装置（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎ
ｎｏｖａｔｉｏｎｓ；Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）を使用して、分析の一部を行った。より高い
感度設定で知見を検証するためにこれらを使用した。
瘢痕における電気活性源の決定。瘢痕における電気活性の細胞源を決定するために、Ｆ
ｕｒａ－２／ＡＭを心筋に予め負荷することにより電圧シグナルが測定された領域で細胞
内Ｃａ２＋の測定を行った。シグナルが残留筋細胞から生じた場合、電気刺激に応答して
Ｃａ２＋過渡応答（ＣａＴｓ）が予想される。しかし、電圧シグナルが異常な筋細胞又は
他の細胞実体（即ち線維芽細胞又は筋線維芽細胞）から生じていた場合、ＣａＴｓは、電
気刺激に応答して生じ得ない（Ｃｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
Ｆｕｒａ－２を排出する陰イオン輸送体を遮断し、従って細胞における色素保持を向上
させるために１ｍｍｏｌ／Ｌプロベネシドとともにこれらの実験用のタイロード液を補給
した（その全体において本明細書中で参照により組み込まれるＤｉ Ｖｉｒｇｉｌｉｏ
ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５６：９５９－６３（１９８８））。ＤＭＳＯ－
プルロニック酸Ｆ－１２７（２５％ｗ／ｖ）中の１ｍｍｏｌ／Ｌ保存液としてＦｕｒａ－
２／ＡＭを調製した。色素の１００μＬボーラスを灌流ライン中のバブルトラップに注入
して、色素の希釈及び心臓への緩徐な添加を可能にした。蛍光シグナルが低いか又は時間
依存的に喪失するがゆえに必要とされる場合、色素のさらなるボーラスを注入した。Ｆｕ
ｒａ－２／ＡＭは７６０ｎｍで２Ｐ励起し、ショートパス６５０ｎｍダイクロイックミラ
ーを通じて蛍光発光を誘導し、５１０～５６０ｎｍで回収した。同じ焦点面で同じスキャ
ンライン及び１．９３ｍｓスキャン時間を使用して何らかの電圧シグナルが検出された直
後にＣａ２＋測定を行った。
データ分析及び解釈。３ｘ３ピクセルアレイから広視野の電圧シグナルを平均した。正
確なサイクル長の時間及びラインスキャン率からの情報を利用して、２５回の連続刺激（
記録の５ｓ）からの平均電圧又はＣａ２＋トレースを並べて生成させる特注ソフトウェア
を使用して、２Ｐ電圧及びＣａ２＋シグナルを処理した。平均したトレースからＡＰシグ
ナルの特徴を分析した。これらの測定は、１０～９０％上昇過程の立ち上がり時間（ＴＲ
ｉｓｅ）及び５０％活性化から５０、７５及び９０％再分極のＡＰ持続時間を含んだ（そ
れぞれＡＰＤ５０、ＡＰＤ７５及びＡＰＤ９０）。刺激時間に対するＬＶ壁におけるその
時点でのＡＰの到達時間として活性化時間を決定した。
単回刺激心拍（シグナル）後のトレース全体のピーク振幅を拡張期中のトレースのピー
ク振幅（ノイズ）により除したものとしてＳ／Ｎを計算した（補足図面Ｓ１）。１のＳ／
Ｎ値は、ベースラインのノイズを超え、上回るシグナルは示さなかった。個々のトレース
及び対応するＳ／Ｎ値の観察に基づいて、Ｓ／Ｎ＞１．４を有意義な一過性シグナル（電
圧又はＣａ２＋）とみなした。動き又はノイズスパイクにより生じる人為的シグナルを除
外するためにＳ／Ｎ＞１．４の全てのトレースをさらに精査した。全データを平均±標準
誤差として表した。スチューデントのｔ検定を使用してデータ群を比較した。
心筋梗塞後２８日でのレシピエント心臓の組織病理及びトリクローム染色から、ｈｉＣ
Ｍの同種レシピエントにおける梗塞サイズも左心室サイズも顕著に縮小したことが明らか
になった。各１５０μｍのギャップがある２５枚のスライドから梗塞の長さを測定した（
１０番目のスライドごと、各スライドにおいて３枚の切片で５μｍ；スライド１～２５０
）。発明者らは、ｈｉＣＭ細胞を受容したレシピエントにおいてアルファ－サルコメア陽
性ドナー心筋細胞及び未熟血管構造を同定した。一方、同種ｍｉＣＭでは細胞は検出され
なかった（図１８）。
詳細なＰＶ－ｌｏｏｐ分析から、左心室パラメーターの顕著な改善が明らかになった。
ＩＴから、同種細胞の生存だけでなく、それらが生着し、心筋梗塞後の心臓を機能面で回
復させたことが示された（図１９Ａ）。ｍｉＣＭ（緑）又はｈｉＣＭ「スーパー細胞」（
赤）注入の何れかを受けた梗塞心臓のＰＶ－ｌｏｏｐ分析。
次のパラメーターは、ｈｉＣＭが心臓機能を回復させたことを示し：駆出率（ＥＦ）は
、心拍あたりの心室から駆出される血液体積の、拡張末期の心室の血液体積に対する比で
ある。１回の拍出量（ＳＶ）は、１回の収縮で心室により駆出される血液体積である。こ
れは、拡張末期の体積と収縮末期の体積との間の差である（図１９Ｂ）。心室の１回仕事
係数（ＳＷ）は、大動脈への１回拍出量を駆出するために左心室により行われる作業とし
て定義される。心臓出力（ＣＯ）は、単位時間に心室により拍出される血液量として定義
される（図１９Ｃ）。収縮末期の血圧体積関係（ＥＳＰＶＲ）は、任意の心腔体積で心室
により発現され得る最大血圧を示す。ＥＳＰＶＲは、前負荷、後負荷及び心拍の変化に対
して比較的感受性が低い。これによって、駆出率、心臓出力及び１回拍出量のような他の
血行動態パラメーターを超える収縮機能の指標改善が起こる。
心筋梗塞の結果、Ｐ－Ｖ－ループ分析で体積が増加し、圧力が低下し、心臓のポンプ機
能が低下する。心筋梗塞後にＨＩＰ－心筋細胞を注入した場合、圧力及び体積の変化が妨
げられ、心臓再生及びリモデリング予防が示される。
実施例７：ｈｉＣＭに分化させたヒトＨＩＰ細胞
ヒトＨＩＰ細胞を低免疫心筋細胞に分化させた。６ウェルプレート中の希釈マトリゲル
（３５６２３１、Ｃｏｒｎｉｎｇ）上にｈＨＩＰ細胞を播種し、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８
Ｆｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中で維持した。９０％培養密度で分化を
開始させ、２％Ｂ－２７マイナスインスリン（Ｇｉｂｃｏ）及び６μＭ ＣＨＩＲ－９９
０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を含有する５ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０へと培地を交
換した。２日後、ＣＨＩＲ不含の２％Ｂ－２７マイナスインスリンを含有するＲＰＭＩ－
１６４０へと培地交換した。第３日に、さらに２日間、５μＬのＩＷＲ１を培地に添加し
た。第５日に、培地を交換して２％Ｂ－２７マイナスインスリン培地を含有するＲＰＭＩ
－１６４０に戻し、４８時間置いた。第７日に、Ｂ２７プラスインスリンを含有するＲＰ
ＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）へと培地交換し、その後３日ごとに同じ培地で培地交換を
行った。
分化後第１０日に心筋細胞の精製を行った。簡潔に述べると、低グルコース培地へと培
地交換し、３日間維持した。第１３日に、培地を交換して、Ｂ２７プラスインスリンを含
有するＲＰＭＩ－１６４０に戻した。第１４日に再びこの手順を反復した。
トロポニン（ｃＴＮＴ、データは示さない）に対してｒｔＰＣＲにより分化表現型を確
認した。フォワードプライマー（配列番号１１）は：
５’－ＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＴＴＧＧＧＣＡＴＧＡＡＣＧ Ａ－３’、
リバースプライマー（配列番号１２）は：
５’－ＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＧＣＴＧＡＡ’であった。
免疫蛍光（ＩＦ）染色でも分化表現型を確認した。一次抗体はα－サルコメアアクチニ
ン（ＥＡ－５３、Ａｂｃａｍ）及びトロポニンＩ（ａｂ４７００３、Ａｂｃａｍ）に対す
るものであり、続いて対応する二次抗体はＡＦ４８８又はＡＦ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）と複合化されたものであった。細胞核をＤＡＰＩで染色した。Ｌｅｉｃａ ＳＰ５
レーザー共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を使用してイメージングを行った（データは示さな
い）。
心筋細胞の自発的拍動は、最初に分化第１０日前後で見られた。心筋細胞はヒト心臓組
織と同様の拍動数を示し、心臓刺激（イソプレナリンによる）及び心臓抑制（ｃａｒｄｉ
ａｃ ｂｌｏｃｋｉｎｇ）（ベラパミルによる）に感受性がある。
実施例８：ヒト化マウスにおけるｈｉＣＭ細胞生存同種間移植
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）から購入
した同種ヒト化マウス（ヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウス（１８～３０週）への移植後に低
免疫心筋細胞が生存した。ヒトＣＤ３４＋造血系幹細胞生着ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスは、
多系統ヒト免疫細胞を発現させ、宿主に対してドナー細胞免疫反応性がないＴ細胞依存性
免疫応答を示す機能的ヒト免疫系を示す。動物を無作為に実験群に割り当てた。全ての動
物でヒトＣＤ４５＋細胞集団間のＣＤ３＋細胞のパーセンテージを評価し、ＣＤ３パーセ
ンテージはＷＴとＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ群との間で有意差はなかっ
た（その全体において本明細書中で参照により組み込まれるＤｅｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３７（３）：２５２－２５８（２０１９））。
同種ヒト化マウスの筋肉内に移植した野生型又はＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４
７ｔｇ ｈｉＣＭは、さらなるヒト化マウスモデルでマウスデータを確認した。生体発光
（ＢＬＩ）により心筋細胞を長軸方向に追跡した。時間経過とともに全ｗｔ ｈｉＣＭ移
植物が拒絶された（動物５匹）。５つのＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｈ
ｉＣＭ移植片全てが永久的に生存した（図２０）。心筋梗塞後の移植の後にも低免疫ｈｉ
ＣＭ細胞が生存した（図２１）。
実施例９：マウス誘導多能性幹細胞由来の内皮細胞の作製
ヒトｉＰＳＣ由来内皮細胞（ＥＣ）を作製するための方法が本明細書中で提供される。
代表的な実施形態では、マウスｉＰＳＣ（マウスＨＩＰ細胞など）を内皮細胞のインビト
ロ単層に分化させ得る。
このプロトコールは、６ウェル方式プレート又は１０ｃｍディッシュを使用することを
含む。標準的トリプシンで細胞をトリプシン処理した。しかし、トリプシン処理した細胞
を遠心分離しなかった。むしろ、使用したトリプシンの体積の３倍を超える体積の培地中
で、トリプシン処理したコロニーを再懸濁した。
分化（およそ１２日）前、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を凍結融解した－ＭＥＦ培
地を使用してゼラチンコーティングプレート上で１ｘ１０６個のＭＥＦ／ウェル（６ウェ
ルプレート）。１バイアルのｉＰＳＣを凍結融解し、ＭＥＦ上、３枚の６ウェルに移した
。ＥＳＣ培地を毎日交換した。ＭＥＦ上でコロニーをＥＳＣ培地中で１：３～１：６に分
割した（凍結融解からおよそ８日後）。分割前にＭＥＦ上でＮＴ－ＥＳＣコロニーを観察
した（１００ｘ拡大率）。ＥＳＣ培地中で１：３～１：６でゼラチン上にＭＥＦからコロ
ニーを分割した（前分化からおよそ４日後；第－２日とも呼ぶ）。
第０日～第２日に、分化プロトコールを開始するために細胞を７０～８５％培養密度に
した。ＥＣ分化培地＃１は、ＲＰＭＩ及びＢ－２７サプリメントマイナスインスリン（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び５μＭ ＣＨＩＲ－９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃ
ｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を２日間、含んだ。約２．５
ｍＬの培地／６ウェルプレート又は１０ｃｍプレートを使用した。第０～２日は培地を交
換しなかった。細胞を動かさずにインキュベーター中に置いておいた。
第２日～第４日に、細胞培養物の形態を観察した。ＲＰＭＩ及びＢ－２７サプリメント
マイナスインスリンを含有し、２μＭ ＣＨＩＲ－９９０２１を含むＥＣ分化培地＃２へ
と培地を交換した。細胞のかき混ぜを回避するように注意した。
第４日～第７日に、ＲＰＭＩ培地マイナスインスリンを含む内皮細胞（ＥＣ）分化培地
＃３を使用した。第４日及び第６日に培地交換を実施した。未分化細胞クラスターは浮遊
したままであり、最初のＥＣコロニーが出現した。
第７日～第１７日に、ＥＣコロニーはプレートで密集状態になるまで増殖し続けた。内
皮細胞（ＥＣ）分化培地＃３は、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＢ４３１５４２
及びＹ－２７６３２を補給したＥＣ培地（Ｌｏｎｚａ，Ｂｅｎｉｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒ
ｎｉａ）を含む。ＥＣ分化中、およそ１日おきに培地を交換した（第７日、第９日、第１
１日及び第１３日など）。
材料及び試薬
トリプシン：Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２６０５－０１０
ゼラチンコーティング：ＥｍｂｒｙｏＭａｘ（登録商標）０．１％ゼラチン溶液、カタ
ログ番号ＥＳ－００６－Ｂ。プレート表面を溶液で被覆し、コーティングしたプレートを
使用まで３７℃で保管した。
ＭＥＦ培地：ＤＭＥＭ＋ｇｌｕｔａｍａｘ＋ピルビン酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌグル
コース（Ｇｉｂｃｏ）、１５％ＦＢＳ、ＮＥＡＡ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシ
ン（Ｐ／Ｓ）入り。
第０日～第２日用のＥＣ培地：ＲＰＭＩ及びＢ－２７サプリメントマイナスインスリン
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ａ１８９５６０１、５μＭ ＣＨ
ＩＲ－９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳ
Ａ．カタログ番号Ｓ２９２４）及び１％Ｐ／Ｓ。
第２日～第４日用のＥＣ培地：ＲＰＭＩ及びＢ－２７サプリメントマイナスインスリン
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ａ１８９５６０１、２μＭ ＣＨ
ＩＲ－９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳ
Ａ．カタログ番Ｓ２９２４）及び１％Ｐ／Ｓ。
第０日～第２日培地用に５μＭ（１：２０００）にＣＨＩＲ保存溶液（１０ｍＭ）を培
地中で希釈した。第２日～第４日の培地用に２μＭ（１：５０００）になるように培地中
でＣＨＩＲ保存溶液を希釈した。
第４日～第７日用のＥＣ培地（ＲＰＭＩ培地マイナスインスリン）：ＲＰＭＩ及びＢ－
２７サプリメントマイナスインスリン、５０ｎｇ／ｍＬ血管内皮胞増殖因子（ＶＥＧＦ；
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）、１０ｎｇ／ｍＬ線
維芽細胞増殖因子塩基性（ＦＧＦｂ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０μＭ Ｙ－２７６
３２（ＲＯＣＫ阻害剤）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ
，ＵＳＡ）及び１μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）入り、３日間
。
第７日～第１４日用のＥＣ培地（ＬｏｎｚａからのＥＣ培地）：ＥＧＭ－２ Ｓｉｎｇ
ｌｅＱｕｏｔｓ培地（又はＣＣ－３１６２ ＥＧＭＴＭ－２ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔＴＭ，
ＥＢＭＴＭ－２プラスＧｒｏｗｔｈ ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔのＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓＴ
Ｍ、５００ｍＬ）、１０μＭ Ｙ－２７６３２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎ
ｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、１μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉ
ｃｈ）、２５ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ及び２ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ。
ＣＤ３１＋細胞を選別し、多能性幹細胞由来のマウスＥＣから選択した。ＭＡＣＳを含
む磁気ビーズに基づく選別方法を実施した。例えばＣＤ３１＋細胞の陽性選択のためにＣ
Ｄ３１マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９７－４１８）を使
用した。第１２日～第１４日の後及びＭＡＣＳ選別前の細胞（１００ｘ拡大率）を観察し
た。ＥＣコロニーは８０％～９０％培養密度であり、未分化細胞クラスターが存在した。
紡錘形態で長い細胞は間葉系の分化細胞に相当した。
ＣＤ３１＋細胞のＭＡＣＳ選択のための代表的プロトコールは次のとおりである。
１．細胞をＰＢＳで１回洗浄。
２．トリプシン：０．５ｍＬ／ウェル；３７℃で５分間温置。
３．培地（第７日～１４日培地）、１ｍＬ／ウェルでトリプシン処理を停止。
４．１０００μＬ－エッペンドルフピペットを使用：凝集塊を分解させるためにウェル
を再懸濁。
５．凝集塊を除去するために５０ｍＬファルコンチューブにおいて黄色の１００μｍメ
ッシュフィルターを使用し、５０ｍＬチューブ中で細胞を回収。
６．５０ｍＬチューブを３００ｇ、５分間、４℃でスピン。
７．５０ｍＬチューブ中でペレットが見られる。大きなペレット＝ａｐｐ．９０Ｍｉｏ
細胞。
８．１０個のＭｉｏ細胞あたりを計算：９０μＬ ＭＡＣＳ緩衝液＋１０μＬビーズ。
９．乾燥した細胞ペレットを得るために上清を除去。
１０．ＭＡＣＳ緩衝液中で１０００μＬエッペンドルフピペットを使用してペレットを
再懸濁。
１１．黄色の２００μＬエッペンドルフピペットでビーズを１０に添加し再懸濁。
１２．ボルテックス処理（非常に短時間）。
１３．４℃（冷蔵庫）で３０分間温置。
１４．５０ｍＬチューブに緩衝液を添加することにより１～２ｍＬ ＭＡＣＳ緩衝液／
１０個のＭｉｏ細胞で洗浄。
１５．３００ｇで５分間、４℃にて遠心分離。
１６．ＭｉｄｉＭＡＣＳカラムを磁石に置く。カラムに３ｍＬ ＭＡＣＳ緩衝液を添加
（「プライミング」として）。カラム下：５０ｍＬファルコンチューブ。
１７．細胞ペレットから上清を除去（ペレットは乾燥させる必要あり）。
１８．ペレット上で５００μＬ ＭＡＣＳ緩衝液を添加（ペレットサイズにかかわらず
常に５００μＬを使用）。
１９．カラムに５００μＬ（細胞＋ＭＡＣＳ緩衝液）を添加し、カラムを通過するまで
待機。
２０．３ｍＬの純粋なＭＡＣＳ緩衝液をカラムに添加し、カラムを通過するまで待機：
３回実施（洗浄段階）。
２１．磁石からカラムを除去し、１５ｍＬファルコンチューブに置く。
２２．５ｍＬ ＭＡＣＳ緩衝液をカラムに添加し、「スタンプ」又は「プランジャー」
を使用：１５ｍＬファルコンチューブに５ｍＬを押し入れてＣＤ３１＋細胞を溶出。
２３．３００ｇで５分間４℃にて細胞をスピン。
２４．ペレット化（大きい場合およそ５～１０Ｍｉｏ）：１ｘ６ウェルプレートに播種
（ゼラチンコーティング）。
２５．培地：第７日～第１４日用のＥＣ分化培地。ＭＡＣＳ後に第３日前にプレートを
動かさなかった；その前にインキュベーターからプレートを出さない。
２６．第５日まで第７日～１４日にわたり分化培地を維持。
２７．ＭＡＣＳ選別後、第５日に培地を交換：Ｌｏｎｚａ ＥＧＭ－２ Ｓｉｎｇｌｅ
Ｑｕｏｔｓ培地（ＣＣ－３１６２ ＥＧＭＴＭ－２ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔＴＭ、ＥＢＭＴ
Ｍ－２プラスＧｒｏｗｔｈ ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓのＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓＴＭ、５
００ｍＬ）＋１０μＭ Ｙ－２７６３２。
２８．１日おきに培地交換。ゼラチンコーティングプレート上で細胞を維持。
２９．必要な場合、トリプシンを用いて細胞を１：３に分割した。
３０．ＥＣの特徴を調べるために、当業者にとって公知の方法により、免疫細胞化学、
ＬＤＬアッセイ及び／又はチューブ形成アッセイを実施した。
図２２は、分割前のＭＥＦのＮＴ－ＥＳＣコロニーを示す（１００ｘ拡大率）。図２３
は、分化開始直前のゼラチン上のＮＴ－ＥＳＣを示す（１００ｘ拡大率）。図２４は、５
μＭ ＣＨＩＲから２μＭ ＣＨＩＲに分化培地を交換する前の分化第２日の細胞を示す
（１００ｘ拡大率）。ＣＨＩＲは中胚葉性分化を引き起こす。非中胚葉性細胞は凝集塊を
形成し、浮遊して見え得る。図２５は、培地交換前のＥＣ分化第４日の細胞を示す（１０
０ｘ拡大率）。ＥＣコロニーは、浮遊する未分化細胞凝集塊の下に出現する。図２６は、
分化第７日のＥＣ細胞を示す（１００ｘ拡大率）。ＥＣコロニーが見え、より密集してい
る。数個の未分化細胞クラスターのみが見えた。図２７は、第１２日～第１４日後及びＭ
ＡＣＳ選別前の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。
実施例１０－マウス内皮細胞（ｍｉＥＣ）に分化したＨＩＰ細胞
ＨＩＰ ｉＰＳＣ及びｍｉＰＳＣを内皮細胞（ｍｉＥＣ）に分化させたが、ＨＩＰ細胞
由来ｍｉＥＣのみが同種宿主において長期間生存した。６ウェルプレート中のゼラチン上
にＨＩＰ及びｍｉＰＳＣを播種し、マウスｉＰＳＣ培地中で維持した。細胞が６０％培養
密度に到達した後、分化を開始させ、２％Ｂ－２７マイナスインスリン（両者ともＧｉｂ
ｃｏ）及び５μＭ ＣＨＩＲ－９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇ
ｅｒｍａｎｙ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０へと培地を交換した。第２日に、削減培地
（ｒｅｄｕｃｅｄ ｍｅｄｉａ）：２％Ｂ－２７マイナスインスリン（両者ともＧｉｂｃ
ｏ）及び２μＭ ＣＨＩＲ－９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を含有するＲＰＭＩ
－１６４０へと培地を交換した。第４日～第７日に、ＲＰＭＩ－１６４０ＥＣ培地、２％
Ｂ－２７マイナスインスリンプラス５０ｎｇ／ｍＬマウス血管内皮胞増殖因子（ｍＶＥＧ
Ｆ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、１０ｎｇ／ｍＬマウス
線維芽細胞増殖因子塩基性（ｍＦＧＦｂ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０μＭ Ｙ－２
７６３２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び１μＭ
ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０に細胞
を曝露した。第７日から内皮細胞クラスターが見られ、ＥＧＭ－２ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏ
ｔｓ培地（Ｌｏｎｚａ）プラス１０％ＦＣＳ ｈｉ（Ｇｉｂｃｏ）、２５ｎｇ／ｍＬ ｍ
ＶＥＧＦ、２ｎｇ／ｍＬ ｍＦＧＦｂ、１０μＭ Ｙ－２７６３２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄ
ｒｉｃｈ）及び１μＭ ＳＢ４３１５４２中で細胞を維持した。２１日後に分化工程を完
了し、分化工程中に未分化細胞が剥離した。精製のために、抗ＣＤ１５ ｍＡｂコーティ
ング磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して製造者の
プロトコールに従い、細胞をＭＡＣＳ精製に通した。
ｒｔＰＣＲ）及び免疫蛍光により内皮細胞分化を確認した。ＥＧＭ－２ Ｓｉｎｇｌｅ
Ｑｕｏｔｓ培地プラスサプリメント及び１０％ＦＣＳ ｈｉ中でフロースルーからの高度
精製ＨＩＰ及びｍｉＥＣを培養した。３～４日ごとに細胞を１：３に継代するためにＴｒ
ｙｐＬＥを使用した。上記のようにＰＣＲを行った。次のプライマーを使用した：ＶＥ－
カドヘリンフォワードプライマー（配列番号１３）：５’－ＧＧＡＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴ
ＣＡＣＡＧＡＧ－３’及びリバースプライマー（配列番号１４）：５’－ＣＴＧＧＣＧＧ
ＴＴＣＡＣＧＴＴＧＧＡＣＴ－３’。ｍｉＰＳＣ及びＨＩＰ細胞の両方からのＥＣ細胞は
、ＶＥ－カドヘリン発現を含め、分化した遺伝子発現プロファイルを示し、親細胞はそれ
を示さなかった（図２８）。
ＣＤ３１（ａｂ２８３６４，Ａｂｃａｍ）及びＶＥ－カドヘリン（ｓｃ－６４５８，Ｓ
ａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）に対
する免疫蛍光（ＩＦ）によってもそれらの表現型を確認した。簡潔に述べると、ＰＢＳ中
の４％パラホルムアルデヒドで細胞を１５分間固定した。細胞膜を透過処理液（ＡＳＢ－
０１０２，Ａｐｐｌｉｅｄ ＳｔｅｍＣｅｌｌ）で透過処理し、続いてブロッキング溶液
（ＡＳＢ－０１０３，Ａｐｐｌｉｅｄ ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用し、一次抗体と温置し
た。可視化のために、ＡＦ４８８又はＡＦ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合化した
二次抗体と細胞を温置した。ＤＡＰＩでの核染色後、画像を得て、Ｌｅｉｃａ ＳＰ５レ
ーザー共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で分析した。ｍｉＰＳＣ及びＨＩＰ細胞の両方からの
ＥＣ細胞がＣＤ３１及びＶＥ－カドヘリンに対して両方陽性に染色された（データは示さ
ない）。
免疫蛍光アッセイによってチューブ形成も確認した。２．５ｘ１０５個のｍｉＥＣを５
μＭ ＣＦＳＥ及び０．１μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ（両方ともＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓ
ｈｅｒ）で室温にて１０分間染色し、２４ウェルプレートにおいて１０ｍｇ／ｍＬ未希釈
マトリゲル（３５６２３１，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）上に播種した。４
８時間後、ＩＦによりチューブ形成を可視化した（データは示さない）。
実施例６－ｍＨＩＰ細胞由来内皮細胞は同種移植で生存する
同種低ｍＥＣは、後肢虚血モデルにおいてインビボで生存した。Ａ．フェモラリス（大
腿輪、Ａ．ｆｅｍｏｒａｌｉｓ）の除去後、Ｆｌｕｃ＋ｗｔ又はＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ
－／－ＣＤ４７ｔｇ ｍＥＣの移植物を同種マウスに移植し、ＢＬＩにより長軸方向に追
跡した。群あたり１５匹の動物を使用した。
生体発光イメージング（ＢＬＩ）の場合、Ｄ－ルシフェリン蛍カリウム塩（３７５ｍｇ
／ｋｇ；Ｂｉｏｓｙｎｔｈ ＡＧ，Ｓｔａａｄ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をＰＢＳ（ｐ
Ｈ７．４）（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で溶解させ、麻酔下のマウスの腹腔
内に注射した（２５０μＬ／マウス）。ＩＶＩＳ ２００ ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅ
ｎ）を使用して動物を画像化した。最大光子／秒／ｃｍ２／ステラジアン（ｐ／ｓ／ｃｍ
２／ｓｒ）の単位で関心のある領域（ＲＯＩ）の生体発光を定量した。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉ
ｍａｇｅソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を使用してＲＯＩからの
最大シグナルを測定した。第０日、第１日及び第３０日まで１日おき、及びその後１０日
ごとにマウスを監視した。
全動物のＢＬＩ値をプロットした。免疫原性が非常に高いｗｔ ｍＥＣは１５日以内に
拒絶され、経時的にＢＬＩシグナル低下を示し、一方でＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－Ｃ
Ｄ４７ｔｇ移植物は全て生存した（図２９）。
実施例１１－ｍＨＩＰ細胞由来ＥＣ細胞はインビトロで免疫応答を逃れる
ＨＩＰ細胞由来内皮細胞は、インビトロでＩＦＮ－γ又はナチュラルキラー応答を誘発
しなかった。
Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ。一方向性の酵素結合免疫スポット（Ｅｌｉｓｐｏｔ）アッセ
イの場合、細胞注入から５日後にレシピエント脾臓細胞を脾臓から単離し、応答細胞とし
て使用した。ドナー細胞をマイトマイシンで処理し（５０μｇ／ｍＬで３０分）、刺激細
胞として使用した。１００，０００個の刺激細胞を１ｘ１０６個のレシピエント応答脾臓
細胞と２４時間温置し、Ｅｌｉｓｐｏｔプレートリーダーを使用してＩＦＮ－γ及びＩＬ
－４スポットの頻度を数え上げた。
ドナー特異的抗体。５６℃に３０分間加熱することによって、レシピエントマウスから
の血清を非働化した。等量の血清及び細胞懸濁液（５ｘ１０６／ｍＬ）を４℃で４５分間
温置した。ＦＩＴＣ複合化ヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で細胞を
標識し、フローサイトメトリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により分析した。
インビトロでのマウスＮＫ細胞Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ。ポリＩ：Ｃ注射（２００μＬ
滅菌生理食塩水中の１５０ｎｇポリＩ：Ｃ、腹腔内（ｉ．ｐ．）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒ
ｉｃｈ）後に、ＮＫ細胞を新鮮なＢＡＬＢ／ｃ脾臓から単離した。赤血球溶解後、抗ＣＤ
４９ｂ ｍＡｂコーティング磁気ビーズ選別により細胞を精製し、応答細胞として使用し
た。この細胞集団は＞９９％ＣＤ３－であり、ＮＫ細胞（＞９０％）及び、骨髄細胞を含
む他の細胞（＜１０％）を含有した。Ｅｌｉｓｐｏｔ原理を使用して、ＩＬ－２（１ｎｇ
／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）の存在下でＮＫ細胞をＢ２
ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－又はＢ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－Ｃｄ４７ｔｇ ｍｉＰＳＣ
と同時培養し、それらのＩＦＮ－γ放出を測定した。ＹＡＣ－１細胞（Ｓｉｇｍａ－Ａｌ
ｄｒｉｃｈ）を陽性対照とした。マイトマイシン処理（５０μｇ／ｍＬで３０分間）刺激
細胞をＮＫ細胞とともに（１：１）２４時間温置し、Ｅｌｉｓｐｏｔプレートリーダーを
使用してＩＦＮ－γスポット頻度を数え上げた。
ｗｔ ｍｉＰＳＣ由来ｍｉＥＣのＣ５７ＢＬ／６又はＢＡＬＢ／ｃレシピエントへの注
入から５日後、ＩＦＮ－γ Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイのために脾臓細胞を回収した（箱は
中央値とともに２５ｔｈ～７５ｔｈパーセンタイル、ひげは最小－最大、群あたり動物６
匹、両側スチューデントｔ検定）。ＩＦＮ－γ応答は、全ての同種レシピエントにおいて
非常により強かった。５日後にレシピエント血清と温置したｗｔ ｍｉＰＳＣ由来ｍｉＥ
Ｃに対するＩｇＭ結合の平均蛍光（ＭＦＩ）（箱は中央値とともに２５ｔｈ～７５ｔｈパ
ーセンタイル、ひげは最小－最大、群あたり動物６匹、両側スチューデントｔ検定）。全
ての同種レシピエントにおいて顕著により強いＩｇＭ応答があった（図３０）。
同様に、Ｃ５７ＢＬ／６又はＢＡＬＢ／ｃレシピエントにＢ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／
－ＣＤ４７ｔｇ ｍｉＰＳＣ由来ｍｉＥＣを注入し、５日後にＩＦＮ－γ Ｅｌｉｓｐｏ
ｔを実施した（箱は中央値とともに２５ｔｈ～７５ｔｈパーセンタイル、ひげは最小－最
大、群あたり動物６匹、両側スチューデントｔ検定）。Ｂ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－Ｃ
ｄ４７ｔｇ ｍｉＰＳＣ由来ｍｉＥＣへのＩｇＭ結合の平均蛍光（ＭＦＩ））、５日後に
レシピエント血清と温置した（箱は中央値とともに２５ｔｈ～７５ｔｈパーセンタイル、
ひげは最小－最大、群あたり６匹、両側スチューデントｔ検定）。同種レシピエントにお
いて測定可能なＩＦＮ－γ応答又はＩｇＭ応答はなかった。ＮＫ細胞殺傷に対するＣｄ４
７過剰発現の阻害効果を評価するために、Ｂ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－ｍｉＰＳＣ又は
Ｂ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｍｉＰＳＣ由来のｍｉＥＣを用いてＮＫ細
胞でのＩＦＮ－γ Ｅｌｉｓｐｏｔを実施した（箱は中央値とともに２５ｔｈ～７５ｔｈ
パーセンタイル、ひげは最小－最大、独立実験６回、ボンフェローニの事後検定とのＡＮ
ＯＶＡ）。Ｂ２ｍ－／－Ｃｉｉｔａ－／－ｍｉＰＳＣからの派生物のみがＮＫ細胞殺傷に
感受性であった（図３０）。
実施例１２－ＨＩＰ細胞由来内皮細胞形態学
ＨＩＰ細胞由来内皮細胞は典型的なＥＣ形態を示した。マトリゲル中のＢ２ｍ－／－Ｃ
ｉｉｔａ－／－Ｃｄ４７ｔｇ ｍｉＥＣ移植片を同種ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に移植し
た。これらの低免疫原性派生物は、同種レシピエントにおいて経時的に、インビボでさら
に成熟したか又はそれらの形態を変化させた。
１：１希釈マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の８００，０００個のＢ２ｍ－／－Ｃｉｉ
ｔａ－／－Ｃｄ４７ｔｇ ｍｉＥＣを同種ＢＡＬＢ／ｃマウスに注入した。５６日まで複
数の時間点でマトリゲルプラグを回収し、１％グルタルアルデヒド入りのＰＢＳ中の４％
パラホルムアルデヒド中で２４時間固定した。試料を脱水し、パラフィン中で包埋し、５
μＭの厚さの切片に切った。組織病理に対して、切片をヘマトキシリン及びエオシンで染
色し（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）、倒立光学顕微鏡で画像を撮影した。細胞の源が免疫蛍光染
色で示された。切片を再水和し、抗原回収及びブロッキングを行った。ルシフェラーゼ（
ａｂ２１１７６）、ＶＥ－カドヘリン（ＳＣ－６４５８）に対する抗体及びＡＦ４８８又
はＡＦ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合化した対応する二次抗体とともに試料を温
置した。細胞核をＤＡＰＩで対比染色し、Ｌｅｉｃａ ＳＰ５レーザー共焦点顕微鏡（Ｌ
ｅｉｃａ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像を撮影した。
ｍｉＥＣ及び免疫細胞の同時染色実験に対して、ＶＥ－カドヘリン（ＳＣ－６４５８、
Ｓｉｇｍａ）及びＣＤ３（ａｂ１６６６９、Ａｂｃａｍ）に対する一次抗体を使用し、続
いてＡＦ４８８又はＡＦ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合化された対応する二次抗
体を使用した。未熟な血管形成が観察された。データは示さない．
移植したｍｉＥＣが、第１４日前後に環状構造において組織化を開始し、第３週前後で
赤血球を含有した原始的血管を形成した（データは示さない）。
実施例６からの動物から採取した細胞の灌流ドップラー（Ｐｅｒｉｓｃａｎ ＰＩＭ
ＩＩ”（ＰＥＲＩＭＥＤ Ｌｔｄ．，Ｉｔａｌｙ）から新しい血管形成が明らかになり、
低ＥＣ群で肢をレスキューした（データは示さない）。
実施例１３－内皮細胞に分化したヒトＨＩＰ細胞
ヒトＨＩＰ細胞をｈｉＥＣ細胞に分化させた。野生型ｈｉＰＳＣ及びヒトＨＩＰ細胞を
６ウェルプレート中の希釈マトリゲル（３５６２３１、Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に播種し、Ｅ
ｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｆｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中で維持した。６
０％培養密度で分化を開始させ、２％Ｂ－２７マイナスインスリン（両方ともＧｉｂｃｏ
）及び５μＭ ＣＨＩＲ－９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を含有するＲＰＭＩ－
１６４０へと培地を交換した。第２日に、削減培地（ｒｅｄｕｃｅｄ ｍｅｄｉａ）：２
％Ｂ－２７マイナスインスリン（Ｇｉｂｃｏ）及び２μＭ ＣＨＩＲ－９９０２１（Ｓｅ
ｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０へと培地を交換した。第４日～第７
日に、ＲＰＭＩ－１６４０ＥＣ培地、２％Ｂ－２７マイナスインスリン＋５０ｎｇ／ｍＬ
ヒト血管内皮胞増殖因子（ＶＥＧＦ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｎｇ／ｍＬヒト線
維芽細胞増殖因子塩基性（ＦＧＦｂ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０μＭ Ｙ－２７６
３２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌ
ｄｒｉｃｈ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０に細胞を曝露した。第７日から内皮細胞クラ
スターが見え、ＥＧＭ－２ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ培地（Ｌｏｎｚａ）＋１０％ＦＣＳ
ｈｉ（Ｇｉｂｃｏ）、２５ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ、２ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦｂ、１０μＭ
Ｙ－２７６３２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｓｉ
ｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で細胞を維持した。１４日後に分化工程を完了させ、未分化
細胞が分化工程中に剥離した。精製のために、２０μＭ ＰｌｕｒｉＳｌｎ－１（Ｓｔｅ
ｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）で
４８時間、細胞を処理した。ＥＧＭ－２ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ培地（Ｌｏｎｚａ）＋
サプリメント及び１０％ＦＣＳ ｈｉ（Ｇｉｂｃｏ）中で高度精製ＥＣを培養した。３～
４日ごとに細胞を１：３で継代するために、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを使用した。
それらの表現型を確認するために上記のようにＩＦ染色を実施した。ＣＤ３１（ａｂ２
８３６４、Ａｂｃａｍ）及びＶＥ－カドヘリン（ｓｃ－６４５８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対して一次抗体を使用し、続いてＡＦ４８８又はＡＦ
５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合化された対応する二次抗体を使用した。細胞核を
ＤＡＰＩで染色した。Ｌｅｉｃａ ＳＰ５レーザー共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を使用し
てイメージングを行った。ＶＥ－カドヘリン（フォワード（配列番号１５）：５’－ＡＡ
ＧＡＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＣＡＴＧ－３’及びリバースプライマー（配列番号１６）：５
’－ＣＡＴＧＡＧＣＣＴＣＴＧＣＡＴＣＴＴ－３’）に対するＰＣＲを上記のように行っ
た。
ｗｔ ｈｉＰＳＣ（ａ）及びＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＰＳＣ
（ｂ）の、対応するｈｉＥＣ派生物への分化に成功した。ｈｉＰＳＣ及びＨＩＰ細胞の両
方からのＥＣ細胞は、ＣＤＨ５発現を含む分化した遺伝子発現プロファイルを示し、親細
胞は示さなかった。共焦点免疫蛍光により、ｍｉＥＣはＣＤ３１及びＶＥ－カドヘリンに
対して陽性であった。全ての派生物はそれらの多能性遺伝子の発現を喪失した（２つの独
立した実験の代表的写真）（図３１及びデータは示さない）。
実施例１４－ｈｉＥＣ細胞はヒト化マウス中で生存した
ヒトＨＩＰ細胞は、ヒト化免疫系を有するマウスに移植され、生存した。ヒト化ＮＳＧ
－ＳＧＭ３マウス（１８～３０週）はＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カタ
ログ番号ＳＭＧ３－ＣＤ３４，Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）から購入した。ヒトＣＤ３
４＋造血系幹細胞（ＨＳＥ）－生着ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスは多系統ヒト免疫細胞を発現
した。これらは、宿主に対するドナー細胞免疫反応性がないＴ細胞依存性免疫反応を示す
機能的ヒト免疫系を示した。動物を無作為に実験群に割り当てた。全動物においてヒトＣ
Ｄ４５＋細胞集団中のＣＤ３＋細胞のパーセンテージを評価し、ＣＤ３パーセンテージは
野生型とＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ群との間で有意差はなかった。全て
のヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスはＨＬＡ－Ａ型であり、細胞移植物に対するミスマッチ
の数を計算した。ｈｉＥＣ群でのＥｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて、常に２個のミスマッ
チがあった。
同種ヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスに野生型又はＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４
７ｔｇ ｈｉＥＣ移植物を注入した。５日後にＩＦＮ－γ Ｅｌｉｓｐｏｔを実施した（
平均±ｓ．ｄ．、動物３匹／群、両側スチューデントｔ検定）。ナイーブマウスでのバッ
クグラウンドスポット頻度が示される（平均±ｓ．ｄ．、４匹／群、両側スチューデント
ｔ検定）。５日後に、何れかのｈｉＥＣに対するＩｇＭ結合のｌ，ＭＦＩをレシピエント
血清と温置した（平均±ｓ．ｄ．、３匹／群、両側スチューデントｔ検定）。ナイーブマ
ウスにおけるバックグラウンド蛍光を示す（平均±ｓ．ｄ．、３匹／群、スチューデント
ｔ検定）。Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｈｉＥＣ又はＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－Ｃ
Ｄ４７ｔｇ ｈｉＥＣを用いてヒトＮＫ細胞でのＩＦＮ－γ Ｅｌｉｓｐｏｔを実施した
（箱は中央値とともに２５ｔｈ～７５ｔｈパーセンタイル、ひげは最小－最大、群あたり
６匹、ボンフェローニ事後検定とともにＡＮＯＶＡ）（図３２）。
本明細書中で開示又は参照する全ての刊行物及び特許文書は、それらの全体において参
照により組み込まれる。前述の記載は、例示及び説明の目的のためにのみ与えられている
。この記載は、開示される正確な形態に本発明を限定するものではない。
本発明の範囲は、本明細書に添付される特許請求の範囲により定められるものとする。
非公式配列リスト
配列番号１－ヒトβ－２－ミクログロブリンタンパク質

配列番号２－ヒトＣＩＩＴＡタンパク質、１６０アミノ酸Ｎ－末端

配列番号３－ヒトＣＤ４７タンパク質

配列番号４－単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）タンパク質

配列番号５－エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミ
ナーゼ（ＣＤ）タンパク質

配列番号６－短縮ヒトカスパーゼ９タンパク質

Claims (164)

  1. 低免疫誘導多能性幹細胞（ＨＩＰ細胞）から分化させられた単離低免疫心臓細胞であっ
    て、
    内在性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活
    性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇している、単離低免
    疫心臓細胞。
  2. 前記ＨＩＰ細胞がヒトｉＰＳＣであり、前記Ｂ２Ｍ遺伝子がヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、
    前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＤ４７発現上昇が、プロモータ
    ーの制御下でヒトＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを前記ｉＰＳＣに導入した結果で
    ある、請求項１に記載の単離低免疫心臓細胞。
  3. 前記ＨＩＰ細胞がマウスｉＰＳＣであり、前記Ｂ２Ｍ遺伝子がマウスＢ２Ｍ遺伝子であ
    り、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がマウスＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＤ４７発現上昇が、プロ
    モーターの制御下でマウスＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを前記ｉＰＳＣに導入し
    た結果である、請求項１に記載の単離低免疫心臓細胞。
  4. Ｂ２Ｍ遺伝子活性の前記排除が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルを破壊するクラスター化
    された規則的配置の短回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９反応の結果である、
    請求項１～３の何れか１項に記載の単離低免疫心臓細胞。
  5. ＣＩＩＴＡ遺伝子活性の前記排除が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルを破壊するＣＲ
    ＩＳＰＲ／Ｃａｓ９反応の結果である、請求項１～４の何れか１項に記載の単離低免疫心
    臓細胞。
  6. 前記ＨＩＰ細胞を死に誘導するトリガー物質により活性化される自殺遺伝子をさらに含
    む、請求項１～５の何れか１項に記載の単離低免疫心臓細胞。
  7. 前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であ
    り、前記トリガー物質がガンシクロビルである、請求項６に記載の単離低免疫心臓細胞。
  8. 前記ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子が、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む
    タンパク質をコードする、請求項７に記載の単離低免疫心臓細胞。
  9. 前記ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子が、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする
    、請求項７に記載の単離低免疫心臓細胞。
  10. 前記自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシン
    デアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子であり、前記トリガー物質が５－フルオロシトシン（５－Ｆ
    Ｃ）である、請求項６に記載の単離低免疫心臓細胞。
  11. 前記ＣＤ遺伝子が、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク
    質をコードする、請求項１０に記載の単離低免疫心臓細胞。
  12. 前記ＣＤ遺伝子が、配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項
    １０に記載の単離低免疫心臓細胞。
  13. 前記自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードし、前記トリガー物質が二量
    体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項６に記載の単離低免疫心臓細胞。
  14. 前記誘導型カスパーゼ９タンパク質が、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同
    一性を含む、請求項１３に記載の単離低免疫心臓細胞。
  15. 前記誘導型カスパーゼ９タンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１３
    に記載の単離低免疫心臓細胞。
  16. 前記ＣＩＤが化合物ＡＰ１９０３である、請求項１３～１５の何れか１項に記載の単離
    低免疫心臓細胞。
  17. 前記単離低免疫心臓細胞が、心筋細胞、結節心筋細胞、伝導性心筋細胞、作業心筋細胞
    、心筋細胞前駆体、心筋細胞祖先細胞、心臓幹細胞及び心臓筋肉細胞からなる群から選択
    される、請求項１３～１６の何れか１項に記載の単離低免疫心臓細胞。
  18. 心臓状態又は疾患に罹患している患者を処置する方法であって、請求項１～１７の何れ
    か１項に記載の単離低免疫心臓細胞集団の治療的有効量を含む組成物を投与することを含
    む、方法。
  19. 前記組成物が治療的に有効な担体をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記投与が、前記患者の心臓組織への移植、静脈内注射、動脈内注射、冠動脈内注射、
    筋肉内注射、腹腔内注射、心筋内注射、経心内膜注射、経心外膜注射又は点滴を含む、請
    求項１８又は１９に記載の方法。
  21. 前記心臓状態又は疾患が、小児心筋症、加齢性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、
    拘束型心筋症、慢性虚血性心筋症、周産期心筋症、炎症性心筋症、他の心筋症、心筋炎、
    心筋虚血性再灌流障害、心室機能不全、心不全、うっ血性心不全、冠動脈疾患、末期心疾
    患、アテローム性動脈硬化症、虚血、高血圧、再狭窄、狭心症、リウマチ性心臓、動脈炎
    又は循環器疾患からなる群から選択される、請求項１８～２０の何れか１項に記載の方法
    。
  22. インビトロ分化によって低免疫多能性細胞（ＨＩＰ細胞）集団から低免疫心臓細胞集団
    を作製する方法であって、前記ＨＩＰ細胞において、内在性β－２ミクログロブリン（Ｂ
    ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が
    排除され、ＣＤ４７発現が上昇しており、
    前記方法が、
    （ａ）ＧＳＫ阻害剤を含む培地中でＨＩＰ細胞集団を培養し；
    （ｂ）前駆心臓細胞集団を作製するために、ＷＮＴアンタゴニスを含む培地中で前記Ｈ
    ＩＰ細胞集団を培養し；
    （ｃ）心臓細胞集団を作製するために、インスリンを含む培地中で前記前駆心臓細胞集
    団を培養すること
    を含む、方法。
  23. 前記ＧＳＫ阻害剤が、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体又はその変異体である、請求
    項２２に記載の方法。
  24. 前記ＧＳＫ阻害剤が、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である、請求項２２又は２３
    に記載の方法。
  25. 前記ＷＮＴアンタゴニスが、ＩＷＲ１、その誘導体又はその変異体である、請求項２２
    ～２４の何れか１項に記載の方法。
  26. 前記ＷＮＴアンタゴニスが、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である、請求項２２～
    ２５の何れか１項に記載の方法。
  27. グルコース不含培地中で段階（ｃ）の前記前駆心臓細胞集団を培養することをさらに含
    む、請求項２２～２６の何れか１項に記載の方法。
  28. 前記ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ｃ）の前
    記前駆心臓細胞集団を培養することをさらに含み、
    前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であ
    る場合、前記トリガー物質がガンシクロビルであるか、前記自殺遺伝子がエシェリキア・
    コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である
    場合、前記トリガー物質が５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）であるか、又は前記自殺遺
    伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、前記トリガー物質が二量体誘導
    化合物（ＣＩＤ）である、請求項２２～２７の何れか１項に記載の方法。
  29. 前記ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ｄ）の前
    記心臓細胞集団を培養することをさらに含み、
    前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であ
    る場合、前記トリガー物質がガンシクロビルであるか、前記自殺遺伝子がエシェリキア・
    コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である
    場合、前記トリガー物質が５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）であるか、又は前記自殺遺
    伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、前記トリガー物質が二量体誘導
    化合物（ＣＩＤ）である、請求項２２～２８の何れか１項に記載の方法。
  30. 非心臓細胞から前記低免疫心臓細胞集団を単離することをさらに含む、請求項２２～２
    ９の何れか１項に記載の方法。
  31. 単離した低免疫心臓細胞集団を凍結保存することをさらに含む、請求項３０に記載の方
    法。
  32. 低免疫多能性幹細胞（ＨＩＰ細胞）から分化させられた単離低免疫内皮細胞であって、
    内在性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性
    化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇している、単離低免疫
    内皮細胞。
  33. 前記ＨＩＰ細胞がヒトｉＰＳＣであり、前記Ｂ２Ｍ遺伝子がヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、
    前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＤ４７発現上昇が、プロモータ
    ーの制御下でヒトＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを前記ｉＰＳＣに導入した結果で
    ある、請求項３２に記載の単離低免疫内皮細胞。
  34. 前記ｉＰＳ ＨＩＰ細胞ＣがマウスｉＰＳＣであり、前記Ｂ２Ｍ遺伝子がマウスＢ２Ｍ
    遺伝子であり、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がマウスＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＤ４７発現上
    昇が、プロモーターの制御下でマウスＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを前記ｉＰＳ
    Ｃに導入した結果である、請求項３２に記載の単離低免疫内皮細胞。
  35. Ｂ２Ｍ遺伝子活性の前記排除が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルを破壊する、クラスター
    化された規則的配置の短回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９反応の結果である
    、請求項３２～３４の何れか１項に記載の単離低免疫内皮細胞。
  36. ＣＩＩＴＡ遺伝子活性の前記排除が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルを破壊するＣＲ
    ＩＳＰＲ／Ｃａｓ９反応の結果である、請求項３２～３５の何れか１項に記載の単離低免
    疫内皮細胞。
  37. 前記ＨＩＰ細胞を死に誘導するトリガー物質により活性化される自殺遺伝子をさらに含
    む、請求項３２～３６の何れか１項に記載の単離低免疫内皮細胞。
  38. 前記自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子で
    あり、前記トリガー物質がガンシクロビルである、請求項３７に記載の単離低免疫内皮細
    胞。
  39. 前記ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子が、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む
    タンパク質をコードする、請求項３８に記載の単離低免疫内皮細胞。
  40. 前記ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子が、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする
    、請求項３８に記載の単離低免疫内皮細胞。
  41. 前記自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシン
    デアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子であり、前記トリガー物質が５－フルオロシトシン（５－Ｆ
    Ｃ）である、請求項３７に記載の単離低免疫内皮細胞。
  42. 前記ＣＤ遺伝子が、配列番号５に対する少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク
    質をコードする、請求項４１に記載の単離低免疫内皮細胞。
  43. 前記ＣＤ遺伝子が、配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項
    ４１に記載の単離低免疫内皮細胞。
  44. 前記自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードし、前記トリガー物質が二量
    体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項４１に記載の単離低免疫内皮細胞。
  45. 前記誘導型カスパーゼ９タンパク質が、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同
    一性を含む、請求項４４に記載の単離低免疫内皮細胞。
  46. 前記誘導型カスパーゼ９タンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項４４
    に記載の単離低免疫内皮細胞。
  47. 前記ＣＩＤが化合物ＡＰ１９０３である、請求項４４～４６の何れか１項に記載の単離
    低免疫内皮細胞。
  48. 前記単離低免疫内皮細胞が、毛細血管内皮細胞、血管内皮細胞、大動脈内皮細胞、脳内
    皮細胞及び腎臓内皮細胞からなる群から選択される、請求項４４～４６の何れか１項に記
    載の単離低免疫内皮細胞。
  49. 血管状態又は疾患に罹患している患者を処置する方法であって、治療的有効量の請求項
    ３２～４８の何れか１項に記載の単離低免疫内皮細胞集団を含む組成物を投与することを
    含む、方法。
  50. 前記組成物が治療的に有効な担体をさらに含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記投与が、前記患者の組織への移植、静脈内注射、動脈内注射、冠動脈内注射、筋肉
    内注射、腹腔内注射、心筋内注射、経心内膜注射、経心外膜注射又は点滴を含む、請求項
    ４９又は５０に記載の方法。
  52. 前記血管状態又は疾患が、血管損傷、循環器疾患、血管疾患、虚血性疾患、心筋梗塞、
    うっ血性心不全、高血圧、虚血性組織損傷、虚血肢、脳卒中、神経障害及び脳血管疾患か
    らなる群から選択される、請求項４９～５１の何れか１項に記載の方法。
  53. インビトロ分化による低免疫多能性幹細胞（ＨＩＰ細胞）集団から低免疫内皮細胞集団
    を作製する方法であって、前記ＨＩＰ細胞において、内在性β－２ミクログロブリン（Ｂ
    ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が
    排除され、ＣＤ４７発現が上昇しており、
    前記方法が、
    （ａ）ＧＳＫ阻害剤を含む第１の培地中でＨＩＰ細胞集団を培養し；
    （ｂ）前駆内皮細胞集団を作製するためにＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを含む第２の培地中で
    前記ＨＩＰ細胞集団を培養し；
    （ｃ）低免疫内皮細胞集団を作製するためにＲＯＣＫ阻害剤及びＡＬＫ阻害剤を含む第
    ３の培地中で前記前駆内皮細胞集団を培養すること
    を含む、方法。
  54. 前記ＧＳＫ阻害剤が、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体又はその変異体である、請求
    項５３に記載の方法。
  55. 前記ＧＳＫ阻害剤が約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である、請求項５３又は５４に
    記載の方法。
  56. 前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、その誘導体又はその変異体である、請求項５
    ３～５５の何れか１項に記載の方法。
  57. 前記ＲＯＣＫ阻害剤が約１μＭ～約２０μＭの範囲の濃度である、請求項５３～５６の
    何れか１項に記載の方法。
  58. 前記ＡＬＫ阻害剤が、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体又はその変異体である、請求項
    ５３～５５の何れか１項に記載の方法。
  59. 前記ＡＬＫ阻害剤が約０．５μＭ～約１０μＭの濃度範囲である、請求項５３～５６の
    何れか１項に記載の方法。
  60. 前記第１の培地が２μＭ～約１０μＭのＣＨＩＲ－９９０２１を含む、請求項５３～５
    ９の何れか１項に記載の方法。
  61. 前記第２の培地が、５０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ及び１０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦを含む、
    請求項５３～６０の何れか１項に記載の方法。
  62. 前記第２の培地がＹ－２７６３２及びＳＢ－４３１５４２をさらに含む、請求項６１に
    記載の方法。
  63. 前記第３の培地が１０μＭ Ｙ－２７６３２及び１μＭ ＳＢ－４３１５４２を含む、
    請求項５３～６２の何れか１項に記載の方法。
  64. 前記第３の培地がＶＥＧＦ及びｂＦＧＦをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記第１の培地及び／又は前記第２の培地がインスリンを欠く、請求項５３～６４の何
    れか１項に記載の方法。
  66. 前記ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、前記第２の培地がトリガー物質をさらに含み
    、
    前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であ
    る場合、前記トリガー物質がガンシクロビルであるか、前記自殺遺伝子がエシェリキア・
    コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である
    場合、前記トリガー物質が５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）であるか、又は前記自殺遺
    伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、前記トリガー物質が二量体誘導
    化合物（ＣＩＤ）である、請求項５３～６５の何れか１項に記載の方法。
  67. 前記ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、前記第３の培地がトリガー物質をさらに含み
    、
    前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であ
    る場合、前記トリガー物質がガンシクロビルであるか、前記自殺遺伝子がエシェリキア・
    コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である
    場合、前記トリガー物質が５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）であるか、又は前記自殺遺
    伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、前記トリガー物質が二量体誘導
    化合物（ＣＩＤ）である、請求項５３～６６の何れか１項に記載の方法。
  68. 非内皮細胞から前記低免疫内皮細胞集団を単離することをさらに含む、請求項５３～６
    ７の何れか１項に記載の方法。
  69. 前記単離した低免疫内皮細胞集団を凍結保存することをさらに含む、請求項６８に記載
    の方法。
  70. 低免疫多能性幹細胞（ＨＩＰ細胞）から分化させられた単離低免疫ドーパミン作動性ニ
    ューロン（ＤＮ）であって、
    内在性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活
    性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇している、単離低免
    疫ドーパミン作動性ニューロン（ＤＮ）。
  71. 前記ＨＩＰ細胞がヒトｉＰＳＣであり、前記Ｂ２Ｍ遺伝子がヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、
    前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＤ４７発現上昇が、プロモータ
    ーの制御下でヒトＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを前記ｉＰＳＣに導入した結果で
    ある、請求項７０に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
  72. 前記ＨＩＰ細胞がマウスｉＰＳＣであり、前記Ｂ２Ｍ遺伝子がマウスＢ２Ｍ遺伝子であ
    り、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がマウスＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＤ４７発現上昇が、プロ
    モーター制御下でマウスＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを前記ｉＰＳＣに導入した
    結果である、請求項７０に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
  73. Ｂ２Ｍ遺伝子活性の前記排除が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルを破壊するクラスター化
    された規則的配置の短回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９反応の結果である、
    請求項７０～７２の何れか１項に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
  74. ＣＩＩＴＡ遺伝子活性の前記排除が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルを破壊するＣＲ
    ＩＳＰＲ／Ｃａｓ９反応の結果である、請求項７０～７３の何れか１項に記載の単離低免
    疫ドーパミン作動性ニューロン。
  75. 前記ＨＩＰ細胞を死に誘導するトリガー物質により活性化される自殺遺伝子をさらに含
    む、請求項７０～７４の何れか１項に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
  76. 前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であ
    り、前記トリガー物質がガンシクロビルである、請求項７５に記載の単離低免疫ドーパミ
    ン作動性ニューロン。
  77. 前記ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子が、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む
    タンパク質をコードする、請求項７６に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
  78. 前記ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子が、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする
    、請求項７６に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
  79. 前記自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシン
    デアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子であり、前記トリガー物質が５－フルオロシトシン（５－Ｆ
    Ｃ）である、請求項７５に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
  80. 前記ＣＤ遺伝子が、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク
    質をコードする、請求項７９に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
  81. 前記ＣＤ遺伝子が、配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項
    ７９に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
  82. 前記自殺遺伝子が、誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードし、前記トリガー物質が二
    量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項７５に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニュ
    ーロン。
  83. 前記誘導型カスパーゼ９タンパク質が、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同
    一性を含む、請求項８２に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
  84. 前記誘導型カスパーゼ９タンパク質が配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項８２に
    記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
  85. 前記ＣＩＤが化合物ＡＰ１９０３である、請求項８２～８４の何れか１項に記載の単離
    低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
  86. 前記単離低免疫ドーパミン作動性ニューロンが、神経幹細胞、神経祖先細胞、未熟ドー
    パミン作動性ニューロン及び成熟ドーパミン作動性ニューロンからなる群から選択される
    、請求項８２～８５の何れか１項に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
  87. 神経変性疾患又は状態に罹患している患者を処置する方法であって、治療的有効量の請
    求項７０～８６の何れか１項に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン集団を含む
    組成物を投与することを含む、方法。
  88. 前記組成物が治療的に有効な担体をさらに含む、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン集団が生体分解性足場上にある、請求項８
    ７又は８８に記載の方法。
  90. 前記投与が移植又は注入を含む、請求項８７～８９の何れか１項に記載の方法。
  91. 前記神経変性疾患又は状態が、パーキンソン病、ハンチントン病及び多発性硬化症から
    なる群から選択される、請求項８７～９０の何れか１項に記載の方法。
  92. インビトロ分化によって低免疫多能性細胞（ＨＩＰ細胞）集団から低免疫ドーパミン作
    動性ニューロン集団を作製する方法であって、前記ＨＩＰ細胞中で、内在性β－２ミクロ
    グロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ
    ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇しており、
    前記方法が、
    （ａ）未熟ドーパミン作動性ニューロン集団を作製するために、ソニックヘッジホッグ
    （ＳＨＨ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽
    細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ８）、ＷＮＴ１、レチノイン
    酸、ＧＳＫ３β阻害剤、ＡＬＫ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される１つ
    以上の因子を含む第１の培地中で前記ＨＩＰ細胞集団を培養し；
    （ｂ）低免疫ドーパミン作動性ニューロン集団を作製するために、前記第１の培地とは
    異なる第２の培地中で前記未熟ドーパミン作動性ニューロン集団を培養すること、
    を含む、方法。
  93. 前記ＧＳＫ３β阻害剤が、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体又はその変異体である、
    請求項９２に記載の方法。
  94. 前記ＧＳＫ３β阻害剤が、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である、請求項９２又は
    ９３に記載の方法。
  95. 前記ＡＬＫ阻害剤が、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体又はその変異体である、請求項
    ９２～９４の何れか１項に記載の方法。
  96. 前記ＡＬＫ阻害剤が、約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である、請求項９２～９５の
    何れか１項に記載の方法。
  97. 前記第１の培地及び／又は第２の培地が動物血清を欠く、請求項９２～９６の何れか１
    項に記載の方法。
  98. 前記ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ａ）の前
    記未熟ドーパミン作動性ニューロン集団を培養することをさらに含み、
    前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であ
    る場合、前記トリガー物質がガンシクロビルであるか、前記自殺遺伝子がエシェリキア・
    コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である
    場合、前記トリガー物質が５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）であるか、又は前記自殺遺
    伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、前記トリガー物質が二量体誘導
    化合物（ＣＩＤ）である、請求項９２～９５の何れか１項に記載の方法。
  99. 前記ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ｂ）の前
    記ドーパミン作動性ニューロン集団を培養することをさらに含み、
    前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であ
    る場合、前記トリガー物質がガンシクロビルであるか、前記自殺遺伝子がエシェリキア・
    コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である
    場合、前記トリガー物質が５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）であるか、又は前記自殺遺
    伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、前記トリガー物質が二量体誘導
    化合物（ＣＩＤ）である、請求項９２～９８の何れか１項に記載の方法。
  100. 非ドーパミン作動性ニューロンから前記低免疫ドーパミン作動性ニューロン集団を単離
    することをさらに含む、請求項９２～９９の何れか１項に記載の方法。
  101. 前記単離された低免疫ドーパミン作動性ニューロン集団を凍結保存することをさらに含
    む、請求項１００に記載の方法。
  102. 内在性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活
    性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇している、低免疫誘
    導多能性幹細胞（ＨＩＰ細胞）から分化させられた単離低免疫膵島細胞。
  103. 前記ＨＩＰ細胞がヒトｉＰＳＣであり、前記Ｂ２Ｍ遺伝子がヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、
    前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＤ４７発現上昇が、プロモータ
    ーの制御下でヒトＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを前記ｉＰＳＣに導入した結果で
    ある、請求項１０２に記載の単離低免疫膵島細胞。
  104. 前記ＨＩＰ細胞がマウスｉＰＳＣであり、前記Ｂ２Ｍ遺伝子がマウスＢ２Ｍ遺伝子であ
    り、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がマウスＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＤ４７発現上昇が、プロ
    モーターの制御下でマウスＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを前記ｉＰＳＣに導入し
    た結果である、請求項１０２に記載の単離低免疫膵島細胞。
  105. Ｂ２Ｍ遺伝子活性の前記排除が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルを破壊するクラスター化
    された規則的配置の短回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９反応の結果である、
    請求項１０２～１０４の何れか１項に記載の単離低免疫膵島細胞。
  106. ＣＩＩＴＡ遺伝子活性の前記排除が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルを破壊するＣＲ
    ＩＳＰＲ／Ｃａｓ９反応の結果である、請求項１０２～１０５の何れか１項に記載の単離
    低免疫膵島細胞。
  107. 前記ＨＩＰ細胞を死に誘導するトリガー物質により活性化される自殺遺伝子をさらに含
    む、請求項１０２～１０６の何れか１項に記載の単離低免疫膵島細胞。
  108. 前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であ
    り、前記トリガー物質がガンシクロビルである、請求項１０７に記載の単離低免疫膵島細
    胞。
  109. 前記ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子が、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む
    タンパク質をコードする、請求項１０８に記載の単離低免疫膵島細胞。
  110. 前記ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子が、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする
    、請求項１０８に記載の単離低免疫膵島細胞。
  111. 前記自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシン
    デアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子であり、前記トリガー物質が５－フルオロシトシン（５－Ｆ
    Ｃ）である、請求項１０７に記載の単離低免疫膵島細胞。
  112. 前記ＣＤ遺伝子が、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク
    質をコードする、請求項１１１に記載の単離低免疫膵島細胞。
  113. 前記ＣＤ遺伝子が、配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項
    １１１に記載の単離低免疫膵島細胞。
  114. 前記自殺遺伝子が、誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードし、前記トリガー物質が二
    量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項１０７に記載の単離低免疫膵島細胞。
  115. 前記誘導型カスパーゼ９タンパク質が、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同
    一性を含む、請求項１１４に記載の単離低免疫膵島細胞。
  116. 前記誘導型カスパーゼ９タンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１１
    ４に記載の単離低免疫膵島細胞。
  117. 前記ＣＩＤが化合物ＡＰ１９０３である、請求項１１４～１１６の何れか１項に記載の
    単離低免疫膵島細胞。
  118. 前記単離低免疫膵島細胞が、膵島祖先細胞、未熟膵島細胞及び成熟膵島細胞からなる群
    から選択される、請求項１１４～１１７の何れか１項に記載の単離低免疫膵島細胞。
  119. 治療的有効量の請求項１０２～１１８の何れか１項に記載の単離低免疫膵島細胞集団を
    含む組成物を投与することを含む、糖尿病に罹患している患者を処置する方法。
  120. 前記組成物が治療的に有効な担体をさらに含む、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記単離低免疫膵島細胞集団が生体分解性足場上にある、請求項１１９又は１２０に記
    載の方法。
  122. 前記投与が移植又は注入を含む、請求項１１９～１２１の何れか１項に記載の方法。
  123. インビトロ分化により低免疫原性多能性細胞（ＨＩＰ細胞）集団から低免疫膵島細胞集
    団を作製する方法であって、低免疫原性ｉＰＳＣにおいて、内在性β－２ミクログロブリ
    ン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子
    活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇しており、
    前記方法が、
    （ａ）未熟膵島細胞集団を作製するために、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、トラン
    スフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＥＧＦ）、上皮増殖因子（Ｅ
    ＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）及び血管内皮胞増
    殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦβ）スーパーファミリ
    ー、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ２）、骨形成タンパク質－７（ＢＭＰ７）、ＧＳＫ３
    β阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ１型受容体阻害剤及びレチノイン酸からなる群から選択
    される１つ以上の因子を含む第１の培地中で前記ＨＩＰ細胞集団を培養し；
    （ｂ）膵島細胞集団を作製するために、前記第１の培地とは異なる第２の培地中で前記
    未熟膵島細胞集団を培養すること
    を含む方法。
  124. 前記ＧＳＫ３β阻害剤が、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体又はその変異体である、
    請求項１２３に記載の方法。
  125. 前記ＧＳＫ３β阻害剤が、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である、請求項１２３又
    は１２４に記載の方法。
  126. 前記ＡＬＫ阻害剤が、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体又はその変異体である、請求項
    １２３～１２５の何れか１項に記載の方法。
  127. 前記ＡＬＫ阻害剤が、約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である、請求項１２３～１２
    ６の何れか１項に記載の方法。
  128. 前記第１の培地及び／又は第２の培地が動物血清を欠く、請求項１２３～１２７の何れ
    か１項に記載の方法。
  129. 前記ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ａ）の前
    記未熟膵島細胞集団を培養することをさらに含み、
    前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であ
    る場合、前記トリガー物質がガンシクロビルであるか、前記自殺遺伝子がエシェリキア・
    コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である
    場合、前記トリガー物質が５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）であるか、又は前記自殺遺
    伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、前記トリガー物質が二量体誘導
    化合物（ＣＩＤ）である、請求項１２３～１２８の何れか１項に記載の方法。
  130. 前記ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ｂ）の前
    記膵島細胞集団を培養することをさらに含み、
    前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であ
    る場合、前記トリガー物質がガンシクロビルであるか、前記自殺遺伝子がエシェリキア・
    コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である
    場合、前記トリガー物質が５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）であるか、又は前記自殺遺
    伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、前記トリガー物質が二量体誘導
    化合物（ＣＩＤ）である、請求項１２３～１２９の何れか１項に記載の方法。
  131. 非膵島細胞から前記低免疫膵島細胞集団を単離することをさらに含む、請求項１２３～
    １３０の何れか１項に記載の方法。
  132. 前記単離された低免疫膵島細胞集団を凍結保存することをさらに含む、請求項１３１に
    記載の方法。
  133. 低免疫誘導多能性幹細胞（ＨＩＰ細胞）から分化させられた単離低免疫網膜色素上皮（
    ＲＰＥ）細胞であって、
    内在性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活
    性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇している、単離低免
    疫網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞。
  134. 前記ＨＩＰ細胞がヒトｉＰＳＣであり、前記Ｂ２Ｍ遺伝子がヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、
    前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＤ４７発現上昇が、プロモータ
    ーの制御下でヒトＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを前記ｉＰＳＣに導入した結果で
    ある、請求項１３３に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
  135. 前記ＨＩＰ細胞がマウスｉＰＳＣであり、前記Ｂ２Ｍ遺伝子がマウスＢ２Ｍ遺伝子であ
    り、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がマウスＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＤ４７発現上昇が、プロ
    モーターの制御下でマウスＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを前記ｉＰＳＣに導入し
    た結果である、請求項１３３に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
  136. Ｂ２Ｍ遺伝子活性の前記排除が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルを破壊するクラスター化
    された規則的配置の短回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９反応の結果である、
    請求項１３３～１３５の何れか１項に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
  137. ＣＩＩＴＡ遺伝子活性の前記排除が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルを破壊するＣＲ
    ＩＳＰＲ／Ｃａｓ９反応の結果である、請求項１３３～１３６の何れか１項に記載の単離
    低免疫ＲＰＥ細胞。
  138. 前記ＨＩＰ細胞を死に誘導するトリガー物質により活性化される自殺遺伝子をさらに含
    む、請求項１３３～１３７の何れか１項に記載の単離改変ＲＰＥ細胞。
  139. 前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であ
    り、前記トリガー物質がガンシクロビルである、請求項１３８に記載の単離低免疫ＲＰＥ
    細胞。
  140. 前記ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子が、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む
    タンパク質をコードする、請求項１３９に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
  141. 前記ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子が、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする
    、請求項１３９に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
  142. 前記自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシン
    デアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子であり、前記トリガー物質が５－フルオロシトシン（５－Ｆ
    Ｃ）である、請求項１３８に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
  143. 前記ＣＤ遺伝子が、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク
    質をコードする、請求項１４２に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
  144. 前記ＣＤ遺伝子が、配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項
    １４２に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
  145. 前記自殺遺伝子が、誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードし、前記トリガー物質が二
    量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項１３８に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
  146. 前記誘導型カスパーゼ９タンパク質が、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同
    一性を含む、請求項１４５に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
  147. 前記誘導型カスパーゼ９タンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１４
    ５に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
  148. 前記ＣＩＤが化合物ＡＰ１９０３である、請求項１４５～１４７の何れか１項に記載の
    単離低免疫ＲＰＥ細胞。
  149. 前記単離低免疫ＲＰＥ細胞が、ＲＰＥ祖先細胞、未熟ＲＰＥ細胞、成熟ＲＰＥ細胞及び
    機能的ＲＰＥ細胞からなる群から選択される、請求項１４５～１４８の何れか１項に記載
    の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
  150. 治療的有効量の請求項１３３～１４９の何れか１項に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞集団
    を含む組成物を投与することを含む、眼科状態に罹患している患者を処置する方法。
  151. 前記組成物が、治療的に有効な担体をさらに含む、請求項１５０に記載の方法。
  152. 前記単離低免疫ＲＰＥ細胞集団が生体分解性足場上にある、請求項１５０又は１５１に
    記載の方法。
  153. 前記投与が、前記患者の網膜への移植又は注入を含む、請求項１５０～１５２の何れか
    １項に記載の方法。
  154. 前記眼科状態が、滲出型黄斑変性、萎縮型黄斑変性、若年性黄斑変性、レーバー先天黒
    内障、網膜色素変性症及び網膜剥離からなる群から選択される、請求項１５０～１５３の
    何れか１項に記載の方法。
  155. インビトロ分化によって低免疫多能性細胞（ＨＩＰ細胞）集団から低免疫網膜色素上皮
    （ＲＰＥ）細胞集団を作製する方法であって、前記ＨＩＰ細胞において、内在性β－２ミ
    クログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩ
    ＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇しており、
    前記方法が、
    （ａ）前駆ＲＰＥ細胞集団を作製するために、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４／７
    、ＤＫＫ１、ＩＧＦ１、ノギン、ＢＭＰ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤及びＶＥ
    ＧＦＲ阻害剤からなる群から選択される因子の何れか１つを含む第１の培地中で前記ＨＩ
    Ｐ細胞集団を培養し；
    （ｂ）低免疫ＲＰＥ細胞集団を作製するために、前記第１の培地とは異なる第２の培地
    中で前記前駆ＲＰＥ細胞集団を培養すること
    を含む、方法。
  156. 前記ＡＬＫ阻害剤が、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体又はその変異体である、請求項
    １５５に記載の方法。
  157. 前記ＡＬＫ阻害剤が、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である、請求項１５５又は１
    ５６に記載の方法。
  158. 前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、その誘導体又はその変異体である、請求項１
    ５５～１５７の何れか１項に記載の方法。
  159. 前記ＲＯＣＫ阻害剤が、約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である、請求項１５５～１
    ５８の何れか１項に記載の方法。
  160. 前記第１の培地及び／又は第２の培地が動物血清を欠く、請求項１５５～１５９の何れ
    か１項に記載の方法。
  161. 前記ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ａ）の前
    駆ＲＰＥ細胞集団を培養することをさらに含み、
    前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であ
    る場合、前記トリガー物質がガンシクロビルであるか、前記自殺遺伝子がエシェリキア・
    コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である
    場合、前記トリガー物質が５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）であるか、又は前記自殺遺
    伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、前記トリガー物質が二量体誘導
    化合物（ＣＩＤ）である、請求項１５５～１６０の何れか１項に記載の方法。
  162. 前記ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ｂ）の前
    記ＰＲＥ細胞集団を培養することをさらに含み、
    前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であ
    る場合、前記トリガー物質がガンシクロビルであるか、前記自殺遺伝子がエシェリキア・
    コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である
    場合、前記トリガー物質が５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）であるか、又は前記自殺遺
    伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、前記トリガー物質が二量体誘導
    化合物（ＣＩＤ）である、請求項１５５～１６１の何れか１項に記載の方法。
  163. 非ＲＰＥ細胞から前記低免疫ＲＰＥ細胞集団を単離することをさらに含む、請求項１５
    ５～１６２の何れか１項に記載の方法。
  164. 前記単離した低免疫ＲＰＥ細胞集団を凍結保存することをさらに含む、請求項１６３に
    記載の方法。
JP2024001947A 2018-07-17 2024-01-10 免疫改変された多能性細胞から分化させた細胞 Pending JP2024050597A (ja)

Applications Claiming Priority (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862698981P 2018-07-17 2018-07-17
US201862698978P 2018-07-17 2018-07-17
US201862698984P 2018-07-17 2018-07-17
US201862698973P 2018-07-17 2018-07-17
US201862698965P 2018-07-17 2018-07-17
US62/698,984 2018-07-17
US62/698,965 2018-07-17
US62/698,973 2018-07-17
US62/698,978 2018-07-17
US62/698,981 2018-07-17
JP2021502525A JP2021530232A (ja) 2018-07-17 2019-07-17 免疫改変された多能性細胞から分化させた細胞
PCT/US2019/042117 WO2020018615A2 (en) 2018-07-17 2019-07-17 Cells differentiated from immunoengineered pluripotent cells

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021502525A Division JP2021530232A (ja) 2018-07-17 2019-07-17 免疫改変された多能性細胞から分化させた細胞

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2024050597A true JP2024050597A (ja) 2024-04-10
JP2024050597A5 JP2024050597A5 (ja) 2024-05-31

Family

ID=69165113

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021502525A Pending JP2021530232A (ja) 2018-07-17 2019-07-17 免疫改変された多能性細胞から分化させた細胞
JP2024001947A Pending JP2024050597A (ja) 2018-07-17 2024-01-10 免疫改変された多能性細胞から分化させた細胞

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021502525A Pending JP2021530232A (ja) 2018-07-17 2019-07-17 免疫改変された多能性細胞から分化させた細胞

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20210292715A1 (ja)
EP (1) EP3824074A4 (ja)
JP (2) JP2021530232A (ja)
KR (1) KR20210032454A (ja)
CN (1) CN112639079A (ja)
AU (1) AU2019305585A1 (ja)
BR (1) BR112021000637A2 (ja)
CA (1) CA3109078A1 (ja)
IL (1) IL279871A (ja)
MX (1) MX2021000614A (ja)
SG (1) SG11202100157YA (ja)
WO (1) WO2020018615A2 (ja)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11162079B2 (en) 2019-05-10 2021-11-02 The Regents Of The University Of California Blood type O Rh-hypo-immunogenic pluripotent cells
GB2584664B (en) * 2019-06-10 2023-05-24 Newcells Biotech Ltd Improved retinal organoids and methods of making the same
WO2021041316A1 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Sana Biotechnology, Inc. Cd24 expressing cells and uses thereof
WO2021146471A2 (en) * 2020-01-15 2021-07-22 The Regents Of The University Of California Transplanted cell protection via inhibition of polymorphonuclear cells
TW202202155A (zh) 2020-03-25 2022-01-16 美商薩那生物科技公司 用於治療神經病症及病況之低免疫原性神經細胞
IL297636A (en) * 2020-04-27 2022-12-01 Sana Biotechnology Inc Repeated dose of hypoimmunogenic cells
EP4149525A1 (en) * 2020-05-15 2023-03-22 Rxcell Inc. Hypoimmunogenic cells and uses thereof in immune responses
EP4196568A1 (en) 2020-08-13 2023-06-21 Sana Biotechnology, Inc. Methods of treating sensitized patients with hypoimmunogenic cells, and associated methods and compositions
US11591381B2 (en) 2020-11-30 2023-02-28 Crispr Therapeutics Ag Gene-edited natural killer cells
KR20230137900A (ko) 2020-12-31 2023-10-05 사나 바이오테크놀로지, 인크. Car-t 활성을 조정하기 위한 방법 및 조성물
CA3212370A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Sana Biotechnology, Inc. Immunosuppressive therapies for use with cardiomyocyte cell therapies, and associated methods and compositions
EP4347797A1 (en) 2021-05-27 2024-04-10 Sana Biotechnology, Inc. Hypoimmunogenic cells comprising engineered hla-e or hla-g
EP4370544A2 (en) 2021-07-14 2024-05-22 Sana Biotechnology, Inc. Altered expression of y chromosome-linked antigens in hypoimmunogenic cells
CA3227613A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 William Dowdle Inducible systems for altering gene expression in hypoimmunogenic cells
AU2022325231A1 (en) 2021-08-11 2024-02-08 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce complement-mediated inflammatory reactions
WO2023019225A2 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce instant blood mediated inflammatory reactions
IL310691A (en) 2021-08-11 2024-04-01 Sana Biotechnology Inc Genetically modified primary cells for allogeneic cell therapy
AU2022326565A1 (en) 2021-08-11 2024-02-08 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy
KR20240056604A (ko) * 2021-09-13 2024-04-30 후지필름 셀룰러 다이내믹스, 인코포레이티드 수임 심장 전구세포의 제조 방법
WO2023047433A1 (en) * 2021-09-23 2023-03-30 The University Of Jordan Dental pluripotent stem cells
CN115873797A (zh) * 2021-09-29 2023-03-31 北京干细胞与再生医学研究院 一种视网膜色素上皮细胞的扩增培养基及培养方法
WO2023069480A1 (en) * 2021-10-20 2023-04-27 Vascugen, Inc. Hypoimmune vasculogenic cells
WO2023122337A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Sana Biotechnology, Inc. Chimeric antigen receptor (car) t cells for treating autoimmune disease and associated methods
WO2023133568A2 (en) * 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Hypoimmune beta cells differentiated from pluripotent stem cells and related uses and methods
WO2023154578A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 Sana Biotechnology, Inc. Methods of treating patients exhibiting a prior failed therapy with hypoimmunogenic cells
WO2023158836A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 Sana Biotechnology, Inc. Engineered cd47 proteins and uses thereof
WO2023173123A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells and compositions and uses thereof
WO2023183313A1 (en) 2022-03-22 2023-09-28 Sana Biotechnology, Inc. Engineering cells with a transgene in b2m or ciita locus and associated compositions and methods
WO2023196980A1 (en) * 2022-04-07 2023-10-12 Fate Therapeutics, Inc. Stealth strategy engaging immune recognition pathways for use in allogeneic cell therapies
CN114958768B (zh) * 2022-06-02 2023-03-24 健颐生物科技发展(山东)有限公司 Fgf10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂的制备方法
WO2024003349A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Novo Nordisk A/S Enhancing neuronal differentiation of ventral midbrain neural progenitor cells
WO2024030959A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Sana Biotechnology, Inc. Methods for differentiating cardiomyocytes
WO2024092015A1 (en) * 2022-10-25 2024-05-02 Wisconsin Alumni Research Foundation Adhesion molecule inhibition for stem cell therapies

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2771336C (en) * 2009-09-15 2019-11-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Synergistic anti-cd47 therapy for hematologic cancers
WO2014078414A1 (en) * 2012-11-13 2014-05-22 Joseph Wu Chemically defined production of cardiomyocytes from pluripotent stem cells
AU2014248167B2 (en) * 2013-04-03 2019-10-10 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods and compositions for culturing endoderm progenitor cells in suspension
US20160230143A1 (en) * 2013-09-19 2016-08-11 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Chemically defined culture medium for stem cell maintenance and differentiation
US10968426B2 (en) * 2015-05-08 2021-04-06 President And Fellows Of Harvard College Universal donor stem cells and related methods
WO2017039445A1 (en) * 2015-09-01 2017-03-09 Pluriomics B.V. An in vitro method of differentiating a human pluripotent stem cell population into a cardiomyocyte cell population
CN108368520B (zh) * 2015-11-04 2023-01-17 菲特治疗公司 多能细胞的基因组工程改造
CN108048484B (zh) * 2017-11-14 2021-07-06 海南一龄医疗产业发展有限公司 诱导性多能干细胞及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP3824074A2 (en) 2021-05-26
CN112639079A (zh) 2021-04-09
IL279871A (en) 2021-03-01
US20210292715A1 (en) 2021-09-23
SG11202100157YA (en) 2021-02-25
MX2021000614A (es) 2021-07-02
BR112021000637A2 (pt) 2021-04-13
AU2019305585A1 (en) 2021-01-28
CA3109078A1 (en) 2020-01-23
EP3824074A4 (en) 2022-04-20
JP2021530232A (ja) 2021-11-11
KR20210032454A (ko) 2021-03-24
WO2020018615A3 (en) 2020-02-27
WO2020018615A2 (en) 2020-01-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2024050597A (ja) 免疫改変された多能性細胞から分化させた細胞
US11401508B2 (en) Methods for isolating human cardiac ventricular progenitor cells
DK3183337T3 (en) Use of Jagged 1 / Frizzled 4 as cell surface marker for isolation of human cardiac ventricular progenitor cells
US20200268803A1 (en) Use of lifr or fgfr3 as a cell surface marker for isolating human cardiac ventricular progenitor cells
CN111133099B (zh) 神经纤毛蛋白-1（nrp1）作为细胞表面标志物用于分离人心脏心室祖细胞的用途
AU2011299327B2 (en) Tissue-specific differentiation matrices and uses thereof
JP7333271B2 (ja) 心筋細胞の成熟および生着を増強するための方法および組成物
EP3060649A1 (en) Reprogramming cardiomyocytes with one transcription factor
JP7233717B2 (ja) 多能性幹細胞からの立体臓器の構築
US20200231933A1 (en) Human pluripotent stem cell derived endocardial endothelium
JP2022545737A (ja) 血管疾患を処置する組成物および方法
US20190352601A1 (en) Engineering blood vessel cells for transplantation
WO2006017567A2 (en) Customizing stem cell-derived cardiomyocytes for transplantation
US20230030814A1 (en) Freeze-Dried Preparations Comprising Megakaryocytes and Platelets
WO2019093047A1 (ja) インビトロでの機能的な外分泌腺の製造方法、および、当該方法によって製造される外分泌腺
TW202340454A (zh) 將誘導性多能幹細胞分化為視網膜色素上皮細胞之方法、視網膜色素上皮細胞以及使用該視網膜色素上皮細胞之方法
Shojaie Extracellular Matrix-Mediated Lung Epithelial Cell Differentiation
Henning Identification and characterisation of a novel, multi-potent, skeletal muscle-derived stem cell with broad developmental plasticity
Guddati Derivation of cardiomyocytes from embryonic stem cells and development of techniques to study cardiac lineage
Iglesias-García Analysis of the regenerative potential of the induced pluripotent stem cells in a model of acute myocardial infarction in mice
Blog Category: Regenerative Medicine
Jezierski Characterization and Therapeutic Potential of Human Amniotic Fluid Cells in Mediating Neuroprotection

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240205

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20240205

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240522